CN108823320B

CN108823320B - 高产奶性能娟姗奶牛选育方法

Info

Publication number: CN108823320B
Application number: CN201810536719.5A
Authority: CN
Inventors: 黄明光; 梁金逢; 周晓情; 肖正中; 吴柱月; 朱文; 方治山; 文信旺; 彭夏云; 潘锐
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Animal Husbandry
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Animal Husbandry
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108823320A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及高产奶性能娟姗奶牛选育方法。本申请选用250条10碱基随机引物在由20头高产(305d产奶量>4000kg)和20头低产(305d产奶量<3200kg)娟姗牛所组成的2个DNA池间进行RAPD‑PCR扩增分子标记筛选方法。用筛选到的200条引物对所有个体进行PCR检测,得到了3个与奶牛产奶量性状相关的RAPD标记,并对它们进行了克隆测序以及生物信息学分析。试验结果表明，有S11、S1110和S1120的DNA片段与产奶量有关，其中S11与产奶量性状正相关，S1110和S1120与产奶量性状呈负相关。

Description

高产奶性能娟姗奶牛选育方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及高产奶性能娟姗奶牛选育方法。

背景技术

娟姗牛是源自英吉利海峡杰茜岛的进口奶牛，是英国政府颁布法令保护的珍贵牛种，其最大的优点就是乳质浓厚，乳脂、乳蛋白含量均明显高于普通奶牛，乳脂率平均为5.5-6%，是乳牛著名的品种。该品种在血统上与瑞士褐牛、德温牛和凯瑞牛有关系，而与荷斯坦牛没有关系。在该品种的早期娟姗牛培育过程中，曾被称为奥尔德尼牛(Alderney)。娟姗牛是主要乳用牛品种中最小的品种之一(凯瑞牛和德克斯特牛更小)。该品种与其他品种相比，耐热性强并以其采食性好，乳脂、乳蛋白率较高而著称。

随着人民生活水平的提高，人们对牛奶的需求量日益增加，如何提高产奶量也一直被畜牧研究者广泛关注。影响奶奶牛产奶量的因素很多，其中遗传因素是主要因素之一。因此从基因水平上对奶牛的产奶量性状进行研究，寻找与产奶量紧密连锁的分子标记或克隆出控制产奶量的基因，对于进行标记辅助选择及培育高产娟姗牛，具有十分重要的意义。随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 是由 Williams 和 Welsh在 1990 年发现的一种DNA 多态检测技术。该技术操作简便、快捷，结果准确且灵敏度高。此外RAPD 技术在无须事先了解物种的相关分子生物学信息情况下也可以进行相关标记，因此在品种鉴定、系谱分析、突变体检测、基因定位和遗传育种等方面领域得到广泛应用。已有研究者应用 RAPD 技术筛选中国荷斯坦牛产奶量性状遗传标记，中国荷斯坦牛的乳脂率是3.5%，相比较娟姗牛乳脂率低很多，并且体型与中国荷斯坦牛相比，娟姗牛会小很多，若是能够选育出高产奶的娟姗牛，在同等的养殖面积条件下，将远远提高养殖的经济效益。但是迄今在娟姗牛产奶性能目前未见报道。本研究应用RAPD 技术分别对高产娟姗奶牛组和低产娟姗奶牛组的基因组DNA 进行了多态性分析，并对筛选出的与产奶量相关的标记进行克隆测序及生物信息学分析，以期找到与娟姗奶牛产奶量性状相关的分子标记，为我国南方培育高产娟姗奶牛提供科学依据。

发明内容

鉴于上述内容，有必要提供高产奶性能娟姗奶牛选育方法。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

高产奶性能娟姗奶牛选育方法，

用标记引物S11，序列为GTAGACCCGT，扩增娟姗奶牛血液中的线粒体DNA，如果能够扩增出929bp片段或478bp片段，则标志着该娟姗奶牛为高产奶的娟姗奶牛；或

用标记引物S1110，序列为CAGACCGACC扩增娟姗奶牛血液中的线粒体DNA，如果能够扩增出458bp片段，则标志着该娟姗奶牛为低产奶的娟姗奶牛；或

用标记引物S1120，序列为ACCAACCAGG扩增娟姗奶牛血液中的线粒体DNA，如果能够扩增出669bp片段，则标志着该娟姗奶牛为低产奶的娟姗奶牛。

进一步说明，所述标记引物的是由以下方法筛选得到的：

（1）、取20头高产(305 d 产奶量>4000 kg)和 20 头低产(305 d 产奶量 <3200kg娟姗牛，颈静脉采血 10 mL ，EDTA-k2 抗凝，-20 ℃保存；

（2）、用 DNA 提取试剂盒提取奶牛血液总 DNA 进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测奶牛个体的 DNA 浓度，稀释到同一浓度；取每个个体等量DNA分别混成高产奶牛DNA 池和低产奶牛DNA池；

（3）、用250条 S 系列 10 bp 随机引物，分别以高产和低产DNA 池为模板进行PCR 扩增，PCR 扩增反应体系为Template（基因组DNA 20-50ng/μl）0.5μl，其中，10×Buffer（with Mg²⁺）2.5μl，dNTP （各2.5mM）1μl，酶0.2μl，引物1μl，加双蒸H₂O 至25μl；

PCR 扩增反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45s；36 ℃退火45s；72℃延伸 1min，35 循环后，72 ℃延伸 10min；

PCR 扩增产物在1.2% 的琼脂糖凝胶电泳，电压为 5V/cm ，电泳缓冲液为 0.5×TBE，电泳1～2h后在凝胶成像系统上检测并拍照，从中筛选扩增条带多、重复性好、分辨率高且扩增条带在高、低产 DNA 池间有显著差异的3个引物；经DNA 片段的回收、连接、感受态的制备、转化、质粒 DNA 的提取及重组质粒的酶切鉴定后，进行测序；

其中， 929bp片段的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示或478bp的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

458bp片段的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

669bp片段的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：

本发明发现了娟姗牛中KX592814.1可以作为娟珊奶牛高产基因的标记基因。通过基因选择可实现快速开展种牛育种，省去种牛配种与产奶测定时间，将育种时间缩短到原来的1/2左右。利用该基因检测，还可直接判断该头种牛预计的产奶情况，极大的提高娟姗种牛的育种效率，具有重要的市场价值和意义。

附图说明

图1为奶牛血样总 DNA 的提取电泳图，其中M是DNA Maker SM0331分子量标准，条带从上至下依次为10000 bp、3000 bp、1000 bp、500 bp；编号1-12分别是提取12头奶牛血液总DNA 琼脂糖凝胶电泳图；

图2为引物S11、引物S1110和S1120以高、低产牛血液总DNA为模板的扩增结果，其中M是DNA Maker SM0331分子量标准，条带从上至下依次为10000 bp、3000 bp、1000 bp、500 bp；箭头所指为差异带是S11、S1110和S1120。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

1 材料与方法

1. 1 试验材料

20头高产(305 d 产奶量>4000 kg)和 20 头低产(305 d 产奶量 < 3200kg娟姗牛均由广西壮族自治区畜牧研究提供，颈静脉采血 10 mL ，EDTA-k2 抗凝，-20 ℃保存。

引物及主要试剂：250条S系列随机引物；Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶 EcoRⅠ、DNA Marker DL2 000 、dNTP及 DNA 回收试剂盒均由日本 TaKaRa 公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取

用 DNA 提取试剂盒提取奶牛血液总 DNA 进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测奶牛个体的 DNA 浓度，稀释到同一浓度备用。取每个个体等量DNA 分别混成高产奶牛DNA 池和低产奶牛DNA池。

1.2.2 RAPD 反应体系的优化

对 RAPD 反应体系的摸索，设计了模板、引物、dNTPs 、Mg 2+、Taq 酶、退火温度、反应时间等7个不同参数，设置了4~10 个浓度梯度。循环参数为：94 ℃预变性4 min ；94℃变性45s ，36 ℃退火45s ，72 ℃延伸 1min，35 循环后，72 ℃延伸 10min。扩增产物在1.2% 的琼脂糖凝胶电泳，电压为 5V/cm，电泳缓冲液为 0.5×TBE。电泳 1～2h 后在凝胶成像系统上检测并拍照。

PCR反应体系：

试剂	体积（μl）
		Template（基因组DNA 20-50ng/μl）	0.5
10×Buffer（with Mg<sup>2+</sup>）	2.5
		dNTP （各2.5mM）	1
酶	0.2
		引物（10uM）	1
加双蒸H<sub>2</sub>O 至	25

PCR循环条件：

1.2.3引物的筛选及 RAPD- PCR

用250条 S 系列 10 bp 随机引物，分别以高产和低产DNA 池为模板进行 PCR 扩增，扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，从中筛选扩增条带多、重复性好、分辨率高且扩增条带在高、低产 DNA 池间有显著差异的引物。经DNA 片段的回收、连接、感受态的制备、转化、质粒 DNA 的提取及重组质粒的酶切鉴定等环节后，提交上海生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1. 2. 4 图谱分析及数据统计处理

对扩增图谱观察记录，结果中条带的有和无、强和弱用“1”，“2”，“3”，“4”表示。统计特异条带并分析。

1. 2. 5 生物信息学分析

对测序成功的 RAPD 标记在美国国立卫生研究院(NIH)国家生物学信息中心(NCBI，http：/ /www. ncbi. nih. nlm. gov /Blast)进行序列同源性分析。

2 结果与分析

2.1 DNA 的提取

通过采用动物DNA 提取试剂盒分别对每个奶样进行总DNA提取，电泳检测总 DNA纯度（图1），紫外分光光度计检测总 DNA 浓度。将高产DNA和低产DNA混成高产DNA池和低产DNA池，并稀释至同一浓度备用。

2.2 RAPD 多态性分析

采用优化后的反应体系对 250 条 S 系列随机引物进行 PCR 扩增。筛选出稳定性较好、带型清晰的引物200条。对筛选出的引物在 10 头奶牛血液总 DNA 中进行 RAPD-PCR ，筛选出在不同个体间有明显差异的RAPD 引物 3 条，分别为S11 ，S1110和S1120 (图2)。

2.5 高产奶分子遗传标记的测序与分析

从图 2中可以看出，高产奶组中，S11 在478bp和929bp处分别扩增出特异性亮带，S11 在低产奶组中并未扩增出特异性条带。此外在高产奶组中，S1120在669bp处也扩增出一条亮带，而在低产奶组中并未扩增出特异性条带。在低产奶组中，S1110在458bp处扩增出一条亮带。从以上结果可以分析，S11所扩增的亮带可以作为高产娟姗牛品种的1遗传标记，S1110和S1120 扩增出的弱带可以作为低产娟姗牛品种的一个遗传标记。

2. 1. 3 RAPD 标记检测及其与产奶量相关性分析

用筛选到的RAPD 引物对所有个体进行PCR检测，根据扩增图谱统计分析后，得到了 3 个与奶牛产奶量性状相关的 RAPD 标记，分别命名为S11，S1110和S1120。其中，S11在高产奶牛个体中出现，与产奶量呈正相关。标记S1110和S1120在低产奶牛个体中出现，与产奶量呈负相关。

2. 1. 5 生物信息学分析

对扩增出的RAPD 标记S11，S1110和S1120进行了测序，S11为929 bp和478bp ，S1110 为458bp，S1120为669 bp。同源性分析工作在美国国立卫生研究院（NIH）国家生物学信息中心（NCBI，http：//www.ncbi.nih.nlm.gov/Blast）完成。经 Blast 对比分析（表1-4），结果发现，在牛的基因中，S11 与 KX592814.1基因同源性为82%，因此可以推测 S11可以作为一个重要的高产奶分子标记。

表1 S11 为 929 bp标记片段与NCBI中基因的同源性对比

Description	Max score	Totalscore	Querycover	E value	Ident	Accession
							Oviscanadensiscanadensisisolate43Uchromosome 3sequence	728	1.023e+05	73%	0.0	85%	CP011888.1
BostaurusBACCH240-27A8(Children'sHospitalOaklandResearchInstituteBovineBACLibrarycompletesequence	135	775	16%	2e-27	83%	AC149679.4
							BostaurusBACCH240-309L24(Children'sHospitalOaklandResearchInstituteBovineBACLibrarycompletesequence	135	466	16%	2e-27	83%	AC150916.5
Oviscanadensiscanadensisisolate43Uchromosome 23sequence	128	16390	17%	3e-25	82%	CP011908.1
							Oviscanadensiscanadensisisolate43Uchromosome 1sequence	126	51499	18%	1e-24	82%	CP011886.1
BostaurusisolateDominette_000065Fgenomicsequence	122	16066	17%	1e-23	82%	KX592814.1
							Oviscanadensiscanadensis isolate43Uchromosome 5sequence	119	21090	17%	2e-22	84%	CP011890.1
Oviscanadensiscanadensisisolate43Uchromosome 21sequence	117	11203	16%	6e-22	80%	CP011906.1
							Oviscanadensiscanadensis isolate43Uchromosome 2sequence	115	49182	17%	2e-21	80%	CP011887.1
Oviscanadensiscanadensisisolate43Uchromosome 4sequence	113	23572	16%	8e-21	79%	CP011889.1

表2 S11 为 478bp标记片段与NCBI中基因的同源性对比

Description	Max score	Total score	Query cover	E value	Ident	Accession
							Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 5 sequence	265	7191	85%	1e-66	84%	CP011890.1
Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 13 sequence	254	3634	79%	2e-63	83%	CP011898.1
							Bos taurus isolate Dominette_000065F genomic sequence	250	1616	81%	3e-62	86%	KX592814.1
Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome X sequence	243	15472	78%	5e-60	85%	CP011912.1
							Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 17 sequence	243	4135	71%	5e-60	86%	CP011902.1
Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 26 sequence	241	2388	58%	2e-59	85%	CP011911.1
							Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 1 sequence	239	15144	77%	6e-59	87%	CP011886.1
Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 10 sequence	239	4164	57%	6e-59	83%	CP011895.1
							Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 3 sequence	239	9861	82%	6e-59	81%	CP011888.1
Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 2 sequence	237	14286	77%	2e-58	81%	CP011887.1

表3 S1110 为 458bp标记片段与NCBI中基因的同源性对比

Description	Max score	Totalscore	Querycover	E value	Ident	Accession
							Oviscanadensiscanadensisisolate43Uchromosome 7sequence	603	603	86%	2e-168	94%	CP011892.1
Escherichia coliplasmidpAm08WL3069,completesequence	113	113	13%	4e-21	98%	GQ149348.1
							Cloningvectorp7S6,completesequence	113	113	13%	4e-21	100%	EU541493.1
Cloningvectorp7Z6,completesequence	113	113	13%	4e-21	100%	EU541492.1
							Uncultured fungusITS1,5.8S rRNAgene,ITS2 and26S rRNAgene(partial), cloneYJ4-62	113	113	13%	4e-21	100%	AJ877191.1
CloningvectorpRN-FRT,completesequence	111	111	13%	1e-20	100%	KU749551.1
							Aeromonashydrophila strainSH18class IintegronDfrA17(dfrA17)gene,completecds	111	111	13%	1e-20	100%	KF442256.1
Unculturedbacteriumpartial16S rRNAgene,cloneLE21_106	111	111	14%	1e-20	97%	HE984970.1
							Uncultured fungus18S rRNAgene,ITS1,5.8S rRNAgene,ITS2 and28S rRNAgene,clone4Y2102-50	111	111	13%	1e-20	100%	FR863607.1
Uncultured fungus18S rRNAgene,ITS1,5.8S rRNAgene,ITS2 and28S rRNAgene,clone4Y2101-14	111	111	13%	1e-20	100%	FR863605.1

表4 S1120 为 669bp标记片段与NCBI中基因的同源性对比

Description

Max score

Total score

Query cover

E value

Ident

Accession

Ovis canadensis canadensis isolate 43U chromosome 8 sequence

939

99%

0.0

92%

CP011893.1

3 讨论与结论

娟姗牛乳脂率高和乳蛋白高，风味醇厚，受到广大群众的喜爱。面对市场上娟姗牛奶供不应求的情况，如何提高产奶量一直也是娟姗牛育种工作中比较关注的问题。影响产奶量的因素有很多，其中主要包括遗传、营养、健康水平和环境等^[8]。本试验主要从分子水平上探索与娟姗牛产奶量性状相关的DNA序列并做相应的生物学分析。为此本试验在挑选试验动物时，确保所选的奶牛的年龄、产奶胎次、产奶时间及在产奶期间的生理健康情况都大致相同，并给于同一饲养水平和同一饲养环境条件及饲养管理。通过这些试验设计，尽量较少其他因素的干扰，确保试验能准确可靠的反应DNA水平的差异。本试验用了200 条RAPD 引物，共扩出 2000多条带，即大约对基因组的近2000多个位点进行了分析，所得结果可在一定程度上反映基因组的异同。试验结果显示，有S11、S1110和S120这三条带在高产、低产群体出现差异，因此我们推测这3个DNA片段与产奶量有关，其中S11与产奶量性状正相关，S1110和S120与产奶量性状呈负相关。因此在研究高产娟姗牛培育的过程中，这三个基因片段可作为产奶量辅助选择的遗传标记。

4 验证试验

在广西畜牧研究所试验牛场中，分出6块面积为1亩的养殖牛场，养殖场的条件相同，喂养的饲料均为本研究所购买的膨化大豆、辅料、大豆皮、苜蓿甘草、玉米秸秆、象草配合后的饲料，饲料由专人饲喂和管理；分别设立6个组，1-3试验组为采用本申请的技术方案选育出的高产奶的娟姗牛母牛，每个试验组30头，1-3对照组为未经过选育的娟姗牛母牛，每个对照组30头；

试验对比为娟姗牛的年龄相同，胎次相同，体重相同（偏差±50g），对试验组和对照组进行养殖至泌乳期，检测产奶量和乳成分指标；

泌乳高峰期采奶60天（保证泌乳期存活30头奶牛），每日两次挤奶各采一次，凌晨2:00和下午2:00，记录每天两次的产奶量之和，将1-6组检测70天的总和/中头数=每头的产奶量；并将每组在采奶的第15、30、60天的奶取样后送到牛奶分析实验室，由专人进行检测分析。通常测定牛奶中的乳脂肪、乳蛋白、乳糖含量，具体数据见表5、6：

表5

组别	60d产奶量总和/kg	头数/只	产奶量/（kg/只）
				试验组1	32412.2	30	1080.4
试验组2	32310.4	30	1077.0
				试验组3	32248.9	30	1075.0
对照组1	25310.2	30	843.7
				对照组2	23540.2	30	784.7
对照组3	21896.5	30	729.9

由上表可知，采用本申请选育后能准确的确定娟姗牛为高产奶娟姗牛，这也就是为什么同样条件下，试验组1-3产奶量要高于对照组1-3。

表6

由上表可知，采用本申请选育后的高产奶的娟姗牛的产奶品质相比较对照组1-3的产奶品质优异。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

<110> 广西壮族自治区畜牧研究所

<120> 高产奶性能娟姗奶牛选育方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

gtagacccgt 10

<210> 2

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

cagaccgacc 10

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

accaaccagg 10

<210> 4

<211> 929

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

gtagacccgt tattttgtaa agtgtcccca acttgagttt gtcagatggt aggtgtttcc 60

cgatggctag attgaggcct gcatcttcgg caggaatgtc gcagcagcct cgctgtgctc 120

gcctcgtgac cttttgctag gttgcaggtg acttccgcct gtcccatcac tgctgctgtt 180

cactgcggtc actccactaa ggtgggagct gtcagatccc cctttctttt cccagcagaa 240

tgttctttat actgtgtaat taataagcag tttgtaggag acatcttgga agctgtgtag 300

atgtatcatt cctcaccaag cttcatatat tctttattgt ttatatattt tcagggactt 360

gagatttcct gttttaataa gtgggttatg atccattgct ttcattattt attttgatat 420

ttaagttgtc cctaatttag ccacaaaggc accttcatgc tggtttctgt gtccttttga 480

cgtgtcccta gcatttttgg aacactttct gacttcctga tgcaagatat tacaagctca 540

cctgtacttt ccatgctcag tcctggaatc atctgtctct ccaaagagcg ctggttcttt 600

ttaatgcaaa caggcatccg gaatctggga tctaggcagc agggctgctc attgctcttg 660

gatgctactg ctccgggccc tctaagtggg cagagctcca ggggcctgtt ccatatgcac 720

atccctatac acacatgtgc atgcgtgtgt gctcagtcac tcagtcaggc ccgactctgt 780

gaccccaggg attgcagccg ccagtctccc ccatccgtgg gacagatcag gcgagcgcac 840

tggagtgggt tgccatttcc tcctccaggg gatcttccca acccaggaat ctctagagga 900

tccccgggta ccgagctcga attcgtaat 929

<210> 5

<211> 478

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 5

gtagacccgt ggcagattca tatcaatgta tgacaaaacc agtacaatat tgtaaagtaa 60

ttagcctcca aaaaaaaata tagataaata aataaagtga aaacatacac acacacacac 120

acaaaaagga agaaagaaaa atagtagaag gaaagaaatg ttaaagatca gagcataaat 180

aaaggaataa taataaagat taataagact aaaagctggt tctttgagaa gataaataaa 240

actgacaaac aactatccaa actcttcaag aaaaaaagga caagaatcaa atctgcaaag 300

ttagaagtga aaaaggagag gttacaacag acaatgcaga aataaaaagg atcataaaag 360

actattatga tcaactatat gccagtgaaa cggacaacct gaaagaaacg ggtctacaat 420

cgtcgacctg caggcatgca agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactg 478

<210> 6

<211> 458

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 6

cagaccgacc agaaccacat agtatagaaa atggacgttt ccctaaggaa aaggaatacc 60

taaaagaggg tggaagggaa accaggcagg caaaataatg catacccacc tcaaaaattc 120

attgcattgg ttttcctcag cttacactta acctcttaac actttcttct agtccaataa 180

aagtggaaaa gaggatttat ctatactcat gtttaacaca ggcagaagag taaagagagg 240

ctcggaaaat gctgcaaaat ctatcagcca gcattaccac acagaaaaac ttctgcttcc 300

agagaaggag ccaagttcaa gtcagaggtg gtgaatgcaa gcaggaaagc tcagttcctc 360

cagaaatatt cacggcaagt ggaggaaagg tcggtctgaa tcgtcgacct gcaggcatgc 420

aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgact 458

<210> 7

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 7

accaaccagg catgatttta tgccaaattg gacatttggt agagtctgga gaaattttgt 60

cacaagtctg aatgggggaa gggagagtgc aattggcatc tagtctgctg atgctagaaa 120

tgctgattaa cagcctacag tacacaggtc agcacccaca gcagagaatc acccagtctg 180

aaatggcacc agcaacaaga ttgaaaaatg ctggtccaaa ttttggagat gccgaggagg 240

gaggtcagct gtccaacaga gtgtctgggc tgtcccttta ctaacatgac tcaagaagaa 300

gtggcagcct tgcagcatta atgtatgatt ctctggttcc ttatgctcaa gaaaaatgca 360

ctctacttca taaagtaaga tgtatttgta cgagaagtta agtaatagca ccaaatagaa 420

taaatgtgta agttaaatac ctacctttag atttcaaagg aaaagagaga atataaacat 480

gaggattaag tgtacagagt ctggaggtgt tcttggaatt ctgaccctag ttttaatatt 540

ttctaattag tagactggaa acaaaatatt ttgccttcga aagttcccac gttctcatct 600

ataaaataaa gacctaactt ttagactatg tgtagaaagt atgtaaatca acacctgaaa 660

agtgtttat 669

Claims

1.高产奶性能娟姗奶牛选育方法，其特征在于：包括以下步骤：

用标记引物S1110，序列为CAGACCGACC，扩增娟姗奶牛血液中的线粒体DNA，如果能够扩增出458bp片段，则标志着该娟姗奶牛为低产奶的娟姗奶牛；或

用标记引物S1120，序列为ACCAACCAGG，扩增娟姗奶牛血液中的线粒体DNA，如果能够扩增出669bp片段，则标志着该娟姗奶牛为低产奶的娟姗奶牛；

所述高产奶的娟姗奶牛是指305 d 产奶量>4000 kg的娟姗奶牛，所述低产奶的娟姗奶牛是指305 d 产奶量 < 3200kg的娟姗奶牛；

所述的标记引物是由以下方法筛选得到的：

（1）、取20头高产奶和 20 头低产奶的娟姗奶牛，颈静脉采血 10 mL ，EDTA-k2 抗凝，-20 ℃保存；

（2）、用 DNA 提取试剂盒提取奶牛血液总 DNA 进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测奶牛个体的 DNA 浓度，稀释到同一浓度；取每个个体等量DNA分别混成高产奶娟姗奶牛DNA 池和低产奶娟姗奶牛DNA池；

（3）、用250条 S 系列 10 bp 随机引物，分别以高产奶和低产奶娟姗奶牛DNA 池为模板进行 PCR 扩增，PCR 扩增反应体系为Template 0.5μl，其中，10×Buffer 2.5μl，各2.5mM dNTP共1μl，酶0.2μl，引物1μl，加双蒸H₂O 至25μl；

所述10×Buffer含有 Mg²⁺；所述Template为 20-50ng/μl的基因组DNA ；

PCR 扩增反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45s；36 ℃退火45s；72℃延伸1min，35个循环后，72 ℃延伸 10min；

PCR 扩增产物在1.2% 的琼脂糖凝胶电泳，电压为 5V/cm ，电泳缓冲液为 0.5×TBE，电泳1～2h后在凝胶成像系统上检测并拍照，从中筛选扩增条带多、重复性好、分辨率高且扩增条带在高产奶和低产奶娟姗奶牛 DNA 池间有显著差异的3个引物；经DNA 片段的回收、连接、感受态的制备、转化、质粒 DNA 的提取及重组质粒的酶切鉴定后，进行测序；

其中，高产奶娟姗奶牛 DNA 池中有1个929bp或478bp的RAPD 标记片段，其标记引物为S11；

低产奶娟姗奶牛 DNA 池中有1个458bp片段的RAPD 标记片段，其标记引物为S1110；

低产奶娟姗奶牛 DNA 池中有1个669bp片段的RAPD 标记片段，其标记引物为S1120。

2.根据权利要求1所述的高产奶性能娟姗奶牛选育方法，其特征在于：929bp片段的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，478bp的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.根据权利要求1所述的高产奶性能娟姗奶牛选育方法，其特征在于：458bp片段的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

4.根据权利要求1所述的高产奶性能娟姗奶牛选育方法，其特征在于：669bp片段的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。