ES2239618T3 - Variantes de la cadena gamma del ampk, secuencias de adn que codifican la misma, y usos de esta. - Google Patents
Variantes de la cadena gamma del ampk, secuencias de adn que codifican la misma, y usos de esta.Info
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Abstract
Variantes de la cadena y del AMPK, secuencias de ADN que codifican la misma, y usos de ésta. La presente invención se refiere a nuevas variantes de la cadena y de la proteína kinasa activada con AMPc (AMPK), a genes que codifican dichas variantes y a los usos de éstas. El AMPK tiene un papel clave en la regulación del metabolismo de la energía en la célula eucariótica. El AMPK de mamífero es un complejo heterotrimérico que comprende una subunidad alfa catalítica y dos subunidades beta y gamma no catalíticas que regulan la actividad de la subunidad alfa. El homólogo de levadura (llamado SNF1) de este complejo de enzima está bien caracterizado; comprende una cadena catalítica (Snf1) que corresponde a la subunidad alfa de mamífero, y subunidades reguladoras: Sip1, Sip2 y Gal83 corresponden a la subunidad gamma de mamífero, y Snf4 corresponde a la subunidad gamma de mamífero. Los datos de la secuencia muestran que los homólogos del AMPK existen también en Caenorhabditis elegans y en Drosophila.
Description
Variantes de la cadena \gamma del AMPK,
secuencias de ADN que codifican la misma, y usos de ésta.
La presente invención se refiere a nuevas
variantes de la cadena \gamma de la proteína kinasa activada con
AMPc (AMPK), a genes que codifican dichas variantes y a los usos de
éstas.
El AMPK tiene un papel clave en la regulación del
metabolismo de la energía en la célula eucariótica (HARDIE y col.,
Annu. Rev. Biochem., 67, 821-855,1998; KEMP y col.,
TIBS, 24, 22-25, 1999). El AMPK de mamífero es un
complejo heterotrimérico que comprende una subunidad \alpha
catalítica y dos subunidades \beta y \gamma no catalíticas que
regulan la actividad de la subunidad \alpha. El homólogo de
levadura (llamado SNF1) de este complejo de enzima está bien
caracterizado; comprende una cadena catalítica (Snf1) que
corresponde a la subunidad \alpha de mamífero, y subunidades
reguladoras: Sip1, Sip2 y Gal83 corresponden a la subunidad \beta
de mamífero, y Snf4 corresponde a la subunidad \gamma de
mamífero. Los datos de la secuencia muestran que los homólogos del
AMPK existen también en Caenorhabditis elegans y en
Drosophila.
Se ha observado que las mutaciones en SNF1
y SNF4 de levadura producen defectos en la transcripción de
los genes represores de glucosa, esporulación, termo tolerancia,
biogénesis de peroxisoma, y almacenamiento de glicógeno.
En las células de mamífero, se ha propuesto que
el AMPK actúa como un "galga de combustible". Se activa
mediante un aumento en la proporción AMP:ATP, que deriva de los
estreses celulares como el shock térmico y la reducción de glucosa y
ATP. El AMPK activado activa las rutas productoras de ATP (por
ejemplo, la oxidación de ácidos grasos) e inhibe las rutas de
consumo de ATP (por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos y
colesterol), mediante la fosforilación de las enzimas
acetil-CoA carboxilasa e
hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA)
reductasa. Se ha informado también que inactiva in vitro la
glicógeno sintasa, la enzima reguladora clave de la síntesis de
glicógeno, mediante fosforilación (HARDIE y col., 1998,
supra); sin embargo no está claro si la glicógeno sintasa es
una diana fisiológica del AMPK in vivo.
Varias formas de las tres subunidades diferentes
del AMPK están presentes en mamíferos. En humanos, la PRKAA1
en el cromosoma humano (HSA) 5p12 y la PRKAA2 en
HSA1p31 codifican respectivamente las isoformas \alpha1 y
\alpha2 de la subunidad \alpha, la PRKAB1 en HSA12q24.1 y
la PRKAB2 (todavía sin mapear) codifican respectivamente las
isoformas \beta1 y \beta2 de la subunidad \beta, y
PRKAG1 en HSA12q13.1 y PRKAG2 en
HSA7q35-q36 codifican respectivamente la isoformas
\gamma1 y \gamma2 de la subunidad \gamma (base de datos OMIM,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/, Julio 1999). HARDIE y
col., [1998, supra] también mencionan la existencia de una
tercera isoforma (\gamma3) de la subunidad \gamma del AMPK pero
no proporcionan ninguna información sobre ella. Los análisis de las
secuencias de estas subunidades \gamma muestran que están
compuestas esencialmente de cuatro dominios cistation \beta
sintasas (CBS) cuya función se desconoce. No se ha documentado
todavía ningún efecto fenotípico que derive de una mutación en
ninguna de las subunidades del
AMPK.
AMPK.
Por otro lado, se ha observado que la mayoría de
los cerdos de Hampshire tienen una elevada concentración de
glicógeno intramuscular. En estos cerdos, la glicógenolisis que
tiene lugar después de la matanza conduce a un importante descenso
del pH, dando como resultado carne ácida con una capacidad de
retención de agua reducida y que da una producción reducida de jamón
cocido curado.
El locus (denominado RN) asociado al
elevado contenido muscular de glicógeno se identificó primero
mediante análisis de segregación familiar de datos fenotípicos de
cerdos de Hampshire (LE ROY y col., Genet. Res., 55,
33-40, 1990). Un alelo completamente dominante,
RN^{-}, relacionado con un elevado contenido de glicógeno se da
con elevada frecuencia en la mayoría de las poblaciones de Hampshire
mientras se asume que cerdos de otras razas son homocigóticos para
el alelo recesivo rn^{+}. Estudios posteriores mostraron
que los portadores de RN^{-} tienen un gran aumento
(aproximadamente 70%) de glicógeno en el músculo esquelético pero
no en el hígado (MONIN y col., en 38ª ICoMST, Clemont
Ferrand, FRANCIA, 1992).
La gran diferencia en el contenido de glicógeno
entre cerdos RN^{-} y m^{+} conduce a marcadas
diferencias en la calidad de la carne y en la producción tecnológica
(ENFÄLT y col., J. Anim. Sci., 75, 2924-2935,
1997). El alelo RN^{-} por lo tanto es de importancia
económica considerable en la industria de los cerdos y la mayoría de
las empresas de cría desearían reducir o eliminar esta mutación
dominante.
El fenotipo RN puede determinarse midiendo el
potencial glicolítico en biopsias de músculo de animales vivos, o
después de la matanza (MONIN y col., Meat Science, 13,
49-63, 1985). Sin embargo, este procedimiento tiene
importantes limitaciones para la aplicación en programas de cría
prácticos. La exactitud del ensayo no es del 100%: como hay algún
solapamiento en la distribución fenotípica de RN^{-} y rn+,
el ensayo no es capaz de distinguir homocigotos
RN^{-}/RN^{-} y heterocigotos RN^{-}/rn^{+}.
Adicionalmente, el muestreo de biopsias de músculo en animales vivos
es invasivo y costoso.
Así, existe la fuerte necesidad de desarrollar un
ensayo de ADN diagnóstico sencillo para el locus RN. Además, el
espectacular efecto fenotípico del gen RN en cerdos implica que este
gen tiene un papel importante en la regulación del metabolismo de
los carbohidratos en el músculo esquelético en otros vertebrados, en
particular mamíferos.
El músculo esquelético y el hígado son las dos
reservas principales de glicógeno en mamíferos y la observación de
un aumento de glicógeno muscular mientras que el glicógeno del
hígado es normal sugiere que el fenotipo RN^{-} puede
deberse a una mutación en un gen expresado en el músculo pero no en
el hígado. Los inventores han informado previamente que el gen RN
está situado en el cromosoma 15 de cerdo (MILAN y col., Mamm.
Genome, 7, 47-51, 1996; MARIANI y col., Mamm.
Genome, 7, 52-54, 1996; LOOFT y col.,
Genetics Selection Evolution, 28, 437-442, 1996).
Han descubierto ahora que el alelo RN^{-} se asocia con
una mutación no conservativa en un gen que codifica una nueva
isoforma específica de músculo de la cadena \gamma de la proteína
kinasa activada con AMP (AMPK).
Los diferentes aspectos de la presente invención
se basan en el descubrimiento y la caracterización de esta mutación
y en la identificación y aislamiento del gen mutante.
Según la invención se muestra que una mutación en
una cadena \gamma del AMPK da como resultado una regulación
alterada del metabolismo de los carbohidratos, demostrando que el
AMPK es un componente esencial de dicho metabolismo. Se proporciona
también una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una isoforma
de la cadena \gamma del AMPK específica de músculo. Así se
proporcionan medios para regular el metabolismo de los
carbohidratos, más específicamente para detectar y/o corregir
disfunciones potenciales o reales de la regulación del metabolismo
de los carbohidratos, en particular en el músculo esquelético.
La invención proporciona un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de
identidad o al menos el 85% de similitud, preferentemente el 80% de
identidad o al menos el 90% de similitud, más preferentemente al
menos el 90% de identidad o al menos el 95% de similitud, y todavía
más preferentemente al menos el 95% de identidad o al menos el 99%
de similitud, con la SEQ ID NO:2 del polipéptido. La invención
también proporciona una secuencia aislada de ácido nucleico que
codifica dicho polipéptido, así como el complemento de dicha
secuencia de ácido nucleico.
Dicho polipéptido representa una nueva isoforma
de la cadena \gamma de AMPK específica de músculo, a la que se
denominará también en lo sucesivo Prkag3; al gen que codifica dicho
polipéptido se le denominará en lo sucesivo PRKAG3.
La "identidad" de una secuencia con una
secuencia de referencia se refiere al porcentaje de residuos que son
los mismos cuando las dos secuencias se alinean para una
correspondencia máxima entre las posiciones de residuos. Un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos X% de identidad con una secuencia de referencia se define en
la presente invención como un polipéptido cuya secuencia puede
incluir hasta 100-x alteraciones de aminoácidos por
cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia.
Las alteraciones de aminoácidos incluyen la eliminación, sustitución
o inserción de residuos de aminoácido consecutivos o esparcidos en
la secuencia de referencia.
"Similitud de una secuencia" con una
secuencia de referencia se refiere al porcentaje de residuos que son
los mismos o sólo difieren en sustituciones de aminoácidos
conservativas cuando las dos secuencias se alinean para una
correspondencia máxima entre las posiciones de los residuos. Una
sustitución de aminoácidos conservativa se define como la
sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de
aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo tamaño,
carga o polaridad), que generalmente no cambia las propiedades
funcionales de la proteína. Un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos con al menos el X% de similitud con una secuencia de
referencia se define en la presente invención como un polipéptido
cuya secuencia puede incluir hasta (100-x)
alteraciones de aminoácidos no conservativas por cada 100
aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. Las
alteraciones de aminoácidos no conservativas incluyen la
eliminación, inserción o sustitución no conservativa de residuos de
aminoácidos consecutivos o esparcidos en la secuencia de
referencia.
Por ejemplo:
* Buscando en la base de datos "GenBank nr"
usando BLASTp (ALSCHUL y col., Nucleic Acids Res., 25,
3389-3402, 1997) con ajustes por defecto y la
secuencia completa SEQ ID NO:2 como una búsqueda, se encontraron los
porcentajes más elevados de identidad o similitud con la SEQ ID NO:2
para:
- subunidad \gamma1 del AMPK humano: 65% de
identidad o 82% de similitud (puntuación: 399);
- subunidad \gamma1 del AMPK de rata: 65% de
identidad o 82% de similitud (puntuación: 399);
- subunidad \gamma1 del AMPK murino: 64% de
identidad o 80% de similitud (puntuación: 390);
- subunidad \gamma1 del AMPK de
Drosophila: 53% de identidad o 75% de similitud (puntuación:
332);
- Levadura Snf4: 33% de identidad o 56% de
similitud (puntuación: 173).
Los polipéptidos de la invención incluyen por
ejemplo cualquier polipéptido (ya sea natural, sintético,
semisintético, o recombinante) de cualquier especie vertebrada, más
específicamente de pájaros, como aves de corral, o mamíferos,
incluyendo la bovina, ovina, porcina, murina, equina, y humana, y
que comprende, o consiste en la secuencia de aminoácidos de
cualquier:
- Prkag3 funcional; o
- un mutante alterado funcionalmente de
Prkag3.
"Funcional" se refiere a una proteína que
tiene actividad biológica normal. Dicha proteína puede comprender
mutaciones silenciosas que inducen cambios no sustanciales en su
actividad, y que tienen efectos fenotípicos que no se notan.
Ejemplos no limitantes de Pkrag3 funcional son:
- un Prkag3 porcino que comprende al menos la
secuencia representada en el listado de secuencias adjunto bajo el
nombre SEQ ID NO:2.
- un Prkag3 humano que comprende al menos la
secuencia representada en el listado de secuencias adjunto bajo el
nombre SEQ ID NO: 4.
Las variantes de ayuste de Prkag3 se desvelan
también en la presente invención: por ejemplo, la secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO: 27, y la secuencia de aminoácidos
correspondiente SEQ ID NO: 28 por un lado, y la secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO: 31 y la secuencia de aminoácidos
correspondiente SEQ ID NO: 32 por otro lado representan dos
variantes de ayuste diferentes del Prkag3 porcino.
Un "mutante alterado funcionalmente" de una
proteína comprende una o varias mutaciones que inducen un cambio en
su actividad. Dichas mutaciones incluyen en particular
eliminaciones, inserciones, o sustituciones de residuos de
aminoácidos en un dominio esencial para la actividad biológica de
dicha proteína. Pueden dar como resultado por ejemplo una pérdida
parcial o total de su actividad, o por el contrario un aumento de
actividad, o un daño en la respuesta a efectores reguladores. Las
eliminaciones, inserciones, o sustituciones no conservativas dan
como resultado con más probabilidad un efecto crítico en la
actividad biológica; sin embargo las sustituciones conservativas
pueden inducir también un efecto observable, si tienen lugar en una
posición importante de un sitio activo de la proteína.
Ejemplos no limitantes de los mutantes alterados
funcionalmente de Prakg3 son:
- el variante R41Q que se obtiene de la
sustitución no conservativa de un residuo de glutamina en la
posición 41 de la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO: 4 por un residuo de
arginina (esta sustitución da como resultado un aumento importante
del contenido de glicógeno, que induce un potencial glicolítico
aumentado del músculo esquelético);
- el variante V40I que se obtiene de la
sustitución de un residuo de isoleucina en la posición 40 de la SEQ
ID NO:2 o la SEQ ID NO: 4 por un residuo de valina (esta sustitución
da como resultado un descenso del contenido de glicógeno y así del
potencial glicolítico del músculo esquelético).
Estas sustituciones tienen lugar dentro de una
porción del primer dominio C3S que está altamente conservado entre
el Pkrag3 y las isoformas conocidas previamente de la subunidad
\gamma del AMPK.
Los números de residuo para el Prkac3 se refieren
a la numeración de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:4.
La alineación de las secuencias Prkag3 humana y porcina con las
isoformas \gamma1 y \gamma2 previamente conocidas se muestra en
la Figura 3.
La invención también proporciona un mutante
alterado funcionalmente de una subunidad \gamma del AMPK, en el
que dicho mutante comprende al menos una mutación responsable de
dicha alteración funcional situada dentro del primer dominio CBS, y
preferentemente dentro de la región de éste alineada con la
extensión de la región desde el residuo 30 hasta el residuo 50 de la
SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. Dicha mutación puede obtenerse de la
inserción, eliminación, y/o sustitución de un aminoácido o varios
aminoácidos, adyacentes o no. Más preferentemente, la mutación se
sitúa dentro de la región alineada con la extensión de la región
desde el residuo 35 hasta el residuo 45 de la SEQ ID NO: 2 o
SEQ
ID NO:4, por ejemplo dentro de la extensión de la región desde el residuo 65 hasta el residuo 75 de la isoforma \gamma1.
ID NO:4, por ejemplo dentro de la extensión de la región desde el residuo 65 hasta el residuo 75 de la isoforma \gamma1.
Según una forma de realización particular, dicha
mutación es una sustitución no conservativa, preferentemente una
sustitución R\rightarrowQ. Según otra forma de realización, dicha
mutación es una sustitución conservativa, preferentemente una
sustitución V\rightarrowI.
Ventajosamente, la mutación está situada en un
residuo que corresponde al residuo 41 de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID
NO:4, por ejemplo en el caso de la isoforma \gamma1, en el residuo
70, o en un residuo que corresponde al residuo 40 de la SEQ ID NO:2
o la SEQ ID NO:4, por ejemplo en el caso de la isoforma \gamma1,
en el residuo 69.
La invención también proporciona un AMPK
heterotrimérico en el que la subunidad \gamma está formada por un
polipéptido de la invención.
La invención también proporciona secuencias de
ácidos nucleicos aisladas que codifican cualquiera de los Pkrag3
funcionales o alterados funcionalmente definidos anteriormente o
mutantes alterados funcionalmente de una subunidad \gamma del
AMPK, y secuencias de ácidos nucleicos complementarias de
cualquiera de estas secuencias de ácidos nucleicos.
Esto incluye particularmente cualquier ácido
nucleico aislado que tiene la secuencia de cualquiera de los alelos
que se dan de forma natural del gen PRKAG3, así como cualquier ácido
nucleico aislado que tiene la secuencia de un mutante artificial de
un gen PKRAG3.
Esto también incluye un ácido nucleico aislado
que tiene la secuencia de un mutante natural o artificial de un gen
PRKAG1 o PRKAG2, en el que dicho mutante codifica una
subunidad \gamma1 o \gamma2 alterada funcionalmente del AMPK
como se define anteriormente.
Los ácidos nucleicos de la presente invención se
pueden obtener mediante procedimientos bien conocidos de tecnología
de ADN recombinante y/o síntesis de ADN química. Estos
procedimientos también permiten introducir las mutaciones deseadas
en una secuencia de ADN que se da de forma natural.
Los ejemplos de ácidos nucleicos que codifican
alelos que se dan de forma natural de un gen PRKAG3 están
representados por la SEQ ID NO:1 que codifica un alelo del gen
porcino que se da de forma natural y la SEQ ID NO:3, que codifica un
alelo del gen humano que se da de forma natural. Estas secuencias
pueden usarse para generar sondas que permiten el aislamiento del
PKRAG3 de otras especies o de otras formas alélicas de
PRKAG3 de especies iguales, mediante cribado de una
biblioteca de ADN genómico o ADNc.
La invención también incluye secuencias de ADN
genómico de cualquier especie vertebrada, más específicamente de
pájaros, como aves de corral, o mamíferos, que incluyen en
particular la bovina, ovina, porcina, murina, equina, y humana, que
comprende una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido
de la invención, preferentemente un gen PRKAG3, y hasta 500
kb, preferentemente hasta 100 kb de una secuencia genómica adyacente
3' y/o 5'.
Dichas secuencias de ADN genómico pueden
obtenerse mediante procedimientos conocidos en la materia, por
ejemplo mediante la extensión de una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido de la invención, empleando un procedimiento
como la PCR de restricción de sitio (SARKAR y col., PCR Methods
Applic., 2, 318-322, 1993), PCR inversa (TRIGLIA y
col., Nucleic Acids Res., 16, 8186, 1988) usando cebadores
divergentes basados en una región codificante de Prkag3, PCR de
captura (LAGERSTROM y col., PCR Methods Applic., 1,
111-119, 1991), o similares.
La invención también incluye fragmentos
específicos de una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido de la invención, o de una secuencia de ADN genómico de
la invención así como fragmentos de ácidos nucleicos hibridando
específicamente con ellos. Preferentemente estos fragmentos tienen
al menos 15 pb de longitud, más preferentemente al menos 200 pb de
longitud.
"Fragmentos específicos" se refiere a
fragmentos de ácidos nucleicos que tienen una secuencia que se
encuentra sólo en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
un polipéptido de la invención, y no se encuentra en secuencias de
ácidos nucleicos que codifican polipéptidos relacionados de la
técnica anterior. Esto excluye los fragmentos de ácidos nucleicos
formados por una secuencia compartida con uno de los genes conocidos
PRKAG1 o PRKAG2.
"Fragmentos hibridando específicamente" se
refiere a fragmentos de ácidos nucleicos que pueden hibridar, bajo
condiciones restrictivas, sólo con secuencias de ácidos nucleicos
que codifican un polipéptido de la invención, sin hibridar con
secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos
relacionados de la técnica anterior. Esto excluye los fragmentos de
ácidos nucleicos constituidos por un complemento de una secuencia
compartida con unos de los genes conocidos PRKAG1 o
PRKAG2.
Se excluyen también los ácidos nucleicos o
fragmentos de ácido nucleico constituidos por el EST GENBANK
AA178898 o el EST GENBANK W94830 o los complementos de éstos.
Dichos fragmentos de ácidos nucleicos específicos
o que hibridan específicamente pueden usarse por ejemplo como
cebadores o sondas para detectar y/o amplificar una secuencia de
ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. La
invención abarca conjuntos de cebadores que comprenden al menos un
cebador constituido por un fragmento de ácido nucleico específico o
que hibrida específicamente como se define anteriormente.
La invención también proporciona vectores
recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido de la invención. Los vectores de la
invención son preferentemente vectores de expresión, en los que una
secuencia que codifica un polipéptido de la invención se coloca bajo
control de elementos de control transcripcionales y traduccionales
adecuados. Estos vectores pueden obtenerse e introducirse en una
célula huésped mediante las técnicas de ADN recombinante e
ingeniería genética bien conocidas.
La invención también comprende una célula huésped
procariótica o eucariótica transformada por un vector de la
invención, preferentemente un vector de expresión.
Un polipéptido de la invención puede obtenerse
cultivando la célula huésped que contiene un vector de expresión que
comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho
polipéptido, bajo condiciones adecuadas para la expresión del
polipéptido, y recuperando el polipéptido del cultivo de células
huésped.
Un AMPK heterotrimérico en el que la subunidad
\gamma está constituida por un polipéptido de la invención puede
obtenerse expresando, en conjunto o por separado, una secuencia de
ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, una
secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad \alpha, y
una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad \beta,
y reconstituyendo el heterotrímero.
Los polipéptidos así obtenidos, o los fragmentos
inmunogénicos de éstos pueden usarse para preparar anticuerpos,
empleando procedimientos bien conocidos en la técnica. Los
anticuerpos dirigidos contra el polipéptido Prkag3 completo y
capaces de reconocer cualquier variante de éste pueden obtenerse
así. Pueden obtenerse también anticuerpos dirigidos contra un
epítopo específico de un variante particular (funcional o no) de
Prkag3 o anticuerpos dirigidos contra un epítopo específico de un
mutante alterado funcionalmente que tiene una mutación en el primer
dominio CBS de una subunidad \gamma del AMPK, y capaces de
reconocer dicho variante o mutante alterado funcionalmente.
Como se muestra en la presente invención, es
probable que las mutaciones en una subunidad \gamma del AMPK, y
particularmente las mutaciones en el primer dominio CBS de una
subunidad \gamma del AMPK produzcan alteraciones en el metabolismo
de la energía (por ejemplo, diabetes, obesidad) en vertebrados,
incluyendo humanos. Además, es probable que las mutaciones en el
primer dominio CBS o en otras partes del gen PRKAG3 produzcan
alteraciones en el metabolismo muscular conduciendo a enfermedades
como miopatía, diabetes y enfermedades cardiovasculares.
La presente invención proporciona medios para
detectar y corregir dichas alteraciones.
Más específicamente, la presente invención está
dirigida a procedimientos que utilizan las secuencias de ácidos
nucleicos y/o secuencias polipeptídicas de la invención para la
evaluación diagnóstica, pruebas genéticas y prognosis de una
alteración metabólica.
Por ejemplo, la invención proporciona
procedimientos para diagnosticar alteraciones metabólicas, más
específicamente alteraciones del metabolismo de los carbohidratos, y
preferentemente alteraciones relacionadas con una acumulación de
glicógeno en las células alterada, en particular excesiva, que
deriva de una mutación en un gen que codifica una subunidad \gamma
del AMPK, en los que dichos procedimientos comprenden detectar y/o
medir la expresión de un gen PRKAG3 funcionalmente alterado,
o de un mutante funcionalmente alterado de una subunidad \gamma de
AMPK que tiene una mutación en el gen PRKAG3 o en una
secuencia que codifica el primer dominio CBS de una subunidad
\gamma del AMPK en el genoma de un vertebrado que se sospecha que
tiene dicha alteración.
Según una forma de realización preferida de la
invención, la alteración está relacionada con una acumulación de
glicógeno alterada, en particular excesiva en las células musculares
y deriva de la expresión de un gen PRKAG3 funcionalmente
alterado.
La expresión de un Prkag3 funcionalmente
alterado, o de un mutante funcionalmente alterado de una subunidad
\gamma del AMPK que tiene una mutación dentro del primer dominio
CBS puede detectarse o medirse usando anticuerpos policlonales o
monoclonales específicos para los polipéptidos funcionalmente
alterados de la invención, como se define anteriormente. Se conocen
en la técnica procedimientos adecuados. Incluyen por ejemplo el
ensayo inmunoabsorbente de unión a enzima (ELISA), el
radioinmunoensayo (RIA) y la distribución de células activadas por
fluorescencia (FACS).
Las secuencias de nucleótidos de la invención
pueden usarse para detectar mutaciones en el gen PRKAG3 o en
una secuencia que codifica el primer dominio CBS de una subunidad
\gamma del AMPK, mediante detección de diferencias en secuencias
de genes o en secuencias adyacentes entre individuos normales,
portadores, o afectados.
La invención proporciona un procedimiento para
detectar una mutación en el gen PRKAG3 o en una secuencia que
codifica el primer dominio CBS de una subunidad \gamma del AMPK en
el que dicho procedimiento comprende:
- comprobar la presencia en una muestra de ácido
nucleico de un vertebrado, de una secuencia de ácido nucleico que
codifica un Prkag3 mutante, o un mutante de una subunidad \gamma
del AMPK que tiene una mutación dentro del primer dominio CBS, como
se define anteriormente.
Según una forma de realización preferida de la
invención se proporciona un procedimiento para detectar una
secuencia de ácido nucleico que comprende una mutación en el gen
PRKAG3 o en una secuencia que codifica el primer dominio CBS
de una subunidad \gamma del AMPK en el que dicho procedimiento
comprende:
- hacer contactar una muestra de ácido nucleico
de un vertebrado con una sonda de ácido nucleico obtenida de un
ácido nucleico de la invención y extender dicha mutación, bajo
condiciones de hibridación específica entre dicha sonda y la
secuencia mutante que se va a detectar;
- detectar el complejo de hibridación.
Preferentemente, el procedimiento de la invención
comprende además, antes de la hibridación, la amplificación por PCR
de la muestra del ácido nucleico, de una secuencia que comprende al
menos la porción de la secuencia de PRKAG3 o de la secuencia
que codifica el primer dominio CBS de la subunidad \gamma del AMPK
en el que se va a detectar la mutación.
En la técnica se conocen procedimientos que
permiten la hibridación específica de una sonda con una secuencia
complementaria que encaja perfectamente, y útil para la detección de
mutaciones puntuales. Incluyen por ejemplo PCR Específica de Alelos
(GIBBS, Nucleic Acid Res., 17, 2427-2448, 1989),
Cribado de Oligonucleótidos Específico de Alelos (SAIKI y
col., Nature, 324, 163-166, 1986) y
similares.
Una mutación en el gen PRKAG3 puede
detectarse también mediante defección de marcadores polimórficos
íntimamente unidos a dicha mutación.
La invención también proporciona medios para
identificar dichos marcadores polimórficos.
Dichos marcadores polimórficos pueden obtenerse
por ejemplo, cribando una biblioteca de ADN genómico de un
vertebrado con una sonda específica para el gen PRKAG3, para
seleccionar clones que comprenden al menos una porción de un gen
PRKAG3, y hasta 500 kb, preferentemente 300 kb, más
preferentemente hasta 100 kb de una secuencia cromosómica
flanqueante 3' y/o 5', e identificar un locus polimórfico en dichas
secuencias cromosómicas flanqueantes. El/los alelo(s) de un
marcador polimórfico asociados a un alelo mutante dado del gen
PRKAG3 pueden también identificarse fácilmente mediante el
uso de una biblioteca de ADN genómico de un individuo en el que la
presencia de dicho alelo mutante se ha detectado previamente
mediante hibridación con una sonda de ácido nucleico de la
invención.
Los marcadores polimórficos incluyen por ejemplo,
polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNP), microsatélites,
polimorfismo de inserción/eliminación y polimorfismo de longitud de
fragmento de restricción (RFLP). Estos marcadores polimórficos
pueden identificarse mediante comparación de secuencias que
flanquean el gen PKRAG3 obtenido de varios individuos. Los
microsatélites pueden identificarse también mediante hibridación con
una sonda de ácido nucleico específica de motivos de microsatélite
conocidos.
Una vez que se ha identificado un locus
polimórfico, como se desvela anteriormente, un segmento de ADN que
se extiende en el locus polimórfico puede secuenciarse y pueden
diseñarse un conjunto de cebadores que permiten la amplificación de
dicho segmento de ADN.
La detección de una mutación en el gen
PRKAG3 puede llevarse a cabo amplificando un segmento de ADN
genómico de un vertebrado que se extiende en un locus polimórfico,
mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando un conjunto
de cebadores que flanquean dicho locus polimórfico, y detectando en
dicho ADN amplificado la presencia de un alelo de dicho marcador
polimórfico asociado a dicha mutación.
Según una forma de realización preferida de la
invención, el vertebrado es un mamífero, preferentemente un animal
de granja y más preferentemente porcino, y la mutación que se va a
detectar produce un Prkag3 funcionalmente alterado. La detección de
dicha mutación permite predecir si dicho mamífero o la progenie de
éste tiene probabilidades de tener una concentración de glicógeno
intramuscular superior o inferior a la media. Un ejemplo de dicha
mutación produce un Prkag3 funcionalmente alterado que tiene una
sustitución R41Q, y que da como resultado un contenido de glicógeno
aumentado en el músculo esquelético.
Otro ejemplo de dicha mutación produce un Prkag3
funcionalmente alterado que tiene una sustitución V40I, y da como
resultado un contenido en glicógeno disminuido en el músculo
esquelético. En animales de granja que tienen dicha mutación, la
glicógenolisis que tiene lugar después de la matanza es menos
importante que en animales normales, dando como resultado un pH más
elevado y una potencial mejor calidad de la carne.
La presente invención también incluye kits para
la práctica de los procedimientos de la invención. Los kits
comprenden cualquier recipiente que contenga al menos un fragmento
específico de una secuencia de ácido nucleico de la invención, o al
menos un fragmento de ácido nucleico capaz de hibridarse
específicamente con una secuencia de ácido nucleico de la invención.
Dicho fragmento de ácido nucleico se puede marcar. Se puede usar
junto con kits de amplificación comercialmente accesibles. Pueden
incluir también reacciones de control o marcadores positivos o
negativos, marcadores de tamaño de peso molecular para
electroforesis en gel, y similares. Otros kits de la invención
pueden incluir anticuerpos de la invención, opcionalmente marcados,
así como los reactivos adecuados para detectar una reacción
antígeno-anticuerpo. Pueden incluir también
reacciones de control positivo o negativo o marcadores.
La invención además proporciona medios para
modular la expresión de genes vertebrados que codifican una
subunidad \gamma del AMPK, y más específicamente del gen
PRKAG3 y/o la síntesis o actividad de los productos de
dichos genes.
Un heterotrímero de AMPK purificado que comprende
la subunidad de Prkag3 de tipo salvaje o mutante o una subunidad
\gamma mutante funcionalmente alterada que tiene una mutación en
el primer dominio CBS, puede usarse para comprobar in vitro
la capacidad de los compuestos del ensayo para modular la actividad
del AMPK, o para restablecer la actividad de AMPK alterada. Esto
puede hacerse, por ejemplo:
- midiendo la unión del compuesto a dicho
heterotrímero, usando por ejemplo procedimientos de cribado de
transmisión elevada; o,
- midiendo cambios en la actividad AMPK kinasa,
usando por ejemplo procedimientos de cribado de transmisión
elevada.
Se desvelan, por ejemplo procedimientos de
cribado de transmisión elevada en "High throughput screening: The
Discovery of Bioactive Substances", J.P. DEVLIN (Ed), MARCEL
DEKKER Inc., New york (1997).
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden
usar con fines terapéuticos. Por ejemplo, moléculas complementarias
o fragmentos de éstas (oligonucleótidos antisentido) pueden usarse
para modular la actividad AMPK, más específicamente en el tejido
muscular.
También, una secuencia de ácido nucleico que
codifica un Prkag3 funcional puede usarse para reestablecer una
función AMPK normal.
Las células transformadas o los tejidos animales
que expresan un Pkrga3 de tipo salvaje o mutante, o un mutante
alterado funcionalmente de una subunidad \gamma del AMPK como se
define anteriormente, o que expresan un AMPK que comprende dicho
Pkrag3 mutante, o dicho mutante funcionalmente alterado de una
subunidad \gamma del AMPK, pueden usarse como modelo in
vitro para averiguar el mecanismo de la actividad del AMPK o
para comprobar la capacidad de los compuestos de ensayo de cribado
para modular la expresión del AMPK.
El cribado puede hacerse añadiendo el compuesto
que se va a probar al medio de cultivo de dicha células o dichos
tejidos, y midiendo las alteraciones en el metabolismo de la
energía en dichas células o dichos tejidos usando procedimientos
como medidas de concentraciones de glucosa (niveles), captación de
glucosa, o cambios de la proporción ATP/AMP, glicógeno o contenido
lípido/proteína.
La invención proporciona animales no humanos
transformados con una secuencia de aminoácidos de la invención.
En una forma de realización, dichos animales son
animales transgénicos que tienen al menos un transgen que comprende
un ácido nucleico de la invención.
En otra forma de realización, dichos animales son
animales knockout. "Animales knockout" se refiere a animales
cuyos alelos PRKAG3 nativos o endógenos se han inactivado y
que producen Prkag3 propio no funcional.
A la luz de la revelación de la invención de las
secuencias de ADN que codifican un Prkag3 de tipo salvaje o mutante,
o un mutante alterado funcionalmente de una subunidad \gamma del
AMPK, se pueden producir animales transgénicos así como animales
knockout según técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo por
medio de recombinación homóloga in vivo.
Procedimientos adecuados para la preparación de
animales transgénicos o knock-out se desvelan por
ejemplo en: Manipulating the Mouse Embryo, 2ª Ed., de HOGAN
y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994;
Transgenic Animal Technology, editado por C. PINKERT,
Academic Press Inc., 1994; Gene Targeting: A Practical
Approach, editado por A.L. y J.M. ROBL, ASM Press, 1995;
Mouse Genetics: Concepts and Applications, por Lee M. SILVER,
Oxford University Press, 1995.
Estos animales no humanos pueden usarse como
modelos para enfermedades y alteraciones metabólicas, más
específicamente para enfermedades y alteraciones del metabolismo del
glicógeno en el músculo. Por ejemplo pueden usarse para moléculas de
ensayos de cribado. Los animales transgénicos de la invención pueden
usarse así para comprobar la capacidad de los compuestos de ensayo
para modular la actividad AMPK. Los animales knockout de la
invención pueden usarse, en particular, para comprobar la capacidad
de los compuestos de ensayo para modular el metabolismo de la
energía, más específicamente el metabolismo de los carbohidratos, en
ausencia de Prkag3 funcional.
El cribado puede llevarse a cabo administrando al
animal el compuesto que se va a ensayar, y midiendo las alteraciones
en el metabolismo de la energía en dicho animal usando
procedimientos como el test de tolerancia a la glucosa, medidas de
niveles de insulina en sangre, cambios de la proporción de ATP/AMP,
contenido de glicógeno o lípido/proteína en tejidos y células.
También pueden obtenerse animales de granja
transgénicos o knockout con características de carne modificada o
metabolismo de la energía modificado.
La presente invención se ilustrará adicionalmente
mediante la descripción adicional que sigue a continuación, que se
refiere a ejemplos de obtención y uso de los ácidos nucleicos de la
invención. Debería entenderse sin embargo que estos ejemplos se dan
sólo como medio de ilustración de la invención y no constituyen de
ninguna manera una limitación de ésta.
Se ha cribado una biblioteca de cromosomas
artificiales bacterianos porcinos (BAC)
(ROGEL-GAILLARD y col., Cytogenet and Cell Genet,
851, 273-278, 1999) y construido un conjunto de
clones de BAC solapantes a lo largo de la región del cromosoma 15 de
cerdo que alberga el gen RN. Estos clones de BAC se usaron a
su vez para desarrollar nuevos marcadores genéticos en forma de
polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNPs) o microsatélites
(MS).
Los nuevos marcadores se usaron junto con algunos
marcadores descritos previamente para construir un mapa de unión de
alta resolución. Todos estos marcadores se enumeran en la Tabla 1.
Los análisis de unión estándar que usan datos de pedigrí que
comprenden aproximadamente 1000 meiosis informativas para la
segregación en el locus RN hacen posible excluir el RN
de la región proximal al MS479L3 y distal al microsatélite
Sw936. El análisis de desequilibrio de unión (LD) se hizo
con los mismos marcadores y una muestra aleatoria de 68 jabalíes de
cría de la población Hampshire sueca, puntuada para el fenotipo RN
midiendo el contenido de glicógeno en el músculo. Los resultados del
análisis LD usando el programa DISMULT (TERWILLIGER, Am. J. Hum.
Genet., 56, 777-787, 1995) se muestran en la figura
1. Revelan un pico LD agudo alrededor de los marcadores MS127B1 y
SNP127G63. Parecía que estos marcadores mostraban desequilibrio de
unión completo con el alelo RN^{-}, es decir, el RN^{-} se
asociaba con un único alelo en estos dos loci. La interpretación más
sencilla de este descubrimiento es que la mutación RN^{-} apareció
en un cromosoma que portaba estos alelos y que los dos marcadores
están tan íntimamente unidos al locus RN que la frecuencia de
recombinación es cercana al 0%. Los dos marcadores están ambos
presentes en los clones BAC de solapamiento 127G6 y 134C9 sugiriendo
que el gen RN puede residir en el mismo clon o en uno de los clones
veci-
nos.
nos.
Se construyó una biblioteca perdigonada del clon
BAC 127Gs y se recogieron más de 1000 lecturas de secuencia dando
aproximadamente secuencias de ADN aleatorias de 500000 pares de
bases del clon. Los datos se analizaron y se construyeron conjuntos
de secuencias con los paquetes de software PHRED, PHRAP, y CONSED
(University of Washington Genome Center,
http://ftp.genome.washington.edu). Los datos de las
secuencias se enmascararon para repeticiones usando el software
REPEATMASKER
(http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker)
y se llevaron a cabo búsquedas BLAST usando el sitio Web NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Se obtuvieron tres
coincidencias convincentes con las secuencias de codificación. Dos
de ellas, eran contra secuencias/genes de ADNc humano, KIAA0173 que
se describe como similar a la tubulin tirosina ligasa de cerdo y que
está situado en HSA2q (Unigene cluster Hs.169910,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/) y CYP27A1 situado en
HSA2q33-ter (Unigene cluster Hs. 82568). Los
resultados sugerían en gran medida que las secuencias de
codificación del cerdo son ortólogas a estos genes humanos como está
bien establecido que la región RN es homóloga a
HSA2q33-36 (ROBIC y col., Mamm. Genome, 10,
565-568, 1999). Sin embargo, ninguna de estas
secuencias aparecía como genes candidatos plausibles para RN.
La tercera secuencia de codificación identificada en BAC127G6 mostró
una muy importante similitud de secuencia con diferentes secuencias
\gamma de la proteína kinasa activada con AMP incluyendo la
secuencia SNF4 de levadura. La secuencia de ADNc de este gen
se determinó mediante análisis RT-PCR y RACE usando
ARNm de músculo de un homocigoto rn^{+}/rn^{+}.
Esta secuencia se muestra en la Figura 2 y en el listado de
secuencias adjunto bajo el nombre SEQ ID NO:1.
5'UTR: región 5'no traducida
3'UTR: región 3' no traducida.
CDS: secuencia codificante.
***: codon de parada
"-": identidad con la secuencia master
".": gap de alineación.
Se determinó la fase de traducción según la
homología de otros miembros en la familia de proteínas y asumiendo
que el primer codon de metionina en la fase es el codon de
iniciación. La secuencia polipeptídica deducida según esto se
muestra en el listado de secuencias adjunto bajo el nombre SEQ ID
NO:2.
La secuencia nucleotídica completa del ADNc de
PRKAG3 de cerdo se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo
el nombre SEQ ID NO:27 y la secuencia polipeptídica completa se
muestra en el listado de secuencias adjunto bajo el nombre SEQ ID
NO:28 y en la Figura 3.
La Figura 3 muestra una alineación de aminoácidos
construida con el programa CLUSTAL W (THOMPSON y col.,
Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680, 1994) con
secuencias de \gamma de AMPK representativas en las bases de datos
de los nucleótidos.
HumG1: Genbank U42412
MusG1: Genbank AF036535
\newpage
HumG2: PRKAG2 humano (Genbank AJ249976)
PigG3: PRKAG3 de cerdo (este estudio)
HumG3: PRKAG3 humano (este estudio)
Dros: Drosophila (Genbank AF094764)
Tanto la secuencia de PRKAG2 como la de
Drosophila tienen regiones aminoterminales más largas pero no
muestran homología importante con la región aminoterminal del PRKAG3
y no se incluyeron.
*: codon de terminación.
"-": identidad con la secuencia master
".": gap de alineación
Los cuatro dominios CBS están subrayados y la
posición de la mutación RN^{-} está indicada por una
flecha.
La Tabla 2 siguiente muestra las identidades de
las secuencias de aminoácidos (diagonal superior) y de nucleótidos
(diagonal inferior) (en %) entre las secuencias de AMPKG/SNF4 de
mamífero, Drosophila y levadura. En el caso del
PRKAG3 de cerdo y el PRKAG3 humano, las identidades se calcularon
en referencia a las porciones de éstas representadas respectivamente
por la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:3, para las secuencias de
nucleótidos, y por la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:4, para las
secuencias de aminoácidos.
La Figura 4 muestra un árbol filogenético de
proximidad de vecinos construido con el software PAUP (SWOFFORD,
Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods),
Sinauer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachusetts,
1998) usando SNF4 de levadura como especie externa, se indica el
soporte para órdenes de ramas obtenido en el análisis Bootstrap con
1000 replicantes, la escala del árbol se indica en la parte
inferior. El resultado mostró que el gen del cerdo situado en la
región RN es distinto de las isoformas de PRKAG1 y
PRKAG2 de mamífero y con la mayor probabilidad ortólogo a un
gen humano representado por la secuencia EST humana AA178898
(GenBank) que se obtiene de una biblioteca de ADNc de músculo. Este
gen se denomina en la presente invención PRKAG3 ya que es la
tercera isoforma de una proteína kinasa \gamma activada con AMP
ya caracterizada.
La secuencia de ADNc de este gen se determinó
mediante análisis RT-PCR y 5'RACE usando ADNc de
músculo esquelético humano (Clontech, Palo Alto, CA). Esta secuencia
se muestra en la Figura 2 y en el listado de secuencias bajo el
nombre SEQ ID NO:3. La secuencia polipeptídica deducida que tiene el
97% de identidad con la secuencia porcina SEQ ID NO:2 (véase Tabla
2) se muestra en la Figura 2 y en el listado de secuencias bajo el
nombre SEQ ID NO:4.
La secuencia de ADNc completa se muestra también
en el listado de secuencias adjunto bajo el nombre SEQ ID NO:29; la
secuencia polipeptídica deducida se muestra en el listado de
secuencias adjunto bajo el nombre SEQ ID NO:30 y en la Figura 3.
Usando el panel híbrido de radiación TNG humano
de alta resolución:
(http://shgc-www.stanford.edu/RH/
TNGindex.html) se mapearon los homólogos humanos de PRKAG3, CYP27A1 y KIAA0173, todos presentes en el BAC127Gs porcino. Los tres genes están también unidos muy íntimamente en el genoma humano. El PRKAG3 se mapeó a una distancia de 33 cR_{50000} del KIAA0173 y 52 cR_{50000} del CYP27A1, con los apoyos de reserva de 6,8 y 4,5, respectivamente.
TNGindex.html) se mapearon los homólogos humanos de PRKAG3, CYP27A1 y KIAA0173, todos presentes en el BAC127Gs porcino. Los tres genes están también unidos muy íntimamente en el genoma humano. El PRKAG3 se mapeó a una distancia de 33 cR_{50000} del KIAA0173 y 52 cR_{50000} del CYP27A1, con los apoyos de reserva de 6,8 y 4,5, respectivamente.
El papel establecido del AMPK en la regulación
del metabolismo de la energía, incluyendo el almacenamiento del
glicógeno, y su situación en la región que muestra el máximo
desequilibrio de unión hizo al PRKAG3 un gen candidato muy
fuerte para el RN. Esto fue reforzado adicionalmente mediante
análisis por hibridación de una técnica de hibridación de tipo
Northern de tejido múltiple humano (CLONTECH, Palo Alto, CA) usando
PRKAG1 humano (IMAGE clon 0362755 correspondiente a la
entrada de GenBank AA018675), PRKAG2 humano (IMAGE clon
0322735 que corresponde a la entrada de GenBank W15439) y una sonda
PRKAG3. Los resultados se muestran en la Figura 5.
H: Corazón, B:cerebro, Pl:Placenta, L:Pulmón,
Li: Hígado, M: Músculo esquelético, K: Riñón, Pa:
Páncreas,
S: Bazo, Th: Timo, P: Próstata, T: Testículos, O:
Ovario
I: Intestino delgado, C: Colon (revestimiento
mucoso)
PBL: Leucocito de Sangre Periférica.
Mientras que las sondas PRKAG1 y
PRKAG2 mostraron una distribución de la expresión de tejido
amplia, el PRKAG3 mostró una expresión específica de músculo
distinta. Este resultado también está avalado por la base de datos
EST humana en la que se han identificado múltiples EST que
representan PRKAG1 y PRKAG2 en diversas bibliotecas de
ADNc mientras que de una biblioteca de ADNc de músculo se ha
obtenido un único EST (entrada de GenBank AA178898) que representa
PRKAG3. La expresión específica de músculo del PRKAG3
y la falta de expresión en hígado son completamente consistentes con
el efecto fenotípico del RN^{-}, es decir que el contenido
de glicógeno se altera en el músculo pero es normal en el hígado
(ESTRADE y col., Comp. Biochem. Physiol. 104B,
321-326, 1993).
Las secuencias de PRKAG3 se determinaron a
partir de homocigotos rn^{+}/rn^{+} y RN^{-}/RN^{-}
mediante análisis por RT-PCR. Se encontró entre la
secuencia de animales rn^{+} y RN^{-} una comparación que
revelaba un total de siete diferencias de nucleótidos cuatro de las
cuales eran sustituciones no sinónimas, como se muestra en la
siguiente Tabla 3. El cribado de estas siete SNP con ADN genómico de
cerdos rn^{+} y RN^{-} adicionales de diferentes razas reveló
cinco alelos PRKAG3 diferentes, pero sólo la sustitución de
sentido erróneo R41Q se asoció exclusivamente al RN^{-}. Esta
sustitución no conservativa tiene lugar en CBS1 que es la región
más conservada entre las formas isotópicas de la cadena \gamma del
AMPK y la arginina en este residuo (número 70 en Prkag1) se conserva
entre isoformas diferentes de secuencias de \gamma del AMPK
mamífero así como en la secuencia de Drosophila
correspondiente (Figura 3). Se diseñó un ensayo de ADN diagnóstico
simple para la mutación R41Q basándose en el ensayo de ligación de
oligonucleótidos (OLA; LANDEGREN y col., Science, 241,
1077-1080, 1988). El cribado de un gran número de
animales RN^{-} y rn^{+} de la raza de Hampshire así como de un
gran número de animales rn^{+} de otras razas mostró que el alelo
41Q estaba presente en todos los animales RN^{-} pero no se
encontró en ningún animal rn^{+}, como se muestra en la siguiente
Tabla 4. La ausencia del alelo 41Q de otras razas es consistente
con la asunción de que el alelo RN^{-} se originaba en la raza de
Hampshire; el alelo no se ha encontrado todavía en animales pura
raza de otras razas. En conclusión, los resultados proporcionan
pruebas convincentes de que el PRKAG3 es idéntico al gen RN y
que lo más probable es que la sustitución de R41Q sea la mutación
causante.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{a} representa poblaciones de Hampshire tanto francesas como
suecas\cr ^{b} heterozigosidad RN ^{-} /rn ^{+} deducida usando
información del pedigrí\cr ^{c} \begin{minipage}[t]{137mm}
razas: Angler Saddleback, n=31; Blond Mangalitza. N=2; Bunte
Bentheimer, n=16; Duroc, n=160; Göttinger Minipig, n=4; Landrace,
n=83; Large White, n=72; mEishan, n=8; Piétrain, n=75; Red
Mangalitza, n=5; \hskip0,1cm Rotbunte Husumer, n=15;
Schwalbenbauch Mangalitza, n=7; \hskip0,1cm Schwäbisch Hällische,
n=2; European Wild Boar, n=5; Japanese Wild Boar,
n=3.\end{minipage} \cr ^{d} se refiere a los números de
nucleótido de la SEQ ID NO:
1\cr}
Sin ligarse a ningún mecanismo particular, puede
suponerse que el heterotrímero de AMPK que incluye el PKRAG3 está
implicado en la regulación del transporte de la glucosa en el
músculo esquelético.
Recientemente se ha informado que la activación
del AMPK inducida por el análogo del AMP AICAR o por
concentraciones del músculo conduce a una toma de glucosa aumentada
en el músculo esquelético (BERGERON y col., Am. J. Physiol.,
276, E938-944, 1999; HAYASHI y col.,
Diabetes, 47, 1369-1373, 1998). Si ésta es la
función del heterotrímero de AMPK que incluye el PRKAG3, la R41Q
puede ser una mutación de ganancia de función que produce una
holoenzima constitutivamente activa, por ejemplo debido a la pérdida
de un sitio alostérico de inactivación. Si es así, la actividad del
AMPK reducida en animales RN^{-} es probable que refleje
inhibición de respuesta debido al estado de alta energía del
músculo. Se espera una entrada de glucosa aumentada al músculo
esquelético para conducir a un aumento en el contenido de glicógeno
en el músculo como se observa en los animales RN^{-}. Se ha
mostrado que la sobreexpresión del transportador de glucosa 4
(GLUT4) en ratones transgénicos conduce a una entrada aumentada de
glucosa y a un almacenamiento aumentado de glicógeno (TREADWAY y
col., J. Biol. Chem., 269, 29956-29961, 1994).
Este tipo de modelo de ganancia de función es consistente con el
dominio del RN^{-} ya que la presencia de una única copia sin
regular tendría un gran efecto sobre la actividad de la enzima
AMPK.
También puede proponerse una hipótesis
alternativa sobre la importancia funcional de la sustitución R41Q
asociada al alelo RN^{-}. Basándose en los papeles establecidos
de la enzima SNF1 de levadura en la utilización del glicógeno y del
AMPK mamífero para inhibir las rutas de consumo de energía y
estimular las rutas productoras de energía, se espera que el AMPK
activado inhiba la síntesis del glicógeno y estimule la degradación
del glicógeno. Si éste es el papel funcional de la(s)
isoforma(s) que contienen el producto de PRKAG3, la
sustitución R41Q sería una mutación de pérdida de función o una
mutación negativa dominante que bloquea el heterotrímero del AMPK en
un estado inactivo, inhibiendo así la activación del AMP y la
degradación del glicógeno. En estos casos, el efecto fenotípico
debería explicarse por haplo-insuficiencia, dado que
el RN^{-} parece completamente dominante.
Así la R41Q puede ser una mutación negativa
dominante, pero sólo si interfiere con múltiples isoformas dado que
la principal actividad del AMPK en el músculo parece estar asociada
con las isoformas PRKAG1 y 2 [CHEUNG, y col. Biochem. J. 346,
659 (2000)].
El fenotipo distinto de la mutación RN^{-}
indica que el PRKAG3 juega un papel clave en la regulación del
metabolismo de la energía en el músculo esquelético. Por ejemplo, es
probable que el PRKAG3 esté implicado en la adaptación al ejercicio
físico, que está asociado a un aumento en el almacenamiento de
glicógeno. También es concebible que las mutaciones de pérdida de
función en el PRKAG3 (u otros genes del AMPK) puedan
predisponer a los individuos a diabetes mellitus no dependiente de
insulina, y las isoformas del AMPK son dianas potenciales de
fármacos para el tratamiento de esta alteración.
Una parte del PRKAG3 que incluye el codon
41 se amplificó en reacciones de 10 \mul que contenían 100 ng de
ADN genómico, dNTPs 0,2 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 4,0 pmol tanto de
cebador sentido (AMPKG3:5'-GGAGCAAATGTG
CAGACAAG-3') como de antisentido (AMPKG3R2:5'-CCCACGAAGCTCTGCTTCTT-3'), DMSO 10%, 1 U de Taq ADN polimerasa y tampón de reacción (ADVANCED BIOTECH, London, UK). Las condiciones de la ciclación incluían una incubación inicial a 94ºC durante 5 min seguida de 3 ciclos a 94ºC (1 min), 57ºC (1 min) y 72ºC (1 min), y 35 ciclos de 94ºC (20 segundos), 55ºC (30 segundos) y 72ºC (30 segundos). La discriminación de alelos en la posición del nucleótido 122 se hizo usando el ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA, LANDEGREN y col., Science, 241, 1077-1080, 1988). El procedimiento OLA se llevó a cabo como un ensayo basado en gel. Cada reacción de OLA de 10 \mul contenía 0,5 pmol de cada sonda SNPRN-A (5'-Hex-TGGCCAACGGCGTCCA-3'), SNPRN-G (5'ROX-GGCCAACGGCGTCCG-3') y SNPRN-Común (5'fosfato-AGCGGCACCTTTGTGAAAAAAAAAA-3'), 1,5 U de AMPLIGASA termoestable y tampón de reacción (EPICENTRE TECHNOLOGIES, Madison, WI) y 0,5 \mul del producto de PCR AMPKG3F3/AMPKG3R2. Después de una incubación inicial a 95ºC durante 5 minutos, el siguiente perfil termocíclico se repitió 10 veces: desnaturalización a 94ºC (30 segundos), y alineamiento de sondas y ligación a 55ºC (90 segundos). Después de la ciclación OLA, se desnaturalizó con calor a 94ºC 1 \mul de producto (3 minutos), se enfrió en hielo, y se cargó en gel desnaturalizante de poliacrilamida 6% para electroforesis en un secuenciador de ADN ABI377 (PERKIN ELMER, Foster City, USA). Las longitudes de los fragmentos resultantes y la flourescencia de pico se analizaron usando el software GENESCAN (PERKIN ELMER, Foster City, USA).
CAGACAAG-3') como de antisentido (AMPKG3R2:5'-CCCACGAAGCTCTGCTTCTT-3'), DMSO 10%, 1 U de Taq ADN polimerasa y tampón de reacción (ADVANCED BIOTECH, London, UK). Las condiciones de la ciclación incluían una incubación inicial a 94ºC durante 5 min seguida de 3 ciclos a 94ºC (1 min), 57ºC (1 min) y 72ºC (1 min), y 35 ciclos de 94ºC (20 segundos), 55ºC (30 segundos) y 72ºC (30 segundos). La discriminación de alelos en la posición del nucleótido 122 se hizo usando el ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA, LANDEGREN y col., Science, 241, 1077-1080, 1988). El procedimiento OLA se llevó a cabo como un ensayo basado en gel. Cada reacción de OLA de 10 \mul contenía 0,5 pmol de cada sonda SNPRN-A (5'-Hex-TGGCCAACGGCGTCCA-3'), SNPRN-G (5'ROX-GGCCAACGGCGTCCG-3') y SNPRN-Común (5'fosfato-AGCGGCACCTTTGTGAAAAAAAAAA-3'), 1,5 U de AMPLIGASA termoestable y tampón de reacción (EPICENTRE TECHNOLOGIES, Madison, WI) y 0,5 \mul del producto de PCR AMPKG3F3/AMPKG3R2. Después de una incubación inicial a 95ºC durante 5 minutos, el siguiente perfil termocíclico se repitió 10 veces: desnaturalización a 94ºC (30 segundos), y alineamiento de sondas y ligación a 55ºC (90 segundos). Después de la ciclación OLA, se desnaturalizó con calor a 94ºC 1 \mul de producto (3 minutos), se enfrió en hielo, y se cargó en gel desnaturalizante de poliacrilamida 6% para electroforesis en un secuenciador de ADN ABI377 (PERKIN ELMER, Foster City, USA). Las longitudes de los fragmentos resultantes y la flourescencia de pico se analizaron usando el software GENESCAN (PERKIN ELMER, Foster City, USA).
El procedimiento basado en OLA para la mutación
R41Q se usó para determinar el genotipo de muestras de ADN recogidas
de 68 animales Hampshire suecos fenotipados como RN^{-} o como
rn^{+} según el valor de su potencial glicolítico. La Figura 6
ilustra resultados de OLA típicos de los tres genotipos posibles.
Todos los animales RN^{-} se marcaron como homocigotos A/A (n=28)
o heterocigotos A/G (n=36) en la posición del nucleótido 12
mientras que los animales rn^{+}eran homocigotos G/G (n=4) en esta
posición.
Se clonó un microsatélite 127B1 (MS127B1) a
partir de un BAC 127G7 que contenía PRKAG3 de cerdo. El clon
BAC se digirió con Sau3AI y los fragmentos de restricción se
subclonaron en el sitio BamH1 de pUC18. La biblioteca
resultante se sondeó con una sonda de oligonucleótido (CA)15
marcada con [\gamma-32P]-dATP.
Los fragmentos que hibridaban en mayor medida se secuenciaron, y se
diseñaron cebadores para amplificación por PCR de los loci de los
microsatélites. Se llevaron a cabo reacciones de PCR de diez \mul
que contenían 100 ng de ADN genómico, dNTPs 0,2 mM, MgCl_{2} 1,5
mM, 4,0 pmol tanto de cebador sentido
(MS127B1F:5'-Fluorescein-CAAACTCT-TCTAGGCGTGT-3')
como antisentido
(MS1271R:5'-GTTTCTGGAACTTCCATATGCCATGG-3'),
y 1 U de Taq DNA polimerasa y tampón de reacción (ADVANCED BIOTECH,
London, UK). Las condiciones de ciclación incluyeron una incubación
inicial a 94ºC durante 5 minutos seguida por 3 ciclos a 94ºC (1
minuto), 57ºC (1 minuto) y 72ºC (1 minuto), y 35 ciclos de 94ºC (20
segundos), 55ºC (30 segundos) y 72ºC (30 segundos). Los productos de
la PCR (0,3 \mul) se separaron usando electroforesis en gel
desnaturalizante de poliacrilamida 4% en un secuenciador de ADN
ABI377 (PERKIN ELMER, Foster City, USA). Las longitudes de los
fragmentos resultantes se analizaron usando el software GENESCAR y
GENOTYPER (PERKIN ELMER, Foster City, USA).
El procedimiento se usó para determinar el
genotipo de muestras de ADN recogidas de 87 animales de Hampshire
suecos fenotipados como RN^{-} o rn^{+} según el valor de su
potencial glicolítico (GP). El alelo 108 (pb) mostró una asociación
completa al alelo RN^{-} en este material dado que todos los
animales RN^{-} (RN^{-}/ RN^{-} o RN^{-}/rn^{+}) eran
homocigotos o heterocigotos para este alelo mientras que ningún
animal rn^{+} (rn^{+}/rn^{+}) portaba este alelo, como se
muestra en la Tabla 5 siguiente.
La mutación RN^{-} inactiva un sitio
BsrBI GAG^CGG/CTC^GCC (el sitio BsrBI no es
palindrómico). En este sitio, la secuencia de RN^{-} es AAGCGG en
lugar de GAGCGG.
Un fragmento largo de 134 pb del gen RN se
amplifica a partir de ADN genómico porcino. El alelo rn^{+} se
identifica después de digestión con BsrBI, mediante la
detección de dos fragmentos de 83 y51 pbs.
El ensayo se lleva a cabo como sigue:
1º Secuencias de cebador:
Secuencia de cebadores usados para amplificar la
región de la mutación RN:
RNU: 5' GGGAACGATTCACCCTCAAC
3'
RNL: 5' AGCCCCTCCTCACCCACGAA
3'
Para proporcionar un control interno de la
digestión, se ha añadido un sitio BsrBI en el extremo de uno
de los dos cebadores en una larga cola de 20 pb. La cola permite
tanto la creación de un sitio BsrBI (una cola más corta
podría ser suficiente), y una discriminación fácil del fragmento
sin cortar de los otros fragmentos. El uso de cebadores con cola no
afecta a la eficacia y a la especificidad de la amplificación.
La secuencia del cebador RNL modificado que
incluye una cola control con un sitio BsrBI es:
RNLBsrA14: 5'
A_{5}C_{2}A_{7}CCGCTCAGCCCCTCCTCACCCACGAA
3'
2º Mezcla de reacción PCR usada:
- 50 ng ADN
- 0,5 Unidades Taq polimerasa (GIBCO BRL)
- MgCl_{2}1,5 mM
- dNTP 200 mM
- cada cebador 0,2 \muM
- Volumen de reacción total: 25 \mul
3º Condiciones de PCR usadas (en termociclador
OMNIGENE HYBAID):
- 1x (5min 95ºC)
- 35x (45 segundos, 57ºC, 45 segundos, 72ºC, 45 segundos, 95ºC)
- 1x (45 segundos, 57ºC, 15 minutos, 72ºC)
4º Digestión de la enzima de restricción
realizada a 37ºC durante 2 horas:
- 10 \mul de producto PCR
- 1x tampón BsrBI BIOLABS
- 5 U de enzima de restricción BsrBI (BIOLABS)
- Volumen de reacción total: 15\mul
5º Tamaño de los fragmentos producidos después de
la PCR usando cebadores con cola de control y digestión con
BsrBI:
- Fragmento sin cortar del alelo RN^{-} o rn^{+}: 154 pb
- Después de la digestión del fragmento amplificado a partir del alelo RN^{-}: 137 pb + 17 pb
- Después de la digestión del fragmento amplificado a partir del alelo rn^{+}: 83 pb + 54 pb+ 17 pb
- Se puede identificar la diferencia de tamaños tanto después de electroforesis en gel de poliacrilamida como de agarosa/NUSIEVE o de agarosa.
\newpage
Adicionalmente, se analizó el polimorfismo V40I
(que se refiere a la posición 40 de la SEQ ID NO:2) en un conjunto
de 181 animales homocigotos rn^{+}/rn^{+} (R/R en la posición 41
de la SEQ ID NO:2) mediante PCR-RFLP usando la
enzima de restricción Fokl. El potencial glicolítico se
determinó en paralelo según el procedimiento desvelado por MONIN
y col., (Meat Science, 13, 49-63, 1985).
Los resultados se muestran en la Tabla 6
siguiente:
Estos resultados muestran que el polimorfismo
V401 tiene un efecto importante en el potencial glicolítico en el
músculo esquelético.
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE
AGRONOMIQUE
\hskip1cmMILAN, Denis
\hskip1cmANDERSSON, Leif
\hskip1cmLOOFT, Christian
\hskip1cmROBIC, Annie
\hskip1cmROGEL-GAILLARD, Claire
\hskip1cmIANNUCCELLI, Natalie
\hskip1cmGELLIN, Joel
\hskip1cmKALM, Ernst
\hskip1cmLE ROY, Pascale
\hskip1cmCHARDON, Patrick
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VARIANTES DE LA CADENA GAMMA DEL
AMPK, SECUENCIAS DE ADN QUE LA CODIFICAN, Y USOS DE ÉSTA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPcb539-99
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 99402236.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-09-10
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 00401388.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-05-18
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1867
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (472)..(1389)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (472)..(1389)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaatttcaa gtcagccaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcaaaaga ccgtgctact
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgggaacct ctatatgctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagggaaata caaatcacag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccagctca caggatgaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtttctgcag ctttagcatc tattcc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagtatcct gggcttctga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtttctccag gtttccagac atccac
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttctgtct gcccctactt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtttctaagt tctactgtaa gacacc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagctgtg gtggctgaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcacagca gtgccaccta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaactcttc taggcgtgt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtttctggaa cttccatatg ccatgg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggtggatg gtaggcttca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctcgctcc tgaaggaagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcacgtgg ccatgctatc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcaactgga ttgagtcagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggcgcaac tgttatttct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggcaaagga agagcacag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccgtgggc atcgttgg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaaggagac agacagggcga
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1873
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1395)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1395)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2022
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 514
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus Scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
Claims (32)
1. Una subunidad gamma de una kinasa activada por
AMP de vertebrado (AMPK), en la que dicha subunidad gamma es un
polipéptido que comprende al menos una secuencia que tiene al menos
el 70% de identidad con el polipéptido SEQ ID NO:2.
2. Un polipéptido de la reivindicación 1, en el
que dicho polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos el
95% de identidad con el polipéptido SEQ ID NO:2.
3. Un polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho polipéptido comprende la
secuencia SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4.
4. Un polipéptido que es un mutante alterado
funcionalmente de una subunidad gamma de una kinasa activada por AMP
de vertebrado, en el que dicha alteración funcional deriva de una
mutación situada en la región del primer dominio CBS de dicha
subunidad gamma alineada con la región de un polipéptido de SEQ ID
NO:2 que se expande del residuo 30 al residuo 50.
5. Un polipéptido de la reivindicación 4, en el
que la mutación es una sustitución R\rightarrowQ o una sustitución
V\rightarrowI.
6. Un polipéptido de la reivindicación 5
seleccionado entre:
- un polipéptido que tiene una secuencia que
deriva de una sustitución R\rightarrowQ en una posición que
corresponde a la posición 41 en la SEQ ID NO:2;
- un polipéptido que tiene una secuencia que
deriva de una sustitución V\rightarrowI en una posición que
corresponde a la posición 40 en la SEQ ID NO:2.
7. Un ácido nucleico aislado seleccionado
entre:
a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;
b) un ácido nucleico según a), que comprende
adicionalmente hasta 500 kb de una secuencia de ADN genómico
adyacente 3' y/o 5'.
c) el complemento de un ácido nucleico según a) o
b).
8. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación
7 seleccionado entre:
a) un ácido nucleico que tiene cualquiera de las
secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3;
b) el complemento de un ácido nucleico a).
9. Un fragmento de ácido nucleico seleccionado
entre:
a) un fragmento específico de al menos 15 pb de
la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No.1 o SEQ ID No.3, o el
complemento de éstos.
b) un fragmento de ácido nucleico de al menos 15
pb que hibrida específicamente bajo condiciones restrictivas con la
secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID No.1 o la SEQ ID No.3, o
con el complemento de éstas; siempre que dicho fragmento de ácido
nucleico no esté formado por el EST GENBANK AA178898 o por el EST
GENBANK W94830.
10. Un vector recombinante que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Una célula huésped transformada mediante un
vector recombinante de la reivindicación 10.
12. Un animal no humano transgénico que comprende
un transgen que codifica un polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
13. Un animal no humano
knock-out, en el que el gen que codifica un
polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 se ha
inactivado mediante knock-out.
14. Un AMPK heterotrimérico en el que la
subunidad \gamma está formada por un polipéptido de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6.
15. Un procedimiento in vitro de detección
de una alteración metabólica a partir de una mutación en un gen que
codifica una subunidad \gamma del AMPK, en el que dicho
procedimiento comprende comprobar la presencia, en una muestra de
ácido nucleico de un vertebrado, de una secuencia de ácido nucleico
que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1
a 6, en el que dicho polipéptido está funcionalmente alterado.
16. Un procedimiento de la reivindicación 15, en
el que dicha alteración funcional deriva de una mutación situada en
la región del primer dominio CBS de dicha subunidad gamma alineada
con la región de un polipéptido de SEQ ID NO:2 que se extiende desde
el residuo 30 hasta el residuo 50.
17. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16 en el que dicha alteración está relacionada
con una acumulación de glicógeno alterada en las células musculares
y deriva de la expresión de un alelo alterado funcionalmente de un
polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
18. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17 en el que la presencia del ácido nucleico
que codifica dicho polipéptido mutante se comprueba haciendo
contactar dicha muestra de ácido nucleico con una sonda de ácido
nucleico obtenida de un ácido nucleico de la reivindicación 10 y que
se expande en dicha mutación, bajo condiciones de hibridación
específica entre dicha sonda y la secuencia mutante que se va a
detectar, y detectando el complejo de hibridación.
19. Un procedimiento para obtener un par de
cebadores que permitan detectar un marcador polimórfico genético
unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho
procedimiento comprende:
- cribar una biblioteca de ADN genómico de un
vertebrado con una sonda específica para una secuencia de ácido
nucleico que codifica un polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, para seleccionar clones que comprenden al
menos una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y hasta 300
kb de una secuencia cromosómica flanqueante 3' y/o 5'.
- identificar un locus polimórfico en dichas
secuencias cromosómicas flanqueantes, y secuenciar un segmento de
ADN que comprende dicho locus polimórfico.
- diseñar pares cebadores que flanquean dicho
locus polimórfico.
20. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19 en el que el vertebrado es un mamífero.
21. Un procedimiento de la reivindicación 20 en
el que dicho mamífero es un cerdo.
22. Un procedimiento in vitro para
detectar una disfunción del metabolismo de los carbohidratos que
deriva de la expresión de un alelo alterado funcionalmente de un
polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un
vertebrado, en el que dicho procedimiento comprende:
- obtener un par de cebadores mediante el
procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21,
- hacer contactar una muestra de ADN genómico de
dicho vertebrado con dicho par de cebadores bajo condiciones que
permiten la amplificación por PCR;
- analizar el producto de la PCR para detectar si
está presente un alelo de un marcador polimórfico unido a una
secuencia de ácido nucleico que codifica un alelo alterado
funcionalmente de un polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
23. Un procedimiento de la reivindicación 22, en
el que dicho polipéptido alterado funcionalmente deriva de una
sustitución R41Q en la SEQ ID NO:2.
24. Un procedimiento de la reivindicación 22, en
el que dicho polipéptido alterado funcionalmente deriva de una
sustitución V40I en la SEQ ID NO:2.
25. Un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho vertebrado es un
mamífero.
26. Un procedimiento de la reivindicación 25 en
el que dicho mamífero es un cerdo.
27. Un procedimiento in vitro para
detectar una disfunción del metabolismo de los carbohidratos que
deriva de la expresión de un alelo alterado funcionalmente de un
polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un
vertebrado, en el que dicho procedimiento comprende:
- hacer contactar una muestra de ADN genómico de
dicho vertebrado con un par de cebadores seleccionados entre:
- * un par de cebadores formados por la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 18;
- * un par de cebadores formados por la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22
- bajo condiciones que permiten la amplificación por PCR;
- analizar el producto de la PCR para detectar si
está presente un alelo de un marcador polimórfico unido a una
secuencia de ácido nucleico que codifica un alelo alterado
funcionalmente de un polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
28. El uso de una célula transformada de la
reivindicación 11 para comprobar la capacidad de compuestos de
ensayo para modular la actividad AMPK.
29. El uso de un animal transgénico no humano de
la reivindicación 12 para comprobar la capacidad de compuestos de
ensayo para modular la actividad AMPK.
30. Es uso de un animal knock-out
no humano de la reivindicación 13 para comprobar la capacidad de
compuestos de ensayo para modular el metabolismo de la energía en
ausencia de un polipéptido funcional de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
31. El uso de un AMPK heterotrimérico de la
reivindicación 14 para comprobar la capacidad de compuestos de
ensayo para modular la actividad AMPK.
32. El uso de un polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 para preparar un anticuerpo dirigido contra
dicho polipéptido.
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| EP99402236 | 1999-09-10 | ||
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