CN104894239B - 一种用AMPKγ基因评价昆虫发育速率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用AMPKγ基因评价昆虫发育速率的方法。本发明公开了检测AMPKγ基因表达量的物质在评价昆虫发育速率中的应用。所述检测AMPKγ基因表达量的物质具体为由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成的引物对。采用本发明提供的引物对及方法评价昆虫发育速率仅需2‑3天，而用传统的生物学方法需要30‑60天左右。本发明提供的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适合于在昆虫商品检验检测中推广应用。

Description

一种用AMPKγ基因评价昆虫发育速率的方法
技术领域
本发明属于生物技术、昆虫分子生态学领域，涉及一种用AMPKγ基因评价昆虫发育速率的方法。
背景技术
适温区内温度与昆虫生长发育在生态学上常用发育历期或发育速率作为生长发育速率的指标。发育历期是指完成一定发育阶段(一个世代、一个虫期或一个龄期)所经历的天数，发育速率则指一天所完成的发育速度，为发育历期的倒数即，V＝1/N式中：V为发育速率N为发育历期。
温度与生物生长发育的关系,比较集中地反映在温度对植物和变温动物(特别是昆虫)发育速率的影响上，昆虫的生长发育速率是评价害虫生长发育的重要指标，昆虫作为变温动物,对温度变化更为敏感。目前昆虫学领域集中于研究温度变化对昆虫生长、发育的影响。目前已构建了多个描述温度与昆虫增长速率的关系模型,用于解释温度对昆虫发育速率的影响。在一定条件下的昆虫发育速率反映昆虫对所处环境条件(温度，栖境)的适合度，也是害虫栖息地风险评价、害虫监测预警和害虫宜生区划分的重要依据。
昆虫生活的生境往往具有物种偏好性，生境为昆虫提供了食物、生态位和栖息环境，良好的栖息地是昆虫分布和繁盛的根本，因此，评价昆虫在生境中的生长发育速率和对生境的适合度尤为重要。
目前，昆虫生长发育速率大多数的评价主要集中在用昆虫生态学数据和指标来评价，评价内容多，用时较长，一般需要昆虫种群的1-2代，耗时长、所需人力物力多，费用高，因此，需要建立一种快速预测和判断昆虫发育的方法，突破对有效积温的研究的局限性。
AMPKγ即AMP依赖的蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子。它表达于各种代谢相关的器官中，能被机体各种刺激激活，包括细胞压力、运动和很多激素及能影响细胞代谢的物质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是评价昆虫的发育速率。
为了解决以上技术问题，本发明提供检测AMPKγ基因表达量的物质在评价昆虫发育速率中的应用。
上述应用中，所述检测AMPKγ基因表达量的物质包含如下(1)-(6)所示的产品中的至少一种：
(1)成套DNA分子，由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成；
(2)成套DNA分子组合物，由(1)所述的成套DNA分子和扩增所述昆虫的持家基因的成套DNA分子组成；
(3)含有(1)所述的成套DNA分子的试剂盒；
(4)含有(2)所述的成套DNA分子组合物的试剂盒；
(5)AMPKγ；
(6)AMPKγ基因。
所述SEQ ID No.1所示的DNA分子和所述SEQ ID No.2所示的DNA分子可以混合包装也可以独立包装，将该成套DNA分子称为成套DNA分子B。
所述成套DNA分子用于扩增所述昆虫的AMPKγ基因或其部分片段。
所述(1)所述的成套DNA分子(成套DNA分子B)和所述扩增所述昆虫的持家基因的成套DNA分子独立包装。
上述应用中，所述扩增所述昆虫的持家基因的成套DNA分子为如下A所示的成套DNA分子：
A、由SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的成套DNA分子。
所述SEQ ID No.5所示的DNA分子和所述SEQ ID No.6所示的DNA分子可以混合包装也可以独立包装。
所述AMPK的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述AMPKγ基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示。AMPKγ的全称为腺苷酸活化蛋白激酶。
所述昆虫可以为昆虫个体或昆虫群体。
所述昆虫可以为亚洲小车蝗。
为了解决以上技术问题，本发明还提供评价昆虫发育速率的方法，包括如下步骤：检测名称为A生境和B生境的两种生境中的同一种待测昆虫的AMPKγ基因表达量，如果A生境的所述待测昆虫的AMPKγ基因表达量高于B生境的所述待测昆虫的AMPKγ基因表达量，则所述待测昆虫在A生境中的发育速率低于或候选低于所述待测昆虫在B生境中的发育速率。
所述待测昆虫的AMPKγ基因表达量的检测方法包括如下步骤：以所述待测昆虫的cDNA为模板，以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物，进行实时荧光定量PCR，得到所述待测昆虫的AMPKγ基因表达量。
所述实时荧光定量PCR的内参基因具体为延伸因子基因EF基因。所述实时荧光定量PCR中，用SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的引物对扩增所述延伸因子基因EF基因。
所述AMPK的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述AMPKγ基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
所述昆虫可以为昆虫个体或昆虫群体。
所述昆虫可以为亚洲小车蝗。
为了解决以上技术问题，本发明还提供成套DNA分子，由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成；
或，
为了解决以上技术问题，本发明还提供成套DNA分子组合物，由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成的成套DNA分子(成套DNA分子B)和扩增昆虫的持家基因的成套DNA分子组成。
所述SEQ ID No.1所示的DNA分子和所述SEQ ID No.2所示的DNA分子可以混合包装也可以独立包装，将该成套DNA分子称为成套DNA分子B。
所述扩增昆虫的持家基因的成套DNA分子具体为如下A所示的成套DNA分子：
A、由SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的成套DNA分子。
所述成套DNA分子B和所述扩增昆虫的持家基因的成套DNA分子独立包装。
所述SEQ ID No.5所示的DNA分子和所述SEQ ID No.6所示的DNA分子可以混合包装也可以独立包装。
所述昆虫可以为昆虫个体或昆虫群体。
所述昆虫可以为亚洲小车蝗。
上述成套DNA分子或上述成套DNA分子组合物可用于评价昆虫的发育速率。
所述昆虫可以为昆虫个体或昆虫群体。
所述昆虫可以为亚洲小车蝗。
为了解决以上技术问题，本发明还提供评价昆虫发育速率的试剂盒，该试剂盒包含所述的成套DNA分子；
或，
为了解决以上技术问题，本发明还提供评价昆虫发育速率的试剂盒，该试剂盒包含所述的成套DNA分子组合物。
上述任一所述的试剂盒还包含记载在可读载体上的使用说明，说明中记载的内容为上述任一所述的方法。
所述昆虫可以为昆虫个体或昆虫群体。
所述昆虫可以为亚洲小车蝗。
为了解决以上技术问题，本发明还提供上述任一所述的方法或或检测AMPKγ基因表达量的物质在如下A-G任一所示中的应用：
A、昆虫的栖息地风险评价；
B、昆虫监测预警；
C、昆虫宜生区划分；
D、评价昆虫生活环境的恶化情况；
E、鉴定或辅助鉴定昆虫对环境的适应程度；
F、鉴定或辅助鉴定昆虫在生境中的发育速率；
G、鉴定或辅助鉴定昆虫在生境中的抗逆性。
所述昆虫可以为昆虫个体或昆虫群体。
所述昆虫具体为亚洲小车蝗。
所述检测AMPKγ基因表达量的物质具体包含如下(1)-(6)所示的产品中的至少一种：
(1)成套DNA分子，由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成；
(2)成套DNA分子组合物，由(1)所述的成套DNA分子和扩增所述昆虫的持家基因的成套DNA分子组成；
(3)含有(1)所述的成套DNA分子的试剂盒；
(4)含有(2)所述的成套DNA分子组合物的试剂盒；
(5)AMPKγ；
(6)AMPKγ基因。
所述SEQ ID No.1所示的DNA分子和所述SEQ ID No.2所示的DNA分子可以混合包装也可以独立包装，将该成套DNA分子称为成套DNA分子B。
所述成套DNA分子用于扩增所述昆虫的AMPKγ基因或其部分片段。
所述(1)所述的成套DNA分子(成套DNA分子B)和所述扩增所述昆虫的持家基因的成套DNA分子独立包装。
所述扩增所述昆虫的持家基因的成套DNA分子具体为如下A所示的成套DNA分子：
A、由SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的成套DNA分子。
所述SEQ ID No.5所示的DNA分子和所述SEQ ID No.6所示的DNA分子可以混合包装也可以独立包装。
所述AMPK的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述AMPKγ基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
上述任一所述的发育速率是指昆虫个体在一定生境环境中，能生存并传递其基因于下代的能力，发育速率可以通过待测昆虫的发育历期来体现。
本发明的实验证明，可以通过检测AMPKγ基因表达量来评价昆虫发育速率，特别是不同生境中的亚洲小车蝗的发育速率。
采用本发明提供的引物对及方法评价昆虫发育速率仅需2-3天，而用传统的生物学方法需要30-60天左右。本发明提供的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适合于在昆虫商品检验检测中推广应用。
附图说明
图1为亚洲小车蝗EF内参扩增曲线。
图2为亚洲小车蝗EF内参融解曲线。
图3为亚洲小车蝗AMPKγ基因扩增曲线。
图4为亚洲小车蝗AMPKγ基因融解曲线。
图5为亚洲小车蝗在不同生境中的发育速率。
图6为AMPKγ基因相对表达量与发育速率之间回归直线(P<0.05)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于扩增AMPKγ基因的引物的设计与合成
根据亚洲小车蝗的AMPKγ基因设计并合成如下用于扩增该基因部分片段的引物：
上游引物AMPKγ-F：5’-CTGAAGGACCAGGTGAAGC-3’(SEQ ID No.1)；
下游引物AMPKγ-R：5’-CTTTGGCAGGTCGTTGATA-3’(SEQ ID No.2)。
亚洲小车蝗的AMPKγ基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其AMPKγ的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
实施例2、检测亚洲小车蝗的发育速率
一、将亚洲小车蝗(Oedaleus decorus asiaticus Bei—Bienko,1941)根据其生境的不同分为如下四组：
I组：糙隐子草群系中的亚洲小车蝗；
II组：羊草群系中的亚洲小车蝗；
III组：克氏针茅群系中的亚洲小车蝗；
IV组：冷蒿群系中的亚洲小车蝗；
上述各组的亚洲小车蝗均为20只，一直到亚洲小车蝗自然死亡。
上述各组的生境类型(如糙隐子草群系、羊草群系、克氏针茅群系和冷蒿群系)为调查不同生境中植物的多样性，高度，盖度，密度，昆虫多样性等划分的生境类型。
二、分别提取I组、II组、III组和IV组各组的亚洲小车蝗的RNA，并反转录分别得到I组、II组、III组和IV组各组的亚洲小车蝗的cDNA。
三、实时荧光定量PCR扩增
分别以步骤二得到的I组、II组、III组和IV组各组的亚洲小车蝗的cDNA为模板，以实施例1合成的上游引物AMPKγ-F和下游引物AMPKγ-R为引物，按照SYBR(R)Green INucleic A kit(Invitrogen产品，产品目录号为S7567)说明书进行RT-PCR，检测各组亚洲小车蝗的AMPKγ基因的相对表达量，以亚洲小车蝗延伸因子EF基因(延伸因子基因)作为内参基因，扩增该内参基因的引物为上游引物EF-F和下游引物EF-R。
上游引物EF-F：5’-AGAACGGACAAACTCGTGAGC-3’(SEQ ID No.5)；
下游引物EF-R:5’-AATAGGAACAAAGGCAACAGC-3’(SEQ ID No.6)。
以上RT-PCR反应体系如表1所示，RT-PCR反应条件如表2所示。
表1 RT-PCR反应体系
表2 RT-PCR反应条件
RT-PCR扩增结果如图1-图4所示。
以上RT-PCR实验重复三次。
图1为四组亚洲小车蝗EF内参扩增曲线；图2为四组亚洲小车蝗EF内参融解曲线；图3为四组亚洲小车蝗AMPKγ基因扩增曲线；图4为四组亚洲小车蝗AMPKγ基因融解曲线。图1和图3中，1代表I组，2代表II组，3代表III组，4代表IV组。
图1和图3表明，RT-PCR扩增曲线平滑，重复性好。图2和图4表明，RT-PCR溶解曲线呈单一峰，说明没有非特异性扩增，荧光定量结果准确。
各组亚洲小车蝗EF内参基因ct值如表3所示。
表3各组亚洲小车蝗EF内参基因的ct值
基因名称 组别 ct1 ct2 ct3 平均ct
EF I组 18.930 18.864 19.369 19.055
EF II组 19.318 19.079 19.039 19.145
EF III组 17.907 18.164 18.233 18.101
EF IV组 18.425 18.367 18.297 18.363
亚洲小车蝗中AMPKγ基因定量结果如表4所示。
表4各组亚洲小车蝗AMPKγ基因定量结果
表3和表4中的ct1、ct2和ct3分别为第一次、第二次和第三次RT-PCR实验得到的ct值，表4中，2-ΔCT为AMPKγ基因的相对表达量。
四、亚洲小车蝗发育速率的判断
亚洲小车蝗发育速率的判断标准如下：如果A生境的亚洲小车蝗的AMPKγ基因平均表达量高于B生境的亚洲小车蝗的AMPKγ基因平均表达量，则亚洲小车蝗在A生境中的发育速率低于亚洲小车蝗在B生境中的发育速率。
结合上述亚洲小车蝗发育速率的判断标准及表4，得到如下结论：
与II组相比，I组的AMPKγ基因的平均表达量明显下调。与III组相比，IV组的AMPKγ基因的平均表达量明显上调。根据各组的AMPKγ基因的平均表达量可以得出，亚洲小车蝗在糙隐子草群系的发育速率大于亚洲小车蝗在羊草群系的发育速率，亚洲小车蝗在羊草群系的发育速率小于亚洲小车蝗在克氏针茅群系的发育速率，亚洲小车蝗在克氏针茅群系的发育速率大于亚洲小车蝗在冷蒿群系的发育速率。
五、同时通过传统的生物学方法(调查生命表的方法)每天统计I组、II组、III组和IV组的亚洲小车蝗的发育历期，一直到亚洲小车蝗自然死亡，得到各组亚洲小车蝗发育速率由大到小为：I组亚洲小车蝗的发育速率大于II组亚洲小车蝗的发育速率，II组亚洲小车蝗的发育速率小于III组亚洲小车蝗的发育速率，III组亚洲小车蝗的发育速率大于IV组亚洲小车蝗的发育速率。由此得到，亚洲小车蝗在糙隐子草群系的发育速率大于亚洲小车蝗在羊草群系的发育速率，亚洲小车蝗在羊草群系的发育速率小于亚洲小车蝗在克氏针茅群系的发育速率，亚洲小车蝗在克氏针茅群系的发育速率大于亚洲小车蝗在冷蒿群系的发育速率。
亚洲小车蝗在不同生境中的发育速率如图5所示。
以上实验证实，本发明的检测方法得到的判断结果(步骤四所示的判断结果)与用传统生物学方法检测得到的结果相一致，证明本发明提供的方法(步骤一至四所述的方法)的正确性，采用本发明提供的方法可以快速检测不同生境中的亚洲小车蝗的AMPKγ基因的表达量的变化，并结合本发明提供的亚洲小车蝗发育历期的判断标准，可以来判断亚洲小车蝗活体种群的环境恶化情况和发育速率的差异。
AMPKγ基因相对表达量与发育速率之间回归直线见图6。
本发明提供的评价昆虫发育速率的方法总结如下：检测名称为A生境和B生境的两种生境中的同一种待测昆虫的AMPKγ基因表达量，如果A生境的待测昆虫的AMPKγ基因表达量高于B生境的待测昆虫的AMPKγ基因表达量，则待测昆虫在A生境中的发育速率低于待测昆虫在B生境中的发育速率。其中检测名称为A生境和B生境的两种生境中的同一种待测昆虫的AMPKγ基因表达量的方法包括如下步骤：以待测昆虫的cDNA为模板，以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物，进行实时荧光定量PCR，得到待测昆虫的AMPKγ基因表达量。

Claims (1)

1.一种评价昆虫发育速率的方法，包括如下步骤：检测名称为A生境和B生境的两种生境中的同一种待测昆虫的AMPKγ基因表达量，如果A生境的所述待测昆虫的AMPKγ基因表达量高于B生境的所述待测昆虫的AMPKγ基因表达量，则所述待测昆虫在A生境中的发育速率低于或候选低于所述待测昆虫在B生境中的发育速率；
所述待测昆虫的AMPKγ基因表达量的检测方法包括如下步骤：以所述待测昆虫的cDNA为模板，以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物，进行实时荧光定量PCR，得到所述待测昆虫的AMPKγ基因表达量；
所述实时荧光定量PCR的内参基因为EF基因；所述实时荧光定量PCR中，用SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子组成的引物对扩增所述EF基因；
所述昆虫为亚洲小车蝗；
所述生境为糙隐子草群系、羊草群系、克氏针茅群系或冷蒿群系。
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WO2001020003A2 (en) * 1999-09-10 2001-03-22 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Variants of the gamma chain of ampk, dna sequences encoding the same, and uses thereof

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