JP2003509052A - AMPKのγ鎖の変異体、それをエンコードするDNA配列及びその使用 - Google Patents

AMPKのγ鎖の変異体、それをエンコードするDNA配列及びその使用

Info

Publication number
JP2003509052A
JP2003509052A JP2001523774A JP2001523774A JP2003509052A JP 2003509052 A JP2003509052 A JP 2003509052A JP 2001523774 A JP2001523774 A JP 2001523774A JP 2001523774 A JP2001523774 A JP 2001523774A JP 2003509052 A JP2003509052 A JP 2003509052A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
polypeptide
nucleic acid
acid sequence
ampk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2001523774A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3983051B2 (ja
Inventor
アンダーソン,リーフ
ローフト,クリスティアン
カルム,エルンスト
ミラン,デニス
ロビ,アニー
ロゲル−ガイラード,クレア
イアンヌセリ,ナタリー
ゲリン,ジョエル
ロイ,パスカル レ
シャルドン,パトリック
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of JP2003509052A publication Critical patent/JP2003509052A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3983051B2 publication Critical patent/JP3983051B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/05Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 この発明は、脊椎動物のAMP-活性化キナーゼ(AMPK)のγ鎖の変異体、ならびに該変異体をエンコードする核酸配列及びエネルギー代謝の機能不全の診断又は治療のためのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 この発明は、AMP-活性化プロテインキナーゼ(AMPK)のγ鎖の新規な変異体、該
変異体をエンコードする遺伝子及びその使用に関する。 AMPKは、真核細胞でのエネルギー代謝の調節において主要な役割を有している
(HARDIEら、Annu. Rev. Biochem., 67, 821-855, 1998; KEMPら、TIBS, 24, 22
-25, 1999)。哺乳動物のAMPKは、触媒作用性のαサブユニットとαサブユニット
の活性を調節する2つの非触媒作用性のβ及びγサブユニットからなるヘテロト
リマー複合体である。この酵素複合体の酵母同族体(SNF1と示す)は、十分に特徴
付けられている; それは、哺乳動物のαサブユニットに相当する触媒作用鎖(Snf
1)、及び制御サブユニット: 哺乳動物のβサブユニットに相当するSip1、Sip2
及びGal83 、及び哺乳動物のγサブユニットに相当するSnf4からなる。配列デー
タは、AMPK同族体は線虫(Caenorhabditis elegans) 及びショウジョウバエ(Dros
ophila)にも存在することを示している。
【0002】 酵母SNF1及び SNF4の突然変異は、グルコース抑制遺伝子の転写、胞子形成、
熱耐性、ペルオキシソーム生物発生及びグリコーゲン貯蔵の不足を引起こすこと
が認められている。 哺乳動物細胞では、AMPKは「燃料計」として作用することが提案されている。
それは、熱ショック及びグルコースとATPの涸渇のような細胞ストレスに起因し
て、AMP:ATP比の増加によって活性化される。活性化AMPKはATP-産生経路(例えば
脂肪酸酸化)を開き、酵素アセチル-CoA カルボキシラーゼ及びヒドロキシメチル
グルタリル-CoA (HMG-CoA)リダクターゼのリン酸化をとおして、ATP-消費経路 (
例えば脂肪酸及びコレステロール合成)を阻害する。それは、インビトロで、グ
リコーゲン合成の主要な制御酵素であるグリコーゲンシンセターゼをリン酸化に
より不活化することも報告されている(HARDIEら、1998, 上記)。しかし、グリコ
ーゲンシンセターゼがインビボでAMPKの生理学上の標的であるか否かは、依然と
して不明である。
【0003】 哺乳動物には、3つの異なるAMPKサブユニットについて幾つかのイソ型が存在
する。ヒトでは、ヒト染色体 (HSA) 5p12 上のPRKAA1及びHSA1p31上のPRKAA2が
、それぞれαサブユニットのイソ型α1及びα2をエンコードし、HSA12q24.1 上
のPRKAB1及びPRKAB2 (まだマップされていない)が、それぞれβサブユニットの
イソ型β1及びβ2をエンコードし、かつHSA12q13.1 上のPRKAG1 及びHSA7q35-q3
6 上のPRKAG2が、それぞれγサブユニットのイソ型γ1及びγ2をエンコードして
いる(OMIM データベース、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/, 1999年7月)。H
ARDIEら[1998, 上記]も、AMPKのγサブユニットの第三イソ型(γ3)の存在を示し
ているが、その情報は全く提供していない。これらのγサブユニットの配列解析
は、それらが本質的に、機能が未知の4つのシスタチオンβシンターゼ(CBS)ドメ
インからなることを示している。AMPKサブユニットのいずれかにおける突然変異
に起因する表現型の作用は、いまだ証明されていない。
【0004】 他方、大部分のハンプシャーブタは、筋肉内グリコーゲン濃度が高いことが観
察されている。これらのブタでは、屠殺後に生じるグリコーゲン分解が重要なpH
の低下をもたらし、この結果、水分保持能を減じた酸性肉を生じ、硬い調理ハム
の収率を低下させる。 グリコーゲンの高い筋肉含量と関連した遺伝子座(RNと称する)は、ハンプシャ
ーブタからの表現型データのファミリーの分離解析により初めて同定された(LE
ROY ら、Genet. Res., 55, 33-40, 1990)。高いグリコーゲン含量に相関した完
全に優性なアレレ、RN-は、大部分のハンプシャー群で高頻度に生ずるが、他品
種のブタは正常な劣性rn+ アレレの同型接合体であると思われる。その後の研究
により、RN-キャリアは、肝臓ではなく細胞骨格にグリコーゲンを多く増加させ
る(約70%)ことが分かった(MONINら、38th ICoMST, Clermont-Ferrand, FRANCE,
1992)。
【0005】 RN-とrn+ のブタのグリコーゲン含量の大きな相違は、肉質及び技術分野に著
しい違いをもたらす(ENFALTら、J. Anim. Sci., 75, 2924-2935, 1997)。RN-
レレは、したがって、ブタの産業において経済的にかなり重要であり、大部分の
養殖会社はこの優性突然変異を減じるか、又は除きたいであろう。 RN表現型は、生きた動物又は屠殺後の筋肉生検で糖分解能を測定して決定する
ことができる(MONINら、Meat Science, 13, 49-63, 1985)。しかし、この方法は
、実際上の繁殖プログラムでの適用を厳しく制限する。試験の精度は100%ではな
い: RN-及びrn+ の表現型分布ではいくらか重複があるので、試験はRN-/RN-同型
接合体及びRN-/rn+ 異型接合体を区別できない。さらに、生きた動物での筋肉生
検のサンプリングは、侵襲性かつ高価である。 したがって、RN遺伝子座のための簡単な診断DNA試験の開発が、極めて必要で
ある。さらに、ブタでのRN遺伝子の劇的な表現型作用は、この遺伝子が、他の脊
椎動物、特に哺乳動物の骨格筋肉で炭水化物の代謝調節に重要な役割を有してい
ることを意味している。
【0006】 骨格筋肉及び肝臓は哺乳動物において2つの主要なグリコーゲンのレザバーで
あり、肝臓のグリコーゲンが正常なときの筋肉グリコーゲンの増加の知見は、RN - 表現型が、おそらくは肝臓ではなく筋肉で発現される遺伝子の突然変異に起因
していることを示唆している。発明者らは、RN遺伝子がブタの染色体15に局在し
ていることを以前に報告している(MILANら、Mamm. Genome, 7, 47-51, 1996; MA
RIANIら、Mamm. Genome, 7, 52-54, 1996; LOOFTら、Genetics Selection Evolu
tion, 28, 437-442, 1996)。ここで、RN-アレレが、AMP-活性化プロテインキナ
ーゼ(AMPK)γ鎖の新しい筋肉特異的なイソ型をエンコードする遺伝子の非保存的
な突然変異に関連していることが発見された。
【0007】 この発明の種々の観点は、この突然変異の発見及び特徴づけならびに突然変異
遺伝子の同定及び単離に基づいている。 この発明によれば、AMPKのγ鎖における突然変異は炭水化物の代謝制御を変え
ることが示され、AMPKがこの代謝の必須成分であることが立証された。また、AM
PKのγ鎖の筋肉特異的なイソ型をエンコードする核酸配列が提供される。すなわ
ち、炭水化物の代謝の制御手段、より詳細には、特に骨格筋肉での炭水化物の代
謝制御の検出手段及び/又は可能性のある、もしくは実際の機能不全の修正手段
が提供される。
【0008】 この発明は、ポリペプチドSEQ ID NO: 2と、少なくとも 70%の同一性又は少な
くとも 85%の類似性、好ましくは80%の同一性又は少なくとも 90%の類似性、よ
り詳細には少なくとも 90%の同一性又は少なくとも 95%の類似性、さらに好まし
くは少なくとも 95%の同一性又は少なくとも 99%の類似性を有するアミノ酸配列
からなるポリペプチドを提供する。また、この発明は、該ポリペプチドをエンコ
ードする単離された核酸配列ならびに該核酸配列の相補体を提供する。 このポリペプチドは、AMPKのγ鎖の新しい筋肉特異的なイソ型を示す。以降、
これをPrkag3としても示す; 該ポリペプチドをエンコードする遺伝子は、PRKAG3
としても示す。
【0009】 この発明の好ましい具体例によれば、このポリペプチドは、ポリペプチドSEQ
ID NO: 28と少なくとも 75%の同一性、好ましくは少なくとも 80%の同一性を有
するアミノ酸配列からなる。 基準配列との配列の「同一性」は、2つの配列が、残基位置間の一致が最大に
なるようアラインされた時に同じである残基の%を意味する。基準配列との同一
性が少なくとも X%のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、基準のアミノ酸配
列の各100アミノ酸当たり100-X個までのアミノ酸変化を配列が含み得るポリペプ
チドとしてここに定義される。アミノ酸の変化は、基準配列における保存又は散
在するアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を含む。
【0010】 基準配列との配列の「類似性」は、2つの配列が、残基位置間一致が最大にな
るようアラインされた時に、同じであるか、又は保存アミノ酸置換によってのみ
異なる残基の%を意味する。保存アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を一般
に変化しない、化学特性(例えば大きさ、電荷又は極性)が類似する別のアミノ酸
残基へのアミノ酸残基の置換として定義される。基準配列との類似性が少なくと
も X%のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ここで、基準アミノ酸配列の各1
00アミノ酸当たり(100-X)個までの非保存アミノ酸の変化を配列が含み得るポリ
ペプチドとして定義される。非保存アミノ酸の変化は、基準配列において保存又
は散在するアミノ酸残基の欠失、挿入又は非保存置換を含む。
【0011】 例えば: * 設定をデフォルトにし、SEQ ID NO: 2配列全体を質問としてBLASTpを用いる"G
enBank nr"データベースを検索すると(ALTSCHULら、Nucleic Acids Res., 25, 3
389-3402, 1997)、SEQ ID NO: 2との同一性又は類似性の高い%は、 - ヒトAMPKのγ1サブユニット: 65%同一又は82%類似(スコア: 399); - ラットAMPKのγ1サブユニット: 65%同一又は82%類似(スコア: 399); - マウスAMPKのγ1サブユニット: 64%同一又は80%類似(スコア: 390); - ショウジョウバエAMPKのγサブユニット: 53%同一又は75%類似(スコア: 332);
- 酵母Snf4: 33%同一又は56%類似(スコア: 173); について見られた。 * 設定をデフォルトにし、SEQ ID NO: 28配列全体を質問としてBLASTpを用いる"
GenBank nr"データベースを検索すると、より高い同一性又は類似性の%は、 - ヒトAMPKのγ1サブユニット: 64%同一又は80%類似(スコア: 403); - ヒトAMPKのγ2サブユニット: 62%同一又は83%類似(スコア: 425); - ラットAMPKのγ1サブユニット: 61%同一又は77%類似(スコア: 404); - マウスAMPKのγ1サブユニット: 63%同一又は79%類似(スコア: 394); - ショウジョウバエAMPKのγサブユニット: 52%同一又は76%類似(スコア: 340)
について見られた。
【0012】 この発明のポリペプチドは、 - 機能性Prkag3; 又は - 機能的に改変されたPrkag3の突然変異体 のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又はこれらから構成される、例えばいずれ
かの脊椎動物種、より詳細には、鳥、例えば家禽、又はウシ、ヒツジ、ブタ、マ
ウス、ウマならびにヒトを含む哺乳動物由来のいずれかのポリペプチド(天然、
合成、半合成又は組換えのいずれか)を含む。 「機能性」は、生物活性が正常なタンパク質を意味する。そのようなタンパク
質は、その活性に実質的な変化を誘発せず、顕著な表現型作用を有しないサイレ
ント突然変異からなっていてもよい。機能性Prkag3の非限定的な例は: - 別紙の配列リストのSEQ ID NO: 2で示される配列から少なくともなるブタPrk
ag3;これは、例えばポリペプチド SEQ ID NO: 28を含む; - 別紙の配列リストのSEQ ID NO: 4で示される配列から少なくともなるヒトPrk
ag3; これは、例えばポリペプチドSEQ ID NO: 30を含む である。
【0013】 また、この発明はPrkag3のスプライス変異体を含む:例えば、ヌクレオチド配
列 SEQ ID NO: 27及び一方の相当するアミノ酸配列 SEQ ID NO: 28、及びヌクレ
オチド配列SEQ ID NO: 31 及び他方の相当するアミノ酸配列SEQ ID NO: 32は、
ブタ Prkag3の2つの異なるスプライス突然変異体を示す。 タンパク質の「機能的に改変された突然変異体」は、活性の変化を誘発する1
又は数個の突然変異からなる。このような突然変異は、特に、タンパク質の生物
活性に必須なドメイン中のアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含む。それらは
、例えば活性の部分又は全体的な損失を生じるか、又は逆に、活性の増加、もし
くは調節エフェクターに対する応答の損傷を生じ得る。欠失、挿入又は非保存置
換は、生物活性に重要な影響を与える可能性がある。しかし、保存置換も、タン
パク質の活性部位の重要な位置で生じる場合には、顕著な影響を誘発し得る。
【0014】 機能的に改変されたPrkag3突然変異体の非限定的な例は: - SEQ ID NO: 2 又は SEQ ID NO: 4の位置41におけるアルギニン残基のグルタミ
ン残基による非保存置換に起因するR41Q変異体(この置換はグリコーゲン含量の
重要な増加を生じ、骨格筋肉の糖分解能の増加を誘発する); - SEQ ID NO: 2 又はSEQ ID NO: 4の位置40におけるバリン残基のイソロイシン
残基による置換に起因するV40I変異体(この置換は、グリコーゲン含量、つまり
骨格筋肉の糖分解能の低下を生じる)である。 これらの置換は、Prkag3とAMPKのγサブユニットの既知のイソ型とで高度に保
存される第一CBSドメインの部分内で生じる。 Prkag3の残基数は、SEQ ID NO: 2又はSEQ ID NO: 4のアミノ酸番号を意味する
。既知のγ1及びγ2のイソ型とのヒトならびにブタの Prkag3配列のアラインメ
ントを図3に示す。
【0015】 また、この発明は、例えばPrkag3ポリペプチドの一部の欠失によって得ること
のできるPrkag3突然変異体を提供する。この突然変異体は、一般に機能的に改変
されている。それらは、Prkag3配列全体と70%未満の同一性を有し得る。しかし
、突然変異体の非欠失配列の同一性は、相当するPrkag3配列、より詳細にはSEQ
ID NO: 2由来の相当する配列とアラインした際に、70%より高くあるべきである
。突然変異体は、例えば機能性Prkag3をエンコードする核酸配列における、核酸
セグメントの挿入又は欠失によって、又は非センスコドンを導入する規則的な(p
unctual)突然変異によって得られる核酸配列の発現に起因していてもよい。 また、この発明は、機能的に改変されたAMPKのγサブユニットの突然変異体を
提供する。この変異体は、第一CBSドメイン内、好ましくはSEQ ID NO:2 又は SE
Q ID NO:4の30〜50残基にわたる領域とアラインされたドメインの領域内に局在
する機能性変化の原因である少なくとも 1つの突然変異からなる。この変異体は
、1アミノ酸又は隣合っているか、もしくは隣合っていない幾つかのアミノ酸の
挿入、欠失及び/又は置換に起因し得る。より好ましくは、突然変異は、SEQ ID
NO:2 又は SEQ ID NO:4の35〜45残基にわたる領域とアラインされた領域内、例
えばγ1イソ型の65〜75残基にわたる領域内に局在する。
【0016】 詳細な具体例によれば、突然変異は非保存置換、好ましくはR→Q置換である。
別の詳細な具体例によれば、突然変異は保存置換、好ましくはV→I置換である。 有利には、突然変異は、SEQ ID NO:2 又はSEQ ID NO:4の41残基に相当する残
基、例えばγ1イソ型の場合には70残基、又はSEQ ID NO:2 もしくはSEQ ID NO:4
の40残基に相当する残基、例えばγ1イソ型の場合には例えば69残基に局在する
。 また、この発明は、γサブユニットがこの発明のポリペプチドからなる、ヘテ
ロトリマーAMPKを提供する。 また、この発明は、上記の機能性の、もしくは機能的に改変されたPrkag3又は
AMPKのγサブユニットの機能的に改変された突然変異体のいずれかをエンコード
する単離された核酸配列、及びこれらの核酸配列のいずれか1つの核酸相補配列
を提供する。
【0017】 これは、特に、PRKAG3遺伝子の天然に存在するアレレのいずれかの配列を有す
る単離されたいずれかの核酸、ならびにPRKAG3遺伝子の人為的な突然変異体の配
列を有する単離されたいずれかの核酸(但し核酸はEST GENBANK AA178898からは
構成されない)を含む。 また、これは、上記の機能的に改変されたγ1又はγ2サブユニットをエンコー
ドする、PRKAG1又は PRKAG2遺伝子の天然もしくは人為的な突然変異体の配列を
有する単離されたいずれかの核酸を含む。 この発明の核酸は、組換えDNA技術及び/又は化学DNA合成の周知方法によって
得ることができる。これらの方法により、天然に存在するDNA配列に所望の突然
変異を導入することも可能である。
【0018】 PRKAG3遺伝子の天然に存在するアレレをエンコードする核酸の例は、ブタ遺伝
子の天然に存在するアレレをエンコードするSEQ ID NO: 1、およびヒト遺伝子の
天然に存在するアレレをエンコードするSEQ ID NO: 3で示される。これらの配列
は、ゲノムDNA又はcDNAのライブラリーのスクリーニングによって、他種由来のP
RKAG3又は同種由来PRKAG3の他のアレレ型の単離を可能にするプローブを作成す
るのに用いてもよい。 また、この発明は、この発明のポリペプチドをエンコードする核酸配列の少な
くとも一部、好ましくはPRKAG3遺伝子の一部、及び隣合うゲノム配列の3'及び/
又は5'の500kbまで、好ましくは100kbまでからなる、いずれかの脊椎動物種、よ
り詳細には、鳥、例えば家禽、又は特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマなら
びにヒトを含む哺乳動物由来のゲノムDNA配列を含む。
【0019】 このようなゲノムDNA配列は、当該分野で公知の方法、例えば制限部位(restrict
ion-site) PCR(SARKARら、PCR Methods Applic., 2, 318-322, 1993)、Prkag3コ
ード化領域ベースの分岐(divergent)プライマーを用いるインバース(inverse) P
CR (TRIGLIAら、Nucleic Acids Res., 16, 8186, 1988)、捕捉(capture) PCR (L
AGERSTROMら、PCR Methods Applic., 1, 111-119, 1991)などのような方法を用
いる、この発明のポリペプチドをエンコードする核酸配列の伸長によって得るこ
とができる。 また、この発明は、この発明のポリペプチドをエンコードする核酸配列又はこ
の発明のゲノムDNA配列の特異的なフラグメント、ならびにそれらと特異的にハ
イブリダイズする核酸フラグメントを含む。好ましくは、これらのフラグメント
は少なくとも 15bp長、より好ましくは少なくとも 20bp長である。
【0020】 「特異的なフラグメント」は、この発明のポリペプチドをエンコードする核酸
配列のみに見られ、従来技術の関連ポリペプチドをエンコードする核酸配列には
見られない配列を有する核酸フラグメントを意味する。これにより、既知のPRKA
G1又はPRKAG2遺伝子の1つと共有される配列からなる核酸フラグメントは除かれ
る。 「特異的にハイブリダイズするフラグメント」は、ストリンジェントな条件下
で、この発明のポリペプチドをエンコードする核酸配列とのみハイブリダイズで
き、従来技術の関連ポリペプチドをエンコードする核酸配列とはハイブリダイズ
しない核酸フラグメントを意味する。これにより、既知のPRKAG1又はPRKAG2遺伝
子の1つと共有される配列の補体からなる核酸フラグメントが除かれる。 EST GENBANK AA178898 又はEST GENBANK W94830 又はそれらの補体からなる核
酸フラグメントも、除かれる。 特異的な核酸フラグメント又は特異的にハイブリダイズする核酸フラグメント
は、例えばこの発明のポリペプチドをエンコードする核酸配列を検出及び/又は
増幅するためのプライマー又はプローブとして使用することができる。この発明
は、上記の特異的な核酸フラグメント又は特異的にハイブリダイズする核酸フラ
グメントから構成される少なくとも 1つのプライマーからなる一連のプライマー
を包含する。
【0021】 また、この発明は、この発明のポリペプチドをエンコードする核酸配列からな
る組換えベクターを提供する。この発明のベクターは、この発明のポリペプチド
をエンコードする配列が適当な転写及び翻訳制御部位のコントロール下にある発
現ベクターであることが好ましい。これらのベクターは、周知の組換えDNA及び
遺伝子工学的な技術によって得て、宿主細胞に導入することができる。 また、この発明は、この発明のベクター、好ましくは発現ベクターによって形
質転換される原核又は真核の宿主細胞からなる。 この発明のポリペプチドは、該ポリペプチドをエンコードする核酸配列からな
る発現ベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適当な条件下で培養し
、宿主細胞培養液からポリペプチドを回収して得ることができる。
【0022】 γサブユニットがこの発明のポリペプチドからなるヘテロトリマーAMPKは、こ
の発明のポリペプチドをエンコードする核酸配列、αサブユニットをエンコード
する核酸配列及びβサブユニットをエンコードする核酸配列をともに又は個別に
発現させ、ヘテロトリマーを再構築することによって得ることができる。 こうして得られるポリペプチド又はその免疫原性フラグメントは、当該分野で
周知の方法を用いて抗体を作成するのに用いることができる。Prkag3の全ポリペ
プチドに対する、そのいずれかの変異体を認識可能な抗体は、こうして得ること
ができる。また、特定のPrkag3変異体(機能性又は非機能性)の特異的なエピトー
プに対する抗体、又はAMPKのγサブユニットの第一CBSドメインに突然変異を有
する機能的に改変された突然変異体の特異的なエピトープに対する、その変異体
もしくは機能的に改変された突然変異体を認識し得る抗体は、こうして得られる
【0023】 ここに示されるように、AMPKのγサブユニットの突然変異、特にAMPKのγサブ
ユニットの第一CBSドメインの突然変異は、ヒトをはじめとする脊椎動物でエネ
ルギー代謝の疾患(例えば糖尿病、肥満)を引起こす可能性がある。さらに、第一
CBSドメイン又はPRKAG3遺伝子の他の部分の突然変異は、筋疾患、糖尿病及び心
血管疾患のような疾患をもたらす筋肉代謝疾患を引起こす可能性がある。 この発明は、これらの疾患を検出し、いやす手段を提供する。 より詳細には、この発明は、診断評価、遺伝子試験及び代謝疾患の予後にこの
発明の核酸配列及び/又はポリペプチド配列を利用する方法である。
【0024】 例えば、この発明は、AMPKのγサブユニットをエンコードする遺伝子の突然変
異に起因する代謝疾患、より詳細には炭水化物代謝疾患、好ましくは改変された
、特に細胞中の過剰なグリコーゲン蓄積に関連した疾患の診断方法を提供する。
この方法は、機能的に改変されたPRKAG3遺伝子、又は脊椎動物から得られる核酸
試料中の第一CBSドメイン内に突然変異を有するAMPKのγサブユニットの機能的
に改変された突然変異の発現を検出及び/又は測定するか、又はPRKAG3遺伝子又
はそのような疾患が予見される脊椎動物ゲノムのAMPKのγサブユニットの第一CB
Sドメインをエンコードする配列において突然変異を検出することからなる。 この発明の好ましい具体例によれば、疾患は、改変された、特に筋肉細胞中の
過剰なグリコーゲンの蓄積に関連し、機能的に改変されたPRKAG3遺伝子の発現に
起因する。
【0025】 機能的に改変されたPrkag3、又は第一CBSドメイン内に突然変異を有するAMPK
のγサブユニットの機能的に改変された突然変異の発現は、上記のようなこの発
明の機能的に改変されたポリペプチドに特異的なポリクローナル又はモノクロー
ナル抗体のいずれかを用いて検出又は測定することができる。適当な方法は、当
該分野で公知である。方法には、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELI
SA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び蛍光活性細胞分類(FACS)が含まれる。 この発明のヌクレオチド配列は、正常な個体、キャリア個体又は影響を受けて
いる個体間の遺伝子配列又は隣合う配列の相違を検出することによって、PRKAG3
遺伝子又はAMPKのγサブユニットの第一CBSドメインをエンコードする配列中の
突然変異を検出するために用いることができる。
【0026】 この発明は、 - 脊椎動物由来の核酸試料を得て; - この核酸試料中における、上記のような、Prkag3突然変異体をエンコードす
る核酸配列、又は第一CBSドメイン内に突然変異を有するAMPKのγサブユニット
の突然変異体の有無を確認すること からなる、PRKAG3遺伝子又はAMPKのγサブユニットの第一CBSドメインをエンコ
ードする配列における突然変異を検出する方法を提供する。 この発明の好ましい具体例によれば、 - 脊椎動物から核酸試料を得て; - この核酸試料を、この発明の核酸から得られる核酸プローブと接触させ、こ
のプローブと検出されるべき突然変異配列間の特異的なハイブリダイゼーション
条件下で、突然変異をスパンし(spanning)、 - ハイブリダイゼーション複合体を検出すること からなる、PRKAG3遺伝子又はAMPKのγサブユニットの第一CBSドメインをエンコ
ードする配列における突然変異からなる核酸配列の検出方法が提供される。
【0027】 好ましくは、この発明の方法は、PRKAG3配列又は突然変異が検出されるAMPKの
γサブユニットの第一CBSドメインをエンコードする配列の一部から少なくとも
なる配列のハイブリダイゼーション前に、核酸試料からPCR増幅をさらに行うこ
とからなる。 完全に一致する相補配列とのみのプローブの特異的なハイブリダイゼーション
を可能にし、かつ規則的な突然変異の検出に有用な方法は、当該分野で公知であ
る。それらには、例えばアレレ特異的PCR(GIBBS, Nucleic Acid Res., 17, 2427
-2448, 1989)、アレレ特異的オリゴヌクレオチドスクリーニング(SAIKIら、Natu
re, 324, 163-166, 1986)などが含まれる。 PRKAG3遺伝子の突然変異は、突然変異に密接に関連している多型マーカーの検
出により検出することもできる。
【0028】 また、この発明は、この多型マーカー、より詳細にはゲノム配列内にPRKAG3遺
伝子の少なくとも一部及び500 kb、好ましくは300 kbまで、より好ましくは100k
bまでの隣合う配列の3' 及び/又は5'からなる多型マーカーの同定手段を提供す
る。 この多型マーカーは、核酸配列からなり染色体配列にフランクしているクロー
ンを選択するために、例えばPRKAG3遺伝子に特異的なプローブを用いて脊椎動物
からゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし、フランキング染色体配列中の
多型マーカーを同定することによって得ることができる。PRKAG3遺伝子の所定の
突然変異アレレに関連する多型マーカーのアレレは、突然変異アレレの存在がこ
の発明の核酸プローブでのハイブリダイゼーションによってあらかじめ検出され
る個体由来のゲノムDNAライブラリーを用いても簡単に同定することができる。
【0029】 多型マーカーには、例えば一塩基多型(SNP)、マイクロサテライト、挿入/欠失
多型及び制限フラグメント長多型(RFLP)が含まれる。これらの多型マーカーは、
幾つかの個体から得られるPRKAG3遺伝子をフランキングしている配列の比較によ
って同定することができる。マイクロサテライトは、既知のマイクロサテライト
モチーフの特異的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって同定する
こともできる。 いったん多型マーカーが同定されると、多型遺伝子座にわたるDNAセグメント
をシークエンスでき、該DNAセグメントの増幅を可能にする一連のプライマーを
デザインすることができる。 また、この発明は、該DNAプライマーを包含する。 PRKAG3遺伝子における突然変異の検出は、脊椎動物由来のゲノムDNA試料を得
て、この発明の一連のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により多型マー
カーにスパンするDNAセグメントを増幅し、増幅したDNA中で、突然変異に関連し
た多型マーカーのアレレの有無を検出することによって行うことができる。
【0030】 一例として、この発明により得られる多型マーカー、及びブタのPRKAG3遺伝子
のRN-アレレに密接に関連する多型マーカーの検出を可能にするDNA プライマー
を以下の表1に挙げる。 この発明の好ましい具体例によれば、脊椎動物は哺乳動物、好ましくは家畜動
物、より好ましくはブタであり、検出されるべき突然変異は機能的に改変された
Prkag3を生ずる。この突然変異の検出により、哺乳動物又はその子孫が平均より
高い又は低い筋肉内グリコーゲン濃度を有する可能性があるかどうかを予見する
ことができる。このような突然変異の一例は、R41Q置換を有し、骨格筋肉内のグ
リコーゲン含量を増加する、機能的に改変されたPrkag3を生ずる。 このような突然変異の別の例は、V40I置換を有し、骨格筋肉内のグリコーゲン
含量を低下させる、機能的に改変されたPrkag3 を生じる。このような突然変異
を有する家畜動物では、屠殺後に生じるグリコーゲン分解が正常な動物ほど重要
ではなく、pHを高くし、肉質をより良くする可能性がある。
【0031】 また、この発明は、この発明の方法の実施のためのキットを含む。キットは、
この発明の核酸配列の少なくとも 1つの特異的なフラグメント、又はこの発明の
核酸配列と特異的にハイブリダイズし得る少なくとも 1つの核酸フラグメントを
含むいずれかの容器からなる。この核酸フラグメントは、標識してもよい。キッ
トは、この発明の一連のプライマーからなっていてもよい。キットは、市販の増
幅キットと共に用いることができる。キットは、正又は負の対照反応又はマーカ
ー、ゲル電気泳動用の分子量マーカーなどを含んでいてもよい。 この発明の他のキットは、任意に標識したこの発明の抗体、ならびに抗原-抗
体反応の検出用の適当な試薬を含んでいてもよい。それらは、正又は負の対照反
応又はマーカーを含んでいてもよい。 さらに、この発明は、AMPKのγサブユニットをエンコードする脊椎動物遺伝子
、より詳細にはPRKAG3遺伝子の発現、及び/又は該遺伝子生成物の合成又は活性
の調節手段を提供する。
【0032】 野生型又は突然変異Prkag3サブユニット、又は第一CBSドメインに突然変異を
有する機能的に改変されたγサブユニット突然変異体からなる精製AMPKヘテロト
リマーは、AMPK活性を調節するか、又は改変されたAMPK活性を回復することので
きる化合物をインビトロでスクリーニングするために用いることができる。これ
は、例えば - 例えばハイスループットスクリーニング法を用いてヘテロトリマーに対する
化合物の結合を測定する; 又は、 - 例えばハイスループットスクリーニング法を用いてAMPKキナーゼ活性の変化
を測定する ことによって行ってもよい。
【0033】 ハイスループットスクリーニング法は、例えば"High throughput screening:
The Discovery of Bioactive Substances", J.P. DEVLIN (編集), MARCEL DEKKE
R Inc., New York (1997)に開示されている。 この発明の核酸は、治療目的に用いることができる。例えば、その相補分子又
はフラグメント(アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、より具体的には、筋肉組
織中のAMPK活性を調節するのに用いることができる。 また、機能性 Prkag3をエンコードする核酸配列は、正常なAMPKの機能回復に
用いることができる。 野生型もしくは突然変異Prkag3、あるいは上記のAMPKのγサブユニットの機能
的に改変された突然変異を発現するか、又は突然変異Prkag3もしくはAMPKのγサ
ブユニットの機能的に改変された突然変異からなるAMPKを発現する形質転換細胞
又は動物組織は、AMPK活性の代謝を誘発するために、又はAMPKの発現を調節し得
る化合物をスクリーニングするために、インビトロのモデルとして用いることが
できる。
【0034】 スクリーニングは、試験すべき化合物を、細胞又は組織の培養培地に加え、グ
ルコース濃度(レベル)、グルコース摂取又はATP/AMP比の変化、グリコーゲン又
は脂質/タンパク質含量の測定のような方法を用いて細胞又は組織におけるエネ
ルギー代謝の変化を測定して行うことができる。 発明は、この発明の核酸配列で形質転換された動物を提供する。 ひとつの具体例で、動物は、この発明の核酸からなる導入遺伝子を少なくとも
有するトランスジェニック動物である。 別の具体例では、この動物はノックアウト動物である。「ノックアウト動物」
は、天然又は内因性のPRKAG3アレレが不活化されており、独力で機能性 Prkag3
を生産しない動物を意味する。
【0035】 野生型もしくは突然変異Prkag3、又はAMPKのγサブユニットの機能的に改変さ
れた突然変異をエンコードするDNA配列についてのこの発明の開示に照らすと、
トランスジェニック動物ならびにノックアウト動物は、例えばインビボの同種組
換え手段により当該分野で公知の技術にしたがって生産することができる。 トランスジェニック又はノックアウトの動物の生産に適当な方法は、例えば H
OGAN らによるManipulating the Mouse Embryo 第2版、Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, 1994; Transgenic Animal Technology、C. PINKERT編集、Acade
mic Press Inc., 1994; Gene Targeting: A Practical Approach、A.L. JOYNER
編集、Oxford University Press, 1995; Strategies in Transgenic Animal Sci
ence、G.M. MONASTERSKY 及びJ.M. ROBL編集、ASM Press, 1995; Lee M. SILVER
によるMouse Genetics: Concepts and Applications、University Press, 1995
に開示されている。
【0036】 これらの動物は、代謝の疾患及び疾病、より詳細には筋肉のグリコーゲン代謝
の疾患及び疾病のモデルとして用いることができる。例えば、動物は、試験分子
のスクリーニングに用いることができる。つまり、トランスジェニック動物は、
AMPK活性を調節し得る化合物のスクリーニングに用いることができる。この発明
のノックアウト動物は、機能性Prkag3の不在下、特にエネルギー代謝、より詳細
には炭水化物の代謝を調節可能な化合物のスクリーニングに用いることができる
。 スクリーニングは、動物に試験されるべき化合物を投与し、その動物でのエネ
ルギー代謝の変化を、グルコース耐性試験、血中インシュリンレベル測定、ATP/
AMP比の変化、組織及び細胞中のグリコーゲン又は脂質/タンパク質含量のような
方法を用いて測定することにより行うことができる。
【0037】 肉特性が改変されるか又はエネルギー代謝が改変されたトランスジェニック又
はノックアウトの家畜動物を得ることもできる。 この発明は、この発明の核酸の入手及び使用の実施例に言及する以下の追加的
な記載によってさらに例証されるであろう。しかし、これらの実施例はこの発明
の例示にすぎず、いかなる方法でもそれを限定するものではないことは理解され
るべきである。
【0038】 実施例1: PRKAG3遺伝子の単離 ブタの細菌の人為的な染色体(BAC)ライブラリー(ROGEL-GAILLARDら、Cytogene
t and Cell Genet, 851, 273-278, 1999)をスクリーンし、RN遺伝子を有するブ
タ染色体15の領域にわたる重複BACクローンの整列群(contig)を構築した。これ
らのBACクローンを順番に用いて、以下の表1に記載するように、一塩基多型(SN
Ps)又はマイクロサテライト(MS)の形態の新しい遺伝マーカーを開発した。
【0039】
【表1】
【0040】 新しいマーカーは、高解像リンケージマップを構築するために幾つかの前記の
マーカーと共に用いた。RN遺伝子座での分離のための約1,000の有益な減数分裂
からなる系統データを用いる標準的なリンケージ解析により、MS479L3に近位で
マイクロサテライト Sw936に遠位の領域からRNを除外することができた。連鎖不
均衡(LD)解析は、同じマーカー及びスウェーデンハンプシャー群由来の68品種の
雄ブタの無作為の試料を用いて行い、筋肉中のグリコーゲン含量を測定してRN表
現型をスコアにした。DISMULTプログラムを用いるLD解析の結果(TERWILLIGER, A
m. J. Hum. Genet., 56, 777-787, 1995)を図1に示す。結果は、マーカー MS12
7B1とSNP127G63の周囲にシャープなLDピークを示している。これらのマーカーは
、RN- アレレとの完全な連鎖不均衡を示すものと思われる。つまり、RN-は、こ
れらの2つの遺伝子座で1つのアレレと関連していた。この知見についてのもっと
も単純な解釈は、RN- 突然変異はこれらのアレレを有する染色体で生じるという
こと、及び2つのマーカーは、組換え頻度が0%に近いRN遺伝子座にかなり密接に
関連しているということである。2つのマーカーは、重複しているBACクローン、
127G6と134C9に共に存在し、RN遺伝子が同じクローン又は隣合うクローンの1つ
に存在しうることを示唆している。
【0041】 BACクローン127G6のショット-ガンライブラリーを構築し、読解した 1,000個
以上の配列を集めて、クローンから約500,000塩基対のランダムDNA配列を得た。
データを解析し、配列の整列群をPHRED、PHRAP 及びCONSEDソフトウエアパッケ
ージ(University of Washington Genome Center, http://bozeman.mbt. washing
ton.edu)を用いて構築した。配列データをREPEATMASKER ソフトウエア(http://f
tp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker)を用いて繰り返し体について
マスクし、BLAST検索をNCBIウェブサイト (http://www.ncbi.nlm.nih. gov)を用
いて行った。コード化配列に対して3つの説得力ある一致が得られた。これらの
うち2つはヒトcDNA 配列/遺伝子に対するものであり、ブタのチューブリン-チロ
シンリガーゼに類似しているとして記載されるKIAA0173はHSA2qに局在し(UniGen
e cluster Hs.169910, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)、CYP27A1は HS
A2q33-terに局在した(UniGene cluster Hs. 82568)。結果は、RN領域がHSA2q33-
36に相同であることが十分に確立されたので、ブタのコード化配列がこれらのヒ
ト遺伝子に対してオーソロガスであることを強く示唆した(ROBICら、Mamm. Geno
me, 10, 565-568, 1999)。しかし、これらの配列はRNのもっともらしい候補遺伝
子とは思われない。BAC 127G6で同定された第三のコード化配列は、酵母SNF4配
列をはじめとする種々のAMP-活性化プロテインキナーゼγ配列に著しく高い配列
類似性を示した。この遺伝子のcDNA配列は、rn+/rn+ 同型接合体由来の筋肉mRNA
を用いるRT-PCR 及びRACE解析により決定された。この配列を図2及び別紙の配
列リストにSEQ ID NO: 1で示す。
【0042】 図2の説明: 5' UTR: 5' 非翻訳領域 3' UTR: 3' 非翻訳領域 CDS: コード化配列 ***: 停止コドン '-': マスター配列に対する同一性 '.': アラインメントギャップ 翻訳フレームは、フレーム中の最初のメチオニンコドンを開始コドンと仮定し
て、タンパク質ファミリーでの他のメンバーに対するホモロジーに基づいて決定
した。これに基づいて推測されたポリペプチド配列を、別紙の配列リストにSEQ
ID NO: 2で示す。 ブタのPRKAG3 cDNAの完全なヌクレオチド配列は、別紙の配列リストにSEQ ID
NO: 27で示し、完全なポリペプチド配列は、別紙の配列リストにSEQ ID NO: 28
で、また図3に示す。
【0043】 図3は、ヌクレオチドデータベース中の代表的なAMPKγ配列を有する CLUSTAL
W プログラム(THOMPSONら、Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680, 1994)で
構築したアミノ酸アラインメントを示す。 図3の説明: 用いた配列: HumG1: Genbank U42412 MusG1: Genbank AF036535 HumG2: ヒトPRKAG2 (Genbank AJ249976) PigG3: ブタ PRKAG3 (本研究) HumG3: ヒト PRKAG3 (本研究) Dros: ショウジョウバエ (Genbank AF094764) SNF4 (酵母): Genbank M30470 PRKAG2とショウジョウバエの配列は、いずれもより長いアミノ末端領域を有す
るが、PRKAG3のアミノ末端領域に対しては有意なホモロジーを示さず、含まれな
かった。
【0044】 略語: *: 停止コドン '-': マスター配列に対する同一性 '.': アラインメントギャップ 4つのCBSドメインを上部に付し(overline)、RN- 突然変異の位置を矢印で示す
。 以下の表2は、哺乳動物、ショウジョウバエ及び酵母AMPKG/SNF4配列における
アミノ酸(上の項)とヌクレオチド配列(下の項) の同一性を示す(%)。ブタのPRKA
G3とヒトのPRKAG3の場合、同一性は、ヌクレオチド配列についてはSEQ ID NO: 1
及びSEQ ID NO: 3、アミノ酸配列についてはSEQ ID NO: 2 及びSEQ ID NO: 4に
よってそれぞれ示される同一性の部分を参照して算出した。
【0045】
【表2】
【0046】 図4は、酵母SNF4を外集団として用いるPAUPソフトウェア(SWOFFORD, 節減(及
び他の方法)を用いる系統発生解析、Sinauer Associates, Inc. Publishers, Su
nderland, Massachusetts, 1998)で構築した隣接-結合系統樹(Neighbor-Joining
phylogenetic tree)を示す。1,000個の複製を用いたブートストラップ解析で得
られる支線オーダーのサポートを示し、樹のスケールを下に示す。結果は、RN領
域に局在するブタ遺伝子は哺乳動物のPRKAG1ならびにPRKAG2のイソ型とは異なる
ことを示しており、遺伝子は筋肉cDNAライブラリーから誘導されるヒト EST配列
AA178898 (GenBank)によって示されるヒト遺伝子にオルソローガスであると思わ
れる。この遺伝子は、これまでに特徴付けられた哺乳動物のAMP活性化プロテイ
ンキナーゼγの第三イソ型であるので、ここでPRKAG3と示す。 この遺伝子のcDNA配列は、ヒト骨格筋肉cDNAを用いるRT-PCR 及び5'RACE 解析
によって決定した(Clontech, Palo Alto, CA)。この配列を、図2及び配列リスト
のSEQ ID NO: 3に示す。ブタの配列 SEQ ID NO: 2 と97%の同一性を有する推定
上のポリペプチド配列(表2参照)は、図2及び配列リストのSEQ ID NO: 4に示す。
【0047】 完全なcDNA配列は、別紙の配列リストにSEQ ID NO: 29でも示す;推定されるポ
リペプチド配列は、別紙の配列リストのSEQ ID NO: 30及び図3に示す。 高解像のヒトTNG 放射ハイブリッドパネル: (http://shgc-www.stanford.edu/
RH/TNGindex.html) を用いて、ブタのBAC127G6に存在するPRKAG3、CYP27A1 及
びKIAA0173のヒト同族体をマップした。3つの遺伝子は、ヒトのゲノムでも極め
て近くに結合している。PRKAG3は、 KIAA0173 から33 cR50.000及びCYP27A1から
52 cR50.000の距離で、それぞれ6.8及び4.5のロッドスコアサポート(lod score
support)を用いてマップされた。 グリコーゲン貯蔵をはじめとするエネルギー代謝調節におけるAMPKの確立した
役割、及び最大の連鎖不均衡を示す領域でのその位置により、PRKAG3がRNに対し
て極めて強力な候補遺伝子となった。これは、ヒトPRKAG1 (GenBank エントリー
AA018675Iに相当するMAGEクローン0362755)、ヒトPRKAG2 (GenBank エントリー
W15439に相当するIMAGEクローン0322735)及びブタのPRKAG3プローブを用いるヒ
トの複数組織のノーザンブロットのハイブリダイゼーション解析により、さらに
強調された。結果を図5に示す。
【0048】 図5の説明: H: 心臓、B: 脳、Pl: 胎盤、L: 肺、Li: 肝臓、M: 骨格筋肉、K: 腎臓、Pa: 膵
臓、S: 脾臓、Th: 胸腺、P: 前立腺、T: 精巣、O: 卵巣、I: 小腸、C: 結腸(粘
膜網(mucosal lining))、PBL: 末梢血液白血球。 PRKAG1及びPRKAG2プローブは、広範囲な発現の組織分布を示したが、PRKAG3は
、異なる筋肉特異的な発現を示した。この結果はヒトESTデータベースでも支持
され、PRKAG1 及び PRKAG2を示す複数のESTsが種々のcDNAライブラリーで同定さ
れ、PRKAG3を示す1つのEST (GenBank エントリーAA178898)が筋肉のcDNAライブ
ラリーから得られた。PRKAG3の筋肉特異的な発現及び肝臓での発現の欠損は、完
全にRN-の表現型作用と一致している。つまり、グリコーゲン含量は筋肉で変化
されるが、肝臓では正常である(ESTRADEら、Comp. Biochem. Physiol. 104B, 32
1-326, 1993)。
【0049】 PRKAG3配列は、RT-PCR解析によりrn+/rn+ 及びRN-/RN- 同型接合体から決定し
た。比較により7つのヌクレオチドの相違全てを示したところ、以下の表3に示す
ように、そのうちの4つについて、非同一置換がrn+ とRN-の動物由来の配列間に
認められた。異なる品種の追加されたrn+ 及びRN- のブタ由来のゲノムDNAとの
これらの7つのSNPsのスクリーニングにより5つの異なるPRKAG3アレレが示された
が、R41Q ミスセンス置換はRN-に排他的に関連しているにすぎなかった。この非
保存置換はCBS1で生じる。これは、AMPK γ鎖のアイソタイプ形態にもっとも保
存されている領域であり、この残基のアルギニン(Prkag1の70残基)は哺乳動物の
AMPK γ配列の異なるイソ型ならびに相当するショウジョウバエの配列に保存さ
れている(図3)。R41Q突然変異に対する簡単な診断DNA試験を、オリゴヌクレオチ
ド連結アッセイ(OLA; LANDEGRENら、Science, 241, 1077-1080, 1988) に基づい
てデザインした。 ハンプシャー品種の多数のRN- 及び rn+ 動物ならびに他品種
の多数のrn+動物をスクリーンすると、表4に示すように、41Q アレレは全てのRN - 動物で存在するが、rn+ 動物では全く見られないことが分かった。他品種に41Q
アレレがないことは、RN-アレレがハンプシャー品種で生じたとの仮定と一致し
ている。アレレは、他品種由来の純血動物ではいまだ認められていない。結論と
して、結果は、PRKAG3がRN遺伝子と同一であり、もっとも可能性のあるR41Q 置
換が突然変異の原因であるとの説得力ある証拠を示している。
【0050】
【表3】
【0051】
【表4】
【0052】 特定の機序に関わらなければ、PRKAG3を含むAMPKへテロトリマーは骨格筋肉へ
のグルコースの輸送制御に関わっているものと推測される。 AMPK類似体AICAR又は筋肉収縮により誘発されるAMPKの活性化は骨格筋肉での
グルコース摂取を増加させることが、最近報告されている(BERGERONら、Am. J.
Physiol., 276, E938-944, 1999; HAYASHIら、Diabetes, 47, 1369-1373, 1998)
。 これがPRKAG3を含むAMPKヘテロトリマーの機能であれば、R41Qは、例えば不
活化しているアロステリック部位を欠いているために、構成上活性なハロ酵素を
生じる機能増大(gain-of-function)突然変異であってもよい。もしそうであれば
、RN-動物でのAMPK活性の低下は、筋肉の高エネルギー状態のためにフィードバ
ック阻害を反映する可能性がある。骨格筋肉へのグルコースの摂取増加は、RN-
動物で認められたような筋肉のグルコーゲン含量の増加をもたらすものと期待さ
れる。トランスジェニックマウスでのグルコーストランスポーター4(GLUT4)の過
剰発現は、グルコースの摂取を増加し、グリコーゲンの貯蔵を増すことが示され
ている(TREADWAYら、J. Biol. Chem., 269, 29956-29961, 1994)。この種の機能
増大モデルは、1つの非制御コピーの存在がAMPK酵素活性に大きく影響するので
、RN-の優性に一致している。
【0053】 また、RN-アレレに関連したR41Q置換の機能上の重要性に対する別の仮説が提
案され得る。グリコーゲンの利用における酵母SNF1酵素、及びエネルギー消費経
路阻害ならびにエネルギー産生経路刺激のための哺乳動物AMPKの確立された役割
に基づけば、活性化AMPKはグリコーゲン合成を阻害し、グリコーゲン分解を刺激
するものと考えられる。これがPRKAG3生成物を含むイソ型の機能上の役割であれ
ば、R41Q置換は、機能欠損突然変異体又は不活性状態でAMPKヘテロトリマーをロ
ックする優性-陰性(dominant-negative)突然変異体であり、この結果、AMP活性
化及びグリコーゲン分解を阻害するであろう。これらの場合、表現型作用は、 R
N-が完全に優性であるために、ハプロ-不十分性(haplo-insufficiency)によって
説明されるはずである。
【0054】 R41Qは、この結果、優性陰性突然変異体であってもよいが、筋肉中の主要なAM
PK活性はPRKAG1及び2つのイソ型に関連していると考えられるので、複数のイソ
型に緩衝している場合のみである[CHEUNG,ら、Biochem. J. 346, 659 (2000)]。 RN- 突然変異体の異なる表現型は、PRKAG3が骨格筋肉でのエネルギー代謝の制
御に主要な役割を果たしていることを示している。例えば、PRKAG3はグリコーゲ
ン貯蔵の増加に関連した物理的な運動に対する適応に関わっていると考えられる
。 また、PRKAG3の機能欠損突然変異体(又は他のAMPK遺伝子)は、非インシュリ
ン-依存性真性糖尿病に個体を感染しやすくし、AMPKイソ型はこの疾患の治療の
ための潜在的な薬剤標的であると考えられる。
【0055】 実施例2: ブタPRKAG3におけるR41Q置換の検出 コドン41を含むPRKAG3の一部を、100 ngのゲノムDNA、0.2 mM dNTPs、1.5 mM
MgCl2、4.0 pmolのフォワード(AMPKG3F3:5'-GGAGCAAATGTGCAGACAAG-3')及びリバ
ース(AMPKG3R2:5'-CCCACGAAGCTCTGCTTCTT-3')双方のプライマー、10% DMSO、1 U
のTaq DNAポリメラーゼ及び反応緩衝液(ADVANCED BIOTECH, London, UK)を含む1
0μl反応物で増幅させた。サイクリング条件には、94℃で5分の初期インキュベ
ーション、続いて94℃(1分)、57℃(1分)及び72℃(1分)での3サイクル、及び94℃
(20秒)、55℃(30秒)及び72℃(30秒)の35サイクルを含めた。ヌクレオチド位置12
2でのアレレの弁別は、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA, LANDEGREN ら、S
cience, 241, 1077-1080, 1988)を用いて行った。OLA法は、ゲル-ベースのアッ
セイとして行った。各10μlのOLA 反応には、0.5 pmolの各プローブSNPRN-A (5'
Hex-TGGCCAACGGCGTCCA-3')、SNPRN-G (5'ROX-GGCCAACGGCGTCCG-3') 及び SNPRN-
共通(Common) (5'リン酸塩-AGCGGCACCTTTGTGAAAAAAAAAA-3')、1.5 Uの熱安定性A
MPLIGASE 及び反応緩衝液(EPICENTRE TECHNOLOGIES, Madison, WI)及び 0.5 μ
lのAMPKG3F3/AMPKG3R2 PCR産物を含めた。95℃で5分の初期インキュベーション
後、以下の熱サイクルプロフィルを10回繰り返した: 94℃(30秒)の変性、55℃(9
0秒)でのプローブアニーリング及び連結。OLAサイクル後、1μlの生成物を94℃
(3分)で熱変性し、氷上で冷却し、ABI377 DNA シークエンサー(PERKIN ELMER, F
oster City, USA)での電気泳動用の6%ポリアクリルアミド変性ゲルに充填した。
得られたフラグメント長及びピークの蛍光発光は、GENESCANソフトウェア(PERKI
N ELMER, Foster City, USA)を用いて分析した。
【0056】 R41Q突然変異体のためのOLA-ベース法を用いて、糖分解能(GP)値に基づいてRN - 又はrn+ のいずれかとしての表現型をもつ68頭のスウェーデンハンプシャー動
物から回収したDNA試料の遺伝子型を決定する。図6は、3つの潜在的な遺伝子型
からの一般的なOLA結果を示している。全てのRN-動物は、ヌクレオチド位置122
で同型接合体A/A (n=28) 又は異型接合体A/G (n=36)としてスコアされたが、rn+ 動物はこの位置で同型接合体G/G (n=4)であった。
【0057】 実施例3: 密接に関連するマイクロサテライトMS127B1を用いるRN- アレレの有無
の予想 マイクロサテライト127B1 (MS127B1)は、ブタPRKAG3を含むBAC 127G7 からク
ローンした。BACクローンをSau3AIで消化し、制限フラグメントをpUC18のBamHI
部位にサブクローンした。得られたライブラリーを、[γ-32P]-dATP標識した (C
A)15 オリゴヌクレオチドプローブでプローブした。強くハイブリダイズするク
ローンをシークエンスし、マイクロサテライト遺伝子座のPCR増幅用プライマー
をデザインした。100 ng ゲノムDNA、0.2 mM dNTPs、 1.5 mM MgCl2、4.0 pmol
のフォワード(MS127B1F:5'-フルオレセイン-CAAACTCTTCTAGGCGTGT-3') 及びリバ
ース(MS127B1R:5'-GTTTCTGGAACTTCCATATGCCATGG-3')双方のプライマー、及び1 U
のTaq DNA ポリメラーゼ及び反応緩衝液(ADVANCED BIOTECH, London, UK)を含
む10μlのPCR反応を行なった。サイクリング条件には、94℃で5分の初期インキ
ュベーション、続いて94℃(1分)、57℃(1分)及び72℃(1分)での3サイクル、及び
94℃ (20秒)、55℃(30秒)及び72℃(30秒)の35サイクルを含めた。PCR生成物(0.3
μl)を、ABI377 DNAシークエンサー(PERKIN ELMER, Foster City, USA)で4%ポ
リアクリルアミド変性ゲル電気泳動を用いて分離した。得られたフラグメント長
は、 GENESCAN 及び GENOTYPER ソフトウェア(PERKIN ELMER, Foster City, USA
)を用いて解析した。
【0058】 方法を用いて、糖分解能(GP)値に基づいてRN-又はrn+ のいずれかとしての表
現型をもつ87頭のスウェーデンハンプシャー動物から回収したDNA試料の遺伝子
型を決定する。下記の表5に示すとおり、全てのRN- (RN-/ RN- 又はRN-/rn+)動
物はこのアレレに同型接合体又は異型接合体であったが、rn+ (rn+/rn+)動物は
このアレレを有しなかったように、アレレ108 (bp)はこの物質でRN-アレレに対
する完全な関連性を示した。
【0059】
【表5】
【0060】 実施例4: PCR-RFLP 試験を用いるRN-アレレの有無の検出 RN-突然変異は、BsrBI 部位GAG^CGG/CTC^GCC (BsrBI RE 部位はパリンドロー
ムではない)を不活化する。この部位では、RN- 配列はGAGCGG ではなくAAGCGGで
ある。 RN遺伝子の134 bp長フラグメントは、ブタのゲノムDNAから増幅される。rn+
アレレはBsrBIの消化後に83 及び51 bpsの2つのフラグメントの検出によって同
定される。 試験は、以下のように行う:1. プライマー配列: RN突然変異領域の増幅に用いたプライマー配列: RNU: 5' GGGAACGATTCACCCTCAAC 3' RNL: 5' AGCCCCTCCTCACCCACGAA 3' 消化を内部制御するために、BsrBI部位を、20 bp長のテール内の2つのプライ
マーの1つの末端に加える。テールにより、BsrBI部位の作成(より短いテールで
十分な可能性がある)及び他のフラグメントからの未切断フラグメントの容易な
弁別が可能である。テールプライマーの使用は、増幅の効率及び特異性に影響を
及ぼさない。 BsrBI部位を有するコントロールテールを含むRNL修飾プライマーの配列: RNLBsrA14: 5' A5C2A7CCGCTCAGCCCCTCCTCACCCACGAA 3'
【0061】2. 用いたPCR反応混合物: 50 ng DNA 0.5 ユニット Taq ポリメラーゼ(GIBCO BRL) 1.5 mM MgCl2 200 mM dNTP 0.2 μM 各プライマー 全反応容量: 25 μl3. 使用したPCR条件(OMNIGENE HYBAID サーモサイクラー): 1x (5分 95℃) 35x (45秒 57℃、45秒72℃、45秒95℃) 1x (45秒57℃、15分72℃)
【0062】4. 37℃で2時間行った制限酵素消化: 10 μl PCR生成物 1x BsrBI BIOLABS 緩衝液 5U BsrBI 制限酵素(BIOLABS) 全反応容量: 15 μl 5. コントロールテールを有するプライマーを用いるPCR後に産生されるフラ グメントの大きさ及びBsrBIでの消化: RN- 又はrn+ アレレからの未切断フラグメント : 154 bp RN- アレレから増幅したフラグメントの消化後 : 137 bp + 17 bp rn+ アレレから増幅したフラグメントの消化後 : 83 bp + 54 bp + 17 bp 大きさの相違は、ポリアクリルアミド、アガロース/NUSIEVE又はアガロースの
ゲル電気泳動のいずれかの後に同定できる。
【0063】 実施例5: 糖分解能に対するV40I多型の影響 さらに、一連の181頭の rn+/rn+ 同型接合体動物(SEQ ID NO: 2の位置41でR/R
)を、FokI制限酵素を用いるPCR-RFLPにより、V40I多型について分析した(SEQ ID
NO: 2の位置40を示す)。糖分解能を、MONINら(Meat Science, 13, 49-63, 1985
)によって開示される方法にしたがって、同時に測定した。 結果を以下の表6に示す:
【0064】
【表6】
【0065】 これらの結果は、V40I多型が、骨格筋肉の糖分解能に有意な影響を有している
ことを示している。
【0066】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 5/10 C12Q 1/02 9/12 1/48 Z C12Q 1/02 1/68 A 1/48 G01N 33/15 Z 1/68 33/50 Z G01N 33/15 33/53 M 33/50 33/566 33/53 C12N 15/00 ZNAA 33/566 5/00 A B (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT, AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,C A,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM ,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH, GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,K E,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS ,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN, MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM ,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN, YU,ZA,ZW (71)出願人 アンダーソン,リーフ ANDERSSON,Leif スウェーデン、エス−752 39 アップサ ラ、ベルガゲーテン 30 Bergagatan 30,S−752 39 Uppsala SWEDEN (71)出願人 ローフト,クリスティアン LOOFT,Cristian ドイツ、24802 ボケルホルム、ミッテル ヴェーク 3 ツェー Mittelweg 3 c,24802 B okelholm GERMANY (71)出願人 カルム,エルンスト KALM,Ernst ドイツ、24239 アハターヴェーア、シュ マールホルト 1 Schmalholt 1,24239 Ac hterwehr GERMANY (72)発明者 アンダーソン,リーフ スウェーデン、エス−752 39 アップサ ラ、ベルガゲーテン 30 (72)発明者 ローフト,クリスティアン ドイツ、24802 ボケルホルム、ミッテル ヴェーク 3 ツェー (72)発明者 カルム,エルンスト ドイツ、24239 アハターヴェーア、シュ マールホルト 1 (72)発明者 ミラン,デニス フランス、エフ−31670 ラベジ、シェミ ン デュ トリコ、3 ビス (72)発明者 ロビ,アニー フランス、エフ−31650 サン−オーレ− ドゥ−ゲメヴィレ、リュ デ カピトー ル、33 (72)発明者 ロゲル−ガイラード,クレア フランス、エフ−75013 パリ、リュ レ オン モーリス ノルマン、156 (72)発明者 イアンヌセリ,ナタリー フランス、エフ−31320 カスタネット− トロサン、ブールヴァード デ アロッ テ、7 (72)発明者 ゲリン,ジョエル フランス、エフ−31320 アウゼヴィレ、 アレ デ アマゾネス、8 (72)発明者 レ ロイ,パスカル フランス、エフ−91300 マーシー、アヴ ェニュ サン マルク、32 (72)発明者 シャルドン,パトリック フランス、エフ−91430 ヴァウハラン、 リュ ドゥ プティ フォンテーヌ、17 Fターム(参考) 2G045 AA25 AA29 AA40 BB20 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA15 DA20 DA31 DA36 DA54 DA77 FB02 FB04 4B024 AA10 AA11 BA10 CA02 CA09 HA14 4B050 CC04 DD11 LL02 LL03 4B063 QA18 QA19 QQ27 QQ42 QR07 QR55 QR62 QS25 QS34 4B065 AB01 BA02 CA29 CA41 CA46

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 γサブユニットが、ポリペプチドSEQ ID NO: 2と少なくとも
    70%の同一性を有する配列から少なくともなるポリペプチドである脊椎動物のAM
    P-活性化キナーゼ(AMPK)のγサブユニット。
  2. 【請求項2】 ポリペプチドが、ポリペプチドSEQ ID NO: 2と少なくとも 9
    5%の同一性を有する配列からなる請求項1のポリペプチド。
  3. 【請求項3】 ポリペプチドが、ポリペプチドSEQ ID NO: 28と少なくとも
    75%の同一性を有する配列からなる請求項1のポリペプチド。
  4. 【請求項4】 ポリペプチドが、配列SEQ ID NO: 2又はSEQ ID NO: 4からな
    る請求項1〜3のいずれかによるポリペプチド。
  5. 【請求項5】 ポリペプチドが、配列SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30又はSE
    Q ID NO: 32からなる請求項4のポリペプチド。
  6. 【請求項6】 ポリペプチドが脊椎動物のAMP-活性化キナーゼのγサブユニ
    ットの第一CBSドメイン内に局在する突然変異を少なくとも有する、γサブユニ
    ットの機能的に改変された突然変異体であるポリペプチド。
  7. 【請求項7】 突然変異が、残基30〜残基50にわたるポリペプチドSEQ ID N
    O:2の領域とアラインされた第一CBSドメイン領域内に局在する請求項6のポリペ
    プチド。
  8. 【請求項8】 突然変異がR→Q置換又はV→I置換である請求項7のポリペプ
    チド。
  9. 【請求項9】 - SEQ ID NO: 2の位置41に相当する位置におけるR→Q置換
    に起因する配列を有するポリペプチド; - SEQ ID NO: 2の位置40に相当する位置におけるV→I置換に起因する配列を有
    するポリペプチド から選択される請求項8のポリペプチド。
  10. 【請求項10】 請求項1〜5のいずれかのポリペプチドの一部の欠失に起
    因する、脊椎動物のAMP-活性化キナーゼのγサブユニットの突然変異体であるポ
    リペプチド。
  11. 【請求項11】 EST GENBANK AA178898又はEST W94830からは構成されない
    ことを条件とする、請求項1〜10のいずれかのポリペプチドをエンコードする
    核酸配列、又はその補体。
  12. 【請求項12】 配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:27、SEQ ID N
    O:29、SEQ ID NO:31を有する請求項11の核酸配列、又はその補体。
  13. 【請求項13】 請求項1〜10のいずれかのポリペプチドをエンコードす
    る核酸配列の少なくとも 一部、及び500kbまでの隣合うゲノムDNA配列の3'及び/
    又は5'からなる核酸配列、又はその補体。
  14. 【請求項14】 EST GENBANK AA178898又はEST GENBANK W94830からは構成
    されないことを条件とする、 - 請求項1〜10のいずれかのポリペプチドをエンコードする核酸配列、又は
    請求項13の核酸配列の特異的なフラグメント; - 請求項1〜8のいずれかのポリペプチドをエンコードする核酸配列、又は請
    求項11の核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする
    核酸フラグメント から選択される核酸フラグメント。
  15. 【請求項15】 請求項14の核酸フラグメントからなるプライマーから少
    なくともなる、請求項11〜13のいずれかの核酸配列を増幅するための一連の
    プライマー、又はその一部。
  16. 【請求項16】 請求項1〜10のいずれかのポリペプチドをエンコードす
    る核酸配列からなる組換えベクター。
  17. 【請求項17】 請求項1〜10のいずれかのポリペプチドをエンコードす
    る核酸配列によって形質転換される宿主細胞。
  18. 【請求項18】 請求項1〜10のいずれかのポリペプチドをエンコードす
    る核酸配列によって形質転換されるトランスジェニック動物。
  19. 【請求項19】 請求項1〜5のいずれかのポリペプチドをエンコードする
    遺伝子が不活化されているノックアウト動物。
  20. 【請求項20】 γサブユニットが、請求項1〜10のいずれかのポリペプ
    チドからなるヘテロトリマーAMPK。
  21. 【請求項21】 - 脊椎動物由来の核酸試料を得て; - この核酸において、ポリペプチドが機能的に改変されている請求項1〜10
    のいずれかのポリペプチドをエンコードする核酸配列の有無を確認すること からなる、AMPKのγサブユニットをエンコードする遺伝子における突然変異に起
    因する代謝疾患の検出方法。
  22. 【請求項22】 疾患が、筋肉細胞中の改変されたグリコーゲン蓄積に関連
    し、請求項1〜5のいずれかのポリペプチドの機能的に改変されたアレレの発現
    に起因する請求項21の方法。
  23. 【請求項23】 突然変異ポリペプチドをエンコードする核酸配列の有無が
    、請求項14の核酸から得られる核酸プローブと核酸試料を接触させ、プローブ
    と検出されるべき突然変異配列との特異的なハイブリダイゼーション条件下で、
    この突然変異をスパンし、ハイブリダイゼーション複合体を検出することによっ
    て確認される請求項21又は22のいずれかの方法。
  24. 【請求項24】 - 請求項1〜5のいずれかのポリペプチドをエンコード
    する核酸配列及びフランキング染色体配列からなるクローンを選択するために、
    核酸配列に特異的なプローブを用いて脊椎動物由来のゲノムDNAライブラリーを
    スクリーニングし、 - フランキング染色体配列中の多型遺伝座を同定し、多型遺伝子座からなるDNA
    セグメントをシークエンスし、 - 多型遺伝子座をフランクしているプライマー対をデザインする ことからなる、請求項1〜5のいずれかのポリペプチドをエンコードする核酸配
    列に関連する遺伝多型マーカーを検出できる一対のプライマーを得るための方法
  25. 【請求項25】 選択されたクローンが、請求項1〜5のいずれかのポリペ
    プチドをエンコードする核酸配列の少なくとも 一部、及び500kbまでの隣合う配
    列の3'及び/又は5'からなる請求項24の方法。
  26. 【請求項26】 脊椎動物が哺乳動物である請求項21〜25のいずれかの
    方法。
  27. 【請求項27】 哺乳動物がブタである請求項26の方法。
  28. 【請求項28】 請求項24〜26のいずれかの方法によって得られる一対
    のプライマー。
  29. 【請求項29】 - 脊椎動物由来のゲノムDNA試料を得て、 - このDNAを、PCR増幅可能な条件下で請求項28の一対のプライマーと接触さ
    せ、 - PCR産物を分析し、請求項1〜5のいずれかのポリペプチドについて機能的に
    改変されたアレレをエンコードする核酸配列に関連する多型マーカーのアレレが
    存在するかどうかを検出する ことからなる、請求項1〜5のいずれかのポリペプチドの機能的に改変されたア
    レレの脊椎動物での発現に起因する炭水化物代謝の機能不全の検出方法。 選択されたクローンが、請求項1〜5のいずれかのポ
  30. 【請求項30】 機能的に改変されたポリペプチドが、SEQ ID NO:2のR41Q
    置換に起因する請求項29の方法。
  31. 【請求項31】 脊椎動物が哺乳動物である請求項29又は30のいずれか
    の方法。
  32. 【請求項32】 哺乳動物がブタである請求項31の方法。
  33. 【請求項33】 一対のプライマーが、 - SEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 7及びSEQ ID NO: 8からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 9 及び SEQ ID NO: 10からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 11 及びSEQ ID NO: 12からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 13 及び SEQ ID NO: 14からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 15 及び SEQ ID NO: 16からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 17 及び SEQ ID NO: 18からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 19 及び SEQ ID NO: 20からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 21 及び SEQ ID NO: 22からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 23 及び SEQ ID NO: 24からなるプライマー対; - SEQ ID NO: 25 及び SEQ ID NO: 26からなるプライマー対 から選択される請求項32の方法。
  34. 【請求項34】 AMPK活性を調節し得る化合物をスクリーンするための請求
    項17の形質転換細胞の使用。
  35. 【請求項35】 AMPK活性を調節し得る化合物をスクリーンするための請求
    項18のトランスジェニック動物の使用。
  36. 【請求項36】 請求項1〜5のいずれかの機能性ポリペプチドの不在下で
    、エネルギー代謝を調節し得る化合物をスクリーンするための請求項19のノッ
    クアウト動物の使用。
  37. 【請求項37】 AMPK活性を調節し得る化合物をスクリーンするための請求
    項20のヘテロトリマーAMPKの使用。
JP2001523774A 1999-09-10 2000-09-11 AMPKのγ鎖の変異体、それをエンコードするDNA配列及びその使用 Expired - Fee Related JP3983051B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99402236 1999-09-10
EP99402236.6 1999-09-10
EP00401388.4 2000-05-18
EP00401388 2000-05-18
PCT/EP2000/009896 WO2001020003A2 (en) 1999-09-10 2000-09-11 Variants of the gamma chain of ampk, dna sequences encoding the same, and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007016822A Division JP2007190021A (ja) 1999-09-10 2007-01-26 AMPKのγ鎖の変異体、それをエンコードするDNA配列及びその使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003509052A true JP2003509052A (ja) 2003-03-11
JP3983051B2 JP3983051B2 (ja) 2007-09-26

Family

ID=26073491

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001523774A Expired - Fee Related JP3983051B2 (ja) 1999-09-10 2000-09-11 AMPKのγ鎖の変異体、それをエンコードするDNA配列及びその使用
JP2007016822A Pending JP2007190021A (ja) 1999-09-10 2007-01-26 AMPKのγ鎖の変異体、それをエンコードするDNA配列及びその使用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007016822A Pending JP2007190021A (ja) 1999-09-10 2007-01-26 AMPKのγ鎖の変異体、それをエンコードするDNA配列及びその使用

Country Status (15)

Country Link
US (1) US7462693B2 (ja)
EP (1) EP1210441B1 (ja)
JP (2) JP3983051B2 (ja)
KR (1) KR100806954B1 (ja)
CN (1) CN100439503C (ja)
AT (1) ATE293167T1 (ja)
AU (1) AU781744B2 (ja)
BR (1) BR0013890A (ja)
CA (1) CA2384313C (ja)
DE (2) DE00967845T1 (ja)
DK (1) DK1210441T3 (ja)
ES (1) ES2239618T3 (ja)
MX (1) MXPA02002613A (ja)
PL (1) PL354753A1 (ja)
WO (1) WO2001020003A2 (ja)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020142310A1 (en) * 2000-04-07 2002-10-03 Leif Andersson Variants of the human AMP-activated protein kinase gamma 3 subunit
JP2004522418A (ja) 2000-09-08 2004-07-29 アイオワ ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション,インコーポレーティッド 新規なprkag3対立遺伝子並びに生殖性及び肉質の形質の遺伝標識としてのその使用
WO2003065795A2 (en) * 2002-01-18 2003-08-14 Evotec Neurosciences Gmbh An invertebrate animal model with neurodegenerative phenotype for screening and testing substances
WO2003064465A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Arexis Ab Prkag3 gene promoter and uses thereof
EP1476464A1 (en) 2002-02-01 2004-11-17 Arexis AB Variants of the alpha 1 subunit of human ampk
DK1476012T3 (da) * 2002-02-01 2010-05-31 Arexis Ab Transgene mus, der udtrykker PRKAG3
GB0221148D0 (en) * 2002-09-12 2002-10-23 Univ Dundee Kinase inhibitor screening assay
US8688385B2 (en) * 2003-02-20 2014-04-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for selecting initial doses of psychotropic medications based on a CYP2D6 genotype
CN104894239B (zh) * 2015-05-11 2017-12-19 中国农业科学院植物保护研究所 一种用AMPKγ基因评价昆虫发育速率的方法
CN113207808B (zh) * 2021-06-03 2023-09-29 贵州大学 一种柯乐猪的选育方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4041156A (en) * 1974-11-08 1977-08-09 Mitsubishi Chemical Industries Limited N2 -alkoxynaphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4096255A (en) * 1974-11-08 1978-06-20 Mitsubishi Chemical Industries Limited N2 -naphthalenesulfonyl-L-argininamides, and pharmaceutical salts, compositions and methods
US4018915A (en) * 1976-01-05 1977-04-19 Mitsubishi Chemical Industries Ltd. N2 -alkoxynaphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4046876A (en) * 1974-11-08 1977-09-06 Mitsubishi Chemical Industries Limited N2 -alkoxynaphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4104392A (en) * 1974-11-08 1978-08-01 Mitsubishi Chemical Industries Ltd. N2 -naphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof, and antithrombotic compositions and methods employing them
US4055651A (en) * 1974-11-08 1977-10-25 Mitsubishi Chemical Industries Ltd. N2 -alkoxynaphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4055636A (en) * 1974-11-08 1977-10-25 Mitsubishi Chemical Industries Ltd. N2 -alkoxynaphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4073914A (en) * 1974-11-08 1978-02-14 Mitsubishi Chemical Industries Limited N2 -naphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4070457A (en) * 1974-11-08 1978-01-24 Mitsubishi Chemical Industries Ltd. N2 -naphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4036955A (en) * 1976-07-22 1977-07-19 Mitsubishi Chemical Industries Ltd. N2 -naphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
US4018913A (en) * 1976-01-14 1977-04-19 Mitsubishi Chemical Industries Ltd. N2 -alkoxynaphthalenesulfonyl-L-argininamides and the pharmaceutically acceptable salts thereof
AUPN745096A0 (en) * 1996-01-08 1996-02-01 St. Vincent's Institute Of Medical Research Novel amp activated protein kinase
US5885803A (en) * 1997-06-19 1999-03-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Disease associated protein kinases
US20020142310A1 (en) 2000-04-07 2002-10-03 Leif Andersson Variants of the human AMP-activated protein kinase gamma 3 subunit
JP2004522418A (ja) 2000-09-08 2004-07-29 アイオワ ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション,インコーポレーティッド 新規なprkag3対立遺伝子並びに生殖性及び肉質の形質の遺伝標識としてのその使用
EP1476464A1 (en) 2002-02-01 2004-11-17 Arexis AB Variants of the alpha 1 subunit of human ampk
WO2003064465A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Arexis Ab Prkag3 gene promoter and uses thereof
DK1476012T3 (da) 2002-02-01 2010-05-31 Arexis Ab Transgene mus, der udtrykker PRKAG3

Also Published As

Publication number Publication date
CA2384313C (en) 2010-10-19
ES2239618T3 (es) 2005-10-01
JP3983051B2 (ja) 2007-09-26
US7462693B2 (en) 2008-12-09
DK1210441T3 (da) 2005-07-04
CN100439503C (zh) 2008-12-03
EP1210441B1 (en) 2005-04-13
DE60019433D1 (de) 2005-05-19
US20070199081A1 (en) 2007-08-23
DE60019433T2 (de) 2006-02-23
PL354753A1 (en) 2004-02-23
CA2384313A1 (en) 2001-03-22
BR0013890A (pt) 2002-05-07
CN1402787A (zh) 2003-03-12
ATE293167T1 (de) 2005-04-15
EP1210441A2 (en) 2002-06-05
AU7786400A (en) 2001-04-17
AU781744B2 (en) 2005-06-09
WO2001020003A3 (en) 2001-05-17
KR100806954B1 (ko) 2008-02-22
WO2001020003A2 (en) 2001-03-22
KR20020062918A (ko) 2002-07-31
JP2007190021A (ja) 2007-08-02
DE00967845T1 (de) 2004-07-08
MXPA02002613A (es) 2003-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7462693B2 (en) Variants of the Gamma Chain of AMPX, DNA sequences encoding the same, and uses thereof
Csóka et al. Expression analysis of six paralogous human hyaluronidase genes clustered on chromosomes 3p21 and 7q31
US20100261173A1 (en) Identification Of Fat And Lean Phenotypes In Chickens Using Molecular Markers
US20090246778A1 (en) Identification of fat and lean phenotypes in chickens using molecular markers
KR20200024772A (ko) B4galt1 변이체 및 이의 용도
CA2388363C (en) Dna polymerase lambda and uses thereof
Janzen et al. ARPP-16 mRNA is up-regulated in the longissimus muscle of pigs possessing an elevated growth rate
EP1165603B1 (en) Human neurogenin 3-encoding nucleotide sequences
Larsen et al. Characterization of the porcine FBX07 gene: the first step towards generation of a pig model for Parkinsonian pyramidal syndrome
EP2275118A2 (en) Pancreas-specific proteins
US7166704B2 (en) Antibodies immunologically specific for PD2, a protein that is amplified and overexpressed in pancreatic cancer
CA2319037A1 (en) Identification of factors which mediate the interaction of heterotrimeric g proteins and monomeric g proteins
CN100352842C (zh) 对促肾上腺皮质激素释放激素刺激的应答而表达增加的基因
US20050222070A1 (en) Pancreas-specific proteins
US6703220B1 (en) Human neurogenin 3-encoding nucleotide sequences
US20040242468A1 (en) Gene involved in mineral deposition and uses thereof
Zhang et al. Association of polymorphism of IGF-II gene with growth traits in Nanyang cattle
US6100058A (en) Gap12 genes and their uses
Choi et al. Porcine LMNA is a positional candidate gene associated with growth and fat deposition
JP2000509986A (ja) ホスファチジルイノシトール3―キナーゼのp85αサブユニットをコードする突然変異体cDNA
US20030166881A1 (en) Novel genes associated with allergic hypersensitivity and mast cell activation
WO2000012719A1 (en) Cdc2-related kinase associated with acute leukemia

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20040311

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20040311

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060530

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060817

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20060817

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20061114

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070126

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070320

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070328

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20070626

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20070703

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100713

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100713

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110713

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110713

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120713

Year of fee payment: 5

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees