CN102719554A - 一种芹菜est-ssr指纹图谱构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法以及指纹图谱的应用。该方法以芹菜育种材料的基因组DNA模板为研究对象，通过查询GenBank数据库上公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3v1.0在线引物设计软件，设计EST-SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出多态性较强的EST-SSR位点，并使用GeneTools（Sygene）软件进行条带分子量分析，构建EST-SSR指纹图谱。利用EST-SSR指纹图谱可用于芹菜品种亲缘关系、品种鉴定等分析。
Description
技术领域
本发明属于农业的蔬菜分子辅助育种与应用技术领域，具体涉及芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法及其应用，是一种基于EST-SSR分子标记技术的分析。
背景技术
芹菜，属伞形科植物。有水芹、旱芹两种，功能相近，药用以旱芹为佳。旱芹香气较浓，又名“香芹"，亦称"药芹"。芹菜含有丰富蛋白质、胡萝卜素、碳水化合物、脂肪、B族维生素、维生素C、糖类、氨基酸及矿物质和膳食纤，其中磷和钙的含量较高。芹菜是高纤维食物,它经肠内消化作用产生一种木质素或肠内脂的物质，这类物质是一种抗氧化剂，常吃芹菜，尤其是吃芹菜叶，对预防高血压、动脉硬化等都十分有益，并有辅助治疗作用。
芹菜是一年或两年生草本植物，株高约50～80厘米。茎一般都在手指粗细，中间为空。根呈须状。叶为羽状复叶卵形。花白色。芹菜每年六月开始播种，一星期左右就可出苗，经过六十天左右生长，就可以食用。芹菜的开花期为七月至十一月，花朵细小呈白色，里面可找到种子。芹菜耐寒不喜高温，最佳温度在15到20摄氏度之间为佳。
芹菜品种间形态特征差异极小，从植物学上较难区分，且易受到环境和人为因素影响;再加上芹菜为二年生蔬菜，生长期长，进行芹菜优良性状早期鉴定和遗传关系研究十分必要。通过分子标记对芹菜进行早期选择、预测，将会大大加速育种进程，缩短育种年限，同时某些不易区分的性状也将通过遗传标记的间接选择达到目的。利用遗传图，把优良基因，如雄性不育基因、抗病基因等分离出来都将会为芹菜遗传育种增加更为丰富的品系。
和其它类型分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前遗传多样性和群体遗传结构研究中最常用的标记之一。目前开发的SSR标记主要有基因组SSR和EST-SSR两类。基因组SSR引物的开发通常需要构建基因组文库，花费大，效率低。随着大量表达序列标签(EST)的出现，对于许多植物而言，利用EST数据库开发SSR引物是一项高效、低花费的选择。另外，由于部分EST-SSR标记来自于基因的编码区，所以更容易获得基因表达的信息，可为功能基因的直接鉴定提供重要依据。
目前EST-SSR标记已被用于小麦(Eujayletal.,2001)、玉米(Wang and Bowen, 1998)、大麦(Kota
et al., 2001;Thiel et al., 2003)、甘蔗(Cordeiro
et al., 2001)、葡萄(Scott et al., 2001)等的遗传作图(Kota et al., 2001)、遗传多样性(Eujayl
et al., 2001)、基因发掘(Remington et al., 2001; Vigouroux et
al., 2002)等研究。但关于标记芹菜EST-SSR指纹图谱的构建尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用，为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于包括候选EST-SSR位点搜寻、验证、EST-SSR位点分析及指纹图谱构建步骤：
（1）候选EST-SSR位点搜寻：以芹菜英文名或拉丁文名或别称为关键词查询GenBank数据库公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3 v1.0在线软件扫描分析EST序列中候选EST-SSR位点信息，并设计每个候选EST-SSR位点PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物；
（2）候选EST-SSR位点验证：以芹菜基因组DNA为模板，每个位点经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点；
其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；
其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点；
（3）EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0。
采用本发明所述的构建方法构建芹菜EST-SSR指纹图谱，其特征在于包括8个EST-SSR位点信息、PCR扩增引物、11个芹菜育种材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱和基于EXCEL格式的指纹图谱：
（1）8个芹菜EST-SSR位点及其PCR扩增引物
（2）以11份芹菜育种材料DNA为模板，8对芹菜EST-SSR引物分别PCR扩增及聚丙烯凝胶电泳结果，见图1；
（3）一套基于EXCEL数据格式的芹菜EST-SSR指纹图谱，包括11份芹菜育种材料的8个EST-SSR位点结果，见表2。
表2 11个芹菜育种材料的8个EST-SSR位点指纹图谱：
其中，条带代表聚丙烯酰胺凝胶电泳条带分子量大小，以bp为单位；Band代表条带数量；S1~S11代表11个芹菜育种材料样品。
本发明所述的11份芹菜育种材料指的是本实验室保留的芹菜育种材料，编号分别为S1、S2、S3~……S11；DNA提取方法为CTAB法。
本发明更加详细的芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法，包括：
步骤1：
候选EST-SSR位点搜寻：
以芹菜（celery）为关键词查询GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/term=celery）等数据库公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3
v1.0在线软件的SSR screening and primers（http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgiPRIMER_TYPE=2&CLEAR_FORM=no&LOAD_EXAMPLE=no），分析芹菜EST序列信息，获得芹菜候选EST-SSR位点，并设计芹菜候选EST-SSR引物，包括上游引物和下游引物。
步骤2：
候选EST-SSR位点验证：
以11个芹菜基因组DNA模板（50±1 ng/μL）为研究对象，经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点；
其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；
其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点。
步骤3：已确认EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：
将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0；
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理：
EST-SSR是以1～6个碱基为重复单元，是存在于EST序列中的SSR。EST (Expressed sequence tag，表达序列标签) 是将mRNA在体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其5’端或3’端进行测序后获得的长约150～500bp的表达序列片段。EST序列来自实验室构建的cDNA文库或从美国国家生物信息中心（NCBI）的Genbank中下载。采用相关软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和聚丙烯凝胶凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，从而构建指纹图谱。
2、芹菜候选EST-SSR位点的搜寻：
以芹菜（celery）为关键词查询
GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/term=celery）等数据库公布的芹菜EST序列，共查询到1122条EST序列，以FASTA格式下载至本地磁盘；
利用BatchPrimer3 v1.0在线软件的SSR screening and primers功能（http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgiPRIMER_TYPE=2&CLEAR_FORM=no&LOAD_EXAMPLE=no），对1122条芹菜EST序列进行分析，获得候选EST-SSR位点194个，并依据每个位点设计一对EST-SSR引物，包括上游引物和下游引物；
3、芹菜候选EST-SSR位点的筛选验证：
以实验室保存的11个芹菜基因组DNA模板（50±1 ng/μL）为研究对象，选择其中47对引物进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点8个（表1，图1）；
其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；
其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点。
4、芹菜EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：
将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0；
本发明公开的芹菜EST-SSR指纹图谱构建的8个位点的PCR扩增引物，如序列表1-16所示：
| 引物编号 | 引物序列（5ˊ-3ˊ） |
| No. 1 | TTCATCGTCATCATAGGAATC |
| No.2 | GGAGCATCTATTGGTTCTCTT |
| No.3 | TGAAGGTGATTGACAAGATTC |
| No.4 | AACCATTCTCTCCATTCTCTC |
| No.5 | GGTTGCTGCTTTAATACCAC |
| No.6 | TTGAACAAGGAAGTAGGAACA |
| No.7 | CTAATGCGGAGCTTATTACAA |
| No.8 | AAACCAACACATCCATTTCTA |
| No.9 | CTCTCTCTCTCGCTCATCTCT |
| No.10 | TTCGAGAAAGTTATCGGAGTA |
| No.11 | CACTCTTGTTCAACAGCAAA |
| No.12 | TGAGGATCTTGTGAATGTTTT |
| No.13 | CTCCTCCTCCTCATTTCTATC |
| No.14 | TGAGGATCTTGTGAATGTTTT |
| No.15 | CTTCTTCATTCCCAGGATAAC |
| No.16 | GTGGAGGATGTAATTGAAGTG |
本发明公开的芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用与现有技术相比所具有的积极效果在于：遗传稳定性强，标记密度较高，技术成熟，应用成本较低。
附图说明:
图1为8个芹菜EST-SSR位点的PCR扩增结果；
图2为11个芹菜品种的遗传进化图。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。
实施例1：
芹菜候选EST-SSR位点的搜寻
（1）数据库：GenBank
EST数据库
（2）分析软件：BatchPrimer3
v1.0在线软件
（3）以芹菜（celery）为关键词查询GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/term=celery）等数据库公布的芹菜EST序列，查询得到1122条EST序列；
利用BatchPrimer3 v1.0在线软件的SSR screening and primers功能（http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgiPRIMER_TYPE=2&CLEAR_FORM=no&LOAD_EXAMPLE=no），对1122条芹菜EST序列进行分析，获得候选EST-SSR位点194个，并依据每个位点设计一对EST-SSR引物。
实施例2
芹菜候选EST-SSR位点的筛选验证
（1）试剂：Promega公司生产的GoTaq® Master Mix溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；
（2）EST-SSR引物序列见表1；
表1 8个芹菜EST-SSR位点及其PCR扩增引物
（3）实验材料：11个芹菜基因组DNA模板；
（4）以实验室保存的11个芹菜基因组DNA模板（50±1 ng/μL）为研究对象，选择其中47对引物进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点8个（表1，图1）；
其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；
其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点。
实施例3
芹菜EST-SSR位点分析及指纹图谱构建
（1）凝胶图像分析软件：GeneTools（Sygene）软件；
（2）指纹图谱构建软件：EXCEL软件；
聚丙烯酰胺凝胶电泳染色结束后，将凝胶放入凝胶成像系统拍照，并将图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，并依据分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；
构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱（表2），记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0，具体见表2：
表2 11个芹菜育种材料的8个EST-SSR位点指纹图谱：
实施例4
芹菜EST-SSR指纹图谱在芹菜品种遗传亲缘关系分析上的应用
（1）软件SLT-Ntsys2.10软件
将基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱数据导入SLT-Ntsys2.10软件，分析芹菜育种材料的进化亲缘关系（图2）。
聚类分析结果表明，11份芹菜材料在相似系数0.75处可被分为2簇。A簇包括7份芹菜品种，B簇包括4份芹菜品种。A簇可被分为3个亚簇，B簇可被分为2个亚簇。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业质量标准与检测技术研究所
<120> 一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用
<160> 16
<170> PatentIn
version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcatcgtca tcataggaat
c
21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggagcatcta ttggttctct
t
21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgaaggtgat tgacaagatt
c
21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaccattctc tccattctct
c
21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggttgctgct ttaataccac
20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgaacaagg aagtaggaac
a
21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctaatgcgga gcttattaca
a
21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaaccaacac atccatttct
a
21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctctctctct cgctcatctc
t
21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttcgagaaag ttatcggagt
a
21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cactcttgtt caacagcaaa
20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgaggatctt gtgaatgttt
t
21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctcctcctcc tcatttctat
c
21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgaggatctt gtgaatgttt t
21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cttcttcatt cccaggataa
c
21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtggaggatg taattgaagt
g
21
Claims (2)
1.一种芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于包括候选EST-SSR位点搜寻、验证、EST-SSR位点分析及指纹图谱构建步骤：
（1）候选EST-SSR位点搜寻：以芹菜英文名或拉丁文名或别称为关键词查询GenBank数据库公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3 v1.0在线软件扫描分析EST序列中候选EST-SSR位点信息，并设计每个候选EST-SSR位点PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物；
（2）候选EST-SSR位点验证：以芹菜基因组DNA为模板，每个位点经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点；
其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master
Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；
其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21
mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点；
（3）EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0。
2.采用权利要求1所述的构建方法构建芹菜EST-SSR指纹图谱，其特征在于包括8个EST-SSR位点信息、PCR扩增引物、11个芹菜育种材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱和基于EXCEL格式的指纹图谱：
（1）8个芹菜EST-SSR位点及其PCR扩增引物：
（2）以11份芹菜育种材料DNA为模板，8对芹菜EST-SSR引物分别PCR扩增及聚丙烯凝胶电泳结果，见图1；
（3）一套基于EXCEL数据格式的芹菜EST-SSR指纹图谱，包括11份芹菜育种材料的8个EST-SSR位点结果，见表2：
表2
11个芹菜育种材料的8个EST-SSR位点指纹图谱：
其中，条带代表聚丙烯酰胺凝胶电泳条带分子量大小，以bp为单位；Band代表条带数量；S1~S11代表11个芹菜育种材料样品。
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