KR100686424B1 - Ｐｒｋａｇ3 대립유전자 및 이를 생식 형질 및 육질형질에 대한 유전자 마커로서 사용하는 방법 - Google Patents

Ｐｒｋａｇ3 대립유전자 및 이를 생식 형질 및 육질형질에 대한 유전자 마커로서 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 더 많은 동복자를 출산하고/하거나 더 우수한 육질을 생성시킬 것으로 여겨지는 동물을 결정하고 바람직하게는 차후 사육 목적을 위해 상기와 같은 동물을 선별하기 위한 동물 육질 및 생식 효율에 대한 유전자 마커, 상기 마커를 확인하는 방법, 및 동물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 마커는 PRKAG3 유전자내의 특정한 다형성의 존재 여부에 근거한 것이다.

Description

ＰＲＫＡＧ3 대립유전자 및 이를 생식 형질 및 육질 형질에 대한 유전자 마커로서 사용하는 방법{NOVEL PRKAG3 ALLELES AND USE OF THE SAME AS GENETIC MARKERS FOR REPRODUCTIVE AND MEAT QUALITY TRAITS}
본 발명은 일반적으로 동물 사이의 유전학적 차이를 검출하는 것에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 동물의 개선된 육질 형질, 동복산자수 형질 및 기타 경제적 형질과 관련된 유전가능한 표현형을 표시하는 유전자 마커에 관한 것이다. 또한, 동물의 유전자형 결정 및 선별에 이들 마커를 사용하기 위한 방법 및 조성물이 개시된다.
개개의 동물 사이 뿐만 아니라 바람직한 특징을 가진 동물을 얻기 위한 육종 기술에 의해 이용될 수 있는 품종 사이에는 유전학적 차이가 존재한다. 예를 들어, 중국 품종은 조기에 발정기에 도달하고 큰 동복산자수를 갖는 것으로 알려져 있는 반면, 미국 품종은 보다 큰 성장율 및 무지방성으로 유명하다. 그러나, 종종, 원하는 형질에 대한 유전가능성이 낮고, 표현형 변이에 기초하여 개체를 선별하는 표준 육종 방법은 실제로 존재하는 유전학적 변이성 또는 복잡한 유전자 상호작용을 충분히 고려하지 못한다.
제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석이 돼지 DNA를 연구하기 위하여 여러 그룹에 의해 이용되었다. 참고문헌[Jung et al., Theor. Appl. Genet., 77:271-274 (1989)]은 본원에 참고내용으로 포함되어 있으며, 2마리의 돼지 품종 사이의 유전학적 변이성을 입증하기 위하여 RFLP 기술을 이용하는 것을 개시하고 있다. 이들 품종내의 돼지 백혈구 항원(SLA) 클래스 Ⅰ 유전자에 대하여 다형성이 입증되었다. 참고문헌[Hoganson et al., Abstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science, March 26-28, 1990]은 본원에 참고내용으로서 포함되어 있으며, 중국종 돼지에 대한 돼지 주요조직적합복합체(MHC) 유전자의 다형성에 관하여 보고하고 있으며, RFLP 분석에 의해 입증하고 있다. 참고문헌[Jung et al., Theor. Appl. Genet., 77:271-274 (1989)]은 본원에 참고내용으로 포함되어 있으며, 특정 돼지 내의 SLA 클래스 Ⅰ 유전자의 RFLP 분석을 보고하고 있다. 저자는, 결과가 돼지 SLA/MHC 클래스 Ⅰ 유전자와 생식 및 능력 특성 사이에 관련성이 존재함을 제시하고 있다고 진술하였다. 그들은 또한 SLA 클래스 Ⅰ 제한 단편을 유전자 마커로서 사용하는 것이 돼지 성장 능력을 개선하는데 장래에 유망할 수 있다고 진술하고 있다.
바람직한 특정 대립유전자를 추적하는 능력은 주효한 유전자에 대한 DNA 분자 마커를 확인하는 신규하고 지루한 공정과 관련된다. 마커는 주요 효과를 갖는 단일 유전자에 결합되거나, 부가적 효과를 갖는 다수의 유전자에 결합될 될 수 있다. DNA 마커는 여러 이점이 있다: 분리가 측정하기에 용이하고 분명하며, DNA 마커가 공동-우성(co-dominant)이어서 이형접합 동물 및 동형접합 동물이 분명하게 식별될 수 있다. 일단 마커 시스템이 확립되면, 개개의 어린 동물 또는 심지어 배 아로부터 조직 또는 혈액 샘플을 채취한 후에 언제든지 DNA 마커를 검정할 수 있으므로 선별 결정이 매우 용이해질 수 있다.
수용체 유전자의 유전학적 차이의 사용은 선별을 위한 매우 가치있는 마커 시스템이 될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,550,024호 및 제5,374,526호(Rothschild et al.)는 보다 큰 동복산자수와 관련된 돼지 에스트로겐 수용체 유전자의 다형성을 개시하고 있으며, 이러한 개시내용은 본원에 참고내용으로 포함되었다. 미국특허 제5,935,784호는 보다 큰 동복산자수 및 총 생식 효율과 관련된 돼지 프로락틴 수용체 유전자내의 다형성 마커를 개시하고 있다.
물론, 동복산자수는 사육자에게 직접적인 경제적 영향을 미치며, 또한 비육 생산 동물에게 중요한 것은 육질이다. 육질은 많은 상이한 측면과 마찬가지로 객관적이고 주관적이며 전체 형질을 구성하여 평가하기 어려운 특징이다. 다른 음식에서와 마찬가지로 육질을 결정하는 요인은 매우 많다[참고문헌: Wood et al., Proceedings of The Nutrition Society (1999) 58:363-70]. 이것으로는, 미생물 위험의 부재(음식 안정성) 및 동물 착취의 방지(동물 복지)가 있다. 또한, 고기의 감각적 어필, 즉 이것의 풍미 및 먹기에 적합한 품질, 및 특히 지방의 양 및 유형과 관련하여 인식된 건강성이 포함된다.
돼지 생고기의 품질은 많은 유전적 및 비유전적 인자에 의해 영향을 받는다. 후자로는, 농장, 운반, 도살 및 가공 조건이 포함된다. 고기 연구자들은 이러한 인자에 대하여 상당히 많은 연구를 수행하였고, 이것은 상당한 품질 개선을 초래하였다. 또한, 이러한 연구의 일부는 동물의 유전학적 백그라운드에 공헌하였고, 몇 몇 연구는 유전학적 인자의 중요성을 드러내었다. 이것은 동물의 선택적 육종 및 유전자 기술의 사용이 돼지고기의 품질을 강화시키는데 중요한 역할을 할 수 있다는 산업적 인식을 형성시켰다.
DNA 수준에서의 정보는 특정 주요 유전자를 결정하는데 도움이 되지만, 이미 선택한 정량적 형질의 선별을 보조할 수도 있다. 표현형 데이터에 더하여 분자적 정보는 선별의 정확성을 증가시키고 따라서 선별 반응의 정확성을 증가시킬 수 있다. 마커 보조 선별(MAS) 프로그램내에서의 초과 반응의 크기는 이론적 관점으로부터 많은 작업자에 의해 고려되었다. 일반적으로, MAS는 낮은 유전성을 갖고 표현형적으로 측정하기에 고가인 형질에 유용하다. 특히 육질은 MAS를 이용하기에 좋은 기회로서 적격이다. 예를 들어, 참고문헌[Meuwissen, T.H.E. and Goddard, M.E.(1996) "The use of Marker Haplotypes in Animal Breeding Schemes", Genet. Sel. Evol., 28 161-176]은 전통적 방법을 이용하여 진행하기 곤란한 생식 및 육질과 같은 형질에 대한 마커 보조 선별의 영향을 고려하였다. 그러한 결과는 매우 고무적이며, 육질과 같은 형질에 대하여, 도살 후에 형질을 측정하는 경우에 64% 이하의 부가적 반응을 달성할 수 있다는 것을 나타내었다.
사실, 육질이나 동복산자수와 같은 경제적 형질을 유전학적으로 개선하는데 최상의 방법은 선별된 집단내에서 관련 DNA-마커를 직접 찾는 것이다. 육질 측정은 육종 조직의 핵심 집단으로부터의 몇몇 동물에 대하여 연속적으로 수행될 수 있다. 육질의 완전한 평가는 도살 후에만 수행될 수 있기 때문에, 데이터는 추려진 동물에 대하여 수집되어야 하고 잠재적인 육종 동물에 대하여 획득될 수 없다. 동 복산자수에 대하여도 유사하게, 암컷이 출생 후에만 산자수를 확인하기 위하여 확인될 수 있다. 이들 형질에 대한 유전학적 성질을 확인하는 것은 유전자 수준에서 선별을 허용할 것이다.
이러한 표현형 데이터는 관련 DNA 마커의 검출 및 확인된 마커를 실험 집단을 이용하여 유효하게 하거나 후보 유전자를 시험하기 위하여 수집된다. 그 후, 중요한 마커 또는 유전자가 선별 공정내에 직접 포함될 수 있다. 분자적 정보의 장점은, 본 발명자들이 그것을 육종 동물이 어릴때에 얻을 수 있다는 것이며, 이것은 성장능력 시험이 완결되기 전에 DNA 마커에 기초하여 동물을 미리 선별할 수 있다는 것을 의미한다. 이것은 전체적인 시험 및 선별 시스템을 위해 커다란 장점이다.
이전부터, 유전자 수준에서 개선된 특성을 갖는 동물을 확인하고 선별함으로써 동물의 육질 뿐만 아니라 생식 특징을 개선하기 위해 사용될 수 있는 마커를 식별할 필요성이 존재하였다.
본 발명의 목적은, pH, 마블링, 색상 및 육즙감량에 의해 입증되는 바람직한 고기 특징 또는 보다 큰 동복산자수를 나타내는 PRKAG3 유전자에 기초하여 또는 이 유전자내의 유전자 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 이들 유전자 마커의 존재를 결정하는 검정법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적 목적은 원하는 형질에 대한 선별 및 육종 방법의 정확성을 증가시키는, 동물을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 마커의 존재의 결정을 크게 촉진하는 PCR 증폭 시험을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 부분적으로 개시될 것이고, 상세한 설명으로부터 부분적으로 자명해질 것이며, 발명의 실시예에 의해 습득할 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 이점은 특히 첨부된 청구항에 지적된 수단 및 조합에 의해 달성될 것이다.
발명의 요약
본 발명은 동물의 육질 형질 및 생식 특성과 관련된 유전자 마커로서 유용한 PRKAG3 유전자의 대안적 유전자 형태의 발견에 관한 것이다. PRKAG3 유전자는 종 및 동물사이에 고도로 보존되어 있고, 본원에 개시된 상이한 대립유전자가 소, 양, 닭 등과 같은 경제적이거나 비육 생산용의 다른 동물내의 이러한 유전자의 변이성과 상호관련되는 것으로 기대된다.
본원에 구체화되고 폭넓게 설명된 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 그리고 그 목적에 따라, 본 발명은 바람직한 육질 형질을 가질 것으로 여겨지는 동물을 결정하거나 바람직하지 않은 육질 형질을 나타내는 대립유전자를 갖는 돼지에 대하여 선별하기 위한 동물 스크리닝 방법을 제공하는 대안적 표현형을 발견하는 것이다. 본원에서 "바람직한 육질 형질"이란 많은 측정가능한 육질 형질 중 하나가 소정의 집단의 평균을 능가하는 상당한 개선(증가 또는 감소)을 의미하며, 이러한 정보는 육질이 최적화된 균일한 집단을 달성하기 위한 육종에 이용될 수 있으며, 이것은 원하는 육질 특징에 따라 어떤 형질에서의 증가 또는 다른 형질에서의 감소를 포함할 수 있다. 고려될 수 있는 이러한 인자들은 하기를 포함하지만 이것에 제한되지 않는다:
요부(loin) 미놀타 밝기(L*): 43-47 단위의 범위(어두운 색으로부터 밝은 색까지)가 허용될 수 있지만, 43의 L*가 바람직하다; 즉, 일반적으로 이러한 범위내에서 높은 경제적 가치를 가진다(이것은 시장에 의존적이며, 예를 들어 일본 흙 돼지고기(darker pork)에서 바람직하다).
요부 일본 색상 스코어(JCS): 2.5-5.0 단위의 범위(밝은 색으로부터 어두운 색까지)가 허용될 수 있지만, 3-4의 JCS가 바람직하다.
요부 마블링(근육내 지방의 수준): 개선된 고기 먹기 품질 특징과 관련이 있으므로 일반적으로 마블링이 높을수록 바람직하다.
요부 pH: (사후 24시간에 측정된 궁극적 고기 산도: 이러한 속성은 돼지고기 품질의 가장 중요한 단일 형질이다); 5.50-5.80의 범위가 바람직하지만, 고기의 색상과 (낮은) 퍼지에 긍정적으로 영향을 미치므로, 5.80이 더 좋다.
후지(ham) 미놀타 밝기(L*): 43-52 단위의 범위가 허용될 수 있으나, 낮을수록(43) 좋다.
후지 pH: 높을수록; 즉 5.80이 좋다.
육즙감량 또는 퍼지: 1%-3%의 범위가 허용될 수 있으나, 낮을수록 좋다.
육질의 이러한 측정은 당업자에 의해 일반적으로 인정되는 예이다. 육질의 고찰을 위하여 하기 참고문헌을 참조할 수 있다[참고문헌: Sosnicki, A.A., E.R. Wilson, E.B. Sheiss, A. deVries, 1998 "Is there a coat effective way to produce high quality pork?", Reciprocal Meat Conference Proceedings, Vol. 51].
따라서, 본 발명은 바람직한 육질을 생성할 것으로 여겨지는 동물을 확인하고/하거나 바람직한 육질을 생산할 것으로 여겨지지 않는 동물을 확인하여 최상의 육질을 위한 육종 및 선별을 최적화하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 사육되는 경우 큰 동복산자수를 생성할 것으로 여겨지는 동물을 결정하거나 보다 작은 동복산자수를 나타내는 대립유전자를 가진 돼지에 대하여 선별하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법을 포함한다. 본원에서 "보다 많은 동복자"란 소정의 집단의 평균을 능가하는 동복산자수에서의 현저한 증가를 의미한다. 따라서, 본 발명은 보다 많은 동복자를 출산할 것으로 여겨지는 동물 및/또는 보다 많은 동복자를 출산할 것으로 여겨지지 않는 동물을 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이러한 형질을 검정하는 방법은 일반적으로 하기 단계들을 포함한다: 1) 돼지로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 2) 단계 1)로부터 얻은 게놈 DNA 또는 단백질을 검정하여 PRKAG3 대립유전자(들)가 존재하는지를 결정하는 단계. 또한, 여기에는 PRKAG3 유전자내의 일련의 다형성이 선택 또는 확인 프로토콜에 조합되게 하여 이들 마커 각각의 이점을 최대화시키는 일배체형 데이터가 포함된다.
몇몇 다형성은 PRKAG3 단백질의 아미노산 조성에서의 변화와 관련되므로, 검정 방법도 PRKAG3 단백질의 아미노산 조성을 확인하는 것과 관련된다. 이러한 유형에 대한 방법 또는 정제 및 분석은 통상 단백질의 항체에 의한 형광 표지, 분리 및 정제(즉, 역상 HPLC 시스템), 및 아미노산 서열의 존재를 확인하기 위한 자동화 단백질 시퀀서의 사용을 포함하는 수단을 통해 단백질을 단리시키는 것과 관련된다. 이러한 검정을 위한 프로토콜은 표준이며, 당업계에 공지되어 있고, 참고문헌[Ausubel et. al.,(eds.), Short Protocols in Molecular Biology Fourth ed. John Wiley and Sons 1999]에 개시되어 있다.
바람직한 구체예에서, 유전학적 샘플이 분석된다. 간략하게, 유전 물질 샘플을 동물로부터 수득하고, 샘플을 분석하여 유전자 형태에 의존하여 증가된 동복산자수 또는 개선된 육질 또는 둘 모두와 관련된 AMP-활성 단백질 키나아제 조절 감마 서브유닛(PRKAG3) 유전자내의 다형성의 존재 또는 부재를 결정하였다.
당업자에게 자명하듯이, 서열 차이에 대해 핵산 분자를 비교하는 경우, 다양한 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 제한 단편 길이 다형성 분석, 헤테로듀플렉스 분석, 단일 가닥 입체형태적 다형성 분석, 변성 구배 전기영동 및 온도 구배 전기영동 등이 있다.
바람직한 구체예에서, 다형성은 제한 단편 길이 다형성이고, 검정은 단리된 유전 물질로부터 돼지 PRKAG3 유전자를 확인하고; 유전자를 제한 효소에 노출시켜 다양한 길이의 유전자 제한 단편을 생성시키고; 예를 들어, 전기영동 또는 HPLC 분리법에 의해 제한 단편을 분리하여 제한 패턴을 형성시키고; 수득된 제한 단편 패턴을 원하는 마커를 갖거나 갖지 않은 것으로 공지된 PRKAG3 유전자와 비교하는 단계를 포함한다. 동물이 마커에 대하여 양성이면, 이러한 동물은 육종 프로그램에 포함되는 것으로 고려될 수 있다. 동물이 마커 표현형에 양성으로 시험되지 않으면, 상기 동물은 그룹으로부터 추려져서 달리 이용될 수 있다. 또한, 일배체형 데이터의 사용은 육질 및/또는 동복산자수 양자를 위한 다수의 대립유전자에 대한 스크리닝과 함께 사용될 수 있다.
가장 바람직한 구체예에서, 유전자는 프라이머 및 DNA 중합효소를 사용하여 단리되어 다형성을 함유하는 유전자의 특정 영역이 증폭된다. 다음, 증폭된 영역은 제한 효소에 의해 절단되고, 단편은 다시 분리된다. RFLP 패턴의 가시화는 단편을 단순히 염색하거나 증폭에 사용된 프라이머 또는 누클레오시드 트리포스페이트를 표지하여 이루어진다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 특정 집단내에서 육질 및/또는 동복산자수에 대한 유전자 마커를 확인하는 방법을 포함한다. 동일 품종 또는 교배품종 또는 유사한 유전 계통의 암수 돼지를 사육하고, 새끼의 수(암컷에 대하여) 및/또는 각 돼지에 의해 생산된 육질을 결정하였다. 각 돼지의 PRKAG3 유전자내의 다형성을 확인하고 새끼의 수 또는 육질과 관련시켰다. 바람직하게는, RFLP 분석을 이용하여 다형성을 결정하였다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 돼지 이외의 특정 경제적 동물의 육질 및/또는 동복산자수(출생수)에 대한 유전 마커를 확인하는 방법을 포함한다. 상이한 동물 사이에서 이러한 유전자의 고도로 보존된 성질에 기초하여, 본원의 교시를 기본으로 하여 육질 또는 동복산자수(출생수)에 대하여 선택하기 위해 본원에 설명된 정규 시험으로 이러한 마커가 상이한 동물종에 적용될 수 있다. 동일 품종 또는 교배 품종 또는 유사한 유전 계통의 암수 동물을 사육하고, 새끼의 수 또는 각 동물에 의해 생산된 육질을 결정하여 상관관계를 수립하였다. 서열을 이용할 수 있는 다른 동물에 대하여는, 서열의 BLAST 비교를 사용하여 특정 대립유전자가 본원에 개시된 것과 유사한지 확인하였다. 유사 다형성이 다른 동물 및 다른 밀접히 관련된 유전자내에서 존재할 것이다. 용어 "유사 다형성"은 BLAST 비교에 의해 결정된 본원에 개시된 것 중 어느 것과 동일한 다형성일 것이다.
하기 용어를 2개 이상의 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 관계를 설명하기 위하여 사용하였다: (a) "기준 서열", (b) "비교 윈도우", (c) "서열 동일성", (d) "서열 동일성의 퍼센트", 및 (e) "실질적 동일성".
(a) 본원에서 "기준 서열"이란 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 서열이다. 이 경우, 참조 PRKAG3 서열이 이에 해당한다. 기준 서열은 특정 서열의 서브세트 또는 전체일 수 있다; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 절편 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열.
(b) 본원에서 "비교 윈도우"란 폴리뉴클레오타이드 서열의 인접하고 특정된 절편에 대한 기준을 포함하며, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 서열은 기준 서열과 비교될 것이고, 비교 윈도우내의 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 2개 서열의 최적 배열을 위해 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 것이다. 일반적으로, 비교 윈도우는 길이가 20개 이상의 인접 뉴클레오타이드이고, 선택적으로 30, 40, 50, 100 또는 그 이상일 수 있다. 당업자는, 폴리뉴클레오타이드 서열내에 갭을 포함함으로 인해 기준 서열에 매우 유사해지는 것을 회피하기 위하여, 갭 패널티가 통상 도입되고 매치수로부터 감해진다는 것을 이해할 것이다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 참고문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부 상동성 알고리즘; 참고문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘; 참고문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법; 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 수행될 수 있으며, 이들의 비제한적인 예로는 PC/유전자 프로그램내의 CLUSTAL(Intelligenetics, Mountain View, California); GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA) 등이 있으며; CLUSTAL 프로그램은 참고문헌[Higgins and Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Application in the Biosciences 8:155-65 (1992),및 Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994)]에 잘 설명되어 있다. 데이터베이스 유사성 검색에 사용될 수 있는 BLAST 계통의 프로그램은 하기를 포함한다: 뉴클레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 질의 서열용 BLASTN; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 질의 서열용 BLASTX; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 단백질 질의 서열용 BLASTP; 뉴클레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 단백질 질의 서열용 TBLASTN; 및 뉴클레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 질의 서열용 TBLASTX. 참고문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)]을 참고하라.
다르게 명시되지 않는 한, 본원에서 제시된 서열 동일성/유사성 값은 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용하는 BALST 2.0 스위트(suite) 프로그램을 사용하여 얻어진 값을 나타낸다[참조: Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402(1997)]. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 예를 들어, 내쇼날 센터 포 바이오테크놀로지-인포메이션(National Center for Biotechnology-Information(http://www.hcbi.nlm.nih.gov/)을 통해 일반이 이용할 수 있다.
상기 알고리즘은, 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드로 배열된 경우에 소정의 포지티브 값의 한계 스코어 T와 매칭하거나 만족시키는, 질의 서열에서 길이 W의 단축 워드를 동정함으로써 일정값 이상의 HSP(high scoring sequence pairs)를 동정하는 단계를 포함한다. T는 인접 워드 스코어 한계치로서 언급된다[참조: 상기 Altschul et al.]. 이들 초기 인접 워드 히트(hits)는 이것들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시시키기 위한 시드(seed) 역할을 한다. 이후, 워드 히트는 누적 배열 스코어가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오타이드 서열에 대해 파라미터 M(한 쌍의 매칭되는 잔기에 대한 보상 스코어는 항상 0보다 크다) 및 N(미스매칭되는 잔기에 대한 페널티 스코어는 항상 0보다 작다)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 있어서, 스코어링 매트릭스는 누적 스코어를 계산하기 위해 사용된다. 워드 히트의 각 방향으로의 연장은 누적 배열 스코어가 최대 달성 값에서 수량 X 만큼 떨어지는 경우; 하나 이상의 네가티브 스코어링 잔기 배열의 축적으로 인해 누적 스코어가 0 또는 그 미만이 되는 경우; 또는 어느 한 서열의 말단이 도달되는 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 민감도 및 배열의 스피드를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열에 대한)은 디폴트로서 워드길이(W) 11, 기대값(E) 10, 컷오프 100, M =5, N=4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 있어서, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이(W) 3, 기대값(E) 10 및 BLOSUM 62 스코어링 매트릭스를 사용한다[참조: Henikoff & Henikoff(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
서열 동일성 퍼센트를 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 두개의 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다[참조예: Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993)]. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성 측정 중 하나는 가능성의 최소 합계(P(N))이며, 이는 두개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 일어날 수 있는 가능성을 표시한다.
BLAST 검색은 단백질이 무작위 서열로서 모델화될 수 있음을 가정한다. 그러나, 많은 실제 단백질은 동형중합체 트랙, 단기 반복체, 또는 하나 이상의 아미노산으로 부화된 영역일 수 있는 비-무작위 서열의 영역을 포함한다. 이러한 복잡도가 낮은 영역은 단백질의 다른 영역이 전체적으로 유사하지 않다고 하더라도 관 련되지 않은 단백질 사이에 배열될 수 있다. 다수의 복잡도가 낮은 필터 프로그램은 이러한 낮은 복잡도의 배열을 감소시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, SEG(Wooten and Federhen, Comput. Chem., 17:149-163(1993)) 및 XNU(Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201(1993))의 낮은 복잡도의 필터가 단독으로 사용되거나 조합하여 사용될 수 있다.
(c) 본원에서 사용되는 바와 같이, 두개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정 비교 윈도우 상에 최대 상응도로 배열되는 경우에 동일하게 되는 두개의 서열에서 잔기의 비교를 포함한다. 서열 동일성의 퍼센트가 단백질과 관련하여 사용되는 경우에, 동일하지 않은 잔기 부분은 보존성 아미노산 치환에 의해 다르게 되고, 이때 아미노산 잔기는 유사한 화학 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 분자의 작용성을 바꾸지 않는다. 서열이 보존성 치환에서 차이가 있는 경우, 서열 동일성 퍼센트는 치환의 보존성 특정을 보정하도록 상향 조절될 수 있다. 이러한 보존성 치환에 의해 차이가 나는 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 한다. 이러한 조절을 하기 위한 수단은 당업자들에게 널리 공지되어 있다. 대표적으로, 이것은 전체 미스매치 보다는 부분으로서 보존성 치환을 스코어링함으로써 서열 동일성 퍼센트를 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산은 스코어 1로 주어지고, 비보존성 치환은 스코어 제로인 경우, 보존성 치환의 스코어는 제로 내지 1이다. 보존성 치환의 스코어링은 예를 들어, 메이어(Meyer) 및 밀러(Miller)(Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17(1988))의 알고리즘, 예컨대 프 로그램 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California, USA)로 수행됨으로써 계산된다.
(d) 본원에서 사용되는 "서열 동일성 퍼센트"는 비교 윈도우 상에서 두개의 최적 배열된 서열을 비교함으로써 측정된 값을 의미하며, 이때 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오타이드 서열 부분은 두개의 서열 중 최적 배열에 대해 기준 서열(부가 또는 결손을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결손(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 이러한 비율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 다수의 매칭된 자리를 나타나게 하는 자리의 수를 측정하여 비교 윈도우에서 전체 자리 수를 매칭된 자리의 수로 나누고, 이 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출함으로써 계산된다.
(e)(I) 용어 폴리뉴클레오타이드 서열의 "실질적 동일성"은 표준 파라미터를 사용하여 기술된 배열 프로그램 중 하나를 사용하여 기준 서열과 비교하여, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 매우 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 당업자들은 이러한 값이 코돈 축퇴, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 배치 등을 고려함으로써 두개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 엔코딩된 단백질의 상응하는 동일성을 측정하도록 적절하게 조절될 수 있음을 인지할 것이다. 이를 위해 아미노산 서열의 실질적 동일성은 일반적으로 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 의미한다.
이러한 프로그램 및 알고리즘은 본원 기재된 것들에 대해 표적 유전자에서의 특정 다형성의 유사체를 확인할 수 있다. PRKAG3 유전자의 고도로 보존된 특성에 근거하여 앞서 언급된 바와 같이(Jeon T. J., V. Armeger, C. Rogel-Gaillard, A. Robic, E. Bongcam-Rudloff et al., 2001 Genomics 72:297-303), 이러한 다형성은 다른 동물에 존재할 것이고 본원의 교시를 이용하여 통상적인 파라미터 최적화와 관련된 본원에 개시되어 있는 것 이외의 다른 동물에서의 동일한 용도가 있을 것으로 예상된다. 돼지 PRKAG3 서열이 도 1에 기재되어 있다.
또한, 대안적 DNA 마커의 특정 대립유전자와 특정 유전자(예를 들어, 본원에 논의된 PRKAG3 유전자)와 관련된 것으로 알려진 DNA 마커의 대립유전자 사이의 연결을 확립시키는 것이 가능한데, 이는 특정 형질과 관련된 것으로 이미 나타났다. 따라서, 현재 상황에서, PRKAG3 유전자를 취하여, 적어도 단기간에, 보다 많은 동복산자수 및/또는 보다 우수한 육질을 생성할 것 같은 돼지를 선택하거나, 대안으로, 대안적인 15번 염색체 마커의 특정 대립유전자 선택을 통해, PRKAG3 관련된 마커의 특정 대립유전자를 간접적으로 선택함으로써, 보다 작은 동복산자수 및/또는 덜 좋은 육질을 생성할 것 같은 돼지를 선택하는 것이 가능할 것이다. 돼지 15번 염색체 상에서 PRKAG3에 연결되는 것으로 공지된 이러한 마커의 예로는 SW1683 및 SW1983이 포함된다. 본원에서 용어 "유전자 마커"는 다형성, 이들이 연결되어 있는 마커, 마이크로새틀라이트(microsatellite)의 사용과 관련된 단백질 변화를 검정하는 수단, 또는 심지어 마커에 의해 표시된 원인성 단백질 변화 및 동물의 육질에 영향을 미치는 것과 같은 용도를 검정하는 수단에 의해 기술된 다형성만을 포함하는 것은 아니다.
본원에서 흔히 사용되는 특정 다형성의 명명은 특정 제한 효소의 명칭에 의한 것이다. 이것은 부위가 동정될 수 있는 유일한 방법이 이러한 제한 효소의 사용에 의해서 확인됨을 내포하는 것은 아니다. 특정 다형성을 동정하는데 사용될 수 있는 다른 제한 효소를 동정하기 위해 당업자들은 많은 데이터베이스 및 자료를 이용할 수 있다. 예를 들어, http://darwin.bio.geneseo.edu는 확인할 서열 및 다형성의 분석에 관한 제한 효소를 제공할 수 있다. 사실, 본원에서 교시된 바에 따르면, 제한 효소를 포함하지 않을 수도 있으나, 동일한 유전자 형태 또는 단백질 대체형에 대해 검정하는 대체 방법들로 특정 다형성 또는 대립유전자를 동정하는 다수의 방법이 있다.
첨부되는 도면은 본원에 병합되며, 본 명세서의 일부분을 구성하는 것으로 본 발명의 일 구체예를 예시하고 있으며, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하고자 한다.
도면의 설명
도 1은 아미노산을 포함하는 돼지 PRKAG3 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이며, 대안적 다형성 좌위 및 이들의 아미노산 변화가 확인된다.
도 2a 및 2b는 엑손 1, 엑손 2 및 그 사이의 신규 인트론 서열을 포함하는 PRKAG3 유전자의 5' 플랭킹 영역의 서열을 도시한 것이다. 도 2a는 SINE(11)을 가지며, 도 2b는 SINE(22)을 포함하지 않는다. 이러한 서열은 추가의 프라이머를 형성하는데 사용될 수 있다. 진한 표시 부분은 SINE 사이의 직접적인 반복을 나타내며, 진하고 이탤릭체인 부분은 PRKAG3 유전자의 엑손(엑손 1 및 엑손 2)을 나타낸 다.
도 3a 및 3b는 SSC15에 대한 육질과 관련된 QTL 입증을 위한 F-비의 곡선을 도시한 그래프이다. x 축은 연관 지도(linkage map) 상의 상대적 위치를 나타낸다. 이들 축은 F-비를 나타낸다. x 축상의 화살표는 마커가 존재하는 위치를 나타낸다. 3개의 라인은 5% 염색체별(----), 5% 게놈별(━ ) 및 1% 게놈별(- - -) 중요도에 대한 평균 글리코겐, 평균 락테이트 및 평균 해당 포텐셜 형질을 제시하고 있다. 도 3b는 pH 형질을 보여준다.
도 4는 후지 및 요부에서 pH 및 색상 스코어에 대한 PRKAGE3의 일배체형 치환 효과를 입증하고 있다. 일배체형 치환 효과는 5개의 라인(ALL)을 교차하여, 그리고 각각의 라인 내에서 추정된다. 라인은 랜드레이스(Landrace: LR), 라지 화이트(Large White: LW) 또는 듀록(Duroc:DU), 듀록 기재 합성 라인(DS) 및 버크셔(Berkshire) 기재 라인(BE)에 기초한다. 별도의 스케일은 BE 라인에 대해 사용된다. 동일한 위첨자를 갖는 칼럼내 있는 추정치는 교차하는 라인 추정치에 대해 p <0.005에서 현저하게 다르고, 라인 추정치에 대해 p<0.005에서 현저히 다르다.
발명의 상세한 설명
하기 실시예와 함께 본원 발명의 구체예에 대해 상세하게 비교하여 본원 발명의 원리를 설명하고자 한다.
AMP-활성 단백질 키나아제는 ATP-생성 경로상의 회전에 관여하며, ATP 소비 경로를 억제한다. 또한, 인산화에 의해 글리코겐 합성효소를 불활성화시킬 수 있 다. AMPK는 세개의 서브 유닛, 즉, 촉매적 α사슬 및 두개의 조절 서브유닛 β및 γ로 구성된다.
국제 출원 공개 제 WO/01/20003호(Institut National De Le Recherche Agronomique)에는 PRKAG3 유전자의 변이체를 개시하고 있다. 이들 변이체는 공지된 PRKAG3의 RN- 대립유전자와 관련된, R41Q(이러한 경우는 아미노산 200에 해당한다) 치환, V40I(아미노산 199) 치환을 포함한다. 상기 출원은 RN-(200Q) 표현형으로 불리우는 햄프셔 돼지에서 높은 해당 포텐셜과 관련된 PRKAG3 유전자의 코돈 200에서의 돌연변이(동형접합 또는 이형접합 상태)의 발견을 보고하고 있다. 이러한 표현형을 갖는 돼지는 매우 낮은 pH, 감소된 수보유력을 가지며, 경화된 조리 햄의 생산을 감소시킨다. 그러나, 상이한 라인의 돼지의 분석은 코돈 200에서의 이러한 돌연변이가 햄브셔 품종에 발생하고, 다른 돼지 품종에서는 매우 낮은 빈도로 일어나거나, 거의 전혀 발생하지 않는 것으로 제안하고 있다. 추가로, 상기 PCT 공개의 실시예 5에 기재된 바와 같이, 200Q는 항상 199V와 함께 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 199번 위치에서의 마커가 200Q 마커로부터 유전자 마커로서 변이 또는 독립적인 값을 갖지 않음을 제안하고 있다.
상기 국제 출원 제 WO/01/20003은 200Q 마커가 바람직하지 않은 RN- 돌연변이와관련되어 있음을 확인시켜 준다. 상기 출원은 이러한 마커가 항상 199V와 함께 발견되나, 199V 또한 보다 우수한 육질을 갖는 200R과 함께 존재한다는 것을 교시하고 있다. 출원인은 놀랍게도, 199I/200R의 제 3의 조합이 199V/200R의 육질보 다 평균적으로 보다 우수한 육질을 갖는다는 것을 발견하였다. 추가로, 상기 출원인은 V199I 다형성이 놀랍게도 동복산자수에서의 변화에 관련되어 있음을 발견하였다. 이러한 정보는 199 마커가 육종 도구로서 사용될 수 있게 한다.
추가로, 출원인은 새로운 다형성 좌위, G52S를 확인하였으며, 이는 육질 개선과 관련되어 있다. 끝으로, 일배체형 분석을 수행하여 199I-52G와 공지된 30T 다형성(Milan et. al., 2000) 간의 상호 작용을 평가하였다. 이러한 구체예에 따르면, 30T-52G-199I 일배체형(이후, 일배체형 3)은 육질 특징에 있어서 가장 바람직하였다.
도 1은 PRKAG3 유전자 및 본원에서 논의되는 모든 다형성을 도시하고 있다(서열번호:1은 야생형이다). 본 출원에 기술되는 실시 이전에, 이러한 유전자가 다른 품종에 있어서 경제적인 형질에 영향을 미친다는 증거는 없었다. 놀랍게도, PRKAG3 유전자, PRKAG3-199, PRKAG-30 및 PRKAG3-52에 있어서 새로운 마커는 이제 육질 형질에서의 변이 뿐만 아니라 햄프셔 품종 이외의 많은 종의 돼지의 동복산자수와 같은 생식 형질과 상관이 있음이 밝혀졌다. 이들 새로운 마커는 색상, pH 수준, 마블링, 육즙감량에 있어서 최고 기술적 품질의 고기와 상관되며, 또한 동복 산자수 형질과 상관되는 것으로 나타났다. 본 발명에 따르면, 이러한 형질(들)을 갖는 다형성과의 관계가 유전자 마커가 특정 품종 또는 유전학적 라인에 대해 동정될 수 있도록 하여 바람직한 고기 특징 및/또는 동물의 일생에서 초기에 바람직한 동복산자수를 갖는 동물이 확인되도록 한다.
PRKAG3-199의 상이한 마커 유전자형은 PRKAG3 유전자내 다형성의 결과이며, 이는 뉴클레오타이드 595번 위치에서 구아닌에서 아데닌으로의 변이를 초래하고(서열번호: 7), 이는 발린에서 이소류신(아미노산 199)으로의 아미노산 변화를 일으킨다(서열번호: 8). 이러한 변이는 이어서 더 낮은 글리코겐, 락테이트 및 해당 포텐셜과 관련된 대립유전자 1에 제한 부위를 생성시킨다. 이러한 부위는 또한 하나 이상의 카피가 존재하는 경우에 동복산자수 증가와 상관되는 것으로 밝혀졌다.
PRKAG3-52의 상이한 마커 유전자형은 PRKAG3 유전자내 다형성의 결과이며, 이는 뉴클레오타이드 154번 위치에서 구아닌에서 아데닌으로의 변이를 초래하고(서열번호: 5)(아미노산 52), 이는 글리신에서 세린으로의 아미노산 변이를 일으킨다(서열번호: 6). 이러한 변화는 이어서 더 낮은 글리코겐, 락테이트 및 해당 포텐셜과 관련된 대립유전자 2에 제한 부위를 생성시킨다.
PRKAG3-30의 상이한 마커 유전자형은 PRKAG3 유전자내 다형성의 결과이며, 이는 뉴클레오타이드 89번 위치(서열번호: 3)(아미노산 30)에서 아데닌에서 시토신으로의 변이를 초래하고, 이는 아스파라긴에서 트레오닌으로의 아미노산 변이를 일으킨다(서열번호: 4). 이러한 다형성은 이미 보고되어 있으나, 육질 표현형과 상관되어 있음은 밝혀지지 않았다. 상기 트레오닌은 개선된 육질과 상당히 관련되어 있다.
본 발명은 동물의 경제적 가치가 있는 형질에 대한 유전자 마커에 관한 것이다. 이들 마커는 육질 형질 및/또는 동복산자수, 생식 형질과 상당히 관련되어 있는 대립유전자를 나타내며, 이에 따라 관련된 PRKAG3 유전자내의 다형성의 존재 또 는 부재를 확인함으로써 사육되는 경우에 보다 많은 동복산자수 또는 보다 우수한 육질(또는 둘 모두)을 생성할 수 있는 동물을 결정하기 위해 동물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 유전자 마커 및 특정 품종, 스트레인, 집단 또는 그룹의 동물내의 상기 마커를 확인하는 방법과 관련되며, 따라서, 암컷 동물은 특정 품종, 스트레인, 집단, 또는 그룹에 대해 평균 이상으로 현저히 증가된 동복산자수를 달성할 수 있을 것이다. 유사하게, 상기 방법은 바람직한 육질의 고기를 생산할 수 있을 동물을 확인하는데 사용될 수 있다.
이러한 마커의 존재 또는 부재를 확인하는 방법은 어떠한 방법이라도, 사용될 수 있으며, 예를 들어, SSCP(단일 가닥 입체형태적 다형성) 분석, BESS(염기 절제 서열 스캐닝), RFLP 분석, 헤테로듀플렉스 분석, 변성 구배 겔 전기영동 및 온도 구배 전기 영동, 대립유전자 PCR, 리가아제 연쇄 반응 직접 시퀀싱, 미니 시퀀싱, 핵산 하이브리드화, PRKAG3 유전자 또는 PRKAG3 유전자의 다른 연결 서열의 마이크로-어레이-타입 검출(micro-array-type detection)을 포함한다. 본 발명의 범위내에는 또한 이러한 다형성의 존재하에 일어나는 단백질 입체형태적 변화 또는 서열 변화를 검정하는 것을 포함한다. 이러한 다형성은 원인성 돌연변이일 수 있거나 아닐 수 있지만, 이러한 변화의 존재가 표시일 것이고, 표현형 차이에 대해 유전적 또는 단백질에 기초하여 검정할 수 있다.
하기에서는 본 발명의 다형성을 검정하는데 사용될 수 있는 기술을 전반적으로 검토하고 있다.
본 발명에서, 유전 물질의 샘플은 동물로부터 얻어진다. 샘플은 혈액, 조직, 정액 등으로부터 얻을 수 있다. 일반적으로, 말초혈 세포가 공급원으로서 사용되며, 유전 물질은 DNA이다. 충분량의 세포를 습득하여 분석을 위한 충분량의 DNA를 제공한다. 이러한 양은 당업자들이 인지하고 있으며 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 이러한 DNA는 당업자들에게 공지된 기술에 의해 말초혈 세포로부터 단리된다.
핵산의 단리 및 증폭
게놈 DNA의 샘플을, 타액, 협측 세포, 모근, 혈액, 제대 혈액, 양수, 간질액, 복강액, 융모막 융모, 및 손상되지 않은 간기 핵 또는 중기 세포를 갖는 기타 적합한 세포 또는 조직 샘플을 포함하는 통상적인 세포로부터 단리시켰다. 이들 세포는 신선하거나 보존된 기관으로부터, 또는 조직 샘플 또는 생검으로부터와 같은 단단한 조직으로부터 입수할 수 있다. 샘플은 방부제, 항응고제, 완충액, 고정화제, 영양제, 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 상호혼합하지 않는 특정 화합물을 함유할 수 있다.
이러한 여러 공급으로부터 게놈 DNA를 단리시키는 방법은 예를들어 문헌(Kirby, DNA Fingerprinting, An Introduction, W.H. Freeman & Co. New York(1992))에 기술되어 있다. 게놈 DNA는 또한 배양된 1차 또는 2차 세포 배양액으로부터 단리될 수 있거나, 상기 언급된 조직 샘플로부터 유래된 형질전환된 세포주로부터 단리될 수 있다.
동물 RNA 샘플 또한 사용될 수 있다. RNA는 상기 샘브룩(Sambrook) 등의 문 헌에 기술된 바와 같은 PRKAG3 유전자를 발현시키는 조직으로부터 단리될 수 있다. RNA는 전체 세포성 RNA, mRNA, 폴리 A+ RNA, 또는 이들의 조합일 수 있다. 가장 우수한 결과를 위해, RNA는 정제되나 또한 비정제된 세포질 RNA일 수 있다. RNA는 이후 증폭 주형으로서 사용되는 DNA를 형성하도록 역전사될 수 있으며, 이에 따라 RCR은 간접적으로 RNA 전사체의 특정 집단을 증폭시킨다[참조예: Sambrook, supra, Kawasaki et al., Chapter 8 in PCR Technology, (1992) supra, and Berg et al., Hum. Genet. 85:655-658(1990)].
PCR 증폭
증폭의 가장 일반적인 수단은 참고로 본원에 통합되는 미국 특허 제 4,683,195호, 제 4,683,202호, 제 4,965,188호에 기술되어 있는 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다. PCR이 혈액 세포의 표적 영역을 증폭시키는데 사용되는 경우에, 헤파린처리된 전혈은 다른 샘플로부터 분리된 밀봉된 진공 튜브로 흡입되고 청정 장갑으로 다루어져야 한다. 최상의 결과를 위해서, 혈액은 수집 즉시 처리되어야 하고, 이것이 불가능한 경우에는 사용시까지 4℃에서 밀봉된 용기에 유지되어야 한다. 다른 생리적 체액의 세포가 또한 검정되어질 수 있다. 이러한 임의의 체액을 사용하는 경우에 체액내의 세포는 원심분리에 의해 체액 성분으로부터 분리되어져야 한다.
조직은 5mm 페트리 디쉬에서 멸균된 1회용 외과용 메스와 멸균된 니들 (또는 두개의 외과용 메스)를 사용하여 대강 잘라야 한다. 조직 절편으로부터 파라핀을 제거하기 위한 방법은 당업자에게 널리 공지된 다양한 전문 안내서에 기술되어 있 다.
PCR에 의해 샘플의 표적 핵산 서열을 증폭시키기 위하여, 서열은 증폭 시스템의 구성성분에 접근가능해야 한다. 표적 DNA를 분리하기 위한 한 방법은 비교적 큰 샘플에 유용한 미가공 추출이다. 간략하게, 혈액 샘플로부터 얻은 단핵세포, 양막액으로부터 얻은 양막구, 배양된 융모 세포 등을 표준 방법에 의해 멸균 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 구배상에 층을 형성하여 분리한다. 간기 세포를 수집하여 DNA 추출전에 멸균 인산염완충액으로 3회 세척한다. 말초혈 림프구로부터 얻은 DNA를 시험할 때, 삼투압 충격(펠릿을 증류수로 10초간 처리)을 주고 첫 세척 후에 잔류 적혈구가 보일 때까지 추가 2회 세척하는 것이 제안된다. 이는 PCR 반응시에 헤모글로빈이 가지는 헴 기의 억제 효과를 방지할 것이다. PCR 시험이 샘플 수집 후에 즉각 수행되지 않는 경우에, 106 세포의 분취액을 멸균된 에펜도르프 튜브에서 펠릿화할 수 있고, 건조 펠릿을 사용시까지 -20℃에서 동결시킬 수 있다.
세포를 프로테나아제 K 100㎕/㎖이 첨가된 50mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% 트윈 20, 0.5% NP40의 완충액 중에 재현탁시킨다. 2시간동안 56℃에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 10분동안 95℃에서 가열시켜 프로테나아제 K를 불활성화시키고 즉시 젖은 얼음(snap-cool)으로 옮겼다. 큰 응집물이 존재하는 경우에 동일한 완충액에서 다른 사이클의 절단이 수행되어야 한다. 상기 추출물 중 10㎕가 증폭을 위해 사용되었다.
조직 예를 들어, 융모 세포 또는 컨플루언스를 이루도록 배양된 세포로부터 DNA를 추출하는 경우에, 프로테나아제 K를 가지는 상기 언급된 완충액의 양은 조직 샘플의 크기에 따라 달라질 수 있다. 추출물을 50℃ 내지 60℃에서 4 내지 10시간동안 인큐베이션하고, 다음에 10분동안 95℃에서 인큐베이션하여 프로테나아제를 불활성화시킨다. 더 긴 인큐베이션 동안에는, 신선한 프로테나아제 K를 원래 농도로 약 4시간후에 첨가하여야 한다.
샘플이 적은 수의 세포를 함유하는 경우에, 본원에 참고로 통합되는 문헌(Higuchi, "Simple and Rapid Preparation of Samples for PCR", in PCR Technology, Ehrlich, H.A. (ed.), Stockton Press, New York)에 기술된 방법에 의해 수행할 수 있다. PCR을 골수 및 말초혈 배양으로부터 얻은 개개 콜로니로부터 유래된 아주 적은 수의 세포(1000개 내지 5000개)의 표적 부위를 증폭하는데 사용할 수 있다. 샘플중의 세포를 PCR 용해 완충액(10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.1㎎/㎖ 젤라틴, 0.45% NP40, 0.45% 트윈 20)중에 현탁시키고 사용시까지 동결시킨다. PCR이 수행될 경우에, 프로테나아제 K(2㎎/㎖)의 0.6㎕를 PCR 용해 완충액중의 세포에 첨가한다. 다음에, 샘플을 약 60℃까지 가열하고 1시간동안 인큐베이션하였다. 10분동안 95℃로 샘플을 가열하여 프로테나아제 K를 불활성화하여 절단을 중단시키고 다음에 얼음에서 냉각시킨다.
PCR을 위하여 DNA를 추출하기 위한 비교적 용이한 방법은 문헌(Miller et al., Nucleic acids Res. 16:1215, 1998)으로부터 개선된 염석(salting out)과정이다. 단핵세포를 피콜-하이파크 구배상에서 분리한다. 세포를 3㎖의 용해 완충액(10mM Tris-HCl, 400mM NaCl, 2mM Na2 EDTA, pH 8.2) 3㎖ 중에 재현탁시킨다. 50㎕의 프로테나아제 K 용액(20㎎/㎖) 및 150㎕의 20% SDS 용액을 세포에 첨가하고 나서 약 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨다. 인큐베이션동안 튜브를 록킹(rocking)하는 것은 샘플의 절단을 증가시킬 것이다. 프로테나아제 K 절단이 밤새 인큐베이션후에 불완전할 경우(단편이 여전히 보이는 경우)에 20㎎/㎖ 프로테나아제 K 용액 50㎕를 추가로 용액중에 혼합시키고 회전하는 플랫폼상에서 또는 가볍게 록킹하면서 37℃에서 하루 밤 더 인큐베이션시킨다. 적절한 절단후에, 6M NaCl 용액 1㎖을 샘플에 첨가하고 세게 혼합한다. 생성된 용액을 3000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 펠릿은 침전된 세포 단백질을 함유하는 반면, 상층액은 DNA를 함유한다. 상층액을 4㎖의 이소프로판올을 함유하는 15㎖ 튜브로 옮겼다. 튜브의 내용물을 물 및 알코올 상이 혼합되고 백색 DNA 침전물이 형성될 때까지 가볍게 혼합시켰다. DNA 침전물을 제거하고 70% 에탄올중에 담가 가볍게 혼합하였다. DNA 침전물을 에탄올로부터 제거하고 공기 건조시켰다. 침전물을 증류수에 놓고 용해시켰다.
PCR을 위한 고분자량 DNA의 추출용 키트에는 게놈 단리 키트 A.S.A.P.(Genomic Isolation Kit A.S.A.P., Boehringer Manheim, Indianapolis, Ind.), 게놈 DNA 단리 시스템(GIBCO BRL, Gaithersburg, Md), Elu-Quick DNA 정제 키트(Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), DNA 추출 키트(Stratagene, LaJolla, Calif), 터보겐 단리 키트(TurboGen Isolation Kit, Invitrogen, San Diego, Calif.) 등이 포함된다. 제조자의 지시에 따른 이들 키트의 사용은 본 발명의 방 법을 수행하기 전에 DNA를 정제하는데 일반적으로 허용된다.
추출된 DNA의 농도 및 순도는 260nm 및 280nm에서 희석된 분취액의 흡광도를 분광 분석하여 측정할 수 있다. DNA의 추출 후에, PCR 증폭이 계속될 수 있다. PCR의 각 사이클의 첫 단계는 프라이머 신장에 의해 형성된 핵산 이중가닥의 분리를 포함한다. 가닥이 분리되면, PCR의 다음 단계는 표적 서열을 플랭킹하는 프라이머로 분리된 가닥을 하이브리드화하는 것을 포함한다. 다음에 프라이머는 신장되어 표적 가닥의 상보적인 카피를 형성한다. 연속적인 PCR 증폭을 위하여, 프라이머를 각 프라이머가 이중 서열을 따라 하이브리드화하는 위치가 하나의 프라이머로부터 합성된 신장된 생성물이 주형(상보체)으로부터 분리된 경우에 다른 프라이머의 신장을 위한 주형으로서 역할하도록 하는 위치가 되도록 고안한다. 변성, 하이브리드화, 및 신장 사이클은 원하는 양의 증폭된 핵산을 수득하기에 필요한 만큼 여러 차례 반복된다.
PCR 증폭의 특히 유용한 구체예에서, 가닥 분리는 충분한 시간동안 충분히 고온으로 반응을 가열시켜 이중가닥의 변성을 유발하나 중합효소의 가역적인 변성은 유발하지 않음으로서 수행된다(참고: 참고로 본원에 통합된 미국 특허 제 4,965,188호). 통상적인 열 변성은 수 초 내지 수 분의 약 80℃ 내지 105℃의 온도와 관련된다. 그러나, 가닥 분리는 물리적, 화학적 또는 효소적 수단을 포함하는 임의의 적합한 변성 방법에 의해 수행될 수 있다. 가닥 분리는 헬리카제, 또는 예를 들어 헬리카제 활성을 보일 수 있는 효소에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 효소 RecA 는 ATP의 존재하에 헬리카제의 활성을 가진다. 헬리카제에 의한 가 닥 분리에 적합한 반응 조건은 당 기술분야에 공지되어 있다(참고: Kuhn Hoffman Berling, 1978, CSH-Quantitative Biology, 43: 63-67; 및 Radding, 1982, Ann. Rev. Genetics 16: 405-436; 각각은 본원에 참고로 통합됨).
PCR에서 프라이머의 주형-의존 신장은 적절한 염, 금속 양이온 및 pH 완충 시스템으로 구성된 반응 매질 중의 적절한 양의 4개의 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(통상적으로 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP)의 존재하에 중합제에 의해 촉매된다. 적합한 중합제는 주형-의존 DNA 합성을 촉매하는 것으로 공지된 효소이다. 일부 경우에, 표적 부위는 세포에 의해 발현되는 단백질의 일부 이상을 엔코딩할 수 있다. 이러한 경우에, mRNA는 표적 부위의 증폭을 위하여 사용될 수 있다. 대안적으로, PCR은 추가의 증폭을 위해 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있고, 프라이머 신장을 위한 초기 주형은 RNA이다. RNA 주형으로부터 상보적인 카피-DNA(cDNA) 서열을 합성하기에 적합한 중합제는 역전사효소(RT), 예를 들어, 조류 미에로블라스토시스 바이러스 RT, 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스 RT, 또는 테루무스 써머필러스(Tth) DNA 중합효소, 퍼킨 엘머 세투스, 인크.(Perkin Elmer Cetus, Inc.)에서 상용 역전사효소 활성을 가지는 열안정성 DNA 중합효소이다. 통상적으로, 게놈 RNA 주형은 단지 DNA 주형만을 남기는 초기 역전사 단계 후에 제 1 변성 단계 동안 열 손상된다. DNA 주형으로 사용되는 적합한 중합효소에는 예를 들어 E. coli DNA 중합효소 I 또는 이의 클레노우(Klenow) 단편, T4 DNA 중합효소, Tth 중합효소, 및 써머스 아큐아티쿠스로부터 분리되어 퍼킨 엘머 세투스, 인크.에서 상용 열-안정성 DNA 중합효소인 Taq 중합효소가 포함된다. 후자의 효소는 핵산의 증폭 및 시퀀싱에 널리 사용된다. Taq 중합효소를 사용하기 위한 반응 조건은 당 기술분야에 공지되어 있고 문헌(Gelfand, 1989, PCR Technology, supra)에 기술되어 있다.
대립유전자 특이적 PCR
대립유전자-특이적 PCR은 변이 또는 다형성의 존재 또는 부재시에 상이하게 나타나는 표적 부위를 차별화시킨다. 표적 서열의 특정 대립유전자에만 결합하는 PCR 증폭 프라이머를 선택한다. 이 방법은 문헌(Gibbs, Nucleic Acid Res. 17: 12427-2448, 1989)에 기술되어 있다.
대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 스크리닝 방법
추가 진단 스크리닝 방법은 문헌(Saiki et al., Nature 324: 163-166, 1986)에 기술된 바와 같이 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드(ASO)를 사용한다. 하나 이상의 염기쌍 미스매치를 보이는 올리고뉴클레오티드를 임의의 특정 대립유전자을 위하여 생성한다. ASO 스크리닝 방법은 돌연변이 올리고뉴클레오티드에 비해 올리고뉴클레오티드의 감소된 결합을 보이는 변이형 표적 게놈 또는 PCR 증폭된 DNA와 비변이형 올리고뉴클레오티드사이의 불일치를 검출한다. 낮은 엄격도하에서 대립유전자의 모든 다형성 형태에 결합하지만 높은 엄격도하에서는 대응하는 대립유전자에만 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안할 수 있다. 대안적으로, 본질적으로 두가지 반응을 얻을 수 있는 엄격도 조건이 고안될 수 있는데, 예를 들어 표적 유전자의 변이형에 대응하는 ASO는 그 대립유전자과 하이브리드화하고, 야생형 대립유전자과는 하이브리드화하지 않을 것이다.
리가아제 매개 대립유전자 검출 방법
시험 피검체의 DNA의 표적 부위는 리가아제-매개 대립유전자 검출에 의해 질환이 없거나 질환이 있는 패밀리 구성원의 표적 영역과 비교될 수 있다(참고: Landergren et al., Science 241: 107-1080, 1998). 리가아제는 또한 문헌(Wu et al., Genomics 4: 560-569, 1989)에 기술된 연결 증폭 반응에서 점돌연변이를 검출하는데 사용된다. 연결 증폭 반응(LAR)은 문헌(Wu, supra, and Barany, Proc. Nat. Acad. Sci. 88:189-193, 1990)에 기술된 바와 같이 주형 의존 연결의 연속적인 반응을 사용하여 특정 DNA 서열의 증폭을 사용한다.
변성 구배 겔 전기영동
중합효소 연쇄 반응을 사용하여 생성된 증폭 생성물은 변성 구배 겔 전기영동의 사용에 의해 분석될 수 있다. 상이한 대립유전자는 상이한 서열-의존 용융 특성 및 용액중의 DNA의 전기영동 이동에 기초하여 동정될 수 있다. DNA 분자는 증가된 온도 또는 변성 조건하에서 용융 도메인이라 불리는 부분에서 용융된다. 각 용융 도메인은 분리된 염기-특이적 융점(TM)에서 상호적으로 용융된다. 용융 도메인은 그 길이가 20 염기쌍 초과하고, 수 백 염기쌍에 달할 수 있다.
서열 특이적 용융 도메인 차이에 기초한 대립유전자간의 차이는, 본원에 참고로 통합되는 내용인 문헌(Erlich, ed., PCR Technology, Principle and Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman and Co., New York, 1992)의 7장에 기술된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 평가될 수 있다.
일반적으로, 변성 구배 겔 전기영동에 의해 분석되는 표적 영역은 표적 영역 을 플랭킹하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭된다. 증폭된 PCR 생성물은, 본원에 참고로 통합되는 내용인 문헌(Myers et al., Meth. Enzymol. 155:501-527, 1986) 및 문헌(Myers et al., in Genomic Analysis, A Practical Approach, K. Davies Ed. IRL Press Limited, Oxford, pp95-139, 1998)에 기술된 바와 같이, 선형 변성 구배를 가지는 폴리아크릴아미드 겔에 적용된다. 전기영동 시스템은 표적 서열의 용융 도메인의 Tm보다 다소 낮은 온도에서 유지된다.
변성 구배 겔 전기영동의 대안적인 방법에서, 표적 서열은 처음에 상기 Erlich의 7장에 기술된 바와 같이 GC 클램프라 불리는 GC 뉴클레오티드 스트레치에 부착될 수 있다. 바람직하게는, GC 클램프의 뉴클레오티드의 80% 이상은 구아닌이거나 시토신이다. 바람직하게는 GC 클램프는 30염기쌍이상이다. 이러한 방법은 특히 높은 Tm을 가지는 표적 서열에 적합하다.
일반적으로 표적 영역은 상기에 기술된 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머 중 하나는 5'말단에 30 염기쌍 이상의 GC 풍부 서열인 GC 클램프 부위를 가지고, 이는 증폭시에 표적 부위의 5'로 삽입된다. 생성된 증폭 표적 부위를 상기 기술된 바와 같이 변성 구배 조건하에서 전기영동 겔 상에 런닝시켰다. 하나의 염기 차이로 다른 DNA 단편은 겔을 통과하여 다른 위치로 이동할 것이고, 이는 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화될 수 있다.
온도 구배 겔 전기영동
온도 구배 겔 전기영동(TGGE)은 변성 구배가 화학 변성제의 농도를 달리하는 대신에 온도를 달리하여 생성되는 것을 제외하고는 변성 구배 겔 전기영동과 동일 한 원리에 기초한다. 표준 TGGE는 전기영동 패쓰(path)를 따라 런닝하는 온도 구배를 가지는 전기영동 장치를 사용한다. 샘플이 일정한 농도의 화학 변성제를 함유한 겔을 통하여 이동함에 따라 샘플은 증가된 온도하에 있게 된다. TGGE의 대안적인 방법인 일시적인 온도 구배 겔 전기영동(TTGE 또는 tTGGE)은 전체 전기영동 겔의 천천히 증가하는 온도를 사용하여 동일한 결과를 달성한다. 샘플이 겔을 통하여 이동함에 따라, 전체 겔의 온도가 증가하고 이는 샘플이 겔을 통과할 때 증가된 온도하에 있도록 한다. GC 클램프의 혼입과 생성물의 가시화와 함께 PCR 증폭을 포함하는 샘플의 제조는 변성 구배 겔 전기영동을 위한 것과 동일한 것이다.
단일 가닥 입체형태적 다형성 분석
PRKAG3 좌위에서 표적 서열 또는 대립유전자가 단일 가닥 구조 다형성 분석을 사용하여 구별될 수 있고, 이는 문헌(Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2766-2770, 1989)에 기술된 바와 같이, 단일 가닥 PCR 생성물의 전기영동에 의한 이동상의 차이에 의해 염기 차이를 구별한다. 증폭된 PCR 생성물은 상기 기술된 바와 같이 생성될 수 있고, 가열되거나 다른 방법으로 변성되어 단일 가닥 증폭 생성물을 형성한다. 단일 가닥 핵산은 리폴딩(refolding)하거나 염기 서열에 부분적으로 의존하는 2차 구조를 형성할 수 있다. 이와 같이, 단일 가닥 증폭 생성물의 전기영동에 의한 이동은 대립유전자 또는 표적 서열간에 염기 서열 차이를 검출할 수 있다.
미스매치의 화학적 또는 효소적 절단
표적 서열간의 차이는 또한 문헌(Grompe et al., Am. J. Hum. Genet. 48:212-222, 1991)에 기술된 바와 같이 미스매치 염기 쌍의 차별적인 화학적 절단에 의해 검출될 수 있다. 다른 방법에서, 표적 서열간의 차이는 문헌(Nelson et al., Nature Genetics 4: 11-18, 1993)에 기술된 바와 같이 미스매치 염기쌍의 효소적 절단에 의해 검출될 수 있다. 요약컨대, 동물 및 질환을 가진 패밀리 구성원으로부터 얻은 유전 물질은 미스매치가 없는 헤테로하이브리드 DNA 이중가닥을 생성하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 "헤테로하이브리드"는 한 동물로부터 얻은 제 1 DNA 가닥과 통상 대상 특성에 대한 형질이 다른 동물인 다른 동물로부터 얻은 제 2 DNA 가닥을 포함하는 DNA 이중가닥을 의미한다. 미스매치가 없는 헤테로하이브리드를 위한 양성 선별은 작은 삽입, 결실 또는 PRKAG3 다형성과 관련될 수 있는 다른 다형성의 추정을 가능하게 한다.
비-겔(Non-gel) 시스템
다른 가능한 기술에는 TaqManTM(Perkin Elmer)와 같은 비-겔 시스템을 포함된다. 이 시스템에서 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 문제의 돌연변이를 플랭킹하여 그 부위의 PCR 증폭이 가능하게 하도록 고안된다. 다음에, 제 3 올리고뉴클레오티드 프로브는 유전자의 상이한 대립유전자간에 변화되기 쉬운 염기를 함유하는 부위에 하이브리드화되도록 고안된다. 상기 프로브는 5' 및 3' 말단 둘 모두에 형광 염료로 표지된다. 이들 염료는 서로가 근접하게 있는 경우에 이들 중 하나의 형광은 다른 것에 의해 켄칭되어 검출될 수 없도록 선택된다. 프로브에 상관적인 주형의 5'에 위치한 PCR 프라이머로부터 Taq DNA 중합효소에 의한 신장은 Taq DNA 중합효소의 5' 뉴클리아제 활성을 통하여 어닐링(anealing)된 프로브의 5' 말단에 부착된 염료를 절단시킨다. 이는 켄칭 효과를 제거하여 프로브의 3' 말단의 염료로부터의 형광을 검출할 수 있도록 한다. 상이한 DNA 서열간의 차이는 주형 분자에 대한 프로브의 하이브리드화가 완전하지 않은 경우 예를 들어, 일부 형태의 미스매치가 있는 경우에, 염료의 절단은 일어나지 않는다는 사실을 통하여 발생한다. 이와 같이, 올리고뉴클레오티드 프로브의 뉴클레오티드 서열은 이것이 결합되는 주형 분자에 완전히 상보적인 경우에만 켄칭 효과가 제거될 수 있다. 반응 혼합물은 두개의 상이한 프로브 서열을 함유할 수 있고, 이것은 존재해야 하는 상이한 대립유전자에 대하여 고안되어 한 반응에서 두개의 대립 유전자의 검출을 가능하게 한다.
또 다른 기술에는 효소적 형광 방출에 의하는 등온 증폭을 포함하는 인베이더 검정(Invader Assay)이 포함한다. www.twt.com 에서 Third Wave Technology를 참조할 수 있다.
PCR에 의하지 않은 DNA 진단
PRKAG3에 연결된 DNA 서열은 동물 및 패밀리 구성원의 제한 단편 길이 다형성을 포함하는 다형성에 기초하여 증폭 단계없이 수행될 수 있다. 하이브리드화 프로브는 일반적으로 표적 핵산의 모두 또는 일부에 상보적인 염기쌍을 통하여 결합하는 올리고뉴클레오티드이다. 프로브는 통상적으로 하이브리드화 조건의 엄격도에 따라 프로브 서열과의 완전한 상보성이 부족한 표적 서열에 결합한다. 프로브는 바람직하게는 직접 또는 간접적으로 표지되어 프로브의 존재 또는 부재에 대 한 검정에 의해 표적 서열의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 직접적인 표지 방법에는 32P 또는 35S와 같은 방사성동위원소 표지가 포함된다. 간접적인 표지 방법에는 형광 태그, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 결합할 수 있는 바이오틴 복합체 또는 펩티드 또는 단백질 태그가 포함된다. 시각 검출 방법에는 발광물질, 텍사스 레드, 로다민 및 이의 유도체, 레드 류코 다이 및 e, e', 5, 5'-5354아메틸벤질리딘(TMB), 플루오로세인(Fluorescein) 및 이의 유도체, 단실(dansyl), 움벨리페론(umbelliferone) 등 호오스 래디쉬 퍼옥시다제, 알카라인 포스파타아제 등이 포함된다.
하이브리드화 프로브에는 PRKAG3가 있는 돼지 염색체에 하이브리드화할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열이 포함되어, 제한 단편 길이 다형성, 초가변 영역, 반복 엘리먼트, 또는 다양한 수의 텐덤 리피트(tandem repeat)를 포함하는, PRKAG3에 연결된 유전자 마커를 형성한다. 하이브리드화 프로브는 임의의 유전자 또는 적합한 유사체일 수 있다. 추가의 적합한 하이브리드화 프로브에는 엑손 단편 또는 cDNA의 일부, 또는 염색체의 해당 부위에 대한 지도로 공지된 유전자가 포함된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 반복단위 부위 하이브리드화 프로브는 높은 엄격도 하이브리드화 조건에서 특정 좌위에서 적은 수의 단편을 인식하는 것이거나, 엄격도 조건이 낮아진 경우에 그 좌위에서 보다 많은 수의 단편을 인식하는 것이다.
하나 이상의 추가적인 제한 효소 및/또는 프로브 및/또는 프라이머가 사용될 수 있다. 추가적인 효소, 제작된 프로브 및 프라이머는 당업자에 의한 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.
본원에 기술된 방법이 단일 제한 효소 및 단일 세트의 프라이머의 사용에 의할 수 있으나, 이 방법에 제한된 것은 아니다. 요망되는 경우, 하나 이상의 추가적인 제한 효소 및/또는 프로브 및/또는 프라이머가 사용될 수 있다. 일부 상황에서는 실제로 특정 일배체형을 제공하는 마커의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 추가의 효소, 제작된 프로브, 및 프라이머는 본원에 제시되고 삽입된 기술과 조합하여 일상적인 실험을 통하여 결정될 수 있다.
본 발명에 따라, PRKAG3 유전자의 다형성은 육질 및 동복산자수와 관련된 것을 가지는 것으로 동정되었다. 일 구체예에서, 마커의 존재 또는 부재는 제한 엔도뉴클리아제를 사용하여 PCR RFLP에 의해 검정될 수 있고, 증폭 프라이머는 다형성을 둘러싸는 부위의 높은 상동성으로 인하여 PRKAG3에 대한 인간 유사체, 돼지 또는 다른 관련된 유전자를 사용하여 고안될 수 있거나, 진뱅크(GenBank)에 예시된 공지된 PRKAG3 유전자 서열 데이터를 사용하여 고안될 수 있거나 심지어 본원의 기술 및 참조에 기초한 밀접하게 둘러싸는 유전자로부터의 연관 데이터로부터 얻을 수 있는 서열로부터 고안될 수 있다. 다형성을 둘러싸는 서열은, 다형성에 바로 인접한 서열로부터 취해진 약 4개 내지 30개의 연속적인 염기를 가지는 프라이머가 요망되는 제한 효소로 처리되기 전에 그 부위를 크게 증폭시키는 중합효소 연쇄 반응과 함께 사용될 수 있는 대체 PCR 시험의 개발을 용이하게 할 것이다. 프라이머는 정확한 상보성을 필요로 하는 것은 아니고; 상당히 대응하는 서열이면 족하다. PCR에 의한 증폭을 위한 프라이머의 고안은 당업자에게 공지되어 있고 문헌(Ausubel, "Short Protocols in Molecular Biology, Fourth Edition" John and sons 1999)에 상세한 것이 논의되어 있다. 하기는 프라이머 고안의 간략한 설명이다.
프라이머 고안 전략
중합효소 연쇄 반응(PCR)법의 사용이 증가됨으로써, PCR의 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오티드의 선택 또는 고안에 도움을 주기 위해 많은 프로그램의 개발이 고무되어 왔다. 인터넷을 통해 자유롭게 입수가능한 그러한 프로그램의 4가지 예로서 하기의 것들이 있다: PRIMER (화이트헤드 인스티튜트의 마크 델리 및 스티븐 링콜른에 의해 개발됨: UNIX, VMS, DOS 및 매킨토시 버전으로 사용가능함), 올리고뉴클레오티드 선택 프로그램(OSP)(세인트 루이스에 소재한 워싱톤 유니버시티의 필 그린 및 라디나 힐러에 의해 개발됨: UNIX, VMS, DOS 및 매킨토시 버전으로 사용가능함), PGEN (요시: 오로지 DOS 버전으로 사용가능함), 앰플리파이(Amplify)(위스콘신 유니버시티의 빌 엥글: 오로지 매킨토시 버전으로 사용가능함). 일반적으로 이러한 프로그램은, 공지된 약간의 반복 서열 엘리먼트를 조사한 후에, 추정되는 프라이머의 길이 및 GC 함량을 분석하여 Tm을 최적화시킴으로써, PCR 프라이머의 고안시에 도움을 준다. 상업용 소프트웨어를 또한 입수할 수 있으며, 급속하게 실시되는 프라이머 선택 과정에는 가장 일반적인 서열 분석 팩키지가 포함된다.
시퀀싱 및 PCR 프라이머
시퀀싱 또는 PCR 프라이머 중 어느 하나로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 고안하는 경우에 표적을 특이적으로 인식하는 적당한 서열을 선택한 다음, 올리고뉴클레오티드가 안정한 2차 구조를 가질 가능성을 제거하기 위해 서열을 시험해야 한다. 서열 중에서 인버팅 반복단위를 반복 동정 또는 상기한 바와 같은 RNA-폴딩 프로그램을 사용하여 동정할 수 있다[참조: 핵산 구조 예측]. 가능성있는 줄기 구조가 확인되는 경우, 프라이머의 서열은 예측된 2차 구조를 최소화시키는 어느 하나의 방향으로 일부 뉴클레오티드를 이동시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 또한 적당한 벡터 및 삽입 DNA의 양 가닥의 서열과 비교되어야 한다. 확실하게, 서열화되는 프라이머는 표적 DNA에 대해 단일 매칭되어야 한다. 또한, 목적하지 않는 표적 DNA 서열과 단지 단일 미스매칭되는 프라이머를 배제하는 것도 고려된다. 게놈 DNA를 증폭시키는데 사용된 PCR 프라이머에 대해서, 프라이머 서열을 임의의 상당한 매칭이 일어나는지의 여부를 결정하기 위해 진뱅크 데이터베이스내 서열과 비교해야 한다. 올리고뉴클레오티드 서열이 임의의 공지된 DNA 서열, 또는 보다 중요하게는 임의의 공지된 반복 엘리먼트 내에 존재하는 경우, 프라이머 서열을 변화시켜야 한다.
또한, 본 발명의 방법 및 물질을 돼지 DNA, 유전학적인 유형의 개별적인 돼지를 평가하여, 돼지 내에서 유전학적인 차이를 검출하는데 보다 일반적으로 사용할 수 있다. 특히, 돼지 게놈의 DNA 샘플은, PRKAG3 유전자 내의 다형성이 존재하는지의 여부를 결정하기 위한 하나 이상의 대조표준에 대한 참조에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게는, RFLP 분석이 돼지 PRKAG3 유전자에 대해서 실시되고, 그 결과를 대조표준과 비교한다. 상기 대조표준은 돼지 PRKAG3 유전자의 다형성이 공지되어 있는 상이한 돼지의 돼지 PRKAG3 유전자를 RFLP 분석한 결과이다. 마찬가지로, 돼지의 PRKAG3 유전자형은 이것의 게놈 DNA 샘플을 수득하고, DNA 내에서 PRKAG3 유전자를 RFLP 분석한 다음, 이것의 결과를 대조표준과 비교함으로써 결정될 수 있다. 또한, 상기 대조표준은 상이한 돼지의 PRKAG3 유전자를 RFLP 분석한 결과이다. 상기 결과로부터, 돼지의 PRKAG3 유전자 내의 다형성을 특정함으로써 돼지의 타입이 유전학적으로 결정된다. 종국적으로, 돼지 중에서의 유전학적 차이는 2마리 이상의 돼지로부터의 게놈 DNA 샘플을 입수하여, PRKAG3 유전자 내의 다형성의 존재 또는 부재를 확인하고, 그 결과를 비교함으로써 검출될 수 있다.
이러한 분석은 상기 논의된 바와 같이 육질과 관련된 유전자 마커를 확인하고, 동복산자수와 같은 그밖의 특징과 상호연관될 수 있는 PRKAG3 유전자 내에서의 그밖의 다형성을 확인하고, 돼지의 유전자형과 표현형을 과학적이면서 일반적인 방법으로 분석하는데 유용하다.
본 발명의 유전자 마커, 방법 및 신규한 대립 유전자는 또한 육질 및/또는 돼지의 품종, 라인 또는 집단에 있어서의 생식 효율(동복산자수)을 개선시키기 위한 번식 프로그램에 유용하게 사용된다. 일부 경우에, 또한 바람직한 육질과 연관된 다형성에 대해 적어도 이형 접합성이며 바람직하게는 동형 접합성인 종을 연속적으로 선택하고 번식시킴으로써 동복산자수가 개선될 것이다. 이것은 실시예 2에서 연구된 집단에 적용될 것이다.
이러한 다형성을 지니는 동물의 동복산자수/육질에 대한 효과를 보유하고 있는 이로운 형질과 긍정적으로 또는 부정적으로 연관되어 있는 다형성을 갖는 것으로 확인된 특정 유전자가 본원의 실시예 및 방법에 개시되어 있다. 유전자 내에서 다형성의 존재는, 종종 특정 대립 유전자 형태에서 제한 부위에서 야기되는 단일 염기 대체물에 의해 확인된다. 그러나, 본원에서 입증되고 논의된 바와 같은 특정의 대립 유전자는 동일한 다형성 (대립 유전자)의 지표에 대해서 분석될 수 있었던 것과 연관된 다수의 염기 변화를 보유할 수 있다. 또한, 그밖의 유전자 마커 또는 유전자는 본원에 개시된 다형성과 연관되어, 기타 유전자 또는 유전자 단편의 동정에 대해 분석될 수 있으나, 이것은 궁극적으로 동일한 다형성에 대한 동물의 유전학적 특성에 따라 달라진다. 본원에 개시된 대립 유전자 차이에 기초하여 동물을 분류하고 확인하는 임의의 분석은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
일단 다형성 및 확립된 특정 형질에 대한 상호연관성이 확인되고 나면, 당업자는 이러한 다형성에 대해 동물의 유전자형을 결정하는 다양한 방법이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 대안적인 시험의 고안은 당업계에 공지된 파라미터가 최적화되어 있다는 것을 나타내며, 이는 본원에 충분히 기술된 본 발명의 범주내에 있을 것이다.
재료 및 방법
혈통, 연관 및 QTL 맵핑: 본 발명자는 버크셔 및 요크셔(BxY) 돼지 품종을 이종교배시켜 525마리의 F2 자손을 출산시키고, 인터벌 맵핑법(참조: Haley et al., 1994)을 사용하여 육질에 대한 QTL을 맵핑(참조: Malek et al., 2001)시키기 위해 이 혈통을 사용하였다. 이러한 이종교배에서, 버크셔 품종은 특히 pH, 색상, 함수율 및 부드러움의 측면에서 양호한 육질을 갖도록 선택되었다. PRKAG3 유전자를 CRI-MAP(버전 2.4) 맵핑 프로그램(참조: Green et al., 1990)을 사용하여 BxY 패밀리 연관 지도에 대해 맵핑하였다. PRKAG3 부위 정보를 포함하는 인터벌 맵핑법(참조: Haley et al., 1994)을 돼지 15번 염색체(SSC 15)(도 1)에 대해 육질의 QTL을 맵핑하는데 사용하였다. QTL 효과를 추정하였고, 이것은 평균 요크셔 대립 유전자 효과에 대해 비교한 버크셔 대립 유전자 효과를 나타내었다.
조직 샘플 및 DNA/RNA 단리: 혈액 샘플 및 표현형을 수집하고, 몇몇의 F8 동물로부터의 후지와 요부로부터의 혈액 샘플과 근육 조직과 함께, 이종교배 패밀리(참조: Malek et al., 2001)로부터 F0, F1 및 F2 동물에 대해 기록하였다. 또한, 본 발명자는 돼지(랜드레이스, 라지 화이트, 듀록, 듀록 합성종 및 버크셔)의 5종의 상이한 상용 라인으로부터의 혈액 샘플의 다량의 수집물을 수득하였다. 게놈 DNA를 표준 탈염 과정에 의해 전체 혈액 샘플로부터 단리시키고, 전체 RNA를 제조업자의 지시(GIBCO/BRL, Rockville, MD)에 따라 TRIzol 시약법을 사용하여 후지 및 요부 근육 조직으로부터 추출하였다.
PCR, RT-PCR, RACE 및 다형성의 발견: 진뱅크(AF214521)에서 입수가능한 PRKAG3 돼지 유전자 서열을 기초로, 본 발명자는 PRKAG3 유전자의 전체 코딩 영역 을 증폭시키기 위한 프라이머를 고안하였다. 상기 PCR 반응을, 12.5ng의 돼지 게놈 DNA, 1.5mM MgCl2, 0.125mM dTNP, 각각 0.3μM의 프라이머 및 0.35U의 Taq DNA 중합효소(Promega, Medison, WI) 및 PCR 완충액(10mM Tris-HCl, 50mM KCl 및 0.1% Triton®X-100)을 10㎕의 최종 부피로 사용하여 실시하였다. 전체 RNA(3.5㎍)를 제조업자의 프로토콜(프라이머: 세트 A: 정방향 5'ATGAGCTTCCTAGAGCAAGGAG3' 및 역방향 5'CAGGTCTCAATCTTATGTTCTTC3'; 세트 B: 정방향 5'CGTCCGAGCGGCACCTTTGT3' 및 역방향 5'AAGGTTCCAAGGTTCTCAGGC3')에 따라 무작위 헥사뉴클레오티드 프라이밍 및 수퍼스크립트 II (GIBCO/BRL, Rockville, MD)에 의해 역전사시켰다. cDNA 말단의 5' 신속한 증폭(RACE) 실험은 제조업자의 지시에 따라 FirstChoice RLM-RACE kit(Ambion, Austin, TX)를 사용하여 수행한 후에, PCR 생성물 (유전자 특이적인 프라이머: 외부 5'CCCACGAAGCTCTGCTTCTT3' 및 내부 5'TCCTTGCTCTAGGAAGCTCAT3')을 서열화시킴으로써 수행되었다. 앰플리콘(amplicon)을 염료 터미네이터(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 ABI 377 자동 시퀀서 상에서 시퀀싱하였다. 본 발명자는 서열을 어셈블링하고 다형성을 확인하기 위해 시퀀서 소프트웨어(Gene Codes Corporation, version 4.0.5, Ann Arbor, MI)를 사용하였다.
유전자형 결정 및 PCR-RFLP 분석: 각각 분석된 미스센스 돌연변이를 플랭킹하는 영역을 T30N 및 G52S 치환체에 대한 동일한 쌍의 프라이머(정방향 5'ATGAGCTTCCTAGAGCAAGGAG3' 및 역방향 5'GGCTGCATGATGTTATGTGCCT3') 및 I199V에 대해 상이한 쌍의 프라이머(정방향 5'GGAGCAAATGTGCAGACAAG3' 및 역방향 5'CCCACGAAGCTCTGCTTCTT3')를 사용하여 증폭시켰다. (I199V에 대한) BsaHI, (G52S에 대한) HphI 및 (T30N에 대한) StyI 제한 효소를 사용하여 절단시킨 후에, 절단된 PCR 생성물을 4%의 NuSieve 아가로오스(FMC, Rockland, ME) 겔 상에서 분리시키고, 에티듐 브로마이드를 사용하여 염색시켰다. SINE 다형성에 대해서, PCR 증폭(프라이머: 정방향 5'GAAACTCTTCTCCCCACAGAC3' 및 역방향 5'GGCTGCATGATGTTATGTGCCT3')을 실시한 후에, 1% 아가로오스(AMRESCO, Solon, OH) 겔 상에서 생성물을 분리시켰다. 이러한 다형성에 대한 유전자형을 결정한 후에, RN- 또는 200Q 대립 유전자를 확인할 기회를 증가시키도록 일배체형 2(표 2)를 갖는 모든 동물을 또한 R200Q 치환체에 대해 유전자형을 결정하였다[참조: Milan et al., 2000]. 200Q 대립 유전자에 대한 2개의 동형 접합체 및 4개의 캐리어를 발견하였고, 이들을 추가의 통계적인 분석치로부터 제거하여, RN- 돌연변이가 그밖의 치환체에 대한 본 발명자의 분석법에 영향을 끼치지 않도록 하였다. R200Q 치환체에 대해서, 본 발명자는 I199V 돌연변이에 대해서와 동일한 프라이머를 사용하였고, BsrBI 제한 효소를 사용하여 절단시켰다. 최종적인 확인사항으로서, 상이한 일배체형을 갖는 약 100마리의 동물 중 무작위 샘플을 또한 R200Q 치환에 대해 스코어링하였으나, 어떠한 동물도 200Q 대립 유전자를 보유하고 있지는 않았다.
표현형 형질 측정: BxY 패밀리에 대한 표현형을 전형적인 기술(참조: Malek et al., 2001)을 사용하여 측정하였는데, 여기에는 pH, 색상 및 해당 포텐셜이 포 함되었다. 5종의 상용 라인으로부터 입수한 돼지에 대해, 상용 팩킹 플랜트에서 데이터를 수집하고, 개별적인 고기의 컬러(안심 및 햄 반사율- 이 값이 낮을수록 바람직함) 및 음식을 공급하지 않고 24시간이 경과한 후에 개별적인 요부 및 후지의 pH를 수득하였다. 패키징 플랜트에서 수득한 데이터에 대해서는, 글리코겐 또는 해당 포텐셜을 전혀 측정하지 않았다. 색상 및 pH 표현형 형질의 측정은 글리코겐 및 해당 포텐셜과 간접적으로 상호연관되는 육질의 일반적인 측정이다.
통계학적 분석
-버크셔 ×요크셔 F 2 집단 분석: PRKAG3 I199V 치환체와, 글리코겐, 락테이트, 해당 포텐셜 사이에서의 연관성 및 BxY F2 집단에서의 육질 형질을 댐(dam), 도살 일자, 성별 및 I199V 유전자형이 포함된 모델을 사용하는 일반적인 선형 모델 절차(SAS®procedure GLM, SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 시험하였다. 3개 모두의 유전자형에 대한 최소 제곱 평균을 I199V 치환에 대해서 수득하였다.
- 상용 라인 분석: PRKAG3 다형성 사이의 연관성과 육질 형질을, 무작위 효과로서 사이어(sire), 고정적인 효과로서 도살일자 및 마아커 유전자형(들)을 항상 포함하는 모델을 사용하는 혼합 모델 절차(SAS®procedure MIXED, SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 시험하였다. 교배 라인 분석에 대한 고정 효과로서 라인을 추가하였다. 모든 형질이 암컷에 대해서만 측정되고 단지 하나의 사육장이 각각의 도살 일자에 대해 표시되기 때문에, 성별 및 사육장은 포함되지 않았다. 수컷은 본 분석법의 이 부분에는 사용되지 않았으나, BxY에서의 본 발명의 결과로 부터 유전자형 효과에 성별이 포함되지 않았다는 것을 알 수 있다. 3개의 치환 부위 각각에 대한 개별적인 유전자형 효과를 포함하는 풀 모델을 5종의 상용 라인을 넘나들며 다양하게 구비하였다. 어떠한 현저한 유전자형 효과도 육질 형질에 관한 효과와 관련된 치환체를 확인하기 위한 역방향 제거(제거하기 위한 p ＞ 0.10)에 의해 제거되지 않았다.
3개의 유전자형 클래스에 대한 최소 제곱(LS) 평균을 개별적으로 분석된 치환체 각각에 대한 상용 라인 내에서 수득하였다. 유전자형 상호작용에 의한 어떠한 라인도 확인되지 않았으므로, 대립 유전자 효과의 추정치에 대한 신뢰도를 개선시키기 위해 5종의 라인으로부터 얻은 데이터를 교차 라인 분석에 대해 풀링하였다.
3개의 치환체의 조합 효과를 일배체형 치환 효과로서 추정하였다. 일배체형 사이의 대조를, 사이어(랜덤), 도살일자 및 본 일배체형의 0, 1 또는 2 복사물을 갖는 동물에 상응하여 -1, 0 및 1의 값을 갖는 각각의 일배체형에 대해 하나의 변수를 포함하는 모델로부터 추정하였다. 일배체형 치환 효과는 일배체형의 평균 편차로서 존재하며, 이것은 최악의 일배체형으로부터 최상의 일배체형까지의 차이를 반영한다. 연관 분석에 사용된 동물의 수는 측정된 형질에 기초하여 달라지며, 이것은 표 3, 4 및 5에 기재되어 있다.
결과
마아커 개발 및 연관 맵핑: 다수의 현저한 QTL을 마아커 SW1683 및 SW1983(도 1) 사이에서 PRKAG3 유전자가 위치하는 영역(참조: Milan et al., 2000) 내에 있는 SSC15(참조: Malek et al., 2001)상에서 검출하였다. 이들에는, PRKAG3 200Q 대립 유전자 뿐만 아니라 24시간의 후지 및 요부의 pH 및 24시간 요부 헌터 L값(광 반사율)에 의해 영향을 받는 것으로 이미 보고되어 있는 (참조: Milan et al., 2000) 평균 글리코겐 함량 및 해당 포텐셜에 대한 QTL이 포함되었다. 이 QTL에서 흥미롭게도 부가 효과(RN- 돌연변이가 우세함)를 갖는 바람직한 대립 유전자가 예측된 바와 같이 주로 버크셔 종(일반적으로 매우 양호한 육질을 가짐)으로부터 유래하였다(표 1). PRKAG3 유전자는, 돼지 RN 영역(참조: Milan et al., 2000)에서 BAC 콘티그의 최근 개발, 사람 전사체 지도(참조: Jeon et al., 2001)를 사용하여 이 영역에서 돼지 지도의 고도의 연관 순서 보존 및 최근에 개발된 인간 게놈 지도(참조: Lander et al., 2001)에 기초한, 이 영역에서의 독특한 후보 유전자였다. 본 발명자는 공개된 RN- 치환체에 대해 파운더(founder) 동물, 즉 2마리의 버크셔 사이어 및 9마리의 요크셔 댐을 최초로 시험하였다. 파운더 동물 모두는 rn+ 대립 유전자(200R)를 보유하고 있었다. 육질에 대한 최대값을 사용하여 BxY 패밀리 파운더 및 4마리의 F3 개체에서의 PRKAG3 유전자의 전체 코딩 영역을 시퀀싱함으로써, 본 발명자는 3개의 미스센스 돌연변이를 확인하였다. 이들은 상기한 T30N 및 I199V 치환체(참조: Milan et al., 2000)이며, 신규한 미스센스 돌연변이(G52S)이다. 밀란 등(2000)에 의해서 확인된 또 다른 비동일성 치환체(P53L)가 이들 모두가 53P인 경우 BxY 패밀리의 파운더에서 분리되는 것으로 확인되지 않았다. 5'UTR에 대한 정보가 부족하기 때문에, 본 발명자는 완벽한 5' 플랭킹 서열 및 그 영역에서 유전자 집단을 발견하도록 RACE를 사용하였다. 인트론의 SINE 다형성에 의해 개시 코돈의 79bp 업스트림이 개시되는 것으로 확인되었으나, 이것은 3개의 요크셔 그랜덤(grandam)에만 존재하였다. 이종교배 패밀리의 파운더 사이에 있는 각 부위의 대립 유전자 서열이 상이하다는 사실에 기초하여, 본 발명자는 G52S 및 I199V 치환체가 종래 보고된 육질 QTL에 대한 가장 가능성있는 후보물이라고 간주하였다. I199V 치환체를 사용하여, 본 발명자는 글리코겐, 락테이트 및 해당 포텐셜과 24시간 pH(도 1)에 대한 QTL의 넓은 피크 아래의 위치에 대해 BxY 연관 지도내에서 PRKAG3 유전자를 맵핑하였다. PRKAG3 I199V 정보를 추가한 후에, SSC15에 대한 마아커 순서 및 지도 길이는 말렉 등(2001)의 문헌에서와 동일하였다. PRKAG3 I199V (도 1)를 포함하는 QTL의 재분석에 의해, 말렉 등(2001)에 의한 결과와 비교한 경우 F값 및 SSC 15(0 내지 3cM)에 대한 QTL 피크의 위치가 약간 변화되었다.
F 2 관련성 연구: 관련성 분석법을 사용하여, 본 발명자는 평균 글리코겐 및 락테이트 함량, 및 F2 BxY 집단에 대한 해당 포텐셜(I199V 치환에 대해서만 데이터가 도시되어 있음-표 2)에 대한 3개의 모든 치환체(T30N, G52S 및 I199V)의 현저한 효과를 확인하였다. 글리코겐 및 락테이트 함량과 해당 포텐셜의 측정을 포함하나 이러한 측정과 관련된 육질 형질의 일부에서도 또한, 분석된 형질의 대부분에 대한 I199V 치환체에 대해 가장 현저한 효과가 밝혀졌다. F2 데이터로부터, 30T, 52G 및 199I 대립 유전자가 육질이 가장 우수하였다. 이종교배시에 연관 불균형이 많이 일어날 것으로 예측되기 때문에,이 유전자가 육질에서 확인된 변화에 직접 관련되기 쉬운지의 여부를 결정하도록, 이종교배시킨 돼지의 다수의 상업적 라인에서 이러한 돌연변이의 효과를 확인하고 조사할 필요가 있었다.
상용 집단의 분석: 분석된 치환에 대한 유전자형 빈도는 표 3에 기재되어 있다. 모든 3개의 치환 부위에 있어서, 버크셔 라인은 BxY F2 데이터를 기초로 하여 골격근에서의 낮은 글리코겐 함량( 및 더욱 우수한 육질)과 관련된 유전자형에 대해 더 높은 빈도를 갖는다. 기타 상용 집단은 버크셔 집단과 비교할 경우, 특히 I199V 치환체로 표시된 바람직한 대립유전자에 대한 빈도가 낮다.
PRKAG3 돌연변이 및 육질과 이 돌연변이와의 관련성을 5종의 상용 라인 각각에 대해, 그리고 이 모든 라인에 걸쳐서 시험하였다. 모든 라인에 따른 분석에서 치환 부위의 역향 제거에 있어서, 모든 6가지 형질을 갖는 모델에서는 I199V가 유지되었으며, 후지 pH, 요부 pH, 요부 미놀타 L 및 요부 미놀타 b에 대해서는 G52S가 유지되었으며, T30N은 후지 미놀타 L, 요부 미놀타 L 및 후지 미놀타 b에 대해 유지되었다.
각각의 치환은 3개 이상의 형질과 별개로 관련되기 때문에, 각각의 치환 효과는 독립적으로 추정되었다. 라인에 따른(표 4) 및 라인내의(표 5) 평균 유전자형의 최소제곱 추정치는 분석된 치환과 육질의 측정치 사이에 서로 현저하게 영향을 끼친다는 것을 나타내며, 이는 여러 부가적인(신규한) rn+ 대립유전자가 존재할 수 있음을 암시한다.
관련성 연구는, 분석된 모든 형질에 있어서 라인에 따른(표 4) 및 라인내의(표 5, 데이터는 I199V에 대해서만 기재되어 있음) 가장 큰 효과가 I199V 치환에 의해 수득된다는 것을 나타낸다. 이러한 치환에 있어서, 라인에 따라 분석되는 경우, 본 연구에 이용된 모든 육질 형질과의 관련성은 매우 현저하였다(p<0.0005). 개별적인 라인 각각에 대한 동일한 치환체에 있어서는 하나 이상의 형질과의 현저한 관련성이 나타났으며, 듀록 및 듀록 합성종에서 후지 미놀타 b 및 듀록 합성종에서 요부 pH에 대한 현저한 효과를 나타내었다. 이러한 두 품종(듀록 합성종, 듀록)은 각각의 유전자형에 대한 다수의 동물과의 관련 분석에서 가장 우수한 빈도 분포를 갖는다(표 5). 라인에 따른 분석 및 대부분의 개별적인 라인의 결과에서, 효과는 우수한 육질에 유리한 대립 유전자인 대립유전자 199I와 모든 형질에 있어서 동일한 경향으로 나타났다.
5가지 형질에 대한 현저하지만, I199V와 비교할 경우 더 적은 효과는 라인에 따라(표 4) 분석할 경우, T30N 치환에서 나타났다. T30N의 라인내 분석은 듀록 및 듀록 합성종 집단에서만 거의 배타적으로 효과를 나타냈다(데이터 미도시됨). 대부분의 경우, 효과는 더욱 우수한 육질과 관련된 대립유전자 30T와 동일한 경향으로 나타났다.
G52S 치환에 있어서, 현저한(p<0.05) 효과는 라인에 따른 분석에서 단지 두가지의 형질(후지 pH 및 요부 미놀타 L)에 대해서만 나타났으며, 상이한 대립유전자는 이러한 형질에 바람직한 것으로서 확인되었다. 듀록 합성종 집단에 있어서 라인내 분석은 요부 미놀타 색상 스코어(데이터는 미도시됨)에 대한 현저한 관련성을 나타내었다.
본 발명자는 5종의 상용 집단을 시험하였으며, 단지 4개의 일배체형을 발견하였다(표 6). 버크셔 집단은 높은 빈도(0.87)의 일배체형 3(30T-52G-199I)을 갖는 최소의 다형성이다. 라지 화이트에서, 일배체형 2(30T-52S-199V)는 가장 빈번하며, 일배체형 1(30N-52G-199V)은 랜드레이스, 듀록 및 듀록 합성종 집단에서 가장 높은 빈도수를 갖는다. 일배체형 4(30T-52G-199V)는 모든 집단에서 가장 낮은 빈도수를 갖는다.
각 라인에 대한 및 라인에 따른 일배체형 치환 효과를 4가지 일배체형의 평균으로부터 편차로서 계산하였다(도 2). 라인에 따른 및 라인내의 분석은 요부 특성에 대한 것보다 후지 pH 및 색상 측정값에 대한 일배체형간의 더 큰 차이를 나타냄을 보여주었다. 후지 pH에 있어서, 라인에 따른 및 라인내의 분석은, 라인에 따른 분석에서는 일배체형 3이 기타 각각의 일배체형과 현저하게 차이나고(p<.0005), 각각의 개체 라인 분석에서는 하나 이상의 다른 일배체형과 현저하게 차이나는(p<.05) 가장 높은 효과를 나타냈다. 일배체형 2는 대부분의 형질에 있어서 두번째로 우수했으며, 일배체형 1 및 4를 갖는 라인은 육질에 있어서 가장 열악한 특성을 나타냈다. 이러한 체계는 버크셔 집단에서는 분명하지 않았으며, 종에 따른 분석 결과와 상응하게 가장 낮은 값을 갖는 일배체형 4에서만 상이한 차이가 관찰되었다. 버크셔에서 뚜렷하지 않은 결과는, 부분적으로는 이러한 품종에서 다형성의 수준이 낮으며, 일배체형 1 및 4에 대한 부수적인 관찰 횟수가 매우 적었기 때문인 것으로 여겨진다. 듀록 합성종 집단에서 일배체형 4의 평가는 다른 라인에서의 평가와 상이한 것으로 나타났다(특히 후지 pH에 있어서, 일배체형 2(p<.05) 및 일배체형 1(p<.01)보다 현저하게 높지만, 이러한 집단에서 일배체형 4의 빈도는 매우 낮았다(0.07)). 이러한 라인(비록 이의 시초가 6세대 전이지만)의 합성적 특성은 연장된 결합 불균형이 존재할 가능성을 제공하여, 결합된 좌위가 일배체형 치환 효과에 기여할 수 있는 기회를 증가시킨다.
미놀타 스코어에 대한 일배체형의 결과는 pH 결과와 일치한다. 일배체형 3은 일반적으로 유리한 효과(낮은 색상 스코어)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 개체 라인으로부터의 결과에서 약간의 예외가 있지만, 이는 샘플링에 의한 것일 수 있다. 단지 현저한 편차가 일배체형 2에서 나타났으며, 이는 버크셔에서 더 낮은 미놀타 b 스코어와 관련있다(p<.05). 라인에 따른 분석에서, 일배체형 2는 대부분의 경우에서 일배체형 3에 대해 두번째이다.
토론
이러한 작업에서 보고된 결과는, PRKAG3 유전자의 신규한 대립유전자가 육질 형질에 영향을 끼친다는 중요한 증거를 제공한다. 이러한 결론은 하기 세가지 사항을 기초로 한다: 1) 육질에 미치는 PRKAG3 대립유전자 즉 rn+ 및 RN-의 공지된 효과. 2) BxY 패밀리에서 PRKAG3이 위치하는 영역에서, SSC15에 대해 밝혀진 관련된 육질 형질에 대한 여러 QTL(이러한 QTL은 본래의 R200Q 치환체가 단리되지 않은 돼지에서 발견됨)의 관찰. 3) PRKAG3 치환과 글리코겐 및 락테이트 함량과의 관련 성, 해당 포텐셜, 및 BxY F2 집단에서의 육질 형질과 여러 관련되지 않은 사용 돼지 라인에서의 육질 형질에 대한 본원에 기재된 결과.
개체 치환의 관련성 분석은, 세개의 연구중 I199V 치환이 육질 형질에서 가장 중요하고 큰 차이를 나타냄을 보여준다. 예를 들어, BxY F2 분석은 해당 포텐셜 및 글리코겐과 락테이트 함량에 있어서 I199V 유전자형 부류간의 현저한 차이를 나타내었다(표 2). 또한, 대부분의 분석된 육질 형질에 대한 중요한 효과가 밝혀졌다. 대립유전자 199I는 낮은 수준의 글리코겐, 락테이트 및 해당 포텐셜, 높은 후지 및 요부 pH 및 더욱 우수한 색상 스코어와 관련있음이 밝혀졌다. 이러한 마커는 BxY F2에서 충분한 정보를 제공하여 대립유전자 효과를 우수하게 평가할 수 있다.
상용 집단 분석에서, I199V 치환은 후지 pH에 있어서 랜드레이스 라인에서는 0.14, 및 라인에 따라서는 0.10 이하의 동형접합성 클래스간의 LS 평균의 현저한 차이와 관련된다(표 4 및 5). 육질 색상 측정중 하나에 있어서, 후지 미놀타 L, 현저한 LS 평균차는 동형접합성 유전자형간에 3.5 이하 유닛 반사율(reflectance)(랜드레이스에서), 그리고 라인에 따라서는 2.0 이하의 유닛 반사율을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 0.5 내지 1 표현형 표준 편차의 범위에 해당한다. 기타 형질 및 품종에 대한 중요한 차이가 또한 밝혀졌다. 전반적인 육질에 중요한 형질에서 이런 등급(magnitude)의 효과는 동물 육종 산업에 매유 유리하다.
I119V 이외에, 큰 효과가 T30N의 단일 치환 분석에서 평가되었다. 그러나, 분석시 I199Vrk 또한 포함되는 경우, T30N 치환의 단지 완만한 효과가 유지되었다. 부위 30과 199간의 강한 연관 불균형은 대부분 부위 30에서 검출되는 효과에 기인한 것으로 여겨진다. G52S의 단일 부위 분석에서는 대부분 중요하지 않은 작은 효과가 관찰되었다.
일배체형 분석은 비동일성 치환 효과 분석을 보조하며, 199번 위치 및 52번 위치에서 효과에 대한 추가적인 증거를 제공한다. 199I를 함유하는 유일한 일배체형인 일배체형 3은 pH 및 육질 색상 측정값에 있어서 가장 유리한 일배체형이다. 대부분의 시험 상황에서, 52S를 함유하는 유일한 일배체형 2는 특히 후지의 육질 형질에서 중간치 값을 나타내며, 여기서 효과의 차는 기타 형질에서 보다 더욱 현저하고 컸다. 일배체형 1 및 4에 대한 값은 함께 범위의 최하값에 근접하며, 대부분의 경우에 서로 현저한 차이도 나타내지 않았다.
이러한 두 일배체형(1 및 4)의 값이 대부분의 평가에서 비교적 유사하기 때문에, T30N 치환이 육질 변화에 별로 영향을 끼치지 못한다고 결론내렸다. 라인에 따른 분석 즉, 일배체형 4의 빈도가 0.10을 초과하는 랜드레이스 및 라지 화이트 분석에서, 일배체형 4와 비교할 경우, 일배체형 1(본 일배체형은 30N 변이와 관련됨)이 후지 미놀타 스코어에 대해 유리한 영향을 끼침을 발견하였다. 기타 집단에서는, 일배체형 4의 매우 낮은 빈도로 인해 이러한 일배체형 효과의 차를 평가하기 어려웠다.
일배체형 4와 일배체형 2간의 차는 단지 G52S 부위에 있다. 일배체형 4와 2의 영향은, 라인에 따른 분석시 후지 및 요부 둘 모두에서 pH 및 미놀타 L 스코어 에 있어서, 그리고 개체 라인, 가장 현저하게는 라지 화이트의 몇몇 형질에 있어서, 현저하게 차이가 났다. 일배체형 2(52S를 함유하고, 세린을 엔코딩함)가 일배체형 4(52G를 함유하고, 글리신을 엔코딩함) 보다 바람직하였다. 이는 52G가 바람직한 대립유전자인 것으로 추정된 BxY 연구에서 밝혀진 것에 상반된다. F2의 파운더의 제한된 수로 인한 I199V 부위와의 강한 연관 불균형 때문에, 이러한 집단에서 G52S 치환의 정확한 효과가 가려졌을 수 있다. 흥미롭게는, 개체 분석시 G52S은 대부분의 형질 및 라인에 대해 영향을 끼치지 못했다. 이 분석으로 일배체형 2와 나머지 3개의 조합물을 비교하였다. 나머지 3가지 일배체형의 혼합물은 일배체형 빈도에 따라 일배체형 2의 평균값과 유사한 평균값을 유도하여, G52S가 개별적으로 분석될 경우 차이가 검출되지 않으며, 이는 일배체형을 기초로하는 분석 값을 나타낸다는 것을 도 2로부터 알 수 있다.
일배체형 4에 존재하는 30T 변이는 단일 부위 분석을 기초로 하여 육질에 바람직하다는 것을 밝혀냈으며, 이는 듀록 및 듀록 합성종에서 대부분의 형질에 대한 현저한 효과와 관련이 있다. 이들 두 집단에서, 일배체형 3은 완만한 빈도를 가지며(표 6), 30T 및 유리한 199I 변이체를 함유한다. 따라서, 199I 변이체는 결합 불균형으로 인한 30T 부위 변이에 더 많은 영향을 끼친다.
치환체의 결합 분석 및 일배체형 분석으로 돼지에서의 육질 측정시 상이한 크기 효과를 갖는 PRKAG3 유전자에서 3가지의 비동일성 치환이 존재함을 입증하였다. "하나의 유전자- 몇개의 다형성-다양한 표현형"의 이러한 흥미로운 모델은 복 합적인 표현형 형질에 대한 구별가능한 부가적 효과에 기초를 두고 있으며, 이는 기타 형질을 추가로 연구하기 위한 모델로서 제공될 수 있다. 선택하의 유전자의 연속 돌연변이의 결과로서 다수의 대립유전자의 존재는 최근 돼지에서 제안되어 왔다(Jeon et al., 1999; Nezer et al., 1999).
I199V 치환은 이러한 패밀리의 유전자에서 매우 보존적인 영역인 시스타티오닌 베타-신타아제(CBS) 도메인에서 발생한다(Milan et al., 2000). CBS 도메인의 역할은 여전히 불명료하지만, 세포질 타겟팅(Pontig, 1997), 단백질-단백질 상호작용(Bateman, 1997) 및/또는 단백질 활성의 조절(Beteman, 1997)과 관련됨이 시사되었다. PRKAG3 유전자에서 4개의 CBS 도메인이 존재하며(Milan et al., 2000), I199V 치환체는 첫번째의 가장 보존적인 도메인에 위치한다. Pfam 소프트웨어를 이용하여 수득된 CBS 도메인과 γ3펩티드간의 정렬은 이 위치에서 바람직한 아미노산이 이소류신이라는 것을 나타내었다(결과는 미도시됨). 본 연구에서 흥미롭게는, 대립유전자 199I(부위 199에서 이소류신을 코딩함)가 상용 집단 및 BxY F2 패밀리에서 우수한 육질과 관련이 있으며, 또한 BxY F2 패밀리에서는 더 낮은 수준의 글리코겐, 락테이트 및 해당 포텐셜과 관련이 있음을 밝혀내었다.
밀란(Milan) 등(2000)은 200Q 돌연변이(RN-)가 항상 199V와 함께 발견됨을 보여주었다. 그런, 199V는 200R 및 200Q와 함께 발견되며, 199I는 항상 200R과 함께 발견되었다. 단지 세개의 뉴클레오타이드가 이러한 치환 부위를 분리하기 때문에, 이들간의 재조합 가능성은 극히 적다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 R200Q가 가장 최근의 치환체라고 여겼으며, 가설 또한 단지 햄프셔 돼지 품종에서만 이러한 변이가 존재한다는 점에 의해 지지되었다. 두 일배체형 199V-200R과 199I-200R은 오래전부터 유전되어 왔을 수 있는데, 이는 이들 각각이 멧돼지 및 여러 종의 아목 수이스포르메스(Suisformes)(Ciobanu et al., 비공개된 결과)를 포함하는 오늘날까지 분석된 대부분의 품종에서 확인되었기 때문이다.
199V-200R 일배체형은 199I-200R 일배체형(BxY F2 데이터)과 비교할 경우, 높은 글리코겐 함량 및 더 낮은 사후 후지/요부 pH와 관련이 있다. 코돈 199에서의 치환은 아마도 글루코오스 대사에 영향을 끼치며, 따라서 근육 글리코겐 함량을 증가시켰다. 세번째 일배체형 199V-200Q는 RN- 표현형을 부여한다. 글리코겐 함량에 대한 199V-200Q의 관련 효과는 기타 일배체형의 효과보다 더 컸으며, 199V-200Q 일배체형이 다른 일배체형에 비해 우세하였다. 이러한 이유로, 본 발명자는, RN- 표현형이 R200Q 치환 단독에 의한 결과에 비해 199V-200Q 일배체형의 혼합된 효과에 의한 것이라고 여겼다. 이러한 효과는 상기 치환에 의한 CBS 도메인의 변형에 의해 초래될 수 있다.
AMPK의 α 및 γ 조절 서브유닛의 정확한 기능은 아직 불명료하다. 그러나, 이 둘 모두는 키나아제 활성에 필수적인 것으로서 공지되어 있다(Hardie and Carling, 1997). 시험관내 실험은, β서브유닛이 서로 직접적으로 상호작용하지 않는 γ 및 α 서브유닛 둘과 상호작용하기 때문에, β 서브유닛이 AMPK의 이질성삼량체 구조 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다(Woods et al., 1996). 최근의 실험은 알로스테릭 AMP-결합 부위가 AMPK 복합체의 γ 및 α 서브유닛 둘 모두를 포함할 수 있음을 암시한다(Cheung et al., 2000). 쳉(Cheung) 등(2000)은 AMP의 부재하에, 이질성삼량체 복합체가 γ 및 α 서브유닛간의 상호작용 없이는 주로 불활성을 띠는 우수한 모델을 제안하였다. 이러한 상황에서, α 서브유닛에서의 Thr172 부위의 인산화와 기질과의 상호작용은 α 서브유닛의 자동억제 영역에 의해 차단된다. AMPK의 활성 형태에서, α 서브유닛 자동억제 영역과 하나 이상의 γCBS 도메인간의 상호작용은 자동억제를 제지시켜, AMP가 서브유닛에 결합하여 조합물을 안정화시킨다(Cheung et al., 2000). 정렬 정보 즉, R200Q 부위가 근처에 존재하는 AMPK 복합체 조절의 제안된 모델은 AMPK의 활성에 대한 I199V 치환체의 역할에 대한 가설을 지지한다. AMPK 복합체의 분자 구조가 아직 밝혀지지 않았지만, 본 발명자는, G52 치환의 관찰된 효과로부터 아미노산 변화가 효소의 구조 및 활성에 영향을 끼칠 수 있다는 것을 가정하였다.
γ3 서브유닛이 골격근에서 우세하게 발현되지만, AMPK 활성은 γ1 및 γ2 이소폼과 더욱 관련이 있는 것으로 나타났다(Cheung et al., 2000). 그러나, 아직 해석되지 않은 메카니즘에서, PRKAG3 유전자에서의 R200Q 치환(또는 I199V-200Q 혼합)은 햄프셔 돼지(Milan et al., 2000)에서 AMPK 활성에 중요한 차이를 유발시키며, 이는 γ3 이소폼이 골격근의 글루코오스 대사에서 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다. 이러한 상황을 해결하기위해서는 상세한 서브유닛 혼합에 대한 더욱 상세한 작용성 연구가 필요할 것이다. 글루코오스 대사에서 AMPK의 역할은 효모로부 터의 관련된 SNF1 복합물과의 비교를 기초로 하여, 생리학적 센스를 만드는 것이다. 또한, 여러 연구는, AMPK가 글리코겐 신타아제를 불활성화시키고(Carling and Hardie, 1989; Poulter et al., 1988; Zhang et al., 1993), 산화질소 신타아제를 활성화시키고(Fryer et al., 2000), 글루코오스 트랜스포터 4의 플라즈마 막으로의 전좌를 증가시킴으로써(Hayashi et al., 1998; Kurth-Kraczek et al, 1999; Bergeron et al., 1999; Holmes e tal., 1999), 글리코겐 대사에 관여한다는 것을 보여준다.
육질 측정에 대해 본원에서 언급된 치환 효과가 우성 RN- 변이로 효과보다 다소 작지만, 이들은 생물학적으로 경제적으로 중요하다. 특히, 이러한 대립유전자는, 단지 햄프셔 품종과 관련되며, 대부분 돼지 출산 프로그램에 제한되어 이용된 RN- 변이체와는 대조적으로, 오늘날까지 분석된 모든 상용 라인 및 품종에서 단리된다. PRKAG3에 대한 본원에 보고된 결과는 또한, 유전학자들이 종내에서 그리고, 종에 따라 더욱 격별한 효과를 유도하기 위해, 공지된 유전자에서 경제적으로 영향을 끼치는 추가의 돌연변이를 찾아내야 한다는 것을 제시하고 있다. 이러한 의향은 표적 종 또는 품종 이외의 기타 유전자와 관련된 주요 효과, 예를 들어, 마우스(Huszar et al., 1997)와 사람(Yeo et al., 1998), 그리고 더 작은 범위로는 돼지(Kim et al., 2000)에서 MC4R 변이의 큰 효과에 관한 보고서에 의해 지지된다.
동물 종에서 생화학적으로 중요한 신규한 유전자의 확인은 또한 사람 생의학적 표적에 대한 유용한 정보를 제공할 것이다. 이러한 학식은 신규하고 흥미로운 대립유전자가 발견되었을 경우, 향상될 것이다. PRKAG3의 경우, 이러한 유전자 및 사람에서 기타 AMPK 관련 유전자가, 이들의 작용 및 QTL 위치를 기초로 하여 사람 타입 Π 당뇨병에 대한 흥미로운 시험대상이라는 것이 제안되었다(Milan et al., 2000). 이러한 이유로, 이들 신규한 대립유전자의 효과는 글루코오스 대사에 영향을 끼치는 잠재적인 인자에 대한 새로운 견해를 제공할 수 있으며, 이러한 질병의 추가적인 연구에 고려되어야 한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌 전체를 본원에 참조로 인용하였으며, 참고문헌에는 하기 참고문헌들이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다:
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표 1. 돼지 15번 염색체에 대한 다양한 육질 형질에 대한 5% 염색체별 레벨 에서의 유의한 QTL에 대한 증거.
위치 부가적 우세 변이 형질 F-값a (cM) 효과b S.E. 효과 S.E. (%)
평균 글리코겐d 7.74 69 -0.70 0.21 0.65 0.031 3.52
평균 락테이트d 4.50 69 -2.24 0.79 -1.10 1.16 2.00
평균 해당 포텐셜d 6.37 69 -3.63 1.02 0.18 1.50 4.69
24시간 후지 pH 8.42* 72 0.05 0.01 -0.02 0.02 4.00
24시간 요부 pH 12.21** 78 0.05 0.01 -0.01 0.02 5.61
a순열 시험에 의해 결정된 바와 같이 5% 레벨에서의 염색체별 F-통계 한계치는 5.02였다.
b유전된 2가지 버크셔 대립유전자, 이형접합체를 가진 개체 및 2가지 요크셔 대립유전자를 가진 개체에 대한 각각의 +a, d, 및 -a의 유전자형 값에 상응하는 부가적 (a) 및 우세 (d) QTL 효과. 포지티브 부가 효과는 버크셔 대립유전자는 상기 형질을 증가시켰고, 네가티브는 버크셔 대립유전자가 상기 형질을 감소시켰음을 나타낸다. 우세 효과는 2가지 동형접합자의 평균과 관련있다.
c변이(%) = 추정된 부가 및 우세 효과 및 ½의 대립유전자 빈도를 기초로 하여 F2에서의 남아있는 변이의 퍼센트로서 나타낸 QTL에서의 유전자 변이이다.
d측정 단위 - μmol/g
* 5% 게놈별 레벨에서의 유의(significant)(F>8.22)
** 1% 게놈별 레벨에서의 유의(F>9.96)
표 2. 버크셔 x 요크셔 F 2 동물에서의 PRKAG3 유전자 I199V 치환 부위에서 유전자형과 육질 사이의 관련성 결과.
I199V
형질 II IV VV
평균 글리코겐 8.01(0.31)c 9.10(0.24)d 9.37(0.33)d
평균 락테이트 84.83(1.17)e 86.83(0.91)a 90.54(1.27)f,b
평균 해당 포텐셜 100.84(1.50)a,e 105.02(1.17)b 109.28(1.64)f,a
팩킹 플랜트 5.91(0.02)c 5.89(0.02) 5.84(0.02)d
후지 pH
팩킹 플랜트 5.80(0.02)c,e 5.75(0.01)d,a 5.71(0.02)f,b
요부 pH
랩 요부 pH 5.86(0.02)c,e 5.80(0.01)d,a 5.77(0.02)f,b
랩 요부 미놀타 21.54(0.29)c 22.11(0.22) 22.76(0.31)d
팩킹 플랜트 44.17(0.41)a 45.07(0.32) 45.49(0.45)b
요부 헌터
랩 요부 헌터 46.56(0.30)a 47.07(0.23) 47.70(0.33)b
하기 형질들은 p<0.05에서 유의하지 않았다: 랩 후지 미놀타, 랩 후지 헌터, 및 팩킹 플랜트 요부 미놀타. 최소 제곱 평균을 각 형질에 대해 평가하였고 이 추정치를 괄호안에 표준 오차와 함께 제시하였다. 각 유전자형 클래스에서 동물의 수는 n = 131 (II), 260-265 (IV), 및 111-113 (VV)이었다. 최소 제곱 추정치 사이의 상당한 차이를 2-문자 위첨자로 나타내었다: a-b p<0.05, c-d p<0.005, e-f p<0.0005. 위첨자 "a"로 나타낸 추정치는 위첨자 "b"로 나타낸 추정치(들)과 현저하게 상이하며, 이들 각각의 유의 레벨에서 c-d 및 e-f에 대해서와 같다.
표 3. 5종의 상용 돼지 품종에서 PRKAG3 유전자내의 T30N, G52S 및 I199V 치환에 대한 유전자형 빈도.
SNP 유전자형 랜드레이스 라지 화이트 버크셔 듀록 듀록 합성종
T30N TT TN NN 0.27 0.50 0.23 0.69 0.29 0.02 0.89 0.11 0.00 0.34 0.46 0.20 0.37 0.48 0.15
n 556 404 103 298 627
G52S SS SG GG 0.07 0.42 0.51 0.19 0.49 0.32 0.00 0.10 0.90 0.02 0.25 0.73 0.03 0.24 0.73
n 560 409 91 257 649
I199V II IV VV 0.02 0.23 0.75 0.07 0.31 0.62 0.74 0.25 0.01 0.17 0.44 0.39 0.14 0.47 0.39
n 569 375 89 260 578
표 4. 5종의 상용 돼지 품종에서 PRKAG3 유전자의 T30N, G52S 및 I199V 치 환 부위에서의 유전자형과 육질 형질 사이의 관련성 결과.
Figure 112005045858661-pct00014
최소 제곱 평균을 각 치환 부위에 대해 개별적으로 평가하였고 이를 괄호안에 추정치의 표준 오차와 함께 제시하였다. 최소 제곱 평균 추정치(형질 및 치환 부위내에서) 사이의 현저한 차이를 2-문자 위첨자로 나타내었다: a-b p<0.05, c-d p<0.005, e-f p<0.0005. 위첨자 "a"로 나타낸 추정치는 위첨자 "b"로 나타낸 추정 치(들)과 p<0.05에서 현저하게 상이하며, 이들 각각의 유의 레벨에서 c-d 및 e-f에 대해서와 같다.
표 5. 5종의 상용 돼지 품종에서 PRKAG3 유전자의 I199V 치환 부위에서의 유전자형과 육질 사이의 관련성 결과.
Figure 112005045858661-pct00015
최소 제곱 평균을 I199V 치환 부위에 대해 개별적으로 평가하였고 이를 괄호안에 추정치의 표준 오차와 함께 제시하였다. 현저한 차이(라인과 치환 부위내에 서)를 2-문자 위첨자로 나타내었다: a-b p<0.05, c-d p<0.005, e-f p<0.0005. 위첨자 "a"로 나타낸 추정치는 위첨자 "b"로 나타낸 추정치(들)과 p<0.05에서 현저하게 상이하며, 이들 각각의 유의 레벨에서 c-d 및 e-f에 대해서와 같다.
표 6. 5종의 상용 돼지 품종에서 PRKAG3 유전자의 T30N, G52S 및 I199V 치환에 대한 일배체형 빈도.
시판용 라인 n 일배체형 a 빈도 Nb
1 2 3 4 후지 pH 요부 pH 후지 min L 요부 min L 후지 min b 요부 min b
랜드레이스 라지 화이트 버크셔 듀록 듀록 합성종 518 337 83 234 511 0.48 0.17 0.05 0.43 0.39 0.29 0.45 0.05 0.15 0.17 0.13 0.22 0.87 0.38 0.37 0.10 0.16 0.03 0.04 0.07 271 151 37 184 299 488 319 71 216 472 284 153 37 184 299 489 319 72 215 474 281 150 37 183 297 475 308 72 215 474
a일배체형 1: 30N-52G-199V; 일배체형 2: 30T-52S-199V; 일배체형 3: 30T-52G-199I; 일배체형 4: 30T-52G-199V
bN - 일배체형 조합 분석에서 사용된 동물의 수.
실시예 2
본 발명에 따라, 매우 놀랍게도, PRKAG3 대립유전자는 동물에서의 동복산자수와 중요한 관계를 가지는 것으로 밝혀졌다. 이러한 특정 구체예에서 본 발명은 동물에서의 동복산자수에 대한 유전자 마커에 관한 것이다. 본 발명은 증가된 동복산자수와 상호관련된 PRKAG3 유전자내의 다형성의 존재 또는 부재를 확인함으로써, 사육시에 더 많은 동복자를 출산할 것으로 여겨지는 동물을 결정하기 위해 동물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본원에 사용되는 용어 "증가된 동복산자수" 는 소정의 군집의 평균을 능가하는 산자수에서의 생물학적으로 의미있는 증가를 의미한다.
PRKAG3 유전자형과 동복산자수와의 관련성.
PRKAG3의 코돈 199에서의 다형성을 동복산자수 데이터와 함께 유전자형 소우(sow)를 위해 사용하였다. 다형성과 육질 형질 사이의 관련성을 가진 것으로 종래에 밝혀진 랜드레이스 라인(A)과 합성 듀록 라인(B)에 상응하는 2가지 라인을 사용하였다.
데이터를 최초 출산 기록과 모든 출산경력에 따라 분석하였다(표 7).
표 7 새끼의 수
라인 출산 1 모든 출산 대립유전자 빈도 1
A 224 468 0.15
B 311 670 0.46
통계학적으로 의미있는 관련성(p<0.05)이 최초 출산에서 라인 B에 대해 유전자형과 동복산자수 형질(전체 출생수, 생존 출생수) 사이에서 발견되었다(표 8). 이형접합자는 가장 큰 동복산자수를 가지는 것으로 밝혀졌고, 또한 11개 유전자형은 22개 동형접합자 보다 더 많은 동복산자수를 가지는데(p<0.3) 이는 대립유전자 1의 1 카피 이상을 가진 소우(sow)에 대해 장점을 가짐을 시사한다. 흥미롭게도, 라인 A에서의 차이가 가능하게는 낮은 수의 관찰기록으로 인해 통계학적 유의에 도달하지 않았음에도 불구하고, 유사한 효과가 라인 A에서 나타난 것 같다. 그러나, 더 많은 관찰기록이 존재하는 경우 이형접합자와 유전자형 22 사이의 차이는 생존출생수에 대해 통계학적 유의(p<0.1)에 도달하였다.
유사한 효과는 두 라인 모두에 대한 모든 출산 데이터세트를 통해 나타났다. 이러한 경우 전체 출생수에 대한 라인 A에서의 효과는 p<0.08의 유전자형 유의를 가졌다.
표 8. 생식 형질에 대한 분석
산자수 유전자형
LS평균(s.e.)
형질 11 12 22 p
라인 A 첫번째 출산 7 53 164
NBA 11.10(1.4) 11.05(0.63)c 10.06(0.47)d 0.21
TNB 12.25(1.5) 11.78(0.68)a 10.89(0.51)b 0.29
라인 B 첫번째 출산 66 154 91
NBA 8.04(0.43)a 8.43(0.34)g 7.34(0.39)b,h 0.02
TNB 9.35(0.47)a 9.76(0.38)i 8.55(0.43)b,j 0.02
라인 A 모든 출산 13 111 344
NBA 11.44(1.09)a 10.64(0.46)a 10.01(0.34)b 0.16
TNB 12.79(1.16)a,c 11.42(0.49)b 10.73(0.37)a,d 0.08
라인 B 모든 출산 140 324 206
NBA 8.66(0.37)a 9.13(0.31)b,c 8.65(0.34)d 0.13
TNB 9.53(0.39)a 10.02(0.33)b 9.57(0.36)a 0.18
LS평균 유의 레벨:
a-b p<0.30; c-d p<0.10; e-f p<0.05; g-h p<0.01; i-j p<0.005.
PCR 시험 프로토콜:
PRKAG3-30 PCR-RFLP 시험
StyI 다형성
프라이머
RF1 - 5'ATG AGC TTC CTA GAG CAA GGA G 3'
RN52R2 - 5'GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3'
PCR 조건
믹스1
10x PCR 완충액 1.0 ㎕
MgCl2(15mM) 1.0 ㎕
dNTP(2mM) 1.0 ㎕
Rf1 프라이머 0.25 ㎕
RN52R2 프라이머 0.25 ㎕
Taq 중합효소 0.07 ㎕
ddH2O 5.43 ㎕
게놈 DNA 1 ㎕
반응 튜브에 믹스1과 DNA를 혼합한다. 미네랄 오일로 오버레이시킨다. 하기 PCR 프로그램을 런닝시킨다: 4분 동안 94℃; 45초 동안 94℃, 45초 동안 59℃ 및 45초 동안 72℃의 35 사이클; 그런 다음 12분 동안 72℃에서 최종 신장.
2% 아가로오스 겔상에서 PCR 생성물 3 ㎕를 체크하여 증폭의 성공여부 및 네가티브 대조표준의 무결성을 확정한다.
절단은 하기 절차에 의해 수행할 수 있다:
StyI 절단 반응
PCR 산물 3 ㎕
NE 완충액 3 1 ㎕
BSA(10mg/ml) 0.1 ㎕
StyI(10U/㎕) 0.3 ㎕
ddH2O 5.6 ㎕
PCR 생성물, 완충액, 효소 및 물의 칵테일을 만든다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 절단된 생성물을 로딩 염료와 혼합하고(1:6) 4% 아가로오스 겔상에서 런닝시킨다.
유전자형:
11 - 198 및 72 bp -AAC/AAC
12 - 198, 181, 72 및 17 bp -AAC/ACC
22 - 181, 72 및 17 bp -ACC/ACC
PRKAG3-SINE(Short INterspersed Element) 다형성 시험
프라이머
RP1F -5' GAA ACT CTT CTC CCC ACA GAC 3'
RN52R2 -5' GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3'
PCR 조건
믹스1
10x PCR 완충액 1.0 ㎕
MgCl2(15mM) 1.0 ㎕
dNTP(2mM) 1.0 ㎕
RP1F 프라이머 0.25 ㎕
R52R2 프라이머 0.25 ㎕
Taq 중합효소 0.07 ㎕
ddH2O 5.43 ㎕
게놈 DNA 1 ㎕
반응 튜브에 믹스1과 DNA를 혼합한다. 미네랄 오일을 오버레이시킨다. 하기 PCR 프로그램을 런닝시킨다:
1 사이클 - 4분 동안 95℃
15 사이클 - 1'20" 동안 95℃
1' 동안 64℃
1'40" 동안 74℃
30 사이클 - 1'20" 동안 95℃
1' 동안 58℃
1'40" 동안 73℃
- 12분 동안 73℃에서 최종 신장.
PRKAG3-52 PCR-RFLP 시험
HphI 다형성
프라이머
RF1 -5' ATG AGC TTC CTA GAG CAA GGA G 3'
RN52R2 -5' GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3'
PCR 조건
믹스1
10x PCR 완충액 1.0 ㎕
MgCl2(15mM) 1.0 ㎕
dNTP(2mM) 1.0 ㎕
Rf1 프라이머(10mp/㎕) 0.25 ㎕
RN52R2 프라이머(10pM/㎕) 0.25 ㎕
Taq 중합효소(5U/㎕) 0.07 ㎕
ddH2O 5.43 ㎕
게놈 DNA 1 ㎕
반응 튜브에 믹스1과 DNA를 혼합한다. 미네랄 오일을 오버레이시킨다. 하기 PCR 프로그램을 런닝시킨다: 4분 동안 94℃; 45초 동안 94℃, 45초 동안 59℃ 및 45초 동안 72℃의 35 사이클; 그런 다음 12분 동안 72℃에서 최종 신장.
2% 아가로오스 겔상에서 PCR 생성물 3 ㎕을 체크하여 증폭 성공 및 네가티브 대조표준의 무결성을 확정한다. 생성물 크기는 270bp이다.
절단은 하기 절차에 의해 수행될 수 있다.
HphI 절단 반응
PCR 생성물 3 ㎕
NE 완충액 4 1 ㎕
HphI(5U/㎕) 0.6 ㎕
ddH2O 5.4 ㎕
PCR 생성물, 완충액, 효소 및 물의 칵테일을 만든다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 절단된 생성물과 로딩 염료를 혼합하고(1:6) 4% 아가로오스 겔상에서 런닝시킨다.
유전자형:
11 - 270bp
12 - 270bp, 158bp 및 112bp
22 - 158bp 및 112bp.
PRKAG3-199 PCR-RFLP 시험
BsaHI 다형성
프라이머
RNF - 5' GGA GCA AAT GTG CAG ACA AG 3'
RNR - 5' CCC ACG AAG CTC TGC TTC TT 3'
PCR 조건
믹스1
10x PCR 완충액 1.0 ㎕
MgCl2(15mM) 1.0 ㎕
dNTP(2mM) 1.0 ㎕
RNF 프라이머(10pM/㎕) 0.25 ㎕
RFR 프라이머(10pM/㎕) 0.25 ㎕
Taq 중합효소(5U/㎕) 0.07 ㎕
ddH2O 5.43 ㎕
게놈 DNA 1 ㎕
반응 튜브에 믹스1과 DNA를 혼합한다. 미네랄 오일을 오버레이시킨다. 하기 PCR 프로그램을 런닝시킨다: 4분 동안 94℃; 45초 동안 94℃, 45초 동안 61℃ 및 1분 동안 72℃의 35 사이클; 그런 다음 12분 동안 72℃에서 최종 신장.
2% 아가로오스 겔상에서 PCR 생성물 3 ㎕을 체크하여 증폭 성공 및 네가티브 대조표준의 무결성을 확정한다. 생성물 크기는 258bp이다.
절단은 하기 절차에 의해 수행될 수 있다:
BsaHI 절단 반응
PCR 생성물 3 ㎕
NE 완충액 4 1 ㎕
BsaHI(5U/㎕) 0.6 ㎕
BSA(10mg/ml) 0.1 ㎕
ddH2O 5.3 ㎕
PCR 생성물, 완충액, 효소 및 물의 칵테일을 만든다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 절단된 생성물을 로딩 염료(1:6)와 혼합하고 4% 아가로오스 겔상에서 런닝시킨다.
유전자형:
11 - 167bp 및 91bp
12 - 167bp, 119bp 및 91bp
22 - 119bp 및 91bp
SEQUENCE LISTING <110> Iowa State University Research Foundation <120> Novel PRKAG3 Alleles and Use of the Same as Genetic Markers for Reprodcutive and Meat Quality Traits <130> P04668US3 <150> 60/231045 <151> 2000-09-08 <150> 60/260,239 <151> 2001-01-08 <150> 60/299,111 <151> 2001-06-18 <160> 17 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 1873 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> CDS <222> (1)..(1392) <400> 1 atg agc ttc cta gag caa gga gag agc cgt tca tgg cca tcc cga gct 48 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 gta acc acc agc tca gaa aga agc cat ggg gac cag ggg aac aag gcc 96 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 tct aga tgg aca agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg cct ccg ggc 144 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ccg agg gaa ggt ccc cag tcc agg cca gtt gct gag tcc acc ggg cag 192 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 gag gcc aca ttc ccc aag gcc aca ccc ttg gcc caa gcc gct ccc ttg 240 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 gcc gag gtg gac aac ccc cca aca gag cgg gac atc ctc ccc tct gac 288 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 tgt gca gcc tca gcc tcc gac tcc aac aca gac cat ctg gat ctg ggc 336 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 ata gag ttc tca gcc tcg gcg gcg tcg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 gaa gag aag cca gcc ccg tgc cca tcc cca gag gtg ctg tta ccc agg 432 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ccg ggg gcc cag gtc tac atg 480 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 cac ttc atg cag gag cac acc tgc tac gat gcc atg gcg acc agc tcc 528 His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 aaa ctg gtc atc ttc gac acc atg ctg gag atc aag aag gcc ttc ttt 576 Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 gcc ctg gtg gcc aac ggc gtc cga gcg gca cct ttg tgg gac agc aag 624 Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 aag cag agc ttc gtg ggg atg ctg acc atc aca gac ttc atc ttg gtg 672 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val 210 215 220 ctg cac cgc tat tac agg tcc ccc ctg gtc cag atc tac gag att gaa 720 Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu 225 230 235 240 gaa cat aag att gag acc tgg agg gag atc tac ctt caa ggc tgc ttc 768 Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 aag cct ctg gtc tcc atc tct ccc aat gac agc ctg ttc gaa gct gtc 816 Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 tac gcc ctc atc aag aac cgg atc cac cgc ctg ccg gtc ctg gac cct 864 Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 gtc tcc ggg gct gtg ctc cac atc ctc aca cat aag cgg ctt ctc aag 912 Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 ttc ctg cac atc ttt ggc acc ctg ctg ccc cgg ccc tcc ttc ctc tac 960 Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 cgc acc atc caa gat ttg ggc atc ggc aca ttc cga gac ttg gcc gtg 1008 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 gtg ctg gaa acg gcg ccc atc ctg acc gca ctg gac atc ttc gtg gac 1056 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 cgg cgt gtg tct gcg ctg cct gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg 1104 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 ggc ctc tac tct cgc ttt gat gtg atc cac ctg gct gcc caa caa aca 1152 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 tac aac cac ctg gac atg aat gtg gga gaa gcc ctg agg cag cgg aca 1200 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tcc tgc cag ccc cac gag acc ttg ggg 1248 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa cag gtg cac cgc ctg gtg ctc 1296 Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 gtg gat gag acc cag cac ctt ctg ggc gtg gtg tcc ctc tct gac atc 1344 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile 435 440 445 ctt cag gct ctg gtg ctc agc cct gct gga att gat gcc ctc ggg gcc 1392 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452 gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512 taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572 atctcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632 gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692 atgatggagg gcctcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752 gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct 1812 gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872 g 1873 <210> 2 <211> 464 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 2 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val 210 215 220 Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu 225 230 235 240 Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile 435 440 445 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 <210> 3 <211> 1873 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> CDS <222> (1)..(1392) <400> 3 atg agc ttc cta gag caa gga gag agc cgt tca tgg cca tcc cga gct 48 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 gta acc acc agc tca gaa aga agc cat ggg gac cag ggg acc aag gcc 96 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Thr Lys Ala 20 25 30 tct aga tgg aca agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg cct ccg ggc 144 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ccg agg gaa ggt ccc cag tcc agg cca gtt gct gag tcc acc ggg cag 192 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 gag gcc aca ttc ccc aag gcc aca ccc ttg gcc caa gcc gct ccc ttg 240 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 gcc gag gtg gac aac ccc cca aca gag cgg gac atc ctc ccc tct gac 288 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 tgt gca gcc tca gcc tcc gac tcc aac aca gac cat ctg gat ctg ggc 336 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 ata gag ttc tca gcc tcg gcg gcg tcg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 gaa gag aag cca gcc ccg tgc cca tcc cca gag gtg ctg tta ccc agg 432 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ccg ggg gcc cag gtc tac atg 480 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 cac ttc atg cag gag cac acc tgc tac gat gcc 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cac cgc ctg ccg gtc ctg gac cct 864 Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 gtc tcc ggg gct gtg ctc cac atc ctc aca cat aag cgg ctt ctc aag 912 Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 ttc ctg cac atc ttt ggc acc ctg ctg ccc cgg ccc tcc ttc ctc tac 960 Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 cgc acc atc caa gat ttg ggc atc ggc aca ttc cga gac ttg gcc gtg 1008 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 gtg ctg gaa acg gcg ccc atc ctg acc gca ctg gac atc ttc gtg gac 1056 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 cgg cgt gtg tct gcg ctg cct gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg 1104 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 ggc ctc tac tct cgc ttt gat gtg atc cac ctg gct gcc caa caa aca 1152 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 tac aac cac ctg gac atg aat gtg gga gaa gcc ctg agg cag cgg aca 1200 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tcc tgc cag ccc cac gag acc ttg ggg 1248 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa cag gtg cac cgc ctg gtg ctc 1296 Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 gtg gat gag acc cag cac ctt ctg ggc gtg gtg tcc ctc tct gac atc 1344 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile 435 440 445 ctt cag gct ctg gtg ctc agc cct gct gga att gat gcc ctc ggg gcc 1392 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452 gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512 taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572 atctcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632 gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692 atgatggagg gcctcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752 gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct 1812 gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872 g 1873 <210> 4 <211> 464 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 4 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Thr Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro 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Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 ggc ctc tac tct cgc ttt gat gtg atc cac ctg gct gcc caa caa aca 1152 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 tac aac cac ctg gac atg aat gtg gga gaa gcc ctg agg cag cgg aca 1200 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tcc tgc cag ccc cac gag acc ttg ggg 1248 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa cag gtg cac cgc ctg gtg ctc 1296 Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 gtg gat gag acc cag cac ctt ctg ggc gtg gtg tcc ctc tct gac atc 1344 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile 435 440 445 ctt cag gct ctg gtg ctc agc cct gct gga att gat gcc ctc ggg gcc 1392 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452 gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512 taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572 atctcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632 gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692 atgatggagg gcctcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752 gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct 1812 gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872 g 1873 <210> 8 <211> 464 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 8 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 Ala Leu Val Ala Asn Gly Ile Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val 210 215 220 Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu 225 230 235 240 Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile 435 440 445 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 <210> 9 <211> 1873 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> CDS <222> (1)..(1392) <400> 9 atg agc ttc cta gag caa gga gag agc cgt tca tgg cca tcc cga gct 48 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 gta acc acc agc tca gaa aga agc cat ggg gac cag ggg aac aag gcc 96 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 tct aga tgg aca agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg cct ccg ggc 144 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ccg agg gaa ggt ccc cag tcc agg cca gtt gct gag tcc acc ggg cag 192 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 gag gcc aca ttc ccc aag gcc aca ccc ttg gcc caa gcc gct ccc ttg 240 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 gcc gag gtg gac aac ccc cca aca gag cgg gac atc ctc ccc tct gac 288 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 tgt gca gcc tca gcc tcc gac tcc aac aca gac cat ctg gat ctg ggc 336 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 ata gag ttc tca gcc tcg gcg gcg tcg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 gaa gag aag cca gcc ccg tgc cca tcc cca gag gtg ctg tta ccc agg 432 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ccg ggg gcc cag gtc tac atg 480 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 cac ttc atg cag gag cac acc tgc tac gat gcc atg gcg acc agc tcc 528 His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 aaa ctg gtc atc ttc gac acc atg ctg gag atc aag aag gcc ttc ttt 576 Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 gcc ctg gtg gcc aac ggc gtc caa gcg gca cct ttg tgg gac agc aag 624 Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Gln Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 aag cag agc ttc gtg ggg atg ctg acc atc aca gac ttc atc ttg gtg 672 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val 210 215 220 ctg cac cgc tat tac agg tcc ccc ctg gtc cag atc tac gag att gaa 720 Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu 225 230 235 240 gaa cat aag att gag acc tgg agg gag atc tac ctt caa ggc tgc ttc 768 Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 aag cct ctg gtc tcc atc tct ccc aat gac agc ctg ttc gaa gct gtc 816 Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 tac gcc ctc atc aag aac cgg atc cac cgc ctg ccg gtc ctg gac cct 864 Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 gtc tcc ggg gct gtg ctc cac atc ctc aca cat aag cgg ctt ctc aag 912 Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 ttc ctg cac atc ttt ggc acc ctg ctg ccc cgg ccc tcc ttc ctc tac 960 Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 cgc acc atc caa gat ttg ggc atc ggc aca ttc cga gac ttg gcc gtg 1008 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 gtg ctg gaa acg gcg ccc atc ctg acc gca ctg gac atc ttc gtg gac 1056 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 cgg cgt gtg tct gcg ctg cct gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg 1104 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 ggc ctc tac tct cgc ttt gat gtg atc cac ctg gct gcc caa caa aca 1152 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 tac aac cac ctg gac atg aat gtg gga gaa gcc ctg agg cag cgg aca 1200 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tcc tgc cag ccc cac gag acc ttg ggg 1248 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa cag gtg cac cgc ctg gtg ctc 1296 Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 gtg gat gag acc cag cac ctt ctg ggc gtg gtg tcc ctc tct gac atc 1344 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile 435 440 445 ctt cag gct ctg gtg ctc agc cct gct gga att gat gcc ctc ggg gcc 1392 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452 gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512 taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572 atctcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632 gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692 atgatggagg gcctcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752 gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct 1812 gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872 g 1873 <210> 10 <211> 464 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 10 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Gln Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val 210 215 220 Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu 225 230 235 240 Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile 435 440 445 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 <210> 11 <211> 1095 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 11 gaaactcttc tccccacaga ctccctcctg gagcagcctc gggggaccta agcatcaagg 60 taggtggggc tgcccctgct cgcgggccca ggctcttctc ccacctcctt ttcttccacg 120 tcttcaggac cccaatctcc cccactccac tcgcctggct cttgtcttcc tctcctttgc 180 cttctttgtt ccgctttgtt tcttcttcct ccctctccct cacctcctcc ctctttcaaa 240 agagtagagg gggcatctat agagtctgga gattgggact ctcttgactt tctcgcttac 300 tagctgtgtg atttgtggca aattgcttca cctctctgag ctcaggtctc tcgttagtaa 360 aacagggctg atagccatgc ccttcggata agattgccgt gagggttgaa tgagaaattt 420 gttggaggac aagccctttg aagcttccca atattaaata tttttattta tttatttatt 480 ttttgtcttt ttgctattcc tttgggccgc tcccacggca tatggaggtt cccaggctag 540 gggtcgaatc ggagctgtag ccactggcct acgccagagc cacagcaacg cgggatccga 600 gccgcatctg caacctacac cacagctcac ggcaacgccg gatcgttaac ccactgagca 660 ggggcaggca ccgaacctgc aacctcatgg ttcctagtgg gattcgttaa ccactgcgcc 720 acgacgggaa ctccccaata ttaaatatta ttattagtaa cattttaatg gaatttattg 780 tgttactccc cattaaccaa acaggtccca ttctcccttg cagagatgag cttcctagag 840 caaggagaga gccgttcatg gccatcccga gctgtgacca ccagctcaga aagaagccat 900 ggggaccagg ggaccaaggc ctctagatgg acaaggcagg aggatrtaga ggaagggggg 960 cctccgggcc cgagggaarg tgagttcaag gccagttctg gggagctggg actgggggca 1020 gtgggcagtc ctcaaacctg gggcccgtct ctggtctggt ccctccataa cacaggcaca 1080 taacatcatg cagcc 1095 <210> 12 <211> 808 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 12 gaaactcttc tccccacaga ctccctcctg gagcagcctc gggggaccta agcatcaagg 60 taggtggggc tgcccctgct cgcgggccca ggctcttctc ccacctcctt ttcttccacg 120 tcttcaggac cccaatctcc cccactccac tcgcctggct cttgtcttcc tctcctttgc 180 cttctttgtt ccgctttgtt tcttcttcct ccctctccct cacctcctcc ctctttcaaa 240 agagtagagg gggcatctat agagtctgga gattgggact ctcttgactt tctcgcttac 300 tagctgtgtg atttgtggca aattgcttca cctctctgag ctcaggtctc tcgttagtaa 360 aacagggctg atagccatgc ccttcggata agattgccgt gagggttgaa tgagaaattt 420 gttggaggac aagccctttg aagcttccca atattaaata ttattattag taacatttta 480 atggaattta ttgtgttact ccccattaac caaacaggtc ccattctccc ttgcagagat 540 gagcttccta gagcaaggag agagccgttc atggccatcc cgagctgtga ccaccagctc 600 agaaagaagc catggggacc aggggaccaa ggcctctaga tggacaaggc aggaggatat 660 agaggaaggg gggcctccgg gcccgaggga argtgagttc aaggccagtt ctggggagct 720 gggactgggg gcagtgggca gtcctcaaac ctggggcccg tctctggtct ggtccctcca 780 taacacaggc acataacatc atgcagcc 808 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 13 atgagcttcc tagagcaagg a 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 14 ggctgcatga tgttatgtgc ct 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 15 gaaactcttc tccccacaga c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 16 ggagcaaatg tgcagacaag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 17 cccacgaagc tctgcttctt 20

Claims (58)

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  10. 돼지로부터 생물학적 샘플 물질을 수득하는 단계; 및 상기 돼지에서 개선된 육질 형질과 관련된 유전자형의 존재를 검정하는 단계로서, 이러한 유전자형이 a) PRKAG3 유전자에서, 서열번호:2의 BLAST 비교에 의해 결정하여 199번 위치에 발린 및 200번 위치에 아르기닌을 초래하거나 200번 위치에 아르기닌이 존재하는 경우 199번 위치에 이소류신을 초래하며 이를 특징으로 하는 다형성을 특징으로 하는 단계를 포함하여, 개선된 육질 형질을 나타낼 것으로 여겨지는 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 다형성이 뉴클레오타이드 595번 위치에서 구아닌에서 아데닌으로의 변이인 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 검정하는 단계가 짧은 산재된 엘리먼트간 (short interspersed element) 다형성 시험을 포함하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 검정이 하기의 프라이머 RP1F 및 프라이머 RN52R2로부터 선택되고 이들을 기초로 하는 프라이머를 사용하여 PRKAG3 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법:
    RP1F -5' GAA ACT CTT CTC CCC ACA GAC 3'
    RN52R2 -5' GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3'.
  14. 제 10항에 있어서, 다형성을 함유하는 PRKAG3 유전자 또는 이의 일부분의 양을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 증폭이 다형성 BsaHI 부위를 함유하는 PRKAG3 유전자 영역을 증폭시킬 수 있는 정방향 서열 프라이머 및 역방향 서열 프라이머를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 하기의 프라이머 RNF 및 프라이머 RNR로부터 선택되고 이들을 기초로 하는 방법:
    RNF - 5' GGA GCA AAT GTG CAG ACA AG 3'
    RNR - 5' CCC ACG AAG CTC TGC TTC TT 3'.
  17. 돼지로부터 생물학적 샘플 물질을 수득하는 단계; 및 상기 돼지에서 개선된 육질 형질과 관련된 유전자형의 존재를 검정하는 단계로서, 이러한 유전자형이 a) PRKAG3 유전자에서, 서열번호:1의 BLAST 비교에 의해 결정하여 아미노산 30번 위치에서 아스파라긴에서 트레오닌으로의 아미노산 변화를 초래하고 이를 특징으로 하는 다형성을 특징으로 하는 단계를 포함하여 개선된 육질 형질을 나타낼 것으로 여겨지는 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 다형성이 서열번호:1의 BLAST 비교에 의해 결정하여 뉴클레오타이드 89번 위치에서 아데닌에서 시토신으로의 변이인 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 유전자형이 StyI 다형성인 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 검정하는 단계가 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석, 미니시퀀싱, MALD-TOF, SINE, 헤테로듀플렉스 분석, 단일 가닥 입체형태적 다형성(SSCP), 변성 구배 겔 전기영동(DGGE) 및 온도 구배 겔 전기영동(TGGE)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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  22. 제 20항에 있어서, 다형성을 함유하는 PRKAG3 유전자 또는 이의 일부분의 양을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 증폭이 다형성 StyI 부위를 함유하는 PRKAG3 유전자 영역을 증폭시킬 수 있는 정방향 서열 프라이머 및 역방향 서열 프라이머를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 하기의 프라이머 RF1 및 프라이머 RN52R2로부터 선택되고 이들을 기초로 하는 방법:
    RF1 - 5'ATG AGC TTC CTA GAG CAA GGA G 3'
    RN52R2 - 5'GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3'.
  25. 돼지로부터 생물학적 샘플 물질을 수득하는 단계; 및 상기 돼지에서 개선된 육질 형질과 관련된 유전자형의 존재를 검정하는 단계로서, 이러한 유전자형이 a) PRKAG3 유전자에서, 서열번호:1의 BLAST 비교에 의해 결정하여 아미노산 52번 위치에서 글리신에서 세린으로의 아미노산 변화를 초래하고 이를 특징으로 하는 다형성을 특징으로 하는 단계를 포함하여 개선된 육질 형질을 나타낼 것으로 여겨지는 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 다형성이 서열번호:1의 BLAST 비교에 의해 결정하여 뉴클레오타이드 154번 위치에서 구아닌에서 아데닌으로의 변이인 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 유전자형이 HphI 다형성인 방법.
  28. 제 25항에 있어서, 검정하는 단계가 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석, 미니시퀀싱, MALD-TOF, SINE, 헤테로듀플렉스 분석, 단일 가닥 입체형태적 다형성(SSCP), 변성 구배 겔 전기영동(DGGE) 및 온도 구배 겔 전기영동(TGGE)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 삭제
  30. 제 28항에 있어서, 다형성을 함유하는 PRKAG3 유전자 또는 이의 일부분의 양을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 증폭이 다형성 HphI 부위를 함유하는 PRKAG3 유전자 영역을 증폭시킬 수 있는 정방향 서열 프라이머 및 역방향 서열 프라이머를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 하기의 프라이머 RF1 및 프라이머 RN52R2로부터 선택되고 이들을 기초로 하는 방법:
    RF1 - 5'ATG AGC TTC CTA GAG CAA GGA G 3'
    RN52R2 - 5'GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3'.
  33. 발현시 서열번호:6의 PRKAG3 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
  34. 제 33항에 있어서, 서열번호:5로 구성되는 뉴클레오타이드 서열.
  35. 서열번호:5의 뉴클레오타이드 서열에 의해 엔코딩되는 PRKAG3 단백질.
  36. 서열번호:6으로 구성되는 단백질.
  37. 발현시에 199번 위치에 이소류신 및 200번 위치에 아르기닌을 포함하는 서열번호:8의 PRKAG3 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
  38. 서열번호:8의 단백질.
  39. 발현시에 서열번호:2의 서열을 기준으로 하여 30번 위치에 트레오닌 및 199번 위치에 이소류신을 포함하는 PRKAG3 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
  40. 제 39항에 따른 PRKAG3 단백질.
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  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 돼지로부터 유전 물질 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 돼지에서 바람직한 육질 형질과 관련된 유전자형의 존재를 검정하는 단계로서, 이러한 유전자형이 서열번호:1의 PRKAG3 단백질에서 아미노산 30번 위치에 트레오닌, 아미노산 52번 위치에 글리신 및 아미노산 199번 위치에 이소류신이 존재함을 특징으로 하는 단계를 포함하여 바람직한 육질 형질을 가질 것으로 여겨지는 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  46. 돼지로부터 유전 물질 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 돼지에서 바람직한 육질 형질과 관련된 유전자형의 존재를 검정하는 단계로서, 이러한 유전자형이 서열번호:1의 PRKAG3 단백질에서 199번 위치에 이소류신 및 200번 위치에 아르기닌이 존재함을 특징으로 하는 단계를 포함하여 바람직한 육질 형질을 가질 것으로 여겨지는 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  47. 각 돼지 암컷에 의해 출생된 새끼의 수 또는 상기 돼지의 육질을 결정하는 단계; 각 돼지의 PRKAG3 유전자 또는 이와 동등한 유전자의 제 11항 또는 제 17항에 기재된 다형성 또는 이들의 동등물을 포함하는 다형성을 결정하는 단계; 및 각 돼지 암컷에 의해 출생된 새끼의 수 또는 육질을 상기 다형성과 관련시켜서 돼지의 육질 또는 동복산자수에 대한 다형성을 확인하는 단계를 포함하여 돼지의 육질, 동복산자수, 또는 육질과 동복산자수 둘 모두에 대한 유전자 마커를 확인하는 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 확인된 유전자 마커에 의해 바람직한 육질 또는 동복산자수를 가질 것으로 예측되는 사육용 돼지를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 분석이 BsaHI, HphI 및 StyI으로 구성된 군으로부터 선택된 제한 효소에 의한 PCR 증폭 DNA의 절단을 포함하는 방법.
  50. PRKAG3 유전자의 다형성 BsaHI, HphI 또는 StyI 부위 중 하나 이상을 포함하는 대립유전자를 포함하는, 돼지에 존재하는 PRKAG3의 대립유전자를 결정하는 단계; 육질, 동복산자수, 또는 육질과 동복산자수 둘 모두에 영향을 미치는 것으로 공지된 유전자에 대한 다른 마커의 대립유전자를 결정하는 단계; 및 대립유전자의 바람직하지 않은 조합을 가진 돼지에 대하여 대립유전자의 바람직한 조합을 가진 돼지를 선별하는 단계를 포함하여, 육질, 동복산자수, 또는 육질과 동복산자수 둘 모두에 대한 형질의 바람직한 조합을 가진 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, PRKAG3 대립유전자의 결정이 PRKAG3에 직접 또는 간접적으로 결합된 하나 이상의 DNA 마커와 관련된 하나 이상의 대립유전자의 존재를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  52. 제 51항에 있어서, DNA 마커가 마이크로새틀라이트(microsatellite)인 방법.
  53. 삭제
  54. 돼지로부터 유전 물질 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 돼지에서 바람직한 육질과 관련된 유전자형의 존재를 검정하는 단계로서, 이러한 유전자형이 PRKAG3 유전자에서 BsaHⅠ, HphⅠ 또는 StyⅠ 다형성 중에서 2개 이상의 다형성의 조합을 특징으로 하는 단계를 포함하여 바람직한 육질 형질을 가질 것으로 여겨지는 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  55. 돼지로부터 유전 물질 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 돼지에서 바람직한 동복산자수, 육질, 또는 동복산자수와 육질 둘 모두와 관련된 유전자형의 존재를 검정하는 단계로서, 이러한 유전자형이 PRKAG3 유전자에서의 BsaHⅠ, HphⅠ 또는 StyⅠ 다형성 중에서 2개 이상의 다형성의 조합을 특징으로 하는 단계를 포함하여 동복산자수, 육질 형질, 또는 동복산자수와 육질 형질 둘 모두에 대해 증가된 값을 가질 것으로 여겨지는 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  56. 돼지로부터 유전 물질 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 돼지에서 바람직한 육질 형질과 관련된 유전자형의 존재를 검정하는 단계로서, 이러한 유전자형이 서열번호:1의 PRKAG3 단백질에서 아미노산 30번 위치에 트레오닌, 아미노산 52번 위치에 세린 및 아미노산 199번 위치에 발린이 존재함을 특징으로 하는 단계를 포함하여 바람직한 육질 형질을 가질 것으로 여겨지는 돼지를 결정하기 위해 돼지를 스크리닝하는 방법.
  57. 삭제
  58. 제 55항 또는 제 56항에 있어서, 검정이 하기의 프라이머 RP1F 및 RN52R2로부터 선택되고 이들을 기초로 하는 프라이머를 사용하여 PRKAG3 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법:
    RP1F -5' GAA ACT CTT CTC CCC ACA GAC 3'
    RN52R2 -5' GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3'
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