DE60225196T2

DE60225196T2 - Marker-unterstützte rinderauswahl für verbesserte milchzusammensetzung

Info

Publication number: DE60225196T2
Application number: DE60225196T
Authority: DE
Inventors: Sarah Blott; Jong-Joo Kim; Anne Schmidt-Kuntzel; Anne Cornet; Paulette Berzi; Nadine Cambisano; Bernard Grisart; Latifa Karim; Patricia Simon; Michel Georges; Frederic Farnir; Wouter Coppieters; Sirja Moisio; Johanna Vilkki; Dave Johnson; Richard Spelman; Christine Ford; Russell Snell
Original assignee: GRISART BERNHARD
Current assignee: GRISART BERNHARD
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2002-08-16
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2022-08-17
Also published as: EP1608773A1; AU2002330791A1; CA2451592A1; WO2003104492A1; DE60225196D1; ATE386823T1; AU2002330791B2; EP1608773A4; CA2451592C; US20040254104A1; EP1608773B1; US7407750B2

Description

Erfindungsgebiet
Diese Erfindung betrifft eine Anwendung einer markerunterstützten Rinderauswahl aus quantitativen Wesenszugsorten (QTL), die in Verbindung mit einem erhöhten Milchvolumen und einer verbesserten Milchzusammensetzung stehen, insbesondere, wenn auch keineswegs ausschließlich, durch Feststellen des Vorhandenseins von mindestens einem Polymorphismus in demjenigen Gen, das den Wesenszugsorten (QTL) zugeordnet ist.
Hintergrund
Die genetische Basis der Rindermilchproduktion ist von immenser Bedeutung für die Milchindustrie. Die Fähigkeit, die Milchvolumen und den Milchinhalt einzustellen, birgt die Möglichkeit in sich, die Viehzucht zu ändern und Produkte zu erzeugen, die darauf zugeschnitten sind, einen ganzen Bereich von Forderungen zu erfüllen. Insbesondere würde ein Verfahren zur genetischen Auswertung von Rindern wünschenswert sein, um solche auszuwählen, die mit wünschenswerten Wesenszügen versehen sind, beispielsweise eine erhöhte Milchproduktion und eine verbesserte Milchzusammensetzung.
Bis heute ist die Rindergenomtheorie nicht verstanden worden, und wenig ist über die Gene bekannt, die für die Milchproduktion verantwortlich sind. Während es Berichte über die quantitativen Wesenszugssorte (QTLs) auf dem Rinderchromosomen 20 gibt, von dem angenommen wird, dass es mit der Milchproduktion in Verbindung steht (Georges et al, 1995; Arranz et al, 1998), sind die betreffenden, spezifischen Gene wegen der geringen, kartografischen Auflösung der laufenden, experimentellen Entwürfe (beispielsweise Mackay, 2001; Andersson, 2001; Flint und Mott, 2001; Mauricio, 2001) bis heute nicht identifiziert worden.
Im Folgenden werden die Dokumente Falaki et al, 1996, (D1) und Aggréy et al, 1999, (D4) erörtert. Falaki et al. untersuchten die Restriktionsbruchlängenpolymorphismen (RFLPs), die in Verbindung mit den Milchproduktionswesenszügen stehen, im Rinderwachstumhormonrezeptorgen (GHR), zogen aber keine bestimmten Schlussfolgerungen über die Wirkung von Polymorphismen auf die Milchwesenszüge. Aggréy et al. untersuchten RFLPs, die in Verbindung mit milchbezogenen Wesenszügen stehen, in der 5'-Seitenregion des Rinder-GHR-Gens, bestätigten aber nicht das vermutete Potential zur Verwendung eines Polymorphismus bei der markerunterstützten Auswahl.
Strategien zur Verbesserung der kartografischen Auflösung erfordern sehr oft das Züchten einer großen Anzahl von Nachkommen, um die Dichte der Kreuzungsstellen in den interessierenden Chromosomenregionen zu erhöhen (beispielsweise Darvasi, 1998). Wenn mit Menschen oder Hoftieren gearbeitet wird, ist eine solche Lösung nicht praktisch. Eine alternative Lösung ist die Verbindungsungleichgewichtskartografie (LD), die auf die Erforschung von historischen Rekombinanten abzielt und in einigen Viehbestandspopulationen, einschließlich Milchvieh, gezeigt worden ist und die sich im Vergleich mit menschlichen Populationen (Farnir et al, 2000) über sehr lange Chromosomenbereiche erstreckt. Die Langbereichs-LD ergibt wahrscheinlich nur eine begrenzte, kartografische Auflösung und das Auftreten einer Assoziierung bei der Abwesenheit der Verbindung aufgrund einer gametischen Assoziierung zwischen nicht syntenischen Orten. Eine QTL kann, wenn sie einmal kartografiert worden ist, bei der markerunterstützten Auswahl nutzbringend angewandt werden.
Die markerunterstützte Auswahl, die die Fähigkeit vorsieht, einem spezifischen, begünstigten, genetischen Allel zu folgen, umfasst die Identifizierung eines molekularen DNA-Markers oder mehrerer solcher Marker, der bzw. die mit einem Gen oder einer Gruppe von Genen abgeschieden werden, die einer QTL zugeordnet sind. DNA-Marker weisen mehrere Vorteile auf. Sie sind relativ leicht zu messen und sind unzweideutig. Da DNA-Marker kodominant sind, können heterozygote und homozygote Tiere bestimmt identifiziert werden. Wenn ein Markersystem eingerichtet worden ist, können die Auswahlentscheidungen sehr leicht getroffen werden, weil DNA-Marker zu jeder Zeit analysiert werden können, nachdem eine DNA-haltige Probe von einem individuellen, jugendlichen oder erwachsenen Tier oder sogar früher genommen wurde, weil es möglich ist, Embryos in vitro zu prüfen, wenn solche Embryos gesammelt werden.
Die Anmelder haben nun einen Polymorphismus in einem Gen identifiziert, das in Verbindung mit der QTL-Wirkung auf das Rinderchromosomen 20 steht.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Anwendungsverfahren zur markerunterstützten Auswahl dieses Polymorphismus im Rindergen zu schaffen, der mit einem erhöhten Milchproduktionsvolumen und einer geänderten Milchzusammensetzung in Verbindung steht; zusätzlich oder alternativ sollen Genmarker zur Verwendung bei diesem Verfahren vorgesehen werden; zusätzlich oder alternativ sollen Tiere ausgewählt werden, die das Verfahren gemäß der Erfindung verwenden, und ebenso soll Milch herstellbar sein, die von den ausgewählten Tieren erzeugt wird; ferner soll zusätzlich oder alternativ die Öffentlichkeit über eine nutzbringende Auswahl unterrichtet werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung eines Polymorphismus in der Transmembrandomäne des Wachstumshormonrezeptorgens, der mit einem erhöhten Milcherzeugungsergebnis und einer geänderten Milchzusammensetzung in Verbindung steht, und auf die Entdeckung von Seitenpolymorphismen. Der Polymorphismus in der Transmembrandomäne ist auch mit einer Zunahme des Lebendgewichts verbunden.
Im Einzelnen führt der Polymorphismus in der Kodesequenz des Rinderwachstumshormonrezeptorgens (GHR) für die Transmembrandomäne zu einer F279Y-Aminosäurensubstitution (diese erfolgt aufgrund einer einzelnen Basenänderung an der Position Nt836 in der cDNA-Sequenz T-A, die eine Kodonänderung TTT-TAT und die entsprechende Aminosäurenänderung von F nach Y ergibt, siehe SEQ-ID-Nr. 4 für die cDNA-Sequenz, SEQ-ID-Nr. 5 für die Aminosäurensequenz und SEQ-ID-Nr. 2 für die einschließende Gensequenz). Insbesondere sind die GHR-Allele, die durch die Substitution von A durch T (F279Y) gekennzeichnet sind, derart identifiziert worden, dass sie mit einem erhöhten Milchvolumen und einer geänderten Milchzusammensetzung bei Tieren in Abhängigkeit davon verbunden sind, ob sie homozygot mit oder ohne Substitution oder ob sie heterozygot sind, wenn sie ein substituiertes Allel tragen. Genauer gesagt ergibt das Vorhandensein der F279Y-Aminosäurenänderung einen erhöhten Milchertrag und eine Verminderung des Milchfetts und des Milchproteinprozentsatzes sowie des Lebendgewichts.
Ferner sind eine Anzahl von Nukleotidänderungen identifiziert worden, die die F279Y-Polymorphismusstelle umgeben (in 3 dargestellt) und für sich oder in Kombination verwendet werden können, um Haplotypen zu gewinnen, die dem F279Y-Allelenzustand entsprechen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich damit auf die Verwendung des Polymorphismus (F279Y) und/oder der Seitenpolymorphismen bei einem Verfahren zur Identifizierung und Auswahl eines Rinds, das diese Polymorphismen aufweist, und auf die Schaffung von Markern, die für eine solche Identifizierung spezifisch sind. Ausstattungssätze (Kits), die diese Marker zur Auswahl der Marker enthalten, und damit ausgewählte Tiere bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Genotypisieren von Kühen oder Bullen hinsichtlich der dort offenbarten Polymorphismen, der ausgewählten, derart genotypisierten Kühe und Bullen, der Milch, des Fleisches, der Embryos, und der Samen der ausgewählten Kühe bzw. Bullen gerichtet.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nun anhand der in den beigefügten Zeichnungen enthaltenen Figuren näher erläutert. Es zeigen:
1

A. einen Mikrosatellitenplan des Chromosomen 20. Der Name d3r entsprechenden Marker ist oben in der Figur und die zugehörige Position der Marker ist in Zentimorgan (Kosambi) unten in der Figur angegeben. GHRJA entspricht einem Mikrosatellitenmarker im Promotor des Wachstumshormonrezeptorgens. Die höchstwahrscheinliche Position des Prolaktinrezeptors (PRLR), der von der Aufspaltung von SNP-Markern abgeleitet ist (Sirja Moisio, in Vorbereitung) wird angegeben. Marker, die nicht mit Unterschieden von > 1000 eingeordnet werden konnten, sind in Klammern gesetzt. Die schwarze Kurve, die längs des oberen Quadranten des Plans verläuft, entspricht dem Informationsinhalt (ausgedrückt als Prozentsatz, rechte Y-Achse), der im GDD gewonnen wird.
B. eine übliche QTL-Kartografie. Die hellgraue Kurve und die dunkelgraue Kurve, die unten links beginnen, entsprechen Ortsmarken, die für den Milchprozentsatz bzw. für den Milchfettprozentsatz gewonnen werden. Die Ortsmarken werden als log(1/p) (linke Y-Achse) ausgedrückt, wobei p der chromosomenweiten Wahrscheinlichkeit entspricht, das entsprechende Signal unter der Nullhypothese zu gewinnen und kein QTL anzutreffen, das durch eine Phänotypänderung bestimmt wird. Die höchstwahrscheinlichen QTL-Positionen, die über 1000 Ureingabeproben (linke Y-Achse) gewonnen werden, sind als schwarze Vertikalbalken wiedergegeben. Das sich ergebende 95%-Vertrauensintervall ist als dicker, horizontaler, grauer Balken auf der oberen Achse der Figur gezeigt.
C. eine auf einen Haplotyp basierende Prüfung für die Zuordnung. Markerfenster, die bedeutende Wirkungen bei der auf einem Haplotyp basierenden Zuordnungsprüfung zeigen, sind als hellgraue Zylinder dargestellt, die sich in der Mitte oben im Diagramm befinden. Ihre Position in Bezug auf die linke Y-Achse entspricht annähernd ihrem Bedeutungswert, der derart bestimmt wird, wie es in M&M beschrieben worden ist.

2 LOD-Markenprofile, die für den Proteinprozentsatz längs des Chromosomen-20-Plans gewonnen werden, die LDVVM-Programme verwendet. Der Name der den Plan bildenden Marker ist oben in der Figur angegeben, während die entsprechende Position dieser Marker in Zentimorgan (Kosambi) unten in der Figur angegeben ist. Die als Kurven wiedergegebenen Daten sind durch die Nummerierung in der Figur dargestellt. Die Kurve 1 wird dadurch gewonnen, dass nur die Verbindungsinformation berücksichtigt wird, während alle anderen Kurven dadurch gewonnen werden, dass sowohl die Verbindung als auch das LD berücksichtigt werden. Die Kurve 2 stellt den Mikrosatellitenmarkerplan des Chromosomens 20 dar. Die Kurve 3 stellt vom Chromosomen 20 den Mikrosatellitenmarkerplan und sechs GHR-SNPs (F279Y[Nt836], Nt864 – 33[T-G], Nt933 + 21[A-G], Nt1095[T-C], N528T[Nt1583] und Nt1922[C-T]) dar. Die Kurve 4 stellt vom Chromosomen 20 den Mikrosatellitenmarkerplan und fünf GHR-SNPs (Nt836[F279Y] ausgenommen) dar. Die Kurve 5 stellt vom Chromosomen 20 den Mikrosatellitenmarkerplan und vier PRLR-SNPs dar. Die Rauten entsprechen den LOD-Marken, die durch eine Einzelpunktanalyse mit den einzelnen GHR-SNPs gewonnen werden. Die Namen der entsprechenden SNPs sind in den benachbarten Kästchen angegeben.
3 eine schematische Darstellung des Rinder-GHR-Gens. Die 10 Exons sind als große Zylinder gezeigt und mit einer Exonnummer bezeichnet. Kodesequenzen sind in Dunkelgrau gezeigt, während die 3'- und 5'-UTR-Sequenzen in Hellgrau gehalten sind. Introns sind als unterbrochene, dünne Zylinder gezeigt. SNPs sind als Linien gekennzeichnet, die mit einem Kästchen verbunden sind, die die entsprechende DNA-Sequenz angeben. Die SNPs, für die Ahnen 1 und 18 als heterozygot gefunden wurden, sind durch Sternchen gekennzeichnet. Bezug wird auf die SEQ-ID-Nrn. 1, 2 und 3 für die Genomsequenzen und auf die SEQ-ID-Nr. 4 für die cDNA-Sequenz sowie auf die Polymorphismen genommen.
4 die Frequenzverteilung der GHR-SNP-Haplotypen in der Holländisch-Holsteinisch-Friesischen Population.
5 ein UPGMA-Dendrogramm, das die genetische Verwandtschaft zwischen dem SC-Haplotyp und dem MC-Haplotyp an der Position 43,4 cM (Intervall GHR-TGLA53; Dendrogramm 5A) bzw. 42,7 cM (Dendrogramm 5B) darstellt. Die vertikalen Balken entsprechen (rechts) der Gruppe von Klustern, die die Wahrscheinlichkeit der Daten maximieren, und (links) dem Status des entsprechenden Haplotyps für die Nukleotidänderung, die eine F279Y-Mutation ergibt (F: weiß; Y: schwarz).
6 eine 104bp-Nukleotidsequenz des Rinder-GHR-Gens und die DNA-Sequenzänderung, die der Aminosäuren-F279Y-Änderung entspricht, die mit dem QTL (SEQ-ID-Nr. 62) verbunden ist. Die Primer, die für die Verstärkung der Region und der Position der für die Feststellung von Allelen benutzten Sonden verwendet werden, sind ebenfalls gezeigt (SEQ-ID-Nrn. 8, 9 10, 11).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es ist zunächst entdeckt worden, dass das GHR-Gen des Rinds mit dem QTL auf den Chromosomen 20 verknüpft ist, das mit verbesserten Milch- und Gewebeproduktionswesenszügen in Verbindung steht. Genauer gesagt ist ein neuer Polymorphismus im GHR-Gen entdeckt worden. Es wird angenommen, dass dieser Polymorphismus für diese Wesenszüge verantwortlich ist.
Das Verfahren, das zur Isolierung von Genen verwendet wird, die besondere Phänotypen verursachen, ist als positionelles Kandidatenklonen bekannt. Das Verfahren umfasst:

i) die chromosomale Lokalisierung des Gens, das die besonderen Phänotypen verursacht, wobei genetische Marker in einer Verbindungsanalyse verwendet werden, und
ii) die Identifizierung der Gene, die den besonderen Phänotyp verursacht, unter den „Kandidaten"-Genen, von denen bekannt ist, dass sie in der entsprechenden Region lokalisiert sind; die meisten dieser Kandidatengene werden aus einer verfügbaren Karteninformation von Menschen und Mäusen ausgewählt.

Die Bearbeitungsmittel zur Durchführung der Anfangslokalisierung (Schritt (i)) sind Mikrosatellitenmarkerkarten, die für Vieharten verfügbar und im öffentlichen Bereich (Eishop et al., 1994; Barendse et al., 1994; Georges et al., 1995; Kappes, 1997) vorhanden sind. Die Bearbeitungsmittel, die für das positionelle Kandidatenklonen gebraucht werden (Schritt (ii) oben), insbesondere die BAC-Bibliotheken, sind teilweise im öffentlichen Bereich verfügbar. Die Genom-Bibliotheken mit großen Einfügungen, die mit Bacterial Artificial Chromosomes (BAC; bakteriellen, künstlichen Chromosomen) aufgebaut sind, sind im öffentlichen Bereich für die meisten Vieharten einschließlich Rindvieh verfügbar. Die generellen Prinzipien des positionellen Kandidatenklonens können Collins, 1995, und Georges und Anderson, 1996, entnommen werden.
Neuerdings ist von einer quantitativen Wesenszugstelle (QTL) berichtet worden (Georges et al., 1995; Arranz et al., 1998), die gezeigt worden ist, um den Milchertrag und die Milchzusammensetzung zu beeinflussen. Die genaue Stelle (QTL) auf dem Chromosonen 20 jedoch ist nicht bekannt gewesen.
Durch Verwendung einer dichteren Chromosomen-20-Karte und durch Verwertung von Verbindungsgleichgewichtsstörungssverfahren, die die Kartenposition der QTL verfeinern, wurde festgestellt, dass der Chromosomenabschnitt, der für den Wachs tumshormonrezeptor kodiert, für mindestens einen Teil der Chromosomen-20-QTL-Wirkung verantwortlich ist.
Diese Wirkung wurde ferner in die Karte der Nukleotidsequenz des GHR-Gens und eines mit dem Chromosomen 20 verbundenen Polymorphismus aufgenommen, wobei gezeigt wird, dass diese Wirkung eine einzelne Basenänderung an der Position Nt836 in der cSDNA-Sequenz T-A aufweist, die eine Kodonänderung TTT-TAT und die entsprechende Aminosäurensubstitution F279Y ergibt. Einige der im Rinder-GHR-Gen identifizierten, genetischen Polymorphismen sind in 3 gezeigt. Die cDNA-Sequenz wird ebenfalls als SEQ-ID-Nr. 4 ausgewiesen.
Die in den Figuren gezeigte Sequenzinformation gibt Anlass für zahlreiche und getrennte Aspekte der Erfindung.
Gemäß einem Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Feststellung des genetischen Vorzugs eines Rinds hinsichtlich der Milchzusammensetzung und des Milchvolumens und/oder des Lebendgewichts vor, wobei dieses Verfahren den Schritt der Feststellung des GHR-Genotyp-Zustands des Rinds aufweist. Insbesondere ist dieses Verfahren für das Genotypisieren und das Auswählen von Kühen und Bullen nützlich, die den gewünschten Genotypstatus aufweisen, so dass Milch, Fleisch, Embryos und Samen von diesen Kühen bzw. Bullen gesammelt werden können. Ein solcher Samen würde für Zuchtzwecke nützlich sein, um Rinder zu erzeugen, die den gewünschten Genotyp und damit den gewünschten Phänotypstatus aufweisen. Ferner sind die durch die Verfahren gemäß der Erfindung genotypisierten Kühe auch für Zuchtzwecke nützlich, insbesondere für das Züchten mit den ausgewählten Bullen, und/oder für die künstliche Befruchtung mit dem Samen der ausgewählten Bullen. Die Embryos und die durch solche Kühe erzeugte Nachkommenschaft bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer Ausbildung der Erfindung wird der Genotypstatus mit Bezug auf die DNA festgestellt, die von diesen Rindern gewonnen wird.
Alternativ wird dieser Genotypstatus mit Bezug auf die mRNA festgestellt, die von diesen Rindern gewonnen wird.
Gemäß einer weiteren Ausbildung der Erfindung wird der Genotypstatus mit Bezug auf die Aminosäurensequenz eines ausgedrückten Rinder-GHR-Protein festgestellt, die von diesen Rindern gewonnen wird.
In üblicher Weise wird bei diesem Verfahren der Genotypstatus der die Rinder-GHR kodierenden DNA direkt oder indirekt festgestellt.
Alternativ wird bei diesem Verfahren der Genotypstatus mindestens einer Nukleotiddifferenz von der die Rinder-GHR kodierenden Nukleotidsequenz direkt oder indirekt festgestellt.
Im Einzelnen wird bei diesem Verfahren der Genotypstatus des Rinder-GHR-Allels (Allele), das durch die Nukleotidsubstitution an der Stelle Nt836 auf der cDNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 4) (Ersatz von TTT durch TAT, der eine entsprechende Substitution der F279Y-Aminosäure ergibt) gekennzeichnet ist, direkt oder indirekt festgestellt.
Alternativ wird bei diesem Verfahren der Genotypstatus des Rinder-GHR-Allels (Allele), das durch die in 3 genannten Nukleotidsubstitutionen gekennzeichnet ist, entweder direkt oder indirekt festgestellt.
Es gibt zahlreiche, dem Fachmann geläufige Standardverfahren zur Feststellung, ob eine besondere DNA-Sequenz in einer Probe vorhanden ist. Ein Beispiel ist die Po lymerase Chain Reaction (PCR; Polymerasekettenreaktion). Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung umfasst daher einen Verfahrensschritt, der zur Feststellung, ob die Substitution von T durch A an der Stelle Nt836 in der Sequenz der GHR-cDNA vorhanden ist, das Verstärken der DNA bei der Anwesenheit von Primern, die auf der Nukleotidsequenz des GHR-Gens und der Seitensequenz beruhen, und/oder bei der Anwesenheit eines Primers umfasst, der mindestens einen Teil eines Polymorphismus enthält, der hier offenbart ist und der bei seiner Anwesenheit eine geänderte, relative Milchfett- und Proteinproduktion sowie eine geänderte Milchmenge ergibt. Derselbe technische Vorgang kann unternommen werden, um den Genotypstatus jedes Polymorphismus oder aller Polymorphismen festzustellen, die in 3 dargestellt sind. Der F279Y-Aminosäurensubstitutionspolymorphismus wird als Beispiel in den folgenden Beschreibungen verwendet.
Ein Primer gemäß der vorliegenden Erfindung, der beispielsweise bei der PCR verwendet wird, ist ein Nukleinsäurenmolekül, das ausreichend komplementär zu der Sequenz, auf der er basiert, und ausreichend lang ist, um den entsprechenden Teil eines Nukleinsäurenmoleküls selektiv zu hybridisieren, das verstärkt und von dem eine Synthese unter in-vitro-Bedingungen gefördert werden soll, die gewöhnlich bei der PCR verwendet werden. Ebenso ist eine Sonde der vorliegenden Erfindung ein Molekül, beispielsweise ein Nukleinsäurenmolekül mit genügender Länge und genügender Komplementärität zu dem interessierenden Nukleinsäuremolekül, das sich unter mehr oder weniger strengen Bedingungen an die interessierende Nukleinsäurensequenz zur deren Feststellung in Anwesenheit von Nukleinsäurenmolekülen bindet, die unterschiedliche Sequenzen aufweisen. Ein Marker gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäurenmolekül, das dem GHR-Gen oder einem Bruchstück oder einer Variante dieses Gens oder einer Seitenregion entspricht, die für das Genotypisieren und/oder Auswählen eines Rinds nützlich ist, das einen oder mehrere Polymorphismen gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist. Einzelne Marker gemäß der vorliegenden Erfindung oder eine Kombination von Markern, die einen Haplotyp-Markersatz (d. i. ein Haplotyp, der eine Markergruppe bildet, die zur Feststellung des Genotypstatus über eine Region einer DNA oder eines Allels, insbesondere mit Bezug auf den Status des F279Y-Polymorphismus, verwendet wird) aufweisen bzw. aufweist, können dazu verwendet werden, ein Rind gemäß der vorliegenden Erfindung zu genotypisieren oder auszuwählen.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Feststellung der genetischen Vorteile des Rinds in Bezug auf den Milchgehalt und die Milchmenge hinsichtlich eines Materialmusters vor, das eine von einem Rind gewonnene mRNA aufweist. Dieses Verfahren umfasst das Feststellen, ob eine A-durch-T-Substitution in der Sequenz der den GHR kodierenden mRNA vorhanden ist. Das Vorhandensein einer derartigen Substitution zeigt wieder eine Verbindung mit einer geänderten, relativen Milchmenge und -zusammensetzung an.
Wenn nun wieder ein Verstärkungsverfahren wie die PCR für die Feststellung verwendet wird, ob der Polymorphismus in der die GHR kodierenden mRNA vorhanden ist, umfasst dieses Verfahren ein umgekehrtes Transkribieren der mRNA, wobei eine umgekehrte Transkriptase verwendet wird, um eine cDNA zu erzeugen und dann diese cDNA in Anwesenheit eines Primerpaars zu verstärken, das komplementär zu einer Nukleinsequenz ist, die ein Protein kodiert, das die biologische Aktivität einer Wildtyp-GHR aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt weist die Erfindung die Verwendung eines Musters bei dem Verfahren zum Genotypisieren gemäß der Erfindung auf, wobei das Muster aus beliebigen fünf oder mehreren benachbarten, in 2 gezeigten Nukleotiden der GHR-Sequenz ausgewählt wird, die deshalb genügend komplementär zu einer diese Rinder-GHR kodierenden Nukleinsäurensequenz oder zu deren Komplement ist, so dass sie sich daran unter strengen Bedingungen bindet. Ein derartiges Muster enthaltene Diagnostikkits sind ebenfalls vorgesehen. Diese Muster können aus Folgendem ausgewählt werden:
Die Erfindung weist ferner ein isoliertes Nukleinsäuremolekül auf, das ein DNA-Molekül, das ganz oder teilweise die in 6 dargestellte Nukleinsäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 62) umfasst oder das von der Sequenz aufgrund der Entartung des genetischen Kodes abweicht, oder einen Nukleinsäurenstrang enthält, der sich mit dem genannten Nukleinsäuremolekül unter strengen Hybridisierungsbedingungen hybridisieren kann.
Die Erfindung umfasst eine isolierte mRNA, die von einer DNA transkribiert wird, die eine Sequenz aufweist, die einem Nukleinsäuremolekül der Erfindung entspricht.
Die Erfindung umfasst ferner eine Primerzusammensetzung, die für die Feststellung der Anwesenheit der die GHR kodierenden DNA und/oder der Anwesenheit der DNA nützlich ist, die ein geändertes Protein kodiert. Bei einer Form kann die Zusammensetzung einen Nukleinsäurenprimer aufweisen, der im Wesentlichen komplementär zu einer die GHR kodierenden Nukleinsäuresequenz ist. Die Nukleinsäuresequenz kann ganz oder teilweise die in 6 gezeigte sein (SEQ-ID-Nr. 62). Eine derartige Zusammensetzung aufweisende Diagnostikkits sind ebenfalls vorgesehen.
Die Erfindung sieht ferner ein Diagnostikkit vor, das zur Feststellung der ein geändertes GHR-Protein im Rind kodierenden DNA nützlich ist, wobei dieses Kit einen ersten Primer und einen zweiten Primer zur Verstärkung der DNA aufweist und diese Primer komplementär zu Nukleotidsequenzen der DNA in Aufwärtsrichtung bzw. in Abwärtsrichtung von einem Polymorphismus im Teil der die GHR kodierenden DNA sind, wodurch sich eine geänderte Milchmenge und Milchzusammensetzung ergibt. Das Kit kann auch weitere Primer aufweisen, die komplementär zu einer der T- oder A-Varianten ist, die auf dem GHR-Gen vorhanden sind.
Die Entwicklung von allelspezifischen Antikörpern, die die Anwesenheit des F oder des Y an der Stelle 279 des GHR-Gens feststellen sollen, ist ebenfallls beabsichtigt. Verfahren zum Präparieren dieser Antikörper sind dem Fachmann an sich bekannt. Diese allelspezifischen Antikörper können dann bei einem Verfahren zur Auswahl von Rindtieren verwendet werden. Insbesondere ist ein Diagnostikkit beabsichtigt, das diese Antikörper und Mittel zur Feststellung des Antikörpers enthält, wenn sie an die DNA gebunden sind. Das Diagnostikkit kann auch ein Handbuch zur Verwendung des Kits aufweisen.
Auf Antikörper beruhende Diagnostiken sind aber nicht die einzige Möglichkeit. Ein weiteres Diagnostikkit kann eine Nukleotidsonde, die zu der in 6 gezeigten Sequenz oder zu einem Oligonukleotid-Bruchstück davon für die Hybridisierung mit einer mRNA von einer Zellprobe komplementär ist, und Mittel zur Feststellung der Nukleotidprobe aufweisen, das mittels eines Standardverfahrens an die mRNA in der Probe gebunden wird. Gemäß einem besonderen Aspekt umfasst das Kit dieses Aspekts der Erfindung eine Sonde mit einem Nukleinsäurenmolekül, das ausreichend komplementär zu einer in 6 gezeigten Sequenz oder deren Komplement ist, so dass sie sich daran unter strengen Bedingungen bindet. Der Begriff „Strenge Hybridisierungsbedingungen" hat eine übliche Bedeutung für einen Fachmann. Geeignete, strenge Bedingungen, die die Nukleinsäurenhybridisierung fördern, beispielsweise sechsmal Natriumchlorid/Natriumzitrat (SSC bei einer Temperatur von etwa 45°C sind dem Fachmann an sich bekannt und sind in den „Current Protocols in Molecular Biology", Verlag Wiley Sons, NY, 1989, offenbart. Geeignete, strenge Waschvorschriften hängen vom Homologiegrad und der Probenlänge ab. Wenn die Homologie 100% beträgt, kann eine hohe Temperatur (65–75°C) verwendet werden. Wenn die Homologie geringer ist, muss eine niedrigere Waschtemperatur verwendet werden. Wenn jedoch das Muster sehr kurz ist (< 100 bp), muss sogar bei einer Homologie von 100% eine niedrigere Temperatur benutzt werden. Generell wird das Waschen bei niedrigen Temperaturen (37–40°C) begonnen, und dann wird die Temperatur in 3–5°C-Schritten erhöht, bis der Hintergrund niedrig genug ist, damit er keinen Hauptfaktor bei der Autoradiografie ist. Das Diagnostikkit kann auch ein Handbuch für die Benutzung des Kits aufweisen.
Eine der Hauptanwendungen der vorliegenden Erfindung besteht in der markerunterstützten Auswahl von Rindern, die einen Polymorphismus im GHR-Gen aufweisen und die mit verbesserten Milcherzeugungswesenszügen verbunden sind. Die Erfindung sieht daher einen Diagnostilkit vor, das dazu verwendet werden kann, beispielsweise den GHR-Genotyp des genetischen Rindermaterials zu bestimmen. Ein Kit umfasst einen Primersatz, der zur Verstärkung des genetischen Materials verwendet wird. Ein Kit kann einen Primer aufweisen, der eine Nukleotidsequenz zur Verstärkung einer Region des genetischen Materials enthält, die den A-durch-T-Substitutionspolymorphismus umfasst, der die hier beschriebene F279Y-Aminosäurenänderung kodiert. Ein derartiges Kit kann auch einen Primer zur Verstärkung der entsprechenden Region des normalen GHR-Gens, d. i. die Sequenz ohne den Polymorphismus, enthalten. Gewöhnlich enthält ein derartiges Kit auch einen weiteren Primer in Aufwärtsrichtung oder Abwärtsrichtung von der interessierenden Region, der zu einem kodierenden und/oder nicht kodierenden Teil des Gens komplementär ist. Diese Primer werden zur Verstärkung desjenigen Abschnitts verwendet, das die interessierende Mutation, d. h. den Polymorphismus, enthält.
Insbesondere ist die Erfindung auf die Verwendung des Polymorphismus im GHR-Gen beim Genotypisieren von Kühen und Bullen und auch von Kühen und Bullen gerichtet, die durch ein derartiges Genotypisieren ausgewählt werden, bei dem die im GHR-Gen vorhandene Änderung festgestellt worden ist. Derartig ausgewählte Bullen bilden einen wertvollen Zuchtviehbestand, und die Erfindung ist auch auf den Samen gerichtet, der durch derartig ausgewählte Bullen für Zuchtzwecke erzeugt wird. Derartig ausgewählte Kühe und deren Nachkommenschaft bilden ebenfalls einen wertvollen Zuchtviehbestand. Ferner können derartige Kühe wertvolle Milchherden bilden, weil die von solchen Kühen erzeugte Milch in größeren Mengen als bei äquivalenten, nicht ausgewählten Kühen erzeugt wird und/oder eine geänderte Zusammensetzung insofern aufweist, als diese einen niedrigeren Milchfettprozentsatz und einen niedrigeren Milchproteinprozentsatz hat, die der Erbschaft von Tyrosin an der Stelle 279 im GHR-Protein entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher das Genotypisieren von Rindern, sowohl Kühen als auch Bullen, für die hier beschriebene Variation der A-durch-T-Substitution, von ausgewählten Kühen und Bullen, von Milch und Samen, die durch die ausgewählten, genotypisierten Kühe und Bullen erzeugt werden und der Nachkommenschaft, die von den ausgewählten Rindern erzeugt wird und die Embryos und Zellen (einschließlich Zelllinien) umfasst, die für das Klonen des genannten, ausgewählten Rinds nützlich sind.
Das aktuelle Genotypisieren wird unter Verwendung von Primern durchgeführt, die auf einen spezifischen, hier beschriebenen Polymorphismus abzielen und die als allelspezifische Oligonukleotide bei der üblichen Hybridisierung, den Taqmann-Analysen, den OLA-Analysen usw. arbeiten können. Alternativ können die Primer derart beschaffen sein, dass sie ein Genotypisieren durch Mikrosequenzierung erlauben.
Diese Primer sind aber nur eine Auswahl der Anwendungen dieser Erfindung. Weitere Anwendungen werden dem Fachmann einleuchten und sind keineswegs ausgeschlossen. Im Gegenteil, die Erfindung deckt nicht nur die vorgesehenen, spezifischen Lehren ab, sondern erstreckt sich auf alle Variationen und Modifikationen, die im Sinn und der Absicht des Adressaten sind.
Die Erfindung wird nun anhand von besonderen Beispielen näher erläutert, die die Erfindung jedoch in keiner Weise beschränken sollen.
Versuchsbeispiele
1. Materialien und Verfahren
Herkunftsmaterial
Das in dieser Untersuchung verwendete Herkunftsmaterial umfasst Folgendes:

– Datensatz I: ein vorher beschriebenes Aufbaumuster aus einer Schwarz- und Weiß- und Holstein-Friesischen Enkelin, von dem eine Probe in den Niederlanden genommen wurde und das aus 22 väterlichen, halbgeschwisterlichen Familien bei einer Gesamtmenge von 987 Bullen zusammengesetzt ist (Spelman et al., 1996; Coppieters et al., 1998a);
– Datensatz II: 276 nachwuchsgeprüfte Holstein-Friesische Vatertiere, von denen eine Probe in den Niederlanden genommen wurde;
– Datensatz III: 1550 nachwuchsgeprüfte Holstein-Friesische Vatertiere, von denen eine Probe in Neuseeland genommen wurde;
– Datensatz IV: 959 nachwuchsgeprüfte Jersey-Vatertiere, von denen eine Probe in Neuseeland genommen wurde;
– Datensatz V: 485 Holstein-Friesusche Kühe, von denen eine Probe in Neuseeland genommen wurde;
– Datensatz VI: 387 Jersey-Kühe, von denen eine Probe in Neuseeland genommen wurde.

Phänotypen
Phänotypen waren Tochterertragsabweichungen (DYD) für Bullen, Milchabsonderungswerte (LV = nicht rückläufige, erste Milchabsonderungsabweichungen) für Kühe und auch durchschnittliche, väterliche, vorausgesagte Übetrtragungsfähigkeiten (PTA) für Bullen und Kühe für den Milchprotein- und Milchfettertrag wie auch für den Protein- und Fettprozentsatz (Van Raden & Wiggans, 1991). DYDs, Milchabsonderungswerte und PTA wurden von CR-DELTA (Niederlande; Datensätze I und II) bzw. von LIC (Neuseeland; Datensätze III-VI) direkt gewonnen.
Kartenaufbau
Das Mikrosatelliten-Genotypisieren, der Kartenaufbau und die Informationsinhalts-Kartenerstellung wurden durchgeführt, wie es vorher beschrieben wurde (Coppieters et el., 1998a). Die Sequenzinformation für die Primer, die für die PCR-Verstärkung der Mikrosatellitenmarker vom anonymen Typ II verwendet werden, kann von ArkDB (http://www.thearkdb.org/species.html) bezogen werden. Die folgenden Primer wurden auf der Basis von Heap et al., 1995, aufgebaut, um einen Mikrosatelliten in der Promotorregion des Wachstumshormon-Rezeptorgens zu verstärken: GHRJA.UP: 5'-TGCTCTAATCTTTTCTGGTACCAGG-3' und GHRJA.DN: 5'-TCCTCCCCAAATCAATTACATTTTCTC-3' (SEQ-ID-Nr. 60 bzw. 61).
Übliche QTL-Kartenerstellung
Die QTL-Kartenerstellung wurde durch eine Vielfachmarker-Rückentwicklung durchgeführt, wobei die vorher erwähnte HSQM-Software (Coppieters et al., 1998a) verwendet wurde. Die chromosomengroßen Signifikanzschwellwerte wurden durch eine Vertauschung bestimmt, wie sie vorher beschrieben wurde (Churchill & Doerge, 1995; Coppieters et al., 1998b). Isolierte Vatertierfamilien wurden auf der Basis von Ergebnissen von Analysen innerhalb der Familie idntifiziert, wie es vorher beschrieben wurde (Coppieters et al., 1998a).
Auf dem Haplotyp beruhende Prüfung auf Verbindung
Annahmen: es wurde angenommen, dass ein QTL durch zwei zusätzlich arbeitende Allele, nämlih „Q" und „q", gekennzeichnet ist, die in der interessierenden Population mit entsprechenden Allelfrequenzen q und (1 – q) isoliert werden. Es wurde ferner angenommen, dass das „Q"-Allel in der Population durch Mutation oder Wanderung auf einem Chromosomen des Haplotyps „H" für eine Reihe von Seitenmarkern auftritt. Alle anderen Haplotypen waren als „Q" ausgebildet und wurden so bezeichnet. Bei der vorliegenden Generation kann sich der „H"-Haplotyp noch in der LD befinden, bei der das „Q"-Allel eine Menge D aufweist. Die Wirkung der „O"-durch-„H"-Haplotypsubstitution kann dann den folgenden Wert annehmen:
wobei α der halben Differenz zwischen den Phänotypwerten der „QQ"-Individuen zu den „qq"-Individuen entspricht und h der Populationsfrequenz des „H"-Haplotyps entspricht (Falconer & Mackay, 1996).

Prüfung auf Verbindung: es wurde vorausgesetzt, dass in dem vorliegenden GDD Phasenmarkergenotypen für alle Söhne, deren Vatertiere, aber nicht deren Muttertiere verfügbar waren, da die Muttertiere nicht markergenotypisiert waren, und dass T_i zu (DYD_i – PA_i) wird, wobei DYD_i die Tochterertragsabweichung des Sohns i und PA_i die durchschnittliche, vorausgesagte Übertragungsfähigkeit (Van Raden und Wiggans, 1991) des Vatertiers und Muttertiers des Sohns i war. Unter diesen Voraussetzungen kann der erwartete Wert von T_i als eine Funktion des Markergenotyps der Vatertierchromosomen (SC) und der Markergenotypen der väterlichen (PC) und mütterlichen (MC) Fortpflanzungszellen ausgedrückt werden, die vom Sohn i vererbt wurden, wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt ist: Tabelle 1 Erwartete Werte von T (= DYD – PA) als Funktion des Markergenotyps des Vatertiers und der Markergenotypen der väterlichen und mütterlichen Fortpflanzungszellen, die durch den Sohn vererbt wurden

Väterlicher Genotyp I (SC)	Väterliche Fortpflanzungszelle (PC)	Mütterliche Fortpflanzungszelle	(MC)
Väterlicher Genotyp I (SC)	Väterliche Fortpflanzungszelle (PC)	H	O
HH	H	T = 1/2αh	T = –1/2α(1 – h)
HO	H	T = 1/2α(1 + h)	T = 1/2αh
HO	O	T = –1/2α(1 – h)	T = –1/2α(2 – h)
OO	O	T = 1/2αh	T = –1/2α(1 – h)

SC, PC, MC, H, O, α und h werden wie im Abschnitt „Materialien und Verfahren" definiert.

Die erwarteten Werte von T_i waren ersichtlich lineare Funktionen der unbekannten Haplotypsubstitutionswirkung α. Mindestens die Eckwerteeinschätzung von α waren deshalb durch lineare Regression leicht gewonnen, während das Verhältnis:
das als F-Statistikwert mit 1 und n – 2 Freiheitsgraden verteilt wird, dazu verwendet wurde, das Auftreten zugunsten einer statistisch bedeutenden Haplotypsubstitutionswirkung zu messen. n entspricht der im GDD verfügbaren Anzahl der Söhne.
Wenn T_i als Phänotyp verwendet wurde, wurde im Wesentlichen eine Übertragungsungleichgewichtsprüfung (TDT; Spielman et al., 1993) durchgeführt, die gleichzeitig die Zuordnung und Verbindung prüfte. Da die Muttertiere nicht genotypisiert waren, wurde die TDT teilweise auf die übliche Zuordnungsprüfung beschränkt.
Auswahl der Marker und der Haplotypen: bis hierher haben die Anmelder nicht definiert, welche der auf dem Chromosomen verfügbaren m Marker betrachtet werden müssen, wenn ein Haplotyp bestimmt wird. Da der genaue Ort des QTL und auch die Größe des Haplotyps nicht bekannt sind, der das α maximiert, wurden alle möglichen Fenster, die zwischen einem und m benachbarten Marker enthalten sind, getrennt geprüft. Die Anmelder prüften auf diese Weise m Fenster eines Markers, (m – 1) Fenster zweier Marker, (m – 2) Fenster von drei Markern, ... und ein Fenster von m Markern.
Nachdem die den Haplotyp zusammensetzenden Marker ausgewählt worden waren, war es nötig, den „H"-Haplotyp unter allen Haplotypen auszuwählen, die in der Population angetroffen wurden. Bei dem vorgeschlagenen Verfahren entsprachen die Haplotypen, die nacheinander als „H"-Haplotypen betrachtet wurden, den Chromosomen der „s"-Vatertiere im GDD, von dem bekannt war, dass es heterozygot „Qq" für den QTL ist, der auf den Ergebnissen einer markerunterstützten Isolierungsanalyse beruht, die bei ihren Söhnen durchgeführt wurde (siehe oben). Wie von vornherein bekannt war, welche der Homologen der Vatertiere das „Q"-Allel trugen, wurden die Haplotypen bei einer Gesamtmenge von 2s Homologen geprüft, die beiden Chromosomen entsprachen.
Bei der Abschätzung der Substitutionswirkung der Haplotypen eines gegebenen Vatertiers wurden dessen Söhne vom Datensatz entfernt, um das Herausziehen einer Information zu vermeiden, die mit der Verbindungsanalyse redundant wäre.
Signifikanzschwellwerte: das oben definierte F-Verhältnis hat keine Bedeutung für die durchgeführten Vielfachprüfungen, d. h., die (m² + m)/2 Markerfenster, die für jedes der 2s Homologen geprüft wurden. Die Anmelder berücksichtigten die Vielfachprüfung durch Anwendung einer Permutationsprüfung. Die Phänotypen und Markergenotypen wurden tausendmal umgesetzt, und die 2s(m² + m)/2 Prüfungen wurden mit jedem Datensatz durchgeführt. Die mit den Realdaten gewonnenen, höchsten F-Verhältnisse wurden dann mit den höchsten F-Verhältnissen verglichen, die von den 1000 Permutationen gewonnen wurden.
Gleichzeitige Gewinnung der Verbindung und der Verbindungsgleichgewichtsstörung
QTL-Feinkartografie, die sowohl die Verbindung als auch die LD ausnutzt: das verwendete Kartografieverfahren wurde mit den LDVCM-Programmen (LD-Varianz-Komponenten-Kartografie) durchgeführt und in folgender Weise zusammengefasst. Um das Vorhandensein eines QTL an der Kartenstelle p der betrachteten Chromosomen zu prüfen:

1. Für alle Marker auf dem betrachteten Chromosomen bestimmte der Anmelder die Markerverbindungsphase der Vatertiere und Söhne, wie es schon beschrieben wurde (Farnier et al., 2002). Daher bestanden die Markerdaten dann aus 2s Vatertierchromosomen (SC), n väterlich vererbten Chromosomen der Söhne (PC) und n mütterlich vererbten Chromosomen der Söhne (MC), wobei s und n der Anzahl der Vatertierfamilien bzw. der Anzahl der Söhne im GDD entsprachen. Aus den Genotypen der PC wurde die Wahrscheinlichkeit leicht errechnet, dass der Sohn i das „linke" (λ_p) oder „rechte" (p_p = 1 – λ_p) SC von seinem Vatertier an der Kartenstelle p erbte (Coppieters et al., 1998b).
2. Der Anmelder berechnete die Wahrscheinlichkeiten (Φ_p) der Identität durch Erbfolge (IBD) für alle paarweisen Kombinationen von SC und MC, wobei das von Meuwissen & Goddard, 2001, beschriebene Verfahren verwendet wurde. Dieses Verfahren erreicht fast die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Chromosomen IBD sind bei einer gegebenen Kartenposition, bedingt durch den Zustand der Identität durch Stellung der Seitenmarker auf der Basis der Vereinigungstheorie (Hudson, 1985). Die Fenster von sechzehn Markern wurden betracht, um Φ_p zu berechnen.
3. Bei der Benutzung von (1 – Φ_p) als Entfernungsmaß wendeten die Anmelder den UPGMA-hierarchischen Klusteralgorithmus an (beispielsweise Mount, 2001), um ein festgewurzeltes Dendrogramm zu erzeugen, das die genetische Verwandtschaft an der Position p zwischen allen SC- und MC-Haplotypen darstellt, die in der Population angetroffen wurden.
4. Der Anmelder verwendete den logischen Rahmen, der durch dieses Dendrogramm geschaffen wurde, um die SC und MC in funktionell festgelegten Klustern zu gruppieren. Ein Kluster wird als Gruppe aus Haplotypen definiert, die in einem gemeinsamen Knoten vereinigt sind. Ein nützliches Merkmal der UPGMA-Bäume in dieser Hinsicht ist, dass die Entfernung (1 – Φ_p) zwischen allen Haplotypen, die sich in einem gegebenen Knoten vereinigen, ≤ 2 × der Entfernung zwischen dem Knoten und einem dieser Haplotypen ist. Als Folge wird der Baum in Abwärtsrichtung von der Wurzel abgetastet, und die Zweige werden abgeschnitten, bis die Knoten erreicht worden sind, so dass alle vereinigten Haplotypen (das sind alle Haplotypen innerhalb des Klusters) ein Entfernungsmaß (1 - Φ_p) < T aufweisen (Kim et al., 2002).
5. Der Anmelder modellierte die Phänotypen der Söhne (DYDs), wobei das folgende Modell verwendet wurde: Y = Xb + Zhh + Zuu + e, wobei y der Vektor der Phänotypaufzeichnungen aller Söhne, b ein Vektor von festen Wirkungen, die in dieser Studie das Gesamtmittel vermindern, X eine Inzidenzmatrix, die die festen Wirkungen auf individuelle Söhne bezieht, die in dieser Studie auf einen Vektor von Einheiten vermindert werden, h der Vektor der Zufalls-QTL-Wirkungen, die den definierten Haplotypklustern entsprechen, und Z_h ein Inzidenzmatrix ist, die die Haplotypkluster auf individuelle Söhne bezieht. Ferner kann in Z_h ein Maximum von drei Elementen je Linie einen Nichtnullwert aufweisen: „1" in der Spalte, die dem Kluster entspricht, zu dem der MC-Haplotyp gehört, „λ_p" und „p_p" in den Spalten, die den Haplotypklustern des „rechten" SC bzw. des „linken" SC entsprechen. Wenn einer des SC und/oder Mc zum selben Kluster gehört, werden die entsprechenden Koeffizienten addiert. Zu ist eine diagonale Inzidenzmatrix, die individuelle, vielfachgenetische Wirkungen auf individuelle Söhne bezieht, und e ist ein Vektor von individuellen Fehlerbedingungen. Haplotypklusterwirkungen mit entsprechender Varianz σ² _H, individuelle vielfachgenetische Wirkungen mit entsprechender Varianz σ² _A und individuelle Fehlerbedingungen mit entsprechender Varianz σ² _E wurden abgeschätzt, wobei AIREML (Johnson und Thompson, 1955) durch Maximierung der folgenden, beschränkten, logarithmischen Wahrscheinlichkeitsfunktion L verwendet wurde: L = -.5In|IV|-.5In|XTV–1X|-.5(y – X^b)TV–1(y – X^b) In dieser Funktion ist: V = σ2 HZhHZT h + σ2 AZuAZT u + σ2EI. Weil der Anmelder annahm, dass die Kovarianz zwischen den QTL-Wirkungen der verschiedenen Haplotypklustern Null ist, beschränkt sich H auf eine Identitätsmatrix. Diese differenziert die vorhandene Näherung von der von Meuwissen und Goddard, 2000, in der H die Matrix zwischen den Haplotyp-IBD-Wahr scheinlichkeiten ist. A ist die additive, genetische Verwandschaftsmatrix (Lynch und Walsh, 1997).
6. Die Schritte 4 und 5 wurden für alle möglichen Werte von T (von 0 bis 1) wiederholt, um eine beschränkte, maximale Wahrscheinlichkeitslösung (REML) für die Kartenposition p zu identifizieren. In Analogie zu Farnir et al., 2000, bezeichnete der Anmelder die dieser REML-Lösung entsprechende Hypothese als H₂.

QTL-Kartografie, die nur die Verbindung auswertet: es sei bemerkt, dass das vorhergehende Modell mit geringen Änderungen ausgeweitet werden kann, um den QTL nur durch Auswertung der Verbindungsinformation zu kartografieren. Dies wurde einfach dadurch erreicht, dass alle MCs ignoriert wurden und angenommen wurde, dass alle SCs zu bestimmten Haplotypklustern gehören, ungeachtet ihres Markergenotyps. Die REML-Lösungen für die verschiedenen Parameter wurden gefunden, wie es im vorhergehenden Abschnitt beschrieben wurde. Wieder in Analogie zu Farnir et al., 2002, wurde die entsprechende Hypothese als H₁ bezeichnet.
Hypotheseprüf- und Signifikanzschwellwerte: die logarithmische Wahrscheinlichkeit der Daten unter der H₂-Hypothese und der H₁-Hypothese wurden mit derjenigen der Nullhypothese H₀ von keinem QTL an der Kartenposition p verglichen. Die Wahrscheinlichkeit wurde berechnet, wie es oben beschrieben wurde, doch wurde dabei das folgende, eingeschränkte Modell verwendet: Y = Xb + Zuu + e.
Der Nachweis zugunsten einer QTL an der Kartenposition p wurde dann als LOD-Marke ausgedrückt: Zp = 0,43(LH1/2 – LH0).
Der Anmelder führte wie üblich bei der Durchführung der Intervallkartografie die hypothetische Position des QTL durch die Chromosomenkarte durch und berechnete die LOD-Marken an jeder Kartenposition, wie vorher beschrieben wurde, um chromosomenweite LOD-Markenprofile zu erzeugen.
Kim et al., 2002, haben durch Simulation gezeigt, dass beim Analysieren eines Chromosomens von 100 cM mit einer Markerdichte von einem Marker pro 5 cM der Wert 2In(10)z_p (unter der Nullhypothese) annähernd eine Chi-Quadrat-Verteilung mit zwei Freiheitsgraden hat, die für zwei und sechs unabhängige Wesenszüge korrigiert (Bonferroni-Korrektur) waren, wenn H₁ bzw. H₂ geprüft wurde. Die chromosomengroßen Sinifikanzniveaus wurden von diesen Verteilungen bei dieser Studie errechnet.
Festlegung der Sequenz des kodierenden Teils des Wachstumshormonrezeptors (GHR) aus der Genom-DNA
Um Primer zu entwickeln, die dem Anmelder erlauben würden, die ganze GHR-kodierende Sequenz aus der Rindergenom-DNA bequem zu verstärken und festzulegen, wurde eine Rinder-BAC-Bibliothek (Warren, 2000) auf den Bildschirm gebracht, wobei Standardprozeduren mit einer Oligonukleotidsonde verwendet wurden, die zum Exon 10 komplementär waren und die acht GHR-enthaltende Klone isolierten. Die DNA von einem dieser Klone wurde als Matrize für das Sequenzieren der Intron-Exon-Grenzen benutzt, wobei Exonprimer verwendet wurden, deren Ausbildung auf der Rinder-cDNA-Sequenz (beispielsweise Hauser et al., 1990) beruhten und von denen vorausgesagt wurde, dass sie die Exon-Intron-Grenzen flankieren, wobei eine Konservierung der Intronposition zwischen dem Menschen und dem Vieh angenommen wurde (beispielsweise Godowski et al., 1989). Die Primer wurden dann auf der Basis der erhaltenen Introninformation derart ausgebildet, dass sie die das meiste der GHR-kodierenden Sequenz aus der Genom-DNA verstärkten und festlegten, wobei Standardprozeduren verwendete wurden. Eine Liste solcher Primer ist in der folgenden Tabelle 2 angegeben. Die Sequenzspuren wurden mit einer POLYPHRED-Software analysiert (Nickerson et al., 1997). Tabelle 2 Primer, die zur Verstärkung und Festlegung der GHR-Exons aus der Rindergenom-DNA verwendet wurden

Alle Primersequenzen sind in der Form 5' -> 3' geschrieben. Alle Exons waren PCR-verstärkt und sequenzmäßig mit denselben Primern festgelegt, außer dem Exon 10, das mit GHRex10-F und GHRex10-R verstärkt und dann mit diesen Primern plus GHRex-1F, GHRex10-1R, GHRex10-2F und GHRex10-2R sequenzmäßig festgelegt wurde.

Oligonukleotid-Bindungsanalyse (OLA)
Eine OLA-Prüfung zum Genotypisieren des GHR-Polymorphismus, der die F278Y-Aminosäurenänderung (das Folgende ist eine Beschreibung einer ebenfalls benutzten Tag Man-Analyse) Nt864 – 33(T-G)-, Nt933 + 21(A-g)-, Nt1095(T-C)-, N528T(Nt1583)- und Nt1922(C-T)-SNPs im Multiplexverfahren kodierte, wurde durchgeführt, wie es vorher beschrieben wurde (Karim et al., 2000). Die für den PCR-Verstärkungsschritt und die Bindungswirkung verwendeten Primer sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben: Tabelle 3 Primer (5'-3'), die für das OLA-Mulriplexverfahren der GHR-SNPs verwendet wurden
Feststellen der Allelvarianten, die die F279Y-Aminosäurenänderung verursachen
Die F279Y-Variation (A-durch-T-Ersatz) wurde ebenfalls festgestellt, wobei die Taq-Man-Analyse folgendermaßen benutzt wurde: Primersequenzen 5' zu 3':
Sondensequenzen 5'-3':
Beide Sonden verwenden MGB (Nebenkanalbinder) als nicht fluoreszierenden Löscher.
Die Endwirkungsbedingungen sind 1 × Universal Mastermix (Angewandte Biosysteme), Primer mit jeweils 500 nM (Invitrogen), Adaral-Sonde (FAM) mit 100 nM, Adara2-Sonde (VIC; Angewandte Biosysteme) mit 200 nM und 2 μl einer 1/20-Verdünnung einer DNA-Matrix in einer Gesamtmenge von 10 μl.
Die Zyklusbedingungen waren 50°C für zwei Minuten, 95°C Anfangsdenaturierung für zehn Minuten, dann 40 Denaturierungszyklen bei 94°C für fünfzehn Sekunden und Kühlung und Ausbreitung 60°C für eine Minute.
Die Sondenpositionen sind unterstrichen. Die polymorphe Lage ist mit einer obenliegenden Klammer bezeichnet und ist entweder ein A oder ein T. Dies erfolgt an der Position 836 der kodierenden Region mit dem Beginn der Benummerung bei der ATG-Anfangslage.
Ein 104bp-Produkt wurde bei dieser Reaktion erzeugt. Wenn das A-Allel vorhanden war, wurde die FAM-gekennzeichnete Sonde gebunden, und diese fluoreszierte bei 518 nm. Als der Zyklus abgeschlossen war, wurde die Platte mit dem AB17900-Sequence-Detection-System abgetastet, und die Fluoreszenz von jeder Platte wurde richtig festgestellt. Das sich ergebende Korrelationsdiagramm teilt sich in drei Bruchteile auf mit A-Homozygoten (Phenylalanin) in der oberen, linken Ecke, T-Homozygoten (Tyrosin) in der unteren, rechten Ecke und TA-Heterozygoten zwischen diesen Ecken. Jeder Bruchteil wurde eingekreist, und die Software legte automatisch den Genotyp für jede Probe fest. Auf jeder Platte gab es Kontrollen mit jeweils acht Behältern mit bekannten Homozygoten, Heterozygoten und keine Matrixkontrollen.
Abschätzung der Wirkung auf den Milchertrag und die Milchzusammensetzung, wobei diese Wirkung mit dem F279Y-Polymorphismus in der allgemeinen Milchviehpopulation verbunden ist:
Die Wirkung der Genotypänderung auf den Milchertrag und die Milchzusammensetzung wurde abgeschätzt, wobei folgendes Modell verwendet wurde: y = μ + gi + ai + ei,wobei y_i = DYDs waren, wenn Bullen betrachtet wurden, oder Milchwerte, wenn Kühe betrachtet wurden; g_i ist ein fester Effekt, die der Genotypänderung (TT, AA oder TA) entspricht; a_i ist eine zufallspolygene Komponente, die für alle bekannten Stammbaumverhältnisse („animal model” [Lynch und Walsh, 1997] steht, wobei nicht geno typisierte Individuen eingeschlossen sind, deren Phänotypen ignoriert wurden), und e_i ist ein Zufallsrest. Die maximalen Wahrscheinlichkeitslösungen für g_i, a_i, e_i wurden gewonnen, indem das MTDFREML-Programm (Boldman et al., 1993) verwendet wurde, bei dem σ² _a/(σ² _a + σ² _e) für die Ertragswesenszüge (Ertrag in Prozent) bei 70% (75%) bzw. 35% (50%) für die DYDs bzw. LVs.
Die statistische Bedeutung der A-durchT-Ersatz-Genotypwirkung wurde mit folgender Formel abgeschätzt:
wobei SSM_F, SSM_R und SSE_F die Summe der Quadrate aufgrund des vollen Modells, bzw. des beschränkten Modells bzw. des Fehlers (volles Modell) sind, wobei diese Summe als F-Statistikwert mit 3 und (n – 3) Freiheitsgraden verteilt ist.
2. Ergebnisse
Aufbau einer Mikrosatellitenkarte hoher Dichte des Rinderchromosomens 20:
Um die Kartenposition der Chromosomen-20-QTL zu verfeinern, wurde zunächst die Markerdichte auf diesem Chromosomen erhöht. Der Datensatz I für 22 zusätzliche, allgemein verfügbare Mikrosatelliten, die bekanntlich das Rinderchromosomen 20 kartenmäßig erfassen, als auch für einen Mikrosatelliten in der Promotorregion des Rinderwachstumshormon-Rezeptorgans (GHRJA) wurde genotypisiert. Eine männliche Verbindungskarte wurde aufgebaut, die 29 Marker enthielt, die 85cM(K) mit einem Durchschnittsmarkerintervall von 3cM(K) abdeckten. Der Informationsgehalt der entspechenden Karte wurde berechnet, wie es vorher beschrieben worden ist (Coppieters et al., 1998a). Er lag über 80% für das Meiste der Chromosomenlänge. Die in 1 gezeigte Karte gibt auch die Position des Prolaktin-Rezeptorgens (PRLR) wieder, das von den Isolierungsdaten der Prolaktinrezeptor-SNPs im selben Stammbaummaterial (Sirja Moisio, unveröffentlichte Beobachtungen) abgeleitet waren. Es sei darauf hingewiesen, dass sich das GHR-Gen beim Menschen im Band 5p13.3 an der Kartenposition 37,4 Mb auf der menschlichen „Goldener-Weg"-Sequenz (Ensembl Human Genome Server: http://www.ensembl.org) befindet, während sich das PRLR-Gen im Band 5p13.1 an der Kartenposition 50,9 Mb befindet, d. h. etwa 15 Mb vom früheren entfernt. Der genetische Abstand, der das Rinder-GHR-Gen vom Rinder-PRLR-Gen trennt, ist deshalb mit den menschlichen Daten kompatibel.
Übliche QTL-Kartenerfassung unter Verwendung einer Karte mit dichten Markern:
Diese neuen Mikrosatellitengenotypen wurden dann dazu benutzt, eine QTL-Kartenanalyse im Datensatz I zu wiederholen. 1 zeigt die Stellenmarkierungen, die durch eine Vielfachmarkerregression in der durch die Familie vorgenommenen Analyse längs der erneut erzeugten Chromosomen-20-Markerkarte gewonnen wurden. Wie es erwartet wurde, bestätigen diese Ergebnisse das Vorhandensein eines QTL mit starker Wirkung auf den Proteinprozentsatz an der wahrscheinlichsten Position 49 cM. Der QTL beeinflusste den Fettprozentsatz nur geringfügig und hatte nur sehr mäßigen Einfluss auf die Ertragswesenszüge (Daten sind nicht gezeigt).
Bootstrap-Analysen wurden für den Proteinprozentsatz gemäß Visscher et al., 1996, durchgeführt, um das 95%-Vertrauensintervall (CI) für die Position des QTL abzuschätzen. 1 stellt die Verteilung der wahrscheinlichsten Position des QTL innerhalb von 1000 Bootstrap-Mustern als auch die abgeleiteten 95%-Cl dar. Es ist ersichtlich, dass das Cl etwa 50 cM abdeckt, das im Wesentlichen der distalen Hälfte des Chromosomens 20 und deshalb eine sehr arme Stelle des QTL entspricht.
Die Regressionsanalysen innerhalb der Familie wurden dann hinsichtlich des Proteinprozentsatzes durchgeführt, wie beschrieben wurde (Arranz et al., 1998), um die Vatertierfamilien zu identifizieren, die für diesen QTL die Abstammung bildeten. Zwei derartige Familien wurden im Datensatz I identifiziert: die Familien 1 und 18 (Daten sind nicht gezeigt).
Verfeinern der Kartenposition eines QTL: Verwendung einer auf einem Haplotryp beruhenden Prüfung für die Zuordnung:
Die vorher beschriebenen Analysen innerhalb einer Familie zeigen, dass die Vatertiere 1 und 18 heterozygot für QTL-Allele mit großen Substitutionswirkungen („Q") auf dem Chromosomen 20 waren. Die vorhergehende Arbeit innerhalb derselben Population zeigte ein extensives, genomweites Verbindungsungleichgewicht aufgrund der Zufallsverschiebung (Farmir et al., 2000). Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Markerhaplotypen, die die „Q"-Allele in den Stammbaumvatertieren flankieren, auch genau so gut in Verbindungsungleichgewicht mit denselben „Q"-Allelen in der allgemeinen Population sein könnten. Um diese Hypothese zu prüfen, maßen wir die Wirkung auf den Proteinprozentsatz der Vatertierhaplotypen in der allgemeinen Population, wobei die auf dem Haplotyp beruhende Prüfung für die Zuordnung verwendet wurde, die oben in Materialien & Verfahren beschrieben worden sind.
Bei der Durchführung der Prüfung wurden fünf Haplotypfenster identifiziert, die bedeutende F-Verhältnisse (p < 0,01 nach Korrektur für die Vielfachprüfung) ergaben, die Substitutionswirkungen von etwa 0,03% Milchprotein entsprachen. Die entsprechenden Haplotypen waren alle von einem Chromosomenabschnitt abgeleitet, der durch die Vatertiere 1 und 18 durch Erbfolge identisch aufgeteilt war. Die Söhne beider Vatertiere waren aus dem Datensatz vor der Durchführung der Zuordnungsprüfung ent fernt worden. 1 zeigt die Position und die statistische Bedeutung der entsprechenden Markerfenster. Es ist ersichtlich, dass ihre Positionen sich um das TGLA153-GHRJ-Markerpaar entsprechend einer kleinen Spitze für die Proteinprozente konzentrieren, dass aber die wahrscheinlichste QTL-Position auftritt, wenn die Fettprozente analysiert werden. Dieses Ergebnis führt stark zu der Annahme, dass ein Gen in der Nähe dieser Marker tatsächlich für die QTL-Wirkung verantwortlich ist, die auf dem Chromosomen 20 beobachtet wird.
Verfeinern der Kartenposition eines QTL: kombinierte Verbindung und LD-Analyse:
Um die Entdeckungen zu bestätigen, die mit der auf dem Haplotyp beruhenden Prüfung der Zuordnung gewonnen wurden, analysierten wir den Datensatz I, indem das LDVCM-Programm für eine kombinierte Verbindungs- und LD-Kartenerstellung verwendet wurde. 2 zeigt die Ortsmarkierungen, die mit diesem Annäherungsversuch für die Proteinprozente gewonnen wurden. Das Profil, das bei der Betrachtung der Verbindungsinformation gewonnen wurde, verläuft nur im Wesentlichen parallel zu demjenigen Profil, das durch die Vielfachmarkerregression gewonnen wurde (vgl. 1), obwohl die LOD-Marken etwas weniger bedeutend sind (z_max = 1,8; chromosomenweiter p-Wert = 0,016). Wenn jedoch die Verbindungsungleichgewichtsinformation berücksichtigt wird, wurde eine sehr bedeutende LOD-Marke von 8,5, der einem chromosomenweiten p-Wert von 1,5E-8 entspricht, an der Kartenposition 43 cM erhalten, die sehr dicht an der Chromosomenregion liegt, die durch die auf dem Haplotyp beruhenden Zuordnungsprüfung identifiziert wurde. Wenn derselbe Näherungsversuch unternommen wurde, wurde eine sehr bedeutende LOD-Marke in derselben Chromosomenregion für den Fettprozentsatz (Position 43 cM; LOD-Marke 5,9; p-Wert 7,5E-6), den Milchertrag (Position 43 cM; LOD-Marke 3,2; p-Wert 0,0047) und den Proteinertrag (Position 43 cM; LOD-Marke 5,2; p-Wert 3,7E-5) (Daten sind nicht gezeigt) gewonnen. Diese Ergebnisse unterstützten deshalb die Existenz eines QTL-beeinflussten Milchertrags und einer QTL-beeinflussten Milchzusammensetzung in der Nähe des GHR-Gens.
Abtasten des Rinderwachstumshormon-Rezeptorgens (GHR) für den DNA-Sequenz-Polymorphismus:
Da es schien, als ob das GHR-Gen für mindestens für einen Teil der QTL-Wirkung verantwortlich war, wurde vorausgesagt, dass die Vatertiere 1 und 18 aufgrund der auf den Haplotyp beruhenden Zuordnungsprüfung beide heterozygot für eine Mutation sein würden, die verursacht, dass der GHR funktionell unterschiedlich ist. Es wurde deshalb entschieden, den kodierenden Teil des GHR-Gens für den DNA-Sequenz-Polymorphismus in diesen Tieren abzutasten. Intronprimer, die eine leichte Verstärkung und Sequenzerstellung der Exons 310 des GHR erlauben, wurden entwickelt, wie es in Materialien & Verfahren beschrieben wurde. Die Analyse der Sequenzspuren, die von fünf Holstein-Friesland-Individuen mit den Vatertieren 1 und 18 gewonnen wurden, ergab zehn einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNP) im GHR-Gen. 3 gibt die Position und das Wesen der entsprechenden SNPs wieder.
Vier dieser Nukleotidpolymorphismen sind SNPs, die in den Introns (Nt71 – 85[del1], Nt864 – 33[T-G] und Nt933 + 21[A-G]) positioniert sind, einer ist ein SNP, der in der 3'UTR des GHR-Gens (Nt1922[T-G] und Nt933 + 21[A-G]) vorhanden ist, und drei sind synchrone Mutationen in dritten Kodonpositionen (Nt1095[C-T], Nt1635[C-T] und Nt1809[C-T]). Von keinem dieser SNPs kann von vornherein angenommen werden, dass er die Funktion des GHR-Gens beeinflusst (die SEQ-ID-Nr. 1 entspricht einem Teil des Introns 2 und des Exons 3; die SEQ-ID-Nr. 2 entspricht Teilen der Introns 8, 9 und des Exons 9; die SEQ-ID-Nr. 4 entspricht der cDNA).
Die beiden restlichen SNPs jedoch ändern die Aminosäurensequenz des GHR-Rezeptors. Eine A-durch-T-Substitution im Exon VIII ergibt einen nicht konservativen Ersatz eines neutralen Phenylamins durch einen ungeladenen, aber polaren Tyrosinrest (F279Y). Der entsprechende Phenylaminrest befindet sich in der Transmembrandomäne des GHR und wird unter allen analysierten Säugetieren (Mensch, Pavian, Kaninchen, Maus, Ratte, Hund, Schwein, Schaf, Opossum) konserviert, ausgenommen das Guinea-Schwein, bei dem der Phenylalaninrest trotzdem durch einen neutralen Leuzinrest ersetzt wird. Bei Küken und Tauben ist der entsprechende Rest auch ein neutrales Isoleuzin (hinsichtlich der Gen- und DNA-Sequenz siehe die SEQ-ID-Nrn. 2 und 4 und die Aminosäurensequenz SEQ-ID-Nr. 5).
Eine C-durch-A-Substitution im Exon X ergibt einen Ersatz eines Asparagins durch ein Threonin (N528T), wobei beide Aminosäuren polare, ungeladene Reste sind. Dieser Rest ist während der Evolution weniger konserviert und entweder ein Asparaginrest (Mensch, Kaninchen, Schwein, Küken) oder ein Serinrest (Ovin, Maus, Ratte) (s. SEQ-ID-Nrn. 4 und 5).
Die Vatertiere 1 und 18, die beide heterozygot für die GHR-enthaltenden Markerhaplotypen sind, die mit einer sehr bedeutenden Substitutionswirkung auf den Proteinprozentsatz in der Zuordnungsprüfung verbunden sind, waren heterozygot für die SNPs Nt71 – 85(del1) (s. SEQ-ID-Nr. 1), Nt864 – 33(T-G) (s. SEQ-ID-Nr. 3) und vor allem Nt836 (F279Y) (s. SEQ-ID-Nrn. 2, 4 und 5). Bei der gegebenen Wirkung dieses SNP auf die Sequenz des GHR-Gens und daher möglicherweise auf seine Proteinfunktion stand F279Y als primärer Kandidat für die Mutation hervor, die die beobachtete QTL-Wirkung verursachte.
Das Einschließen der SNPs in die kombinierte Verbindung und die LD-Analyse erhöhen die LOD-Marke an der GHR-Stelle dramatisch:
Eine Oligonukleotidverbindungsanalyse (OLA) wurde durchgeführt, wie für das Multiplexgenotypisieren der SNPs Nt836 (F279Y), Nt864 – 33(T-G), Nt933 + 21(A-G), Nt1095(T-C) (s. SEQ-ID-Nr. 4), Nt1583 (N528T) (s. SEQ-ID-Nr. 4), Nt1583 (N528T) (s. SEQ-ID-N. 4) und Nt1922(C-T) (s. SEQ-ID-Nr. 4) beschrieben wurde, und diese Analyse wurde beim Datensatz I angewendet. Die Verbindungsphase wurde festgestellt, wie es beschrieben wurde (Farnir et al., 2002). 4 zeigt die Frequenzverteilung der GHR-Haplotypen, wie sie in den mütterlichen Chromosomen (MC, s. oben) gemessen wurde. Diese Figur zeigt, dass mindestens 13 bestimmte Haplotypen in der Holland-Friesland-Population auftreten, dass aber drei dieser Haplotypen für 85% der Chromosomen in dieser Population verantwortlich sind.
Der GHR-SN P-Haplotyp wurde durch die Verbindungsanalyse auf der Chromosomen-20-Markerkarte an der Position 42,7 cM platziert, die erwartungsgemäß mit dem GHRJ-Mikrosatelliten koinzidiert.
Eine kombinierte Verbindungs- und LD-Analyse wurde dann durchgeführt, die die LDVCM-Software verwendete und die neuen GHR-SNP-Genotypen einschloss. Wie in 2 für den Proteinprozentsatz gezeigt ist, erhöhte der Einschluss der GHR-SNPs die maximale LOD-Marke um 3,8 Einheiten, so dass sich eine maximale LOD-Marke vom 12,3 an der Position 43 cM ergab, d. h. gerade am distalen Ende des GHR-Gens. Die folgende Tabelle 4 gibt die entsprechenden Varianzkomponenteneinschätzungen wieder.
Das Einschließen der GHR-SNPs in die LDVCM-Analyse hatte eine vergleichbare Wirkung, als der Fettprozentsatz analysiert wurde. Die LOD-Marke erhöhte sich von 5,9 auf 7,8 und hatte ihr Maximum genau am GHR-Gen (wie in der Tabelle 4 unten gezeigt ist). Die Wirkung war mäßiger für den Milchertrag und den Fettwertrag, wobei sich die LOD-Marken auf um 0,4 bzw. 0,1 Einheiten erhöhten, doch lag das Maximum in beiden Fällen auf dem GHR-Gen (s. Tabelle 4 unten). Nur für den Proteinertrag ergab das Einschließen der GHR-SNPs eine bemerkenswerte Abnahme der LCD-Marken, wobei diese von 5,2 auf 1,7 oder weniger in der Region des GHR-Gens fielen (s. Tabelle 4 unten).

Zum Vergleich ergab die Durchführung einer kombinierten Verbindungs- und LD-Analyse nach dem Einschluss eines Haplotyps, der aus vier PRLR-SNPs zusammengesetzt war, eine örtliche Abnahme der LOD-Markenwerte für alle Wesenszüge (s. 2 für den Proteinprozentsatz). Tabelle 4 Ergebnisse der LDVCM-Analyse nach Zufügung von sechs GHR-SNPs zur BTA20-Mikrosatellitenkarte

Wesenszug	Kartenposition	Kluster-Nr.	r²-QTL	LOD-Marke	r²-POLYG	r²-RES
Milchertrag (Kgs)	GHR	21	0,06	4,9	0,72	0,22
Fettertrag (Kgs)	GHR	4	0,05	3,3	0,81	0,14
Proteinertrag (Kgs)	GHR	20	0,04	1,7	0,78	0,18
Fett-%	GHR	5	0,09	7,8	0,88	0,02
Protein-%	GHR ^--GLA153	22	0,10	12,3	0,87	0,03

Kartenposition: Markerintervall, das mit der höchsten LOD-Marke für den betrachteten Wesenszug verbunden ist; Kluster-Nr.: die Anzahl der Kluster im Haplotypdendrogramm, das die höchste LOD-Marke ergibt; r²-(QTL: Bruchteil der Wesenszugvarianz aufgrund des QTL, berechnet aus 2σ² _H/(2σ² _H + σ² _A + σ² _E); r²-PO-YG: Bruchteil dder Wesenszugvarianz aufgrund des polygenen Hintergrunds, berechnet aus σ² _A/(2σ² _H + σ² _A + σ² _E); r²-RES: Bruchteil des Wesenszug, der durch das Modell nicht erklärt wird, berechnet aus σ² _E/(2σ² _H + σ²A + σ² _E).

Einzigartiger Status des Nt836(F279Y)-Polymorphismus mit Rücksicht auf die Chromosomen-20-QTL-Wirkung:
Zwei Prüfungen wurden dann durchgeführt, um die relative Verteilung der verschiedenen SNPs zur Erhöhung des Signals festzustellen, das für den Proteinprozentsatz steht. Erstens wurden die LDVCM-Analysen durch aufeinanderfolgendes Fallenlassen von einem der sechs GHR-SNPs wiederholt, die den GHR-SNP-Halotyp bilden. Während das Fallenlassen der SNPs Nt864 – 33(T-G), Nt933 + 21(A-G), Nt1095(T-C), Nt1583 (N528T) und Nt1922(C-T) die LOD-Markenprofile (Daten sind nicht gezeigt) nicht wesentlich änderten, vernichtete das Fallenlassen des SNP Nt836 (F279Y) anscheinend die ganze Verstärkung, die durch Betrachtung des vollständigen GHR-SNP-Haplotyps (2) gewonnen wurde. Zweitens wurde die LDVCM verwendet, um die Wirkungen der verschiedenen GHR-SNPs individuell (d. h. ohne Betrachtung der Seitenmarkerdaten) abzuschätzen: Nt836 (F279Y) ergab eine LOD-Marke von 11,5, während die anderen SNPs LOD-Marken von nur 0,75 (Nt864 – 33[T-G]), 0,22 (Nt933 + 21[A-G7), 0 (Nt1095[T-C]), 2,18 (Nt1583[N5281]) bzw. 1,77 (Nt1922[C-T]) ergaben.
Insgesamt weisen diese Ergebnisse klar in Richtung eines einzigartigen Status des NT836-(F279Y)-Polymorphismus in Bezug auf die Chromosomen-20-QTL-Wirkung hin, wobei angezeigt wird, dass dieser SNP mindestens teilweise für die QTL-Wirkung verantwortlich ist.
5 zeigt auch die Isolierung des T-(F)-Allels und des A-(Y)-Allels innerhalb des Haplotypklusters, wobei die LDVCM-LOD-Marken maximiert werden, wenn der Proteinprozentsatz bzw. der Fettprozentsatz einschließlich aller schs GHR-SNPs analysiert werden. Wenn der Proteinprozentsatz analysiert wird, ist die REML-Lösung mit einer Gruppierung in 22 Haplotypklustern verbunden, von denen 17 homogen in Bezug auf den Nt836-(F279Y)-Polymorphismus sind. Für den Fettprozentsatz sind die entsprechenden Zahlen acht Kluster insgesamt, von denen fünf homogen in Bezug auf den Nt836-(F279Y)-Polymorphismus sind.
Wirkung des A-durch-T-(F279Y-GHR-Polymorphismus auf den Milchertrag und die Milchzusammensetzung in der allgemeinen Milchviehpopulation:
Um die Wirkung des Nt836-(F279Y)-GHR-Polymorphismus auf den Milchertrag und die Milchzusammensetzung genauer abschätzen zu können, genotypisierten wir die Datensätze II–VI, entsprechend zusätzlicher 2772 Bullen und 872 Kühe, für diesen SNP. Die Wirkungen des Nt836-(F279Y)-Genotyps auf die DYDs und LVs für den Milchertrag (in Kgs), Proteinertrag (in Kgs), Fettertrag (in Kgs), Proteinprozentsatz und Fettprozentsatz wurden abgeschätzt, wobei ein Mischmodell, das eine feste Genotypwirkung einschloss, und ein Zufallstiermodell verwendet wurde, das für den polygenen Hintergrund sorgte. Aus der Tabelle 5 ist zu erkennen, dass die A-durch-T-Substitution (F279Y) sich in sehr ähnlicher Weise in allen analysierten Populationen verhielt, sei es die Holländische oder Neuseeländer, die Holstein-Friesland- oder die Jersey-Rasse. Erwartungsgemäß war die Wirkung der A-durch-T-Änderung (F279Y) in allen fünf Datensätzen beim Proteinprozentsatz sehr ausgeprägt, verantwortlich für eine Wesenszugänderung von 4% auf 8%. Die Wirkung der A-durch-T-Substitution (F279Y) war ebenfalls in all diesen Populationen auf den Fettprozentsatz klar feststellbar und im geringeren Maß auf den Milchertrag feststellbar. Sie war für eine Änderung von 1,6–6% im Fettprozentsatz und eine Änderung von 0,8–4,5% im Milchertrag verantwortlich. Für den Milchertrag erhöhte die Vererbung eines Y-Allels die DYD für den Milchertrag von geschätzten 67±Kgs auf 112 ± Kgs und die LV für den Milchertrag von 86 ± Kgs auf 162 ± Kgs. Die Wirkungen der A-durch-T-Substitution (F279Y) auf den Fettertrag und den Proteinertrag waren im Wesentlichen nicht be deutend, obwohl eine Tendenz in Richtung auf eine Abnahme des Fettertrags von 1,5–2,5 Kgs für jede Dosis des A-(Y)-Allels bemerkbar war.

Die Tatsache, dass die A-durch-T-Substitution (F279Y) sehr vergleichbare Wirkungen in allen fünf analysierten Populationen zeigten, unterstützt in starkem Maß ihre bonafide-Natur und die Kausalität der Nt836-(F279Y)-Mutation. Tabelle 5 Wirkung der GHR-Nt5836-(F279Y)Mutation auf den Milchertrag und die Milchzusammensetzung (A) Datensätze I + II (Holländische Holstein-Friesland-Vatertiere, DYDs) Genotypfrequenzen: FF: 0,67; FY: 0,31; YY: 0,02; n = 1263

Wesenszug	FY – FF (±SE)	YY – FF (±SE)	r² _QTL	p-Wert_QTL
Milchertrag (Kgs)	67 ± 16 Kgs	128 ± 49 Kgs	0,012	6,8E-05
Fettertrag (Kgs)	–1,4 ± 0,6 Kgs	–4,1 ± 1,8 Kgs	0,004	0,015
Proteinertrag (Kgs)	–0,1 ± 0,4 Kgs	–0,2 ± 1,3 Kgs	0,000	0,961
Fett %	–0,06 ± 0,01%	–0,14 ± 0,03%	0,022	2,2E-09
Protein-%	–0,033 ± 0,01%	–0,06 ± 0,01%	0,040	7,3E-15

Datensatz III (Neuseeland-, Holstein-Friesland-Vatertiere, DYDs) Genotypfrequenzen: FF: 0,68; FY: 0,29; YY: 0,03; n = 1550

Wesenszug	FY – FF (±SE)	YY – FF (±SE)	r² _QTL	P-Wert_QTL
Milchertrag (Kgs)	89 ± 17 Kgs	68 ± 45 Kgs	0,001	8,4E-06
Fettertrag (Kgs)	–1,5 ± 0,7 Kgs	–5,2 ± 1,7 Kgs	0,009	0,01
Proteinertrag (Kgs)	–1,0 ± 0,5 Kgs	–4,4 ± 1,3 Kgs	0,009	0,007
Fett-%	–0,13 ± 0,02%	–0,20 ± 0,02%	0,016	1,2E-12
Protein%	–0,10 ± 0,01%	–0,17 ± 0,04%	0,081	8,0E-32

(C) Datensatz IV (Neuseeland-, Jersey-Vatertiere, DYDs) Genotypfrequenzen: FF: 0,89; FY: 0,10; YY: 0,01; n = 959

Wesenszug	FY – FF (±SE)	YY – FF (±SE)	r² _QTL	p-Wert_QTL
Milchertrag (Kgs)	112 ± 33 Kgs	441 ± 102 Kgs	0,045	3,3E-05
Fettertrag (Kgs)	–0,1 ± 1,5 Kgs	–2,3 ± 4,7 Kgs	0,000	0,97
Proteinertrag (Kgs)	–0,3 ± 1,1 Kgs	–6,3 ± 3,3 Kgs	0,005	0,31
Fett-%	–0,19 ± 0,05%	–0,68 ± 0,02%	0,058	5,6E-05
Protein-%	–0,13 ± 002%	–030 ± 0,08%	0,084	1,1E-07

(D) Datensatz V (Neuseeland-, Holstein-Friesland-Kühe, LVs) Genotypfrequenzen: FF: 0,73; FY: 0,24; YY: 0,03; n = 485

Wesenszug	FY – FF (±SE)	YY – FF (±SE)	r² _QTL	p-Wert_QTL
Milchertrag (Kgs)	87 ± 48 Kgs	99 ± 129 Kgs	0,008	0,17
Fettertrag (Kgs)	–1,3 ± 2,2 Kgs	–8,3 ± 5,9 Kgs	0,003	0,34
Proteinertrag (Kgs)	–0,6 ± 1,5 Kgs	–3,1 ± 4,1 Kgs	0,001	0,73
Fett-%	–0,14 ± 0,05%	–0,31 ± 0,13%	0,023	0,004
Protein-%	–0,10 ± 0,02%	–0,19 ± 0,06%	0,055	2,3E-06

(E) Datensatz VI (Neuseeland-, Jersey-Kühe, LVs) Genotypfrequenzen: FF: 0,81; FY: 0,17; YY: 0,02; n = 387

Wesenszug	FY – FF (±SE)	YY – FF (±SE)	r² _QTL	p-Wert_QTL
Milchertrag (Kgs)	162 ± 52 Kgs	59 ± 135 Kgs	0,022	0,009
Fettertrag (Kgs)	–2,1 ± 2,7 Kgs	–8,3 ± 6,9 Kgs	0,007	0,40
Proteinertrag (Kgs)	1,2 ± 1,7 Kgs	–1,4 ± 4,5 Kgs	0,001	0,73
Fett %	–0,28 ± 0,06%	–0,33 ± 0,17%	0,058	6,7E-05
Protein%	–0,13 ± 0,03%	–0,10 ± 0,07%	0,068	1,6E-05

(i) FY – FF: Differenz zwischen den mittleren Wesenszugwerten des FY-Genotyps und des FF-Genotyps = Wirkung einer Y-Dosis; (ii) YY – FF: Differenz zwischen den mittleren Wesenszugwerten der YY-Variante und der FF-Variante = Wirkung von zwei Y-Dosen; (iii) r² _QTL: Größe der Wesenszugänderung, erläutert durch die GHR-F279Y-Änderung; (iv) p-Wert_QTL: statistische Bedeutung der GHR-F279Y-Änderungswirkung. Zu beachten ist, dass die absoluten Werte der Wirkungen auf die Prozentsatzwesenszüge nicht direkt zwischen den Datensätzen I + II (Niederlande) und den Datensätzen III–VI (Neuseeland) verglichen werden können, weil die Prozentsatzwesenszüge aus den Ertragswesenszügen errechnet werden, für die verschiedene Formulare in beiden Ländern verwendet wurden.

3. Schlussfolgerungen
Ein strenger Nachweis ist vorgesehen, dass das GHR-Gen mindestens teilweise für die QTL-Wirkung verantwortlich ist, die früher als auf dem Rinderchromosomen 20 befindlich beschrieben wurde (Georges et al., 1995; Arranz et al., 1998). Die nicht konservative Substitution eines hochkonservierten F-Rests in der Transmembrandomäne legt nahe, dass der F279Y-Polymorphismus der direkte Grund für die beständig zugeordneten Wirkungen auf den Milchertrag und die Milchzusammensetzung sein könnte. Der F279Y-Polymorphismus beeinflusst auch das Lebendgewicht. In einer Querzuchtanalyse (Holstein-Friesland, Jersey, und Ayrshire) erhöhte das T-Alle) (F-Aminosäure) das Lebendgewicht um 1,9 kg, d. h. um 5%. Dies ist mit einer direkten Wirkung des GHR kompatibel.

Die Wirkungen des F279Y-Aminosäuren-Allelzustands auf die Indexziffern, die als Basis für die Auswahl in den Niederlanden und Neuseeland (INET- bzw. Zuchtwert [BW]) sind sehr bedeutend. Als Tatsache zeigt ein rückschauender Überblick auf die Genotypen der Neuseeland-Vatertiere klar, dass sich die Häufigkeit der T-Allele in den letzten Jahren erhöht hat und dass der TT-Genotyp die Wahrscheinlichkeit für ein Vatertier erhöht hat, für die Zucht ausgewählt zu werden (Tabelle 6). Daher erwarten wir, dass dieser Marker das Vermögen hat, sehr nützlich für die markerunterstützte Auswahl zu sein und die Häufigkeit des begünstigten T-Allels wirksamer zu erhöhen. Tabelle 6 Genotyphäufigkeiten von Bullen, die für die kommerzielle, auf dem Zuchtwert beruhende Verwendung nachwuchsgeprüft ausgewählt sind.

Zucht/SPS-Jahr	Nachwuchsgeprüfte Bullen			Ausgewählte Bullen
Holstein-Friesland	AA	AT	TT	AA	AT	TT
1994	3	19	62	0	1	9
1995	1	24	87	0	1	5
1996	1	36	100	0	2	13
Jersey
1994	2	5	46	0	0	9
1995	0	7	55	0	0	7
1996	1	18	36	0	1	5
1997	1	10	89	0	0	6

Die Datensätze V und VI (aus Kühen zusammengesetzt) erlaubten die Analyse der potentiellen Dominanz-Wirkungen zwischen dem F-Allel und den Y-Allel. Ein sehr mäßiges Auftreten zugunsten der Dominanz des Y-Allels über das F-Allels wurde für den Proteinprozentsatz gefunden (p < 0,05; Daten sind nicht gezeigt). Da jedoch die Anzahl der YY-Individuen klein war, war das Vermögen, bedeutende Dominanzzwischenwirkungen festzustellen, sehr begrenzt. Vorläufige Analysen mit diesen Datensätzen legten auch nahe, dass die Nt836-(F279Y)-Mutation und die vorher beschriebene K232A-Mutation im Rinder-DGAT-Gen (Grisart et al., 2002) in additiver Weise arbeiten.
Wir halten es für unwahrscheinlich, dass die F279Y-Änderung für die gesamte Chromosomen-20-QTL-Wirkung verantwortlich ist. Tatsächlich legt die Prüfung der Ortsmarken (beispielsweise 1) nahe, dass zusätzlich auch weiter fernliegende Gene an der QTL-Wirkung auf BTA20 beteiligt sein könnten. Wir haben auch zwei Vatertiere identifiziert, die für eine QTL-Wirkung auf den BTA20 klar heterozygot wirken würde, ungeachtet der homozygoten Wirkung für den Nt836-(F279Y)-Polymorphismus (Daten sind nicht gezeigt).
Es sei darauf hingewiesen, dass nicht beabsichtigt ist, die Erfindung auf die obigen Beispiele zu begrenzen; viele Änderungen, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich sind, sind möglich, ohne von den Erfindungsmerkmalen abzuweichen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert sind.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Genotypisieren von Rindern gerichtet, um die Auswahl von Tieren mit geänderten Milcherzeugung- und Tierkörper-Wesenszügen zu erleichtern. Insbesondere weisen diese Wesenszüge eine geänderte Milchmenge, einen geänderten Milchproteingehalt und einen geänderten Milchfettgehalt sowie ein erhöhtes oder vermindertes Lebendgewicht auf. Es sei darauf hingewiesen, dass für diese Wesenszüge ausgewählte Rinderherden einen erhöhten Milchertrag und ein erhöhtes Lebendgewicht oder geänderte Merkmale für besondere Anwendungen erzeugen und deshalb von bedeutendem, wirtschaftlichen Vorteil für die Bauern sind. Samen und Enbryos solcher ausgewählter Tiere sind ebenfalls für selektive Zuchtzwecke nützlich.

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Claims

Verfahren zur Feststellung der genetischen Hauptmerkmale eines Rinds hinsichtlich der Milchzusammensetzung und des Milchvolumens, wobei das Verfahren den Schritt zur Feststellung des GHR-Genotyp-Zustands des Rinds umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Genotyp-Zustand durch das Vorhandensein von Nt836(T-A[F279Y]) in den SEQ-ID-Nrn. 1 bis 5 entweder mittels eines direkten Verfahrens oder eines indirekten Verfahrens festgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Genotyp-Zustand hinsichtlich der DNA, mRNA und/oder des Proteins festgestellt wird, das vom Rind durch ein direktes Verfahren oder ein indirektes Verfahren gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Genotyp-Zustand durch Erkennung des Vorhandenseins des F279Y-Polymorphismus festgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein des F279Y durch Feststellung des Vorhandenseins eines oder mehrerer Polymorphismen indirekt festgestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Folgendes enthält: ein oder mehrere Polymorphismen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Folgendes enthält: Nt71 – 85(del1), Nt71 – 12(T-C), Nt864 – 33(T-G), Nt933 + 21(A-G), Nt1922(C-T), Nt1095(C-T), Nt1635(C-T), Nt1809(C-T) und Nt1583(N528T), wobei der Polymorphismus mit F279Y verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verwendung eines Haplotyp-Marker-Satzes enthält.
Verfahren zur Auswahl eines Rinds, das einen gewünschten GHR-Genotyp-Zustand aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es die Feststellung des Genotyp-Zustands nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und den Schritt der Auswahl des Rinds auf der Basis dieser Feststellung enthält.
Verfahren zum Identifizieren eines Rinds, das einen Genotyp aufweist, der geänderte Milchproduktionswesenszüge anzeigt, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verwendung eines Musters des Rinds und die Feststellung des Vorhandenseins von Nt(T-A[F279Y]) entweder durch ein direktes Verfahren oder durch ein indirektes Verfahren aufweist, wobei das Vorhandensein des genannten Polymorphismus mit geänderten Milchproduktionswesenszügen verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein von Nt836(T-A[F279y]) durch Identifizieren des Nt836-(T-A[F279Y])-Polymorphismus im Nukleinsäuremuster direkt festgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein von Nt836(T-A[F279y]) durch Identifizieren eines Polymorphismus indirekt festgestellt wird, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die Nt71 – 85(del1), Nt71 – 12(T-C), Nt864 – 33(T-G), Nt933 + 21(A-G), Nt1922(C-T), Nt1095(C-T), Nt1635(C-T), Nt1809(C-T) und Nt1583(N528T) aufweist, die in den SEQ-ID-Nrn. 1 bis 5 des Rinder-GHR-Gens dargestellt sind, wobei der Polymorphismus mit Nt836([T-A]F279Y) verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die geänderten Milchvolumenwesenszüge ein geändertes Milchvolumen, einen geänderten Milchproteingehalt und einen geänderten Milchfettgehalt der Milchzusammensetzung aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Polymorphismus Nt836([T-A]F279Y) ist und durch das Kodetriplett TTT oder TAT (dargestellt in den SEQ-ID-Nrn. 2 und 4) und die entsprechenden Aminosäuren Phenylalanin bis Tyrosin an der Aminosäurenposition 279 in der SEQ-ID-Nr. 5 kodiert ist, wobei das Vorhandensein von entweder Phenylalanin oder Tyrosin mit geänderten Milchproduktionswesenszügen nach Anspruch 10 verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner den Schritt der Verstärkung der genannten Rinder-GHR-Gensequenz zum Identifizieren des Polymorphismus aufweist, der mit den identifizierten Milchproduktionswesenszügen verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verstärkung Primer verwendet werden, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den SEQ-ID-Nrn. 6 bis 39 besteht.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verstärkung Primer verwendet werden, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer Nukleotidsequenz mit etwa mindestens 12 benachbarten Basen der SEQ-ID-Nrn. 1 bis 4 und ferner aus einem Polymorphismus besteht, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Nt1922(C-T), Nt1095(C-T), Nt1635(C-T), Nt1809(C-T), Nt836(T-A[F279Nt1922(C-T), Nt1095(C-T), Nt1635(C-T), Nt1809(C-T), Nt836(T-A[F279Y]) und Nt1583(N528T) besteht.
Verwendung eines Primers im Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Primer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Nukleotidsequenz mit etwa mindestens 12 benachbarten Basen der SEQ-ID-Nrn. 1 bis 4 und ferner aus einem Polymorphismus besteht, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Nt1922(C-T), Nt1095(C-T), Nt1635(C-T), Nt1809(C-T), Nt836(T-A[F279Y]) und Nt1583(N528T) besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein von entweder Phenylalanin oder Tyrosin 279 der Aminosäurensequenz SEQ-ID-Nr. 5 in einem Rindergewebe festgestellt wird, wobei ein alleler, spezifischer Antikörper verwendet wird.
Verwendung der GHR-Gensequenz SEQ-ID-Nrn. 1 bis 4 oder eines Bruchstücks bzw. einer Variante davon, die Nt836(T-A[F279Y]) enthalten, bei der Identifizierung eines oder mehrerer DNA-Marker, die beim Genotypisieren und/oder Auswählen eines Rinds gemäß den Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 7 bis 13 verwendbar sind.
Verwendung eines oder mehrerer Polymorphismussequenzen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Nt71 – 85(del1), Nt71 – 12(T-C), Nt864 – 33(T-G), Nt933 + 21(A-G), Nt1922(C-T), Nt1095(C-T), Nt1635(C-T), Nt1809(C-T) und Nt1583 (N528T) aufweist, die in den SEQ-ID-Nrn. 1 bis 4 dargestellt sind, bei einem Verfahren zum Identifizieren und Auswählen eines Rinds, das den Nt836-([T-A]F279Y)-Polymorphismus in seinem GHR-Gen aufweist.
Verwendung eines Sensors bei den Verfahren der Genotypisierung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor aus beliebigen fünf oder mehr benachbarten Nukleotiden der GHR-Sequenzen der SEQ-ID-Nrn. 1 bis 4 ausgewählt wird, wobei der Sensor ausreichend komplementär zur genannten Nukleinsäuresequenz so ausgebildet ist, dass er sich an diese unter strengen Bedingungen bindet.
Verwendung eines Kits zur Genotypisierung eines Rinds hinsichtlich der Milchzusammensetzung und des Milchvolumens, wobei die Genotypisierung mit GHR verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit einen Primer oder einen Sensor nach Anspruch 14 oder 18 aufweist.