CZ20021770A3 - Metoda kryopreservování vybraných spermií - Google Patents

Description

Vynález se vztahuje k metodě mražení spermií vybraných pro určité vlastnosti stejně jako mražení vzorků vybraných spermií a metody užití těchto vzorků. Vynález je zvláště užitečný pro uchování spermií vybraných podle pohlaví.

Dosavadní stav techniky

Více než před půl stoletím bylo umělé oplodnění uvedeno ve Spojených Státech jako komerční rozmnožovací nástroj pro různé savčí druhy. Ačkoliv umělé oplodnění bylo zpočátku limitováno oblastí, která byla relativně blízko místu, kde se prováděl sběr spermatu, pokroky v kryopreservaci a skladování spermií urychlily širokou distribuci a komercializaci spermatu, zamýšleného pro umělé oplodnění nebo oplodnění in vitro.

Další zlepšení ve sběru savčích spermií, výběru, kryopreservaci, skladování a technikách zacházení zvýšilo schopnost chovatelů získat žádané vlastnosti zvířat. Například pokrok ve výběru savčích spermií založený na jemném rozdílu ve fyzikálních charakteristikách, umožnil rozdělit spermie na základě pohlaví, tj., vybrat spermie, které obsahují buď X nebo Y chromozóm. Tato technika umožnila chovatelům ovlivnit relativní procento X a Y chromozomů ve vzorku a tak určovat výsledné pohlaví. Schopnost vybrat spermie na základě pohlaví nebo jiné žádoucí charakteristiky poskytuje důležitý nástroj pro urychlení genetického pokroku, zvýšení účinnosti produkce a dosažení větší flexibility v pečování o dobytek. Úplné využití tohoto nástroje však závisí na schopnosti zmrazit a skladovat vybrané spermie.

Je dostupná řada metod pro výběr buněk; avšak tento výběr a následné zpracování spermií představuje unikátní pokrok, protože spermie nejsou schopné DNA reparace a také kvůli morfologii spermií. Každá spemie má akrozóm, který pokrývá hlavičku, a ocásek, který je důležitý pro oplodnění a který je relativně náchylný k fyzikálnímu poškození. Navíc, fertilita spermií klesá s prodlužující se dobou mezi odběrem a použitím. Protože nejdostupnější metody výběru zahrnují fyzikální stresy a jsou časově náročné, vybrané spermie jsou do určité míry kompromitované ve srovnání s neselektovanými spermiemi. Fertilita může být dále snížena, pokud selekční technika zahrnuje podstatnou diluci. Odhaduje se, že tento diluční efekt může být způsoben ztrátou protektivních komponent v seminální plasmě.

Průtoková cytometrie je zvláště účinná selekční metoda, která se užívala pro výběr spermií podle typu pohlaví. Avšak vybrané spermie jsou znevýhodněné při arteficielní inseminaci nebo při in vitro oplodňovacím protokolu ve srovnání s těmi, které byly normálně získané. Navíc průtoková cytometrie je časově náročná a kvůli fyzikálním omezením průtokových cytometrů musí být spermie pro výběr ředěny na úroveň, která není optimální pro skladování (obvykle na řádově 10⁵ 10⁶ /ml). Navíc vybrané spermie, zamýšlené pro arteficielní oplodnění musí být koncentrované tak, aby mohlo být použito obvyklé balení a doručovací zařízení. Potřeba kroku koncentrování tedy vystavuje již tak do jisté míry kompromitované spermie dalšímu fyzikálnímu stresu.

Mražení spermií také snižuje fertilitu, pohyblivost a/nebo životnost a ačkoliv techniky pro mražení neselektovaných spermií jsou dobře známé, žádná technika pro kryopreservaci vybraných spermií nebyla popsána.

Podstata vynálezu

Presentovaný vynález umožňuje kryopreservaci spermií, které byly vybrány podle určitých charakteristik, usnadňuje skladování a/nebo dopravování vzorků vybraných spermií do míst vzdálených od místa sběru. Táním se získají životaschopné spermie, které lze použít v procedurách jako je arteficielní • · · · • · ·

4 4 4 4 ·

444 44 44 oplodnění („AI“) a in vitro fertilizace („IVF“). Tyto výsledky jsou překvapující, neboť je dobře dokumentovaná fragilita spermií. Dříve výzkumníci demonstrovali, že zátěže spojené s různými metodami selekce nebo kryopreservace vedou k významnému poklesu fertility a/nebo životaschopnosti. Prezentovaný vynález poprvé ukázal, že těhotenství může být dosaženo pomocí spermií, které byly selektovány a následně zamrazeny.

Vynález představuje významný pokrok v chovatelství dobytka, kde výběr spermií pro užití v takových procedurách může být využit k produkce potomstva, které má žádané vlastnosti. Například, výběr k získání spermií, které nesou buď chromozóm X nebo Y umožňuje kontrolu pohlaví potomků, což je výhodné pro produkci zvířat jako je hovězí dobytek. Výběr pohlaví také nachází uplatnění v chovu cenných (například dostihoví koně) nebo ohrožených zvířat. Schopnost zmrazit vzorky vybraných spermií, kterou vynález poskytuje, umožní široké užití selekčních metod například k zvýšení efektivity produkce dobytka stejně jako k zvýšení kvality chovů.

Definice

Termín „akrozóm“ nebo „akrozomální čepička“ se vztahuje k čepičce, která pokrývá přední polovinu hlavičky spermie a která obsahuje enzymy, potřebné k penetraci vajíčka.

Termín „sex-typ“ se vztahuje ktypu pohlavního chromozómu, který je přítomen v spermii (například X nebo Y chromozóm).

Termín „kapacitace“ se vztahuje k speciálním změnám spermie, která vyvíjí schopnost oplodnit vajíčko, tyto změny zahrnují změny enzymů na povrchu akrozómu, které vedou k výdeji akrozomálních enzymů, které usnadňují penetraci spermie do vajíčka.

Při užití ve vztahu k spermii, termín „kryoprotektant“ se vztahuje k molekule, která ochraňuje spermii během cyklu zmrazování a tání, čímž napomáhá přežívání a udržuje fertilizační schopnost.

· • ♦ · · · · • ·

4 4 ·

4 »4 4 4 4

Termín „diluční efekt“ se vztahuje k rychlému poklesu pohyblivosti a/nebo životaschopnosti spermií, jsou-li výrazně naředěny.

Při užití zde, termín „selekce“ se vztahuje k metodě, kde jsou vzorky rozděleny na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti určité vlastnosti ( pokud z kontextu nevyplývá něco jiného). Tedy „vzorek selektovaných spermií“ je vzorek získaný po podrobení zdrojového vzorku selekci pro specifickou vlastnost. Selektovaný vzorek spermií je tedy obohacen vzhledem k zdrojovému vzorku spermiemi, které mají specifické vlastnosti.

Termín „třídění“ se zde užívá k popisu selekční metody prováděné s užitím třídiče fluorescencí aktivovaných buněk (FASC).

Termín „extender“ se vztahuje k jakémukoliv médiu, které zachovává životaschopnost spermií. Termín „extenze“ se vztahuje k naředění spermií pomocí extenderu.

Termín „počáteční (iniciální) extender“ se vztahuje k médiu, které se užívá k extenzi spermií před izolačním krokem metody tohoto vynálezu.

Termín „konečný (finální) extender“ se vztahuje k médiu, které se užívá k extenzi spermií před zmrazovacím krokem metody tohoto vynálezu.

„Organická substance“ v extenderu zde popisuje jakoukoliv organickou substanci, která má sklon snižovat chladový šok a zachovat fertilitu spermií.

„Energetický zdroj“ v extenderu popisuje zde jakýkoliv substrát nebo substanci, které spermie mohou využívat pro udržení buněk a /nebo pohyblivosti.

Termín „osmolalita“, jak je používán zde , je měření osmotického tlaku rozpuštěných částic roztoku ve vodním roztoku (například v extenderu). Částice roztoku zahrnují obojí, ionty i neionizované molekuly. Osmolalita je vyjádřena jako »9 9999 • 9 9 9 9 9 9 9 9 koncentrace osmoticky aktivních částic (například osmolů) rozpuštěných v 1 kilogramu vody.

·· ··· · » » · » · ···

Metoda kryopreservace

Vynález popisuje metodu kryopreservace vybraných spermií a zahrnuje následující kroky:

1) Získání a selekce vzorku spermií

2) Zchlazení vzorků vybraných spermií

3) Izolace spermií ze vzorků vybraných spermií

4) Přidání finálního extenderu k izolovaným spermiím k vytvoření suspenze spermií

5) Zmražení suspenze spermií

Získání vzorků vybraných spermií

První krok kryopreservační metody vynálezu je získání vzorků předtím vybraných spermií, stejně jako podrobení zdrojového vzorku nějaké vhodné selekční metodě. Spermie jakéhokoliv druhu mohou být vybrány a zamrazeny podle metody tohoto vynálezu. Metoda může být prováděna se spermiemi domestikovaných zvířat, především dobytka, stejně jako se spermiemi divoce žijících zvířat (například ohrožených druhů). Upřednostňuje se, aby vzorek obsahoval spermie savců. Lidské spermie, bovinní, koňské, ovčí, losí a bizoní jsou preferovány především.

Obecně, vzorek vybraných spermií obsahuje normální, životaschopné spermie. Ejakulát, ze kterého jsou spermie získávány, má typicky okolo 50% a lépe nejméně 75% morfologicky normálních spermií. V těchto tělískách obvykle nejméně 40 a lépe nejméně 60% spermií vejakulátu vykazuje rostoucí pohyblivost.

Je dostupná široká škála metod pro výběr buněk z mixované populace, která zahrnuje například výběr buněk, založený na vazbě buněk nebo buněčných komponent s protilátkami, částicemi protilátek nebo dalšími vazebnými partnery, a různé barvení.

• 9 ···« ·· ·· ·· ·· • · 9 ···« «**·

Vynález je zde uváděn se selekční technikou založenou na rozdílném typu pohlaví a pro tento vynález podle pohlaví vybírané spermie mohou být získány s užitím jakéhokoliv selekčního postupu, který využívá výhody mírného rozdílu mezi X a Y typem spermií. Příkladem metody, založené na rozdílu pohlaví jsou magnetické techniky (viz například U.S. Patent No 4,276,139), sloupcové techniky (viz například U.S. Patent No 5,414,537), gravimetrické techniky (viz například U.S. Patent No 3,894,529, obnovený Patent No 32350, U.S. Patent No 4,092,229, 4,067,965 a 4,155,831). Selekce podle pohlaví, založenýma rozdílu v elektrických vlastnostech, je popsána v U.S. Patentu No 4,083, 957 a technika selekce která je založená na rozdílu v elektrických a gravimetrických vlastnostech, je diskutovaná v U.S. Patentu No 4,225,405, 4,698,142 a 4,749,458. U.S. Patent No 4,009,260 a 4,339,434 popisuje selekci založenou na rozdílech motility. Biochemické techniky, založené na protilátkách jsou popsané v U.S. Patent Nos 4,511,661, 4,99,283, 3,687,803, 4,191,749, 4,448,767, zatímco U.S. Patent Nos 5,021,224, 5,346,990, 5,439,362 a 5,660,997 popisují selekci, založenou na rozdílu v membránových proteinech buněk.

Průtoková cytometrie je upřednostňovaná metoda, která se používá pro separaci buněk z míchané populace a je založená na různém barvení fluorescenčními barvivý nebo vazně fluorescenčně poznačené molekuly, například protilátky nebo nukleové kyseliny. Ve třídiči fluorescencí aktivovaných buněk (FASC), se buňky „třídfdo různých populací na základě intensity fluorescence při ozáření. FASC se může používat pro selekci spermií podle pohlaví, protože X chromozóm obsahuje poněkud více DNA než Y chromozóm. Když jsou spermie barveny pomocí fluorescenčního barviv, které se váže na DNA, spermie, které nesou X chromozóm absorbují více barviva než spermie, které nesou Y chromozóm a tímto způsobem mohou být rozděleny 2 populace buněk pomocí FACS. Tento postup je diskutován v U.S. Patentu No 4.362,264 a podstatně rozšířen na pU.S. Patent 5,135,759 (vydáno Johnsonovi). Rozdělování může být umocněno použitím průtokového cytometru s vysokou rychlostí, jako je MoFlo® průtokový cytometr, který vyrábí Cytomation, inc. (Ft. Collins, CO) a je popsaný v U.S. Patentu Nos 5,150,313, 5,602,039, 5,602,349 a 5,643,769 právě tak jako v PTC Publication No WO 96/12171.

• · · · ·« ·· ·*· »*«*··» • · ·· · · · *· · · ··««

Selekční metoda, založená na získání vzorku vybraných spermií je především ta, která dokáže uchovat životaschopnost spermií. Normální průtoková cytometrická technika by měla být obecně modifikovaná pro dělení spermií a to kvůli relativní fragilitě spermií. Přesněji, průtoková cytometrie obsahuje barvení, ředění (diluci) a vystavení buněk světlu. Všechny tyto kroky představují zátěž a mohou snižovat životaschopnost spermií. Citlivost spermií k těmto druhům zátěže může být různá u různých druhů a dokonce i mezi jednotlivými jedinci téhož druhu. Tato citlivost musí být buďto dokumentovaná, nebo může být snadno určena pomocí empirických studií, jak je popsáno v Příkladu 1-5.

Modifikace, které zvyšují životaschopnost spermií jsou popsané v patentových publikacích, které jsou diskutované výše. Například, postup, který dává zlepšení pouzdra a sběrného systému po řízění spermií, je popsán v PC Publication Co. WO 99/33956 (aplikace No. PTC/US98/27909). Dále Příklady 1-7 uvedené níže, popisují příkladné postupy pro barvení a rozdělování spermií. Příklad 3 popisuje studii účinku laserové intenzity a koncentrace barviva na motilitu vybraných zmrazených spermií po roztáni.

999 9

9

9 99

9 9 9 9 9 9

999 99 99

9 9

Vzorek vybraných spermií obsahuje řadu dalších součástí kromě spermií a často obsahuje komponenty, které jsou přidávané kvůli ochraně spermií během procesu výběru. V případě FACS, vzorek vybraných spermií může obsahovat komponentu(y) roztoků, které se používají pro barvení a třídění ( například tekutinu pouzdra a zachycovací nárazník).

Vzorek vybraných spermií navíc obsahují typicky extender, nebo frakce extenderů. Například jsou velmi dobře známe dvoustupňové extendery, kdy „frakce A“ postrádá glycerol a „frakce B“ obsahuje glycerol. Frakce A je přidávána ke spermiím nejdříve a následuje přidání stejného objemu frakce B. při tomto kroku je frakce B většinou rozdělena do nejméně 2 stejných částí a podávána postupné, tj, druhá část frakce B je podána 15 minut po první.

Nejsou- li přítomné žádné extenderové komponenty, pak je extender nebo jeho frakce přidáván typicky k selektovanému vzorku spermií před tím, než jsou spermie izolované ze vzorku. Jsou- li přítomné pouze některé komponenty extenderů, dodatečné komponenty mohou být přidány podle volby tak, vybrané spermie obsahovaly kompletní extender nebo extenderové frakce před krokem isolace. V exemplárních vzorcích, hovězí spermie jsou rozdělovány průtokem tak, že vyrobené vzorky selektovaných spermií obsahuje také a frakci extenderů ( viz příklad 2,3 a 4). Je-li žádáno, B frakce extenderů může být přidána k vzorku před krokem izolace ( viz Příklad 5). Podávání extenderů před izolaci ( nebo frakce extenderů) se označuje „iniciální extender“, aby se odlišil od „finálního extenderů“, užívaného k extenzi isolovaných spermií před mražením. Jestliže vzorek vybraných spermií byl vybraný pomocí FACS, iniciální extender může být vyrovnán do tekutiny pouzdra, užívaného pro rozdělování. Příkladové vyrovnávací tekutiny pouzdra a extendery jsou popsány detailně v příkladu 4.

Extender vhodný pro užití pro vzorek vybraných spermií obsahuje fyziologicky přijatelný nosič. Fyziologicky přijatelný nosič je typicky vodní a v preferovaných aplikacích obsahuje deionisovanou vodu. Vhodný extender často obsahuje jednu nebo více z následujících komponent: kryoprotektant, komponentu, která udržuje osmolalitu a vyrovnává pH, anorganickou substanci, která předchází chladovému šoku a uchovává fertilitu spermií, detergent, která působí synergicky s jistými • » « « organickými substancemi tak, aby zvýšil ochranu spermií, zdroj energie, který může spermie využívat, antioxidant, který chrání spermii před chladovým šokem, substanci, která umocňuje kapacitami spermií a jedno nebo více antibiotik.

Ačkoliv kryoprotektant, vhodné pro tento vynález nejsou omezeny pouze na ty, které účinkují určitým mechanismem, nejobvyklejší kryoprotektant účinkují aspoň t části, omezením intracelulární dehydratace. Přesněji, zmražení je doprovázeno vzestupem koncentrace roztoku v okolí spermie. Tento vzestup koncentrace roztoku táhne vodu z buněk, což zvyšuje intracelulární elektrolytovou koncentraci. Příkladné kryoprotektant obsahují glycerol, dymetyl sulfoxid, propylénglykol a podobně. Kryoprotektant vhodný pro užití v daném extenderu se může lišit v závislosti na druhu, od kterého jsou spermie získávány. Například, glycerol je vhodný pro užití kryopreservace lidských a hovězích spermií, ale obvykle se neužívá pro kryopreservaci vepřového a králičího spermatu. Tyto preference jsou dobře známé pro mnoho komerčně hodnotných spermií a lze je snadno určit empiricky pro další typy spermií.

Extender, vhodný pro tento vynález obsahuje jednu nebo více komponent, které pomáhají udržovat osmolalitu a zajišťují nárazníkovou kapacitu. V preferovaných uvedeních tohoto vynálezu, osmolalita extenderu je přibližně stejná, jako osmolalita fyziologické tekutiny. Upřednostňuje se osmolalita extenderu v rozmezí okolo 280mOsm až do 300 mOsm. Hodnota pH je také přednostně ve fyziologicky přijatelném rozmezí, nejlépe v rozmezí mezi 6,5 až 7,5.

Látky, které pomáhají udržovat osmolalitu a pH v tomto rozmezí, jsou dobře známé a mohou být přidávány k extenderu v tuhém skupenství nebo již jako roztok. Nárazníkové systémy obsahující soli, jako karbohydrát, nebo kombinaci z nich, mohou být tedy z těchto důvodů používány. Zvláštní příklady zahrnují citrát sodný, tri(hydroxymetyl)aminometan, a TES ( N-tris(hydroxymetyl)metyl-2aminometansulfonovou kyselinu) a pufry glutamátu sodného; mléko; HEPESpufrovací medium; a jakékoliv jejich kombinace. Komponenty, užívané k tomu, aby pomohly udržet osmolalitu a zajistily pufrovací kapacitu se mohou v určité aplikaci lišit v závislosti na dalších komponentách extenderu a v některých

• 9 ♦ 9 9

9

9 9

9 9

9999 * 9 • ·«♦

9 9

9 9

999 případech na druhu, od kterého jsou spermie odebrány. Výběr těchto komponent pro užití v prezentovaném vynálezu je však na úrovni dovedností v oboru.

Jedna nebo více organických látek , které ochraňují spermie před chladovým šokem a pomáhají zachovat fertilizační kapacitu, mohou být také zahrnuty v extenderu. Takové substance jsou dobře známé a někdy se také označují jako „nepronikající kryoprotektant“. Je-li znalost oboru, je snadné určit organickou látku, vhodnou pro zvláštní provádění kryopreservační metody, která je popsána zde. Například organické substance, která obsahuje protektivní součásti (například lipoproteiny, fosfolipidy, lecitin), o kterých se domníváme, že snižují dopad chladového šoku a dilučního efektu, mohou být přidány do extenderu.vhodná organická substance obsahuje disacharidy, trisacharidy a nějaké jejich kombinace. Příkladné organické substance zahrnují vaječný žloutek, výtažek z vaječného žloutku, mléko, mléčný extrakt, kasein, albumin, lecitin, cholesterol, a nějakou jejich kombinaci.

Extender může také obsahovat detergent. Uvádí se, že alkylové ionické detergenty, jako je dodekylsulfát sodný (SDS), účinkují souhlasně s vaječným žloutkem a zvyšují ochranu proti chladovému šoku. Další detergenty vhodné pro kryopreservaci mohou být také užívány v extenderu a výběr zvláštního detergentu pro specifické uplatnění závisí na stupni dovedností s zřetelem k návodu, uvedenému zde. Viz Příklad 5.

Je upřednostněno, aby extender obsahoval zdroje energie, které spermie mohou snadno využívat. Při nepřítomnosti energetických zdrojů mohou spermie utilizovat intracelulární fosfolipidy a další látky. Přidání energetického zdroje do extenderu tedy ochrání intracelulární rezervy a buněčné komponenty. Jak je dobře známo, cukry, především monosacharidy, poskytují vhodný zdroj energie, přestože další konvenční zdroje energie se mohou použít v extenderu. Příkladné monosacharidy vhodné k užití v extenderu zahrnují glukózu, fruktózu a/nebo manózu.

V extenderu může být zahrnuto jeden nebo více antioxydantů, aby zabezpečily další ochranu proti chladovému šoku. Příkladné antioxydanty zahrnují butylovaný hydroxytoluen (BTH), jeho deriváty, a podobně. Užitečné mohou být však ještě ·* ♦ · • «·« * · • · · • · · ·» *·· • ·· • ♦ • » ♦

··♦· další antioxydanty, které jsou umístěny vextenderu, a výběr příslušného antioxydantu pro specifické užití závisí na znalosti v oboru, s přihlédnutím k doporučení uvedenému zde.

Extender může také obsahovat látky, které usnadňují kapacitami spermií. Je známá řada facilitátorů kapacitace a každý může být použit v extenderu. Příklady zahrnují enzymy jako je alfa amyláza, beta amyláza, beta glukuronidáza, které mohou být užity i v kombinaci, pokud je to žádoucí.

Konečně extender přednostně obsahuje antibiotika, protože bakteriální růst může podstatně porušit životaschopnost spermií a zvýšit riziko infekce hostitele při arteficielní inseminaci nebo in vitro fertilizační proceduře. Jakékoliv z antibiotik, která jsou vhodná pro použití v kryopreservaci buněk , může být také užito v extenderu. Výběr vhodného antibiotika závisí na druhu, od kterého jsou spermie získány, proceduře získání a na zacházení se vzorkem spermií a na specifickém mikroorganismu, který má být zasažen. Příkladné antibiotika zahrnují tylozin, gentamycin, linkomycin, spektinomycin, linko-spektin (kombinace linkomycinu a spektinomycinu), penicilín, streptomycin a tikarcilin, které se mohou použít samostatně nebo v kombinaci. Samozřejmě, znalec v oboru může snadno určit další antibiotika vhodná k použití v extenderu.

Příkladné extendery jsou diskutovány ve větších detailech níže a v příkladech provedení.

Koncentrace spermií je typicky nižší ve vzorku vybraných spermií než ve zdrojovém vzorku a jak bylo označeno výše, pokud užíváme FACS, zředění je významné. Typické rozdělení založené na typu pohlaví spermií může vyrobit vzorky, které obsahují spermie v koncentraci 6 x 10⁵ buněk/ml zachyceného pufru. Takové nízké koncentrace nejsou vhodné pro skladování (alespoň ne pro většinu testovaných druhů), kryopreservační metoda vynálezu obecně koncentruje vzorky vybraných spermií.

Chlazení vzorku vybraných spermií •4 «««4 • 4 • 4·4 ·« *· ** • *4 · 4 »· 4 • * 44 4 4 4

4 444 4 4 44

444 44 ·4 4« ··♦·

Druhý krok v kryopreservační metodě zavádí chlazení vzorku selektovaných spermií, typicky, pokles teploty kontrolovanou rychlostí. Příliš rychlé chlazení může přivodit chladový šok, který může vyústit ve ztrátu integrity membrány a ztrátu funkce buňky. Závažnost účinku chladového šoku kolísá od druhu ke druhu a závisí na faktorech, jako je rychlost chlazení a teplotní rozmezí. Za vhodně kontrolovaných podmínkách chlazení jsou spermie schopné se adaptovat na termální efekt. Příklad 2, mezi jiným, popisuje podmínky pro chlazení hovězích spermií a určuje vhodné podmínky pro chlazení spermií dalších druhů v rámci znalostí v oboru.

V preferovaných aplikacích tohoto vynálezu je vzorek vybraných spermií ochlazen typicky z 22°Celsia na 5°Celsia, a chlazení probíhá po dobu od 60 minut do 24 hodin, lépe po dobu od 90 minut do asi 240 minut, a nejlépe po dobu od 90 minut do asi 120 minut. Chlazení může být provedeno jakoukoliv konvenční metodou, včetně jednoduchého umístění vzorku vybraných spermií do prostředí s teplotou 5°Celsia.

Izolace buněk spermií z vzorku vybraných spermií

Po iniciální extenzi vzorku vybraných spermií, jsou spermie izolované ze vzorku s použitím dostatečně jemné izolační metody, která zajišťuje návratnost spermií nejméně 50%, lépe od 75% do 90% a nejlépe od 80% do 90%. Během kroku izolace by zchlazené spermie měly zůstat v chladu, mezi asi 1 a zhruba 8°Celsia a nejlépe blízko mezi 4 a 5°Celsia.

Může být použita jakákoliv z různých metod, který je vhodná pro znovuzískání a izolaci spermií ze suspenze, včetně například filtrace, sedimentace a centrifugace. V příkladné preferované aplikaci se vzorek vybraných spermií rozdělí do 50 ml zkumavek v objemu, který nepřevyšuje 27 ml a lépe je mezi 20 a 27 ml. Centrifugace separování při 4°Celsia, pří 850 g po dobu 20 minut. Přednostně centrifugační krok zajišťuje nejméně od 50% do 90% návratnost spermií, lépe od 60% do 90% a nejlépe od 70% do 90%. Po izolaci je supernatant odstraněn a sediment je jemným vířením suspendován nebo opakovaně

0» 0000 00 0· ·0

0*0 0 0 0 0 0 0 · 0

00··· 00 00 00 0

0 0000 000 • 0 000 0· 00 0« 0·00 aspirován při 4°C. Koncentrace spermií je po té typicky určena (například pomocí hemacytometru).

Finální extenze izolovaných spermií

Po izolaci jsou spermie sebrány a extendovány s finálním extenderem na koncentraci vhodnou pro mražení. Preferovaná koncentrace spermií po finální extenzi a před mražením je v rozmezí 1x 10⁶/ ml až 300 χ 10⁶/ ml, lépe 10 χ 10⁶/ ml až 50 x 10⁶/ ml, a nejlépe 10 x 10⁶/ ml až 20 χ 10⁶/ ml.

Výše uvedený popis iniciálního extenderu lze také aplikovat na finální extender, který může být stejný nebo odlišný od iniciálního extenderu. V zvláštním uvedení, složení vzorku spermií s finálním extenderem se v podstatě podobné ( pokud ne dokonce stejné) jako složení vzorku spermií po přidání iniciálního extenderu.

V upřednostňovaném vyjádření vynálezu se používá extender vaječný žloutekTris. Po přidání extenderu obsahuje suspenze spermií glycerol ( kryoprotektant); kyselinu citrónovou a tri(hydroxymetyl)aminometan (pufr); vaječný žloutek (organická substance); fruktózu (energetický zdroj); tylozin, gentamycin a linkospektin (antibiotika). Typické přibližné koncentrace po podání finálního extenderu k izolovaným spermií jsou:

Komponenty extenderu vaječný žloutek - Tris

Glycerol

Kyselina citrónová tri(hydroxymetyl)aminometan vaječný žloutek fruktóza tylozin gentamycin linko-spektin

4- 8% (objemových)

55-75 mM 190-210 mM

5- 25% (objemových) 45-65 mM

25-100 ug/ml 200-300 ug/ml 100-400 ug/ml* *100-400 ug/ml linkomycin a 100-400 ug/ml spektomycin

0* 0000

0 • ··· «0 ·0 • 0 ·

00 0 0 · 0 0 0 0· 0 0 0 «0 0 0000 000 00 000 00 00 0* 0000

Koncentrace těchto komponent po dodáni finálního extenderu k izolovaným spermiím je v obměnách tohoto uvedení okolo 6% ( objemových) glycerolu, okolo 65 mM kyseliny citrónové, okolo 200 mM tri(hydroxymetyl)aminometanu, okolo 20% ( objemových vaječného žloutku, okolo 56 mM fruktózy, okolo 50ug/ml tylozinu, okolo 250 ug/ml gentamycinu a okolo 150/300ug/ml linko-spektin (to je 150 ug/ml linkomycinu a 300 ug/ml spektomycin) v deionizované vodě.

V alternativním uvedení je užíván extender vaječný žloutek - citrát. Po přidání extenderu obsahuje suspenze spermií glycerol ( kryoprotektant); citrát sodný (pufr); vaječný žloutek (organická substance); tylozin, gentamycin a linko-spektin (antibiotika). Typické přibližné koncentrace po podání finálního extenderu k izolovaným spermií jsou:

Komponenty extenderu vaječný žloutek - citrát

Glycerol Citrát sodný vaječný žloutek tylozin gentamycin linko-spektin

4- 8% (objemových)

60-80 mM

5- 25% (objemových)

25-100 ug/ml 200-300 ug/ml 100-400 ug/ml*

Ί 00-400 ug/ml linkomycin a 100-400 ug/ml spektomycin

Příkladové upřednostňované koncentrace pro mražení hovězích spermií jsou okolo 7% ( objemových) glycerolu, okolo 72 mM citrátu sodného, okolo 20% ( objemových) vaječného žloutku, okolo 50ug/ml tylozinu, okolo 250 ug/mí gentamycinu a okolo 250/300ug/ml linko-spektinu.

V alternativním uvedení je užíván extender vaječný žloutek - TES-Tris (EY Test). Po přidání extenderu obsahuje suspenze spermií glycerol ( kryoprotektant); vaječný žloutek a ohřáté mléko, například homogenizované mléko obsahující 1,25% fruktózy s 10% glycerolu (organická substance); tylozin, gentamycin a linko-spektin (antibiotika). Typické přibližné koncentrace po podání finálního extenderu k izolovaným spermií jsou:

• 4 ·· «·Μ · 4*44 ·» 4» • 4 4 » • * *♦ • 4 4 4 4 •44 4« 44

4 4

Komponenty extenderu vaječný žloutek - TES - Tris

Glycerol 3-7% (objemových)

Tris(hydroxymetyl-metyl) aminoetanová kyselina 140-170mM tri(hydroxymetyl)aminometan 60-80 mM vaječný žloutek 5-25% (objemových) fruktóza 45-65 mM tylozin 50-150 ug/ml gentamycin 400-600 ug/ml linko-spektin 200-700 ug/ml* *200-700 ug/ml linkomycin a 200-700 ug/ml spektomycin

Příkladové upřednostňované koncentrace pro mražení hovězích spermií jsou okolo 5% (objemových) glycerolu, okolo 158 mM Tris(hydroxymetyl-metyl) aminoetanové kyseliny, okolo 72 mM tri(hydroxymetyl)aminometanu, okolo 20% ( objemových) vaječného žloutku, okolo 8mM fruktózy, okolo 100 ug/ml tylozinu, okolo 500 ug/ml gentamycinu a okolo 300/600ug/ml linko-spektinu.

V zatím dalším alternativním provedení je užíván mléčný extender. Po přidání extenderu obsahuje suspenze spermií glycerol ( kryoprotektant); ohřáté mléko, homogenizované mléko (organická substance); tylozin, gentamycin a linkospektin (antibiotika). Typické přibližné koncentrace těchto komponent po podání finálního extenderu k izolovaným spermií jsou:

Komponenty mléčného extenderu

Homogenizované mléko

Glycerol

Fruktóza

Tylozin gentamycin linko-spektin

90% (objemových)

3-7% (objemových) 1,25%(váhových) ug/ml

250 ug/ml

250-300 ug/ml* *250-300 ug/ml linkomycin a 250-300 ug/ml spektomycin

0090 0 0 0 009 • 0 • 0 • 0 · »0 »0 0 0 0 * 4 0 * 0 0 0 00 00 »0 00 • 0 9 0 « 0 0

0 0

0 ·00·

Příkladové upřednostňované koncentrace pro mražení hovězích spermií jsou okolo 90%mléka, okolo 10% (objemových) glycerolu, okolo 1,25% fruktózy (váhových?) okolo 50 ug/ml tylozinu, okolo 250 ug/ml gentamycinu a okolo 250/300 ug/ml linko-spektinu.

Jako finální extender pro mražení vybraných spermií se mohou standardně užít ještě další extendery. Byla popsána řada extenderů, které jsou optimální pro mražení spermií od různých druhů a mnohé jsou komerčně dostupné. Mrazicí extendery pro koňské spermie typicky obsahují mléko, vaječný žloutek, různé cukry, elektrolyty a kryoprotektant. Příkladové mrazicí extendery jsou popsány v práci Squirese EL et al, Cooled and frozen Stallion Semen Animaí Reprod. And Biotechnology Laboratory, Bulletin No 69, Chapter 8, „Seminal Extenders“, pp 4951 (July 1999).

Ekvilibrace a mražení spermií

Extenze vzorku spermií vyrobí suspenzi spermií, která je po té přenesena do kontejnerů určených pro mražení. Je-li zamýšleno, že spermie budou použity pro fertilizaci, pak jsou buňky s výhodou rozděleny do jednotlivých individuální dávek, které budou postačující k dosažení fertilizace. Požadovaná dávka může podstatně kolísat druh od druhu a je dobře známá ( například pro dobytek nebo pro koně) nebo může být snadno určena. V případě hovězích spermií, vybraných na základě pohlaví, vhodná dávka kolísá v rozmezí od 1x10® do 3x10⁶ spermií.

Vhodný zásobník se může použít pro mražení zahrnuje například ampule, brčka. Spermie, které jsou zamýšlené pro použití pro Al jsou typicky zmrazovány v brčcích ( například 0,25ml nebo 0,50 ml brčka), které jsou upraveny pro inseminační pistoli. Upřednostňovaná úprava je tato: bolus extenderů je natažen do brčka, a následuje postupně vzduch, spermie, vzduch a extender, tak, že spermie jsou chráněny na obou stranách vzduchem, který je odděluje na obou stranách brčka od bolusu extenderů.

*4 4444 44 »·» *4 44 • 44 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 444 4 4 4« 4 4 4

4 *44 44 444 4 4

4 4444 444

4« »44 44 44 44 *444

Je obvykle dovoleno spermie před mrazením ustálit na 5°Celsia. Přednostně se dovoluje ustálit spermie na dobu v rozmezí mezi 1 hodinou a 18 hodinami, lépe mezi 3 hodinami a 18 hodinami, nejlépe mezi 3 hodinami a 6 hodinami (viz Příklad 2).

Ustálení následuje nějaká standardní zmrazovací metoda, která zajišťuje, že zmrazování nebude probíhat příliš rychle (například nebude přesahovat asi 0,5°Celsia/minutu). Upřednostňovaná je rychlost zmrazování okolo 0,5°C/minutu. V příkladném upřednostňovaném provedení jsou spermie umístěny do statické tekuté dusíkaté páry a mrazení se provádí ve třech oddělených fázích při periodě asi 10 minut. V první fázi zmrazování jsou spermie ochlazeny asi z 5°C na -15°C rychlostí od 4Q°C/minutu do 60°C/minutu. Ve druhé fází mrazení jsou spermie chlazeny asi z - 15°C na -60°C rychlostí od 25°C/minutu do 35°C/minutu. Ve třetí fázi jsou spermie ponořeny do tekutého dusíku při asi -100°C.

Vzorky vybraných spermií

Vynález zajišťuje v dodatku k mrazicím metodách zmražený vzorek spermií, včetně výběru spermií ze zdrojového vzorku podle určitých vlastností. Spermie mohou být od jakéhokoliv druhu, včetně těch, které byly diskutovány výše s referencemi k mrazicí metodě. Vynález zahrnuje mrazené vzorky spermií, vybrané podle nějaké charakteristiky jakoukoliv vhodnou metodou, jako jsou tyto popsané výše. Upřednostňované popisy zahrnují zmrazené vybrané lidské, bovinní, koňské, vepřové, ovčí, losí nebo bizoní spermie. Výběr na základě pohlaví je přednostně prováděn s užitím průtokové cytometrie, jak bylo obecně popsáno výše.

Předmětem vynálezu je také zásobník, který obsahuje zmrazené vzorky spermií podle tohoto vynálezu. Zásobník může být vyroben z jakéhokoliv materiálu, který nereaguje s zmrazenými vzorky spermií a může být jakéhokoliv tvaru nebo jiné vlastnosti, která usnadňuje užití vzorku pro zamýšlenou aplikaci. Například pro vzorky, které jsou zamýšleny k použití pro IA je kontejner s výhodou brčko ( například 0,25 ml nebo 0,5 ml brčko), které je upravené pro použití s inseminační pistolí. Zásobník je zapečetěn jakýmkoliv způsobem, který je vhodný pro

9999

9 9

9 999

9 9

999 • · · φ 9 9 9 ·* 99 *9 9999 zachování vzorků v zamýšlené skladovací teplotě, která je typicky pod -80°Celsia. Brčka o obsahu 0,25 ml mohou být zapečetěna například ultrasonograficky, PVC prachem, nebo zátkami z bavlny a polyvinylu a/nebo nerezovými ocelovými kuličkami (BB).

Protože zmrazené vzorky popsané v tomto vynálezu jsou typicky rozmraženy před použití, vynález také zahrnuje rozmrazování předtím zmrazených vzorků vybraných spermií a zásobníku, který zahrnuje rozmrazovací vzorek.

Metoda použití vzorku vybraných spermií

Zmrazený vzorek vybraných spermií podle tohoto vynálezu je vhodný pro použití v jakékoliv metodě, kde jsou využívány spermie. Vzorek může být rozmražen a použit k jakékoliv konvenční fertilizační metodě, jako je arteficieiní inseminace nebo in vitro fertilizace. Rozmrazování se provádí stejným způsobem, jako pro zmrazené neselektované spermie. Krátce, brčko, které obsahuje zmrazený vzorek spermií se ponoří do vodní lázně o teplotě asi 35°Celsia až 37°Celsia na dobu asi 20 až 30 sekund. Po tání se provede umístění semene (například inseminace) podle standardních postupů, které pečují o ochranu spermií před výkyvy okolního prostředí.

• · · · · · • · · ···· ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Účinek diluce na spermie

Cíl: určit účinek koncentrace spermií na pohyblivost spermií pro nezmražené a netříděné, ale vysoce naředěné spermie

A. Účinek diluce na neproprané spermie

1. Sebrání zdrojového vzorku. Spermie byly sebrány od býků podle rutinního sběrového protokolu s užitím arteficielní vagíny jak popisuje Schenk J.,Proc 17th NAAB, p. 48-58 (1998) a Saacke RG, Proč NAAB Tech Conf Al Reprod. 41:22-27 (1972). Všechny ejakuláty obvykle obsahují více než 50% vysoce pohyblivých a více než 75%morfologicky normálních spermií. K surovému ejakulátu byly přidány antibiotika jak popisuje Shin S., Proč NAAB Tech Conf Al Reprod. 11:33-38 (1986) během 15 minut po sběru a koncentrace spermií se určila s užitím spektrofotometrie.

2. Metoda. Spermie od 4 býku byly naředěny na 1,25, 2,5, 5, 10, 15 a 20 x 10^{2 * * * 6}/ml s využitím extenderu vaječný žloutek- citrát (EYC), který byl připraven z 20% vaječného žloutku (objemových) v 72mM citrátu sodném, 50Tg/ml tylozinu,

250 Tg/ml gentamycinu a 250/300 Tg/ml linko-spektinu. Každý vzorek byl připraven zdvojeně (2 zkumavky/zředění/býk) a obsahovaly 8 ml celkového objemu na zkumavku. Všechny vzorky byly inkubovány po dobu 60 minut při 22 °Celsia, po té byly centrifugovány a použitím centrifugy (Eppendorf, Model # 5810R) při 600x g po dobulO minut, aby došlo ke koncentraci spermií. Po centrifugaci se z jedné sady duplikátu neodstranil supernatant; spermie byly resuspendována ve stejném médiu a na původní koncentraci opakovanou jemnou aspirací 5-ml sérologickou pipetou. (Druhá sada duplikátu zkumavek se použila v příkladu 1B.) Vzorky spermií se po té ochladily na 5°Celsia během 90 minut rychlostí 0,2°Celsia/minutu. Tyto spermie byly označeny jako neproprané • · spermie. Všechny vzorky se inkubovaly při 5°Celsia po dobu 24-48 hodin po sběru.

3. Posouzení motility. Po inkubaci před tím, než se posuzovala pohyblivost, se vzorky zahřály na 37°celsia s použitím suchého blokového inkubátoru na 10 minut. Pro tento pokus se určil pro každý vzorek jednoduchý, slepý odhad procenta rostoucí pohyblivosti spermií. Progresivní pohyblivost spermií se určovala subjektivně pro každou podtřídu jedním pozorovatelem (x200, fázový kontrastní mikroskop); další osoba připravovala mikroskopický nátěr randomizovaným způsobem, takže pozorovatel nebyl zpraven o ošetření.

4. Statistická analýza. Data byla zpracována analýzou rozptylu (SAS institute, Cary, North Carolina) s faktory býka a počátečním naředěním koncentrace. Oddělená analýza byla provedena pro každou dobu inkubace. Diluční trendy se testovaly s (log) lineárními kontrasty.

5. Výsledky. Data pro nepromyté spermie (tabulka 1) ověřily (log) lineární závislost (p < 0,01) pro oba inkubační časy. Procento pohyblivých spermií se zvyšovalo s rostoucí koncentrací spermií z 1,25 10^{5 6}/ml do 10 x 10⁶/ml, ale tady byl po té lehký rozdíl. Kubický termín byl signifikantní ( p < 0,05) pro 24 hodinovou a marginálně signifikantní ( p < 0,1) pro 48 hodinovou inkubaci. Byl přítomný efekt býka (p < 0,1) při obou časech.

• · » · ϊ :

• · · ·· · · · · · · · ·

Tabulka 1. Účinek chlazení na motilitu nepromytých spermií při ochlazení na 5°C

Inkubace v 5°C
Diluce (102 * * * 6/ml) 24 hodin3 48 hodinb
1,25	18c	0G
2,25	38c'd	gC?
5,0	56d	31d,e
10,0	6P	42e
15,0	55d	44e
20	58d	41e
S.E?	5,6	6,4

^a (log) lineární (p < 0,01) a kubické efekty (p < 0,05) ^b (log) lineární (p < 0,01) a kubické efekty (p < 0,1) ^c,d,e průměry se sloupci bez obecného nadpisu se liší (p < 0,05)

Nehyba průměru čtverce ANOVA + \'N (SAS institut, Cary, NC, USA)

B. Účinek diluce na proprané spermie

1. Sebrání zdrojového vzorku. Druhá sada z dvojice zkumavek, které obsahují vzorky přiopravené v příkladu 1A se použila pro tento experiment.

2. Metoda. Spermie byly zředěny, inkubovány a koncentrovány jako v příkladu 1A. Následovala centrifugace, aspirovalo se 7,1 ml supernatantu z každé zkumavky, odstranilo se většina seminální plasmy a zůstaly tak spermie v 900-ul peletách. Spermie se zředily s EYC (viz příklad 1A) aby se připravila suspenze spermií 10x10 ⁶/ml. Tyto vzorky byly zchlazeny na 5°C na dobu 90 minut jako v příkladu 1A.

• · • · · ·· ·· «· ·· • ·· · · ·· ·

3. Posouzení motility. Vzorky byly otepleny a posouzeny na rostoucí motilitu jako v příkladu 1A.

4. Statistická analýza. Data byla analyzována jako v příkladu 1A. Navíc, data v příkladu 1B. byla analyzována i pro inkubační koncentraci při 5°C.

5. Výsledky. Data pro promyté spermie nevykazovala žádný signifikantní efekt ošetření, pokud se hodnotily po 24 hodinách. Po době skladování 48 hodin při 5°C však byl přítomen efekt býka, počátečního zředění, inkubační koncentrace a býka podle inkubační koncentrace (p < 0,05). Více spermií zůstávalo pohyblivých, pokud se držely při 20 x 10^{5 6}/ml než 10 x 10⁶/ml (31% versus 20%, p < 0,05). Počáteční ředění 1,25, 2,5 a 5 x 10⁶ spermií/ml resultovalo v nižší progresivní pohyblivost než 10 x 10⁶/ml (p < 0,05)., s příslušným hlavním efektivním průměrem 19, 20, 27, a 37% motilních spermií.

·· ··· ·· ·· ·· ····

Tabulka 2. kumulativní účinek promytí, zředění, koncentrace a chlazení na progresivní motilitu spermií (%)

Koncentrace spermií(106/ ml) během 1 hod preinkubace při 37°C	Skladování při 5°C-koncentrace spermií a trvání skladování
24 hodin	48 hodin3
20 x 106/ml	10 x 106/ml	20 x 106/ml	10 x 106/mlb
1,25	45	49	24	15
2,5	51	40	29	11
5,0	54	54	32	21
10,0	51	50	40	34
15,0	60		41
20,0	55		40

^aKoncentrace 20 x 10⁶/ml je lepší (p < 0,05) než 10 x 10⁶/ml po 48 hodinách skladování.

Také iniciální zředění na 10 x 10⁶/ml je lepší než nižší ředění (p < 0,05).

Polované standardní chyby (Vchyba průměru čtverce ANOVA + byly 4,0 pro 24 hodin a 2,8 pro 48 hodin inkubace

Signifikantní (log) lineární trend (p < 0,06)

6. Závěr Vysoké zředění spermií a ochlazení vede k podstatnému snížení procenta pohyblivých spermií, nezávisle na přítomnosti nebo odstranění seminální plazmy. Tento diluční efekt je však více vyjádřen při koncentrování spermií na 10 x 10⁶/ml a dokonce více při koncentrování na 20 x 10⁶/ml před skladováním při 5°C. spermie od některých býků tolerují diluci lépe než spermie jiných býků; nalezené rozdíly v býcích jsou však typické. Extrémně zředěné spermie mohou být částečně znevýhodněny při skladování odstraněním protektivních sloučenin seminální plazmy.

» ft · · 4

F · • · ·· ♦ * * ♦

Příklad 2

Účinek ekvilibrační doby před zmrazením tříděných spermií

Cíl: ověřit účinek ekvilibrační doby ( 3, 6 a 18 hodin, 5°C) před zmrazením na průtokem tříděné spermie.

Následující experiment se celý opakuje a používá stejné býky.

1) Sebrání zdrojového vzorku. Spermie od 4 býků byly sebrány a připraveny jako v příkladu 1A.

2) Metoda.

a) Barvení a příprava pro třídění

i) Příprava barvení skladového roztoku: skladový roztok o 8,89mM Hoechst 33342 (bis-benzimid H-33342;# 190305, INC Biomedicals lnc.,Aurora.OH) se připraví v deionizované vodě.

ii) Procedura barvení spermií: spermie jsou zředěny v modifikované, TALP pufru (tabulka 3) na 400 χ 10⁶ spermií/ml. Následuje diluce a přidání Hoechst 33342 barviva do suspenze spermií v koncentraci 224 uM. Po té, co se přidá barvivo k suspenzi spermií, vzorek se inkubuje po dobu 60 minut při 34°C. Po inkubaci jsou spermie zředěny na 100 χ 10⁶ spermií/ml sTALP, který obsahuje 2,67% čištěného vaječného žloutku a 0,002% potravinového barviva (FD&C#40), které hasí fluorescenci Hoechst 33342 ve spermiích s kompromitovanou buněčnou membránou a dovoluje, aby byly vyřazeny během třídicího procesu. Těsně před průtokovým tříděním je vzorek filtrován gravitační jednotkou skrz 40 um nylonovou síťkový filtr, aby se odstranila tkáňová drť a nebo poškozené spermie.

b) Třídění. Dvoulinkový argonový laser, který pracuje v 351 a 364 nm a 150 mW se používá pro excitaci Hoechst 33342 barviva. Průtokový cytometr/buněčný třídič

9 9 99 9 φ · φφ φφ φφ

9 9 φφφφ Φφφφ

Φ Φ Φ ΦΦ ΦΦΦΦ φφ >

·· «φφφφφφφφφ

Z.V ΦΦ φ φφφφ φφφ

9 99 9 φφ φφ φφ φφφφ

SX MoFlo®(Cytomation, Inc, Fort Collins, CO, USA), který pracuje na 50 psi. Tekutina založená na Tris se používá, a je složená z Tri (hydroxymetyl)aminometan monohydrátu (Tris; 197,OmM; #C-7129, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA), monohydrát kyseliny citrónové (55,4mM #C7129,Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) a fruktóza (47,5 mM #C7129,Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA). Do tekutiny založené na Tris se také přidávají základní antibiotika, 0,58g/l penicilinu a 0,05 g/l sulfátu streptomycinu. Spermie se dělí procesem, který se označuje jako objemné třídění, který dovoluje rychlé nahromadění velkého množství spermií, takže široká škála příkladů může být provedena v rozumném čase. Spermie prochází průtokovým cytometrem za standardních pracovních podmínek s tím rozdílem, že všechny kapky, které obsahují životaschopné spermie se seberou do jedné zkumavky spíše než aby byly rozděleny do 2 zkumavek podle specifické vlastnosti ( například dělení podle typu pohlaví). Spermie jsou rozděleny na základě životaschopnosti; přesněji, spermie, které mají poškozenou plazmatickou membránu jsou vyloučeny během procesu objemového třídění. Barvené spermie se udržují v teplotě 22 +_1°C během třídění. Objemově roztříděné spermie se seberou do plastikových 50 ml zkumavek, které obsahují 2 ml 20% vaječný žloutek-Tris extenderů, který je připravený z 20 % vaječného žloutku (objemové) v 200 mM Tris, 65mM kyseliny citrónové, 56 mM fruktózy, 50 Tg/ml tylozinu, 250Tg/ml gentamycinu a 150/300 Tg/ml linko-spektinu v deionizované vodě. Vaječný žloutek-Tris extender se označuje jako Tris-A frakce aby se vyznačilo chybění glycerolu na tomto bodě procedury. Spermie se seberou do zkumavek tak, aby obsahovaly 12 ml a přibližně 6 χ 10⁶ spermií. Spermie se následně inkubují pří 22 °C po dobu 1 až 3 hodin, aby se napodobily podmínky třídění na základě typu pohlaví.

c) Příprava pro zmražení. Po inkubaci následuje ochlazení roztříděných spermií na 5°C po dobu 70 minut. Po ochlazení jsou dvě zkumavky umístěny do mrazicí otočné centrifugy nastavené na 5°C a zkumavky se centrifugují při 850g po dobu 20 minut Pak se odstraní supernatant a proces pokračuje po přidání 150ul frakce A extenderů Tris kaši 150ul peletám spermií při 5°C tak, aby se vytvořila koncentrace spermií asi 40 χ 10⁶. Spermie od individuálních býků se seberou a okamžitě zředí s stejným množstvím extenderů vaječný žloutek- Tris, který

9999

9

9 99

9 9999 999

999 99 99 99 9999 obsahuje 12% (objemových glycerolu („Tris B frakce“). Tato Tris B frakce se přidá k suspenzi spermií jako 2 stejné objemy v 15 minutových intervalech tak, aby se ustavila výsledná koncentrace spermií 20 x 10^{5 6}. Konečná koncentrace glycerolu kompletního extenderu vaječný žloutek- Tris, který obsahuje spermie je 6% (objemových).

d) Ekvilibrace a mražení. Extendované spermie se po té balí do 0,25 ml brček, které jsou z polyvinylchloridu, aby byly zmraženy rutinním postupem na mřížkách v statické tekuté dusíkaté páře. Brčka od každého ze 4 býků byl zamrazeny po 3, 6 a 18 hodinách celkového ekvilibračního času při 5°C.

3) Ověření pohyblivosti po roztátí. Brčka jsou podrobena tání ve vodní lázni při 37°C. slepý odhad progresivní motility se provádí po inkubaci vzorků při 37°C po dobu 0, 1 a 2 hodin po tání. Každá z 2 pozorovatelů odhaduje progresivní motilitu spermií z každé ze dvou brček se spermiemi. Tyto čtyři zaslepení pro každou experimentální jednotku představují podvzorkování.

4) Statistická analýza. Statisticky byly vzorky analyzovány jako střední hodnota plot nejmenších kvadrátů ANOVA aby se analyzoval efekt nějakého pozorovatele a pozorovatele x interakce léčby. N se vztahuje k počtu experimentálních jednotek, ne podvzorků; standardní chyba se počítala na základě průměrů 4 podvzorků z chyby čtverce průměru ANOVAs a počtu experimentálních jednotek; nejmenší kvadráty průměrů se presentovaly. Efekt ošetření se ověřoval odděleně ANOVAs pro každý inkubační čas. Model zahrnoval býky jako randomizační efekt a ekvilibrační čas a pozorovatele jako dané efekty; subplot byl konsistentní s termínem pozorovatel a vztažené interakce.

5) Výsledky. 3 nebo 6 hodinová ekvilibrační metoda byla lepší než 18 hodin (tabulka 4), na základě procenta progresivně pohyblivých spermií pro 0 a 1 hodinu (p < 0,01) ale ne pro 2 hodiny inkubace po tání. Účinky býka byly jasné pro 1 a 2 hodiny inkubačního času (p < 0,05), ale ne pro čas 0. Nebyla zde žádná signifikantní (p > 0,1) interakce býka s časem ekvilibrace ani zde nebyl přítomný signifikantní efekt pozorovatele pro kteroukoliv odpověď.

·♦ ··· · • 9

999

9» 9 «· ·· ·· • · · 9 · 9 9

9 99 9 ·

9 «999 99

99» 99 ·9 99

Tabulka 3. Modifikovaný TALP pufr

Ingredience	Koncentrace
Na Cl	95,0 mM
KCI	3,0mM
NaHPO4	0,3mM
NaHCO3	10,0mM
MgCL2.6 H20	0,4mM
Na Pyruvát	2,0mM
Glukóza	5,0mM
Na Laktát	25,0mM
HEPESa	40,0mM
Bovinní sérový albuminb	3,0mg/ml
Gentamycin sulfát	30,0ug/ml

^a#H3375, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA ^b#US70195, Frakce V; Amersham/Life Scinece, Cleveland OH, USA

Tabulka 4. Efekt předmrazicího ekvilibračního času na progresivní motilitu po tání

Ekvilibrace při 5°C	Inkubace v 37°C po tání
0 hod	1 hod	2 hod
3 hod	41a	36a,b	16
6 hod	41a	37a	18
18 hod	35 b	ŠP	12
S.E.c	1,5	0,8	2,0

^{a b} Nad sloupky znamenají bez obecného nadpisu Tukey HSD ^cPůlovaná standardní chyba

Vchyba průměru čtverce ANOVA + VN • » · ·· · • ·

4 44

4« 44 44 44

4··· 4 > · 4

44·· 44 4

4 444 44 444 4 ·

4 4444 444 • 4 444 44 44 4· 4444

6) Závěr. Výsledky neukazují žádný rozdíl v motilitě spermií po tání při ekvilibračním čase 3 a 6 hodin a teplotě 5°C, ale je zde patrný významný pokles motility spermií po 18 hodinách ekvilibrace při 5°C před mražením. 3 a 6 hodinové rozmezí dovoluje sběr 2 po sobě následujících 3 hodinových roztřiďovacích sérií pro mražení spermií bez poklesu motility po tání.

Protože interakce býka a ekvilibračního času není signifikantní, 3 a 6 ti hodinová ekvilibrace je adekvátní s tím, že se užívají pouze 4 býci. Optimální ekvilibrační čas pro menšinu býků se odhaduje na více než 6 hodin.

·· · 4·« ♦ » ♦ 444 ·» »4 ·· 4« « *4 * · 9« 4

4 44 4 4 4 • · 4 *444 * · ·

4« 4*4 «4 44 4« *444

Příklad 3

Účinek koncentrace barviva a síly laseru na vybrané spermie

Cíl: ověření účinku koncentrace barviva Hoechst 33342 v kombinaci s intenzitou laseru na průtokem vybrané spermie.

1) Sběr zdrojového vzorku. Seberou se spermie od 6 býků a připraví se stejně, jak je popsáno v příkladu 1 A.

2) Metoda.

a) Design experimentu. Jeden ejakulát (2 býci) a 2 ejakuláty z různých dnů (4 býci) se užijí v designu 2 a 2 plus kontrola

b) Barvení a výběr. Barvení, příprava pro třídění, třídění spermií se provádí podle popisu v příkladu 2, s výjimkou toho, že barvivo Hoechst 33342 se přidávalo ke suspenzi spermií v konečné koncentraci 149 TM nebo 224 TM; a spermie byly ve velkém roztříděny pomocí laseru, který pracoval na 100 mW nebo 150 mW incidence síly. Ve velkém roztříděné spermie se sebraly do 50 ml plastikových zkumavek jak je popisováno v příkladu 2. 4 zkumavky, které obsahovaly přibližně celkově 15 χ 10⁶ spermií se od každého býka sebrali během 1 hodiny. Roztříděné spermie se inkubovaly 1 hodinu při 22°C, aby se napodobil delší čas třídění.

c) Příprava pro mražení. Po inkubaci následovalo chlazení spermií jako v příkladě 2. Spermie se koncentrovaly centrifugaci při 850 x g po dobu 20 minut. Pak se odstraní supernatant a proces pokračuje po přidání 150ul frakce A extenderu Tris k asi 150ul peletám spermií při 5°C . Všechny pelety se spermiemi se suspendují jemně opakovaně prováděnou reaspirací a spermie od individuálních býků se sebraly. Tris- B frakce extenderu se přidala po krocích jak je popsáno v příkladu 2. nebarvené, netříděné kontroly pro každého býka se připravily v Tris extenderu, který obsahoval 6% glycerol v koncentraci 20x 10⁶ a byly chlazeny na 5;C, dokud nebyly připraveny ve velkém tříděné spermie.

d) Ekvilibrace a mražení. Kontroly a tříděné spermie byly zabaleny do 0;25mt polyvinylchloridových brček jak je popsáno v příkladu 2, ekvilibrovány na 5°C po dobu 3 hodin a po té konvenčně zmraženy.

*© φφφφ ·

• φφ© ·* ·* • © 9

9 9 9 9

9 9-9 9 9 9

9 9 · 9 9 9 *«» Φ * » Φ · ΦΦΦ© ··<

ΦΦ ΦΦΦ ·· Φ© ·© ©ΦΦΦ

3) Posouzení motility po roztátí. Brčka byla rozmražena a obsah kontrolován jak je popsáno v příkladu 2.

4) Statistická analýza. Obecný popis statistické analýzy byl dán v příkladu 2. Specificky se sledoval efekt ošetření pomocí ANOVA. Tento model zahrnoval koncentraci barviva, intenzitu laseru a býka, jako hlavní parametry, pozorovatele a vztažené interakce jako vedlejší. Býci byli považováni jako randomizační efekt a další faktory jako fixní.

5) Výsledky. Efekty býka byly signifikantní pro procento progresivně pohyblivých spermií okamžitě po tání (p < 0,1) a hodinu a 2 hodiny po inkubaci při 37°C (p < 0,05). Nebyl přítomen žádný efekt koncentrace barviva nebo býka podle koncentrace barviva na motilitu spermií v jakémkoliv inkubačním čase. S býky, kteří byly zvažování jako randomizační efekt, 150 mW laserové energie resultovalo v nižší motilitu spermií po tání než 100 mW (p < 0,05) ve všech třech inkubačních časech. Byl přítomen efekt býka podle laserové energie ((p < 0,05) na motilitu spermií v první ,ale ne druhé a třetí hodině. Také vysoká energie laseru vedla k motilitě spermií než u kontrol (p < 0,05) v 0 a 1 hodině inkubace (tabulka 5). Byl signifikantní efekt pozorovatele v první hodině inkubace, ale ne ve druhé (p >0,1).

* 9999 • ··· «9

9 9

9999

Tabulka 5. Účinek intenzity laseru a koncentrace barviva na motilitu spermií po tání (%)

Průměr hlavního Účinku	Inkubace při 37°C
0 h	1 h	2h
Kontrola	49	44	33
Koncentrace barviva
149 uM	41	39	30
224 uM	42	39	30
Intenzita laseru
100 mW	46	42	33
150 mW	38a	35 b	27
S.E.c	2,2	1,2	1,3

^a Signifikantní hlavní účinek (p < 0,1) a rozdíl od kontrol (p < 0,05) ^b Rozdíl od kontrol (p < 0,05).

^c Půlovaná standardní chyba \'chyba průměru čtverce ANOVA + vN

6) Závěty. Procento progresivní motility spermií po tání je porušeno barvením a procesem třídění. Vyšší intenzita laseru je více devastující než intenzita nižší. Nebyl pozorován žádný efekt koncentrace barviva na pohyblivost spermií po tání. Tedy, excitace spermií pomocí vazby barviva Hoechst 33342 při nižších laserových intenzitách je méně devastující a to barvení spermií při vyšších koncentracích barviva nemá žádný zničující účinek na motilitu spermií po tání. Pozorované poškození bylo zřejmě hlavně v oblasti pohybové ústrojí spermií.

Příklad 4

Zhodnocení procedury před tříděním a barvením a výběru extenderu pro kryopreservaci spermií

Cíl: (1)ověření účinku tří ošetření spermií před tříděním a (2) ověřit kombinace tekutiny pouzdra a extenderu pro kryopreservaci průtokem tříděných spermií

1) Sběr zdrojového vzorku. Seberou se spermie od 4 býků a připraví se stejně, jak je popsáno v příkladu 1A.

2) Metoda.

a) Design experimentu. Byl uspořádán 3(ošetření před tříděním) podle 3 ( extendery) podle 2 (tekutina pouzdra) podle 4 (býci) podle 2 (pozorovatel) faktoriální experiment k určení nejlepší procedury k zacházení se spermiemi před tříděním a k ověření tří extenderu pro kryopreservaci vybraných spermií.

b) Barvení a příprava vzorků. Čerstvě sebrané spermie od 4 býků byly ošetřeny následujícím způsobem:

(1) Zředěny na 400 x 10⁶/ml v modifikovaném TALP (viz příklad 2, tabulka

3) a barveny po dobu 1 hodiny při 34°C před objemovým tříděním („zředění - 0 h“);

(2) Inkubovány k vyrovnání při 22°C po dobu 3 hodin před dilucí, obarveny a roztříděny („úprava - 3 h“); nebo (3) Rozředěny a barveny jako „zředění - 0 h“ a po té inkubovány při 22°C po dobu 3 hodin před objemovým tříděním („zředění - 3 h“)

c) Extendery. Srovnávaly se následující mrazicí extendery: EYC (viz příklad 1), který obsahuje 7% glycerolu, vaječný žloutek-Tris (viz příklad 2), který obsahuje 6%glycerolu, a vaječná žloutek-TES-Tris (TEST), který obsahuje 5% glycerolu. EYC „frakce A“ se vztahovala k EYC extenderu, který neobsahoval žádný glycerol a EYC „frakce B“ se vztahovala EYC k extenderu, který obsahoval dvojnásobek finální, žádané koncentrace glycerolu (například 14%). Tedy, pokud se zkombinovala frakce EYC A a EYC B ve stejném poměru, finální EYC exténder obsahoval 7% glycerolu. Tris A a B frakce se označují stejně, jak je popsáno ·· ·· • · · · • · v příkladu 2. TEST extender se připraví jako kompletní extender, který obsahuje 5% glycerolů; tedy není žádná A a B frakce extenderu TEST.

d) Tekutina pouzdra. Tekutina pouzdra byla buďto 98,6 mM dihydrát citrátu sodného (#S279-3, Fisher Scientific, Fair Lawn NJ) nebo tris, jak je popsán v přikladu 2. Oba typy Tekutiny pouzdra byly adjustovány na pH 6,8; osmolalita byla okolo 270 - 280 mOsm/kg. Tris se používal k sebrání spermií, které byly dále umístěny do extenderu vaječný žloutek -Tris a zmrazovacím extenderu TEST. Tekutina pouzdra, která obsahovala 6,8mM dihydrát citrátu sodného se užívala k sběru spermií, které byly následně extendovány v EYC zmrazovacím extenderu.

e) Třídění. Přibližně 58 x 10⁶ spermií bylo objemově roztříděno pro každou kombinaci ošetření před tříděním, tekutinu pouzdra a extenderu tak, jak se popisuje v příkladu 2, s užitím 150 mW incidenční laserové energie. Pro každé třídění se spermie sebraly během hodiny. Po třídění se vzorky inkubovaly ve 22°C po dobu 2 hodin, aby simulovaly 3 hodinové třídění.

f) Příprava pro zmražení. Po inkubaci následovalo chlazení spermií, jak je popsáno v příkladu 2. Po chlazení byly vzorky centrifugovány v 5°C při 850 x g po dobu 20 ti minut. Každý vzorek obsahoval 28 ml celkového objemu a vzorky byly zabaleny do 50 ti ml plastikových zkumavek. Po té co byl odstraněn supernatant, spermie se vrátily do chladné místnosti o teplotě 5°C k extenzi. Vzorky se extendovaly na 40 x 10⁶/ml uložením 131 ul suspenze spermií do 69ul A frakce extenderu EYC, A frakce extenderu vaječný žloutek - Tris nebo TEST extenderu. Okamžitě byly suspenze adjustovány na 20 x 10⁶/ml spermií přidáním příslušného extenderu, který obsahoval glycerol. ( například B frakce extenderu EYC, B frakce extender tris) nebo TEST. B frakce extenderů se přidaly do odpovídajících vzorků po krocích (2x) v 15 minutových intervalech, jak se popisuje v příkladu 2. TEST extender se přidal ke spermiím po krocích stejným způsobem jako B frakce EYC a Tris extenderů.

g) Ekvilibrace a mražení. Kontroly a tříděné spermie byly zabaleny do 0,25ml polyvinylchloridových brček jak je popsáno v příkladu 2, ekvilibrovány na 5°G pó dobu 3 hodin a po té zamrazeny ve statické pářé tekutého dusíku.

3) Posouzení motility po Roztátí.. Posouzení spermií po roztátí bylo provedeno jak je popsáno v příkládu 2.

• · »♦♦· • ·

4) Statistická analýza. Obecný popis statistické analýzy byl dán v příkladu 2. Specificky se sledoval efekt ošetření pomocí ANOVA pro jednotlivé časy po roztátí. Hlavní osa zahrnovala ošetření před tříděním, extendery a býka; podosa pozorovatele a asociované interakce. Býci byli považováni za randomizační efekt, ostatní faktory fixní. Celý experiment se opakoval dvakrát. Tukey HSD test se použil pro oddělené průměry.

5) Výsledky. Progresivní motilita spermií po tání byla ovlivněna (p < 0,05) extenderem a býky při každém inkubačním čase po tání a procedurou před tříděním v čase 0 hodin inkubace (tabulka 6). Nebyl přítomen rozdíl kvůli různým tekutinám pouzdra (p > 0,05). V čase inkubace Oh po tání, použití šetrné 3 hodinového ošetření vedl kviče pohyblivým spermiím po roztátí než ostatní 2 ošetření barvením před tříděním ((p < 0,05; tabulka 6). Procedury před tříděním nebyly ale statisticky signifikantní pro inkubaci spermií po tání po dobu 1 a 2 hodin, byl li považovaný býk za randomizační efekt. Bylo důležité, při těchto 2 inkubačních časech, že zde byl signifikantní efekt ošetření před tříděním podle interakce býka (p < 0,05). Dále ošetření před tříděním by bylo signifikantní ve všech inkubačních časech po tání, při posouzení býků jako fixního efektu. Ihned po tání (Oh) TEST byl nejlepší extender, ale po 1 a 2 hodinách inkubace v 37°C byl nejlepší extender Tris. Je důležité, že nebyla žádná interakce ošetření před tříděním a extenderu. Byl přítomen účinek pozorovatelů (p < 0,01) při všech inkubačních časech, ale žádné interakce pozorovatel, ošetření. Byla interakce býk, extender (p < 0,05) při všech 3 inkubačních časech.

• · • · · ·

Tabulka 6. Hlavní účinek ošetření před tříděním a mrazicího extenderu na motilitu spermií po tání (%)

Procedura před tříděním	Inkubace při 37°C
extender	0 h	1 h	2h
Zředění -Oh	Průměr	39a	32	22
Úprava -3h	Průměr	435	36	25
Zředění - 3h	Průměr	38a	31	19
Průměr	EYC	36a	29 a	17a
Průměr	Tris	40 b	39 b	29 b
Průměr	TEST	44 c	33 a	20 a
S.E.d		0,8	0,8	0,7

^a,b,c Průměr ve sloupcích, v hlavních účincích, bez obecného nadpisu se liší (p<0,05).

^d Půlovaná standardní chyba Nehyba průměru čtverce ANOVA + ýN

6) Závěry. Tato studie prokázala, že udržovat spermie upravené po dobu 3 hodin před zředěním, barvením a tříděním je lepší, než okamžitá diluce a barvení 0 h nebo za 3 hodiny. Tedy, po 3 hodiny do třídění je nejlépe pokračovat s novými podíly originálního ejakulátu, který byl udržován upravený po 3 hodiny a po té barven, spíše než pokračovat s originálním vzorkem spermií barvených a držených v koncentraci 400 χ 10^{* 6} spermií/ml.

Přestože TEST extender vykazoval nejvyšší pohyblivost spermií po tání v čase 0, tris byl nejlepší extender, když byly spermie vystaveny inkubaci při 37°C. Jakákoliv tekutina pouzdra se chovala stejně při užití všech extenderů. Na základě těchto výsledků jsme zařadily užití tekutiny pouzdra Tris s kombinací extenderu Tris pro mrazení do standardního pracovního postupu.

• *

Příklad 5

Účinek aditiv extenderu na tříděné spermie

Cíl: ověření účinku přidání dodekyl sulfátu sodného („SDS“) k mrazicímu extenderu na průtokem vybrané spermie.

A. Ověření účinku koncentrace SDS v mrazicím extenderu

1) Sběr zdrojového vzorku. Seberou se spermie od 6 býků a připraví se stejné, jak je popsáno v příkladu 1 A.

2) Metoda. Spermie od každého ze 6 býků se extendovaly na 20 x 10⁶/ml v 20% celkovém vaječný- Tris extenderu („WET“), který obsahoval 0, 0,03, 0,06, 0,09 nebo 0,12 procent SDS a byly zabaleny do brček a Zamrazeny.. WET extender se připravil s užitím 3,028 g Tris(hydroxymetyl)aminometanu, 1,78 g monohydrátu kyseliny citrónové a 1,25 g fruktózy ve 100 ml dvakrát destilované vody, ktomu bylo přidáno 20% celého vejce (objemových%). WET extender se připravil na pH okolo 7,0 a obsahoval konečnou koncentraci glycerolu okolo 6% (objemových). WET extender také obsahoval 1000 Ul sodné soli penicilinu G a 100Tg sulfátu streptomycinu/ml.

3) Výsledky. Patřičné průměry (n = 1 vzorek od každého z 6 býků) byly 51, 51, 50 a 51 a 48% progresivně pohyblivých spermií přibližně 10 minut po tání. Na základě těchto výsledků byla použita 0,05 procentní SDS v příkladu 5B.

B. Ověření účinku 0,06 procentní SDS v různých mrazících extenderech na motilitu průtokem tříděných spermií po tání

1) Sběr zdrojového vzorku. Seberou se spermie od 8 býků a připraví se stejně, jak je popsáno v příkladu 1A.

* · 000 0

0

·· 000 ·· ·· ·· 00 • 0 0 0 • 0 ·

0 0

0 0 0 0 0

2) Metoda. Studovala se motilita po tání u spermií mrazených v vaječný žloutek Tris extenderu (viz příklad 2) a WET extenderu (viz příklad 5A) sa bez 0,06%SDS. Konečný obsah glycerolu v obou extenderech byl 6%.

a) Barvení a příprava pro třídění, třídění. Obarvené vzorky spermií byly připraveny z ejakulátu od každého z 8 býků jak se popisuje v příkladu 2. Barvené spermie byly objemově roztříděny s použitím tekutiny pouzdra Tris, jak se popisuje v příkladu 2, s výjimkou toho, že třídění se dosahovalo s užitím energie laseru 135mW. Vybrané spermie se sebraly do 50-ml plastikových zkumavek, které obsahovaly 2 ml A frakce mrazicího pufru pro každý extender; 15 x 106 tříděných spermií (25ml) pro každé ošetření bylo sebráno a inkubováno po dobu 1 hodiny při 22°C, aby se simulovalo delší třídění.

b) Příprava pro mražení. Zředěné spermie byly po té ochlazeny na 5°C během 90 minut. Stejný obsah příslušné B frakce extenderu se po částech (2x) přidal v 15 minutových intervalech do každé 50 ml plastikové zkumavky, která obsahovala tříděné spermie. Stejné díly o obsahu 25ml ošetřené extenderem se koncentrovaly centrifugací po dobu 20 minut při 850 x g v chladicí centrifuze. Supernatant se odstranil a zůstaly 600 TI pelety spermií, které se rozpustily jemným třepáním za 15 sekund. Nepřidával se žádný další extender k peletám spermií, dokud suspenze pelet spermií obsahovala již glycerol. Koncentrace spermií v suspenzi byla přibližně 20 x 10⁶/ml. Nebarvené, netříděné kontroly pro každého býka se připravily v koncentraci 20 x 10⁶spermií/ml v extenderu vaječný žloutek-Tris, který obsahoval 6% glycerol. Kontroly se umístily do místnosti chladné 5°C, zatímco probíhalo objemové třídění.

c) Ekvilibrace a mražení. Kontroly a tříděné spermie byly zabaleny a zmraženy ve stejný čas. Spermie byly zabaleny do 0,25ml polyvinylchloridových brček, ekvilibrovány na 5°C po dobu 3 až 6 hodin a po té zamrazeny ve statické páře tekutého dusíku.

3) Posouzení motility po roztátí. Ověření spermií při tání a po tání se provádělo tak, jak je popsáno v příkladu 2, s výjimkou toho, že progresivní motilita se posuzovala 0,5 a 2 hodiny po inkubaci ^{4 *}

4) Statistická analýza. Obecný popis statistické analýzy byl dán v příkladu 2.

Specificky se sledoval efekt ošetření pomocí ANOVA pro jednotlivé časy

44 * 4 4

4 4 ·· 4 44 4 • 4 • 444 •4 44 • 4 4 · • · 44

4

4444 inkubace. Hlavní osa zahrnovala extendery a býka; podosa pozorovatele a vztažené interakce. Rozdíl v průměrech se určoval nejmenším signifikantním diferenčním testem.

5) Výsledky. Progresivní motilita spermií po tání byla ovlivněna (p < 0,05) extenderem po 0,5 nebo 2 hodinách inkubace po tání (tabulka 7.) V čase 0,5 hodiny WEA a SDS měly horší výsledky pohyblivosti spermií než Tris a SDS. V 2 hodině všechny druhy ošetření u objemově tříděných spermií byly horší, než netříděných kontrolních spermií. Byl přítomen signifikantní efekt býka a pozorovatele (p < 0,01) při obou inkubačních časech, ale žádné interakce pozorovatel, ošetření.

Tabulka 7. Účinek extenderu na progresivní motilitu (%) po tání ⁶

Extender	Inkubace při 37°C
extender	Oh
Tris (žádný výběr)	42a	41a
Tris w/o SDS	40^	3ΪΓ5
Tris w/SDS	42a	ŠP
WET w/o SDS	40 a,b	35*
WET w/SDS	385	35 a
S.E.c	1,0	1,2

^a,b Průměr ve sloupcích, bez obecného nadpisu se liší (p<0,05). ^c Půlovaná standardní chyba λ/chyba průměru čtverce ANOVA + VN

6) Závěry. Zahrnutí SDS do Tris nebo WET extenderu nemá přínos pro kvalitu spermií, která se odhaduje visuálně určením motility po tání. Rovněž výsledky dosažené s užitím WET nebo Tris extenderu jsou podobné, tedy WET se jeví být stejně účinný jako Tris při kryopreservaci tříděných bovinních spermií.

9999

4 • ···

9

4 4

4 • 4 4

4 4 • 4 4 4 4

4 «

4 4 4 4 • · · *

4444

Příklad 6

Kvalita spermií oddělených podle pohlaví pomocí průtokového třídění pro oblast studií

Cíl: ověření kvality spermií po tání na základě integrity akrozómu

1) Sběr zdrojového vzorku. Seberou se spermie od 3 býků a připraví se stejně, jak je popsáno v příkladu 1A.

2) Metoda. Spermie tříděné a netříděné, kontrolní ze stejného ejakulátu se obarvily a třídily, jak je popsáno v příkladu 2, kromě toho, že spermie byly tříděny podle typu pohlaví na hladině čistoty 90%. Vybrané spermie se sebraly do objemu asi 20 ml a byly zchlazeny na 5°C během 90 minut (0,2°C/min). Po ochlazení se přidal k tříděným spermiím stejný objem extenderu vaječný žloutek-Tris B (viz příklad 2) ve 2 stejných objemech v 15 minutových intervalech. Centrifugace a aspirace supernatantu se provedla stejně, jak se popisuje v příkladu 2. Po centrifugaci a aspiraci supernatantu se přidal ke spermiím extender vaječný žloutek - Tris, který obsahoval 6% glycerolu (objemových) tak, aby byla dosažena výsledná koncentrace spermií okolo 20 x 10⁶ spermií/ml. Zmražení a tání se provedlo tak, jak se popisuje v příkladu 2, vyjma toho, že ekvilibrační čas byl okolo 3 hodin.

3) Ověření motility po řán/.Vizuální odhad procenta progresivně pohyblivých spermií se prováděl při 37°C přibližně 10 minut po tání. Integrita akrozómu spermií se odhadovala pomocí diferenciální interferenční kontrastní mikroskop (x1000) po 2 hodinách inkubace v37°C. Spermie byly ošetřeny 40mM fluoridem sodným, udělal se vlhký nátěr a 100 spermií na ošetření se prohlédlo. Akrozómy byly klasifikovány jako (a) intaktní, (b) oteklý nebo poškozený akrozóm a (c) chybějící akrozóm (na intaktní). ^{4 * *}

4) Statistická analýza. Analyzované údaje od 19 různých dat mrazení byly balancovány pro 3 býky užité v oblasti studií. Efekty ošetření (třídění proti kontrolám) se ověřovaly pomocí ANOVAs s býky jako fixním efektem.

·· 0 ·· ·

5) Výsledky. Procento progresivně pohyblivých spermií po tání bylo signifikantně vyšší (p<0,05) pro netříděné spermie (50%) než pro tříděné spermie (46%, tabulka 8), i přes to, že byly během třídění odstraněné mrtvé spermie. Procento spermií s intaktním akrozómem se však nelišilo. Třídění zvyšovalo procento spermií, kterým chyběl akrozóm, ale také snižovalo procento spermií s poškozeným akrozómem vzhledem k kontrolním spermiím (p<0,05). Byl signifikantní rozdíl v procentu intaktních akrozómů (p<0,05), v procentu neintaktních akrozómů (p<0,01) a progresivní motilitě po tání (p<0,01) mezi býky. Byl efekt býka podle třídění pro motilitu spermií po tání (p<0,01), ale pro ostatní odpovědi ne. Pro býky A a B rozdíl pro motilitu spermií po tání mezi tříděnými a netříděnými spermiemi byl téměř 0; pro býka C tříděné spermie byly 10 procentních bodů níže (19%) v motilitě než kontrolní spermie.

** ♦· ♦· ♦· ···· · · · · • * *· · · · • · · · · 4 4 4 • · · · · φ 4 • * · · ·· ·4·4 ** ··«« • · *

Tabulka 8. Účinek třídění na motilitu (%) po tání a stav akrozómu

	Stav akrozómu
Intaktní	Zničený	Poškozený	Motilita po tání
Kontrolní	64a	20a	15a	50 a
Tříděné	65a	14a	21 a	46^

^a Průměr ve sloupcích, bez obecného nadpisu se liší (p<0,05).

6) Závěry. Vizuální odhad progresivní motility pro tříděné, mražené spermie byl v průměru lehce nižší (4 procentní body; 8%), než pro kontrolní spermie, ačkoliv tento rozdíl byl větší pro jednotlivého býka. Tato vyšetření se prováděla přibližně 10 minut po roztátí. Malý průměrný rozdíl je konzistentní stím, co bylo zjištěno pro neintaktní akrozómy po 2 hodinách inkubace. Spermie s poškozenými nebo chybějícími akrozómy se stávají spíše nepohyblivými. Zvýšené procento spermií s neintaktním akrozómem pro tříděné vzorky, znamená poškození spojené s tříděním kryopreservací před nebo po aktuálním třídění. Přepokládejme, že třídění změní poškozený akrozóm na chybějící. Na základě standardních postupů pro ověřením kvality spermií zde není žádný podklad pro předpoklad, že fertilizační potenciál těchto průtokem tříděných spermií by měl být těžce kompromitován pro většinu býků.

♦ * 9 9 * 9 • 9 • 9 99 • 9 · • · ·

999

Μ 99 • 9 9 9

9 9«

99 «9 «

9 9

9 9 9 9 9 « • ♦ ·· 99 9999

Příklad 7

Výběr podle pohlaví a kryopreservace býčích spermií pomocí 20% extenderu Vaječný žloutek - Tris

Cíl: zadání protokolu pro kryopreservaci průtokem tříděných spermií

1) Sběr a ohodnocení Ejakulátu.. Seber a připrav ejakulát jak je popsáno v příkladu 1A. vyber ejakulát od těch býků, kteří mají více než 75% morfologicky normálních spermií. Vizuálně odhadni procento progresivně pohyblivých spermií (ejakuláty, které mají více než 60% jsou nejlepší pro třídění). Přidej antibiotika k surovému semenu následujícím způsobem: tylozin v konečné koncentraci 100ug/ml, gentamycin v konečné koncentrace 500 ug/ml a linko-spektin v konečné koncentraci 300/600 ug/ml.

2) Barvení a příprava pro třídění. Následně po přidání antibiotik k surovému vzorku spermií vyměř 15-20 minut před barvením. Barvi vzorek tak, jak je popsáno v příkladu 2.

3) Třídění. Třiď oba typy spermií, X i Y spermie, s nastavením třídících vstupů na 90% čistotu. Spermie třiď do 50 ml zkumavek Falcon, které obsahují 2 ml 20% extenderu vaječný žloutek - Tris, frakce A (viz příklad 2) dokud každá zkumavka neobsahuje maximálně 20 ml celkového objemu (nebo maximálně 2 hodiny na třídění) a konečná koncentrace tříděných spermií je 6 x 10^{4 5}/ml. Pamatuj, že dodatečný 20% extender vaječný žloutek - Tris, frakce A zachytávácí lázně se musí dodat po třídění a před chlazením tak, že výsledná koncentrace vaječného žloutku je nejméně 3%.

4) Příprava pro mražení. Následně po třídění zchlaď tříděný vzorek na 5°C během periody 90minut. Po chlazení přidej 20% extender Vaječný žloutek - Tris, frakci B (viz příklad 2) po krocích (2x) v 15 minutových intervalech. Konečný objem Tris, frakce B extenderu, který se přidal k vzorku spermií by měl být stejný jako objem Tris, frakce A extenderu. Celkový objem vzorku spermií po dodání

Tris, frakce B extenderu by neměl přesáhnout 27 ml celkem.

«··· * 9 9

9 9 99

9 · ♦ * · ·· «*» m

9 9 « • 9 99 • · · « • 9 · 4

99

Po té, co se přidá Tris, frakce B extenderu ke vzorku spermií, koncentruj vzorek centrifugací po dobu 20 minut při 850 x g. Aspiruj supernatant a ponech pelety spermií asi 150 ul. Resuspenduj spermie a seber spermie od každého individuálního býka.

5) Mražení. Přidej kompletní extender vaječná žloutek - Tris (6% glycerolu), aby byla dosažena konečná koncentrace spermií 20 x 10⁶/ml. Bal extendované spermie do 0,25 ml polyvinylchloridových brček pro zmražení, jak se popisuje v příkladu 2.

♦ «·

4 4

Příklad 8

Ověření fertility průtokem tříděných, mražených spermií v oblasti studií

Materiál a metody

Sběr a opracování semene

Semeno od mladých býků, u kterých není známa fertilita, bylo sebráno pomocí arteficielní vagíny (viz příklad 1A). Po určení koncentrace spermií spektrofotometrem a subjektivním ověření progresivní pohyblivosti spermií, semeno bylo zpracováno a roztříděno, jak je popsáno v příkladu 2, kromě toho, že spermie byly roztříděny podle typu pohlaví na úrovni 90% čistoty s použitím incidenční energie laseru od přibližně 135 do přibližně 150mW. Zpracování a zmražení se provedlo jak se popsáno v příkladu 2, kromě toho, že ekvilibraóní čas byl okolo 3 hodin. Extender Cornell Universal (Seidel GE Jr., Theriogenology 1997; 48: 1255 - 1264) se použil v oblasti studií 1,2 a 3 pro tekuté semeno. Pro mražené semeno v studiích 2 a 3 byl užívaným extenderem 2,9% Na citrát + 20% vaječný žloutek s konečnou koncentrací glycerolu 7% (viz příklad 1). Pro studii 4 až 11 se spermie mrazily vextenderu založeném na Tris, který byl složen z 200mM Tris, 65 mM kyseliny citrónové, 56 mM fruktózy, 20% vaječného žloutku a finální koncentrace glycerolu 6% (viz příklad 2). Tekutina pouzdra, která se užívala v průtokové cytometrii byla složena z 2,9% Na citrátu (viz příklad 4) pro studii 1,2 a 3 a z Tris pufru pro zbývající studie (viz příklad 2).

Spermie se balily do 0,25-mi French brček v sloupcích tak malých, jako 50ul, které byly ve středu brčka. K minimalizaci dilučního efektu se používaly se používaly malé objemy tak, že zde bylo nejméně 10⁷ spermií/ml. Ve většině studií sloupce extenderu se spermiemi se brčka plnila tak, že nejprve byla vlhká bavlněná zátka, zvlhčená extenderem, následovaná malým sloupcem vzduchu a až po té podle pohlaví tříděnými spermiemi. Když byly spermie zamrazeny, jedno brčko z každé várky bylo rozmraženo v lázni 35°C teplé vody po dobu 30 sekund kvůli kontrole kvality a série, s progresivní motilitou spermií po tání menší, než 25%, se vyřadily. Vzorky spermií roztříděných podle pohlaví byly sonografovány a analyzovány průtokovou cytometrii k určení přesnosti rozčlenění podle pohlaví.

Ošetření jalovic a umělé oplodnění

Používané jalovice byl z 6 široce rozložených výrobních jednotek s různými způsoby řízení. Rozdíly sezónní a v chovu přispívaly dále k heterogenitě experimentu (tabulka 9). Pokud bylo možné, ošetřené a kontrolní byly systematicky měněny pokud šlo o býky, o inseminátory jak jalovice vstupovaly do inseminačních zařízení.

Estrus byl synchronizován jedním ze 4 způsobů (tabulka 9): (1) 500 mg acetátu melengestrolu (MGA) podáváno v krmivu v 2,3 kg zrní po dobu 14 dní, po té následovala i.m. injekce 25mg prostaglandinu F₂a (Lutalyse, Upjohn, Kolamazoo, Ml, USA) 17, 18, 19 den po posledním dni krmení MGA (MGA/PG); (2) jednotlivá injekce 25mg prostaglandinu F₂a (PG); (3) 20 nebo 25mg prostaglandinu F₂a podáni i.m injekcí v 12 denních intervalech (PG/PG) nebo (4) 50 nebo 100 Tg GnRH podáno i.m. injekcí, po té následovalo 25mg prostaglandinu F₂a po 7 dnech (GnRH/PG).

Jalovice byly vyšetřeny vizuálně ráno a večer, zda nastoupil estrus, ale inseminace byla prováděna jen odpoledne po 16 hodině, přibližně ¹Λ nebo 1 den po nástupu estru. Inseminace se prováděla buďto rutinním způsobem do děložního těla, nebo polovina do rohu uteru s použitím atraumatického transferového sheatu (IMV, Minneapolis, MN, USA). V druhém případě bylo semeno umístěno tak, že minulo velkou kurvaturu roku uteru a bylo umístěno co nejvíce dopředu jak bylo možné bez traumatu, stejně jako se provádí nechirurgický transfer embryí. Ve většině případů bylo semeno umístěno mezi přední třetinu a střed cornuy.

Většina experimentů zahrnovala kontrolovanou inseminaci mražených spermií do těla uteru s dávkou 20 nebo 40 x 10⁶ spermií/ml od stejného býka, který se použil pro třídění spermií podle typu pohlaví. Tyto kontroly soužily jako vzorek k odhadu vnitřní, normální fertility jalovic ovlivněné specifickými podmínkami studie, stejně jako fertility užitých býků a zručnosti inseminátorů. Některé studie zahrnovaly nízko dávkované kontroly, neroztříděné podle pohlaví. Někdy byl počet kontrolních inseminaci plánovaný na % nebo 2/3 počtu, který se použil pro každé ošetření ktomu, aby se získalo více informací o spermiích tříděných podle φ* φφφφ φ φ • ···

ΦΦ 00

Φ Φ Φ 0

Φ Φ Φ

Φ Φ Φ

Φ Φ · • Φ ····

Φ φ

φ •

·< ··· ··

Φ Φ Φ · Φ · ·Φ Φ « Φ Φ Φ Φ Φ Φ

V ·· pohlaví. Mražené spermie tříděné podle pohlaví a kontroly byly rozmraženy po dobu 20 až 30 sekund v lázni o teplotě mezi 35 a 37 °C. Různé další podrobnosti jsou shrnuty v tabulce 9.

Těhotenství se diagnostikovalo ultrasonograficky mezi 28 a 37 dnem po inseminaci a/nebo 56 až 92 den po inseminaci, v tomto období bylo určeno ve většině studií pohlaví, jak se popisuje v Curran.S., Theriolgenology 1991; 36:809814, bez toho, že by vyšetřující věděl, jaký byl způsob inseminace, nebo zda šlo o kontroly. Pohlaví telat, která se narodila, bylo téměř shodné s pohlavím diagnostikovaným u fetu. Data se analyzovaly Chi kvadrátem s jedním stupněm volnosti; 2- koncové testy se používaly, dokud nebyl 1- konec. Méně než 5% inseminaci bylo vyřazeno, kvůli chybě při postupu při inseminaci, otevřené infekci reprodukčního traktu, selhání uzávěru cervixu atd. Rozhodnutí o vyřazení zvířete z experimentu bylo vždy provedeno krátce po inseminaci n nebylo nikdy založeno na diagnóze těhotenství.

Tabulka 9.Procedurální detaily z oblasti studií

Studie	Data insemin ace	Chov jalovic	Užití býci	Insemi- nátor	Synchroni- sace estru	komentář
1	5/20-23 1997	Angus	N1, N2, AN4	A,B	MGA/PG	Včetně nízce dávkovaný ch kontrol
2	2/18- 5/22, 1998	Angus - přenese ně	N3, N4, N5, N6	C,D	PG/PG	Nízce dávkované , ale ne normální kontroly, některé jalovice těhotné a některé potratily při synchroniz ace
3	6/2-6/5, 1998	Angus	AN4, AN5 , N7, N8,	B,D	MGA/PG
4	2/10- 13,199 9	Holstein	J2, J4	C,D	PG	Velmi těžké bláto, sníh, vítr a zima, déšť
5	2/24- 26,199 9	Holstein	J2, J4, J5	C,B,D	PG/PG
6	4/14-	Holstein	J2,	C,D	PG	Některé

• · · · · · • · · · ·· «· • · · · · · ♦ • · · · · ·

	16,199 9		J3, J4, J5			jalovice byly reprodukč ní
7	4/27- 5/1,199 9	Holstein Angus přenese ně	AN1, AN4 J	C	MGA/PG	Semeno od jednoho býka bylo dopraveno 6 hodin před tříděním pro špatné počasí
8	4/21- 23,199 9	Angus přenese ně	H1, H2	E	MGA/PG	Hodně krmené jalovice
9	5/5- 8,1999	Červený Angus	AR1, AR2 1	C,F	MGA/PG
10	5/31- 6/2, 1999	Angus	AN4, AN7 AN8	B,D	GnRH/PG
11	7/28- 30,199 9	Holstein	H2, H3	C,D	PG/PG	První replikace dostupná v mhohem větší studii

Výsledky a diskuse « · • · · · · · ·· * · • · · · · · · » • · · · · 9 · · · · • · ··· ·· · · · ·· · ···· ·

Presentovaná data jsou z 11 po sobě jdoucích, heterogenních studií, které vyplývaly z logických aspektů těchto studií, jako je potřeba mít výběr býků pro genetické potřeby stáda, nedostupnost informací o fertilitě býků, limitovaný počet jalovic, nedostupnost stejných inseminátorů během všech studií, obtížné počasí, limitované množství podle pohlaví vybraného semene v časných studiích, 2 sady jalovic, ve kterých některé otěhotněly až do 55 dnů od synchronizace estru, atd. Až 4 býci a 3 inseminátoři byli zahrnuti do každé studie; to nám umožňovalo vzorkovat populace k ověření výsledků, aplikovaných na více než jednoho býka nebo technika; avšak byly produkovány insuficietní data k tomu aby byla ověřena rozdílnost mezi jednotlivými býky ve fertilitě.

Většina sad jalovic byla z chovných stád, vzdálených od naší laboratoře od 140 do 250 km. Nebyl signifikantní rozdíl v podílu těhotenství mezi jednotlivými inseminátory v jakékoliv studii, ale počet chovů na inseminátora byl nízký a rozdíly by možná byly znatelné při větším počtu inseminátorů.

Metody synchronizace estru se nesrovnávaly mezi studiemi, nebylo tedy možné posoudit poměr těhotenství mezi těmito metodami. Podíl těhotenství se jevil být dostatečný pro všechny použité synchronizační postupy.

Protože se inseminace prováděla jednou denně, jalovice, které byly v estru večer, byly oplodněny přibližně 24 hodin po té, co byl estrus detekován. Podíl těhotenství u těchto jalovic pomocí spermií tříděných podle pohlaví byl ve všech studiích 203/414 (49%), a toto se signifikantně nelišilo (p>0,1) od těch jalovic, které byly inseminovány půl dne po detekci estru 266/586 (45,4%). Tato tendence pro vyšší podíl těhotenství při oddálení inseminace je v souhlase s nálezy dalších výzkumů, a je tedy preferováno provádět inseminaci později, než je normálně doporučováno u nízko fertilních býků, když se používají nízké počty spermií, nebo když podmínky jsou z nějakého jiného důvodu suboptimální.

Poměr těhotenství podle způsobu ošetření a, pokud bylo dostupné, pohlaví fetu nebo telete, jsou presentovány v tabulce 10 až 20. Cílem bylo získat samičí pohlaví, kromě studie 8; akurátnost byla 95%, 83%, 90%, 63% a 94% v odpovídající studii 1,3,8, 9, 10 a 11. Ve zbývajících studiích nebylo pohlaví fetu

nebo při narození dostupné kvůli časování diagnostiky těhotenství, nedostupnosti osob, které by byli zběhlé v rozlišení sexu zárodků a/nebo kvůli tomu, že telata nebyla ještě narozena. Toto nebyl hlavní zájem, protože hlavní cíl studie bylo určit fertilitu průtokem tříděných spermií, podávaných v nízké dávce.

Přesnost třídění podle pohlaví může být nastavena na kteroukoliv úroveň mezi 50 a 95+% podle nastavení parametrů třídění. Vyšší přesnost však zároveň vede k nižšímu počtu spermií, vytříděných za jednotku času, zvláště pro Y chromozóm nesoucí spermie. Přesnost 90% je postačující pro rutinní práci.

Hlavní výsledky z každé oblasti studie byly po řadě shrnuty. Všimněte se, že celkové počty spermií jsou dány v záhlaví tabulky; počty progresivně pohyblivých spermií byly obvykle 30 -50% z těchto hodnot. Oblast studie 1 ( tabulka 10) potvrdila, že poměr těhotenství při způsobu inseminace do roku uteru a s užitím nižších počtů podle pohlaví netříděných spermií je podobný, jako u kontrol a normálními počty spermií. Poměr těhotenství v 64 až 67 dni s nezmraženými spermiemi, které byly tříděny podle pohlaví byl 12 procentních bodů pod poměrem těhotenství, které bylo docíleno s tekutými kontrolními spermiemi, které byly zředěné, barvené a centrifugované stejně, jako tříděné spermie. Přesnost třídění podle pohlaví byla 95%; pohlaví narozených telat s použitím podle pohlaví tříděných spermií se přesně shodovalo s diagnózou pohlaví zárodků; byla 1 chyba při určení pohlaví fetu u kontrol. Nebyl žádný potrat mezi 2 měsícem gestace a termínem a všech 19 telat z spermií tříděných podle pohlaví bylo normálních a přežilo. Pro spermie ošetřené podle pohlaví odpovídající poměr těhotenství pro býky N1, N2 a N3 byl 41, 44, a 40%; 39% (13/33) jalovic, které otěhotněly, bylo v estru ráno a 50% (6/12) jalovic bylo v estru večer.

Tabulka 10. Výsledky oblasti studie 1 - Angus jalovice v Wyomingu, 1997

Ošetřen í/místo

Počet sper mií

Počet jaloví c

Počet těhotenst ví ve dni

Počet těhotenst ví ve dni

Počet samičí ch

• · · · · ♦· ·· • · · · *«·· • · · · · « ·

			31 až 33	64 až 67	telat
Tříděné podle pohlaví 5°C / roh děložní	3x105	45	22 (44%)	19 (42%)	18 (95%) a
Kontroly 5°C / roh děložní	3x 106	28	15 (54%)	15 (54%)	5 (53%) b
Mražené kontroly / tělo děložní	40x 10®	29	16 (55%)	15 (52%)	11 (73%) a,b

Poměr pohlaví bez obecného nadpisu se liší (p<0,02).

Oblast studie 2 ( tabulka 11) podává první průkaz, že výsledky se spermiemi tříděnými podle pohlaví a zmraženými jsou podobné, jako ty se spermiemi podle pohlavní tříděnými, ale nezmraženými, je-li provedena úprava pro počet spermií, které jsou zabity při kryopreservaci. Nebyl také žádny rozdíl mezi podíly těhotenství při použití podle pohlaví tříděných spermií skladovaných při 5 nebo 18°C. Podíl těhotenství ve druhém měsíci po inseminaci podle pohlaví tříděných spermií pro jednotlivé býky kolísal mezi 22 a 42% těhotenství (p>0,05). Ztráta embryí mezi 1 a 2 měsícem gestace byla podobná pro těhotenství pomocí podle pohlaví tříděných spermií a kontroly. Data od telat byla dostupná od 39 jalovic z této studie; každá z jalovic (30 těhotenství pomoct podle pohlaví tříděných spermií, 9 kontrol), které byly těhotné v 2 měsíci, porodily tele po normální délce gestace.

Tabulka 11. Výsledky z oblasti studie 2 - přenesené hovězí jalovice v Colorado, 1998

Ošetřen í/místo	Počet spermi í	Počet jalovic	Počet těhotenství ve dni 30 až 35a	Počet těhotenství ve dni 59 až 92a
Kontroly 5°C / roh děložní	5x 105	58	27 (47%)	24(41%)
Tříděné podle pohlaví 5°C / roh děložní	5x 106	51	17(33%)	16 (31%)
Tříděné podle pohlaví 18°C / roh děložní	5x105	46	16 (35%)	12 (26%)
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	1x 106	87	29 (33%)	28 (32%)

není signifikantní rozdíl, χ²

Oblast studie 3 (tabulka 12) potvrzuje, že použití zmražených, podle pohlaví tříděných spermií vede k přiměřenému podílu těhotenství. Přesnost podle pohlaví tříděných spermií byla opět potvrzena; byly zde však 4 chyby v určení pohlaví zárodku vzhledem k pohlaví narozených telat; uváděno je aktuální pohlaví narozených telat. Opět nebyl přítomen žádný potrat mezi 2 měsíci gestace a termínem. Podíl těhotenství průměrovaný přes podle pohlaví tříděné spermie, nemražené a podle pohlaví tříděné spermie, mražené spermie na býka N8, N8 a AN5 a AN4 byl 24, 31, 50 respektive 60% (p<0,1).

» 0*0 0

I * 0 • •00 • · · · • 0 · 0

0·· • 0 · 0

0 0 0

0· 0

Tabulka 12. Výsledky oblasti studie 3 - Angus jalovice ve Wyomingu, 1998

Ošetření/místo	Počet spermií	Počet jalovic	Počet těhotenství ve dni 62 až 65	Počet samičích telat
Tříděné podle pohlaví 18°C / roh děložní	5x 105	37	11 (30%)a	10 (91%) c
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	1x 106	35	18 (51%)a>b	14 (78%) c
Mražené, kontroly / tělo děložní	40x 106	37	27 (73%)b	16 (59%) d

^a,b Průměr bez obecného nadpisu se liší ( p<0,05).

^c,d Procento samičího pohlaví telat z ošetření pomocí spermií tříděných podle pohlaví (83%) se liší od kontrolní skupiny p<0,05, 1 - ocas, χ²

Oblast studií 4,5 a 6 (tabulky 13, 14, 15) byly provedeny ve stejné lokalitě se 3 rozdílnými skupinami jalovic. Bohužel nebylo možné opakovat každou studii podobně, kvůli různostem oblastí studií, jako byla řídící osoba, dostupnost podle pohlaví tříděných spermií od každého býka, a tak dále. Velmi rozdílný podíl těhotenství mezi studiemi 5 a 6 ilustruje, že podmínky byly ve studiích rozdílné. Některé z jalovic ve studii 6 byly dostupné, protože selhaly ve schopnosti otěhotnět ještě po měsíci přirozeného partnerství. Za podmínek těchto studií, podíl těhotenství byl podobný, mezi 1,5 a 3,0 χ 10⁶ podle pohlaví tříděných studií, mražených / v dávce. Dále, nebyla také patrná výhoda inseminace do uterinního rohu. Nebyla žádná signifikantní diference (p>0,05) v podílu těhotenství mezi býky, kromě studie 5, ve které byl podíl těhotenství od J2 20/28 (71%). Byl vyšší než u J4 15/39 (38%) (p<0,05). Tento rozdíl nebyl konsistentní mezi jednotlivými studiemi, protože J4 měl numericky více, ale ne signifikantně (p>0,1) vyšší podíl těhotenství než J2 ve studiích 4 a 6.

9 9 90 0 · · • · · · 9

09 • 9 9 9

9 99

9 · 9 9 9 0 9 9 0

999 09 · · 00 0 0 9 0

Tabulka 13. Výsledky studie 4 - Holstein jalovice v Coloradu, 1999

Ošetřen í/místo	Počet spermi í	Počet jalovic	Počet těhotenství ve dni 30 až 33	Počet těhotenství ve dni 64 až 67*
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,5x 106	55	36 (65%) a’b	36 (65%) a’b
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	3x 106	52	27 (52%)a	26 (50%)a
Mražené, kontroly / tělo děložní	20x 10®	55	45 (82%)b	43 (78%)b
a,b Průměr bez obecného nadpisu se liší (p<O,C	11).

* Šest jalovic těhotných v 30 až 33 týdnu byly řešeny před diagnózou druhého těhotenství; byl předpoklad, že zbylé jsou těhotné.

Tabulka 14. Výsledky oblasti studie 5 - Holstein jalovice v Coloradu, 1999

Ošetřen í/místo	Počet spermi í	Počet jalovic	Počet těhotenství ve dni 33 až 35a	Počet těhotenství ve dni 60 až 62a
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,5x 106	23	12 (52%)	12 (52%)
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	3x 106	25	15 (60%)	14 (56%)
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	1,5x 10®	25	15 (60%)	12 (48%)

• ftft * • · ft · ·· ♦ ft · · ♦ ftft ft ft · · » ft

Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	3,0x 106	25	17(68%)	15(60%)
kontroly mražené / tělo děložní	20x 106	30	20 (67%)	19(63%)

^a Žádný signifikantní rozdíl

Tabulka 15. Výsledky oblasti studie 6 - Holstein jalovice v Coloradu, 1999

Ošetření/místo	Počet spermi í	Počet jalovic	Počet těhotenství ve dni 31 až 34	Počet těhotenství ve dni 60 až 63
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,5x 106	27	11 (41%)a	9(33%)a
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	3x 106	25	10(40%)a	9 (36%)a
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	1,5x 106	24	8(33%)a	7(29%)a
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	3,0x 106	24	10(42%)a	8(33%)a
kontroly mražené / tělo děložní	20x 1Ό6	24	18 (75%)b	17 (71%)b

^a,b průměry bez obecného nadpisu se liší (p<0,05).

9 9 99 9 ·

• · « ·

9 9 «

*· » · • * · 9 «

Pro studii 7 ( tabulka 16) byl z důvodu naplánování studie dostupný pouze 1 inseminátor. Toto byla jediná studie, která podala přesvědčivý průkaz o inseminaci aplikovanou do roku dělohy oproti aplikaci do těla děložního. V případě tohoto inseminátora za daných podmínek studie bylo o 55 více % jalovic (22 procentních bodů) těhotných pomocí spermií tříděných podle pohlaví a mrazných, pokud byly inseminovány do roku děložního a ne do těla. Skutečný rozdíl by mohl být menší, protože je zde široký konfidenční interval nad těmito průměry. Ve všech ostatních studiích (5,6,9 a 11) ve kterých se srovnávala metoda inseminace do těla a rohu děložního, byl podíl těhotenství velmi podobný pro obě metody pro tohoto technika stejně jako pro ostatní techniky.

Semeno od jednoho býka, užívané ve studii 7, bylo dopraveno bez diluce z Monatany letecky v chlazeném boxu v -20 °C před tříděním; dopravní čas byl 6 hodin. Poměr těhotenství pro podle pohlaví tříděné spermie od dvou býků byl téměř identický, 49% pro býka, kde nebyla nutná doprava semene a 52 pro býka, kde byla nutná doprava semene. Semeno nebylo před transportem ředěno pomocí extenderu a nebylo chlazeno, protože barvicí vlastnosti spermií při barvení pomocí Hoechst 33342 se při užiti extenderu pro zředění mění. Navíc, v dalších studiích ( viz příklad 4) bylo prokázáno, že skladovat semeno upravené při vhodné teplotě mezi sběrem a tříděním pomocí průtoku je lepší, než jej zředit.

Tabulka 16. Výsledky oblasti studie 7 - přenesené hovězí jalovice v Colorado, 1999

Ošetření/místo	Počet spermií	Počet jalovic	Počet těhotenství ve dni 33 až 37
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,5x 106	86	34 (40%)a
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	1,5x 106	86	53 (62%)b
kontroly mražené / tělo děložní	20x 106	35	18 (51%)a’b

^a,b průměry bez obecného nadpisu se liší (p<0,01).

• * ·44 4 • 4 « 4 • 444· 4 • · 4 4 4

Oblast studie 8 ( tabulka 17) se týká překrmovaných jalovic, které nebyly implantovány s růstovými urychlovači; v čase, kdy bylo diagnostikováno těhotenství, byl proveden potrat, takže data o telatech nejsou k disposici. Tento experiment ilustruje, že účinný výběr podle pohlaví může být proveden ve směru samčím. Podíl těhotenství pro oba býky byl 50 a 61%.

Tabulka 17. Výsledky oblasti studie 8 - Angus jalovice v Nebrasce, 1999

Ošetřen í/místo	Počet spermií	Počet jalovic	Počet těhotenství3 ve dni 74 až 76	Počet samčích zárodků
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,0x 106	18	7 (39%)	6 (86%)
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,0x 106	18	13 (78%)	12 (92%)

^aZádný signifikantní rozdíl.

Oblast studie 9 (tabulka 18), byla jediná studie, která ukazovala přesvědčivou výhodu při použití 3,0 oproti 1,5 χ 10⁶ podle pohlaví tříděných, mražených spermií/ v inseminační dávce. Tato výhoda byla patrná pro oba inseminátory. Podíl těhotenství pro podle pohlaví tříděné spermie od 2 býků byl 62 a 75%.

Tabulka 18. Výsledky oblasti studie 9 - Červený Angus jalovice v Nebrasce, 1999

Ošetřen í/místo

Počet spermií

Počet jalovic

Počet těhotenství ve dni 60 až 63a

Počet samičích zárodků

• ♦ *

·· ·» • * 9 8 • · ·« • » ·»*·'« • * 9 · 8 · φ

8 «·· · · «· ·* «·<♦ • ·

Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,5x 106	15	8 (53%)	7 (88%)
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	3x106	14	12 (86%)	9 (75%)
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	1,5x 106	16	9 (56%)	7 (78%)
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	3x 106	16	12 (75%)	11 (92%)
kontroly mražené / tělo děložní	20x 106	30	21 (70%)	13 (62%)

^a 3x 10⁶ podle pohlaví tříděných spermií mělo vyšší podíl těhotenství (80%) než

1,5x 10⁶podle pohlaví tříděných spermií (55%), p<0,05, 1 - ocas, x²

Podíl těhotenství v oblasti studie 10 (tabulka 19) pomocí podle pohlaví tříděných, mražených spermií byl podobný jako u kontrol; přesnost roztřídění těchto spermií podle pohlaví byla jen 82%, což ale není signifikantně odlišné od cílové přesnosti 90%. Podíl těhotenství pro podle pohlaví tříděných spermie byl 54,66 a 50% pro býka AN4, AN7 a AN8 (p>0,1). Osmnáct jalovic, které byly použity pro inseminaci v této studii, byly telata, která se narodila jako výsledek ze studie 1.

Tabulka 19. Výsledky oblasti studie 10 -Angus jalovice v Wyoming, 1999

Ošetřen í/místo

Počet spermií

Počet jalovic

Počet těhotenství ve dni 61 až 63a

Počet samičích zárodků

t

η..

♦ * ·· * ♦ · • · ·« » ♦ ··

Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,0 x 106	44	26 (59%)	23 (85%)
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	3x106	43	23 (53%)	17(74%)
kontroly mražené / tělo děložní	20x 10®	35	20 (57%)	12 (57%)

^a Žádný signifikantní rozdíl

Tabulka 20. Výsledky oblasti studie 11 -Holstein jalovice v Colorado, 1999

Ošetřen í/místo	Počet spermi í	Počet jalovic	Počet těhotenství ve dni 28 až 33a	Počet těhotenství ve dni 28 až 33a,b
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	1,0 x 10®	12	8 (67%)	7 (58%)
Tříděné podle pohlaví mražené / tělo děložní	3x 10®	12	6 (50%)	4 (33%)
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	1,0x 10®	7	4 (57%)	4 (57%)
Tříděné podle pohlaví mražené / roh děložní	3x10®	7	4 (57%)	4 (57%)
kontroly mražené / tělo děložní	20x 10®	9	4 (44%)	3 (33%)

^a Žádný signifikantní rozdílx².

^{a b} 16 z 17 (94%) zárodků z ošetření pomocí podle pohlaví tříděných spermií bylo samičí; 2 byly příliš hluboko v tělesné dutině k určení pohlaví pomocí ultrazvuku.

·♦ <*·

»♦ ··♦« ♦ I *«« : > :

• · · · · ·· » «

Data ze studií, kde ošetření bylo stejné kromě 2x 10 a 1,5 x 10⁶ dávka spermií, byly kombinovány.

Tabulka 21. Meta- souhrn zkombinovaných studií s mraženým, podle pohlaví tříděným semenem a mraženými kontrolami

Kombinace studií	Počet spermií/místo	Počet jalovic	Počet těhotenství
5,6,9,11	1,0-1,5 x 106/tělo	77	36 (47%)
	3x106/tělo	76	38 (50%)
	1,0-1,5 x 106/roh	72	32 (44%)
	3x 106/roh	72	39 (54%)
	20 x 106/tělo, kontroly	93	61 (66%)
4,5,6,9,10,11	1,0-1,5 x 106/tělo	176	98 (56%)
	3x106/tělo	171	88 (51%)
	20 x 106/tělo, kontroly	183	124(68%)
5,6,7,9,11	1,5 x 106/těío	163	70 (43%)
	1,5 x 106/roh	158	85 (54%)
	20 x 106/tělo, kontroly	128	79 (62%)

Podíl těhotenství v experimentech pomocí podle pohlaví tříděných spermií byl obecně 70 - 90 % toho, jako pomocí kontrol bez třídění pohlaví s7 až 20 násobným množstvím spermií. Tato diference byla menčí v pozdějších studiích, což možná odráží zlepšení výběru podle pohlaví a procedury přípravy spermií.

V některých studiích byly jalovice vyšetřovány na těhotenství pomocí ultrazvuku v obou 1 a 2 měsíci po inseminaci. Ztráta těhotenství v tomto intervalu byla stejná (p> 0%,1) pro spermie podle pohlaví tříděné (23/261; 8,8%) versus kontroly (9/145; 6,2%), což je jeden z parametrů, který ukazuje, že genetické poškození je *0 »0*0 ·· ··

minimální. Informace o telatech se získaly pouze od několika z těhotných jalovic, protože většina dobytku z předchozích studií byla prodána a ty z posledních studií se ještě nenarodily. Populace telat, produkovaných k datu, než se objevily podle pohlaví tříděné spermie se nezdála být odlišná od populace kontrolní.

Průmyslová využitelnost

Poměr pohlaví u dobytka může být změněn až na 90% zastoupení určitého pohlaví pomocí třídění spermií na základě obsahu DNA pomocí průtokové cytometrie/třídiče buněk, po kterém následuje kryopreservace a relativně rutinní inseminace. Telata, která se narodí ze spermií tříděných podle pohlaví, se jeví být normální. Pro většinu býků v těchto studií se podíl úspěšných těhotenství dosažených pomocí zmrazených, podle pohlaví tříděných spermií v množství 1,0 až 1,5 x 10⁶ pohyboval mezi 70 až 90% toho, co je dosahováno s netříděnými kontrolami mražených spermií v množství 20 až 40 x 10⁶, které jsou používané ke konvenční inseminaci. Tyto výsledky se aplikují na dobře vedené chovy jalovic, ošetřené dobře trénovaným inseminátorem s užitím semene, vyrobeného vlastním zpracováním. Může být malá výhoda provádět inseminaci do obou rohů uteru ve srovnání se způsobem inseminace standardně do těla dělohy.

Je potřeba zde diskutovat prezentovaný vynález podle referencí k specifickým metodám a materiálům. Je potřeba rozumět, že diskuse těchto specifických metod a materiálů v žádném případě nedává jakékoliv limity ve smyslu presentovaného vynálezu, který se rozšiřuje na jakékoliv a všechny alternativní materiály a metody, které jsou vhodné pro uskutečnění závěrů presentovaného vynálezu.

Všechny popsané patenty a publikace jsou zde včleněny podle referencí v jejich úplnosti.

Claims (37)

1) Metoda kryopreservace spermií, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) získání vybraného vzorku spermií;

b) chlazení uvedeného vzorku spermií;

c) izolování spermií z uvedeného vzorku spermií k vytvoření izolovaných spermií;

d) přidání finálního extenderu k uvedenému vzorku spermií k vytvoření suspenze spermií;

e) mražení uvedené suspenze spermií.

2) Metoda podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že vybraný vzorek spermií obsahuje část spermií přítomných v zdrojovém vzorku, tu část spermií vybranou podle vlastností a kde koncentrace selektovaných spermií ve vzorku je nižší než v zdrojovém vzorku.

3) Metoda podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že vybraný vzorek spermií obsahuje podle pohlaví vybrané spermie.

4) Metoda podle nároku 1, vy z n a č u j í c í se t í m, že vybraný vzorek spermií zahrnuje savčí spermie.

5) Metoda podle nároku 4, vy zn a č u j í c í se t í m, že vybraný vzorek spermií zahrnuje bovinní spermie.

6) Metoda podle nároku 4, vy z n a č u j í c í se t í m, že vybraný vzorek spermií zahrnuje koňské spermie.

7) Metoda podle nároku 4, vyznačující se tím, že vybraný vzorek spermií zahrnuje prasečí spermie.

8) Metoda podle nároku 1,vyznačující se tím, že vybraný vzorek spermií zahrnuje spermie vybrané metodou ze skupiny metod zahrnující průtokovou cytometrii, magnetické techniky, sloupcové techniky, gravimetrické techniky, biochemické techniky, techniku založenou na motilitě spermií, techniku založenou na elektrických vlastnostech spermií a jejich kombinací.

9) Metoda podle nároku 8, vyznačující se tím, že vzorek spermií byl vybrán pomocí průtokové cytometrie.

10) Metoda podle nároku 1, vy zn a č u j í c í se t í m, že chlazení se provádí snižováním teploty vzorku vybraných spermií k 5°Celsia.

11) Metoda podle nároku 10, v y z n a č u j í c í se t í m, že chlazení se provádí během doby přibližně 60 minut až 240 minut.

12) Metoda podle nároku 1, vy zn a č u j í c í se t í m, že finální extender přidávaný k uvedenému vzorku vybraných spermií obsahuje, v doplnění k kryoprotektantu, jednu nebo více z následujících součástí: komponentu, která udržuje osmolalitu a pufruje pH, anorganickou sloučeninu, která snižuje chladový šok a udržuje fertilitu spermií, zdroj energie, sloučeninu, která facilituje kapacitami spermií, a antibiotikum.

13)Metoda podle nároku 12, vy zn a č u j í c í se t í m, že je uvedený kryoprotektant vybraný ze skupiny, složené z disacharidů, trisacharidů a jakékoli jejich kombinace.

14)Metoda podle nároku 12, vy z n a č u j i c i se t i m, že je uvedený kryoprotektant vybraný ze skupiny, složené z glycerolu, dimethyl sulfoxidu, ethylen glycerolu, propylen glyceloru a jakékoliv jejich kombinace.

15)Metoda podle nároku 12, vy zn a č u j í c í se t i m, že uvedená komponenta, která udržuje osmolalitu a pufruje pH je vybraná ze skupiny, složené z pufrů obsahujících soli, z pufrů obsahujících karbohydrát a některé jejich kombinace.

16)Metoda podle nároku 12, vy zn a č u j í c í se t í m, že uvedená komponenta, která udržuje osmolalitu a pufruje pH je vybraná ze skupiny složené z citrátu sodného, tris (hydroxymetyl)aminometanu, N- tris (hydroxymetyl)metyl 2-aminometansulfonové kyseliny, glutamátu monosodného, mléka, pufrovacího media HEPES a nějaké jejich kombinace.

17) Metoda podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedená organická komponenta je vybraná ze skupiny, která se skládá z vaječného žloutku, výtažku z vaječného žloutku, mléka, výtažku z mléka, kaseinu, albuminu, lecitinu a nějaké jejich kombinace

18)Metoda podle nároku 12, vy zn a č u j í c í se t í m, že uvedený zdroj energie je monosacharid vybraný ze skupiny zahrnující glukózu, fruktózu, manózu a některou jejich kombinaci.

·»·

19) Metoda podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se t í m, že uvedené antibiotikum je vybrané ze skupiny, která obsahuje tylozin, linkomycin, linko-spektin, spektinomycin, penicilín, streptomycin a nějakou jejich kombinaci.

20)Metoda podle nároku 1, vy zn a č u j í c i se t í m, že po přidání finálního extenderu vzorek spermií a respektive suspenze spermií, obsahuje glycerol, citrát sodný, tris(hydroxymetyl)aminometan, vaječný žloutek, fruktózu a jedno nebo více antibiotik.

I <

21)Metoda podle nároku 1,vyznačující se tím, že po přidání finálního extenderu vzorek spermií a respektive suspenze spermií, obsahuje glycerol, citrát sodný, vaječný žloutek a jedno nebo více antibiotik.

22)Metoda podle nároku 1, vy zn a č u j í c í se t í m, že po přidání finálního extenderu vzorek spermií a respektive suspenze spermií, obsahuje glycerol, vaječný žloutek, mléko, fruktózu a jedno nebo více antibiotik.

23)Metoda podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že uvedený extender má pH v rozmezí okolo 6,5 až 7,5

24)Metoda podle nároku 1, vy z n a č u j í c í se t í m, že se spermie izolují z uvedeného vzorku vybraných spermií pomocí centrifugace.

25)Metoda podle nároku 24, vy zn a č u j í c í se t í m, že centrifugace umožňuje návratnost spermií nejméně 50% a až 90%.

26)Metoda podle nároku 1,vyznačující se tím, že koncentrace spermií v suspenzi před mražením je od přibližně 1 x 10⁶/ml až do 300 x 10⁶/ml.

27) Vzorek mražených vybraných spermií, vyznačující se tím, že zahrnuje část spermií přítomných v zdrojovém vzorku, část spermií je vybraná podle vlastnosti.

28) Vzorek mražených vybraných spermií podle nároku 27, vy z n a č u j í c í se t í m, že vzorek mražených vybraných spermií obsahuje podle pohlaví vybrané spermie.

29) Vzorek mražených vybraných spermií podle nároku 27, vy z n a č u j í c í se t í m, že vzorek mražených vybraných spermií obsahuje savčí spermie.

30) Vzorek mražených vybraných spermií podle nároku 29, vy zn a č u j í c í se t í m, že vzorek mražených vybraných spermií obsahuje bovinní spermie.

31) Vzorek mražených vybraných spermií podle nároku 29, vy z n a č u j í c í se t í m, že vzorek mražených vybraných spermií obsahuje koňské spermie.

32) Vzorek mražených vybraných spermií podle nároku 29, vy zn a č u j í c í se t í m, že vzorek mražených vybraných spermií obsahuje prasečí spermie.

33) Vzorek mražených vybraných spermií podle nároku 27, vyznačující se t í m, že metoda užívaná pro výběr vzorku vybraných spermií zahrnuje techniku ze skupiny skládající se z průtokové cytometrie, magnetické techniky, gravimetrické techniky, biochemické techniky, sloupcové techniky, techniky **< Γ*** • * ·«♦ » · · > · · *· ·· + » · 4 • ·♦ založené na motilitě spermií, techniky založené na elektrických vlastnostech spermií a z jejich kombinace.

34)Vzorek mražených vybraných spermií podle nároku 33, vy z n a č u j í c í se t í m, že vzorek mražených vybraných spermií zahrnuje spermie, které se vybraly pomocí průtokové cytometrie.

35) Vzorek mražených vybraných spermií podle nároku 27, vyznačující se t í m, že vzorek mražených vybraných spermií se vyrobí pomocí metody, která zahrnuje:

a) získání vzorku vybraných spermií;

b) chlazení uvedeného vzorku vybraných spermií;

c) izolaci spermií z uvedeného vzorku vybraných spermií k produkci izolovaných spermií;

d) přidání finálního extenderu k uvedeným izolovaným spermiím k produkci suspenze spermií;

e) mražení uvedené suspenze spermií.

36) Metoda vyznačující se tím, že zahrnuje užití vzorku mražených vybraných spermií podle nároku 27 pro umělou inseminaci nebo in vitro fertilizaci.

37) Metoda podle nároku 36, vy zn a č u j í c í se t í m, že užívá uvedený vzorek mražených vybraných spermií pro umělou inseminaci s použitím nízké dávky.