CN102719554A - 一种芹菜est-ssr指纹图谱构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法以及指纹图谱的应用。该方法以芹菜育种材料的基因组DNA模板为研究对象，通过查询GenBank数据库上公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3v1.0在线引物设计软件，设计EST-SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出多态性较强的EST-SSR位点，并使用GeneTools（Sygene）软件进行条带分子量分析，构建EST-SSR指纹图谱。利用EST-SSR指纹图谱可用于芹菜品种亲缘关系、品种鉴定等分析。

Description

一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用

技术领域

本发明属于农业的蔬菜分子辅助育种与应用技术领域，具体涉及芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法及其应用，是一种基于EST-SSR分子标记技术的分析。

背景技术

芹菜，属伞形科植物。有水芹、旱芹两种，功能相近，药用以旱芹为佳。旱芹香气较浓，又名“香芹"，亦称"药芹"。芹菜含有丰富蛋白质、胡萝卜素、碳水化合物、脂肪、B族维生素、维生素C、糖类、氨基酸及矿物质和膳食纤，其中磷和钙的含量较高。芹菜是高纤维食物,它经肠内消化作用产生一种木质素或肠内脂的物质，这类物质是一种抗氧化剂，常吃芹菜，尤其是吃芹菜叶，对预防高血压、动脉硬化等都十分有益，并有辅助治疗作用。

芹菜是一年或两年生草本植物，株高约50～80厘米。茎一般都在手指粗细，中间为空。根呈须状。叶为羽状复叶卵形。花白色。芹菜每年六月开始播种，一星期左右就可出苗，经过六十天左右生长，就可以食用。芹菜的开花期为七月至十一月，花朵细小呈白色，里面可找到种子。芹菜耐寒不喜高温，最佳温度在15到20摄氏度之间为佳。

芹菜品种间形态特征差异极小，从植物学上较难区分，且易受到环境和人为因素影响;再加上芹菜为二年生蔬菜，生长期长，进行芹菜优良性状早期鉴定和遗传关系研究十分必要。通过分子标记对芹菜进行早期选择、预测，将会大大加速育种进程，缩短育种年限，同时某些不易区分的性状也将通过遗传标记的间接选择达到目的。利用遗传图，把优良基因，如雄性不育基因、抗病基因等分离出来都将会为芹菜遗传育种增加更为丰富的品系。

和其它类型分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前遗传多样性和群体遗传结构研究中最常用的标记之一。目前开发的SSR标记主要有基因组SSR和EST-SSR两类。基因组SSR引物的开发通常需要构建基因组文库，花费大，效率低。随着大量表达序列标签(EST)的出现，对于许多植物而言，利用EST数据库开发SSR引物是一项高效、低花费的选择。另外，由于部分EST-SSR标记来自于基因的编码区，所以更容易获得基因表达的信息，可为功能基因的直接鉴定提供重要依据。

目前EST-SSR标记已被用于小麦(Eujayletal.,2001)、玉米(Wang and Bowen, 1998)、大麦(Kota et al., 2001;Thiel et al., 2003)、甘蔗(Cordeiro et al., 2001)、葡萄(Scott et al., 2001)等的遗传作图(Kota et al., 2001)、遗传多样性(Eujayl et al., 2001)、基因发掘(Remington et al., 2001; Vigouroux et al., 2002)等研究。但关于标记芹菜EST-SSR指纹图谱的构建尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用，为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于包括候选EST-SSR位点搜寻、验证、EST-SSR位点分析及指纹图谱构建步骤：

（1）候选EST-SSR位点搜寻：以芹菜英文名或拉丁文名或别称为关键词查询GenBank数据库公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3 v1.0在线软件扫描分析EST序列中候选EST-SSR位点信息，并设计每个候选EST-SSR位点PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物；

（2）候选EST-SSR位点验证：以芹菜基因组DNA为模板，每个位点经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点；

其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；

其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点；

（3）EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0。

采用本发明所述的构建方法构建芹菜EST-SSR指纹图谱，其特征在于包括8个EST-SSR位点信息、PCR扩增引物、11个芹菜育种材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱和基于EXCEL格式的指纹图谱：

（1）8个芹菜EST-SSR位点及其PCR扩增引物

（2）以11份芹菜育种材料DNA为模板，8对芹菜EST-SSR引物分别PCR扩增及聚丙烯凝胶电泳结果，见图1；

（3）一套基于EXCEL数据格式的芹菜EST-SSR指纹图谱，包括11份芹菜育种材料的8个EST-SSR位点结果，见表2。

表2 11个芹菜育种材料的8个EST-SSR位点指纹图谱：

其中，条带代表聚丙烯酰胺凝胶电泳条带分子量大小，以bp为单位；Band代表条带数量；S1~S11代表11个芹菜育种材料样品。

本发明所述的11份芹菜育种材料指的是本实验室保留的芹菜育种材料，编号分别为S1、S2、S3~……S11；DNA提取方法为CTAB法。

本发明更加详细的芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法，包括：

步骤1：

候选EST-SSR位点搜寻：

以芹菜（celery）为关键词查询GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/term=celery）等数据库公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3 v1.0在线软件的SSR screening and primers（http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgiPRIMER_TYPE=2&CLEAR_FORM=no&LOAD_EXAMPLE=no），分析芹菜EST序列信息，获得芹菜候选EST-SSR位点，并设计芹菜候选EST-SSR引物，包括上游引物和下游引物。

步骤2：

候选EST-SSR位点验证：

以11个芹菜基因组DNA模板（50±1 ng/μL）为研究对象，经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点；

其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；

其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点。

步骤3：已确认EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：

将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0；

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

1、原理：

EST-SSR是以1～6个碱基为重复单元，是存在于EST序列中的SSR。EST (Expressed sequence tag，表达序列标签) 是将mRNA在体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其5’端或3’端进行测序后获得的长约150～500bp的表达序列片段。EST序列来自实验室构建的cDNA文库或从美国国家生物信息中心（NCBI）的Genbank中下载。采用相关软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和聚丙烯凝胶凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，从而构建指纹图谱。

2、芹菜候选EST-SSR位点的搜寻：

以芹菜（celery）为关键词查询

GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/term=celery）等数据库公布的芹菜EST序列，共查询到1122条EST序列，以FASTA格式下载至本地磁盘；

利用BatchPrimer3 v1.0在线软件的SSR screening and primers功能（http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgiPRIMER_TYPE=2&CLEAR_FORM=no&LOAD_EXAMPLE=no），对1122条芹菜EST序列进行分析，获得候选EST-SSR位点194个，并依据每个位点设计一对EST-SSR引物，包括上游引物和下游引物；

3、芹菜候选EST-SSR位点的筛选验证：

以实验室保存的11个芹菜基因组DNA模板（50±1 ng/μL）为研究对象，选择其中47对引物进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点8个（表1，图1）；

其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；

其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点。

4、芹菜EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：

将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0；

本发明公开的芹菜EST-SSR指纹图谱构建的8个位点的PCR扩增引物，如序列表1-16所示：

引物编号	引物序列（5ˊ-3ˊ）
		No. 1	TTCATCGTCATCATAGGAATC
No.2	GGAGCATCTATTGGTTCTCTT
		No.3	TGAAGGTGATTGACAAGATTC
No.4	AACCATTCTCTCCATTCTCTC
		No.5	GGTTGCTGCTTTAATACCAC
No.6	TTGAACAAGGAAGTAGGAACA
		No.7	CTAATGCGGAGCTTATTACAA
No.8	AAACCAACACATCCATTTCTA
		No.9	CTCTCTCTCTCGCTCATCTCT
No.10	TTCGAGAAAGTTATCGGAGTA
		No.11	CACTCTTGTTCAACAGCAAA
No.12	TGAGGATCTTGTGAATGTTTT
		No.13	CTCCTCCTCCTCATTTCTATC
No.14	TGAGGATCTTGTGAATGTTTT
		No.15	CTTCTTCATTCCCAGGATAAC
No.16	GTGGAGGATGTAATTGAAGTG

本发明公开的芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用与现有技术相比所具有的积极效果在于：遗传稳定性强，标记密度较高，技术成熟，应用成本较低。

附图说明:

图1为8个芹菜EST-SSR位点的PCR扩增结果；

图2为11个芹菜品种的遗传进化图。

具体实施方式

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。

实施例1：

芹菜候选EST-SSR位点的搜寻

（1）数据库：GenBank EST数据库

（2）分析软件：BatchPrimer3 v1.0在线软件

（3）以芹菜（celery）为关键词查询GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/term=celery）等数据库公布的芹菜EST序列，查询得到1122条EST序列；

利用BatchPrimer3 v1.0在线软件的SSR screening and primers功能（http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgiPRIMER_TYPE=2&CLEAR_FORM=no&LOAD_EXAMPLE=no），对1122条芹菜EST序列进行分析，获得候选EST-SSR位点194个，并依据每个位点设计一对EST-SSR引物。

实施例2

芹菜候选EST-SSR位点的筛选验证

（1）试剂：Promega公司生产的GoTaq® Master Mix溶液；上海生工合成的EST-SSR引物；

（2）EST-SSR引物序列见表1；

表1 8个芹菜EST-SSR位点及其PCR扩增引物

（3）实验材料：11个芹菜基因组DNA模板；

（4）以实验室保存的11个芹菜基因组DNA模板（50±1 ng/μL）为研究对象，选择其中47对引物进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点8个（表1，图1）；

其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；

其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点。

实施例3

芹菜EST-SSR位点分析及指纹图谱构建

（1）凝胶图像分析软件：GeneTools（Sygene）软件；

（2）指纹图谱构建软件：EXCEL软件；

聚丙烯酰胺凝胶电泳染色结束后，将凝胶放入凝胶成像系统拍照，并将图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，并依据分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；

构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱（表2），记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0，具体见表2：

表2 11个芹菜育种材料的8个EST-SSR位点指纹图谱：

实施例4

芹菜EST-SSR指纹图谱在芹菜品种遗传亲缘关系分析上的应用

（1）软件SLT-Ntsys2.10软件

将基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱数据导入SLT-Ntsys2.10软件，分析芹菜育种材料的进化亲缘关系（图2）。

聚类分析结果表明，11份芹菜材料在相似系数0.75处可被分为2簇。A簇包括7份芹菜品种，B簇包括4份芹菜品种。A簇可被分为3个亚簇，B簇可被分为2个亚簇。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市农业质量标准与检测技术研究所

<120> 一种芹菜EST-SSR指纹图谱构建方法及其应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttcatcgtca tcataggaat c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggagcatcta ttggttctct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaaggtgat tgacaagatt c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaccattctc tccattctct c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggttgctgct ttaataccac 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgaacaagg aagtaggaac a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctaatgcgga gcttattaca a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaaccaacac atccatttct a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctctctctct cgctcatctc t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcgagaaag ttatcggagt a 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cactcttgtt caacagcaaa 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgaggatctt gtgaatgttt t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctcctcctcc tcatttctat c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgaggatctt gtgaatgttt t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cttcttcatt cccaggataa c 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtggaggatg taattgaagt g 21

Claims (2)

1.一种芹菜EST-SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于包括候选EST-SSR位点搜寻、验证、EST-SSR位点分析及指纹图谱构建步骤：

（1）候选EST-SSR位点搜寻：以芹菜英文名或拉丁文名或别称为关键词查询GenBank数据库公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3 v1.0在线软件扫描分析EST序列中候选EST-SSR位点信息，并设计每个候选EST-SSR位点PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物；

（2）候选EST-SSR位点验证：以芹菜基因组DNA为模板，每个位点经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出多态性较强的EST-SSR位点；

其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50 ng/μL的芹菜基因组DNA模板1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性5 min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec）；72℃延伸7 min，4℃保存；

其中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为：浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40% PAG（聚丙烯酰胺） 6 mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） 30μL，10% 过硫酸铵 300μL；设定电压 250V，电泳 1h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定液中浸泡5-10min，硝酸银染色液银染8～10 min，迅速水洗，显色液显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；显色结束后，将凝胶放入成像系统拍照获取谱带信息；比较同一EST-SSR位点在不同芹菜品种中的多态性；具有多态性的候选EST-SSR位点确认为芹菜EST-SSR位点；

（3）EST-SSR位点分析及指纹图谱构建：将电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义分子量Marker，对目标条带进行条带分子量分析；构建基于EXCEL数据格式的EST-SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×或者1，不条带处不记录或者记作0。

2.采用权利要求1所述的构建方法构建芹菜EST-SSR指纹图谱，其特征在于包括8个EST-SSR位点信息、PCR扩增引物、11个芹菜育种材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱和基于EXCEL格式的指纹图谱：

（1）8个芹菜EST-SSR位点及其PCR扩增引物：

（2）以11份芹菜育种材料DNA为模板，8对芹菜EST-SSR引物分别PCR扩增及聚丙烯凝胶电泳结果，见图1；

（3）一套基于EXCEL数据格式的芹菜EST-SSR指纹图谱，包括11份芹菜育种材料的8个EST-SSR位点结果，见表2：

表2 11个芹菜育种材料的8个EST-SSR位点指纹图谱：

其中，条带代表聚丙烯酰胺凝胶电泳条带分子量大小，以bp为单位；Band代表条带数量；S1~S11代表11个芹菜育种材料样品。

Images