DE60304324T2

DE60304324T2 - Mutationsnachweis

Info

Publication number: DE60304324T2
Application number: DE60304324T
Authority: DE
Inventors: Anne Lunden; Leif Andersson; Stefan Marklund
Original assignee: Arexis AB
Current assignee: Funbongen Uppsala Se AB
Priority date: 2002-01-09
Filing date: 2003-01-09
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2023-01-10
Also published as: ES2260624T3; EP1470228B1; NZ533848A; WO2003057886A2; CA2472801A1; AU2003201055B2; EP1470228A2; ATE321865T1; DK1470228T3; AU2003201055A1; US20090197252A1; WO2003057886A3; US7273703B2; US20060147910A1; DE60304324D1; CA2472801C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Mutationen in dem Flavin-haltigen Monooxygenase (FMO3)-Gen und Verfahren zum Nachweis solcher Mutationen bei Nutztieren und Geflügel.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Auftreten von fischigem Fehlaroma in Kuhmilch
Ein fischiges Fehlaroma in Milch ist ein Qualitätsmangel, der vor kurzem bei Großmengen von Milch in Schweden beobachtet wurde, welcher beträchtliche Verluste sowohl für die Milchproduzenten als auch die Milchwirtschaftsbetriebe verursacht. Statistische Daten aus einer Untersuchung, die 1999 in Bezug auf das Auftreten von Fehlaroma in Milch durchgeführt wurde, zeigten, dass von ungefähr 2.100 Herden 115 (d. h. > 5%) eine oder mehrere Beschwerden über fischiges Fehlaroma in Großmengen von Milch erhalten hatten. Insgesamt hatten diese 115 Herden 242 Beschwerden über ein mäßiges fischiges Fehlaroma erhalten, während 18 Proben von Großmengen an Milch so klassifiziert wurden, dass sie einen deutlichen fischigen Geruch/Geschmack aufwiesen. Genaue Zahlen des derzeitigen Auftretens eines fischigen Geruchs bei schwedischen Milchkühen sind schwierig abzuschätzen, da kein routinemäßiger organoleptischer Test an Milch von einzelnen Kühen durchgeführt wird. Wenn jedoch zufällige Proben von Großmengen an Milch von einzelnen Höfen so beurteilt wurden, dass sie ein fischiges Fehlaroma aufwiesen, wurden manchmal Tests an Proben von einzelnen Kühen durchgeführt. Diese Tests haben gezeigt, dass das Fehlaroma oft von einer oder einigen wenigen Kühen innerhalb einer Herde stammt. Um die Schwelle zu überschreiten, über welcher die Testgruppe ein fischiges Fehlaroma in der Großmenge der Milch von einem Hof wahrnimmt, muss ein ausreichend hoher Anteil der gesamten Milch von den betroffenen Kühen stammen. Folglich wird eine einzelne Kuh mit einem fischigen Fehlaroma in der Milch unentdeckt bleiben, wenn sie nicht zu einer ziemlich kleinen Herde gehört. Die obige Zahl von 5% ist somit wahrscheinlich eine Unterschätzung des Problems. In welchem Ausmaß dieses Fehlaroma in anderen Ländern auftritt, ist nicht bekannt, da die große Mehrzahl keine regelmäßigen Tests auf ein Fehlaroma in Großmengen von Milch auf der Stufe des Hofes durchführt. Es gibt soweit keine Anzeichen, dass der Mangel irgendwelche fatalen Auswirkungen auf Merkmale, die der natürlichen Selek tion unterworfen sind, wie das Überleben von Kälbern, oder Merkmale, die zu dem Zuchtziel für die Milchproduktion gehören, hat.
Charakteristische Merkmale
Ein fischiges Fehlaroma ist gekennzeichnet durch einen deutlichen unangenehmen Geschmack und Geruch, welcher an verfaulten Fisch erinnert. Ein fischiger Geruch in Milch (Humphriss, 1953; Corfield, 1955) und Kaffeesahne (Eyer et al. 1990) wurde früher in Verbindung mit bakteriellem Abbau von Lecithin, Cholin und Betain berichtet, wobei die letzteren beiden Zwischenprodukte beim Abbau von Lecithin zu Trimethylamin (TMA)-Oxid, mit TMA als einer Zwischenverbindung, sind. Eine weitere mögliche Quelle für einen fischigen Ton wurde mit der selektiven Oxidation von Butterfett in Verbindung gebracht (Swoboda & Peers, 1977). Die menschliche Nase ist extrem empfindlich gegenüber dem TMA-Geruch (Ayesh & Smith, 1990), z. B. liegt die olfaktorische Schwelle zum Nachweis in Milch bei ca. 1-2 ppm (Metha et al. 1974; von Gunten et al. 1976). Als eine Folge wurde gezeigt, dass Milch von einigen wenigen betroffenen Kühen in einer Herde ausreicht, um ein fischiges Fehlaroma der gesamten Großmenge von Milch zu verursachen. Es gab einzelne Berichte über einen fischigen Geruch in Milch, der mit dem TMA-Gehalt in Milch von Kühen, die mit Weizen gefüttert wurden, zusammenhing (Metha et al. 1974; von Gunten et al. 1976; Kim et al. 1980).
Ähnliche Phänomene bei anderen Spezies
Probleme mit fischigem Geruch, der mit erhöhten TMA-Spiegeln zusammenhängt, wurden beim Menschen ("Fischgeruchsyndrom" oder 'Trimethylaminurie", OMIM # 602079, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) und bei Hühnern (Hobson-Frohock et al. 1973) beschrieben. Beim Menschen wurde eine anormale Sekretion von TMA im Atem, Urin, Schweiß, Speichel und in Vaginalsekretionen beobachtet (Humbert et al. 1970), während bei Hühnern das TMA vorwiegend im Eigelb gefunden wurde (Hobson-Frohock et al. 1973). Das TMA stammt aus dem Abbau im Darm von Nahrungsmitteln/Futterkomponenten, die reich an TMA oder deren Vorläufern sind. Unter normalen Bedingungen wird das erzeugte TMA durch das Leberenzym Flavin-haltige Monooxygenase (FMO) (Hlavica & Kehl, 1977) zu der geruchs- und geschmackslosen Verbindung TMA-Oxid oxidiert. Das TMA-Oxid wird danach im Urin ausgeschieden (Al-Waiz et al. 1987a). Der fischige Geruch ist eine Folge der gestörten Oxidation von TMA (Pearson et al. 1979; Spellacy et al. 1979).
Genetische Ursachen
Der fischige Geruch zeigt beim Menschen einen rezessiven Modus der Vererbung (Al-Walz et al. 1987b, 1987c; Ayesh et al. 1993), wogegen diese bei Hühnern als "semidominant" beschrieben wird, da von der Expression gezeigt wurde, dass sie von der Nahrungsaufnahme von beispielsweise Rübsamenmehl abhängt (Bolton et al. 1976). Beim Menschen wurde von Eltern, die im Hinblick auf den Defekt heterozygot waren, gezeigt, dass sie erhöhte Mengen an TMA im Urin ausschieden, wenn ihnen orale Dosen von 600 mg TMA verabreicht wurden (Al-Waiz et al. 1987c, 1989; Ayesh et al. 1990, 1993). Jedoch resultierte die Behandlung in keinem der Fälle in einem fischigen Geruch.
Von dem Fischgeruchsyndrom bei Menschen wurde vor kurzem gezeigt, dass dieses auf Mutationen in FMO3 beruht, welches eine Isoform der Flavin-haltigen Monooxygenase kodiert (Dolphin et al. 1997b; Treacy et al. 1998; Akerman et al. 1999; Basarab et al. 1999; Forrest et al. 2001). Das Gen wurde auf dem Chromosom 1q23-q25 lokalisiert (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink, August 2001), und seine genomische Sequenz ist bekannt (Dolphin 1997a). Das menschliche FMO3-Gen enthält ein nicht kodierendes und 8 kodierende Exons und ist 22,5 kb lang. (GenBank AH006707, GenBank AL021026). Die Verwendung von Mutationen und Polymorphismen in dem menschlichen FMO3-Gen bei der Diagnose von Trimethylaminurie wurde in der WO 01/23603 vorgeschlagen.
Ursachen in der Ernährung
Die erhöhte Konzentration an TMA, die in verschiedenen Geweben bei Menschen, Hühnern und Rindvieh beobachtet wird, beruht wahrscheinlich auf einer Kombination von genetischen und ernährungsabhängigen Ursachen. Futterkomponenten, die reich an TMA-Vorläufern wie z. B. Betain, Cholin und Sinapin sind, sind Rübenprodukte, grüne Blätter und Cerealien sowie Rübsamenprodukte. Eine hohe Aufnahme dieser Produkte kann zu einer Akkumulation von TMA führen, was wiederum das Enzymsystem überlastet. Rübsamen enthält ebenfalls Progoitrin, eine Substanz, von der in Hühnern gezeigt wurde, dass diese als ein FMO-Inhibitor wirkt, indem sie mit TMA um die aktive Bindungsstelle des Enzyms konkurriert (Pearson et al. 1982). Bei Menschen sind die Hauptquelle von TMA Meeresfisch und andere Meeresfrüchte (Zhang et al. 1999).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1.(a) Alignment von Codon 236-238 für das normale (R238) und mutierte (R238X) FMO3-Allel bei Rindvieh. Dieser Bereich wurde unter Verwendung einer Pyrosequenzierung analysiert. Die Lage des Sequenzierprimers und die 6 sequenzierten Positionen sind angegeben. (b) Ergebnisse der Pyrosequenzierung von den drei verschiedenen Genotypen am Codon 238. Der sequenzierte Umkehrstrang hat die Sequenz (A/G)AGTGA, wobei der A/G-Polymorphismus der R238X-nonsense-Mutation entspricht.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung wird gezeigt, dass die FMO3-nonsense-Mutation R238X das fischige Fehlaroma in Milch verursacht. Dieses ist das erste identifizierte Gen, das einen starken Einfluss auf die wahrgenommene Qualität von Rohmilch hat. Das Genotypisierungsverfahren, das in dieser Untersuchung beschrieben wird, kann nun durch die Zuchtorganisationen verwendet werden, um das Problem bei jenen Züchtungen zu eliminieren, wo eine FMO3-nonsense-Mutation vorliegt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid zur Verfügung, welches eine Flavin-haltige Monooxygenase 3 (FMO3) ist, wobei die FMO3 ein Polypeptid ist, das wenigstens eine Sequenz mit wenigstens 85% Identität, vorzugsweise wenigstens 90% Identität, noch bevorzugter wenigstens 95% Identität mit der Polypeptidsequenz SEQ ID NR. 15 aufweist.
Die Erfindung stellt weiterhin Polypeptide bereit, welche eine Flavin-haltige Monooxygenase 3 (FMO3) sind, wobei die FMO3 ein Polypeptid mit wenigstens 85% Identität, vorzugsweise wenigstens 90% Identität, noch bevorzugter wenigstens 95% Identität mit der Polypeptidsequenz SEQ ID NR. 15 ist.
Ein Beispiel eines solchen Polypeptids ist die Rinder-FMO3, wie es in SEQ ID NR. 15 gezeigt ist. Weitere Beispiele von Polypeptiden der Erfindung sind die Schaf- und die Ziegen-FMO3.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Polypeptide bereit, welche funktional veränderte Mutanten der Flavin-haltigen Monooxygenase 3 (FMO3) sind, wobei die FMO3 ein Polypeptid ist, das wenigstens eine Sequenz mit wenigstens 85% Identität, vorzugsweise wenigstens 90% Identität, noch bevorzugter 95% Identität mit der Polypeptidsequenz SEQ ID NR. 15 aufweist.
Im vorliegenden Zusammenhang soll sich ein Tier auf alle Tierspezies, mit der Ausnahme von Menschen, beziehen.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf Mutanten gerichtet, welche zu dem Aufbau von TMA führen, was zu fischigem Geschmack und/oder Geruch bei einem Tier führt. Solche Mutanten umfassen Mutanten von FMO3 mit einer verminderten katalytischen Aktivität hinsichtlich der TMA-Oxidation, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein Beispiel für solch eine funktional veränderte Mutante ist ein Polypeptid, das aus einer Deletion eines Teils des FMO3-Polypeptids resultiert, wie beispielsweise die R238X-Variante von Rinder-FMO3.
Andere Beispiele von Polypeptiden, welche funktional veränderte Mutanten der Flavin-haltigen Monooxygenase 3 (FMO3) gemäß der Erfindung sind, können durch Insertionen, Deletionen und mis-sense-Mutationen in dem FMO3-Gen entstehen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin isolierte Nukleinsäuresequenzen bereit, welche Flavin-haltige Monooxygenase 3 (FMO3) kodieren, wobei die FMO3 ein Polypeptid ist, das wenigstens eine Sequenz mit wenigstens 85% Identität, vorzugsweise wenigstens 90% Identität, noch bevorzugter wenigstens 95% Identität mit der Polypeptidsequenz SEQ ID NR. 15 aufweist, umfasst.
Beispiele für solche isolierten Nukleinsäuren sind die cDNA-Sequenz, welche die Rinder-FMO3 kodiert, die in SEQ ID NR. 14 gezeigt ist, das Rinder-FMO3-Gen oder Fragmente von diesen. Beispiele für solche Fragmente sind die Exons 3, 6, 7 und 9, die als SEQ ID NR. 9, 10, 11 bzw. 12 gezeigt werden.
Nukleinsäuresequenzen der Erfindung umfassen Varianten des FMO3-Gens wie z. B. die R238X- und E287G-Varianten des Rinder-FMO3-Gens.
Um die prozentuale Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen zum Zweck des optimalen Vergleichs ausgerichtet (z. B. können Lücken in die Sequenz einer ersten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz für eine optimale Ausrichtung mit einer zweiten Amino- oder Nukleinsäuresequenz eingeführt werden). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz durch denselben Aminosäurerest oder dasselbe Nukleotid wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz besetzt ist, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, welche die Sequenzen aufweisen (d. h. % Identität = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtzahl der Positionen (z. B. überlappende Positionen) × 100). In einer Ausführungsform weisen die zwei Sequenzen dieselbe Länge auf.
Die Bestimmung der prozentualen Identität von zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von zwei Sequenzen benutzt wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modifiziert wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873. Ein solcher Algorithmus ist in die NBLAST- und XBLAST-Programme von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 4O3-410 eingebaut. BLAST-Nukleotidsuchen können mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die zu Nukleinsäuremolekülen der Erfindung homolog sind. BLAST-Proteinsuchen können mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu einem Proteinmolekül der Erfindung homolog sind. Um Alignments mit Lücken zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST wie in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 beschrieben verwendet werden. Alternativ kann PSI-Blast verwendet werden, um eine iterative Suche durchzuführen, welche entfernte Verwandtschaften zwischen Molekülen nachweist. Wenn die BLAST-, Gapped BLAST- und PSI-Blast-Programme verwendet werden, können die Default-Parameter der entsprechenden Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Die prozentuale Identität von zwei Sequenzen kann bestimmt werden, indem Techniken, die zu den oben beschriebenen ähnlich sind, mit oder ohne ein Ermöglichen von Lücken verwendet werden. Bei dem Berechnen der prozentualen Identität werden nur exakte Treffer gezählt.
Die Erfindung umfasst ebenfalls spezifische Fragmente einer Nukleinsäuresequenz der Erfindung. "Spezifisches Fragment" bezieht sich auf ein Nukleinsäurefragment mit einer Sequenz, die nur in den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung gefunden wird und nicht in Nukleinsäuresequenzen gefunden wird, die verwandte Polypeptide wie z. B. FMO1, FMO2, FMO4 und FMO5 kodieren. Solche Fragmente können Primer sein, die in Amplifikationsreaktionen wie beispielsweise PCR oder in Hybridisierungsexperimenten verwendet werden, sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Fragmente weisen daher typischerweise eine Länge von wenigstens 10 bp, wie beispielsweise wenigstens 15 bp, insbesondere wenigstens 20 bp auf, können aber ebenfalls länger sein wie beispielsweise wenigstens 50 bp oder wenigstens 100 bp. Der Grad der Identität zwischen den verschieden FMOs scheint über die gesamte Sequenz hinweg derselbe zu sein, wobei der Grad der Identität zwischen FMO3 und FMO2 (welches die engste Verwandte ist) ca. 60% beträgt. Der Grad der Identität zwischen z. B. Rinder- und menschlicher FMO3 ist über die gesamte Sequenz hinweg ungefähr derselbe.
"Spezifisch hybridisierende Fragmente" bezieht sich auf Nukleinsäurefragmente, die unter stringenten Bedingungen nur mit Nukleinsäuren der Erfindung hybridisieren können, ohne mit Nukleinsäuresequenzen zu hybridisieren, die verwandte Polypeptide wie z. B. FMO1, FMO2, FMO4 und FMO5 kodieren.
Die spezifischen Fragmente oder spezifisch hybridisierenden Fragmente können z. B. als Primer oder Sonden zum Nachweisen und/oder Amplifizieren von Nukleinsäuresequenzen, die FMO3-Polypeptide kodieren, verwendet werden.
Ein Definieren geeigneter Hybridisierungsbedingungen, einschließlich stringenter Bedingungen, gehört zu dem allgemeinen Fachwissen. Siehe z. B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Ausg., Sambrook et al., Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; DNA Cloning: A practical Approach, Glover & Hames, Herausg., Oxford University Press 1996; Nucleic Acid Hybridization: Essential techniques, Ross, Herausg., Wiley, 1998. So werden stringente Hybridisierungsbedingungen ausgewählt, indem die Temperatur und/oder die Salzkonzentration in Hybridisierungsexperimenten verändert werden, so dass im Prinzip nur das interessierende Molekül mit der Zielsequenz hybridisiert.
Die Erfindung umfasst Sätze von Primern, die wenigstens einen Primer umfassen, der aus einem spezifischen Fragment oder spezifisch hybridisierendem Fragment wie oben definiert besteht.
Wie hierin gezeigt können Mutationen in dem Rinder-FMO3-Gen zu einem fischigen Fehlaroma von Milch führen, das durch einen veränderten Trimethylamin-Metabolismus verursacht wird.
Es wird weiterhin postuliert, dass Mutationen bei dem Hühner-FMO3-Gen mit einem fischigen Fehlaroma von Eiern zusammenhängen können, die von Hennen erzeugt werden, die solche Mutationen tragen.
Die Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zum Nachweisen einer Mutation in dem FMO3-Gen eines Tieres, wo die Mutation eine Veränderung bei dem Trimethylamin-Metabolismus verursachen wird, was zu einem fischigen Fehlaroma in einem Nahrungsmittelprodukt des Tieres oder seiner Nachkommen führen wird, wobei das Nahrungsmittelprodukt irgendein Nahrungsmittelprodukt, das von Tieren oder deren Nachkommen entnommen oder erzeugt wird, wie beispielsweise Milch oder Eier sein kann. Das Tier kann ein Säugetier, ausschließlich Menschen, sein, das bei der Produktion von solchen Nahrungsmittelprodukten verwendet wird, wie beispielsweise eine Kuh, ein Bulle, ein Schaf oder eine Ziege. Das Tier kann ebenfalls Geflügel wie beispielsweise eine Henne oder ein Hahn sein.
Das Verfahren umfasst:

– Erhalten einer Nukleinsäureprobe aus dem Tier;
– Bestimmen des Vorliegens in der Nukleinsäureprobe einer Nukleinsäuresequenz, welche eine mutierte FMO3 kodiert.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen einer Nukleinsäuresequenz, welche eine Mutation in dem FMO3-Gen eines Tieres umfasst, bereit, wobei die Mutation eine Veränderung bei dem Metabolismus von Trimethylamin verursachen wird, was zu einem fischigen Fehlaroma in einem Nahrungsmittelprodukt des Tieres oder seiner Nachkommen führt.
Das Verfahren umfasst:

– Erhalten einer Nukleinsäureprobe von dem Tier;
– Inkontaktbringen der Nukleinsäureprobe mit einer Nukleinsäuresonde, welche die Mutation umfasst, unter Bedingungen einer spezifischen Hybridisierung zwischen der Sonde und der Mutantensequenz, die nachgewiesen werden soll;
– Nachweisen des Hybridisierungskomplexes.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren der Erfindung weiterhin vor der Hybridisierung eine PCR-Amplifikation aus der Nukleinsäureprobe einer Sequenz, die wenigstens den Teil der FMO3-Sequenz, in welchem die Mutation nachgewiesen werden soll, umfasst.
Verfahren, die eine spezifische Hybridisierung einer Sonde nur mit einer perfekt passenden komplementären Sequenz erlauben und für den Nachweis von Punktmutationen nützlich sind, sind im Stand der Technik bekannt. Sie umfassen beispielsweise eine allelspezifische PCR (Gibbs, Nucleic Acid Res. 17: 2427-2448, 1989), ein allelspezifisches Oligonucleotid-Screening (Saiki et al. Nature 324: 163-166, 1989).
Eine Mutation in dem FMO3-Gen kann ebenfalls durch Nachweis von polymorphen Markern nachgewiesen werden, die mit der Mutation eng verknüpft sind. Solche polymorphen Marker können als Ersatzmarker für die funktionale Mutation selbst verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass sie nicht im Verknüpfungsgleichgewicht mit der Mutation vorliegen. Im Allgemeinen gilt, je enger der polymorphe Marker an der Mutation selbst liegt, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass der Marker als Ersatzmarker verwendet werden kann. Aufgrund von Variationen bei den Rekombinationshäufigkeiten über das Genom hinweg, ist jedoch der physikalische Abstand, in welchem der Ersatzmarker von der Mutation entfernt sein kann, voraussichtlich variabel. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Mittel zum Identifizieren der polymorphen Marker und insbesondere von polymorphen Markern, die innerhalb einer genomischen DNA-Sequenz umfasst sind, welche wenigstens einen Teil eines FMO3-Gens und bis zu 500 kb, vorzugsweise 300 kb, insbesondere bis zu 100 kb der an 3' und/oder 5' benachbarten Sequenz oder das Komplementäre davon enthält, bereit. In Tabelle 3 werden Beispiele von polymorphen Markern, die in cDNA-Sequenzen von normalen Allelen von einem Träger der R238X-Mutation und von einem homozygoten normalen Individuum identifiziert wurden, angegeben.
Diese polymorphen Marker können beispielsweise erhalten werden, indem eine genomische DNA-Bibliothek aus einem Tier mit einer Sonde gescreent wird, die für das FMO3-Gen spezifisch ist, um Klone auszuwählen, welche die Nukleinsäuresequenz und flankierende genomische Sequenzen umfassen, und ein polymorpher Marker in den flankierenden genomischen Sequenzen identifiziert wird. Das Allel (die Allele) eines polymorphen Markers, der mit einem vorgegebenen Mutanten-Alle) des FMO3-Gens verbunden ist, kann ebenfalls leicht durch Verwendung einer genomischen DNA-Bibliothek aus einem Individuum identifiziert werden, wobei das Vorliegen des Mutanten-Allels vorher durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde der Erfindung nachgewiesen wurde.
Polymorphe Marker umfassen beispielsweise Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP), Mikrosatelliten, Insertions/Deletionspolymorphismen und Polymorphismen der Restriktionsfragmentlänge (RFLP). Diese polymorphen Marker können durch Vergleich der Sequenzen, welche das FMO3-Gen flankieren, die aus mehreren Individuen erhalten wurden, identifiziert werden. Mikrosatelliten können ebenfalls durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde identifiziert werden, die für bekannte Mikrosatellitenmotive spezifisch ist, wobei Techniken verwendet werden, die den Fachleuten bekannt sind. Wenn ein polymorpher Marker identifiziert wurde, kann ein DNA-Segment, das den polymorphen Ort überspannt, sequenziert werden, und ein Satz von Primern, die eine Amplifikation des DNA-Segments erlauben, kann geplant werden. Die Erfindung umfasst ebenfalls diese DNA-Primer. Die Planung und Verwendung der DNA-Primer zu dem Zweck der Amplifikation durch PCR oder Hybridisierung liegt innerhalb des Fachwissens des Durchschnittsfachmanns. So können geeignete Primer aus den Sequenzen der Erfindung ausgewählt werden, indem Methoden verwendet werden, die den Fachleuten bekannt sind.
Der Nachweis einer Mutation in dem FMO3-Gen kann durchgeführt werden, indem eine Probe einer genomischen DNA aus einem Tier erhalten wird, ein Segment der DNA, die einen polymorphen Marker überspannt, durch PCR amplifiziert wird, wobei ein Satz von Primern der Erfindung verwendet wird, und in der amplifizierten DNA das Vorliegen eines Allels des polymorphen Markers, der mit der Mutation verbunden ist, nachgewiesen wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls Kits zur Praktizierung der Verfahren der Erfindung bereit. Ein Kit umfasst wenigstens ein spezifisches Fragment einer Nukleinsäure der Erfindung oder wenigstens ein Nukleinsäurefragment, das in der Lage ist, mit einer Nukleinsäuresequenz der Erfindung zu hybridisieren. Die Nukleinsäure kann markiert werden, indem Techniken verwendet werden, die den Fachleuten bekannt sind. Beispiele für geeignete Markierungen umfassen radioaktive Markierungen, fluoreszierende Markierungen und Affinitätsmarkierungen wie z. B. Biotin, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Kits können ebenfalls einen Satz von Primern der Erfindung umfassen. Sie können in Verbindung mit im Handel erhältlichen Amplifikationskits verwendet werden. Sie können ebenfalls positive und/oder negative Kontrollreaktionen oder Marker, Molekulargewichtsgrößenmarker zur Gelelektrophorese und dergleichen beinhalten.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die identifizierte R238X-Mutation in der Rinder-FMO3 und Verfahren, um die Mutation zu identifizieren, um in der Lage zu sein, diese Mutation aus dem Bestand zu entfernen. Die Genotypisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um das Problem bei jenen Züchtungen zu eliminieren, wo eine FMO3-nonsense-Mutation oder andere Mutationen, die zu einem fischigen Geruch oder Geschmack führen, vorliegen. Ein praktischer Weg, um das Problem zu verringern, wäre es, derzeit verwendete Zuchtbullen, Zuchtkühe (bull dams) und junge potenzielle Zuchtbullen vor dem Testen der Nachkommenschaft zu genotypisieren, zu bestimmen, welche Tiere Träger der Mutation(en) sind, und die Träger aus der Zucht zu eliminieren. Auf diesem Weg kann die schädliche Mutation(en) aus der ausgewählten Züchtung eliminiert werden.
BEISPIELE
Beispiel 1. Sequenzierung des Rinder-FMO3-Gens
Proben von Rindvieh und Herstellung der DNA
Die vorliegende Untersuchung umfasste zwei verschiedene Gruppen von Milchvieh. Das erste Material umfasste 21 Kühe der Züchtung Schwedisch Rot und Weiß (SRB) mit Informationen aus sensorischen Analysen der Milch. Zehn der Kühe gehören zu einer der zwei experimentellen Herden, Jälla und Kungsängen, an der schwedischen Universität der Landwirtschaftswissenschaften in Uppsala. Die verbleibenden Kühe gehören zu irgendeiner von vier kommerziellen Herden, welche alle Beschwerden über ein fischiges Fehlaroma in der Großmenge der Milch erhalten hatten. Ir drei der sechs Herden wurden "Kontroll"-Kühe ausgewählt, die mit den betroffenen Kühen in Bezug auf die Zucht, die Laktationszahl und das Stadium der Laktation vergleichbar waren, aber Milch mit einem normalen Geschmack und Geruch erzeugten.
Eine Populationsstudie wurde durchgeführt, bei welcher Bullen und Kühe aus den vier Milchviehzüchtungen in Schweden im Hinblick auf die beobachtete FMO3-nonsense-Mutation genotypisiert wurden. Von jeder der zwei Hauptzüchtungen, SRB und Schwedisch Holstein, wurden 100 Individuen ausgewählt, wogegen von den zwei kleinen Züchtungen, Schwedisch Polled und Schwedisch Jersey, von 25 bzw. 23 Individuen Proben genommen wurden. Die genomische DNA wurde gemäß Standardvorschriften aus Blutproben präpariert.
PCR-Amplifikation und Sequenzierung des Rinder-FMO3-Gens aus genomischen DNA-Proben
Teile von Exons des FMO3-Gens wurden aus genomischen DNA-Proben amplifiziert, wobei Primer verwendet wurden, welche Sequenzen entsprachen, die zwischen Menschen-, Kaninchen-, Maus- und Ratten-FMO3-Sequenzen, welche in der GenBank verfügbar waren, gut konserviert waren (Tabelle 1). Zwei genomische DNA-Proben, eine aus einer Kuh, von der gezeigt worden war, dass sie wiederholt Milch mit einem fischigen Geschmack erzeugt, und die andere von einer Kontroll-Kuh, die normale Milch erzeugte, wurden verwendet. Tabelle 1. Primer-Sequenzen, die zur PCR-Amplifikation des Rinder-FMO3-Gens aus der genomischen DNA verwendet wurden.

¹Die Nummerierung der Exons basiert auf der für das menschliche FMO3-Gen beschriebenen Exon-Intron-Organisation (Dolphin et al. 1997a).

Die PCR wurde durchgeführt in 10 μl-Reaktionen, die 1 × PCR Puffer, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM jedes dNTP, 2,5 pmol jedes Primers, 25 ng genomische DNA und 0,35 U Ampli Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Branchburg, NJ, USA) enthielten. Das Thermocycling wurde in einem PTC200-Gerät (MJ Research, Watertown, MA, USA) durchgeführt und umfasste 40 Zyklen mit Assoziieren lassen bei 53°C für 30 s und Verlängerung bei 72°C für 2 min. Der Denaturierungsschritt fand bei 95°C für 1-2 min in den ersten zwei Zyklen und bei 94°C für 30 s in den verbleibenden Zyklen statt. Die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert (4% Nusieve/Seakem 3:1, FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA). Die PCR-Produkte wurden direkt mit BigDye-Terminatoren und einem ABI377-Gerät (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) sequenziert. Die Sequenzanalyse und der Vergleich der Sequenzen aus den Kühen mit fischig schmeckender bzw. normaler Milch wurden unter Verwendung der Sequencher Software (GENE CODES, Ann Arbor, MI, USA) durchgeführt.
Rinder-FMO3-Gen-Sequenzen
Rinder-FMO3-Sequenzen, welche den menschlichen FMO3-Exons 3, 6, 7, 9 und Intron 8 entsprachen, wurden erzeugt und sind in den SEQ ID NR. 9-13 angegeben. Anschließend wurde der vollständige Kodierungsbereich des Rinder-FMO3-Gens aus RT-PCR-Produkten aus Leber-mRNA sequenziert. Die Rinder-FMO3-cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NR. 14 angegeben, und die entsprechende Polypeptidsequenz von Rinder-FMO3 ist in SEQ ID NR. 15 angegeben. Die Exon-Sequenzen, die aus der genomischen DNA erzeugt wurden, zeigten 100% Identität mit der cDNA-Sequenz, die aus den RT-PCR-Produkten erhalten wurde, und die FMO3-Spezifität wurde stark durch die hohe Sequenzähnlichkeit zu anderen Säugetier-FMO3-Sequenzen unterstützt. Beispielsweise zeigte ein Blast-Vergleich zwischen der vollständigen Kodierungssequenz von Rindvieh-FMO3, die hier erhalten wurde, und der entsprechenden menschlichen Sequenz (Gen-Bank NM 006894) 85% und 82% Identität auf dem Nukleotid- bzw. Aminosäureniveau.
Identifizierung einer nonsense-Mutation in dem Rinder-FMO3-Gen
Partielle Rindvieh-FMO3-Sequenzen, welche aus einer Kuh, die Milch mit starkem fischigem Fehlaroma erzeugte, und einer Kuh, die normale Milch erzeugte, erhalten wurden, wurden verglichen. Die verglichenen Sequenzen beinhalteten zusammen 1522 bp, und 808 bp von diesen repräsentierten die Kodierungssequenz. Der kodierende Teil beinhaltet 268 Codons, was ungefähr 50% des Proteins entspricht. Der einzige Sequenzunterschied, der zwischen den zwei Kühen gefunden wurde, war eine C/T Nukleotid-Substitution, die an Position 62 in Exor 6 lokalisiert war (SEQ ID NR. 10). Die C→T Substitution verändert das Codon für Arginin (R) an Position 238 zu einem Stopp-Codon (X); die Nummerierung der Aminosäurepositionen basiert auf der menschlichen Aminosäuresequenz, welche in der GenBank NM 006894 angegeben ist. Diese nonsense-Mutation wird somit als R238X bezeichnet. Der Pyrosequenziertest bestätigte, dass die betroffene Kuh im Hinblick auf die R238X-Substitution homozygot war, wogegen die Kontrollkuh an Rest 238 homozygot R/R war (1).
Beispiel 2. Verbindung zwischen Mutationen bei FMO3 und dem Vorliegen eines fischigen Fehlaromas in Kuhmilch
Genotypisieren der FMO3-R238X-nonsense-Mutation
Der identifizierte Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) in Exor 6 wurde durch Pyrosequenzieren (Ronaghi et al. 1998) unter Verwendung eines Luc96-Geräts (Pyrosequencing AB, Uppsala, Schweden) genotypisiert. Dieses beinhaltete eine PCR-Amplifikation eines Produkts mit 147 bp aus genomischen DNA-Proben unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5'-Biotin-GAT GAA GGC TAT CCA TGG GAC (SEQ ID NR. 16) und des Rückwärtsprimers 5'-TAA AGG CAT CAA GCC GTA GTT CTC (SEQ ID NR. 17). Die PCR wurde in 20 μl-Reaktionen mit Konzentrationen der Reagenzien wie oben durchgeführt. Das Thermocycling wurde in einem PE9600-Gerät (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) durchgeführt und beinhaltete einen anfänglichen Denaturierungsschritt bei 94°C für 2 min, gefolgt von 5 Zyklen mit 94°C für 30 s, 55°C für 30 s, 72°C für 75 s, 43 Zyklen mit 94°C für 20 s, 50°C für 30 s, 72°C für 45 s und einen letzten Verlängerungsschritt bei 72°C für 5 min. Die Pyrosequenzierung an dem Vorwärtsstrang wurde durchgeführt, indem der Rückwärtssequenzierprimer 5' TGA GGA ATG TTT CAA ATC (SEQ ID NR. 18) und die Bedingungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wurden.
RT-PCR-Amplifikation und Sequenzierung der Rinder-FMO3-cDNA
Zehn Lebern aus SRB-Rindvieh wurden gesammelt, und der Pyrosequenzierungstest zeigte, dass zwei heterozygote Träger der R238X-Mutation waren. Eine dieser Lebern wie auch eine Leber aus einer homozygoten Wildtyp-Kuh wurden zur Herstellung von mRNA, reversen Transkriptions(RT)-PCR-Amplifikation und direkten Sequenzierung des kodierenden FMO3-Bereichs verwendet. Zwei zusätzliche Primer wurden zu diesem Zweck verwendet, welche anhand von Sequenzen in nicht translatierten Bereichen geplant wurden, die eine Konservierung bei anderen Säugetier-FMO3-Sequenzen zeigten. Somit wurden der 5'UTR-Primer 5' GGA CTT AGA CAC ACA GAA GAA AAG AAG (SEQ ID NR. 19) und der 3'UTR-Primer 5' GAG GTG TGA AAT TCT TAT TTT TTA AAT AG (SEQ ID NR. 20) in Paaren mit den Rückwärts- bzw. Vorwärtspyrosequenzierungs-PCR-Primern verwendet. Somit wurde die Kodierungsequenz in zwei überlappenden Stücken amplifiziert, wobei jedes die Stelle der R238X-Mutation einschloss. Poly A-mRNA wurde aus Rindviehlebern isoliert, indem das Quickprep mRNA-Mikroreinigungskit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) verwendet wurde, und eine RT-PCR wurde durchgeführt, indem das First strand cDNA-Synthesekit (Amersham Pharmacia Biotech) mit ~200 ng mRNA, geprimt mit 0,1 μg Zufallshexameren in einem Reaktionsvolumen von 15 μl, verwendet wurde. Zwei μl der abgeschlossenen Reaktion des ersten Stranges wurden in jeder PCR-Reaktion mit einem Gesamtvolumen von 12 μl verwendet, so dass die Endkonzentrationen von dNTP, Mg²⁺, Primern, und AmpliTaq-Polymerase dieselben wie oben waren. Die Bedingungen des Thermocycling waren wie oben für die sequenzierten genomischen DNA-Amplikons beschrieben, aber der 5'-Teil der cDNA erforderte eine wiederholte PCR, um genügend Produkt zur Sequenzierung zu ergeben.
Die R238X-Substitution hängt eng mit dem Vorliegen eines fischigen Fehlaromas in Kuhmilch zusammen
Der Pyrosequenzierungstest wurde verwendet, um ein Fall-Kontroll-Material zu testen, welches Tiere, die Milch erzeugten, die so klassifiziert wurde, dass sie ein fischiges Fehlaroma aufwies, und Kontrolltiere aus derselben Herde umfasste (Tabelle 2). Eine Bewertung der Klasse 2 bedeutet, dass zwei geschulte Personen beide die Probe so klassifizierten, dass diese ein starkes fischiges Fehlaroma aufwies, wogegen Klasse 1 bedeutet, dass die zwei Personen das fischige Fehlaroma als stark/mäßig, mäßig/mäßig oder mäßig/normal beurteilten. Die Ergebnisse zeigten eine sehr starke Verbindung zwischen der FMO3-R238X-nonsense-Mutation und dem starken fischigen Fehlaroma, da acht von neun Tieren mit der Bewertung Klasse 2 im Hinblick auf diese Mutation homozygot waren und das neunte heterozygot war. Im Gegensatz dazu waren die fünf Kontrollproben homozygot normal. Die Gruppe Klasse 1 enthielt Tiere von allen drei Genotypklassen. Tabelle 2. FMO3-Genotypverteilungen in einer Gruppe von 21 Schwedisch Rot und Weiß Kühen mit oder ohne fischigem Fehlaroma in Milch und in Tieren, welche die vier unterschiedlichen Milchkuhzüchtungen in Schweden repräsentieren

¹Die Auswertung basiert auf zwei geschulten Personen. Klasse 2 = beide Personen erkannten ein starkes Fehlaroma (stark/stark); Klasse 1 = stark/mäßig, mäßig/mäßig, mäßig/normal.

Die R238X-Substitution tritt in überraschend hoher Häufigkeit bei der Züchtung Schwedisch Rot und Weiß auf
Das Populationsscreening beinhaltete 248 Tiere, welche die vier Milchviehzüchtungen in Schweden repräsentierten. Die R238X-Substitution wurde bei Schwedisch Holstein, Schwedisch Polled oder Schwedisch Jersey nicht gefunden, war aber überraschend häufig bei der Züchtung Schwedisch Rot und Weiß (Tabelle 2). Zwei homozygote Mutanten und 27 heterozygote wurden bei 100 Tieren beobachtet, und die Schätzung der Allel-Häufigkeit für die Mutation betrug bis zu 15,5%.
SNPs, die durch cDNA-Sequenzierung eines heterozygoten R238X-Trägers und eines homozygoten normalen Tieres beobachtet wurden
Nur das Wildtyp-Transkript schien in der mRNA-Probe aus dem R238X-Träger gut vertreten zu sein. Nur ein sehr schwaches Sequenzierungssignal konnte bei dem Mutanten-Transkript beobachtet werden, welches wenigstens 10 Mal schwächer war als das bei dem Wildtyp-Transkript. Ein ähnliches Ergebnis wurde erhalten, wenn Leber-mRNA aus einem zweiten heterozygoten R238X-Träger verwendet wurde. Folglich konnten wir nicht nach möglichen zusätzlichen Mutationen suchen, die in dem FMO3-Allel vorlagen, welches mit dem fischigen Fehlaroma verbunden war. Jedoch bestätigte das RT-PCR-Experiment, dass die R238X-Mutation in einem exprimierten FMO3-Gen auftritt.
Der Vergleich der Leber-cDNA-Sequenz in voller Länge aus dem normalen Allel von dem Träger und von dem homozygoten normalen Individuum zeigte drei zusätzliche Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), die alle in Tabelle 3 aufgelistet sind. Nur einer der SNPs, E287G, veränderte die Aminosäuresequenz. Tablelle 3. Einzelnukleotidmorphismen in dem Rinder-FMO3-Gen

¹Posotion wie in der SEQ ID NR. 14 nummeriert

Diskussion
Die vorliegende Untersuchung hat den zwingenden Beweis geliefert, dass die beobachtete FMO3-nonsense-Mutation R238X das fischige Fehlaroma in Milch verursacht. Diese Folgerung basiert auf (i) der Identifikation einer offensichtlichen zu einem Funktionsverlust führenden Mutation in einem Gen, welches mit einem ähnlichen Syndrom bei Menschen verbunden ist, (ii) einer sehr starken Verbindung zwischen dem Vorliegen dieser Mutation und einem starken fischigen Fehlaroma in einem Fall/Kontrollmaterial und schließlich (iii) dem Vorliegen dieser Mutation bei der einzigen getesteten Züchtung (SRB) mit gut dokumentierten Fällen eines fischigen Fehlaromas.
Die R238X-Mutation verursacht eine vorzeitige Beendigung, welche mehr als 50% des FMO3-Enzyms eliminiert, von dem erwartet wird, dass es 532 Aminosäuren wie bei dem menschlichen FMO3-Protein umfasst. Von ähnlichen nonsense-Mutationen bei Menschen (E305X, E314X) wurde gezeigt, dass diese zu einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität führen (Treacy et al. 1998, Akerman et al. 1999). Darüber hinaus haben wir nur kaum nachweisbare Spiegel des Mutanten-Transkripts in Leber-mRNA aus zwei heterozygoten Trägern von R238X beobachtet. Dieses wird höchstwahrscheinlich durch den nonsense-vermittelten Zerfall der mRNA erklärt (NMD; Culbertson 1999). Es ist sehr wahrscheinlich, dass Kühe, die für die R238X-Mutation homozygot sind, ein vollständiges Fehlen der FMO3-Aktivität zeigen, die für die Oxidation von TMA zu einer geruchlosen Verbindung nötig ist. Dieses liefert eine plausible Erklärung für das fischige Fehlaroma der Milch von diesen Kühen. Milchproben von fünf dieser Kühe, die für die Mutation homozygot waren und in dieser Studie enthalten waren, wurden vorher im Hinblick auf den TMA-Gehalt analysiert, indem eine dynamische Gasraum-Gaschromatographie verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Milchproben alle vergleichsweise hohe Konzentratiorer an TMA aufwiesen, wogegen die Milch von normalen Kühen nicht nachweisbare oder in wenigen Fällen sehr niedrige TMA-Konzentrationen zeigte.
Die Ergebnisse legten einen rezessiven Modus der Vererbung für das fischige Fehlaroma in Kuhmilch in Übereinstimmung mit der rezessiven Vererbung des Fischgeruchsyndroms bei Menschen nahe. Jedoch gab es keine perfekte Übereinstimmung zwischen diesem Modell und den Beobachtungen aus der Fall/Kontrollstudie, da ein Träger so bewertet wurde, dass er ein starkes fischiges Fehlaroma (Klasse 2) aufwies, und eine homozygote Mutante ein mäßiges Fehlaroma (Klasse 1) zeigte. Wir denken, dass es zwei mögliche Erklärungen für diese Abweichung von einem strikt rezessiven Modell gibt. Das fischige Fehlaroma wird durch Umweltfaktoren wie das Vorliegen von TMA-Vorläufern oder FMO-Inhibitoren im Futter beeinflusst. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die TMA-Konzentration in der Milch von einer der homozygoten Mutanten innerhalb einer einzigen Laktation zwischen 1 und 16 mg TMA/kg Milch variiert. Zweitens ist die sensorische Auswertung ein etwas subjektives Maß. Die Testgruppe, die aus zwei geschulten Personen besteht, überprüft während eines Tages eine beträchtliche Anzahl an Milchproben und kann gewisse Schwierigkeiten haben, die verschiedenen Fehlaromen, die in den Milchproben vorliegen, wahrzunehmen und ebenfalls zwischen verschiedenen Geschmacksrichtungen zu unterscheiden.
Bei dem vorliegenden Material wurde die Mutation nur bei den SRB-Tieren beobachtet, allerdings in einer relativ hohen Häufigkeit. Dieses ist in vollständiger Übereinstimmung mit den Erfahrungen, die von dem Personal im Milchanalyselabor gemacht wurden, das die sensorische Analyse durchführte, die bisher das fischige Fehlaroma nur in Milch von SRB-Kühen gefunden haben. Wir haben die Herkunftsdaten für alle Träger und homozygoten Mutanten analysiert, wir haben aber keinen gemeinsamen Vorfahren dieser Tiere innerhalb der letzten 10 Generationen gefunden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Mutation für einen relativ langen Zeitraum in der bestehenden SRB-Population vorliegt. Der Ursprung der Mutation geht möglicherweise auf den Anfang des letzten Jahrhunderts zurück, wenn man dieses anhand der verfügbaren Information über die Herkunft der betroffenen Tiere beurteilt. Darüber hinaus zeigen die Herkunftsdaten, dass die Mutation in anderen Rindviehpopulationen, die eng mit der Ayrshire[-Rasse] verwandt sind, existieren kann.
Soweit wir wissen ist dieses das erste identifizierte Gen, das einen deutlichen Einfluss auf die wahrgenommene Qualität von Rohmilch hat. Das Genotypisierungsverfahren, das in dieser Studie beschrieben wurde, kann nundurch die Zuchtorganisationen verwendet werden, um das Problem bei jenen Züchtungen zu eliminieren, wo eine FMO3-nonsense-Mutation vorliegt. Ein praktischer Weg, um das Problem zu verringern, wäre es, derzeit verwendete Zuchtbullen, Zuchtkühe und junge potenzielle Zuchtbullen vor dem Testen der Nachkommenschaft zu genotypisieren und Träger aus der Zucht zu eliminieren.
Beispiel 3. Sequenzieren des Hühner-FMO3-Gens
Exonteile des Hühner-FMO3-Gens werden aus genomischen DNA-Proben amplifiziert, indem sowohl Primer, die Sequenzen entsprechen, die bei den Rinder-, menschlichen, Kaninchen-, Maus- und Ratten-FMO3-Sequenzen gut konserviert sind, wie auch Primer, die EST-Sequenzen entsprechen, die von dem Hühner-FMO3-Gen abgeleitet sind, ESTs 6O3149708F1 und 6O3610105F1, die in der Hühner-EST-Datenbank (http://www.chick.umist.ac.uk/cglbin/chicken_database.cgi) verfügbar sind, verwendet werden. Sowohl genomische DNA-Proben von Hennen, von denen gezeigt wurde, dass sie Eier mit einem fischigen Fehlaroma erzeugen, als auch genomische DNA-Proben von normalen Hennen werden als Matritzen verwendet. Die cDNA-Sequenz, welche für die Hühner-FMO3 kodiert, wird aus RT-PCR-Produkten von Leber-mRNA erhalten.
Die Sequenzen, die von Hennen erhalten wurden, von denen gezeigt wurde, dass sie Eier mit einem fischigen Fehlaroma erzeugen, und Sequenzen, die von normalen Hennen erhalten wurden, werden verglichen und Sequenzvarianten werden identifiziert.
Die Hennen werden genotypisiert und FMO3-Varianten, die mit der Erzeugung von Eiern mit fischigem Fehlaroma in Verbindung stehen, werden identifiziert.
LITERATURSTELLEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, das eine Flavin-haltige Monooxygenase 3 (FMO3) ist, worin die FMO3 ein Polypeptid ist, das mindestens eine Sequenz umfasst, die mindestens 85% identisch ist mit der Polypeptidsequenz SEQ ID NR.:15.
Polypeptid nach Anspruch 1, welches Polypeptid ein funktionell geänderter Mutant einer Flavin-haltigen Monooxygenase 3 (FMO3) ist und zum Aufbau von Trimethylamin in einem Tier führt.
Polypeptid nach Anspruch 2, das eine Folge einer Deletion-, Insertion-, Norsense- oder Mis-sense-Mutation in einem FMO3-Gen ist.
Polypeptid nach Anspruch 3, das die R238X-Variante der Rinder-FMO3 ist.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-4 kodiert, oder dessen Komplement.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 5, welche die Nukleinsäuresequenz ist, die in SEQ ID NR. 14 gezeigt ist.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, die mindestens einen spezifischen Teil einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-4 kodiert, und bis zu 500 kb einer 3'- und/oder 5'-angrenzenden genomischen DNA-Sequenz, oder dessen Komplement, umfasst.
Nukleinsäurefragment, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – einem spezifischen Fragment einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-4 kodiert, oder dessen Komplement. – SEQ ID NR. 9, – SEQ ID NR. 10, – SEQ ID NR. 11, – SEQ ID NR. 12, – SEQ ID NR. 16, – SEQ ID NR. 17 und – SEQ ID NR. 18.
Reihe von Primern zur Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 5-7, umfassend mindestens einen Primer, der aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäurefragmenten nach Anspruch 8 ausgewählt ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Mutation im FMO3-Gen eines Tiers, mit der Ausnahme von Menschen, wo die Mutation eine Änderung im Trimethylamin Metabolismus zur Folge hat, welches zu einem Fisch-Fremd-Aroma in einem Lebensmittel führt, das von dem Tier oder dessen Nachwuchs erhalten ist, worin das Verfahren umfasst: auf einem Sample von genomischer DNA, das von dem Tier erhalten ist, ein Segment der DNA, umspannend einen polymodischen Marker, mit PCR amplifizieren unter Anwendung eines Satzes von Primern nach Anspruch 9, welcher Satz von Primern sich spezifisch unter strengen Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren lässt, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-4 kodiert, oder welcher Satz von Primern sich unter strengen Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 7 spezifisch hybridisieren lässt, und Identifizierung in der amplifizierten DNA der Anwesenheit eines Allels eines polymorfischen Markers, der mit der Mutation im FMO3-Gen verbunden ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz umfassend eine Mutation im FMO3-Gen eines Tiers, mit der Ausnahme von Menschen, wo die Mutation eine Änderung im Trimethylamin-Metabolismus zur Folge hat, welches zu einem Fisch-Fremd-Aroma in einem Lebensmittel führt, das von dem Tier oder dessen Nachwuchs erhalten ist, worin das Verfahren umfasst: auf einem Nukleinsäuresample, das von dem Tier erhalten ist, die Anwesenheit einer Nukleinsäuresequenz in dem Nukleinsäuresample determiniert, welche Nukleinsäuresequenz für ein mutiertes FMO3-Polypeptid kodiert.
Verfahren zur Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 11, worin die Nukleinsäuresequenz durch Kontaktieren des Nukleinsäuresample mit einer Nukleinsäureprobe identifiziert wird, welche die Mutation umfasst, unter Bedingungen einer spezifischen Hybridisierung zwischen der Probe und der mutanten Sequenz, die identifiziert werden soll, sowie Identifizierung des Hybridisierungskomplex.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, worin die Anwesenheit der Nukleinsäuresequenz, die für das mutante Polypeptid kodiert, identifiziert wird durch Kontaktieren des Nukleinsäuresample mit einem Nukleinsäurefragment nach Anspruch 8, einem Nukleinsäurefragment, das sich unter strengen Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-4 kodiert, spezifisch hybridisieren lässt, oder einem Nukleinsäurefragment, das sich unter strengen Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 7 spezifisch hybridisieren lässt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, das ausserdem eine PCR-Amplifikation einer Sequenz aus dem Nukleinsäuresample umfasst, welche Sequenz mindestens den Teil der FMO3-Sequenz umfasst, worin die Mutation identifiziert werden soll.