CN105483222A - 一种鸭源性成分微滴数字pcr绝对定量检测试剂盒 - Google Patents

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刘静秋
王莹
马付坤
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Abstract

本发明涉及一种鸭源性成分微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，其主要由微滴数字PCR检测试剂和若干个微滴发生卡组装而成，其中微滴数字PCR检测试剂用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签标示名称、批号、生产日期、有效期。本发明提供的试剂盒有更高的灵敏度、准确度、精确性、重复性，可直接定量，无需标准曲线。对造假制品能有效检测,是一种快速、敏感、准确的鸭源性成分检测用试剂盒和检测方法。

Description

一种鸭源性成分微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种鸭源性成分微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
鸭源性成分(Duck-derivedmaterials)鸭种属DNA片段。
市场销售的牛羊肉及肉制品中,很多都掺杂鸭肉,冒充牛羊肉进行销售,为弥补羊肉味不足,有的甚至掺入羊肉粉、羊肉精膏等添加剂来粉饰其掺假行为,市场上出现了名副其实的“挂羊头卖鸭肉”等严重掺假造假行为,拿鸭肉添加羊肉香精,制成羊肉去欺骗消费者,这既违反相关规定,更是一种商业欺诈。
肉类掺假、掺杂是食品工业中的重要问题,针对当前状况,很多部门诸如工商、药监和质监等部门需要对市场中可疑样品进行检测,但目前肉制品中鸭源性检测方法还未建立起来,无相关检测方法标准,满足不了需求,迫切需要建立该方面相关标准,为肉制品中掺假鉴定及责任追查提供技术支持及法律依据,为肉制品中是否含有鸭源性成分提供检测方法和标准依据。
目前领先的DNA基因检测手段是PCR(聚合酶链式反应)技术。动物源性成分检测的原理也是基于利用不同动物DNA的唯一性,从而采用聚合酶链式反应技术,迅速准确地鉴定产品中是否含有特定动物源性成分。PCR动物源性成分鉴定的应用领域非常广泛,除鉴别肉制品掺假、甄别饲料中是否含有动物源性成分有效防止疾病传播外,还可以对保健品成分中的动物来源鉴定等。
目前动物源性成分检测范围涵盖牛、羊、猪、狗、鸡、马、驴鹿、兔、骆驼等动物种类。但目前国内外无鸭源性成分检测方法标准。
为了对掺假造假制品有效检测,建立快速、敏感、准确的鸭源性成分检测方法是十分必要的。近年荧光PCR技术在掺假鉴别等检测领域得到广泛的应用,它利用PCR技术对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性,克服了组织鉴定和普通PCR方法的不足,但是荧光PCR技术的检测下限仍很低，不能检测出微量的掺假样品，所以提出了数字PCR的概念。
数字化PCR的概念早在1999年就由BertVogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution，有些文献上也称partition)。
如今，数字PCR技术的浪潮已经来临，Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎。
由于扩增前的微滴化处理步骤，使得该技术能够以绝对定量的方式直接“数”出靶分子的个数，因此特别适用于依靠传统定量PCR方法不能很好达到分辨效果的应用领域：拷贝数变异、微量核酸的检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序文库定量与结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等，对遗传病、癌症、传染病的研究提供了一种全新的技术思路与手段。需要指出的是，定量PCR检测灵敏度的极限一般在1％，而QX200数字化PCR的检测灵敏度可达0.001％，在这个意义上实现所谓的痕量检测。故QX200系统应用于出入境检验检疫领域，如在转基因作物检测、包括各种掺假鉴别的检测等方面同样提供了创新的技术方法和完美的解决方案。是一种很有应用价值的诊断方法。
发明内容
本发明解决的技术问题就是，提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单、可以同时检测痕量鸭源性成分的微滴式数字PCR绝对定量的检测。
本发明首先提供一种鸭源性成分微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，其主要由微滴数字PCR检测试剂和若干个微滴发生卡胶垫组装而成，其中微滴数字PCR检测试剂包括以下试剂(所述试剂用合适的外包装盒包装，贴标签标示名称、批号、生产日期、有效期)：
溶液A：RNaseFreedH2O，1支，1mL；溶液B：ddPCR探针法预混液，一支，900μL；溶液C：探针法ddPCR微滴发生油，一支，3.5ml；溶液D：2XddPCR探针法质控液，2ml；溶液E：阳性对照，一支，40μL；溶液F：阴性对照，一支，40μL；使用基因组DNA为阳性模板，使用0.01MpH8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释后冷冻保存；将检验合格的阳性对照制剂按400μL定量分装；使用RNaseFreedH2O为阴性对照；
其中ddPCR探针法预混液其900μL的组成为：500μL的2XddPCRSupermixforprobes，上、下游引物分别为90μL，特异探针为30μL，引物和探针的浓度均为10μM，RNaseFreedH2O190μL；
其中上、下游引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；
特异探针的序列如SEQIDNO:3所示：
SEQ ID NO:1 AAG CCT TCC TCT AGC TCA GC
SEQ ID NO:2 AGA AAA TGC TTT AGT TAA GTC
SEQ ID NO:3 FAM-CTC AGC CGC TTA AAC AAC GC-TAMRA
在此基础上，本发明继续提供一种鸭源性成分微滴数字PCR绝对定量检测方法，采用所述的试剂盒进行微滴数字PCR定量检测。
具体包括步骤：
(1)制备ddPCR反应液，总体积20μL，向扩增管中加入下列反应物：ddPCR探针法预混液，18μL；DNA模板，2μL；
空白对照：以RNaseFreedH2O代替模板，同样条件下扩增；
(2)取微滴发生卡置于卡托中固定，将20μL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL1×溶液D补足；
(3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，同样不能有空着的孔；盖上胶垫密封；
(4)将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；
(5)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，缓慢吸取40μL，再打入96孔板相应位置孔内；
(6)封好膜之后在96孔PCR仪内进行PCR反应，升降温速度≤2.5℃/s；
(7)将完成PCR的96孔板放入plateholder中组装好，之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中；
(8)打开QuantaSoft软件进行检测分析。
其中所述步骤(2)中使用8通道20μL排枪和20μL枪头，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。所述步骤(5)中使用8通道100μL排枪和100μL枪头，加样时枪头接近微滴发生卡底部，缓慢吸出液体，转移至96孔板时，不贴壁，缓慢打入孔内，避免破坏生成的微滴。
其中所述步骤(6)中的PCR反应条件为：
本发明提供的试剂盒有更高的灵敏度、准确度、精确性、重复性，可直接定量，无需标准曲线。对造假制品能有效检测,是一种快速、敏感、准确的鸭源性成分检测用试剂盒和检测方法。
在本发明中,对所设计引物及探针进行特异性预测及实际检验,结果表明所应用引物与常见畜禽物种间无同源性,引物具有较大特异性。另外,采用50mg/kg羊肉DNA溶液对鸭肉DNA进行稀释,结果表明:较大浓度羊肉DNA的存在不影响鸭肉灵敏度测试,灵敏度可达0.1μg/kg,能够满足实际检测需要。另外,肉制品由于加工等工艺原因,DNA会受到影响,特别是加热时DNA片段会变短,因此,引物设计时所要扩增的目的片段要求较短。本发明中设计的引物所扩增的目的片段较短,适于对加工的肉制品中添加的鸭源性成分进行检测。本发明中所采用方法可应用于肉制品掺假诊断、食品生产环节污染监控及食品监督部门检测等各个领域,可以为食品中掺假造假检测提供技术支持,同时为食品安全工作顺利开展打下良好技术基础。
具体实施方式
下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1引物及探针的设计与筛选
1、本发明引物、探针设计：购置市售肉鸭2种、麻鸭1种、野鸭1种，根据Genbank已发表的鸭(Anasplatyrhynchos)线粒体基因组序列(HM010684.1)设计用于扩增鸭细胞色素b基因813bp部分序列(61-873)的通用引物，分别提取不同品种鸭肉的总DNA作为模板，，进行适用于ddPCR的特异性引物和的设计。本实施例给出了筛选最佳引物的过程，选择用软件设计出的其中几对备选引物进行筛选，备选引物如下，见表1。
表1
2、引物的筛选
(1)引物随机配为四对：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2；
(2)然后用染料法做荧光定量PCR，PCR体系配方：2XSYBRGreenSupermix10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，RNaseFreedH2O3μL，阳性模板5μL。PCR的扩增程序为95℃预变性10min；94℃变性30sec，57℃退火60sec，共40个循环；65℃—95℃每5秒升高0.5℃溶解曲线，结束反应。
(3)结果分析，选择没有非特异性扩增的引物对F2R2。
3、探针的筛选
(1)引物探针的组合为：1、F2R2+P1，2、F2R2+P2
(2)然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2XddPCRSupermixforprobes10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，探针0.5μL，RNaseFreedH2O3.5μL，阳性模板4μL，总体积20μL(引物和探针的浓度均为10μM)。然后生成微滴。
(3)上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为95℃预变性10min；94℃变性30sec，55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
(4)分析结果：根据实验结果选择F2R2+P2引物探针组合。
实施例2在ddPCR平台上检测鸭源性成分的PCR方法退火温度的优化。
1、选择引物探针的组合为：F2R2+P2。
2、然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2XddPCRSupermixforprobes10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，探针0.5μL，RNaseFreedH2O3.5μL，阳性模板4μL，总体积20μL(引物和探针的浓度均为10μM)。做8个复孔，然后生成微滴。
3、上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为95℃预变性10min；94℃变性30sec，50～60℃(仪器自动分布8个温度梯度)退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
4、分析结果：根据实验结果选择55～58℃的退火温度。
实施例3引物、探针浓度的优化实验
设计引物探针浓度均为10μM,组合为F2R2P2,体系配置方法见表2。
表2
然后在ddPCR平台上生成微滴，转移到96孔板内，封铝膜。
上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为95℃预变性10min；94℃变性30sec，58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
分析结果：根据实验结果选择F2R2+P2引物探针配方：引物分别为1.8μL，探针为0.6μL。
实施例4PCR扩增升降温速度的优化实验
1、然后在ddPCR平台上，引物探针组合F2R2+P2(浓度为10μM),用ddPCR体系配方：2XddPCRSupermixforprobes10μL，上游引物，下游引物分别为1.8μL，探针为0.6μL，RNaseFreedH2O3.8μL，阳性模板2μL，总体积20μL。每台仪器做4个复孔。然后生成微滴，转移到PCR小管内。
2、在两台同样的PCR仪平台上扩增，PCR的扩增程序为95℃预变性10min；94℃变性30sec，58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应，一台设置升降温速度设置为5℃/sec，另一台上设置升降温速度设置为2.5℃/sec，扩增结束后，把PCR小管内的扩增产物转移到同一块96孔板内，封铝膜，上微滴数字PCR检测仪检测。
3、分析结果：根据实验结果分析发现，升降温速度慢的最后检测的微滴数比升降温速度快的多，扩增效率高，升降温速度慢的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的很开，很容易区分，升降温速度快的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的不开，不容易区分，故选择2.5℃/sec升降温速度。
实施例5总DNA提取
取200mg研磨后的样品于1.5mL离心管中,加入600μLCTAB,15μL蛋白酶K,65℃温育30min；加入500μL酚-氯仿-异戊醇(25:24:1,v/v)混合液强烈振荡,12000r/min离心15min；吸取上清液加入等体积异丙醇,强烈振荡后12000r/min离心10min,弃上清液；用70％乙醇洗涤2～3次,吸弃；用200μLTE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿-异戊醇(24:1,v/v)重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其纯度及浓度。
实施例6检测鸭源性成分的ddPCR方法的建立
1、微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装
将试剂盒分为微滴数字PCR检测试剂，方便保存和运输。用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签(标示名称、批号、生产日期、有效期等)。
溶液A(RNaseFreedH2O)1支，1mL；溶液B(ddPCR探针法预混液)一支，900μL；溶液C(探针法ddPCR微滴发生油)一支，3.5ml；溶液D为2XddPCR探针法质控液，2ml；溶液E(阳性对照)一支，40μL；溶液F(阴性对照)一支，40μL；使用基因组DNA为阳性模板，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)稀释后冷冻保存。将检验合格的阳性对照制剂按400μL定量分装。使用RNaseFreedH2O为阴性对照。
上述一步法ddPCR探针法预混液其900μL的配方为：500μL的2XddPCRSupermixforprobes，上、下游引物分别为90μL，特异探针为30μL，引物和探针的浓度均为10μM。RNaseFreedH2O190μL。
使用时，在18μL的ddPCR探针法预混液中加入2μL的DNA模板，得到20μL的ddPCR反应液，用于制备微滴。
2、ddPCR方法的建立
(1)制备ddPCR反应液，总体积20μL。向扩增管中加入下列反应物：
单反应体系配方 ddPCR探针法预混液 18μL
模板 DNA 2μL
空白对照：以RNaseFreedH2O代替模板，同样条件下扩增。
(2)取微滴发生卡置于卡托中固定，将20μL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL1×溶液D补足，建议使用8通道20μL排枪和20μL枪头(不能用200ul枪头)，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。
(3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，同样不能有空着的孔。
(4)盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢。
(5)将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成
(6)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，建议使用8通道排枪和200μL枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μL，将卡托放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫。
(7)封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。推荐反应条件：
(8)将之前完成PCR的96孔板放入plateholder中组装好，注意板斜角方位，组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中。
(9)打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次系统清洗，若一周以上未使用建议先做一次填充油路再做系统清洗。之后对96孔板中样品信息进行设置，主要是提供实验名称、实验类型以及探针信息等，完成后即可运行仪器，结束后结果会被自动分析，人工核实后保存结果。
4、结果分析和判定
本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：20±5个拷贝；(2)阴性对照：<1个拷贝；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥1个拷贝。(2)阴性：标本检测结果<1拷贝。
实施例7特异性检验
用制备的试剂盒分别检测鸡肉，猪肉，羊肉，牛肉，鹅肉各10份，结果全为阴性；检测鸭肉各10份，结果全为阳性。
以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、可直接定量，检测方便快捷、结果准确可靠。
本发明根据鸭线粒体基因序列设计特异性引物,成功建立了鸭源性成分的荧光PCR检测方法,填补了鸭源性成分检测方法的空白。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鸭源性成分微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，其特征在于：主要由微滴数字PCR检测试剂和若干个微滴发生卡组装而成，其中微滴数字PCR检测试剂包含以下试剂：
溶液A：RNaseFreedH2O，1支，1mL；溶液B：ddPCR探针法预混液，一支，900μL；溶液C：探针法ddPCR微滴发生油，一支，3.5ml；溶液D：2XddPCR探针法质控液，2ml；溶液E：阳性对照，一支，40μL；溶液F：阴性对照，一支，40μL；使用基因组DNA为阳性模板，使用0.01MpH8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释后冷冻保存；将检验合格的阳性对照制剂按400μL定量分装；使用RNaseFreedH2O为阴性对照；
其中ddPCR探针法预混液其900μL的组成为：500μL的2XddPCRSupermixforprobes，上、下游引物分别为90μL，特异探针为30μL，引物和探针的浓度均为10μM，RNaseFreedH2O190μL；
所述上、下游引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；特异探针的序列如SEQIDNO:3所示。
2.一种鸭源性成分微滴数字PCR绝对定量检测方法，其特征在于：采用权利要求1所述的试剂盒进行微滴数字PCR定量检测。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：包括步骤：
(1)制备ddPCR反应液，总体积20μL，向扩增管中加入下列反应物：ddPCR探针法预混液，18μL；DNA模板，2μL；
空白对照：以RNaseFreedH2O代替模板，同样条件下扩增；
(2)取微滴发生卡置于卡托中固定，将20μL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL1×溶液D补足；
(3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，同样不能有空着的孔；盖上胶垫密封；
(4)将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；
(5)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，缓慢吸取40μL，再打入96孔板相应位置孔内；
(6)封好膜之后在96孔PCR仪内进行PCR反应，升降温速度≤2.5℃/s；
(7)将完成PCR的96孔板放入plateholder中组装好，之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中；
(8)打开QuantaSoft软件进行检测分析。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中使用8通道20μL排枪和20μL枪头，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。
所述步骤(5)中使用8通道100μL排枪和100μL枪头，加样时枪头接近微滴发生卡底部，缓慢吸出液体，转移至96孔板时，不贴壁，缓慢打入孔内，避免破坏生成的微滴。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中的PCR反应条件为：
预变性：温度95，℃10min，1个循环；
变性：温度95，℃30s，退火：温度58，℃45s，共40个循环；
结束反应：温度98，℃10min，1个循环。
6.权利要求1所述的试剂盒在市售肉制品成分检测中的应用。
7.权利要求2-5任一项所述的检测方法在市售肉制品成分检测中的应用。
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