DE60019433T2

DE60019433T2 - Ampk-gamma variante, dafür kodierende dna sequenzen, und deren verwendung

Info

Publication number: DE60019433T2
Application number: DE60019433T
Authority: DE
Inventors: Leif Andersson; Christian Looft; Ernst Kalm; Denis Milan; Annie Robic; Claire Rogel-Gaillard; Nathalie Iannuccelli; Joel Gellin; Pascale Le Roy; Patrick Chardon
Original assignee: Arexis AB
Current assignee: Arexis AB
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2020-09-12
Also published as: JP2007190021A; WO2001020003A3; JP3983051B2; BR0013890A; CN1402787A; US20070199081A1; DK1210441T3; ES2239618T3; CA2384313A1; KR20020062918A; EP1210441B1; DE60019433D1; ATE293167T1; CN100439503C; AU7786400A; PL354753A1; AU781744B2; JP2003509052A; US7462693B2; EP1210441A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Varianten der γ-Kette von AMP-aktivierter Proteinkinase (AMPK), Gene, die diese Varianten codieren, und Verwendungen davon.
AMPK spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des Energiestoffwechsels in der eukaryontischen Zelle (HARDIE et al., Annu. Rev. Biochem., 67, 821–855, 1998; KEMP et al., TIBS, 24, 22–25, 1999). Säuger-AMPK ist ein heterotrimerer Komplex, der eine katalytische α-Untereinheit und zwei nichtkatalytische β- und γ-Untereinheiten umfasst, die die Aktivität der α-Untereinheit regulieren. Das Hefehomologe (als SNF1 bezeichnet) dieses Enzymkomplexes ist gut charakterisiert; es umfasst eine katalytische Kette (Snf1), die der α-Untereinheit bei Säugern entspricht, und regulatorische Untereinheiten: Sip1, Sip2 und Gal83 entsprechen der β-Untereinheit von Säugern, und Snf4 entspricht der γ-Untereinheit von Säugern. Sequenzdaten zeigen, dass AMPK-Homologe auch in Caenorhabditis elegans und Drosophila existieren.
Es wurde beobachtet, dass Mutationen in Hefe-SNF1 und -SNF4 zu Defekten bei der Transkription von glucosereprimierten Genen, bei der Sporulierung, bei der Hitzetoleranz, bei der Peroxisomenbiogenese und bei der Glykogenspeicherung führen.
Für Säugerzellen wurde vorgeschlagen, dass AMPK als "Treibstoffanzeige" fungiert. Sie wird durch einen Anstieg im AMP:ATP-Verhältnis aktiviert, die von zellulären Stressmomenten wie Hitzeschock und Glucose- und ATP-Mangel herrührt. Aktivierte AMPK schaltet ATP-produzierende Stoffwechselwege ein (z. B. Fettsäureoxidation) und hemmt ATP-verbrauchende Stoffwechselwege (z. B. Fettsäure- und Cholesterinsynthese), und zwar durch Phosphorylierung der Enzyme Acetyl-CoA-Carboxylase und Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA)-Reduktase. Es wure auch beschrieben, dass sie durch Phosphorylierung in vitro Glykogensynthase, das regulatorische Schlüsselenzym der Glykogensynthese, inaktiviert (HARDIE et al., 1998, supra); es blieb jedoch unklar, ob Glykogensynthase auch in vivo ein physiologisches Ziel von AMPK ist.
In Säugern liegen mehrere Isoformen der drei verschiedenen AMPK-Untereinheiten vor. Bei Menschen codieren PRKAA1 auf dem menschlichen Chromosom (HSA) 5p12 und PRKAA2 auf HSA1p31 die Isoformen α1 bzw. α2 der α-Untereinheit, PRKAB1 auf HSA12q24.1 und PRKAB2 (noch nicht kartiert) codieren die Isoformen β1 bzw. β2 der β-Untereinheit, und PRKAG1 auf HSA12q13.1 und PRKAG2 auf HSA7q35-q36 codieren die Isoformen γ1 bzw. γ2 der γ-Untereinheit (OMIM-Datenbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/, Juli 1999). HARDIE et al., [1998, supra] erwähnen auch die Existenz einer dritten Isoform (γ3) der γ-Untereinheit von AMPK, geben hierzu aber keine Informationen. Die Analyse der Sequenzen dieser γ-Untereinheiten zeigt, dass sie im Wesentlichen aus vier Cystathion-β-Synthase (CBS)-Domänen bestehen, deren Funktion unbekannt ist. Bislang wurde keine phänotypische Wirkung dokumentiert, die sich aus einer Mutation in irgendeiner der AMPK-Untereinheiten ergibt.
Andererseits wurde beobachtet, dass die meisten Hampshire-Schweine eine hohe intramuskuläre Glykogenkonzentration aufweisen. Bei diesen Schweinen führt Glykogenolyse, die nach dem Schlachten auftritt, zu einer deutlichen Abnahme des pH, was zu saurem Fleisch führt, das eine geringere Wasserkapazität besitzt und eine geringere Ausbeute an gekochtem Schinken liefert.
Der Locus (RN genannt), der mit hohem muskulären Glykogengehalt assoziiert ist, wurde erstmals durch Familiensegregationsanalyse phänotypischer Daten von Hampshire-Schweinen identifiziert (LE ROY et al., Genet. Res., 55, 33–40, 1990). Ein vollkommen dominantes Allel, RN^–, das mit hohem Glykogengehalt korreliert ist, kommt mit großer Häufigkeit in den meisten Hampshire-Populationen vor, während man annimmt, dass Schweine aus anderen Züchtungen für das normale, rezessive rn⁺-Allel homozygot sind. Spätere Studien zeigten, dass RN^–-Träger eine starke Glykogenzunahme (etwa 70 %) im Skelettmuskel, aber nicht in der Leber aufweisen (MONIN et al., in 38^th ICoMST, Clermont-Ferrand, FRANKREICH, 1992).
Der große Unterschied im Glykogengehalt zwischen RN^–- und rn⁺-Schweinen führt zu deutlichen Unterschieden in Fleischqualität und technischer Ausbeute (ENFÄLT et al., J. Anim. Sci., 75, 2924–2935, 1997). Das RN^–-Allel ist daher in der Schweineindustrie von beträchtlicher wirtschaftlicher Bedeutung und die meisten Zuchtunternehmen würden diese dominante Mutation gerne reduzieren oder eliminieren.
Der RN-Phänotyp kann bestimmt werden, indem man das glykolytische Potential in Muskelbiopsien von lebenden Tieren oder nach dem Schlachten bestimmt (MONIN et al., Meat Science, 13, 49–63, 1985). Diese Methode ist jedoch in ihrer Anwendung für praktische Zuchtprogramme stark limitiert. Die Genauigkeit des Tests beträgt nicht 100 %: Da es eine gewisse Überlappung bei der phänotypischen Verteilung von RN^– und rn⁺ gibt, kann der Test nicht zwischen RN^–/RN^–-Homozygoten und RN^–/rn⁺-Heterozygoten unterscheiden. Außerdem ist die Probennahme von Muskelbiopsien an lebenden Tieren invasiv und kostspielig.
Es besteht daher ein starker Bedarf an der Entwicklung eines einfachen diagnostischen DNA-Tests für den RN-Locus. Außerdem impliziert die dramatische phänotypische Wirkung des RN-Gens bei Schweinen, dass dieses Gen eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Kohlenhydratstoffwechsels im Skelettmuskel bei anderen Vertebraten, insbesondere Säugern, spielt.
Skelettmuskel und Leber sind die beiden Hauptspeicher für Glykogen in Säugern, und die Beobachtung von erhöhtem Muskelglykogen bei normalem Leberglykogen lässt vermuten, dass der RN^–-Phänotyp auf eine Mutation in einem im Muskel, aber nicht in der Leber exprimierten Gen zurückzuführen sein könnte. Die Erfinder haben bereits früher beschrieben, dass das RN-Gen auf Schweinechromosom 15 lokalisiert ist (MILAN et al., Mamm. Genome, 7, 47–51, 1996 NIARIANI et al., Mamm. Genome, 7, 52–54, 1996, LOOFT et al., Genetics Selection Evolution, 28, 437–442, 1996). Sie haben nun entdeckt, dass das RN^–-Allel mit einer nichtkonservativen Mutation in einem Gen assoziiert ist, das eine neue muskelspezifische Isoform der γ-Kette von AMP-aktivierter Proteinkinase (AMPK) codiert.
Die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung basieren auf der Entdeckung und Charakterisierung dieser Mutation und der Identifizierung und Isolierung des mutierten Gens.
Gemäß der Erfindung wird gezeigt, dass eine Mutation in einer γ-Kette von AMPK zu einer veränderten Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels führt, was zeigt, dass AMPK eine wesentliche Komponente dieses Stoffwechsels ist. Ferner wird eine Nucleinsäuresequenz bereitgestellt, die eine muskelspezifische Isoform der γ-Kette von AMPK codiert. Auf diese Weise werden Mittel bereitgestellt, um den Kohlenhydratstoffwechsel zu regulieren, insbesondere um potentielle oder tatsächliche Fehlfunktionen der Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels, insbesondere im Skelettmuskel, nachzuweisen und/oder zu korrigieren.
Die Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 70 % Identität oder wenigstens 85 % Ähnlichkeit, vorzugsweise 80 % Identität oder wenigstens 90 % Ähnlichkeit, besonders bevorzugt wenigstens 90 % Identität oder wenigstens 95 % Ähnlichkeit, und ganz besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität oder wenigstens 99 % Ähnlichkeit mit dem Polypeptid SEQ ID NO: 2 aufweist. Die Erfindung stellt ferner eine isolierte Nucleinsäuresequenz bereit, die für das Polypeptid codiert, sowie den Komplementärstrang dieser Nucleinsäuresequenz.
Dieses Polypeptid stellt eine neue muskelspezifische Isoform der γ-Kette von AMPK dar und wird nachfolgend auch als Prkag3 bezeichnet; das Gen, das dieses Polypeptid codiert, wird nachfolgend auch als PRKAG3 bezeichnet.
"Identität" einer Sequenz mit einer Vergleichssequenz bezieht sich auf den Prozentsatz der Reste, die gleich sind, wenn die beiden Sequenzen so abgeglichen ("aligned") sind, dass zwischen den Positionen der Reste maximale Übereinstimmung besteht. Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die wenigstens X % Identität mit einer Vergleichssequenz aufweist, wird hier als ein Polypeptid definiert, dessen Sequenz bis zu 100-X Aminosäureänderungen pro jeweils 100 Aminosäuren der Vergleichsaminosäuresequenz beinhalten kann. Aminosäureänderungen umfassen Deletionen, Substitutionen oder Insertionen aufeinanderfolgender oder verstreuter Aminosäurereste in der Vergleichssequenz.
"Ähnlichkeit" einer Sequenz mit einer Vergleichssequenz bezieht sich auf den Prozentsatz der Reste, die gleich sind oder sich nur durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wenn die beiden Sequenzen so abgeglichen sind, dass zwischen den Positionen der Reste maximale Übereinstimmung besteht. Eine konservative Aminosäuresubstitution wird als die Substitution eines Aminosäurerests gegen einen anderen Aminosäurerest mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z. B. Größe, Ladung oder Polarität) definiert, die die funktionellen Eigenschaften des Proteins im Allgemeinen nicht ändert. Ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die wenistens X % Ähnlichkeit mit einer Vergleichssequenz aufweist, wird hier als ein Polypeptid definiert, dessen Sequenz bis zu (100-X) nichtkonservative Aminosäureänderungen pro jeweils 100 Aminosäuren der Vergleichsaminosäuresequenz beinhalten kann. Nichtkonservative Aminosäureänderungen umfassen Deletionen, Insertionen oder nichtkonservative Substitutionen aufeinanderfolgender oder verstreuter Aminosäurereste in der Vergleichssequenz.
Zum Beispiel:

– Bei einer Suche in der Datenbank "GenBank nr" mit BLASTp (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389–3402, 1997) mit Default-Einstellungen und der gesamten Sequenz SEQ ID NO: 2 als Anfrage wurden die höheren Prozent an Identität oder Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 2 gefunden für:
– γ1-Untereinheit von humaner AMPK: 65 % Identität oder 82 % Ähnlichkeit (Score: 399);
– γ1-Untereinheit von Ratten-AMPK: 65 % Identität oder 82 % Ähnlichkeit (Score: 399);
– γ1-Untereinheit von muriner AMPK: 64 % Identität oder 80 % Ähnlichkeit (Score: 390);
– γ1-Untereinheit von Drosophila-AMPK: 53 % Identität oder 75 % Ähnlichkeit (Score: 332);
– Hefe-Snf4: 33 % Identität oder 56 % Ähnlichkeit (Score: 173).

Polypeptide der Erfindung beinhalten beispielsweise jedes Polypeptid (sei es natürlich, synthetisch, halbsynthetisch oder rekombinant) aus irgendeiner Vertebratenspezies ein, insbesondere aus Vögeln, wie Geflügel, oder Säugern, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Maus, Pferd und Mensch, umfassend die oder bestehend aus der Aminosäuresequenz von entweder:

– einem funktionellen Prkag3; oder
– einer funktionell veränderten Mutante von Prkag3.

"Funktionell" bezieht sich auf ein Protein mit normaler biologischer Aktivität. Ein solches Protein kann stille Mutationen umfassen, die keine wesentliche Änderung in seiner Aktivität induzieren und keine merklichen phänotypischen Wirkungen zeigen. Nichteinschränkende Beispiele für funktionelles Prkag3 sind:

– ein porcines Prkag3, das wenigstens die Sequenz umfasst, die in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 2 dargestellt ist;
– ein humanes Prkag3, das wenigstens die Sequenz umfasst, die in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 4 dargestellt ist.

Splice-Varianten von Prkag3 sind hier ebenfalls offenbart: Beispielsweise stellen die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 27 und die entsprechende Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 28 auf der einen Seite und die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 31 und die entsprechende Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 32 auf der anderen Seite zwei unterschiedliche Splice-Varianten von porcinem Prkag3 dar.
Eine "funktionell veränderte Mutante" eines Proteins umfasst ein oder mehrere Mutationen, die eine Änderung in seiner Aktivität induzieren.
Solche Mutationen beinhalten insbesondere Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in einer Domäne, die für die biologische Aktivität dieses Proteins wesentlich ist. Sie können beispielsweise zu einem partiellen oder vollständigen Aktivitätsverlust oder umgekehrt zu einer Aktivitätszunahme oder zu einer Beeinträchtigung der Antwort auf regulatorische Effektoren führen. Deletionen, Insertionen oder nichtkonservative Substitutionen führen mit höherer Wahrscheinlichkeit zu einer kritischen Wirkung auf die biologische Aktivität; auch konservative Substitutionen können jedoch eine deutliche Wirkung induzieren, wenn sie an einer wichtigen Stelle eines aktiven Zentrums des Proteins erfolgen.
Nichteinschränkende Beispiele für funktionell veränderte Mutanten von Prkag3 sind:

– die R41Q-Variante, die aus der nichtkonservativen Substitution eines Argininrests an Position 41 von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 durch einen Glutaminrest resultiert (diese Substitution führt zu einer bedeutsamen Zunahme des Glykogengehalts, wodurch ein erhöhtes glykolytisches Potential des Skelettmuskels induziert wird);
– die V401-Variante, die aus der Substitution eines Valinrests an Position 40 von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 durch einen Isoleucinrest resultiert (diese Substitution führt zu einer Abnahme des Glykogengehalts und damit des glykolytischen Potentials des Skelettmuskels).

Diese Substitutionen treten innerhalb eines Teils der ersten CBS-Domäne auf, die zwischen Prkag3 und den bereits bekannten Isoformen der γ-Untereinheit von AMPK stark konserviert ist.
Die Nummern der Reste für Prkag3 beziehen sich auf die Aminosäurenummerierung von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4. Das Alignment von humanen und porcinen Prkag3-Sequenzen mit bereits bekannten γ1- und γ2-Isoformen ist in 3 gezeigt.
Die Erfindung stellt ferner eine funktionell veränderte Mutante einer γ-Untereinheit von AMPK bereit, wobei diese Mutante wenigstens eine Mutation aufweist, die für diese funktionelle Veränderung verantwortlich ist und innerhalb der ersten CBS-Domäne und vorzugsweise innerhalb der Region von dieser lokalisiert ist, die mit der Region abgeglichen ist, die Rest 30 bis Rest 50 von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 umspannt. Diese Mutation kann aus der Insertion, Deletion und/oder Substitution einer Aminosäure oder mehrerer Aminosäuren, benachbart oder nicht benachbart, resultieren. Beson ders bevorzugt ist die Mutation innerhalb der Region lokalisiert, die mit der Region abgeglichen ist, die Rest 35 bis Rest 45 von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 umspannt, beispielsweise innerhalb der Region, die Rest 65 bis Rest 75 der γ1-Isoform umspannt.
Entsprechend einer besonderen Ausführungsform ist diese Mutation eine nichtkonservative Substitution, vorzugsweise eine R→Q-Substitution. Entsprechend einer anderen besonderen Ausführungsform ist diese Mutation eine konservative Substitution, vorzugsweise eine V→I-Substitution.
Vorzugsweise ist die Mutation bei einem Rest lokalisiert, der Rest 41 von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 entspricht, beispielsweise im Fall der γ1-Isoform bei Rest 70, oder bei einem Rest, der Rest 40 von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 entspricht, beispielsweise im Fall der γ1-Isoform bei Rest 69.
Die Erfindung stellt ferner eine heterotrimere AMPK bereit, wobei die γ-Untereinheit aus einem Polypeptid der Erfindung besteht.
Die Erfindung stellt ferner isolierte Nucleinsäuresequenzen bereit, die irgendeines der oben definierten funktionellen oder funktionell veränderten Prkag3 oder funktionell veränderte Mutanten einer γ-Untereinheit von AMPK codieren, und Nucleinsäuresequenzen, die zu irgendeiner dieser Nucleinsäuresequenzen komplementär sind.
Dies beinhaltet insbesondere jede isolierte Nucleinsäure mit der Sequenz irgendeiner der natürlich vorkommenden Allele eines PRKAG3-Gens, sowie jede isolierte Nucleinsäure mit der Sequenz einer künstlichen Mutante eines PRKAG3-Gens.
Dies beinhaltet auch jede isolierte Nucleinsäure mit der Sequenz einer natürlichen oder künstlichen Mutante eines PRKAG1- oder eines PRKAG2-Gens, wobei diese Mutante eine wie oben definierte funktionell veränderte γ1- oder y2-Untereinheit von AMPK codiert.
Nucleinsäuren der Erfindung können nach den allgemein bekannten Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie und/oder chemischen DNA-Synthese erhalten werden. Diese Verfahren ermöglichen es ferner, die gewünschten Mutationen in eine natürlich vorkommende DNA-Sequenz einzuführen.
Beispiele für Nucleinsäuren, die natürlich vorkommende Allele eines PRKAG3-Gens codieren, sind durch SEQ ID NO: 1 dargestellt, die ein natürlich vorkommendes Allel des Porcingens codiert, und durch SEQ ID NO: 3, die ein natürlich vorkommendes Allel des humanen Gens codiert. Diese Sequenzen können verwendet werden, um Sonden zu generieren, die die Isolierung von PRKAG3 aus anderen Spezies oder von anderen Allelformen von PRKAG3 aus der gleichen Spezies erlauben, indem man eine Genbank von genomischer DNA oder von cDNA screent.
Die Erfindung umfasst ferner genomische DNA-Sequenzen aus beliebigen Vertebratenspezies, insbesondere aus Vögeln, wie Geflügel, oder Säugern, einschließlich insbesondere Rind, Schaf, Schwein, Maus, Pferd und Mensch, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, vorzugsweise ein PRKAG3-Gen, und bis zu 500 kb, vorzugsweise bis zu 100 kb einer 3'- und/oder 5'-benachbarten genomischen Sequenz.
Solche genomischen DNA-Sequenzen können nach dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Verlängerung einer Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, wobei Verfahren wie Restriktionsstellen-PCR (SARKAR et al., PCR Methods Applic., 2, 318–322, 1993), inverse PCR (TRIGLIA et al., Nucleic Acids Res., 16, 8186, 1988) mit divergenten Primern auf Basis einer für Prkag3 codierenden Region, Capture-PCR (LAGERSTROM et al., PCR Methods Applic., 1, 111–119, 1991) oder dergleichen zum Einsatz kommen.
Die Erfindung umfasst ferner spezifische Fragmente einer Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, oder einer genomischen DNA-Sequenz der Erfindung sowie Nucleinsäurefragmente, die spezifisch damit hybridisieren. Vorzugsweise sind diese Fragmente wenigstens 15 bp lang, besonders bevorzugt wenigstens 20 bp lang.
"Spezifische Fragmente" bezieht sich sich auf Nucleinsäurefragmente mit einer Sequenz, die sich nur in den Nucleinsäuresequenzen findet, die ein Polypeptid der Erfindung codieren, und die sich nicht in Nucleinsäuresequenzen findet, die verwandte Polypeptide des Standes der Technik codieren. Dies schließt die Nucleinsäurefragmente aus, die aus einer Sequenz bestehen, die mit einem der bekannten PRKAG1- oder PRKAG2-Gene geteilt wird.
"Spezifisch hybridisierende Fragmente" bezieht sich auf Nucleinsäurefragmente, die unter stringenten Bedingungen nur mit Nucleinsäuresequenzen hybridisieren können, die ein Polypeptid der Erfindung codieren, ohne dabei mit Nucleinsäuresequenzen zu hybridisieren, die verwandte Polypeptide des Standes der Technik codieren. Dies schließt die Nucleinsäurefragmente aus, die aus dem zu einer Sequenz komplementären Strang bestehen, die mit einem der bekannten PRKAG1- oder PRKAG2-Gene geteilt wird.
Nucleinsäuren oder Nucleinsäurefragmente, die aus der EST GENBANK AA178898 oder der EST GENBANK W94830 oder den dazu komplementären Strängen bestehen, sind ebenfalls ausgenommen.
Diese spezifischen oder spezifisch hybridisierenden Nucleinsäurefragmente können beispielsweise als Primer oder Sonden verwendet werden, um eine Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, nachzuweisen und/oder zu amplifizieren. Die Erfindung umfasst Primersets, die wenigstens einen Primer umfassen, der aus einem wie oben definierten spezifischen oder spezifisch hybridisierenden Nucleinsäurefragment besteht.
Die Erfindung stellt ferner rekombinante Vektoren bereit, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die ein Polypeptid der Erfindung codiert. Vektoren der Erfindung sind vorzugsweise Expressionsvektoren, in denen eine Sequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, unter Kontrolle geeigneter transkriptioneller und translationeller Kontrollelemente gestellt ist. Diese Vektoren können nach den allgemein bekannten Methoden der rekombinanten DNA und des Genetic Engineering erhalten und in eine Wirtszelle eingeschleust werden.
Die Erfindung umfasst ferner eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einem Vektor der Erfindung, vorzugsweise einem Expressionsvektor, transformiert ist.
Ein Polypeptid der Erfindung kann erhalten werden, indem man die Wirtszelle, die einen Expressionsvektor enthält, der eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die das Polypeptid codiert, unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind, und das Polypeptid aus der Wirtszellkultur zurückgewinnt.
Eine heterotrimere AMPK, bei der die γ-Untereinheit aus einem Polypeptid der Erfindung besteht, lässt sich erhalten, indem man, gemeinsam oder getrennt, eine Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, eine Nucleinsäuresequenz, die eine α-Untereinheit codiert, und eine Nucleinsäuresequenz, die eine β-Untereinheit codiert, exprimiert und das Heterotrimer rekonstituiert.
Die so erhaltenen Polypeptide, oder immunogene Fragmente davon, können zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, wobei dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren zum Einsatz kommen. Auf diese Weise können Antikörper erhalten werden, die gegen das gesamte Prkag3-Polypeptid gerichtet sind und irgendeine Variante davon erkennen können. Antikörper, die gegen ein spezifisches Epitop einer bestimmten Variante (funktionell oder nicht) von Prka3 gerichtet sind, oder Antikörper, die gegen ein spezifisches Epitop einer funktionell veränderten Mutante gerichtet sind, die eine Mutation in der ersten CBS-Domäne einer γ-Untereinheit von AMPK aufweist, und die diese Variante oder funktionell veränderte Mutante erkennen können, können ebenfalls erhalten werden.
Wie hier gezeigt, verursachen Mutationen in einer γ-Untereinheit von AMPK und besonders Mutationen in der ersten CBS-Domäne einer γ-Untereinheit von AMPK bei Vertebraten, einschließlich Menschen, wahrscheinlich Störungen im Energiestoffwechsel (z. B. Diabetes, Fettsucht). Ferner verursachen Mutationen in der ersten CBS-Domäne oder anderen Teilen des PRKAG3-Gens wahrscheinlich Störungen im Muskelstoffwechsel, die zu Krankheiten wie Myopathie, Diabetes und kardiovaskulären Erkrankungen führen.
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zum Nachweis und zur Korrektur solcher Störungen bereit.
Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, die die Nucleinsäuresequenzen und/oder Polypeptidsequenzen der Erfindung zur diagnostischen Auswertung, zum genetischen Testen und zur Prognose einer Stoffwechselstörung benutzen.
Beispielsweise stellt die Erfindung Verfahren zum Diagnostizieren von Stoffwechselstörungen bereit, insbesondere Störungen im Kohlenhydratstoffwechsel, und vorzugsweise Störungen, die mit einer veränderten, insbesondere einer übermäßigen Glykogenakkumulation in den Zellen korreliert sind, die aus einer Mutation in einem Gen resultieren, das eine γ-Untereinheit von AMPK codiert, wobei diese Verfahren den Nachweis und/oder die Messung der Expression eines funktionell veränderten PRKAG3-Gens oder einer funktionell veränderten Mutante einer γ-Untereinheit von AMPK mit einer Mutation in der ersten CBS-Domäne in einer von einem Vertebraten erhaltenen Nucleinsäureprobe umfassen, oder den Nachweis einer Mutation im PRKAG3-Gen oder in einer Sequenz, die die erste CBS-Domäne einer γ-Untereinheit von AMPK im Genom eines Vertebraten codiert, von dem man annimmt, dass er eine solche Störung hat.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Störung mit einer veränderten, insbesondere einer übermäßigen Glykogenakkumulation in den Muskelzellen korreliert und resultiert aus der Expression eines funktionell veränderten PRKAG3-Gens.
Die Expression eines funktionell veränderten Prkag3 oder einer funktionell veränderten Mutante einer γ-Untereinheit von AMPK mit einer Mutation in der ersten CBS-Domäne kann entweder mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern nachgewiesen oder gemessen werden, die für die funktionell veränderten Polypeptide der Erfindung, wie sie oben definiert sind, spezifisch sind. Geeignete Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Sie bein halten beispielsweise enzymgekoppelten Immunosorbent-Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).
Die Nucleotidsequenzen der Erfindung können verwendet werden, um Mutationen im PRKAG3-Gen oder in einer Sequenz, die die erste CBS-Domäne einer γ-Untereinheit von AMPK codiert, nachzuweisen, indem man Unterschiede in Gensequenzen oder in benachbarten Sequenzen zwischen normalen Individuen, Trägerindividuen oder beeinträchtigten Individuen nachweist.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer Mutation im PRKAG3-Gen oder in einer die erste CBS-Domäne einer γ-Untereinheit von AMPK codierenden Sequenz bereit, wobei das Verfahren umfasst:

– Prüfen auf Anwesenheit, in einer Nucleinsäureprobe von einem Vertebraten, einer Nucleinsäuresequenz, die ein mutiertes Prkag3 oder eine Mutante einer γ-Untereinheit von AMPK mit einer Mutation in der ersten CBS-Domäne, wie oben definiert, codiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäuresequenz bereitgestellt, die eine Mutation im PRKAG3-Gen oder in einer Sequenz umfasst, die die erste CBS-Domäne einer γ-Untereinheit von AMPK codiert, wobei das Verfahren umfasst:

– In-Kontakt-Bringen einer Nucleinsäureprobe von einem Vertebraten mit einer Nucleinsäuresonde, die aus einer Nucleinsäure der Erfindung erhalten wurde und diese Mutation umspannt, unter Bedingungen für eine spezifische Hybridisierung zwischen der Sonde und der nachzuweisenden mutierten Sequenz;
– Nachweisen des Hybridisierungskomplexes.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren der Erfindung außerdem, vor der Hybridisierung, eine PCR-Amplifikation aus der Nucleinsäureprobe einer Sequenz, die wenigstens den Teil der PRKAG3-Sequenz oder der Sequenz umfasst, die die erste CBS-Domäne der γ-Untereinheit von AMPK codiert, in der die Mutation nachgewiesen werden soll.
Verfahren, die die spezifische Hybridisierung einer Sonde nur mit einer perfekt passenden komplementären Sequenz erlauben und sich für den Nachweis von Punktmutationen eignen, sind dem Fachmann bekannt. Sie beinhalten beispielsweise allelspezifische PCR (GIBBS, Nucleic Acid Res., 17, 2427–2448, 1989), allelspezifisches Oligonucleotidscreening (SAIKI et al., Nature, 324, 163–166, 1986) und dergleichen.
Eine Mutation im PRKAG3-Gen kann auch durch Nachweis polymorpher Marker nachgewiesen werden, die eng an die Mutation gekoppelt sind.
Die Erfindung stellt ferner Mittel zum Identifizieren dieser polymorphen Marker bereit.
Solche polymorphen Marker können beispielsweise erhalten werden, indem man eine genomische DNA-Bank von einem Vertebraten mit einer für das PRKAG3-Gen spezifischen Sonde screent, um Klone zu selektionieren, die wenigstens einen Teil eines PRKAG3-Gens und bis zu 500 kb, vorzugsweise 300 kb, ganz besonders bevorzugt bis zu 100 kb einer 3'- und/oder einer 5'-flankierenden chromosomalen Sequenz umfassen, und einen polymorphen Locus in diesen flankierenden chromosomalen Sequenzen identifiziert. Das oder die Allel(e) eines polymorphen Markers, der mit einem gegebenen mutierten Allel des PRKAG3-Gens assoziiert ist, kann bzw. können auch leicht mit einer genomischen DNA-Bank von einem Individuum identifiziert werden, in der das Vorhandensein des mutierten Allels zuvor durch Hybridisierung mit einer Nucleinsäuresonde der Erfindung nachgewiesen wurde.
Polymorphe Marker beinhalten beispielsweise Single Nucleotide-Polymorphismen (SNP), Mikrosatelliten, Insertions/Deletions-Polymorphismen und Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLP). Diese polymorphen Marker können durch Vergleich von Sequenzen identifiziert werden, die das von verschiedenen Individuen erhaltene PRKAG3-Gen flankieren. Mikrosatelliten können auch durch Hybridisierung mit einer Nucleinsäuresonde identifiziert werden, die für bekannte Mikrosatellitenmotive spezifisch ist.
Sobald ein polymorpher Locus, wie oben offenbart, identifiziert wurde, kann ein DNA-Segment, das den polymorphen Locus umspannt, sequenziert werden und es kann ein Primerset entworfen werden, der die Amplifikation dieses DNA-Segments ermöglicht.
Der Nachweis einer Mutation im PRKAG3-Gen kann erfolgen, indem man ein Segment genomischer DNA von einem Vertebraten, das einen polymorphen Locus umspannt, mittels Polymerasekettenreaktion mit einem Satz Primer amplifiziert, die diesen polymorphen Locus flankieren, und in der amplifizierten DNA das Vorhandensein eines Allels dieses mit dieser Mutation assoziierten polymorphen Markers nachweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Vertebrat ein Säuger, vorzugsweise ein Nutztier und besonders bevorzugt ein Schwein, und die nachzuweisende Mutation führt zu einem funktionell verän derten Prkag3. Der Nachweis dieser Mutation ermöglicht es vorherzusagen, ob es wahrscheinlich ist, dass dieser Säuger oder dessen Nachkommenschaft eine intramuskuläre Glykogenkonzentration aufweist, die über oder unter dem Durchschnitt liegt. Ein Beispiel einer solchen Mutation führt zu einem funktionell veränderten Prkag3 mit einer R41Q-Substitution und hat einen erhöhten Glykogengehalt im Skelettmuskel zur Folge.
Ein weiteres Beispiel einer solchen Mutation führt zu einem funktionell veränderten Prkag3 mit einer V40I-Substitution und hat einen verminderten Glykogengehalt im Skelettmuskel zur Folge. Bei Nutztieren mit einer solchen Mutation ist die Glykogenolyse, die nach dem Schlachten auftritt, von geringerer Bedeutung als bei normalen Tieren, was zu einem höheren pH und zu einer potentiell besseren Fleischqualität führt.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Kits zur Durchführung der Verfahren der Erfindung. Die Kits umfassen einen Behälter, der wenigstens ein spezifisches Fragment einer Nucleinsäuresequenz der Erfindung enthält, oder wenigstens ein Nucleinsäurefragment, das in der Lage ist, spezifisch mit einer Nucleinsäuresequenz der Erfindung zu hybridisieren. Dieses Nucleinsäurefragment kann markiert sein. Sie können in Verbindung mit handelsüblichen Amplifikationskits verwendet werden. Sie können ferner positive oder negative Kontrollreaktionen oder Marker, Molekulargewichtsmarker zur Gelelektrophorese und dergleichen beinhalten.
Andere Kits der Erfindung können Antikörper der Erfindung, die gegebenenfalls markiert sein können, sowie die zum Nachweis einer Antigen-Antikörper-Reaktion geeigneten Reagenzien enthalten. Sie können ferner positive oder negative Kontrollreaktionen oder Marker enthalten.
Die Erfindung stellt ferner Mittel zum Modulieren der Expression von Vertebratengenen bereit, die eine γ-Untereinheit von AMPK codieren, und insbesondere des PRKAG3-Gens und/oder der Synthese oder Aktivität der Produkte dieser Gene.
Ein gereinigtes AMPK-Heterotrimer, das eine Wildtyp-Untereinheit oder eine mutierte Prkag3-Untereinheit oder eine funktionell veränderte mutierte γ-Untereinheit mit einer Mutation in der ersten CBS-Domäne umfasst, kann verwendet werden, um in vitro Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zu screenen, AMPK-Aktivität zu modulieren, oder um eine veränderte AMPK-Aktivität wiederherzustellen. Dies kann beispielsweise erfolgen durch:

– Messen der Bindung der Verbindung an das Heterotrimer, beispielsweise mit Screeningverfahren mit hohem Durchsatz; oder
– Messen von Änderungen in der AMPK-Kinaseaktivität, beispielsweise mit Screeningverfahren mit hohem Durchsatz.

Screeningverfahren mit hohem Durchsatz sind beispielsweise offenbart in "High throughput screening: The Discovery of Bioactive Substances", J.P. DEVLIN (Hrsg.), MARCEL DEKKER Inc., New York (1997).
Die Nucleinsäuren der Erfindung können für therapeutische Zwecke verwendet werden. Beispielsweise können komplementäre Moleküle oder Fragmente davon (Antisense-Oligonucleotide) verwendet werden, um die AMPK-Aktivität zu modulieren, vor allem in Muskelgewebe.
Ferner kann eine Nucleinsäuresequenz, die ein funktionelles Prkag3 codiert, verwendet werden, um eine normale AMPK-Funktion wiederherzustellen.
Transformierte Zellen oder tierische Gewebe, die ein Wildtyp-Prkag3 oder ein mutiertes Prkag3 oder eine wie oben definierte funktionell veränderte Mutante einer γ-Untereinheit von AMPK exprimieren, oder die eine AMPK exprimieren, die dieses mutierte Prkag3 oder diese funktionell veränderte Mutante einer γ-Untereinheit von AMPK umfasst, können als in vitro-Modell verwendet werden, um den Mechanismus der AMPK-Aktivität aufzuklären oder um Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zu screenen, die Expression von AMPK zu modulieren.
Das Screening kann dadurch erfolgen, dass man die zu testende Verbindung dem Kulturmedium solcher Zellen oder solcher Gewebe zugibt und Änderungen im Energiestoffwechsel dieser Zellen oder dieser Gewebe misst, wobei Verfahren verwendet werden wie Messung von Glucosekonzentrationen (Spiegel), Glucoseaufnahme oder Änderungen des ATP/AMP-Verhältnisses, des Glykogengehalts oder des Lipid/Proteingehalts.
Die Erfindung stellt nichthumane Lebewesen bereit, die mit einer Nucleinsäuresequenz der Erfindung transformiert sind.
In einer Ausführungsform sind diese Tiere transgene Tiere, die wenigstens ein Transgen besitzen, das eine Nucleinsäure der Erfindung umfasst. In einer weiteren Ausführungsform sind diese Tiere Knockout-Tiere.
"Knockout-Tiere" bezieht sich auf Tiere, deren native und endogene PRKAG3-Allele inaktiviert wurden und die selbst kein funktionelles Prkag3 produzieren.
Angesichts der Offenbarung der Erfindung von DNA-Sequenzen, die ein Wildtyp-Prkag3 oder ein mutiertes Prkag3 oder eine funktionell veränderte Mutante einer γ-Untereinheit von AMPK codieren, lassen sich transgene Tiere sowie Knockout-Tiere nach dem Fachmann bekannten Methoden produzieren, beispielsweise mittels homologer Rekombination in vivo.
Geeignete Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren oder Knockout-Tieren sind beispielsweise offenbart in: Manipulating the Mouse Embryo, 2. Aufl., HOGAN et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; Transgenic Animal Technology, herausgegeben von C. PINKERT, Academic Press Inc., 1994; Gene Targeting: A Practical Approach, herausgegeben von A.L. JOYNER, Oxford University Press, 1995; Strategies in Transgenic Animal Science, herausgegeben von G.M. MONASTERSKY und J.M. ROBL, ASM Press, 1995; Mouse Genetics: Concepts and Applications, von Lee M. SILVER, Oxford University Press, 1995.
Diese nichthumanen Lebewesen können als Modelle für Stoffwechselerkrankungen und -störungen verwendet werden, insbesondere für Erkrankungen und Störungen des Glykogenstoffwechsels im Muskel. Beispielsweise können sie verwendet werden, um Testmoleküle zu screenen. Transgene Tiere der Erfindung können somit verwendet werden, um Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zu screenen, die AMPK-Aktivität zu modulieren. Knockout-Tiere der Erfindung können insbesondere verwendet werden, um Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zu screenen, den Energiestoffwechsel, insbesondere den Kohlenhydratstoffwechsel, in Abwesenheit von funktionellem Prkag3 zu modulieren.
Das Screening kann erfolgen, indem man dem Tier die zu testende Verbindung verabreicht und Änderungen im Energiestoffwechsel bei diesem Tier misst, wobei man Verfahren wie Glucosetoleranztests, Messung von Insulinspiegeln im Blut, Veränderungen des ATP/AMP-Verhältnisses, des Glykogen- oder Lipid/Proteingehalts in Gewebe und Zellen verwendet.
Transgene Nutztiere oder Knockout-Nutztiere mit modifizierten Fleischeigenschaften oder modifiziertem Energiestoffwechsel können ebenfalls erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgende ergänzende Beschreibung weiter erläutert, die sich auf Beispiele zum Erhalt und zur Verwendung von Nucleinsäuren der Erfindung bezieht. Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele lediglich der Veranschaulichung der Erfindung dienen und diese in keiner Weise beschränken.
BEISPIEL 1: ISOLIERUNG DES PRKAG3-Gens
Wir haben eine porcine Bacterial Artificial Chromosome (BAC)-Genbank (ROGEL-GAILLARD et al., Cytogenet and Cell Genet, 851, 273–278, 1999) gescreent und ein Contig aus überlappenden BAC-Klonen über den Bereich von Schweinechromosom 15 konstruiert, das das RN-Gen trägt. Diese BAC-Klone wurden wiederum verwendet, um neue genetische Marker in Form von Single Nucleotid-Polyporphismen (SNPs) oder Mikrosatelliten (MS) zu entwickeln.
Die neuen Marker wurden zusammen mit einigen früher beschriebenen Markern verwendet, um eine hochauflösende Kopplungskarte zu erstellen. Alle diese Marker sind in Tabelle 1 aufgeführt. Standard-Kopplungsanalyse mit Abstammungsdaten, die etwa 1000 informative Meiosen zur Segregation am RN-Locus umfassten, ermöglichten es, RN von der Region proximal zu MS479L3 und distal zum Mikrosatelliten Sw936 auszuschließen. Kopplungsungleichgewichtsanalyse (Linkage Disequilibrium, LD) erfolgte mit den gleichen Markern und einer statistischen Probe von 68 Zuchtebern aus der Swedish Hampshire-Population, die durch Messung des Glykogengehalts im Muskel hinsichtlich des RN-Phänotyps eingeteilt wurden. Die Ergebnisse der LD-Analyse mit dem DISMULT-Programm (TERWILLIGER, Am. J. Hum. Genet., 56, 777–787, 1995) sind in 1 gezeigt. Sie zeigen einen scharfen LD-Peak um die Marker MS127B1 und SNP127G63 herum. Diese Marker schienen ein vollständiges Kopplungsungleichgewicht mit dem RN^–-Allel zu zeigen, d. h. RN^– war mit einem einzigen Allel an diesen beiden Loci assoziiert. Die einfachste Interpretation dieser Beobachtung ist, dass die RN^–-Mutation auf einem Chromosom entstand, das diese Allele trug, und dass diese beiden Marker so eng an den RN-Locus gekoppelt sind, dass die Rekombinationsfrequenz nahezu 0 % ist. Die beiden Marker befinden sich beide auf den überlappenden BAC-Klonen 127G6 und 134C9, was vermuten lässt, dass das RN-Gen auf dem gleichen Klon oder einem der benachbarten Klone liegen könnte.
Es wurde eine Shotgun-Bibliothek des BAC-Klons 127G6 konstruiert und mehr als 1000 Sequenzstücke wurden gesammelt, was etwa 500.000 Basenpaare DNA-Zufallssequenz aus dem Klon ergab. Die Daten wurden analysiert und mit dem PHRED, PHRAP und CONSED-Softwarepaket (University of Washington Genome Center, http://bozeman.mbt.washington.edu) wurden Contigs konstruiert. Die Sequenzdaten wurden mit der Software REPEATMASKER (http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker) für Repeats maskiert, und BLAST-Recherchen erfolgten mit der NCBI-Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Es wurden drei überzeugende Matches mit codierenden Sequenzen erhalten. Zwei davon waren gegen humane cDNA-Sequenzen/Gene, wobei KIAA0173 als ähnlich der Schweinetubulin-Tyrosinligase beschrieben war und auf HSA2q lokalisiert war (UniGene cluster Hs.169910, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) und CYP27A1 auf HSA2q33-ter lokalisiert war (UniGene cluster Hs.82568). Die Ergebnisse lassen stark vermuten, dass die codierenden Sequenzen des Schweins zu diesen humanen Genen ortholog sind, da es allgemein bewiesen ist, dass die RN-Region zu HSA2q33-36 homolog ist (ROBIC et al., Mamm. Genome, 10, 565–568, 1999). Keine dieser Sequenzen schien jedoch ein plausibles Kandidatengen für RN zu sein. Die dritte in BAC 127G6 identifizierte codierende Sequenz zeigte eine hochsignifikante Sequenzähnlichkeit zu verschiedenen γ-Sequenzen von AMP-aktivierten Proteinkinasen, einschließlich der SNF4-Sequenz von Hefe. Die cDNA-Sequenz dieses Gens wurde durch RT-PCR und RACE-Analyse mittels Muskel-mRNA aus einer rn⁺/rn⁺-Homozygote bestimmt. Diese Sequenz ist in 2 und in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 1 gezeigt.
Legende zu 2:
5'-UTR: 5'-nichttranslatierte Region
3'-UTR: 3'-nichttranslatierte Region
CDS: codierende Sequenz
***: Stopcodon
'-': Identität mit Mastersequenz
'.': Alignment-Lücke
Der Leserahmen wurde auf Basis der Homologie zu anderen Mitgliedern der Proteinfamilie und unter der Annahme bestimmt, dass das erste Methionincodon im Rahmen das Startcodon ist. Die auf dieser Basis abgeleitete Polypeptidsequenz ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 2 gezeigt.
Die vollständige Nucleotidsequenz der Schweine-PRKAG3-cDNA ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 27 gezeigt, und die vollständige Polypeptidsequenz ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 28 und in 3 gezeigt.
3 zeigt einen Aminosäureabgleich mit dem Programm CLUSTAL W (THOMPSON et al., Nucleic Acids Research, 22, 4673–4680, 1994) mit repräsentativen AMPK-γ-Sequenzen in den Nucleotiddatenbanken.
Legende zu 3:
Verwendete Sequenzen:
HumG1: Genbank U42412
MusG1: Genbank AF036535
HumG2: Humanes PRKAG2 (Genbank AJ249976)
PigG3: Schweine-PRKAG3 (diese Untersuchung)
HumG3: Humanes PRKAG3 (diese Untersuchung)
Dros: Drosophila (Genkbank AF094764)
SNF4 (Hefe): Genbank M30470
Sowohl die PRKAG2- als auch die Drosophila-Sequenzen weisen längere aminoterminale Regionen auf, aber sie zeigen keine signifikante Homologie mit der aminoterminalen Region von PRKAG3 und wurden nicht einbezogen.
Abkürzungen:
*: Stopcodon
'-': Identität mit Mastersequenz
'.': Alignment-Lücke
Die vier CBS-Domänen sind überstrichen und die Position der RN^–-Mutation ist durch einen Pfeil angegeben.
Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt die Identitäten (in %) der Aminosäuresequenz (oberhalb der Diagonale) und der Nucleotidsequenz (unterhalb der Diagonale) zwischen den AMPKG/SNF4-Sequenzen von Säuger, Drosophila und Hefe. Im Fall von Schweine-PRKAG3 und humanem PRKAG3 wurden die Identitäten bezogen auf die Teile davon berechnet, die durch SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 3 für die Nucleotidsequenzen und durch SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4 für die Aminosäuresequenzen dargestellt sind.
TABELLE 2
4 zeigt einen mittels Neighbor-Joining vorhergesagten phylogenetischen Baum, der mit Hilfe der PAUP-Software (SWOFFORD, Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods), Sinauer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachusetts, 1998) mit Hefe-SNF4 als Outgroup konstruiert wurde; angegeben ist der Support für die bei einer Bootstrap-Analyse mit 1000 Replikaten erhaltenen Anordnungen der Äste, unten ist der Baummaßstab angegeben. Das Ergebnis zeigte, dass sich das in der RN-Region lokalisierte Schweinegen von den PRKAG1- und PRKAG2-Säuger-Isoformen unter scheidet und höchstwahrscheinlich zu einem humanen Gen ortholog ist, das durch die humane EST-Sequenz AA178898 (GenBank) repräsentiert wird, die aus einer Genbank von Muskel-cDNA stammt. Dieses Gen wird hier als PRKAG3 bezeichnet, da es die dritte Isoform einer AMP-aktivierten Proteinkinase γ von Säugern ist, die bislang charakterisiert wurde.
Die cDNA-Sequenz dieses Gens wurde durch RT-PCR und 5'-RACE-Analyse mit cDNA von humanem Skelettmuskel (Clontech, Palo Alto, CA) bestimmt. Diese Sequenz ist in 2 und im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 3 gezeigt. Die abgeleitete Polypeptidsequenz, die 97 % Identität mit der porcinen Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist (siehe Tabelle 2), ist in 2 und im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 4 gezeigt.
Die vollständige cDNA-Sequenz ist auch in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 29 gezeigt; die abgeleitete Polypeptidsequenz ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 30 und in 3 gezeigt.
Mit dem hochauflösenden humanen TNG Radiation Hybrid Panel: (http://shgc-www.stanford.edu/RH/TNGindex.html) kartierten wir die humanen Homologe von PRKAG3, CYP27A1 und KIAA0173, die alle in dem porcinen BAC127G6 vorliegen. Die drei Gene sind im humanen Genom ebenfalls sehr eng gekoppelt. PRKAG3 wurde in einem Abstand von 33 cR_50.000 von KIAA0173 und von 52 cR_50.000 von CYP27A1 kartiert, mit einem Lod-Score-Support von 6,8 bzw. 4,5.
Die etablierte Rolle von AMPK bei der Regulation des Energiestoffwechsels einschließlich der Glykogenspeicherung und ihre Lokalisation in der Region, die ein maximales Kopplungsungleichgewicht zeigte, machten PRKAG3 zu einem sehr starken Kandidatengen für RN. Dies wurde außerdem durch Hybridisierungsanalyse eines Human Multiple Tissue Northern Blots (CLONTECH, Palo Alto, CA) mit humanem PRKAG1 (IMAGE-Klon 0362755, entsprechend GenBank-Eintrag AA018675), humanem PRKAG2 (IMAGE-Klon 0322735, entsprechend GenBank-Eintrag W15439) und einer porcinen PRKAG3-Sonde bestärkt. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Legende zu 4:
H: Herz, B: Hirn, Pl: Plazenta, L: Lunge, Li: Leber, M: Skelettmuskel, K: Niere, Pa: Pankreas, S: Milz, Th: Thymus, P: Prostata, T: Testis, O: Ovarien, I: Dünndarm, C: Kolon (Schleimhaut), PBL: peripherer Blutleukozyt.
Während die PRKAG1- und PRKAG2-Sonden eine breite Gewebeexpressionsverteilung zeigten, zeigte PRKAG3 eine distinkte muskelspezifische Expression. Dieses Ergebnis wird auch durch die humane EST-Datenbank gestützt, wo multiple ESTs, die PRKAG1 und PRKAG2 darstellen, in verschiedenen cDNA-Genbanken identifiziert wurden, wogegen aus einer Genbank von Muskel-cDNA ein einziger EST (GenBank-Eintrag AA178898) erhalten wurde, der PRKAG3 darstellt. Die muskelspezifische Expression von PRKAG3 und das Fehlen der Expression in der Leber sind vollkommen konsistent mit der phänotypischen Wirkung von RN^–, dass nämlich der Glykogengehalt im Muskel verändert, in der Leber aber normal ist (ESTRADE et al., Comp. Biochem. Physiol. 104B, 321–326, 1993).
PRKAG3-Sequenzen wurden durch RT-PCR-Analyse aus rn⁺/rn⁺- und RN^–/RN^–-Homozygoten bestimmt. Ein Vergleich ergab insgesamt sieben Nucleotidunterschiede zwischen der Sequenz von rn⁺- und RN^–-Tieren, von denen vier nichtsynonyme Substitutionen waren, wie in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt ist. Ein Screening dieser sieben SNPs mit genomischer DNA aus weiteren rn⁺- und RN^–-Schweinen verschiedener Züchtungen ergab fünf verschiedene PRKAG3-Allele, aber nur die R41Q Missense-Substitution war ausschließlich mit RN^– assoziiert. Diese nichtkonservative Substitution tritt in CBS1 auf, die unter den Isotypenformen der γ-Kette von AMPK die am besten konservierte Region ist, und Arginin ist bei diesem Rest (Nummer 70 in Prkag1) bei verschiedenen Isoformen von γ-Sequenzen von Säuger-AMPK sowie in der entsprechenden Drosophila-Sequenz konserviert (3). Auf Basis des Oligonucleotid-Ligationsassays (OLA; LANDEGREN et al., Science, 241, 1077–1080, 1988) wurde ein einfacher diagnostischer DNA-Test für die R41Q-Mutation entwickelt. Screening einer großen Zahl von RN^–- und rn⁺-Tieren aus der Hampshire-Zucht sowie einer großen Zahl von rn+-Tieren von anderen Zuchten zeigte, dass das 41Q-Allel in allen RN^–-Tieren vorhanden war, aber in keinem der rn⁺-Tiere gefunden wurde, wie in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigt ist. Das Fehlen des 41Q-Allels bei anderen Zuchten ist konsistent mit der Annahme, dass das RN^–-Allel seinen Ursprung in der Hampshire-Zucht hat; das Allel wurde noch nicht in reinrassigen Tieren von anderen Züchtungen gefunden. Daraus ist zu schließen, dass die Ergebnisse überzeugende Hinweise liefern, dass PRKAG3 mit dem RN-Gen identisch ist und dass die R41Q-Substitution höchstwahrscheinlich die ursächliche Mutation ist.
TABELLE 4
Ohne an einen bestimmten Mechanismus gebunden sein zu wollen kann als Hypothese unterstellt werden, dass das AMPK-Heterotrimer, das PRKAG3 umfasst, an der Regulation des Glucosetransports in den Skelettmuskel beteiligt ist.
Es wurde kürzlich berichtet, dass eine AMPK-Aktivierung, die durch das AMP-Analoge AICAR oder durch Muskelkontraktion induziert wurde, zu einer erhöhten Glucoseaufnahme im Skelettmuskel führt (BERGERON et al., Am J. Physiol., 276, E938-944, 1999; HAYASHI et al., Diabetes, 47, 1369–1373, 1998). Wenn dies die Funktion des PRKAG3 einschließenden AMPK-Heterotrimers ist, könnte R41Q eine funktionsverbessernde Mutation sein, die ein konstitutiv aktives Holoenzym zur Folge hat, beispielsweise aufgrund des Verlusts eines inaktivierenden allosterischen Zentrums. In diesem Fall spiegelt die verringerte AMPK-Aktivität in RN^–-Tieren wahrscheinlich eine Feedback-Inhibierung als Folge des Hochenergiestatus des Muskels wider. Es ist zu erwarten, dass eine erhöhte Glucoseaufnahme in den Skelettmuskel zu einer Zunahme an Muskelglykogengehalt führt, wie er bei RN^–-Tieren beobachtet wird. Es wurde gezeigt, dass eine Überexpression von Glucosetransporter 4 (GLUT4) in transgenen Mäusen zu erhöhter Glucoseaufnahme und erhöhter Glykogenspeicherung führt (TREADWAY et al., J. Biol. Chem., 269, 29956– 29961, 1994). Dieser Typ von Modell für eine verbesserte Funktion ist mit der Dominanz von RN^– konsistent, da das Vorliegen einer einzigen unregulierten Kopie eine starke Wirkung auf die Enzymaktivität von AMPK hätte.
Auch eine alternative Hypothese für die funktionelle Bedeutung der R41Q-Substitution, die mit dem RN^–-Allel assoziiert ist, ließe sich vorschlagen. Basierend auf der etablierten Rolle des Hefe-SNF1-Enzyms bei der Verwertung von Glykogen und von Säuger-AMPK bei der Inhibierung energieverbrauchender Stoffwechselwege und der Stimulierung energieliefernder Stoffwechselwege ist zu erwarten, dass aktivierte AMPK Glykogensynthese inhibiert und Glykogenabbau stimuliert. Wenn dies die funktionelle Rolle der Isoform(en) ist, die das PRKAG3-Produkt enthalten, wäre die R41Q-Substitution eine Mutation, die zum Funktionsverlust führt, oder eine dominant-negative Mutation, die das AMPK-Heterotrimer in einen inaktiven Zustand einlockt und so die AMP-Aktivierung und den Glykogenabbau inhibiert. In diesen Fällen sollte sich die phänotypische Wirkung durch Haplo-Insuffizienz erklären, da RN^– vollkommen dominant erscheint.
R41Q könnte also eine dominant-negative Mutation sein, aber nur, wenn sie multiple Isoformen beeinträchtigt, da die Hauptaktivität von AMPK im Muskel mit den PRKAG1- und 2-Isoformen assoziiert zu sein scheint ([CHEUNG et al., Biochem. J. 346, 659 (2000)].
Der distinkte Phänotyp der RN^–-Mutation zeigt an, dass PRKAG3 bei der Regulation des Energiestoffwechsels im Skelettmuskel eine Schlüsselrolle spielt. Beispielsweise ist PRKAG3 wahrscheinlich an der Adaption an physische Belastung beteiligt, die mit erhöhten Glykogenspeicherung verbunden ist. Es ist auch denkbar, dass Mutationen, die in PRKAG3 (oder anderen AMPK-Genen) zu einem Funktionsverlust führen, Individuen für nichtinsulinabhängigen Diabetes mellitus prädisponieren und AMPK-Isoformen potentielle Wirkstoffziele zur Behandlung dieser Störung sind.
BEISPIEL 2: NACHWEIS DER R41Q – SUBSTITUTION IN SCHWEINE – PRKAG3
Ein Teil von PRKAG3, der Codon 41 beinhaltete, wurde in 10 μl-Reaktionen amplifiziert, die 100 ng genomische DNA, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 4,0 pmol von jeweils Vorwärtsprimer (AMPKG3F3:5'-GGAGCAAATGTGCAGACAAG-3') und Rückwärtsprimer (AMPKG3R2:5'-CCCACGAAGCTCTGCTTCTT-3'), 10 % DMSO, 1 U Taq DNA-Polymerase und Reaktionspuffer (ADVANCED BIOTECH, London, UK) enthielten. Die Bedingungen für das Thermocycling beinhalteten eine anfängliche Inkubation bei 94 °C für 5 min, gefolgt von 3 Zyklen bei 94 °C (1 min), 57 °C (1 min) und 72 °C (1 min) und und 35 Zyklen von 94 °C (20 sec), 55 °C (30 sec) und 72 °C (30 sec). Die Alleldiskriminierung an Nucleotidposition 122 erfolgte mit dem Oligonucleotid-Ligationsassay (OLA, LANDEGREN et al., Science, 241, 1077–1080, 1988). Die OLA-Methode wurde als ein gelbasierter Assay durchgeführt. Jeweils 10 μl OLA-Reaktion enthielten 0,5 pmol von jeder Sonde SNPRN-A (5'Hex-TGGCCAACGGCGTCCA-3'), SNPRN-G (5'ROX-GGCCAACGGCGTCCG-3') und SNPRN-Common (5'Phosphat-AGCGGCACCTTTGTGAAAAAAAAAA-3'), 1,5 U thermostabile AMPLIGASE und Reaktionspuffer (EPICENTRE TECHNOLOGIES, Madison, WI) und 0,5 μl des AMPKG3F3/AMPKG3R2-PCR-Produkts. Nach einer anfänglichen Inkubation bei 95 °C für 5 min wurde das folgende Thermocyclingprofil 10-mal wiederholt: Denaturierung bei 94 °C (30 sec) und Sonden-Annealing und Ligation bei 55 °C (90 sec). Nach OLA-Cycling wurde 1 μl Produkt bei 94 °C hitzedenaturiert (3 min), auf Eis gekühlt und zur Elektrophorese auf ein 6%iges denaturierendes Polyacrylamidgel auf einem ABI377 DNA-Sequenziergerät (PERKIN ELMER, Foster City, USA) geladen. Die resultierenden Fragmentlängen und die Peakfluoreszenz wurden mit GENESCAN-Software analysiert (PERKIN ELMER, Foster City, USA).
Die OLA-basierte Methode für die R41Q-Mutation wurde verwendet, um den Genotyp von DNA-Proben zu bestimmen, die von 68 Swedish Hamshire-Tieren gesammelt worden waren, die auf Basis des Werts für ihr glykolytisches Potential (GP) entweder als RN^– oder rn⁺ phänotypisiert worden waren. 6 veranschaulicht typische OLA-Ergebnisse von den drei möglichen Genotypen. Alle RN^–-Tiere wurden an Nucleotidposition 122 als homozygot A/A (n=28) oder heterozygot A/G (n=36) klassifiziert, während die rn⁺-Tiere an dieser Position homozygot G/G (n=4) waren.
BEISPIEL 3: VORHERSAGE DES VORLIEGENS DES RN^–-ALLELS UNTER VERWENDUNG EINES ENG GEKOPPELTEN MIKROSATELLITEN, MS127B1
Ein Mikrosatellit 127B1 (MS127B1) wurde aus BAC 127G7 kloniert, der Schweine-PRKAG3 enthielt. Der BAC-Klon wurde mit Sau3AI verdaut und die Restriktionsfragmente in die BamHI-Stelle von pUC18 subkloniert. Probing der resultierende Genbank erfolgte mit einer (CA)15-Oligonucleotidsonde, die mit [γ-32P]-dATP markiert war. Stark hybridisierende Klone wurden sequenziert und es wurden Primer zur PCR-Amplifikation von Mikrosatellitenloci entwickelt. Es wurden 10-μl-PCR-Reaktionen durchgeführt, die 100 ng genomische DNA- 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 9,0 pmol von jeweils Vorwärtsprimer (MS127B1F:5'-Fluorescein-CAAACTCTTCTAGGCGTGT-3') und Rück wärtsprimer (MS127B1R:5'-GTTTCTGGAACTTCCATATGCCATGG-3') und 1 U Taq-DNA-Polymerase und Reaktionspuffer (ADVANCED BIOTECH, London, UK) enthielten. Die Bedingungen für das Thermocycling beinhalteten eine anfängliche Inkubation bei 94 °C für 5 min, gefolgt von 3 Zyklen bei 94 °C (1 min), 57 °C (1 min) und 72 °C (1 min) und 35 Zyklen bei 94 °C (20 sec), 55 °C (30 sec) und 72 °C (30 sec). Die PCR-Produkte (0,3 μl) wurden durch Elektrophorese mit einem 4%igen denaturierenden Polyacrylamidgel auf einem ABI377 DNA-Sequenziergerät (PERKIN ELMER, Foster City, USA) aufgetrennt. Die resultierenden Fragmentlängen wurden mit der GENESCAN- und GENOTYPER-Software analysiert (PERKIN ELMER, Foster City, USA).
Das Verfahren wurde verwendet, um den Genotyp von DNA-Proben zu bestimmen, die von 87 Swedish Hampshire-Tieren gesammelt worden waren, die auf Basis des Werts für ihr glykolytisches Potential (GP) als entweder RN^– oder rn⁺ phänotypisiert worden waren. Allel 108 (bp) zeigte in diesem Material eine vollständige Assoziation mit dem RN^–-Allel, da alle RN^– (RN^–/RN^– oder RN^–/rn⁺)-Tiere für dieses Allel homozygot oder heterozygot waren, während keines der rn⁺ (rn⁺/rn⁺)-Tiere dieses Allel trug, wie in der nachfolgenden Tabelle 5 gezeigt ist.
Tabelle 5
BEISPIEL 4: NACHWEIS DES RN^–-ALLELS MIT EINEM PCR-RFLP-TEST
Die RN^–-Mutation inaktiviert eine BsrBI-Stelle GAG^CGG/CTC^GCC (die BsrBI-Restriktionsschnittstelle ist nicht palindromisch). An dieser Stelle ist die RN^–-Sequenz AAGCGG anstelle von GAGCGG.
Ein 134 bp langes Fragment des RN-Gens wird aus porciner genomischer DNA amplifiziert. Das rn⁺-Allel wird nach BsrBI-Verdau durch Nachweis von zwei Fragmenten mit 83 und 51 bp identifiziert.
Der Test wird wie folgt durchgeführt:
1. Primersequenzen:
Primersequenzen, die zur Amplifikation der Region der RN-Mutation verwendet wurden:
RNU: 5' GGGAACGATTCACCCTCAAC 3'
RNL: 5' AGCCCCTCCTCACCCACGAA 3'
Zur internen Kontrolle des Verdaus wurde innerhalb eines 20 bp langen Schwanzes eine BsrBI-Stelle an das Ende eines der beiden Primer angehängt. Der Schwanz erlaubt sowohl die Erzeugung einer BsrBI-Stelle (ein kürzerer Schwanz könnte ausreichen) als auch eine leichte Unterscheidung zwischen ungeschnittenem Fragment und anderen Fragmenten. Die Verwendung von geschwänzten Primern beeinträchtigt die Effizienz und Spezifität der Amplifikation nicht.
Die Sequenz des modifizierten RNL-Primers, der einen Kontrollschwanz mit einer BsrBI-Stelle beinhaltet, ist:
RNLBsrAl4: 5' A₅C₂A₇CCGCTCAGCCCCTCCTCACCCACGAA 3'
2. Eingesetzte PCR-Reaktionsmischung:

50 ng DNA
0,5 Einheiten Taq-Polymerase (GIBCO BRL)
1,5 mM MgCl₂
200 mM dNTP
0,2 μM von jedem Primer
Gesamtes Reaktionsvolumen: 25 μl

3. Verwendete PCR-Bedingungen (auf OMNIGENE HYBAID Thermocycler):
1 × (5 min 95 °C)
35 × (45 sec 57 °C, 45 sec 72 °C, 45 sec 95 °C)
1 × (45 sec 57 °C, 15 min 72 °C)
4. Verdau mit Restriktionsenzym, 2 Stunden bei 37 °C:

10 μl PCR-Produkt
1 × BsrBI BIOLABS-Puffer
5 U BsrBI-Restriktionsenzym (BIOLABS)
Gesamtes Reaktionsvolumen: 15 μl

5. Fragmentgrößen nach PCR mit Primern mit Kontrollschwanz und Verdau mit BsrBI:
Ungeschnittenes Fragment aus RN^–- oder rn⁺-Allel: 154 bp
Nach Verdau von aus RN^–-Allel amplifiziertem Fragment: 137 bp + 17 bp
Nach Verdau von aus rn⁺-Allel amplifiziertem Fragment: 83 bp + 54 bp + 17 bp
Größenunterschiede können entweder nach Polyacrylamid-, Agarose/NUSIEVE- oder Agarosegelelektrophorese identifiziert werden.
BEISPIEL 5: WIRKUNG DES V40I-POLYMORPHISMUS AUF DAS GLYKOLYTISCHE POTENTIAL.
Ferner wurde ein Satz von 181 homozygoten rn⁺/rn⁺-Tieren (R/R an Position 41 von SEQ ID NO: 2) durch PCR-RFLP mit dem Restriktionsenzym FokI auf den V40I-Polymorphismus getestet (bezogen auf Position 40 von SEQ ID NO: 2). Das glykolytische Potential wurde parallel nach der von MONIN et al. (Meat Science, 13, 49–63, 1985) beschriebenen Methode bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 6 gezeigt:
Tabelle 6
Diese Ergebnisse zeigen, dass der V40I-Polymorphismus eine signifikante Wirkung auf das glykolytische Potential im Skelettmuskel hat.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

γ-Untereinheit einer AMP-aktivierten Kinase (AMPK) von Vertebraten, wobei die γ-Untereinheit ein Polypeptid ist, das wenigstens eine Sequenz umfaßt, die wenigstens 70% Identität mit der Polypeptid-SEQ ID NO: 2 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Sequenz umfaßt, die wenigstens 95% Identität mit der Polypeptid-SEQ ID NO: 2 aufweist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Polypeptid die Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 umfaßt.
Polypeptid, welches eine funktionell veränderte Mutante einer γ-Untereinheit einer AMP-aktivierten Kinase von Vertebraten ist, wobei die funktionelle Veränderung aus einer Mutation resultiert, die innerhalb der Region der ersten CBS-Domäne dieser γ-Untereinheit lokalisiert ist, abgeglichen mit der Region eines Polypeptids von SEQ ID NO: 2, die sich von Rest 30 bis Rest 50 erstreckt.
Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die Mutation eine R→Q-Substitution oder eine V→I-Substitution ist.
Polypeptid nach Anspruch 5, ausgewählt aus: – einem Polypeptid mit einer Sequenz, die aus einer R→Q-Substitution an einer Position resultiert, die Position 41 in SEQ ID NO: 2 entspricht; – einem Polypeptid mit einer Sequenz, die aus einer V→I-Substitution an der Position resultiert, die Position 40 von SEQ ID NO: 2 entspricht.
Isolierte Nukleinsäure, ausgewählt aus: a) einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 codiert; b) einer Nukleinsäure, wie sie unter a) definiert ist, welche ferner bis zu 500 kb einer 3'- und/oder 5'-benachbarten genomischen DNA-Sequenz umfaßt; c) dem komplementären Strang einer Nukleinsäure, wie sie unter a) oder b) definiert ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 7, ausgewählt aus: a) einer Nukleinsäure mit irgendeiner der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3; b) dem komplementären Strang einer Nukleinsäure a).
Nukleinsäurefragment, ausgewählt aus: a) einem spezifischen Fragment mit wenigstens 15 bp der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder der hierzu komplementären Sequenz; b) einem Nukleinsäurefragment mit wenigstens 15 bp, das unter stringenten Bedingungen spezifisch mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder der hierzu komplementären Sequenz hybridisiert; mit der Einschränkung, daß das Nukleinsäurefragment nicht aus der EST GENBANK AA178898 oder der EST GENBANK W94830 besteht.
Rekombinanter Vektor, welcher eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis b codiert.
Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 10 transformiert ist.
Nicht-humanes transgenes Lebewesen, welches ein Transgen umfaßt, das für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.
Nicht-humanes Knockout-Lebewesen, bei welchem das Gen, das für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, durch Knockout inaktiviert wurde.
Heterotrimere AMPK, wobei die γ-Untereinheit aus einem Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 besteht.
In vitro-Verfahren zum Nachweis einer Stoffwechselerkrankung, die aus einer Mutation in einem Gen resultiert, das für eine γ-Untereinheit von AMPK codiert, wobei das Verfahren das Prüfen auf Anwesenheit, in einer Nukleinsäureprobe von einem Vertebraten, einer Nukleinsäuresequenz umfaßt, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 codiert, wobei das Polypeptid funktionell verändert ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die funktionelle Veränderung aus einer Mutation resultiert, die innerhalb der Region der ersten CBS-Domäne dieser γ-Untereinheit lokalisiert ist, abgeglichen mit der Region eines Polypeptids von SEQ ID NO: 2, die sich von Rest 30 bis Rest 50 erstreckt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei die Erkrankung mit einer veränderten Glykogenakkumulation in den Muskelzellen korreliert ist und aus der Expression eines funktionell veränderten Allels eines Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 resultiert.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Anwesenheit der Nukleinsäuresequenz, die für das mutierte Polypeptid codiert, geprüft wird, indem die Nukleinsäureprobe mit einer Nukleinsäuresonbe in Kontakt gebracht wird, die aus einer Nukleinsäure nach Anspruch 10 erhalten wurde und diese Mutation umfaßt, unter Bedingungen zur spezifischen Hybridisierung zwischen dieser Sonde und der nachzuweisenden mutierten Sequenz, und Nachweis des Hybridisierungskomplexes.
Verfahren zum Erhalt eines Primerpaars, das den Nachweis eines genetischen polymorphen Markers erlaubt, der mit einer Nukleinsäuresequenz gekoppelt ist, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, wobei das Verfahren umfaßt: – Screenen einer genomischen DNA-Genbank von einem Vertebraten mit einer Sonde, die für eine Nukleinsäuresequenz spezifisch ist, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, um Klone zu selektieren, die wenigstens einen Teil einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, und bis zu 300 kb einer 3'- und/oder 5'-benachbarten chromosomalen Sequenz umfassen; – Identifizieren eines polymorphen Locus in den flankierenden chromosomalen Sequenzen und Sequenzieren eines DNA-Segments, das diesen polymorphen Locus umfaßt; – Konstruieren von Primerpaaren, die den polymorphen Locus flankieren.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 19, wobei der Vertebrat ein Säuger ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Säuger ein Schwein ist.
In vitro-Verfahren zum Nachweis einer Fehlfunktion des Kohlenhydratstoffwechsels, die aus der Expression eines funktionell veränderten Allels eines Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 resultiert, in einem Vertebraten, wobei das Verfahren umfaßt: – Erhalten eines Primerpaars nach dem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21; – In-Kontakt-Bringen einer Probe genomischer DNA von diesem Vertebraten mit dem Primerpaar unter Bedingungen, die eine PCR-Amplifikation erlauben; – Analysieren des PCR-Produkts zum Nachweis, ob ein Allel eines polymorphen Markers, der mit einer Nukleinsäuresequenz gekoppelt ist, die für ein funktionell verändertes Allel eines Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das funktionell veränderte Polypeptid aus einer R41Q-Substitution in SEQ ID NO: 2 resultiert.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das funktionell veränderte Polypeptid aus einer V40I-Substitution in SEQ ID NO: 2 resultiert.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 24, wobei der Vertebrat ein Säuger ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Säuger ein Schwein ist.
In vitro-Verfahren zum Nachweis einer Fehlfunktion des Kohlenhydratstoffwechsels, die aus der Expression eines funktionell veränderten Allels eines Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 resultiert, in einem Vertebraten, wobei das Verfahren umfaßt: – In-Kontakt-Bringen einer Probe genomischer DNA von diesem Vertebraten mit einem Primerpaar, ausgewählt aus: – einem Primerpaar bestehend aus SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18; – einem Primerpaar bestehend aus SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22; unter Bedingungen, die eine PCR-Amplifikation erlauben; – Analysieren des PCR-Produkts zum Nachweis, ob ein Allel eines polymorphen Markers, der mit einer Nukleinsäuresequenz gekoppelt ist, die für ein funktionell verändertes Allel eines Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, vorhanden ist.
Verwendung einer transformierten Zelle nach Anspruch 11 zum Screenen von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit, AMPK-Aktivität zu modulieren.
Verwendung eines nicht-humanen transgenen Lebewesens nach Anspruch 12 zum Screenen von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit, AMPK-Aktivität zu modulieren.
Verwendung eines nicht-humanen Knockout-Lebewesens nach Anspruch 13 zum Screenen von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit, den Energiestoffwechsel in Abwesenheit eines funktionsfähigen Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 zu modulieren.
Verwendung einer heterotrimeren AMPK nach Anspruch 14 zum Screenen von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit, AMPK-Aktivität zu modulieren.
Verwendung eines Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines gegen dieses Polypeptid gerichteten Antikörpers.