KR100806954B1 - ＡＭＰＫ의 γ사슬 변이체, 이를 코드하는 ＤＮＡ 서열 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 척추동물 AMP-활성화된 키나제(AMPK)의 감마 체인의 변이체, 상기 변이체를 코드하는 핵산 서열 및 에너지 대사 질환의 진단 또는 치료를 위한 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

ＡＭＰＫ의 γ사슬 변이체, 이를 코드하는 ＤＮＡ 서열 및 그의 용도{Variants of the gamma chain of AMPK, DNA sequences encoding the same, and uses thereof}

본 발명은 AMP-활성화 단백질 키나제(AMP-activated protein kinase)(AMPK)의 γ사슬의 새로운 변이체, 상기 변이체를 코드하는 유전자 및 그의 용도에 관한 것이다.

AMPK는 진핵 `세포 내에서 에너지 대사를 조절하는 데에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다(HARDIE 등, Annu. Rev. Biochem., 67, 821-855, 1998; KEMP 등, TIBS, 24, 22-25, 1999). 포유동물의 AMPK는 촉매활성을 갖는 하나의 α서브유니트와 촉매활성이 없이 α서브유니트의 활성을 조절하는 두 개의 β서브유니트와 γ서브유니트를 포함하는 헤테로트리머 복합체(heterotrimeric complex)이다. 이 효소 복합체의 효모 상동체(SNF1으로 명명)는 잘 특성화되어 있다; 이는 포유류의 α서브유니트에 대응되는 촉매 사슬(Snf1)과 포유류의 β서브유니트에 대응되는 조절 서브유니트들(Sip1, Sip2 및 Gal83), 포유류의 γ서브유니트에 대응되는 Snf4를 포함한다. 서열 자료(sequence data)는 또한 AMPK 동족체가 Caenorhabditis elegans와 Drosophila에도 존재함을 보여준다.

효모 SNF1과 SNF4의 돌연변이는 포도당-억제된 유전자의 전사, 포자형성, 내열, 퍼옥시좀 생합성 및, 당 저장에 결함을 유발한다는 것이 관찰되었다.

포유류 세포에서는 AMPK가 연료-게이지 역할을 하는 것으로 제안되었다. 즉, 열쇼크(heat shock)나 포도당 및 ATP의 고갈과 같은 세포의 스트레스로부터 야기되는 AMP:ATP 비율의 증가에 의해 활성화된다. 활성화된 AMPK는 효소 아세틸-Co-A 카르복실라제(acetyl-Co-A carboxylase)와 히드록시메틸글루타릴-CoA(HMG-CoA) 리덕타제)(hydroxymethylglutaryl-CoA(HMG-CoA) reductase)의 인산화를 통해 ATP-생산경로(예: 지방산 산화)를 활성화하고, ATP 소비경로(지방산 및 콜레스테롤 합성)를 저해한다. 또한, AMPK는 당 합성의 핵심 조절 효소인 글리코겐 신타제(glycogen synthase)를 인산화에 의해 생체외(in vitro)에서 불활성화시키는 것으로 보고된 바 있다(HARDIE 등, 1998, 상게서); 그러나, 글리코겐 신타제가 생체내(in vivo)에서도 AMPK의 생리학적 표적인지는 불확실하다.

포유류에서는 세가지 다른 AMPK 서브유니트의 여러 가지 이소형(isoform)이 존재한다. 사람의 경우, 인간 염색체(HSA) 5p12 상의 PRKAA1과 HSA1p31 상의 PRKAA2가 각각 α서브유니트의 α1과 α2 이소형을 코드하고, HSA12q24.1 상의 PRKAB1과 PRKAB2(아직 염색체 상의 위치는 정해지지 않음)가 각각 β서브유니트의 β1과 β2 이소형을 코드하며, HSA12q13.1 상의 PRKAG1과 HSA7q35-q36 상의 PRKAG2가 각각 γ서브유니트의 γ1과 γ2 이소형을 코드한다(OMIM database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/, 1999년 7월). 또한, HARDIE 등은(1998, 상게서) AMPK γ서브유니트의 세 번째 이소형(γ3)의 존재를 언급하였으나, 이에 대한 어떤 정보를 제공한 바는 없다. 이러한 γ서브유니트들의 서열분석에 의하면 그들은 필수적으로 기능이 밝혀지지 않은 4개의 시스타티온 β신타제(cystathione βsynthase)(CBS) 도메인으로 구성되어지는 것으로 밝혀졌다. AMPK 서브유니트의 돌연변이로부터 야기되는 표현형적 효과는 아직 보고되지 않았다.

한편, 대부분의 햄프셔 돼지는 근육 내(intramuscular)에 높은 당 농도를 갖는 것으로 밝혀진 바 있다. 이러한 돼지들에 있어서, 도축 후에 발생하는 당 분해로 인하여 pH가 상당히 감소하게 되며, 이는 수분함유능이 감소되고 훈제요리된 햄의 수율을 낮게 하는 산성 육류(acid meat)가 되게 한다.

높은 근육 내 당 농도와 관련된 유전자좌(RN으로 명명)는 햄프셔 돼지유래의 표현형 데이터에 대한 가계 분리 분석에 의해 처음으로 확인되었다(LE ROY 등, Genet. Res., 55, 33-40, 1990). 높은 당 함량과 연관된 완전 우성인 대립형질 유전자 RN^-는 대부분의 햄프셔 돼지 집단에서 높은 빈도로 발생함에 반하여, 다른 품종의 돼지는 보통의 열성인 rn⁺ 대립형질 유전자의 동형접합체(homozygous)인 것으로 추측된다. 뒤이은 연구들에서 RN^-를 갖는 돼지들은 골격근에서는 당의 양이 크게 증가된 값(약 70%)을 가지나, 간에서는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다(MONIN 등, in 38th ICoMST, Clermont-Ferrand, FRANCE, 1992).

RN^- 돼지와 rn⁺ 돼지 사이의 당 함량의 큰 차이로 인하여 고기의 육질과 기술적 수율에 있어서 현격한 차이가 초래된다(ENFALT 등, J. Anim. Sci., 75, 2924- 2935, 1997). 따라서, RN^- 대립형질 유전자는 돼지산업분야에 있어서 상당한 경제적 중요성을 지니며, 대부분의 사육회사는 이러한 우성 돌연변이를 감소시키거나 제거하고자 할 것이다.

RN 표현형은 살아있는 동물 또는 도살 후의 동물의 근육 조직 검사에서 당 분해능을 측정함으로써 결정될 수 있다(MONIN 등, Meat Science, 13, 49-63, 1985). 그러나, 이러한 방법은 실제적 육종 프로그램에 적용함에 있어서 심각한 제한점들을 갖는다. 즉, RN^-와 rn⁺의 표현형 분배에 있어서 어느 정도 중첩이 존재하기 때문에, 본 테스트의 정확도는 100%가 아니고, 본 테스트는 RN^-/RN^- 동형접합체와 RN^-/rn⁺ 이형접합체를 구별할 수가 없다. 더욱이, 살아있는 동물에 대한 근육 조직의 시료 채취는 침습성(invasive)이고, 비용이 많이 든다는 단점이 있다.

따라서, RN 유전자좌에 대한 간단한 DNA 진단테스트의 개발이 강력히 요구되고 있다. 게다가, 돼지에 있어서 RN 유전자의 극적인 표현형적 효과는 이 유전자가 다른 척추동물, 특히 포유류의 골격근 내의 탄수화물 대사 조절에 있어서 중요한 역할을 담당함을 암시한다.

골격근과 간은 포유류에 있어서 두 가지 주된 당 저장고이며, 간의 당 함량이 정상인데 반하여 근육 내 당이 증가하였다는 사실은 RN^- 표현형이 근육에서 발현된 유전자에는 돌연변이가 있으나, 간에서 발현된 유전자에는 그렇지 않기 때문일 수 있다는 것을 암시한다. 본 발명자들은 이전에 RN 유전자가 돼지의 15번 염색체 에 위치하고 있다고 보고한 바 있다(MILAN 등, Mamm. Genome, 7, 47-51, 1996; MARIANI 등, Mamm. Genome, 7, 52-54, 1996; LOOFT 등, Genetics Selection Evolution, 28, 437-442, 1996). 본 발명자들은 RN^- 대립형질 유전자가 AMP-활성화 단백질 키나제(AMPK) γ사슬의 새로운 근육-특이적 이소형을 코드하는 유전자 내의 비보존적 돌연변이와 연관되어 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명의 다양한 양상들은 이러한 발견과 이러한 돌연변이의 특성화 및 돌연변이 유전자의 확인과 분리에 근거한다.

본 발명에 따르면, AMPK γ사슬의 돌연변이는 탄수화물 대사 조절의 변화를 야기시킨다는 것을 밝혔으며, 이는 AMPK가 탄수화물 대사의 필수적인 요소임을 입증해주는 것이다. 또한, 본 발명은 AMPK γ사슬의 근육-특이적 이소형을 코드하는 핵산 서열을 제공한다. 따라서, 탄수화물 대사를 조절하는, 더욱 구체적으로는, 특히 골격근육 세포에서 탄수화물 대사조절의 잠재적인 또는 실제적인 질환을 탐지하거나 바로잡는 수단을 제공한다.

본 발명은 폴리펩티드 서열번호:2와 적어도 70%의 동일성이나 적어도 85%의 유사성, 바람직하게는 80%의 동일성이나 적어도 90%의 유사성, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 동일성이나 적어도 95%의 유사성, 더더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성이나 적어도 99%의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 코드하는 분리된 핵산 서열뿐만이 아니라 상기 핵산 서열의 상보서열을 제공한다.

상기 폴리펩티드는 AMPK γ사슬의 새로운 근육-특이적 이소형을 나타내고, 또한 이하에서는 Prkag3이라 부른다; 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자는 이하에서는 PRKAG3이라 부른다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열번호:28과 적어도 75%의 동일성, 바람직하게는 적어도 80%의 동일성일 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

참조 서열(reference sequence)과의 서열의 동일성(identity)이라 함은 두 서열을 잔기들의 위치가 최대한 부합하도록 정렬하였을 때 동일한 잔기의 백분율을 의미한다. 참조 서열과 적어도 X%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 본 명세서에서는 그의 서열이 참조 아미노산 서열 중의 각 100개의 아미노산 당 100-X개의 아미노산 변이를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 아미노산 변이는 참조 서열에서의 연속적인 또는 산개한 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 삽입을 포함한다.

참조 서열과의 서열의 유사성(similarity)이라 함은 두 서열을 잔기들의 위치가 최대한 부합하도록 정렬하였을 때, 동일하거나 보존성 아미노산 치환에 의해서만 다른 잔기의 백분율을 의미한다. 보존성 아미노산 치환이란 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예를 들면, 크기, 전하량, 또는 극성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말하는데, 이는 일반적으로 단백질의 기능적 특성을 변화시키지는 않는다. 참조 서열과 적어도 X%의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 본 명세서에서는 그의 서열이 참조 아미노산 서열 중의 각 100개의 아 미노산 당 100-X개까지의 비보존성 아미노산 변이를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 비보존성 아미노산 변이에는 참조 서열에서의 연속적인 또는 산개한 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 비보존성 치환이 포함된다.

예를 들면:

* 디폴트 설정 및 의문값(query)으로서 서열번호:2 전체서열을 사용하여 BLASTp(ALTSCHUL 등, Neucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997)를 이용하여 "GenBank nr" 데이터베이스를 검색한 결과, 서열번호:2와의 동일성 또는 유사성의 더 높은 백분율은 이하와 같았다:

- 인간 AMPK의 γ1 서브유니트: 65% 동일성 또는 82% 유사성(점수: 399);

- 랫트(rat) AMPK의 γ1 서브유니트: 65% 동일성 또는 82% 유사성(점수: 399);

- 쥐(murine) AMPK의 γ1 서브유니트: 64% 동일성 또는 80% 유사성(점수: 390);

- 초파리(Drosophila) AMPK의 γ서브유니트: 53% 동일성 또는 75% 유사성(점수: 332);

- 효모 Snf4: 33% 동일성 또는 56% 유사성(점수: 173);

* 디폴트 설정 및 의문값으로서 서열번호:28 전체서열을 사용하여 BLASTp를 이용하여 "GenBank nr" 데이터베이스를 검색한 결과, 동일성 또는 유사성의 더 높은 백분율은 이하와 같았다:

- 인간 AMPK의 γ1 서브유니트: 64% 동일성 또는 80% 유사성(점수: 403);

- 인간 AMPK의 γ2 서브유니트: 62% 동일성 또는 83% 유사성(점수: 425);

- 랫트(rat) AMPK의 γ1 서브유니트: 61% 동일성 또는 77% 유사성(점수: 404);

- 쥐(murine) AMPK의 γ1 서브유니트: 63% 동일성 또는 79% 유사성(점수: 394);

- 초파리(Drosophila) AMPK의 γ서브유니트: 52% 동일성 또는 76% 유사성(점수: 340);

본 발명의 폴리펩티드는 예를 들면, 척추동물 종, 더욱 구체적으로는 가금(poultry)과 같은 조류 또는 소, 양, 돼지, 쥐, 말 및 인간을 포함한 포유류 유래의 폴리펩티드(천연, 합성, 반합성, 또는 재조합된 것)를 포함하고, 하기 아미노산 서열 중의 하나를 포함하거나 그것들로 구성된다:

- 기능적 Prkag3; 또는

- 기능적으로 변이된 Prkag3의 돌연변이.

"기능적"(functional)이란 보통의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 그와 같은 단백질은 그 활성에 있어서 어떠한 실질적인 변화도 수반하지 않고, 어떠한 주목할만한 표현형의 변화도 수반하지 않는 침묵 돌연변이(silent mutation)를 포함할 수 있다. 기능적 Prkag3의 비한정적인 예로는:

- 적어도 서열목록의 서열번호:2로 나타낸 서열을 포함하는 돼지의 Prkag3; 여기에는 예를 들면, 폴리펩티드 서열번호:28이 포함된다;

- 적어도 서열목록의 서열번호:4로 나타낸 서열을 포함하는 인간의 Prkag3; 여기에는 예를 들면, 폴리펩티드 서열번호:30이 포함된다;

본 발명은 또한 Prkag3의 접합 변이체(splice variants)를 포함한다: 예를 들면, 한편으로 서열번호:27 핵산 서열과 이에 대응되는 아미노산 서열 서열번호:28과, 다른 한편으로 서열번호:31 핵산 서열과 이에 대응되는 아미노산 서열 서열번호:32는 돼지 Prkag3의 두 가지 다른 접합 변이체를 나타낸다.

단백질의 "기능적으로 변이된 돌연변이체"(functionally altered mutant)는 그 활성에 있어서 변화를 야기하는 하나 또는 여러 돌연변이를 포함한다. 그와 같은 돌연변이에는 상기 단백질의 생물학적 활성에 필수적인 도메인의 아미노산 잔기의 특정 결실, 삽입, 또는 치환이 포함된다. 상기 돌연변이는 예를 들면 부분적인 또는 전체적인 활성의 상실, 또는 역으로 활성의 증가, 또는 조절 작용인자(effector)에 대한 반응의 결함 등을 야기한다. 결실, 삽입 또는 비보존적 치환은 생물학적 활성에 대하여 치명적인 효과를 야기하기가 더 쉽다; 그러나, 보존적 치환도 그것이 단백질 활성 부위의 중요한 위치에서 발생한다면, 주목할만한 효과를 야기할 수 있다.

Prkag3의 기능적으로 변이된 돌연변이체의 비한정적인 예는:

- 서열번호:2 또는 서열번호:4의 41번 위치에 존재하는 아르기닌 잔기의 글루타민 잔기로의 비보존적 치환으로부터 야기되는 R41Q 변이체(이 치환은 당 함량의 중대한 증가를 초래하며, 따라서 골격근의 당 분해능(glycolytic potential)을 증가시킨다.);

- 서열번호:2 또는 서열번호:4의 40번 위치에 존재하는 발린 잔기의 이소류 신 잔기로의 치환으로부터 야기되는 V40I 변이체(이 치환은 당 함량의 감소를 초래하며, 따라서 골격근의 당 분해능을 감소시킨다.).

이러한 치환들은 Prkag3과 종전에 알려진 AMPK의 γ서브유니트의 이소형 사이에서 높게 보존된 첫 번째 CBS 도메인의 일부분 내에서 일어난다.

Prkag3에 대한 잔기 번호는 서열번호:2 또는 서열번호:4의 아미노산 번호를 의미한다. 종전에 알려진 γ1과 γ2 이소형을 갖는 인간과 돼지의 Prkag3 서열의 정렬은 도 3에 도시되어 있다.

본 발명은 또한 Prkag3의 돌연변이체를 제공하는데, 이는 예를 들면 Prkag3 폴리펩티드의 일부분을 결실시키는 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 돌연변이체는 일반적으로는 기능적으로 변이되어 있다. 그들은 전체 Prkag3 서열과 70% 미만의 동일성을 가질 수 있다. 그러나, 상기 돌연변이체들의 비결실 서열의 동일성은, 대응되는 Prkag3 서열과 함께, 더욱 구체적으로 대응되는 서열번호:2 유래의 서열과 함께 정렬될 경우, 70%를 초과하여 유지되어야 한다. 상기 돌연변이체는, 예를 들면 핵산 단편의 결실 또는 삽입, 또는 기능적 Prkag3를 코드하는 핵산 서열에 넌센스 코돈을 도입하는 점 돌연변이(punctual mutation)에 의해 얻어지는 핵산 서열의 발현으로부터 야기될 수 있다.

본 발명은 또한 AMPK γ서브유니트의 기능적으로 변이된 돌연변이체를 제공하는데, 이러한 돌연변이체는 첫 번째 CBS 도메인, 바람직하게는 서열번호:2 또는 서열번호:4의 30 내지 50번째 잔기 사이에 걸친 영역에 정렬된 영역 안에 위치하는 상기 기능적 변이의 원인이 되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 상기 돌연변 이는 인접하거나 그러하지 아니한, 하나의 아미노산 또는 몇몇 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환으로부터 야기된다. 더욱 바람직하게는, 이러한 돌연변이는 서열번호:2 또는 서열번호:4의 35 내지 45번째 잔기 사이에 걸친 영역에 정렬된 영역 안에 위치하는데, 예를 들면 γ1 이소형의 65 내지 75번째 잔기 사이에 걸친 영역 안에 위치한다.

특정 실시예에 따르면, 상기 돌연변이는 비보존적 치환이며, 바람직하게는 R →Q 치환이다. 또 다른 특정 실시예에 따르면, 상기 돌연변이는 보존적 치환이며, 바람직하게는 V →I 치환이다.

유리하게는, 상기 돌연변이는 서열번호:2 또는 서열번호:4의 41번째 잔기에 대응되는 잔기, 예를 들면, γ1 이소형의 경우에는 70번째 잔기에 위치하며, 또는 서열번호: 2 또는 서열번호: 4의 40번째 잔기에 대응되는 잔기, 예를 들면, γ1 이소형의 경우에는 69번째 잔기에 위치한다.

또한, 본 발명은 γ서브유니트가 본 발명의 폴리펩티드로 구성되는 헤테로트리머 AMPK를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 정의한 기능적 또는 기능적으로 변이된 Prkag3 또는 AMPK γ서브유니트의 기능적으로 변이된 돌연변이를 코드하는 분리된 핵산 서열 및 이러한 핵산 서열 중 어느 하나에 상보적인 핵산 서열을 제공한다.

여기에는 특히 PRKAG3 유전자의 천연 대립형질 유전자의 서열을 갖는 분리된 핵산 서열뿐만 아니라, PRKAG3 유전자의 인공적 돌연변이체의 서열을 갖는 분리된 핵산 서열이 포함되나, 상기 핵산 서열은 EST GENBANK AA178898으로 구성되지는 않 는다.

여기에는 또한 상기 정의한 바 있는 AMPK의 기능적으로 변이된 γ1 또는 γ2 서브유니트를 코드하는 PRKAG1 또는 PRKAG2 유전자의 자연적 또는 인공적 돌연변이체의 서열을 갖는 분리된 핵산 서열도 포함된다.

본 발명의 핵산은 재조합 DNA 기술 및/또는 화학적 DNA 합성의 공지의 방법에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 방법들은 또한 자연적으로 발생하는 DNA 서열 내에 원하는 돌연변이를 도입하는 것을 가능하게 한다.

PRKAG3 유전자의 천연의 대립형질을 코드하는 핵산의 예로는, 돼지 유전자의 천연의 대립형질을 코드하는 서열번호:1과, 인간 유전자의 천연의 대립형질 유전자를 코드하는 서열번호:3이 있다. 이러한 서열들은 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 다른 종으로부터 PRKAG3을 분리하거나, 같은 종으로부터 PRKAG3의 다른 대립형질 유전자형을 분리하도록 하는 프로우브(probe)을 제작하는 데에 사용되어질 수 있다.

본 발명은 또한 적어도 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열의 일부분, 바람직하게는 PRKAG3 유전자의 일부분 및 3′및/또는 5′에 이웃하는 게놈 서열의 500kb까지, 바람직하게는 100kb까지를 포함하는 척추동물 종, 더욱 구체적으로는, 가금(poultry)과 같은 조류 또는 특히 소, 양, 돼지, 쥐, 말 및 인간을 포함하는 포유류의 게놈 DNA 서열도 포함한다.

그와 같은 게놈 DNA 서열은 당업계에 공지된 방법으로 얻어질 수 있는데, 예를 들면 제한부위 PCR(SARKAR 등, PCR Methods Applic., 2, 318-322, 1993), Prkag3의 코드 영역에 기초한 발산형 프라이머를 이용한 역(inverse) PCR (TRIGLIA 등, Nucleic Acids Res., 16, 8186, 1988), 캡쳐(capture) PCR (LAGERSTROM 등, PCR Methods Applic., 1, 111-119, 1991) 등의 방법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열을 연장함으로써 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열 또는 본 발명의 게놈 DNA 서열의 특이적 단편 뿐 아니라, 이들과 특이적으로 혼성화(hybidization)하는 핵산 단편을 포함한다. 바람직하게는 이러한 단편의 길이는 적어도 15bp이며, 더욱 바람직하게는 적어도 20bp이다.

"특이적 단편"(specific fragment)이란 종래 기술의 관련된 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열에서는 발견되지 않고, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열에서만 발견되는 서열을 갖는 핵산 단편을 말한다. 이는 공지의 PRKAG1 이나 PRKAG2 유전자 중 하나와 공유하는 서열로 구성되는 핵산 단편은 배제한다.

"특이적으로 혼성화하는 단편"(specifically hybridizing fragment)이란 엄격한 조건 하에서, 종래 기술의 관련된 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열과 혼성화함이 없이, 오직 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열과만 혼성화할 수 있는 핵산 서열의 단편을 말한다. 이는 공지의 PRKAG1이나 PRKAG2 유전자 중 하나와 공유하는 서열의 상보서열로 구성되는 핵산 단편은 배제한다.

EST GENBANK AA178898 이나 EST GENBANK W94830, 또는 그 상보서열로 구성된 핵산 단편 또한 배제된다.

상기 특이적 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 단편은 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열을 탐지 및/또는 증폭하는 데에 있어서 프라이머 또는 프로우브(probe)으로 사용되어질 수 있다. 본 발명은 상기에서 정의된 바와 같은 특이적 핵산 단편 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 단편으로 구성되는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 프라이머 셋트를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 서열이 적절한 전사 또는 번역 조절 요소의 조절 하에 놓여 있는 발현 벡터이다. 이러한 벡터들은 공지의 재조합 DNA 또는 유전공학적 기법들에 의해 얻어지고 숙주 세포 내로 도입되어질 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 벡터, 바람직하게는 발현 벡터(expression vector)에 의해 형질전환된 원핵 또는 진핵의 숙주 세포를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건에서 상기 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 지닌 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포 배양액에서 폴리펩티드를 회수하는 단계에 의하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 γ서브유니트를 포함하는 헤테로트리머 AMPK는 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열, α서브유니트를 코드하는 핵산 서열 및 β서브유니트를 코드하는 핵산 서열을 함께 또는 각각 발현시키는 단계 및 상기 헤테로트리머로 재구성하는 단계에 의하여 얻어질 수 있다.

상기와 같이 얻어진 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성(immunogenic) 단편은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 항체를 제작하는 데에 사용되어질 수 있다. 따라서, 전체 Prkag3 폴리펩티드에 대한 항체로서, 그의 어떠한 변이체도 인식할 수 있는 항체를 얻을 수 있다. Prkag3의 특정 변이체(기능적 또는 비기능적)의 특이적 에피토프(epitope)에 대한 항체 또는 AMPK γ서브유니트의 첫 번째 CBS 도메인에 돌연변이를 갖는 기능적으로 변이된 돌연변이체의 특이적 에피토프에 대한 항체로서, 상기 변이체 또는 기능적으로 변이된 돌연변이체를 인식할 수 있는 항체를 또한 얻을 수 있다.

본 명세서에서 서술한 바와 같이, AMPK γ서브유니트의 돌연변이, 특히 AMPK γ서브유니트의 첫 번째 CBS 도메인에서의 돌연변이는 인간을 포함한 척추동물에서 에너지 대사의 장애(예를 들면 당뇨, 비만)를 야기할 수 있다. 더 나아가, PRKAG3 유전자의 첫 번째 CBS 도메인 또는 다른 부분에서의 돌연변이는 근육 대사의 장애를 야기하여 근병증(myopathy), 당뇨병, 심혈관질환과 같은 질병들로 이어질 수 있다.

본 발명은 상기 질병들을 탐지하고 치료하는 수단을 제공한다.

더욱 구체적으로는, 본 발명은 대사 장애의 진단 평가, 유전적 테스트 및 예후를 위하여 본 발명의 핵산 서열 및/또는 폴리펩티드 서열을 이용하는 방법에 관한 것이다.

예를 들면, 본 발명은 대사 장애, 더욱 구체적으로는 탄수화물 대사 장애, 그리고 바람직하게는 AMPK γ서브유니트를 코드하는 유전자 내의 돌연변이로부터 야기되는 변이된, 특히 과도한, 세포 내의 당 축적과 관련된 질병을 진단하는 방법 을 제공하며, 상기 방법은 척추동물로부터 얻어진 핵산 시료에서, 기능적으로 변이된 PRKAG3 유전자의 발현 또는 첫 번째 CBS 도메인 내에 돌연변이를 갖는 AMPK γ서브유니트의 기능적으로 변이된 돌연변이의 발현 탐지 및/또는 측정하는 단계 또는 질병을 가진 것으로 의심되는 척추동물의 게놈 상에 존재하는 PRKAG3 유전자, 또는 AMPK γ서브유니트의 첫 번째 CBS 도메인을 코드하는 서열에서의 돌연변이를 탐지하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 질병들은 변이된, 특히 과도한, 근육 세포 내의 당 축적과 관련되고, 기능적으로 변이된 PRKAG3 유전자의 발현으로부터 야기된다.

기능적으로 변이된 Prkag3의 발현, 또는 첫 번째 CBS 도메인 내에 돌연변이를 갖는 AMPK γ서브유니트의 기능적으로 변이된 돌연변이의 발현은 상기 서술한 바와 같이 본 발명의 기능적으로 변이된 폴리펩티드에 대한 특정 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하여 탐지되거나 측정되어질 수 있다. 적절한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 그 방법들로는 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사성면역분석법(radioimmunoassay, RIA) 및 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting, FACS)이 있다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열은 정상인, 보유자, 감염자 사이의 유전자 서열 또는 인접 서열의 차이를 탐지함으로써 PRKAG3 유전자 내, 또는 AMPK γ서브유니트의 첫 번째 CBS 도메인을 코드하는 서열 내의 돌연변이를 탐지해내는 데에 사용되어질 수 있다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 PRKAG3 유전자 내, 또는 AMPK γ서브유니트의 첫 번째 CBS 도메인을 코드하는 서열 내의 돌연변이를 탐지하는 방법을 제공한다:

- 척추동물로부터 핵산 시료를 얻어내는 단계;

- 상기 핵산 시료에 상기 언급한 바와 같은 돌연변이 Prkag3을 코드하는 핵산 서열이 존재하는지, 또는 첫 번째 CBS 도메인 내에 돌연변이를 지니는 AMPK γ서브유니트의 돌연변이가 존재하는지 여부를 검사하는 단계.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 하기 단계를 포함하는 PRKAG3 유전자 내, 또는 AMPK γ서브유니트의 첫 번째 CBS 도메인을 코드하는 서열 내의 돌연변이를 탐지하는 방법을 제공한다:

- 척추동물로부터 핵산 시료를 얻는 단계;

- 상기 핵산 시료를 본 발명의 핵산으로부터 얻어낸 핵산 프로우브와 접촉시키는 단계 및 상기 프로우브와 탐지하고자 하는 돌연변이 서열 사이의 특이적 혼성화 조건 하에서 상기 돌연변이에 걸치는(span) 단계;

- 혼성화 복합체를 탐지하는 단계.

바람직하게는 본 발명의 방법은, 혼성화 이전에, 핵산 시료로부터 돌연변이를 찾고자 하는 PRKAG3 서열의 적어도 일부분 또는 AMPK γ서브유니트의 첫 번째 CBS 도메인을 코드하는 서열을 포함하는 서열의 PCR 증폭 단계를 더욱 포함한다.

프로우브가 완전히 대응되는 상보 서열과만 특이적 혼성화를 하게 하여, 점 돌연변이(punctual mutation)의 검사에 유용한 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 그들은 예를 들면, 대립형질 유전자 특이적 PCR(Allele Specific PCR)(GIBBS, Nucleic Acid Res., 17, 2427-2448, 1989), 대립형질 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐색(Allele Specific Oligonucleotide Screening)(SAKAI 등, Nature, 324, 163-166, 1986)과 같은 것들이 있다.

PRKAG3 유전자에서의 돌연변이는 상기 돌연변이와 밀접하게 연관된 다형 마커(polymorphic markers)의 탐지를 통해서도 탐지되어질 수 있다.

본 발명은 또한 상기 다형 마커, 적어도 PRKAG3 유전자의 일부분 및 3′및/또는 5′인접 서열의 최대 500kb까지, 바람직하게는 300kb까지, 더욱 바람직하게는 100kb까지를 포함하는 게놈 DNA 서열 내에 포함된 더욱 특이적 다형 마커를 확인하는 수단을 제공한다.

상기 다형 마커는 예를 들면, 상기 핵산 서열과 이에 인접하는 염색체 서열을 포함하는 클론을 선별하기 위하여 척추동물의 게놈 DNA를 PRKAG3 유전자에 특이적인 프로우브를 사용하여 스크리닝하는 단계 및 상기 인접하는 염색체 서열에서 다형 마커를 확인하는 단계에 의해 얻어질 수 있다. PRKAG3 유전자의 주어진 돌연변이 대립형질 유전자와 연관된 다형 마커의 대립형질 유전자 또한 상기 돌연변이 대립형질 유전자의 존재가 본 발명의 핵산 프로우브와의 혼성화에 의하여 미리 탐지된 개인 유래의 게놈 DNA 라이브러리를 사용함으로써 쉽게 확인되어질 수 있다.

다형 마커는 예를 들면, 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism), 마이크로새틀라이트(microsatellites), 삽입/결실 다형성 및 제한 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 등이 있다. 이러한 다형 마커들은 여러 개인들로부터 얻은 PRKAG3 유전자에 이웃하는 서열의 비교에 의해 확인되어질 수 있다. 미소위성 또한 기지의 미소위성 모티프에 특이적인 핵산 프로우브와의 혼성화에 의해 확인되어질 수 있다.

다형 마커가 확인된 이후에는 다형성 부위를 걸치는 DNA 단편을 염기서열분석하고, 이 DNA 단편을 증폭시키기 위한 프라이머 셋트를 고안할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 DNA 프라이머를 포함한다.

PRKAG3 유전자의 돌연변이를 탐지하는 것은 척추동물로부터 게놈 DNA의 시료를 얻는 단계, 본 발명의 프라이머 셋트를 이용한 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 다형 마커에 걸쳐있는 상기 DNA 단편을 증폭하는 단계 및 상기 증폭된 DNA 단편에서 상기 돌연변이와 연관된 상기 다형 마커의 대립형질 유전자의 존재를 탐지하는 단계에 의해 수행된다.

실시예에, 본 발명에 따라 얻을 수 있는 다형 마커와 돼지의 PRKAG3 유전자의 RN^- 대립형질 유전자와 밀접하게 연관된 다형 마커의 탐지를 가능하게 하는 DNA 프라이머를 후술할 표1에 열거하였다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 척추동물은 포유류, 바람직하게는 가축, 더욱 바람직하게는 돼지이고, 탐지되는 돌연변이는 기능적으로 변이된 Prkag3을 생산한다. 상기 돌연변이를 탐지함으로써 상기 포유류 또는 그 자손이 근육 내 당 농도를 평균보다 이상 또는 이하로 가질 수 있는지 여부를 예측할 수 있다. 그와 같은 돌연변이의 예는 R41Q 치환을 갖는 기능적으로 변이된 Prkag3을 생산하고, 골격근 내에 당 함량을 증가시킨다.

그와 같은 돌연변이의 또 다른 예는 V40I 치환을 갖는 기능적으로 변이된 Prkag3을 생산하고, 골격근 내에 당 함량을 감소시킨다. 그와 같은 돌연변이를 갖는 가축에 있어서 도살 후에 나타나는 당의 분해가 보통의 동물들보다 덜 중요하며, 높은 pH 및 잠재적으로 더 나은 육질을 갖게 한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 본 발명의 적어도 하나의 특이적 핵산 단편 또는 본 발명의 핵산 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 핵산 단편을 함유하는 용기를 포함한다. 상기 핵산 단편은 표지되어 있을 수 있다. 상기 키트는 또한 본 발명의 프라이머 셋트를 포함할 수 있다. 그들은 상업적으로 이용가능한 증폭 키트와 함께 사용되어질 수 있다. 그들은 또한 전기 영동 등을 위해 양성, 음성 대조(control) 반응액 또는 마커, 분자량 마커 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 키트는 항원-항체 반응을 탐지하기 위한 적절한 시약과 함께, 선택적으로 표지된, 본 발명의 항체를 포함할 수 있다. 그들은 또한 양성 또는 음성 대조 반응액이나 마커(marker)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 AMPK의 γ서브유니트를 코드하는 척추동물 유전자, 더 구체적으로는 PRKAG3 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자 산물의 합성이나 활성을 조절하는 수단을 제공한다.

야생형(wild-type) 또는 돌연변이 Prkag3 서브유니트, 또는 첫 번째 CBS 도메인에 돌연변이를 갖는 기능적으로 변이된 돌연변이 γ서브유니트를 포함하는 정제된 AMPK 헤테로트리머가 AMPK의 활성을 조절하거나, 변이된 AMPK의 활성을 회복 시킬 수 있는 생체외(in vitro) 화합물을 스크리닝하는 데에 사용되어질 수 있다. 이는 예를 들면 다음의 단계에 의하여 행해질 수 있다:

- 예를 들면 고효율 스크리닝 방법(high-throughput screening method)을 이용하여 상기 헤테로트리머에 화합물이 결합하는 것을 측정하는 단계; 또는,

- 예를 들면 고효율 스크리닝 방법을 사용하여 AMPK 키나제의 활성 변화를 측정하는 단계.

고효율 스크리닝 방법은 예를 들면 "High throughput screening: The Discovery of Bioactive Substances", J. P. DEVLIN(Ed), MARCEL DEKKER Inc., NEW YORK(1997)에 기재되어 있다.

본 발명의 핵산은 치료 목적으로 사용되어질 수 있다. 예를 들어, 그에 상보적인 분자 또는 단편 (안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides))는 AMPK의 활성을, 더욱 구체적으로는 근육 조직에서, 조절하는 데에 사용되어질 수 있다.

또한, 기능적 Prkag3을 코드하는 핵산 서열은 보통의 AMPK의 활성을 회복시키는 데에 사용되어질 수 있다.

야생형이나 돌연변이 Prkag3 또는 상기 정의한 AMPK γ서브유니트의 기능적으로 변이된 돌연변이를 발현시키거나, 또는 상기 돌연변이 Prkag3 또는 상기 AMPK γ서브유니트의 기능적으로 변이된 돌연변이를 발현시키는 형질전환된 세포 또는 동물 조직은 AMPK 활성의 메카니즘을 해석하거나 또는 AMPK의 발현을 조절할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 데에 있어서 생체외 모델로 사용되어질 수 있다.

스크리닝은 테스트될 화합물을 상기 세포 또는 조직의 배양액에 첨가하는 단계 및 글루코오스 농도(수준), 글루코오스 흡수량 또는 ATP/AMP 비율, 당 또는 지방/단백질 함량의 변화 측정과 같은 방법을 이용한 상기 세포나 조직 내의 에너지 대사 변화를 측정하는 단계에 의하여 수행되어질 수 있다.

본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 갖는 형질전환된 동물들을 제공한다.

하나의 실시예로, 상기 동물들은 적어도 본 발명의 핵산을 포함하는 형질전환 유전자(transgene)를 갖는 형질전환 동물들이다.

다른 실시예로, 상기 동물은 넉아웃(knockout) 동물들이다. 넉아웃(knockout) 동물이란 그 천연적인 또는 내생의 PRKAG3 대립형질 유전자가 불활성화되어 그 자체로 아무런 기능적 Prkag3를 생산할 수 없는 동물들을 말한다.

야생형이나 돌연변이 Prkag3 또는 AMPK γ서브유니트의 기능적으로 변이된 돌연변이를 코드하는 DNA 서열 발명의 공개라는 관점에서 볼 때, 넉아웃(knockout) 동물뿐만이 아니라 형질전환 동물은 당업계에 공지된 기술에 따라, 예를 들어 생체 내(in vivo) 상동적 재조합(homologous recombination)의 수단에 의해 생산할 수 있다.

형질전환 또는 넉아웃(knockout) 동물의 준비에 적합한 방법은 예를 들면 하기의 문헌들에 공개되어 있다: Manipulating the Mouse Embryo, 2판, HOGAN 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; Transgenic Animal Technology, C. PINKERT 편집, Academic Press Inc., 1994; Gene Targeting: A Practical Approach, A. L. JOYNER 편집, Oxford University Press, 1995; Strategies in Transgenic Animal Science, G. M. MONASTERSKY 및 J. M. ROBL 편집, ASM Press, 1995; Mouse Genetics: Concepts and Applications, Lee M. SILVER, Oxford University Press, 1995.

이러한 동물들은 대사 질병이나 장애, 더욱 구체적으로는 근육 내 당 대사의 질병이나 장애에 대한 모델로서 사용되어질 수 있다. 예를 들면 그들은 테스트 분자를 스크리닝하는 데에 사용되어질 수 있다. 따라서, 형질전환 동물은 AMPK 활성을 조절할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 데에 사용되어질 수 있다. 본 발명의 넉아웃 동물들은 특히, 에너지 대사, 더욱 구체적으로는 기능적 Prkag3의 부재 하에서 탄수화물 대사를 조절할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 데에 사용되어질 수 있다.

스크리닝은 테스트되어질 화합물을 동물에 투여하는 단계 및 글루코오스 내성 테스트, 혈중 인슐린 수치의 측정, 조직과 세포 내의 ATP/AMP 비율, 당 또는 지방/단백질 함량 변화의 측정과 같은 방법을 사용하여 상기 동물에서의 에너지 대사의 변이를 측정하는 단계에 의하여 수행되어질 수 있다.

변화된 육질특성 또는 변화된 에너지 대사를 갖는 형질전환 또는 넉아웃 가축이 또한 얻어질 수 있다.

이하 본 발명의 핵산의 확보 및 사용에 관한 실시예를 참고하여 부가적인 서술에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 실시예들은 단지 본 발명의 예시를 위하여 주어진 것일 뿐, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예1: PRKAG3 유전자의 분리

돼지 박테리아 인공 염색체(Bacterial Artificial Chromosome)(BAC) 라이브러리(ROGEL-GAILLARD 등, Cytogenet and Cell Genet, 851, 273-278, 1999)를 탐색하였으며, RN 유전자를 함유하는 돼지 염색체 15의 영역을 가로지르는 연속하는(a contig of) 중첩 BAC 클론을 제조하였다. 이들 BAC 클론을 하기 표 1에 기술된 바와 같은 단일염기 다형(SNPs) 또는 마이크로새틀라이트(MS)의 형태의 새로운 유전적 마커를 개발하기 위하여 차례로 사용하였다.

상기 새로운 마커는 고해상 연관 지도를 제조하기 위하여 일부 이전에 기술 된 마커와 함께 사용하였다. RN 좌에서의 분리에 대한 약 1,000 정보제공적 감수분열을 포함하는 가계도 자료를 사용한 표준 연관 분석에 의하여 MS479L3에 인접하는 영역 및 마이크로새틀라이트 Sw936에 멀리 떨어진 영역으로부터 RN을 배제시킬 수 있었다. 동일한 마커 및 스웨덴 햄프셔(Swedish Hampshire) 집단 유래의 68마리의 육종용 수퇘지의 임의 시료로 연관 비평형(Linkage Disequilibrium)(LD) 분석을 행하였으며, 근육 중의 글리코겐 함량을 측정함으로써 RN 표현형에 대하여 점수를 매겼다. DISMULT 프로그램(TERWILLIGER, Am. J. Hum. Genet., 56, 777-787, 1995)을 사용한 LD 분석의 결과를 도 1에 나타내었다. 마커 MS127B1 및 SNP127G63 주위에 예리한 LD 피크를 나타내고 있다. 이들 마커는 RN^- 대립형질과의 완전 연관 비평형을 보이는 것, 즉, RN^-는 이들 두개의 좌에서 단일 대립형질과 연관되어 있다. 이 발견을 가장 간단하게 해석하면, RN^- 돌연변이는 이들 대립형질이 있는 염색체상에서 일어나고, 두 마커는 RN 좌와 아주 밀접하게 연관되어 있어서 재조합 빈도가 0%에 가깝다는 것이다. 상기 두 마커는 중첩 BAC 클론 127G6 및 134C9 모두에 존재하며, 이는 RN 유전자가 같은 클론상에 존재하거나 이웃하는 클론 중의 하나에 존재할 수 있다는 것을 의미한다.

BAC 클론 127G6의 샷-건(shot-gun) 라이브러리를 제조하였으며, 상기 클론으로부터 약 500,000bp 램덤 DNA 서열을 제공하는, 1,000개를 초과하는 서열 판독 결과를 수집하였다. 상기 데이터를 분석하였으며 PHRED, PHRAP 및 CONSED 소프트웨어 패키지(University of Washington Genome Center, http://bozeman.mbt.washington.edu)로 서열 연속체(contigs)를 구성하였다. 서열 데이터는 REPEATMASKER 소프트웨어(http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker)를 사용하여 반복서열을 마스크하였으며, NCBI 웹 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용하여 BLAST 검색을 행하였다. 코드 서열과의 매치라고 확신을 줄 수 있을 정도의 3개의 매치가 얻어졌다. 이들 중 둘은 인간 cDNA 서열/유전자, 돼지 튜불린-티로신 리가제와 유사한 것으로 기술되었으며 HSA2q 상에 위치하는 KIAA0173(UniGene cluster Hs.169910, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) 및 HSA2q33-ter 상에 위치하는 CYP27A1(UniGene cluster Hs. 82568)에 대한 것이다. 상기 결과는, RN 영역은 HSA2q33-36과 상동성이라는 사실이 잘 밝혀진 바(ROBIC 등, Mamm. Genome, 10, 565-568, 1999)와 같이, 상기 돼지 코드 서열이 이들 인간 유전자와 오토로거스(orthologous)하다는 것을 암시한다. 그러나, 이들 서열 중 어느 것도 RN의 가능한 후보 유전자인 것 같지는 않다. BAC 127G6 중에서 확인된 제3의 코드 서열은, 효모 SNF4 서열을 포함한 다양한 AMP-활성화 단백질 키나제 γ서열과 아주 유의한 서열 유사성을 보였다. 이 유전자의 cDNA 서열을 rn⁺/rn⁺ 동종접합체 유래의 균육 mRNA를 사용하여 RT-PCR 및 RACE 분석에 의하여 결정하였다. 이 서열은 도 2(도 2a, 도 2b 및 도 2c) 및 서열목록의 서열번호:1로 나타내었다.

도 2의 설명부분:

5′UTR: 5′번역되지 않은 영역

3′UTR: 3′번역되지 않은 영역

CDS: 코드 서열

***: 중지 코돈

'-': 주(master) 서열과 동일함

'ㆍ': 정렬 틈

번역의 프레임은 단백질 패밀리의 다른 구성원과의 상동성에 기초하고 프레임 중의 제1 메티오닌 코돈이 개시 코돈이라고 가정하여 결정하였다. 이 근거에 의하여 추론된 폴리펩티드 서열을 서열목록의 서열번호:2에 나타내었다.

돼지 PRKAG3 cDNA의 완전한 뉴클레오티드 서열을 서열목록의 서열번호:27에 나타내었으며, 그 완전한 폴리펩티드 서열을 서열목록의 서열번호:28 및 도 3에 나타내었다.

도 3은 CLUSTAL W 프로그램(THOMPSON 등, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680, 1994)으로 구성된, 뉴클레오티드 데이터베이스에 있는 대표적인 AMPK γ서열과의 아미노산 정렬(alignment)을 나타낸다.

도 3의 설명부분:

사용된 서열:

HumG1: Genbank U42412

MusG1: Genbank AF036535

HumG2: 인간 PRKAG2 (Genbank AJ249976)

PigG3: 돼지 PRKAG3 (본 연구)

HumG3: 인간 PRKAG3 (본 연구)

Dros: Drosophila(Genbank AF094764)

SNF4(효모): Genbank M30470

PRKAG2 및 Drosophila 서열 모두 더 긴 아미노말단 영역을 가지고 있으나, PRKAG3의 아미노말단 영역과 유의한 상동성을 보이지 않았으며, 따라서 포함시키지 않았다.

약어:

*: 중지 코돈

'-': 주 서열과 동일

'ㆍ': 정렬 틈

4개의 CBS 도메인은 윗선을 그었으며, RN^- 돌연변이의 위치는 화살표로 표시하였다.

하기 표 2는 포유동물, Drosophila 및 효모 AMPKG/SNF 서열 간의 아미노산(상단 대각선) 및 뉴클레오티드 서열(하단 대각선) 동일성(%)을 나타낸다. 돼지 PRKAG3 및 인간 PRKAG3의 경우, 상기 동일성은 뉴클레오티드 서열에 대하여는 각각 서열번호:1 및 서열번호:3 및 아미노산 서열에 대하여는 서열번호:2 및 서열번호:4에 의하여 표시되는 그들의 일부분에 참조하여 계산하였다.

도 4는 외부그룹(outgroup)으로 효모 SNF4를 사용하고 PAUP 소프트웨어(SWOFFORD, Phylogenetic analysis using parsimony(및 그외 방법들), Sinauer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachusetts, 1998))로 구성된 Neighbor-Joining 발생계통도를 나타낸다: 1,000 복제수(replicate)로 부트스트랩 분석(bootstrap analysis)에서 얻어진 가지 순서(branch order)에 대한 지지를 표시하였고, 계통도의 단위를 아래에 표시하였다. 상기 결과는 RN 영역에 위치하는 돼지 유전자는 포유동물 PRKAG1 및 PRKAG2 이소형(isoform)과 구별되며, 근육 cDNA 라이브러리로부터 파생된 인간 EST 서열 AA178898(GenBank)로 나타내어지는 인간 유전자에 가장 오토로거스(ortholgous)하다는 것을 보였다. 이 유전자는, 지금까지 특성화된 포유 동물 AMP-활성화 단백질 키나제 γ의 제3의 이소형이기 때문에 본 명세서에서는 PRKAG3이라고 한다.

이 유전자의 cDNA 서열을 인간 골격근 cDNA(Clontech, Palo Alto, CA)를 사용한 RT-PCR 및 5′RACE 분석으로 결정하였다. 이 서열을 도 2 및 서열목록의 서열번호:3에 나타내었다. 돼지 서열번호:2(참고: 표 2)와 90% 동일성을 갖는 추론된 폴리펩티드 서열을 도 2 및 서열목록의 서열번호:4에 나타내었다.

완전한 cDNA 서열을 또한, 서열목록의 서열번호:29에 나타내었으며, 추론된 폴리펩티드 서열은 서열목록의 서열번호:30 및 도 3에 나타내었다.

고해상 TNG 방사 혼성 패널: (http://shgc-www.stanford.edu/RH/TNGindex.html)을 사용하여, 모두 돼지 BAC127A1에 존재하는, PRKAG3, CYP27A1 및 KIAA0173의 인간 상동체(homolog)의 지도를 작성하였다. 상기 3 유전자는 인간 게놈에서 또한 아주 가깝게 연관되어 있다. PRKAG3은 KIAA0173으로부터 33 cR50.00 및 CYP27A1으로부터 52 cR50.00의 거리에 위치되었으며, 로드 점수 지지(lod score support)는 각각 6.8 및 4.5이었다.

글리코겐 저장을 포함한, 에너지 대사의 조절에 있어서의 AMPK의 이미 알려진 역할 및 최대 연관 비평형을 보이는 영역에 위치한다는 사실로부터, PRKAG3이 RN에 대한 가장 유력한 후보 유전자로 추정되었다. 이는 인간 PRKAG1(GenBank 기탁번호 AA018675에 해당하는 IMAGE 클론 0362755), 인간 PRKAG2(GenBank 기탁번호 W15439에 해당하는 IMAGE 클론 0322735) 및 돼지 PRKAG3 프로우브를 사용한 인간 복수 조직 노던 블롯(CLONTECH, Palo Alto, CA)의 혼성화 분석에 의하여 더 강하게 되었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 설명부분:

H: 심장, B: 뇌, P1: 태반, L: 폐, Li: 간, M: 골격근, K: 신장, Pa: 췌장, S: 지라, Th: 흉선, P: 전립선, T: 정소, O: 난소, I: 소장, C: 결장(점액 내층), PBL: 말단 혈액 백혈구

PRKAG1 및 PRKAG2 포로우브가 발현의 광범위 조직 분포를 보인 반면, PRKAG3은 분명하게 근육-특이적 발현을 보였다. 이 결과는 또한, PRKAG1 및 PRKAG2를 나타내는 복수의 ESTs가 다양한 cDNA 라이브러리에서 확인되었으나, PRKAG3을 나타내는 단일 EST(GenBank 기탁번호 AA178898)는 근육 cDNA 라이브러리로부터 얻어졌던 인간 EST 데이터베이스에 의하여 지지된다. PRKAG3이 근육-특이적으로 발현되고 간에서는 발현이 없다는 사실은 RN^-의 표현형적 효과, 즉 글리코겐 함량은 근육에서 변화하나, 간에서는 정상인 것(ESTRADE 등, Comp. Biochem. Physiol. 104B, 321-326, 1993)과 완전히 일치한다.

PRKAG3 서열은 RT-PCR 분석에 의하여 rn⁺/rn⁺ 및 RN^-/RN^-로부터 결정하였다. rn⁺ 및 RN^- 동물 유래의 서열 사이를 비교해본 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 전체 7개의 뉴클레오티드 차이, 이중 4개는 비동의적(nonsynonymous) 치환인 것이 발견되었다. 다른 혈통(breed)의 추가의 rn⁺ 및 RN^- 돼지 유래의 게놈 DNA로 이들 7개의 SNPs를 탐색한 결과 5개의 다른 PRKAG3 대립형질을 발견하였으나, R41Q 미스센스 치환만이 배타적으로 RN^-과 연관되어 있었다. 이 비보존적 치환은 AMPK γ 체인의 이소타입 형태 중 가장 보존된 영역인 CBS1에서 일어나며, 이 잔기(Prkag1에서 70번)에서의 아르기닌은 해당하는 Drosophila 서열(도 3)에서 뿐만 아니라 포유동물 AMPK γ서열의 다른 이소형 중에서 보존되어 있다. R41Q 돌연변이에 대한 간단한 진단학적 DNA 테스트를 올리고뉴클레오티드 라이게이션 검사(OLA; LANDEGREN 등, Science, 241, 1077-1080, 1988)에 근거하여 설계하였다. 다른 혈통 유래의 많은 수의 rn⁺ 동물 뿐만 아니라 햄프셔 혈통 유래의 많은 RN^- 및 rn⁺ 동물을 탐색한 결과, 하기의 표 4에 나타낸 바와 같이, 41Q 대립형질은 모든 RN^- 동물에 존재하나 rn⁺ 동물에는 발견되지 않는다는 것을 보였다. 다른 혈통에서는 41Q 대립형질이 없다는 것은 RN^- 대립형질이 햄프셔 혈통에서 유래하였다는 가정과 일치한다; 상기 대 립형질은 다른 혈통 유래의 순종 동물에서는 아직 발견되지 않았다. 결론적으로, 상기 결과는 PRKAG3은 RN 유전자와 동일하고, R41Q 치환이 병인적 돌연변이일 가능성이 가장 크다는 확신할 수 있는 증거를 제공하는 것이다.

표 3. 여러 돼지 집단^a에서 rn⁺ 및 RN^- 대립형질과 연관된 PRKAG3 서열의 비교

^a 뉴클레오티드 및 코돈 번호는 서열번호:1의 번호매김에 따른 것이다.

^b H=햄프셔(Hampshire), L=랜드레이스(Landrace), LW= 크고 흰(Large White), M=메이샨(Meishan), WB=야생 수퇘지, D=두로크(Duroc), N.D.=탐지되지 않음, "-"는 위의 서열과 동일함을 나타낸다.

표 4.

^a 프랑스 및 스웨덴 햄프셔 집단 모두를 나타낸다.

^b 이형접합성 RN^-/rn⁺는 가계도 정보를 사용하여 추론하였다.

^c 혈통: 앵글러 새들백, n=31; 블론드 만갈리차, n=2; 분테 벤트하이머, n=16; 두로크, n=160; 괴팅거 미니피그, n=4; 랜드레이스, n=83; 크고 흰, n=72; 메이샨, n=8; 피에트레인, n=75; 레드 만갈리차, n=5; 로트분테 후수머, n=15; 쉬발벤바우흐 만갈리차, n=7; 쉬베비쉬 헬리쉐, n=2; 유럽 야생 수퇘지, n=5; 일본 야생 수퇘지, n=3.

^d 서열번호:1의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다.

어떠한 특정한 기작에 구속되는 것은 아니나, PRKAG3을 포함한 AMPK 헤테로트리머가 골격근으로의 포도당 수송의 조절에 관련되어 있다고 가정할 수 있다.

AMP 유사체 AICAR 또는 근육 수축에 의하여 유도된 AMPK 활성화가 골격근에서 포도당 섭취를 증가시키게 한다는 것이 최근 보고되었다(BERGERON 등, Am. J. Physiol., 276, E938-944, 1999; HAYASHI 등, Diabetes, 47, 1369-1373, 1998). 이것이 PRKAG3을 포함한 AMPK 헤테로트리머의 기능이라면, R41Q는 예를 들면, 불활성 화시키는 알로스테릭 부위(allosteric site)의 상실로 인하여, 구성적으로 활성이 있는 전효소(holoenzyme)가 되도록 하는 기능 취득(gain-of-function) 돌연변이일 수 있다. 그렇다면, RN^- 동물에서 AMPK 활성이 감소하는 것은 근육의 고에너지 상태로 인한 피드백 저해를 반영하는 것일 것이다. 골격근으로의 포도당 섭취가 증가되면, RN^- 동물에서 관찰된 바와 같이 근육 글리코겐 함량을 증가시키게 할 것으로 예상된다. 형질전환 생쥐에서 포도당 수송단백질4(glucose transporter4)(GLUT4)가 과발현되면 포도당 섭취를 증가시키고 글리코겐 저장을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다(TREADWAY 등, J. Biol. Chem., 269, 29956-29961, 1994). 이런 형태의 기능 취득 모델은 하나의 조절되지 않은 카피가 존재함으로써 AMPK 효소 활성에 큰 영향을 미칠 수 있는 바와 같이, RN^-가 우성(dominance)인 것과 일치한다.

RN^- 대립형질과 연관된 R41Q 치환의 기능적 중요성에 대한 또다른 가설을 또한 제안할 수도 있다. 글리코겐의 이용에 있어서 효모 SNF1 효소 및 에너지-소비 경로를 저해하고, 에너지-생산 경로를 촉진하는 포유동물 AMPK의 확립된 역할에 근거하면, 활성화된 AMPK는 글리코겐 합성을 저해하고 글리코겐 분해를 촉진할 것으로 기대된다. 이것이 PRKAG3 산물을 포함하는 이소형의 기능적 역할이라면, R41Q 치환은 AMPK 헤테로트리머를 불활성 상태로 고정시켜, AMP 활성화 및 글리코겐 분해를 저해하는 기능 상실(loss-of-function) 돌연변이 또는 음성-우성 돌연변이(negative-dominant mutation)일 것이다. 이들 경우에 있어서, 표현형적 효과는 RN^-는 완전 우성인 것처럼 보이기 때문에, 하플로-불충분(haplo-insufficiency)에 의하여 설명되어야 한다.

따라서, R41Q는 우성 음성 돌연변이일 수 있으나, 근육 내의 주요 AMPK 활성은 PRKAG1 및 2 이소형(CHEUNG, 등, Biochem. J. 346, 659(2000))과 관련되는 것처럼 보이기 때문에 복수 이소형을 간섭하는 경우에만 우성 음성 돌연변이일 수 있다.

RN^- 돌연변이의 분명한 표현형은, PRKAG3이 골격근에서의 에너지 대사의 조절에 중심적 역할을 한다는 것을 나타낸다. 예를 들면, PRKAG3은 글리코겐 저장을 증가시키는 것과 관련되는, 물리적 운동에 대한 적응과 관련이 있을 것이다. 또한, PRKAG3(또는 다른 AMPK 유전자) 내의 기능 상실 돌연변이는 개체를 비인슐린 의존성 당뇨병이 되기 쉽게 할 수 있으며, AMPK 이소형은 이 질환의 치료를 위한 잠재적 약제 표적이다.

실시예2: 돼지 PRKAG3 중의 R41Q 치환의 탐지

코돈 41을 포함한 PRKAG3의 일부분을 100ng 게놈 DNA, 0.2mM dNTP, 1.5mM MgCl₂, 4.0pmol의 포워드(AMPK3F3: 5′-GGAGCAAATGTGCAGACAAG-3′) 및 리버스(AMPK3R2: 5′-CCCACGAAGCTCTGCTTCTT-3′) 프라이머, 10% DMSO, Taq DNA 폴리머라제 1U 및 반응 버퍼(ADVANCED BIOTECH, LONDON, 영국)를 포함하는 10㎕ 반응액 중에서 증폭하였다. 주기 조건은 94℃에서 5분 동안 초기 배양, 그 후 94℃(1분), 57℃(1분) 및 72℃(1분) 3회, 그리고 94℃(20초), 55℃(30초) 및 72℃(30초) 35회를 포함한다. 뉴클레오티드 122번 위치에서의 대립형질 분별은 올리고뉴클레오티드 라이게이션 검사(OLA, LANDEGREN 등, Science, 241, 1077-1080, 1988)를 사용하여 행하였다. 상기 OLA 법은 겔-기초 검사(gel-based assay)로서 수행되었다. 10㎕의 각 OLA 반응액은 0.5pmol의 각 프로우브 SNPRN-A(5′-Hex-TGGCCAACGGCGTCCA-3′), SNPRN-G(5′-ROX-GGCCAACGGCGTCCG-3′) 및 SNPRN-Common(5′인산-AGCGGCACCTTTGTGAAAAAAAAAA-3′), 1.5U의 열안정성 AMPLIGASE 및 반응 버퍼(EPICENTRE TECHNOLOGIES, Madison, WI) 및 0.5㎕의 AMPKG3F3/AMPKG3R2 PCR 산물을 포함하였다.

95℃에서 5분 동안 초기 배양을 한 후, 다음의 열주기 프로필을 10회 반복하였다:

94℃(30초)에서 변성, 55℃(90초)에서 프로우브 어닐링 및 연결. OLA 주기 반응 후, 1㎕의 산물을 94℃(3분)에서 열변성시키고, 얼음 상에서 냉각시키고, ABI377 DNA 시퀀서(PERKIN ELMER, Foster City, 미국) 상에서 전기영동용 6% 폴리아크릴아미드 변성 겔 상에 로딩하였다. 그 결과 얻어진 단편 및 피크 형광을 GENESCAN 소프트웨어(PERKIN ELMER, Foster City, 미국)를 사용하여 분석하였다.

당분해능(glycolytic potential)(GP) 값에 근거하여 RN^- 또는 rn⁺로서 표현형이 밝혀진 68마리의 스웨덴 햄프셔 동물으로부터 수집한 DNA 시료의 유전형을 결정하기 위하여 R41Q 돌연변이에 OLA-기초 방법을 사용하였다. 도 6은 3개의 가능한 유전형으로부터 기인하는 전형적 OLA 결과를 나타낸다. 모든 RN^- 동물은 뉴클레오티 드 위치 122번에서 동형접합체 A/A(n=28) 또는 이형접합체 A/G(n=36)로서 점수 매겨지는 반면, rn⁺ 동물은 이 위치에서 동형접합체 G/G(n=4)이었다.

실시예3: 가깝게 연관된 마이크로새틀라이트, MS127B1을 사용한 RN ^- 대립형질의 존재의 예측

마이크로새틀라이트 127B1(MS127B1) 돼지 PRKAG3을 포함하는 BAC 127G7으로부터 클론하였다. BAC 클론을 Sau3AI로 소하시키고, 제한 단편을 pUC18의 BamHI 부위에 서브클론하였다. 얻어진 라이브러리를 [γ-32P]-dATP로 표지된 (CA)₁₅ 올리고뉴클레오티드 프로우브로 탐침하였다. 강하게 혼성화하는 클론을 염기분석하였으며, 마이크로새틀라이트 좌의 PCR 증폭을 위한 프라이머를 설계하였다. 100ng 게놈 DNA, 0.2mM dNTP, 1.5mM MgCl₂, 4.0pmol의 포워드(MS127B1F: 5′-플로레신-CAAACTCTTCTAGGCGTGT-3′) 및 리버스(MS127B1R: 5′-GTTTCTGGAACTTCCATATGCCATGG-3′) 프라이머 및 Taq DNA 폴리머라제 1U 및 반응 버퍼(ADVANCED BIOTECH, LONDON, UK)를 포함하는 10㎕ 반응을 수행하였다.

주기반응 조건은 94℃에서 5분 동안 초기 배양, 그 후 94℃(1분), 57℃(1분) 및 72℃(1분) 3회, 그리고 94℃(20초), 55℃(30초) 및 72℃(30초) 35회를 포함한다. PCR 산물(0.3㎕)을 ABI377 DNA 시퀀서(PERKIN ELMER, Foster City, 미국) 상의 4% 변성 겔 전기영동을 이용하여 분리하였다. 그 결과 얻어진 단편의 길이를 GENESCAN 및 GENOTYPER 소프트웨어(PERKIN ELMER, Foster City, 미국)를 사용하여 분석하였다.

당분해능(glycolytic potential)(GP) 값에 근거하여 RN^- 또는 rn⁺로서 표현형이 밝혀진 87마리의 스웨덴 햄프셔 동물으로부터 수집한 DNA 시료의 유전형을 결정하기 위하여 상기 방법을 사용하였다. 대립형질 108(bp)은 하기의 표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 RN^-(RN^-/RN^- 또는 RN^-/rn⁺) 동물이 이 대립형질에 대하여 동형접합체 또는 이형접합체인 반면, 어떠한 rn⁺(rn⁺/rn⁺) 동물도 이 대립형질을 보유하고 있지 않은 바와 같이, 이 재료의 RN^- 대립형질과 완전 연관을 보였다.

표 5.

실시예4: PCR-RFLP 시험을 사용한 RN ^- 대립형질의 존재의 탐지

RN^- 돌연변이는 BsrBI 부위 GAG＾CGG/CTC＾GCC(BsrBI RE 부위는 회문(回文)적이지 않다)를 불활성화시킨다. 그 부위에서, RN^- 서열은 GAGCGG 대신 AAGCGG이다.

RN 유전자의 134bp 길이 단편은 돼지 게놈 DNA로부터 증폭되었다. rn⁺ 대립형질은 BsrBI 소화 후, 83 및 51bp의 두 단편의 탐지에 의하여 확인된다.

상기 테스트는 다음과 같이 수행된다:

1° 프라이머 서열:

RN 돌연변이 영역을 증폭시키기 위하여 사용된 프라이머의 서열:

RNU: 5′-GGGAACGATTCACCCTCAAC-3′

RNL: 5′-AGCCCCTCCTCACCCACGAA-3′

소화의 내부 통제를 제공하기 위하여, BsrBI 부위는 20bp 길이 꼬리 내의 두 프라이머 중 하나의 끝부분(extremity)에 첨가되었다. 상기 꼬리는 BsrBI 부위를 생성(더 짧은 꼬리가 더 충분할 수 있다)시키고, 잘리지 않은 단편을 다른 단편과 쉽게 구별하도록 한다. 꼬리가 달린 프라이머의 사용은 증폭의 효능과 특이성에 영향을 미치지 않는다.

BsrBI 부위를 가진 통제 꼬리를 포함한 RNL 변형된 프라이머의 서열은 다음과 같다:

RNLBsrA14:

5′A₅C₂A₇CCGCTCAGCCCCTCCTCACCCACGAA 3′

2° 사용된 반응 혼합물:

50ng DNA

0.5 단위 Taq 폴리머라제(GIBCO BRL)

1.5mM MgCl₂

200mM dNTP

0.2μM 각 프라이머

총 반응부피 : 25㎕

3° 사용된 PCR 조건(OMNIGENE HYBAID 더모사이클러 상에서 사용):

1x(5분 95℃)

35x(45초 57℃, 45초 72℃, 45초 95℃)

1x(45초 57℃, 15분 72℃)

4° 37℃ 2시간으로 행하여진 제한 효소 소화:

10㎕ PCR 산물

1x BsrBI BIOLABS 버퍼

5U BsrBI 제한 효소(BIOLABS)

총 반응부피: 15㎕

5° 통제 꼬리(control tail)를 가진 프라이머를 사용한 PCR 및 Bsr BI로 소화 후 생산된 단편의 크기:

RN^- 또는 rn⁺ 대립형질로부터 잘리지 않은 단편: 154bp

RN^- 대립형질로부터 증폭된 단편의 소화 후:137bp + 17bp

rn⁺ 대립형질로부터 증폭된 단편의 소화 후: 83bp + 54bp + 17bp

크기 차이는 폴리아크릴아미드, 아가로즈/누시브(NUSIEVE) 또는 아가로즈 겔 전기영동 후에 확인될 수 있다.

실시예5: V40I 다형이 당분해능에 미치는 영향

더욱이, 181마리의 rn⁺/rn⁺ 동형접합체 동물(서열번호:2의 41번 위치에서 R/R)의 한 세트를 FokI 제한 효소를 사용한 PCR-RFLP에 의하여 V40I 다형(서열번호:2의 40번 위치에 대한)에 대하여 분석하였다. 당분해능은 MONIN 등(Meat Science, 13, 49-63, 1985)에 의하여 개시된 방법에 따라 병렬적으로 결정하였다.

그 결과를 하기 표 6에 나타내었다:

표 6.

이들 결과는 V40I 다형이 골격근의 당분해능에 중요한 영향을 미친다는 것을 보이고 있다.

<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE MILAN, Denis ANDERSSON, Leif LOOFT, Christian ROBIC, Annie ROGEL-GAILLARD, Claire IANNUCCELLI, Nathalie GELLIN, Joel KALM, Ernst LE ROY, Pascale CHARDON, Patrick <120> VARIANTS OF THE GAMMA CHAIN OF AMPK, DNA SEQUENCES ENCODING THE SAME, AND USES THEREOF <130> MJPcb539-99 <140> <141> <150> EP 99402236.3 <151> 1999-09-10 <150> EP 00401388.4 >151> 2000-05-18 <160> 32 <210> 1 <211> 1867 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> CDS <222> (472)..(1389) <400> 1 ttcctagagc aaggagagag ccgttcatgg ccatcccgag ctgtaaccac cagctcagaa 60 agaagccatg gggaccaggg gaacaaggcc tctagatgga caaggcagga ggatgtagag 120 gaaggggggc ctccgggccc gagggaaggt ccccagtcca ggccagttgc tgagtccacc 180 gggcaggagg ccacattccc caaggccaca cccttggccc aagccgctcc cttggccgag 240 gtggacaacc ccccaacaga gcgggacatc ctcccctctg actgtgcagc ctcagcctcc 300 gactccaaca cagaccatct ggatctgggc atagagttct cagcctcggc ggcgtcgggg 360 gatgagcttg ggctggtgga agagaagcca gccccgtgcc catccccaga ggtgctgtta 420 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agtctccagg 1989 gatggatggc cttgtatatg gacccctgag aatgagcaat tgagaaaaca aaacaaaagg 2049 aacaatccat gaacttagat tttattggtt tcactcaaaa tgctgcagtc atttgacctg 2109 <210> 4 <211> 305 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Arg Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser 1 5 10 15 Ser Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe 20 25 30 Phe Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser 35 40 45 Lys Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu 50 55 60 Val Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile 65 70 75 80 Glu Gln His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys 85 90 95 Phe Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala 100 105 110 Val Tyr Thr Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp 115 120 125 Pro Val Ser Gly Asn Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu 130 135 140 Lys Phe Leu His Ile Phe Gly Ser Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile 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Sus scrofa <400> 9 ctccagctca caggatgaca 20 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 10 gtttctgcag ctttagcatc tattcc 26 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 11 gaagtatcct gggcttctga 20 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 12 gtttctccag gtttccagac atccac 26 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 13 gcttctgtct gcccctactt 20 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 14 gtttctaagt tctactgtaa gacacc 26 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 15 ccaagctgtg gtggctgaat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 16 cagcacagca gtgccaccta 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 17 caaactcttc taggcgtgt 19 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 18 gtttctggaa cttccatatg ccatgg 26 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 19 agggtggatg gtaggcttca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 20 gtctcgctcc tgaaggaagt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 21 agtcacgtgg ccatgctatc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 22 ctcaactgga ttgagtcagt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 23 ttggcgcaac tgttatttct 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 24 aggcaaagga agagcacag 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 25 agccgtgggc atcgttgg 18 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 26 agaaggagac agacagggcga 21 <210> 27 <211> 1873 <212> ADN <213> Sus scrofa <220> <221> CDS <222> (1)..(1395) <400> 27 atg agc ttc cta gag caa gga gag agc cgt tca tgg cca tcc cga gct 48 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 gta acc acc agc tca gaa aga agc cat ggg gac cag ggg aac aag gcc 96 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 tct aga tgg aca agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg cct ccg ggc 144 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ccg agg gaa ggt ccc cag tcc agg cca gtt gct gag tcc acc ggg cag 192 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 gag gcc aca ttc ccc aag gcc aca ccc ttg gcc caa gcc gct ccc ttg 240 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 gcc gag gtg gac aac ccc cca aca gag cgg gac atc ctc ccc tct gac 288 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 tgt gca gcc tca gcc tcc gac tcc aac aca gac cat ctg gat ctg ggc 336 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 ata gag ttc tca gcc tcg gcg gcg tcg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 gaa gag aag cca gcc ccg tgc cca tcc cca gag gtg ctg tta ccc agg 432 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ccg ggg gcc cag gtc tac atg 480 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 cac ttc atg cag gag cac acc tgc tac gat gcc atg gcg acc agc 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atcaagactc actgtgggac cactgctttg tcccattctc 1685 agctgaaatg atggagggcc tcataagagg ggtggacagg gcctggagta gaggccagat 1745 cagtgacgtg ccttcaggac ctccggggag ttagagctgc cctctctcag ttcagttccc 1805 ccctgctgag aatgtccctg gaaggaagcc agttaataaa ccttggttgg atggaatttg 1865 gagagtcg 1873 <210> 28 <211> 464 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 28 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp 85 90 95 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val 210 215 220 Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu 225 230 235 240 Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 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Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 tac acc ctc atc aag aac cgg atc cat cgc ctg cct gtt ctt gac ccg 864 Tyr Thr Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 gtg tca ggc aac gta ctc cac atc ctc aca cac aaa cgc ctg ctc aag 912 Val Ser Gly Asn Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 ttc ctg cac atc ttt ggt tcc ctg ctg ccc cgg ccc tcc ttc ctc tac 960 Phe Leu His Ile Phe Gly Ser Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 cgc act atc caa gat ttg ggc atc ggc aca ttc cga gac ttg gct gtg 1008 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 gtg ctg gag aca gca ccc atc ctg act gca ctg gac atc ttt gtg gac 1056 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 cgg cgt gtg tct gca ctg cct gtg gtc aac gaa tgt ggt cag gtc gtg 1104 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Cys Gly Gln Val Val 355 360 365 ggc ctc tat tcc cgc ttt gat gtg att cac ctg gct gcc cag caa 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Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Thr Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Asn Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 Phe Leu His Ile Phe Gly Ser Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp 340 345 350 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Cys Gly Gln Val Val 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn His Leu Asp Met Ser Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Ser Leu Gly 405 410 415 Glu Val Ile Asp Arg Ile Ala Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile 435 440 445 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 <210> 31 <211> 2022 <212> ADN <213> Sus scrofa <400> 31 atggagcttg ccgagctaga gcaggcactg cgcagggtcc cggggtcccg ggggggctgg 60 gagctggagc aactgaggcc agagggcaga gggcccacca ctgcggatac tccctcctgg 120 agcagcctcg ggggacctaa gcatcaagag atgagcttcc tagagcaagg agagagccgt 180 tcatggccat cccgagctgt aaccaccagc tcagaaagaa gccatgggga ccaggggaac 240 aaggcctcta gatggacaag gcaggaggat gtagaggaag gggggcctcc gggcccgagg 300 gaaggtcccc agtccaggcc agttgctgag tccaccgggc aggaggccac attccccaag 360 gccacaccct tggcccaagc cgctcccttg gccgaggtgg acaacccccc aacagagcgg 420 gacatcctcc cctctgactg tgcagcctca gcctccgact ccaacacaga ccatctggat 480 ctgggcatag agttctcagc ctcggcggcg tcgggggatg agcttgggct ggtggaagag 540 aagccagccc cgtgcccatc cccagaggtg ctgttaccca ggctgggctg ggatgatgag 600 ctgcagaagc cgggggccca ggtctacatg cacttcatgc aggagcacac ctgctacgat 660 gccatggcga ccagctccaa actggtcatc ttcgacacca tgctggagat caagaaggcc 720 ttctttgccc tggtggccaa cggcgtccga gcggcacctt tgtgggacag caagaagcag 780 agcttcgtgg ggatgctgac catcacagac ttcatcttgg tgctgcaccg ctattacagg 840 tcccccctgg 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Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu 325 330 335 Asp Pro Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu 340 345 350 Leu Lys Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe 355 360 365 Leu Tyr Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu 370 375 380 Ala Val Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe 385 390 395 400 Val Asp Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln 405 410 415 Val Val Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln 420 425 430 Gln Thr Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln 435 440 445 Arg Thr Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr 450 455 460 Leu Gly Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu 465 470 475 480 Val Leu Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser 485 490 495 Asp Ile Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu 500 505 510 Gly Ala

Claims (39)

1. 인간을 제외한 척추동물 AMP-활성화된 키나제(AMPK)의 감마 서브유니트로서, 상기 감마 서브유니트는 서열번호:2, 서열번호:4, 서열번호:28, 서열번호:30 및 서열번호:32로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것인 인간을 제외한 척추동물 AMP-활성화된 키나제(AMPK)의 감마 서브유니트.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호:28의 서열로 구성되는 것인 감마 서브유니트.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호:2 또는 서열번호:4의 서열로 구성되는 것인 감마 서브유니트.
5. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호:28, 서열번호:30 또는 서열번호:32의 서열로 구성되는 것인 감마 서브유니트.
6. 인간을 제외한 척추동물 AMP-활성화된 키나제(AMPK)의 감마 서브유니트의 기능적으로 변이된 돌연변이체인 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는:

   -서열번호:2의 서열의 41번째 위치에서 R이 Q로 치환된 서열을 갖는 폴리펩티드; 또는

   -서열번호:2의 서열의 40번째 위치에서 V가 I로 치환된 서열을 갖는 폴리펩티드;인 것인 폴리펩티드.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제1항 또는 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열.
12. 제11항에 있어서, 서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:27, 서열번호:29, 및 서열번호:31로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 서열을 갖는 것인 핵산 서열.
13. 삭제
14. 삭제
15. 제11항의 핵산 서열 또는 그들의 일부분을 증폭하기 위한 프라이머 세트로서, 상기 프라이머들은 서열번호:5 내지 서열번호:26의 서열들로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 것인 프라이머 세트.
16. 제11항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
17. 제11항의 핵산 서열에 의하여 형질전환된 숙주 세포.
18. 제11항의 핵산 서열에 의하여 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환 동물.
19. 제1항의 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 불활성화된, 인간을 제외한 넉아웃 동물.
20. 감마 서브유니트가 제1항 또는 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드로 구성되는 헤테로트리머 AMPK.
21. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, AMPK의 감마 서브유니트를 코드하는 유전자 중의 돌연변이로 인한 대사 질환을 탐지하는 방법:

    - 인간을 제외한 척추동물로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및

    - 기능적으로 변이된, 제6항의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열이 상기 핵산 중에 존재하는지를 검사하는 단계.
22. 제21항에 있어서, 상기 질환은 근육 세포 중의 글리코겐 축적의 변화와 연관되고 제6항의 폴리펩티드의 기능적으로 변이된 대립형질 유전자의 발현으로부터 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 돌연변이 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열의 존재는, 상기 핵산 시료를 제6항의 폴리펩티드를 코드하는 핵산으로부터 얻어진 핵산 프로우브와 접촉시키고, 상기 핵산 프로우브와 탐지될 돌연변이 서열 사이의 특이적인 혼성화 조건하에서 상기 돌연변이를 걸치게 하는(spanning) 단계 및 상기 혼성화 복합체를 탐지하는 단계에 의하여 검사되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제11항의 핵산 서열과 연관된 유전적 다형 마커를 탐지할 수 있도록 하는 한 쌍의 프라이머를 얻는 방법:

    - 상기 핵산 서열 및 이웃하는 염색체 서열을 포함하는 클론을 선별하기 위하여, 인간을 제외한 척추동물 유래의 게놈 DNA 라이브러리를 제11항의 핵산 서열 에 특이적인 프로우브로 스크리닝하는 단계;

    - 상기 이웃하는 염색체 서열 중의 다형 좌를 확인하는 단계, 및 상기 다형 좌를 포함하는 DNA 절편을 염기서열분석하는 단계; 및

    - 상기 다형 좌에 이웃하는 프라이머 쌍을 설계하는 단계.
25. 제24항에 있어서, 상기 선별된 클론은 제11항의 핵산 서열의 일부분 및 3' 인접서열 또는 5′인접 서열 또는 3' 인접 서열 및 5' 인접 서열의 500 kb까지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제24항에 있어서, 상기 인간을 제외한 척추 동물은 포유동물임을 특징으로 하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지임을 특징으로 하는 방법.
28. 제24항의 방법에 의하여 얻어질 수 있는 한 쌍의 프라이머로서, 상기 프라이머들은 서열번호:5 내지 서열번호:26의 서열들로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 것인 한 쌍의 프라이머.
29. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 척추 동물 중의 제6항의 폴리펩티드의 기능적으로 변이된 대립형질 유전자의 발현으로부터 기인하는 탄수화물 대사의 이상을 탐지하는 방법:

    - 상기 인간을 제외한 척추 동물 유래의 게놈 DNA 라이브러리의 시료를 얻는 단계;

    - 상기 DNA를 PCR 증폭이 되도록 하는 조건하에서 제15항의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계; 및

    - 제6항의 폴리펩티드의 기능적으로 변이된 대립형질체를 코드하는 핵산 서열과 연관된 다형 마커의 대립형질이 존재하는지를 검사하기 위하여 PCR 산물을 분석하는 단계.
30. 제29항에 있어서, 상기 기능적으로 변이된 폴리펩티드는 서열번호:2의 R41Q 치환으로부터 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제29항에 있어서, 상기 인간을 제외한 척추 동물은 포유 동물임을 특징으로 하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 포유 동물은 돼지임을 특징으로 하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 다음의 프라이머 쌍 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법:

    - 서열번호:5 및 서열번호:6으로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:7 및 서열번호:8로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:9 및 서열번호:10으로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:11 및 서열번호:12로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:13 및 서열번호:14로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:15 및 서열번호:16으로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:17 및 서열번호:18로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:19 및 서열번호:20으로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:21 및 서열번호:22로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:23 및 서열번호:24로 구성되는 프라이머 쌍;

    - 서열번호:25 및 서열번호:26으로 구성되는 프라이머 쌍.
34. AMPK 활성을 조절할 수 있는 화합물을 탐색하기 위해 제17항의 형질전환 숙주세포를 사용하는 방법.
35. AMPK 활성을 조절할 수 있는 화합물을 탐색하기 위해 제18항의 인간을 제외한 형질전환 동물을 사용하는 방법.
36. 제1항의 기능적 폴리펩티드의 부재하에서 에너지 대사를 조절할 수 있는 화합물을 탐색하기 위한 제19항의 인간을 제외한 넉아웃 동물을 사용하는 방법.
37. AMPK 활성을 조절할 수 있는 화합물을 탐색하기 위해 제20항의 헤테로트리머 AMPK를 사용하는 방법.
38. 제21항 또는 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간을 제외한 척추동물은 포유동물임을 특징으로 하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지임을 특징으로 하는 방법.

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