KR100757753B1 - 선택된 정자 세포의 동결보존 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특이적 특징에 대해 선택된 정자를 동결보존하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 방법은 성별-선택된 정자를 냉동하는데 사용된다. 본 발명의 동결보존 방법은 많은 수의 선택 방법에 의해 선택된 정자를 냉동하는데 사용될 수 있지만, 유동 세포계측법을 사용한 선택이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 냉동 정자 샘플은 예를 들어 사람, 소, 말, 돼지, 양, 고라니 및 바이슨 정자와 같은 포유류 정자를 포함한다. 냉동된 선택된 정자 샘플은 다양한 용도에 사용될 수 있다. 특히, 이 샘플은 해동되어 수정에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인공수정 또는 생체외수정을 위해 냉동된 선택된 정자 샘플을 사용하는 방법을 포함한다.
소, 인공수정, 정자, 동결보존, 냉동, 성별, 암수감별
Description
본 출원은 1999년 11월 24일자로 제출된 미국 임시 출원 번호 60/167,423의 급부를 주장한다.
본 발명은 특정한 특징에 대해 선택된 정자 세포를 냉동하는 방법, 뿐만 아니라 냉동된 선택된 정자 샘플 및 그러한 샘플의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 성별-선택된 정자를 보존하는데 유용하다.
반세기 이상 전에, 인공수정이 다양한 포유류 종을 위한 상업적 번식 도구로서 미국에 도입되었다. 인공수정은 초기에 정자 수집 현장에 상대적으로 가까운 지역에 제한되었지만, 정자의 동결보존 및 저장에서의 진보는 인공수정 또는 생체외수정용 정자의 광범위한 배급 및 상업화를 용이하게 했다.
포유류 정자 수집, 선택, 동결보존, 저장, 및 취급 기술의 더 이상의 개선은 원하는 특성을 가지는 동물을 생산하는 번식자의 능력을 증진시켰다. 예를 들어, 물리적 특징에서의 약간의 차이를 기초로 포유류 정자를 선택하는 것의 진보는 성별-형을 기초로 정자를 분리하는 것, 즉 X 또는 Y 염색체 중 하나를 함유하는 세포를 선택하는 것을 가능하게 만들었다. 이 기술은 번식자가 샘플에서 X- 또는 Y-형 정자의 상대적 퍼센트를 조작함으로써 자손의 성별을 결정할 수 있게 한다. 성별-형 또는 어떤 다른 바람직한 특징을 기초로 정자를 선택하는 능력은 유전적 진행을 가속하고, 생산 효율을 증가시키고, 가축 관리에서 보다 큰 유연성을 달성하기 위한 중요한 도구를 제공한다.
여러 가지 방법이 세포를 선택하는데 이용가능하지만, 정자의 선택 및 이어지는 프로세싱은 정자가 DNA 수선을 할 수 없다는 것과 정자의 형태 때문에 유례 없는 난제를 나타낸다. 각 정자는 머리 및 꼬리를 덮고 있는 첨체를 가지는데, 이것은 수정능력에 중요하며 상대적으로 물리적인 상처를 입기 쉽다. 이에 더하여, 정자의 수정능력은 수집과 사용 사이의 시간이 증가함에 따라 감소한다. 이용가능한 선택 방법 중 대부분이 물리적 스트레스를 수반하고 시간이 걸리기 때문에, 선택된 정자는 전형적으로, 비-선택된 세포와 비교하여 다소 손상된다. 선택 기술이 유의한 희석을 수반한다면 수정능력은 더 감소될 수 있다. 이 "희석 효과"는 정장에 있는 보호 성분의 손실로 인한 것일 수 있다고 제안되었다.
유동 세포계측법이 성별-형에 의해 정자를 선별하는데 사용되는 특히 효과적인 선택 방법이다. 그러나, 선별된 정자는 표준 인공수정 또는 생체외수정 프로토콜에서 정상적으로 겪게되는 것 이상으로 스트레스를 받는다. 특히, 유동 세포계측법은 시간이 걸리고, 유동 세포계측기의 물리적 제약 때문에, 정자는 저장에 최적이 아닌 수준까지 선별을 위해 희석되어야 한다(보통 105 내지 106/ml 정도까지). 더욱이, 종래의 패키징 및 송달 장치에 사용될 수 있도록 인공수정용으로 선별된 정자는 농축되어야 한다. 따라서, 농축 단계의 필요성은 이미 다소 손상된 정자를 추가의 물리적 스트레스에 노출시킨다.
또한, 정자의 냉동은 수정능력, 운동성, 및/또는 생육능력(viability)을 반드시 감소시키며, 선택되지 않은 정자의 냉동 기술은 잘 알려져 있지만, 선택된 정자를 동결보존하는 기술은 설명되지 않았었다.
(발명의 개요)
본 발명은 특이적 특징에 대해 선택된 정자를 동결보존하는 방법을 제공한다. 이 방법은 정자의 희석을 야기하는 방법에 의해 선택된 정자를 동결보존하는데 특히 유용하며, 이것은 이 방법이 선택된 정자 샘플로부터 정자를 분리하고, 이어서 분리된 정자에 최종 희석제(extender)를 첨가하여 바람직한 정자 농도를 가지는 현탁액을 생성하기 때문이다. 바람직한 구체예에서, 이 방법은 성별-선택된 정자를 냉동하는데 사용된다. 본 발명의 동결보존 방법은 많은 수의 선택 방법에 의해 선택된 정자를 냉동하는데 사용될 수 있지만, 유동 세포계측법을 사용한 선택이 바람직하다.
또한, 본 발명은 성별-형과 같은 특정한 특징에 대해 선택된 냉동 정자 샘플을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 냉동 정자 샘플은 예를 들어 사람, 소, 말, 돼지, 양, 고라니, 또는 바이슨 정자와 같은 포유류 정자를 포함한다. 또한, 본 발명에 따르는 냉동 정자 샘플을 포함하는 용기가 본 발명의 범위내이다.
냉동된 선택된 정자 샘플은 다양한 용도로 사용될 수 있다. 특히, 샘플은 해동되어 수정에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인공수정 또는 생체외수정을 위해 냉동된 선택된 정자 샘플을 사용하는 방법을 포함한다.
(발명의 상세한 설명)
본 발명은 선택된 정자 샘플의 저장 및/또는 수집 현장에서 떨어져 있는 현장까지의 수송을 용이하게 하는, 특정한 특징에 대해 선택된 정자의 동결보존을 허용한다. 해동하여 인공수정("AI") 및 생체외수정("IVF")와 같은 과정에 사용될 수 있는 생육가능한 정자를 얻는다. 이 결과는 잘 알려진 정자의 취약성 때문에 놀라웠다. 이전의 연구원들은 여러 선택 방법 또는 냉동보존에 관련된 스트레스가 수정능력 및/또는 생육능력에 유의한 손실을 가져온다는 것을 증명했다. 본 발명자들은 선택된 후 냉동 정자를 사용하여 임신이 달성될 수 있다는 것을 최초로 증명했다.
본 발명은 가축 관리에서의 중요한 진보를 대표하며, 그러한 과정에 사용되는 정자의 선택은 바람직한 특성을 가지는 자손의 생산을 증가시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, X 또는 Y 염색체 중 하나를 지니는 정자를 얻기 위한 선택은 자손의 성별을 콘트롤할 수 있게 하며, 이것은 젖소 또는 식용우와 같은 동물의 생산자에게 유리하다. 또한, 성별 선택은 귀한(예를 들어, 전시마 또는 경주마) 또는 멸종 위기에 처한 동물을 번식시키는데 사용된다. 본 발명이 제공하는 선택된 정자를 냉동시키는 능력은 그러한 선택 방법의 폭넓은 사용으로, 예를 들어 가축 생산 효율 및 품질을 증가시킬 수 있을 것이다.
정의
용어 "첨체" 또는 "첨체성 모자"는 정자 머리의 앞쪽 반을 덮고 있고 난자 침투에 필요한 효소를 함유하는 모자로 간주한다.
용어 "성별-형"은 정자에 존재하는 성염색체의 종류(즉, X 또는 Y 염색체)로 간주한다.
용어 "수정능획득"은 정자의 난자 침투를 용이하게 하는 첨체 효소의 방출을 야기하는 첨체 표면에서의 효소적 변화와 같은, 난자를 수정시키는 능력을 발달시키기 위해 정자가 겪는 특이적 변화로 간주한다.
정자와 관련하여 사용되는 용어 "저온보호물질"은 냉동-해동 사이클 동안 정자를 보호하여 생존 및 수정 능력 보유를 촉진하는 분자로 간주한다.
용어 "희석 효과"는 고도로 희석되었을 때 정자의 운동성 및/또는 생육능력의 빠른 감퇴로 간주한다.
본원에 사용된 용어 "선택"은 샘플이 특이적 특징의 존재 또는 부재를 기초로 세분되는 방법으로 간주한다(문맥에 다른 규정이 없다면). 따라서, "선택된 정자 샘플"은 공급원 샘플에 특이적 특징에 대한 선택을 행하여 얻어진 샘플이다. 그러므로, 선택된 정자 샘플은 공급원 샘플에 비하여 특이적 특징을 가지는 정자로 부화된다.
용어 "선별"은 형광-활성화 세포 선별기(FACS)를 사용하여 수행되는 선택 방법을 설명하기 위해 본원에 사용된다.
용어 "희석제"는 정자의 생육능력을 보존하려는 경향이 있는 어떤 배지로 간주한다. 용어 "희석(extension)"은 희석제를 사용한 정자의 희석(dilution)으로 간주한다.
용어 "초기 희석제"는 본 발명 방법의 분리 단계 전에 정자를 희석하기 위해 사용되는 배지로 간주한다.
용어 "최종 희석제"는 본 발명 방법의 냉동 단계 전에 정자를 희석하기 위해 사용되는 배지로 간주한다.
본원에 설명된 희석제에 있는 "유기 물질"은 냉각 쇼크를 감소시키고 정자의 수정능력을 보존하려는 경향이 있는 어떤 유기 물질이다.
본원에 설명된 희석제에 있는 "에너지원"은 정자가 세포 유지 및/또는 운동성을 위해 이용할 수 있는 어떤 물질 또는 기질이다.
본원에 사용된 용어 "몰랄삼투농도"는 수용액(예를 들어, 희석제)에 용해된 용질 입자의 삼투압 측정치이다. 용질 입자는 이온 및 비이온화된 분자를 모두 포함한다. 몰랄삼투농도는 물 1kg에 용해된 삼투활성입자(예를 들어, 오스몰)의 농도로서 표현된다.
동결보존 방법
본 발명은 선택된 정자를 동결보존하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의
(1) 선택된 정자 샘플을 얻는 단계;
(2) 선택된 정자 샘플을 냉각하는 단계;
(3) 선택된 정자 샘플로부터 정자를 분리하는 단계;
(4) 분리된 정자에 최종 희석제를 첨가하여 정자 현탁액을 생성하는 단계; 및
(5) 정자 현탁액을 냉동하는 단계
를 포함한다.
선택된 정자 샘플을 얻는 단계
본 발명의 동결보존 방법의 제 1 단계는 미리 선택된 정자 샘플을 얻는 단계 뿐만 아니라 공급원 샘플에 어떤 적합한 선택 방법을 행하는 단계를 포함한다. 어떤 종으로부터의 정자가 선택되어 본 발명의 방법에 따라 냉동될 수 있다. 방법은 길들여진 동물, 특히 가축으로부터의 정자 뿐만 아니라 야생 동물(예를 들어, 멸종 위기에 처한 종)로부터의 정자를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게, 선택된 정자 샘플은 포유류 정자를 함유한다. 사람 정자, 소, 말, 돼지, 양, 고라니 및 바이슨 정자가 특히 바람직하다.
일반적으로, 선택된 정자 샘플은 정상적인 생육가능한 정자를 함유한다. 이 때문에, 정자가 얻어지는 사출액은 전형적으로 적어도 약 50%, 바람직하게 적어도 약 75%의 형태적으로 정상인 정자를 가진다. 이들 구체예에서, 사출액에 있는 정자 중 일반적으로 적어도 약 40%, 바람직하게 적어도 약 60%가 전진적 운동성을 나타낸다.
혼합된 집단으로부터 세포를 선택하는 광범위한 방법이 이용가능하며, 예를 들어 세포 또는 세포 성분과 항체, 항체 단편 또는 다른 결합 파트너의 결합 및 차등 염색에 기초한 선택을 포함한다.
본 발명은 성별-형에 기초한 선택을 사용하여 본원에 예시되며, 본 발명에 사용되는 성별-선택된 정자는 X-형 정자와 Y-형 정자간 특징의 약간의 차이를 이용하는 어떤 선택 전략을 사용하여 얻어질 수 있다. 모범적인 성별-선택 방법은 자 기 기술(예를 들어, 미국 특허번호 4,276,139 참조), 칼럼 기술(예를 들어, 미국 특허번호 5,514,537 참조), 중량 기술(예를 들어, 미국 특허번호 3,894,529, 재발행 특허번호 32350, 미국 특허번호 4,092,229, 4,067,965, 및 4,155,831 참조)을 포함한다. 전기적 성질의 차이에 기초한 성별-선택은 미국 특허번호 4,083,957에 개시되며, 전기적 및 중량적 성질의 차이를 기초로 선택하는 기술은 미국 특허번호 4,225,405, 4,698,142 및 4,749,458에 논의된다. 미국 특허번호 4,009,260 및 4, 339,434는 운동성의 차이에 기초한 선택을 설명한다. 항체에 의존하는 생화학적 기술이 미국 특허번호 4,511,661, 4,999,283, 3,687,803, 4,191,749, 4,448,767에 설명되고, 미국 특허번호 5,021,244, 5,346,990, 5,439,362 및 5,660,997은 멤브레인 단백질의 차이에 기초한 선택을 설명한다.
유동 세포계측법이 형광 염료로의 차등 염색, 또는 항체 또는 핵산과 같은 형광 표지 분자와의 결합을 기초로 혼합된 집단으로부터 세포를 분리하는 바람직한 방법이다. 형광-활성화 세포 선별("FACS")에서, 세포는 조사시의 형광 강도를 기초로 상이한 집단으로 "선별"된다. FACS는 정자의 성별-선택에 사용될 수 있는데, 이것은 X 염색체가 Y 염색체보다 약간 더 많은 DNA를 함유하기 때문이다. 정자가 형광 DNA-결합 염료로 염색될 때, X-염색체를 지니는 정자는 Y-염색체를 지니는 정자보다 더 많은 염료를 흡수하며, 그러므로 두 집단이 FACS에 의해 분리될 수 있다. 이 전략은 미국 특허번호 4,362,246에 논의되었으며, 미국 특허번호 5,135, 759(Johnson)에서 상당히 확대되었다. 분리는 Cytomation, Inc.(Ft. Collins, CO)에 의해 제조된 MoFlo
유동 세포계측기와 같은 고속 유동 세포계측기의 사용을 통해 증진되었으며, 이것은 미국 특허번호 5,150,313, 5,602,039, 5,602,349 및 5,643,796, 그리고 PCT 공보번호 96/12171에 설명된다.
선택된 정자 샘플을 얻는데 사용되는 선택 방법은 정자의 생육능력을 보존하는 것이 바람직하다. 정자의 상대적 취약성 때문에, 정상적 유동 세포계측 기술은 일반적으로 정자를 선별하기 위해 변형되어야 한다. 더 구체적으로, 유동 세포계측은 염색, 희석 및 빛을 사용한 세포의 탐문을 수반한다. 이들 단계는 모두 정자의 생육능력을 감소시킬 수 있는 스트레스를 대표한다. 이들 스트레스에 대한 정자의 감수성은 종들간에서, 심지어 종 범위내의 개체간에서 변할 수 있다. 그러한 감수성은 문헌에 기록되어 있거나, 또는 실시예 1 내지 5에 설명된 것과 같은 경험적 연구에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
생육능력을 증진시키는 변형이 상기 논의된 특허 공보에 설명된다. 예를 들어 정자를 선별하기 위한 개선된 시스(sheath) 및 수집기 시스템을 제공하는 과정이 PCT 공보번호 WO 99/33956(출원 번호 PCT/US98/27909)에 설명된다. 더욱이, 하기 실시예 1 내지 7은 정자를 염색하고 선별하는 모범적인 과정을 설명한다. 실시예 3은 선별되어 냉동 정자의 해동후 운동성에 대한 레이저 강도 및 염료 농도의 효과에 대한 연구를 설명한다. 이 연구는 선별 동안 낮은 레이저 강도의 사용이 해동후 운동성을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
선택된 정자 샘플은 정자 이외의 여러 성분을 함유할 수 있으며, 주로 선택 과정 동안 정자를 보호하기 위해 첨가된 성분을 함유할 것이다. FACS의 경우에, 선택된 정자 샘플은 염색 및 선별을 위해 사용된 용액의 성분(들)을 함유할 수 있 다(예를 들어, 시스 유체(sheath fluid) 및 포착 완충액).
이에 더하여, 선택된 정자 세포는 전형적으로 희석제 또는 희석제 분획을 함유한다. 예를 들어, 글리세롤이 없는 "A 분획" 및 글리세롤을 함유하는 "B 분획"을 포함하는 "2-단계" 희석제가 잘 알려져 있다. A 분획이 먼저 정자에 첨가되고, 이어서 동일한 부피의 B 분획이 첨가된다. 이 단계를 위해, B 분획은 주로 적어도 2개의 알리쿼트로 나누어져 연속적으로 첨가되며, 예를 들어 두번째 B 분획이 첫번째의 15분 후에 첨가된다.
희석제 성분이 존재하지 않는다면, 희석제 또는 희석제 분획이 전형적으로 정자가 샘플로부터 분리되기 전에 선택된 정자 샘플에 첨가된다. 단지 일부의 희석제 성분이 존재한다면, 선택된 정자 샘플이 분리 단계 전에 완전한 희석제 또는 희석제 분획을 포함하도록 추가의 성분이 선택적으로 첨가될 수 있다. 모범적인 구체예에서, 소 정자가 유동-선별되어 A 분획의 희석제를 포함하는 선택된 정자 샘플을 생성한다(실시예 2, 3 및 4 참조). 바람직하다면, 다음에 B 분획이 분리 단계 전에 선택된 정자 샘플에 첨가될 수 있다(실시예 5 참조). 분리전 단계 희석제(또는 희석제 분획)는 냉동 전에 분리된 정자의 희석을 위해 사용되는 "최종 희석제"와 구분하기 위해 "초기 희석제"라고 명명된다. 선택된 정자 샘플이 FACS를 사용하여 선택되었다면, 초기 희석제는 선별을 위해 사용되는 시스 유체와 일치될 수 있다. 모범적인 일치된 시스 유체 및 희석제가 실시예 4에 상세히 설명된다.
선택된 정자 샘플에 사용하기 적합한 희석제는 생리적으로 허용되는 담체를 포함한다. 생리적으로 허용되는 담체는 전형적으로 수성이며, 바람직한 구체예에서는 탈이온수를 포함한다. 적합한 희석제는 통상 다음의 추가 성분 중 하나 이상을 포함한다: 저온보호물질, 몰랄삼투농도를 유지하고 pH를 완충하는 성분, 냉각 쇼크를 방지하고 정자의 수정능력을 보존하는 유기 물질, 어떤 유기 물질과 공동으로 작용하여 정자의 보존을 증진시키는 세제, 정자에 의해 쉽게 이용될 수 있는 에너지원, 냉각 쇼크로부터 정자를 보호하는 항산화제, 정자 수정능획득을 용이하게 하는 물질, 및 하나 이상의 항생제.
본 발명에 유용한 저온보호물질은 특정한 메카니즘에 의해 작용하는 것들로 제한되지는 않지만, 가장 통상적인 저온보호물질은 적어도 부분적으로 세포내 탈수를 감소시킴에 의해 작용한다. 구체적으로, 냉동은 정자를 둘러싼 배지중의 용질 농도의 증가에 의해 달성된다. 이런 용질 농도의 증가는 세포밖으로 물을 뽑아내며, 이것은 세포내 전해질 농도를 증가시킨다. 모범적인 저온보호물질은 글리세롤, 디메틸 술폭시드, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등을 포함한다. 주어진 희석제에 사용하기 적합한 저온보호물질은 정자가 유래된 종에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 글리세롤은 사람 및 소 정자의 동결보존에 사용하기 적합하지만, 일반적으로 돼지 또는 토끼 정자에는 사용되지 않는다. 그러한 선호도는 많은 상업적으로 귀한 정자에 대해 잘 알려져 있으며, 다른 종류의 정자에 대해서는 경험적으로 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명에 유용한 희석제는 몰랄삼투농도를 유지하고 완충용량을 제공하는 것을 돕는 하나 이상의 성분을 선택적으로 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예 에서, 희석제의 몰랄삼투농도는 생리적 유체와 비슷하다. 더 바람직하게, 희석제의 몰랄삼투농도는 약 280mOsm 내지 약 320mOsm의 범위내이다. 또한, pH는 바람직하게 생리적으로 허용되는 범위내이며, 더 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5의 범위내이다.
이들 범위내에서 몰랄삼투농도 및 pH를 유지하는데 도움이 되는 물질이 본 분야에 잘 알려져 있으며, 고체로서 희석제에 첨가되거나, 또는 이미 용액중에 있을 수 있다. 염을 함유하는 완충액, 탄수화물, 또는 그것들의 조합이 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예는 나트륨 시트레이트, 트리스[히드록시메틸]아미노메탄, 및 TES(N-트리스[히드록시메틸]메틸-2-아미노에탄술폰산), 및 모노소듐 글루타메이트 완충액; 밀크; HEPES-완충 배지; 및 그것들의 어떤 조합을 포함한다. 특정 용도에서 몰랄삼투농도를 유지하고 완충용량을 제공하는 것을 돕기 위해 사용되는 성분은 희석제의 다른 성분에 따라, 그리고 어떤 경우에는 정자가 유래된 종에 따라 변할 수 있다. 그러나, 본 발명에 사용되는 그러한 성분의 선택은 본 분야의 기술 수준 내이다.
또한, 냉각 쇼크에 대해 정자를 보호하고 수정 능력을 보존하는 것을 돕는 하나 이상의 유기 물질이 희석제에 포함될 수 있다. 그러한 물질은 잘 알려져 있으며, 때로 "비침투성 저온보호물질"로서 설명된다. 당업자는 본원에 설명된 동결보존 방법의 특정 용도에 적합한 유기 물질을 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 냉각 쇼크 및 희석 효과의 충격을 감소시킨다고 여겨지는 보호 성분(예를 들어, 지방단백질, 인지질, 레시틴)을 함유하는 유기 물질이 희석제에 포함될 수 있다. 적 합한 유기 물질은 이당류, 삼당류, 및 그것들의 어떤 조합을 포함한다. 모범적인 유기 물질은 난황, 난황 추출물, 밀크, 밀크 추출물, 카세인, 알부민, 레시틴, 콜레스테롤, 및 그것들의 어떤 조합을 포함한다.
또한, 희석제는 세제를 포함할 수 있다. 나트륨 도데실 술페이트(SDS)와 같은 알킬 이온 세제는 난황과 공동으로 작용하여 냉각 쇼크에 대한 보호를 증진시킨다고 보고되었다. 또한, 세포의 동결보존에 유용한 다른 세제가 희석제에 사용될 수 있으며, 특이적 용도를 위한 특정 세제의 선택은 본원에 제공된 가이던스로 미루어 보아 본 분야의 기술 수준 내이다. 예를 들어 실시예 5 참조.
바람직하게, 희석제는 정자에 의해 쉽게 이용되는 에너지원을 포함한다. 에너지원의 부재하에 정자는 세포내 인지질 및 다른 세포 성분을 산화시킬 수 있다. 따라서, 희석제에 에너지원의 포함은 세포내 저장물 및 세포 성분을 보호한다. 본 분야에 잘 알려진 바와 같이, 어떤 종래의 에너지원이 희석제에 사용될 수 있지만, 당, 특히 단당류가 편리한 에너지원을 제공한다. 희석제에 유용한 모범적인 단당류는 글루코스, 프럭토스, 및/또는 만노스를 포함한다.
하나 이상의 항산화제가 희석제에 선택적으로 포함되어 냉각 쇼크에 대한 추가적 보호를 제공할 수 있다. 모범적인 항산화제는 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 그것의 유도체 등을 포함한다. 그러나, 세포의 동결보존에 유용한 다른 항산화제가 또한 희석제에 사용될 수 있으며, 특이적 용도를 위한 특정 항산화제의 선택은 본원에 제공된 가이던스로 미루어 보아 본 분야의 기술 수준 내이다.
또한, 희석제는 정자 수정능획득을 용이하게 하는 물질을 함유할 수 있다. 여러 수정능획득 촉진제가 본 분야에 알려져 있으며, 어느 것이든 희석제에 사용될 수 있다. 예는 알파 아밀라제, 베타 아밀라제, 베타 글루쿠로니다제와 같은 효소들을 포함하며, 이것들은 바람직하다면 조합하여 사용될 수 있다.
마지막으로, 희석제는 바람직하게 항생제를 포함하며, 이것은 실질적인 박테리아 성장이 정자의 생육능력을 위협하고, 인공수정 또는 생체외수정 과정에서 숙주의 감염 위험을 증가시킬 수 있기 때문이다. 세포의 동결보존에 유용한 여러 항생제 중 어느 것이 또한 희석제에 사용될 수 있다. 적합한 항생제의 선택은 정자가 얻어지는 종, 정자 샘플의 획득 및 취급에 수반되는 과정, 및 표적이 되는 특이적 미생물(들)에 따른다. 모범적인 항생제는 티로신, 젠타마이신, 린코마이신, 스펙티노마이신, 린코-스펙틴(린코마이신과 스펙티노마이신의 조합), 페니실린, 스트렙토마이신 및 타이카실린을 포함하며, 이것들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 그러나, 당업자는 희석제에 사용하기 적합한 다른 항생제도 쉽게 결정할 수 있다.
모범적인 희석제가 하기에 그리고 실시예에 더욱 상세히 논의된다.
정자 농도는 전형적으로 공급원 샘플보다 선택된 정자 샘플에서 더 낮고, 상기 나타낸 바와 같이 FACS가 사용될 때는 희석이 중요하다. 성별-형에 기초한 전형적인 선별은 6x105세포/포착 완충액 ml의 정자를 함유하는 샘플을 생성할 수 있다. 그러한 낮은 농도는 저장에 최적이 아니므로(적어도 대부분의 시험 종에 대하여), 본 발명의 동결보존 방법은 일반적으로 선택된 정자 샘플을 농축한다.
선택된 정자 샘플을 냉각하는 단계
동결보존 방법의 제 2 단계는 전형적으로 제어된 속도로 온도를 감소시킴에 의한 선택된 정자 샘플의 냉각을 수반한다. 너무 빠른 냉각은 냉각 쇼크를 야기할 수 있으며, 이것은 멤브레인 완전성 및 세포 기능의 손실을 가져온다. 냉각 쇼크 효과의 심각성은 종들 사이에서 변하며, 냉각 속도 및 온도 범위와 같은 요인에 따른다. 적합하게 제어된 냉각 조건하에서 정자는 열적 효과에 적응할 수 있다. 실시예 2는 특히 소 정자를 냉각하는 조건을 설명하며, 다른 종들의 정자를 냉각하는 적합한 조건을 결정하는 것도 본 발명의 기술 수준 내이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 선택된 정자 샘플은 전형적으로 약 22℃ 내지 약 5℃로 냉각되고, 냉각은 일반적으로 약 60분 내지 약 24시간에 걸쳐, 바람직하게는 약 90분 내지 약 240분, 가장 바람직하게 약 90분 내지 120분에 걸쳐 수행된다. 냉각은 선택된 정자 샘플을 단순히 5℃ 환경에 두는 것을 포함하여, 어떤 편리한 방법에 의해 달성될 수 있다.
선택된 정자 샘플로부터 정자 세포를 분리하는 단계
선택된 정자 샘플의 초기 희석 후, 정자는 적어도 약 50%의 정자 회수, 더 바람직하게 약 75% 내지 약 90%의 정자 회수, 가장 바람직하게 약 80% 내지 약 90%의 정자 회수를 제공하는 어떤 충분히 온화한 분리 방법을 사용하여 샘플로부터 분리된다. 분리 단계 동안, 냉각된 정자는 일반적으로 계속 냉각되어야 하는데, 즉 약 1℃ 내지 약 8℃, 바람직하게 4℃ 또는 5℃ 근처를 유지해야 한다.
현탁액으로부터 세포를 회수하는데 적합한 여러 방법 중 어느 것이 정자를 분리하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 여과, 침강, 및 원심분리를 포함한다. 모범적인 바람직한 구체예에서, 선택된 정자 샘플은 약 27ml를 초과하지 않는 부피로, 바람직하게 약 20ml 내지 약 27ml의 부피로 50ml 튜브에 알리쿼트된다. 원심분리는 약 4℃에서 약 850xg으로 약 20분간 수행된다. 바람직하게, 원심분리 단계는 적어도 약 50% 내지 약 90%의 정자 회수, 더 바람직하게 약 60% 내지 약 90%의 정자 회수, 가장 바람직하게 약 70% 내지 약 90%의 정자 회수를 제공한다. 분리 후 상청액이 제거되고, 온화하게 와동시키거나 또는 4℃에서 반복하여 아스피레이션함에 의해 펠렛이 현탁된다. 다음에, 정자 농도가 전형적으로 측정된다(예를 들어, 혈구계수기를 사용하여).
분리된 정자 세포의 최종 희석 단계
분리 후 정자는 모아지고, 바람직하다면 최종 희석제를 사용하여 냉동하기 적합한 농도로 희석된다. 최종 희석후 및 냉동전 정자의 농도는 바람직하게 약 1x106/ml 내지 약 300x106/ml, 더 바람직하게 약 10x106/ml 내지 약 50x106/ml, 가장 바람직하게 약 10x106/ml 내지 약 20x106/ml의 범위내이다.
또한, 상기 초기 희석제에 대한 설명은 최종 희석제에도 적용되며, 최종 희석제는 초기 희석제와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 특정한 구체예에서, 최종 희석제로 희석된 정자 샘플의 조성은 초기 희석제의 첨가 후 정자 샘플의 조성과(동일하지 않다면) 실질적으로 유사하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 난황-트리스 희석제가 사용된다. 희석제의 첨가 후, 정자 현탁액은 글리세롤(저온보호물질); 시트르산 및 트리스[히드록시메틸]아미노메탄(완충액); 난황(유기 물질); 프럭토스(에너지원); 티로신, 젠타마이신 및 린코-스펙틴(항생제)을 포함한다. 분리된 정자에 최종 희석제를 첨가한 후 이들 성분의 전형적인 대략의 농도는 다음과 같다.
특히 소 정자를 냉동하는데 적합한 이 구체예의 변형에서, 분리된 정자에 최종 희석제를 첨가한 후 이들 성분의 농도는 탈이온수중의 약 6%(vol/vol) 글리세롤, 약 65mM 시트르산, 약 200mM 트리스[히드록시메틸]아미노에탄, 약 20%(vol/ vol) 난황, 약 56mM 프럭토스, 약 50㎍/ml 티로신, 약 250㎍/ml 젠타마이신, 및 약 150/130㎍/ml 린코-스펙틴(즉, 150㎍/ml 린코마이신 및 300㎍/ml 스펙티노마이신)이다.
다른 구체예에서는 난황-시트레이트 희석제가 사용된다. 희석제의 첨가 후, 정자 현탁액은 글리세롤(저온보호물질); 나트륨 시트레이트(완충액); 난황(유기 물질); 티로신, 젠타마이신, 및 린코-스펙틴(항생제)을 포함한다. 분리된 정자에 최 종 희석제를 첨가한 후 이들 성분의 전형적인 대략의 농도는 다음과 같다.
소 정자를 냉동하기 위한 모범적인 바람직한 농도는 약 7%(vol/vol) 글리세롤, 약 72mM 나트륨 시트레이트, 약 20%(vol/vol) 난황, 약 50㎍/ml 티로신, 약 250㎍/ml 젠타마이신, 및 약 250/300㎍/ml 린코-스펙틴이다.
다른 구체예에서는 난황-TES-트리스("EY TEST") 희석제가 사용된다. 희석제의 첨가 후, 정자 현탁액은 글리세롤(저온보호물질); 난황 및 가열된 밀크, 예를 들어 1.25% 프럭토스와 10% 글리세롤을 함유하는 균질 밀크(유기 물질); 티로신, 젠타마이신, 및 린코-스펙틴(항생제)을 포함한다. 분리된 정자에 최종 희석제를 첨가한 후 이들 성분의 전형적인 대략의 농도는 다음과 같다.
소 정자를 냉동하기 위한 모범적인 바람직한 농도는 약 5%(vol/vol) 글리세 롤, 약 158mM 트리스[히드록시메틸-메틸]-2-아미노에탄술폰산, 약 72mM 트리스[히드록시메틸]아미노메탄, 약 20%(vol/vol) 난황, 약 8mM 프럭토스, 약 100㎍/ml 티로신, 약 500㎍/ml 젠타마이신, 및 약 300/600㎍/ml 린코/스펙틴이다.
본 발명의 다른 구체예에서는 밀크 희석제가 사용된다. 희석제의 첨가 후, 정자 현탁액은 글리세롤(저온보호물질); 가열된 균질 밀크(유기 물질); 프럭토스(에너지원); 및 티로신, 젠타마이신, 및 린코-스펙틴(항생제)을 포함한다. 분리된 정자에 최종 희석제를 첨가한 후 이들 성분의 전형적인 대략의 농도는 다음과 같다.
소 정자를 냉동하기 위한 모범적인 바람직한 농도는 약 90% 밀크, 약 10% (vol/vol) 글리세롤, 약 1.25% 프럭토스(wt/vol?), 약 50㎍/ml 티로신, 약 250㎍/ ml 젠타마이신, 및 약 250/300㎍/ml 린코-스펙틴이다.
또한, 정자를 냉동하는데 표준적으로 사용되는 다른 희석제가 선택된 정자를 냉동하는데 최종 희석제로써 사용될 수 있다. 여러 종으로부터의 정자를 냉동하는데 사용하도록 최적화된 다양한 희석제가 설명되며, 많은 것이 상업적으로 이용가능하다. 말 정자용 냉동 희석제는 전형적으로 밀크, 난황, 여러 가지 당, 전해질 및 저온보호물질로 구성된다. 모범적인 냉동 희석제가 Squires, E. L. 등, Cooled and Frozen Stallion Semen Animal Reprod. and Biotechnology Laboratory, Bulletin No. 69, Chapter 8,"Seminal Extenders" pp. 49-51 (7, 1999)에 설명된다.
정자의 평형화 및 냉동 단계
정자 샘플의 희석은 정자 현탁액을 생성하며, 다음에 이것이 냉동용 용기로 옮겨진다. 정자가 수정에 사용되도록 의도된다면, 세포는 수정을 달성하기에 충분한 개별 용량으로 편리하게 알리쿼트된다. 필요한 용량은 종들 사이에서 실질적으로 변할 수 있으며, 이것은 잘 공지되어 있거나(예를 들어, 소 및 말에 대해) 쉽게 결정될 수 있다. 성별-선택된 소 정자의 경우, 편리한 용량은 약 1.0x106 정자 내지 약 3.0x106 정자 범위이다.
예를 들어, 앰플, 바이알, 및 스트로를 포함하는 어떤 적합한 용기가 냉동에 사용될 수 있다. AI용 정자는 전형적으로 수정 총과 함께 사용하도록 디자인된 스트로(예를 들어, 0.25ml 또는 0.50ml 스트로)에 냉동된다. 바람직하게, 거환 희석제는 정자가 스트로의 어느 한쪽 말단에서 정자와 거환 희석제를 분리하는 공기층에 의해 어느 한쪽 편에 몰리도록 공기, 정자, 공기, 희석제의 순서로 스트로에 인입된다.
냉동 전에 정자는 일반적으로 약 5℃에서 평형화된다. 바람직하게, 정자는 약 1시간 내지 약 18시간, 더 바람직하게 약 3시간 내지 약 18시간, 가장 바람직하 게 약 3시간 내지 약 6시간 범위내의 기간 동안 평형화하도록 허용된다(실시예 2 참조).
평형화 후 어떤 표준 냉동 방법이 사용될 수 있는데, 단 냉동 속도가 너무 빠르지 않아야 한다(즉, 약 0.5℃/분을 초과하지 않는). 바람직하게 냉동 속도는 약 0.5℃/분이다. 모범적인 바람직한 구체예에서, 정자는 정류상태의 액체 질소 증기에 두어지고, 냉동이 약 10분간에 걸쳐 3개의 분리된 단계로 수행된다. 제 1 냉동 단계에서, 정자는 약 40℃/분 내지 약 65℃/분의 속도로 약 5℃ 내지 약 -15℃까지 냉각된다. 제 2 냉각 단계에서, 정자는 약 25℃/분 내지 약 35℃/분의 속도로 약 -15℃ 내지 약 -60℃까지 냉각된다. 제 3 단계에서, 정자는 약 -100℃에서 액체 질소에 담가진다.
선택된 정자 샘플
냉동 방법에 더하여, 본 발명은 특정한 특징에 대해 공급원 샘플로부터 선택된 정자를 포함하는 냉동 정자 샘플을 제공한다. 정자는 냉동 방법에 관하여 상기 논의된 것들 중 어느 것을 포함하여, 어떤 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명은 상술된 것들과 같은 어떤 적합한 방법에 의해 어떤 특징에 대해 선택된 냉동 정자를 포함한다. 바람직한 구체예는 냉동된 성별-선택된 사람, 소, 말, 돼지, 양, 고라니, 또는 바이슨 정자를 포함한다. 바람직하게, 성별-선택은 상기에 일반적으로 설명된 유동 세포계측법을 사용하여 수행된다.
또한, 본 발명의 범위내에는 본 발명에 따르는 냉동 정자 샘플을 함유하는 용기가 있다. 용기는 냉동 정자 샘플과 반응하지 않는 어떤 재료로 형성될 수 있 으며, 의도된 용도를 위한 샘플의 사용을 용이하게 하는 어떤 모양 또는 다른 특징을 가질 수 있다. AI에 사용되는 샘플에 대해서, 예를 들어 용기는 수정 총과 함께 사용하도록 디자인된 스트로(예를 들어, 0.25ml 또는 0.5ml 스트로)가 편리하다. 용기는 전형적으로 -80℃ 이하의 의도된 저장 온도에서 샘플을 보존하기에 적합한 어떤 방식으로 밀봉된다. 0.25ml 스트로는 예를 들어 PVC 분말을 사용하여 초음파적으로, 또는 면-폴리비닐 마개 및/또는 스테인레스스틸 볼(BB)을 사용하여 밀봉될 수 있다.
본 발명의 냉동 정자 샘플이 전형적으로 사용하기 전에 해동되므로, 또한 본 발명은 이전에는 냉동 상태였던 해동된 선택된 정자 샘플 및 그러한 해동된 샘플을 포함하는 용기를 제공한다.
선택된 정자 샘플의 사용 방법
본 발명의 냉동된 선택된 정자 샘플은 정자가 사용되는 어떤 방법에도 사용하기 적합하다. 샘플은 해동되어 인공수정 또는 생체외수정과 같은 어떤 종래의 수정 방법에 사용될 수 있다. 해동은 냉동된 비-선택된 정자와 동일한 방식으로 수행된다. 간단히 말해서, 냉동 정자를 함유하는 스트로를 약 20초 내지 약 30초 동안 약 35℃ 내지 약 37℃의 온도에서 유지된 수욕에 담근다. 해동 후 정액 부착(deposition)(예를 들어, 수정)이 환경적 동요로부터 정자를 보호하기 위해 조심하면서 표준 과정에 따라서 수행된다.
실시예 1
정자에 대한 희석 효과
목적: 비-냉동된, 비-저장된, 그러나 고도로 희석된 정자에 대해 정자 운동성에 대한 정자 농도의 효과를 측정한다.
A. 비-세척된 정자에 대한 희석 효과
1. 공급원 샘플의 수집
정자를 Schenk J., Proc 17th NAAB, p. 48-58 (1998), 및 Saacke RG, Proc NAAB Tech Conf AI Reprod. 41:22-27 (1972)에 설명된 인공질을 사용하여 통상의 수집 스케쥴에 따라 황소로부터 수집했다. 사용된 모든 사출액은 50% 이상의 전진적인 운동성이 있는 정자 및 75% 이상의 형태학적으로 정상인 정자를 함유했다. 항생제를 Shin S., Proc NAAB Tech Conf AI Reprod. 11:33-38 (1986)에 설명된 바대로 수집후 15분내에 가공하지 않은 사출액에 첨가하고, 정자의 농도를 분광광도계를 사용하여 측정했다.
2. 방법
4마리의 황소로부터의 정자를 72mM 나트륨 시트레이트, 50Tg/ml 티로신, 250 Tg/ml 젠타마이신 및 250/300Tg/ml 린코-스펙틴 중에 20% 난황(vol/vol)을 사용하여 제조된 난황-시트레이트 희석제(EYC)를 사용하여 1.25, 2.5, 5, 10, 15, 및 20x106/ml로 희석했다. 각 샘플을 중복(2튜브/희석/황소) 제조하고, 튜브 당 총부피를 8ml로 했다. 모든 샘플을 22℃에서 60분간 인큐베이션한 후, 진동 버킷 원심분리기(에펜드로프, 모델 #5810R)를 사용하여 600xg로 10분간 원심분리하여 정자를 농축했다. 원심분리 후 한 세트의 중복 튜브로부터 상청액을 제거하지 않고, 정자를 5ml 혈청 피펫을 사용하여 부드럽게 아스피레이션을 반복하여 동일한 배지에 원래 농도로 현탁했다(두번째 세트의 중복 튜브는 실시예 1B에서 사용했다). 다음에, 정자 샘플을 90분에 걸쳐서 0.2℃/분으로 5℃까지 냉각했다. 이들 정자를 "비-세척된 정자"로 명명했다. 모든 샘플을 수집후 24시간 또는 48시간 동안 5℃에서 인큐베이션했다.
3. 운동성의 평가
인큐베이션 후 샘플을 운동성을 측정하기 전 10분간 드라이 블록 인큐베이터를 사용하여 37℃로 가온했다. 이 실험에서 전진적으로 운동하는 정자의 퍼센트에 대한 단일 맹검 추정을 각 샘플에 대해 측정했다. 전진적 정자 운동성을 1명의 관찰자가 각 서브클래스에 대해 주관적으로 측정했고(x200, 위상차 현미경), 다른 사람이 관찰자가 알지 못하는 처리를 하여 무작위적 방식으로 현미경 슬라이드를 제조했다.
4. 통계적 분석
데이타를 황소 및 초기 희석 농도의 인자를 사용한 변수 분석(SAS Institute , Cary, North Carolina)에 의해 분석했다. 개별 분석을 각 인큐베이션 시간에 대해 행했다. 희석 경향을 (log) 선형 대비를 사용하여 시험했다.
5. 결과
비-세척된 정자에 대한 데이타(표 1)로 두 인큐베이션 시간이 (log) 선형 관 계(P<0.01)임이 밝혀졌다. 운동성 정자의 퍼센트는 정자 농도가 1.25x106/ml에서 10x106/ml까지 증가함에 따라 증가했지만, 그후에는 거의 차이가 없었다. 세제곱 항목은 24시간 인큐베이션에 대해 유의(P<0.05)했으며, 48시간에 대해서는 최소한으로 유의(P<0.1)했다. 두 시간 모두 황소 효과(P<0.01)가 있었다.
B. 세척된 정자에 대한 희석 효과
1. 공급원 샘플의 수집
실시예 1A에서 제조된 샘플을 함유하는 두번째 세트의 중복 튜브를 이 실험에 사용했다.
2. 방법
정자를 실시예 1A에서처럼 희석하고, 인큐베이션하고, 원심분리하여 농축했다. 원심분리 후 7.1ml의 상청액을 각 튜브로부터 아스피레이션하여 대부분의 정장을 제거하고 정자를 900㎕의 펠렛에 남겼다. 정자를 EYC(실시예 1A 참조)로 희석하여 10x106/ml 또는 20x106/ml 정자 현탁액을 만들었다. 다음에, 이 샘플을 실시예 1A에서처럼 90분에 걸쳐 5℃로 냉각했다.
3. 운동성 평가
샘플을 실시예 1A에서처럼 가온하고 전진적 운동성에 대해 평가했다.
4. 통계적 분석
데이타를 실시예 1A에서처럼 분석했다. 이에 더하여, 실시예 1B의 데이타를 5℃에서의 인큐베이션 농도에 대해 분석했다.
5. 결과
세척된 정자에 대한 데이타로 정자를 24시간 후 평가했을 때 유의한 치료 효과가 없음이 밝혀졌다. 그러나, 5℃에서 48시간 동안 저장한 후에는 황소, 초기 희석, 인큐베이션 농도 및 황소x인큐베이션 효과(P<0.05)가 있었다. 10x106/ml보다 20x106/ml에 유지했을 때 더 많은 정자가 운동성을 보유했다(31% 대 20%; P<0.05). 1.25, 2.5 및 5x106정자/ml의 초기 희석은 10x106정자/ml보다 더 낮은 전진적 운동성을 야기했으며, 주효과 평균은 각각 19, 20, 27, 및 37% 운동성 정자였다.
C. 결론
고도의 정자 희석 및 냉각은 정장의 존재 또는 제거에 관계 없이 운동성 정자 퍼센트에 실질적인 감소를 야기했다. 그러나, 이 희석 효과는 5℃에서 저장하기 전에 10x106/ml, 더욱이는 20x106/ml으로 희석된 정자를 농축함에 의해 대단히 약화되었다. 어떤 황소의 정자는 다른 황소의 정자보다 희석을 더 잘 견뎠지만, 발견된 황소 차이는 전형적이었다. 극도로 희석한 정자는 정장에 있는 보호 화합물의 제거에 의해 부분적으로 선별 동안 손상될 수 있다.
실시예 2
선별된 정자의 냉동전 평형화 시간의 효과
목적: 유동-선별된 정자에 대한 냉동전 평형화 시간(3, 6 및 18시간, 5℃)의 효과를 평가한다.
다음의 실험을 동일한 황소를 사용하여 그대로 반복했다.
1. 공급원 샘플의 수집
4마리의 황소의 정자를 실시예 1A에 설명된 대로 수집하여 제조했다.
2. 방법
a) 염색 및 선별 준비
i) 염색 스톡 용액의 제조: 8.89mM Hoechst 33342(비스-벤조이미드 H-33342; #190305, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH)의 스톡 용액을 탈이온수중에 제조했다.
ii) 정자 염색 과정: 정자를 변형된 TALP 완충액(표 3)으로 400x106정자/ml로 희석했다. 희석 후 Hoechst 33342 염료를 정자 현탁액에 224μM의 농도로 첨가했다. 염료를 정자 현탁액에 첨가한 후, 샘플을 34℃에서 60분간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 정자를 2.67% 정화된 난황, 및 손상된 세포 멤브레인을 가지는 정자에서 Hoechst 33342의 형광을 퀀칭하여 그것들을 선별 과정 동안 게이트 아웃되게 만드는 0.002% 식용색소(FD&C #40)를 함유하는 TALP를 사용하여 100x106/ml로 희석했다. 유동 선별 직전에 샘플을 40㎛ 나일론 메시 필터를 통해 단위 중력에서 여과하여 어떤 잔해 및/또는 군집된 정자를 제거했다.
b) 선별: 351 및 364nm 및 150mW에서 작동하는 2-라인 아르곤 레이저를 사용하여 Hoechst 33342 염료를 여기시켰다. 사용된 유동 세포계측기/세포 선별기는 50psi에서 작동하는 SX MoFLo
(Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA)였다. 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(트리스; 197.0mM; #T-1503, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 시트르산 일수화물(55.4mM; #C-7129, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 및 프럭토스(47.5mM; #F-0127, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로 구성된 트리스-기제 시스 유체를 사용했다. 0.58g/L 페니실린 및 0.05g/L 스트렙토마이신 술페이트로 구성된 베이스라인 항생제를 또한 트리스-기제 시스 유체에 첨가했다.
정자를 대규모의 실시예가 합리적인 시간내에 행해질 수 있도록 다수의 정자를 빠르게 축적하는 "벌크 선별"로서 언급되는 과정에 의해 선별했다. 정자는 표준 작동 조건하에서 유동 세포계측기를 통과했으며, 예외적으로 생육가능한 정자를 함유하는 모든 방울은 특이적 특징(예를 들어, 성별-형에 의한 선별)을 기초로 2개의 튜브에 선별하기보다는 오히려 단일 튜브에 수집했다. 정자를 생육능력에 근거하여 선별했고, 이로써 손상된 혈장 멤브레인을 가지는 정자는 벌크 선별 동안 배제되었다.
염색된 정자를 선별 동안 22±1℃에 유지했다. 벌크 선별된 정자를 탈이온수중의 200mM 트리스, 65mM 시트르산, 56mM 프럭토스, 50Tg/ml 티로신, 250Tg/ml 젠타마이신, 및 150/300Tg/ml 린코-스펙틴중에 20% 난황(vol/vol)을 사용하여 제조된 20% 난황-트리스 희석제 2ml를 함유하는 50ml 플라스틱 튜브에 수집했다. 이 난황-트리스 희석제를 "트리스-A 분획"이라 명명하여, 과정의 이 시점에서는 글리세롤이 없다는 것을 표시했다. 정자를 12ml 및 대략 6x106 정자를 함유하도록 튜브 에 수집했다. 이어서 정자를 3시간 동안 22℃에서 인큐베이션하여 성별-형에 기초한 선별 조건을 시뮬레이션했다.
c) 냉동 준비: 인큐베이션 후 선별된 정자를 70분에 걸쳐 5℃로 냉각했다. 냉각 후 2개 튜브의 내용물을 모으고, 5℃에서 냉장된 진동 버킷 원심분리기 세트로 옮겨서 20분간 850xg으로 원심분리했다. 상청액을 제거한 후, 약 150㎕의 정자 펠렛에 약 150㎕의 트리스-A 분획 희석제를 첨가함에 의해 5℃에서 프로세싱을 계속하여, 정자 농도를 대략 40x106/ml로 만들었다. 개별 황소의 정자를 모으고 12%(v/v) 글리세롤을 함유하는 난황-트리스 희석제("트리스-B 분획")를 동일 부피 사용하여 즉시 희석했다. 트리스-B 분획을 15분 간격으로 2번 동일한 부피로서 정자 현탁액에 첨가하여, 최종 정자 농도를 20x106/ml로 맞췄다. 정자를 함유하는 완전 난황-트리스 희석제의 최종 글리세롤 농도는 6%(v/v)였다.
d) 평형화 및 냉동: 다음에, 희석된 정자를 0.25ml 염화폴리비닐 스트로에 팩키지하여 정류상태의 액체 질소 증기중에 있는 선반 위에서 통상의 과정에 의해 냉동했다. 4마리의 황소 각각으로부터의 2개 스트로를 5℃에서 3, 6 및 18시간의 총 평형화 시간 후 냉동했다.
3. 해동후 운동성의 평가
스트로를 30초간 37℃ 수욕에서 해동했다. 전진적 운동성에 대한 맹검 추정을 해동후 0, 1 및 2시간 동안 37℃에서 샘플을 인큐베이션한 후 행했다. 2명의 관찰자가 각각 2개 스트로의 정액 각각에 대해 전진적 운동성을 추정했다. 각 실험 단위에 대한 이들 4번의 맹검 추정이 부표본을 대표한다.
4. 통계적 분석
통계적으로, 부표본을 최소제곱법 ANOVA의 서브플롯 대 메인플롯으로서 분석하여, 어떤 관찰자 및 관찰자x처리 상호작용의 효과를 분석했다. N은 부표본이 아니라 실험 단위의 수로 간주한다. 표준 오차를 ANOVA의 오차 평균 제곱 및 실험단위수로부터의 4개 부표본의 평균을 기초로 계산했고, 최소제곱법 평균을 나타낸다.
처리 효과를 각 인큐베이션 시간에 대한 개별 ANOVA에 의해 평가했다. 이 모델은 무작위 효과로서 황소를, 그리고 고정 효과로서 평형화 시간 및 관찰자를 포함했다. 서브플롯은 관찰자 항목 및 관련 상호작용으로 구성했다.
5. 결과
전진적으로 운동하는 정자의 퍼센트에 근거했을 때, 0시간 및 1시간(P<0.01)의 해동후 인큐베이션에 대해 3시간 또는 6시간 평형화 시간이 18시간보다 우수했지만(표 4), 2시간 인큐베이션에 대해서는 아니었다. 황소 효과는 1시간 및 2시간 인큐베이션 시간에서 명백했지만(P<0.05), 0시간에서는 아니었다. 유의한(P>0.1) 황소x평형화 시간 상호작용은 없었으며, 어떤 반응에 대한 유의한 관찰자 효과도 없었다.
6. 결론
결과는 5℃에서 3시간 내지 6시간의 총 평형화 시간에서 해동후 정자 운동성의 차이는 없지만, 냉동전 5℃에서 18시간 평형화한 후에는 정자 운동성에 유의한 퇴보가 있었음을 나타냈다. 3시간 내지 6시간 범위는 해동후 운동성의 감소 없이 정자를 냉동하기 위한, 2번의 연속하는 3시간 선별 배치를 종합하는 것을 허가한다.
황소x평형화 시간 상호작용은 유의하지 않았으므로, 3시간 내지 6시간 평형화가 적합했으며, 4마리의 황소만을 사용했다는 것이 주의사항이다. 소수의 황소에 대한 최적 평형화 시간은 >6시간일 것으로 예상된다.
실시예 3
선별된 정자에 대한 염색 농도 및 레이저 파워의 효과
목적: 유동-선별된 정자에 대한 레이저 강도와 조합된 Hoechst 33342 염료 농도의 효과를 평가한다.
1. 공급원 샘플의 수집
6마리의 황소의 정자를 실시예 1A에 설명된 대로 수집하여 제조했다.
2. 방법
a) 실험 디자인: 1 사출액(2마리 황소) 및 다른 날짜의 2 사출액(4마리 황소)을 2x2 디자인 + 대조표준에 사용했다.
b) 염색 및 선별: Hoechst 33342 염료를 149TM 또는 224TM의 최종 농도로 정자 현탁액에 첨가한 것을 제외하고, 염색, 선별 준비 및 정자 선별을 실시예 2에서 설명된 대로 달성했고, 정자를 100mW 또는 150mW의 입사 파워에서 작동하는 레이저를 사용하여 벌크-선별했다. 벌크-선별된 정자를 실시예 2에 설명된 대로 50ml 플 라스틱 튜브에 수집했다. 대략 15x106총정자/튜브를 함유하는 4개의 튜브를 각 황소에 대해 1시간에 걸쳐 수집했다. 선별된 정자를 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 더 긴 선별 시간을 시뮬레이션했다.
c) 냉동 준비: 인큐베이션 후 정자를 실시예 2에서처럼 냉각했다. 다음에, 정자를 20분간 850xg으로 5℃에서 원심분리기하여 농축했다. 상청액을 제거한 후, 150㎕의 트리스-A 분획 희석제를 5℃에서 각 150㎕ 정자 펠렛에 첨가했다. 모든 정자 펠렛을 부드럽게 아스피레이션을 반복하여 현탁하고, 개별 황소의 정자를 모았다. 트리스-B 희석제를 실시예 2에 설명된 대로 단계적으로 첨가했다. 각 황소에 대한 비-염색된 비-선별된 대조표준을 6% 글리세롤을 함유하는 트리스 희석제중에 20 x106정자/ml로 제조했고, 벌크-선별된 정자를 제조하는 동안 5℃로 냉각했다.
d) 평형화 및 냉동: 대조표준 및 선별된 정자를 실시예 2에 설명된 대로 0.25ml 염화폴리비닐 스트로에 패키지하고, 3시간 동안 5℃에서 평형화한 후, 종래대로 냉동했다.
3. 해동후 운동성 평가
스트로를 실시예 2에 설명된 대로 스트로를 해동하여 평가했다.
4. 통계적 분석
통계적 분석의 일반적 설명은 실시예 2에 제공된다. 구체적으로, 처리 효과를 ANOVA에 의해 평가했다. 이 모델은 메인플롯에 염료 농도, 레이저 강도 및 황소를, 그리고 서브플롯에 관찰자 및 관련 상호작용을 포함했다. 황소는 무작위적 효과 및 고정된 다른 인자로 고려했다.
5. 결과
황소 효과는 해동후 즉시(P<0.1), 그리고 37℃에서 1시간 및 2시간 인큐베이션한 후(P<0.05) 전진적으로 운동하는 정자의 퍼센트에 대해 유의했다. 어떤 인큐베이션 시간에서도 정자 운동성에 대한 염료 농도 또는 황소x염료 농도 효과는 없었다. 황소를 무작위적 효과로서 고려한 경우, 150mW의 레이저 파워는 0시간 인큐베이션에서 100mW보다 더 낮은 정자의 해동후 운동성을 야기했지만(P<0.1), 다른 인큐베이션 시간에서는 아니었다(표 5). 황소를 고정 효과로서 고려한 경우, 150mW의 파워는 세 인큐베이션 시간에서 모두 100mW(P<0.05)보다 더 낮은 정자 운동성을 야기했다. 1시간에서는 정자 운동성에 대한 황소x레이저 파워(P<0.05) 효과가 있었지만, 0시간 또는 2시간 인큐베이션 시간은 아니었다. 또한, 더 높은 레이저 파워는 0시간 및 1시간 인큐베이션 시간에서 대조표준(P<0.05)보다 더 낮은 정자 운동성을 야기했다(표 5). 1시간 인큐베이션 시간에서는 유의한 관찰자 효과가 있었지만, 0시간 또는 2시간은 아니었다. 관찰자x처리 상호작용(P>0.1)은 없었다.
6. 결론
해동후 전진적으로 운동하는 정자의 퍼센트는 염색 및 선별 프로세스에 의해 감소했다. 더 높은 레이저 강도는 낮은 레이저 강도보다 더 손상시켰다. 해동후 정자 운동성에 대한 염료 농도의 효과는 없었다. 따라서, 낮은 레이저 강도에서 정자-결합된 Hoechst 33342 염료의 여기는 손상이 적었고, 더 높은 염료 농도에서 정자를 염색하는 것은 해동후 운동성에 대한 해로운 효과를 가지지 않았다. 관찰된 손상은 아마도 정자 운동성 기계에서인 것 같다.
실시예 4
선별전 염색 과정의 평가 및 정자의 동결보존을 위한 희석제의 선택
목적: (1) 정자에 대한 3가지의 선별전 처리를 평가하고, (2) 유동-선별된 정자의 동결보존을 위한 시스 유체와 희석제 조합을 평가한다.
다음의 실험을 그대로 반복했다.
1. 공급원 샘플의 수집
4마리의 황소로부터의 정자를 실시예 1A에 설명된 대로 수집하여 제조했다.
2. 방법
a) 실험 디자인: 3(선별전 처리)x3(희석제)x2(시스 유체)x4(황소)x2(관찰자) 요인 실험을 디자인하여 선별 전에 정자를 유지하기 위한 최선의 과정을 결정하고, 선별된 정자를 동결보존하기 위한 3가지 희석제를 평가했다.
b) 샘플 제조 및 염색: 4마리의 황소 각각으로부터 신선하게 수집된 정자를 다음과 같이 처리했다.
(1) 변형된 TALP(실시예 2 참조, 표 3)중에 400x106/ml로 희석하고, 벌크-선별 전에 34℃에서 1시간 동안 염색("희석-0시간");
(2) 희석, 염색, 및 선별 전에 3시간 동안 22℃에서 순수하게 인큐베이션("순수-3시간"); 또는
(3) "희석-0시간" 대로 희석 및 염색한 후, 벌크-선별 전에 3시간 동안 22℃에서 인큐베이션("희석-3시간").
c) 희석제: 다음의 냉동 희석제를 비교했다: 7% 글리세롤을 함유하는 EYC(실시예 1 참조), 6% 글리세롤을 함유하는 난황-트리스(실시예 2 참조), 및 5% 글리세롤을 함유하는 난황-TES-트리스(TEST). EYC "A 분획"은 글리세롤을 함유하지 않는 EYC 희석제로 간주하고, EYC "B 분획"은 최종의 바람직한 글리세롤 농도의 2배(즉, 14%)를 함유하는 EYC 희석제로 간주한다. 따라서, EYC A 및 B 분획을 동일한 부피 로 조합할 때, 최종 EYC 희석제는 7% 글리세롤을 함유한다. 트리스 A 및 B 분획도 유사하게 명명되며, 실시예 2에 설명된다. TEST 희석제는 5% 글리세롤을 함유하는 완전 희석제로서 제조되며, 그러므로 TEST에는 "A" 및 "B" 분획이 없다.
d) 시스 유체: 시스 유체는 실시예 2에 설명된 대로 98.6mM 나트륨 시트레이트 이수화물(#S279-3, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) 또는 트리스 중 어느 하나였다. 두 종류의 시스 유체는 모두 pH 6.8로 맞춰졌고, 몰랄삼투농도는 약 270 내지 280mOsm/kg이었다. 트리스 시스 유체를 사용하여 정자를 수집하고, 나중에 난황-트리스 및 TEST 냉동 희석제중에서 희석시켰다. 98.6mM 나트륨 시트레이트 이수화물을 함유하는 시스 유체를 사용하여 정자를 수집하고, 나중에 EYC 냉동 희석제중에서 희석시켰다.
c) 선별: 선별전 처리, 시스 유체 및 희석제의 각 조합에 대해 대략 58x106 정자를 150mW의 입사 레이저 파워를 사용하여 실시예 2에 설명된 대로 벌크-선별했다. 각 선별을 위해서 정자를 대략 1시간에 걸쳐 수집했다. 선별 후 샘플을 2시간 동안 22℃에서 인큐베이션하여 3시간 선별을 시뮬레이션했다.
f) 냉동 준비: 인큐베이션 후 정자를 실시예 2에 설명된 대로 냉각했다. 냉각 후 샘플을 20분간 850xg으로 5℃에서 원심분리했다. 각 샘플의 총부피는 약 20ml였고, 50ml 플라스틱 튜브에 함유되었다.
상청액을 제거한 후, 정자를 희석을 위해 5℃로 냉각된 방으로 돌려보냈다. 샘플을 A-분획 EYC, A-분획 난황-트리스, 또는 TEST 희석제 69㎕에 정자 현탁액 131㎕를 분배함에 의해 40x106/ml으로 희석시켰다. 즉시, 현탁액을 부합되는 글리세롤 함유 희석제(즉, B-분획 EYC, B-분획 트리스) 또는 TEST를 첨가하여 20x106정자/ml로 맞추었다. B-분획 희석제를 실시예 2에 설명된 대로 15분 간격으로 각 샘플에 단계적으로(x2) 첨가했다. TEST를 B-분획 EYC 및 트리스 희석제와 동일한 방식으로 정자에 단계적으로 첨가했다.
g) 평형화 및 냉동: 정자를 0.25ml 염화폴리비닐 스트로에 패키지하고, 5℃에서 3시간 동안 평형화한 후, 정류상태의 액체 질소 증기중에서 냉동했다.
3. 해동후 운동성의 평가
정자의 해동중 및 해동후 평가를 실시예 2에 설명된 대로 행했다.
4. 통계적 분석
통계적 분석의 일반적 설명은 실시예 2에 제공된다. 구체적으로, 처리 효과를 각 해동후 인큐베이션 시간에 대한 변수의 개별 분석에 의해 평가했다. 메인플롯은 선별전 처리, 희석제 및 황소를 포함했고, 서브플롯은 관찰자 및 관련 상호작용으로 구성했다. 황소는 무작위적 효과 및 고정된 다른 인자로서 고려했다. 전체 실험을 2번 반복했다. 튜키 HSD 시험을 수단들을 구별하기 위해 사용했다.
5. 결과
벌크-선별된 정자의 해동후 전진적 운동성은 각 해동후 인큐베이션 시간에서 희석제 및 황소에 의해, 그리고 0시간 인큐베이션에서 선별 전 과정에 의해 영향 (P<0.05)을 받았다(표 6). 시스 유체(P>0.05)로 인한 차이는 없었다. 0시간 해동 후 인큐베이션에서 순수-3시간 처리의 사용은 다른 2가지의 선별 전 염색 처리보다 냉동 및 해동후 더 많은 운동성 정자를 야기했다(P<0.05, 표 6). 그러나, 선별 전 과정은 황소를 무작위 효과로서 고려한 경우, 1 시간 또는 2시간 동안 정자를 해동후 인큐베이션한 후에는 통계적으로 무의미했다. 중요하게도, 이들 두 인큐베이션 시간에서는 유의한 선별 전 처리x황소 상호작용(P<0.05)이 있었다. 더욱이, 선별 전 처리는 황소가 고정 효과로서 고려된 해동후 인큐베이션 시간에서 모두 유의한 효과를 가졌다.
해동후 즉시(0시간)는 TEST가 최선의 희석제였지만, 37℃에서 1 또는 2시간 인큐베이션한 후에는 트리스가 최선의 희석제였다. 중요하게도, 어떤 반응에 대한 선별 전 처리x희석제 상호작용은 없었다. 모든 인큐베이션 시간에서 관찰자 효과 (P<0.01)가 있었지만, 관찰자x처리 상호작용은 없었다. 세 인큐베이션 시간에서 모두 황소x희석제 상호작용(P<0.05)이 있었다.
6. 결론
이 연구는 희석, 염색 및 선별 전에 3시간 동안 순수하게 정자를 유지하는 것이 즉시 희석하고 0시간 또는 3시간 후 염색하는 것보다 더 좋았다는 것을 나타냈다. 따라서, 선별에서 3시간까지는, 염색되어 400x106정자/ml로 유지된 정자의 원래 샘플로 계속하는 것보다는 오히려 3시간 순수하게 유지된 원래 사출액의 새로운 알리쿼트로 계속하는 것이 최선이다.
TEST 희석제가 0시간에서 더 높은 해동후 운동성을 제공했지만, 트리스는 정자가 37℃에서 인큐베이션에 의해 스트레스를 받았을 때 더 우수한 희석제였다. 어느 시스 유체도 각 희석제에 대해 동일하게 잘 작용했다. 이들 결과를 기초로, 우리는 우리의 표준 작업 과정에 트리스 냉동 희석제와 조합된 트리스 시스 유체의 사용을 포함시킨다.
실시예 5
선별된 정자에 대한 희석제 첨가제의 효과
목적: 유동-선별된 정자에 대한 냉동 희석제에 나트륨 도데실 술페이트("SDS ")를 첨가한 효과를 평가한다.
A. 냉동 희석제중의 SDS 농도의 효과 평가
1. 공급원 샘플의 수집
6마리의 황소의 정자를 실시예 1A에 설명된 대로 수집하여 제조했다.
2. 방법
6마리의 황소 각각으로부터의 정자를 0, 0.03, 0.06, 0.09 또는 0.12%의 SDS를 함유하는 20% 전란-트리스("WET") 희석제중에 20x106/ml으로 희석하고, 스트로에 패키지하여 냉동했다. WET 희석제는 이중 증류수 100ml 당 트리스[히드록시메틸]아미노메탄 3.028g, 시트르산 일수화물 1.78g, 및 프럭토스 1.25g을 사용하여 제조했고, 이것에 20% 전란(wol/wol)을 첨가했다. WET 희석제는 약 pH 7.0에서 제조했고, 약 6%(vol/vol)의 최종 글리세롤 농도를 함유했다. 또한, WET 희석제는 페니실린 "G" 나트륨 1000IU 및 스트렙토마이신 술페이트 100Tg/ml를 함유했다.
3. 결과
각 수단(6마리의 황소 각각으로부터의 n=1 샘플)은 해동후 대략 10분에서 51, 51, 50, 51 및 48% 전진적 운동성 정자였다. 이들 결과를 기초로 0.06% SDS를 실시예 5B에 사용했다.
B. 유동-선별된 정자의 해동후 운동성에 대한 여러 냉동 희석제중에 있는 0.06% SDS의 효과 평가
1. 공급원 샘플의 수집
8마리의 황소의 정자를 실시예 1A에 설명된 대로 수집하여 제조했다.
2. 방법
해동후 운동성을 0.06% SDS를 가지거나 또는 가지지 않는 난황-트리스(실시예 2 참조) 및 WET 희석제(실시예 5A 참조)중에서 냉동 정자에 대해 연구했다. 2가지 희석제의 최종 글리세롤 함량은 모두 6%였다.
a) 염색, 선별 준비, 선별: 염색된 정자 샘플을 실시예 2에 설명된 대로 8마리의 황소 각각으로부터의 사출액으로 제조했다. 선별을 135mW의 입사 레이저 파워를 사용하여 달성했다는 것을 제외하고, 염색된 정자를 실시예 2에 설명된 대로 트리스 시스 유체를 사용하여 벌크-선별했다. 선별된 정자를 각 희석제의 A-분획 냉동 완충액 2ml를 함유하는 50ml 플라스틱 튜브에 수집하고, 각 처리에 대해 15x106의 총 선별된 정자(25ml)를 수집하여, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 더 긴 선별을 시뮬레이션했다.
b) 냉동 준비: 다음에, 희석된 정자를 90분에 걸쳐 냉각했다. 동일한 부피의 적합한 B-분획 희석제를 선별된 정자를 함유하는 50ml 플라스틱 튜브 각각에 15분 간격으로 단계적으로(2x) 첨가했다. 25ml/희석제 처리의 알리쿼트를 냉장된 원심분리기에서 850xg으로 20분간 원심분리하여 농축했다. 상청액을 제거하여 600 T1 정자 펠렛을 남기고, 이것을 15초간 온화하게 와동시켜 현탁했다. 펠렛을 함유하는 현탁액이 이미 글리세롤을 함유하므로, 정자 펠렛에 추가의 희석제를 첨가하지 않았다. 정자 현탁액의 농도는 대략 20x106/ml였다. 각 황소에 대한 비-염색된 비-선별된 대조표준을 6% 글리세롤을 함유하는 난황-트리스 희석제중에 20x106정자/ ml로 제조했다. 대조표준을 벌크-선별하는 동안 5℃로 냉각된 방에 두었다.
c) 평형화 및 냉동: 모든 대조표준 및 벌크-선별된 정자를 패키지하고 동시에 냉동했다. 정자를 0.25ml 염화폴리비닐 스트로에 패키지하고, 5℃에서 약 3시간 내지 약 6시간 동안 평형화한 후, 정류상태의 액체 질소 증기중에서 냉동했다.
3. 해동후 운동성 평가
전진적 운동성을 인큐베이션 후 0.5 및 2.0시간에서 평가했다는 것을 제외하고, 정자의 해동중 및 해동후 평가를 실시예 2에 설명된 대로 행했다.
4. 통계적 분석
통계적 분석의 일반적 설명은 실시예 2에 제공된다. 구체적으로, 처리 효과를 각 인큐베이션 시간에 대한 변수의 개별 분석에 의해 평가했다. 이 모델은 메인플롯에 황소 및 희석제를, 그리고 서브플롯에 관찰자 및 관련 상호작용을 포함했다. 평균의 차이를 최소 유의차 시험에 의해 측정했다.
5. 결과
희석제는 0.5시간 또는 2시간 해동후 인큐베이션 후 정자의 전진적 운동성에 영향(P<0.05)을 미쳤다(표 7). 0.5시간에서 WET + SDS는 SDS를 가지는 트리스보다 더 낮은 운동성을 야기했다. 2시간에서 벌크-선별된 정자를 사용한 모든 처리는 비-선별된 대조표준 정자보다 나빴다. 두 인큐베이션 시간에서 모두 유의한 황소 및 관찰자 효과(P<0.01)가 있었지만, 관찰자x처리 상호작용은 없었다.
6. 결론
트리스 또는 WET 희석제에 SDS의 포함은 해동후 운동성의 시각적 추정에 의해 측정된 바대로 정자 품질에 이익이 되지 않았다. 또한, WET 및 트리스 희석제를 사용한 결과는 유사했으며, 그러므로 WET는 선별된 소 정자를 동결보존하는데 트리스만큼 효과적임이 분명했다.
실시예 6
현장 시험용의 유동 선별에 의해 암수감별된 정자의 품질
목적: 첨체 완정성을 기초로 선별된 정자의 해동후 품질을 평가한다.
1. 공급원 샘플의 수집
3마리의 황소의 정자를 실시예 1A에 설명된 대로 수집하여 제조했다.
2. 방법
정자를 90% 순도 수준으로 성별-형에 대해 선별했다는 것을 제외하고, 동일한 사출액로부터의 선별된 및 비-선별된 대조표준 정자를 실시예 2에 설명된 대로 염색, 프로세싱, 및 선별했다. 선별된 정자를 대략 20ml의 부피로 수집하고, 90분간 5℃로 냉각했다(0.2℃/분). 냉각 후 동일한 부피의 난황-트리스 B 희석제(실시예 2 참조)를 15분 간격으로 2번 동일한 부피중의 선별된 정자에 첨가했다. 원심분리 및 상청액의 아스피레이션을 실시예 5에 설명된 대로 달성했다. 원심분리 및 아스피레이션 후, 6% 글리세롤(v/v)을 함유하는 난황-트리스 희석제를 정자 펠렛에 첨가하여 정자 농도를 약 20x106/ml로 만들었다. 평형화 시간이 약 3시간이었다는 것을 제외하고, 냉동 및 해동을 실시예 2에 설명된 대로 행했다.
3. 해동후 운동성의 평가
해동후 대략 10분에서 37℃에서 전진적으로 운동하는 정자의 퍼센트를 시각적으로 추정했다. 정자의 첨체 완전성을 37℃에서 2시간 인큐베이션한 후 차등 간섭차 현미경(x1000)을 사용하여 평가했다. 정자를 40mM 불화나트륨으로 처리하고, 젖은 것을 도말로 만들어, 처리 당 100 정자를 시험했다. 첨체를 (a) 완전 첨체, (b) 팽창 또는 손상된 첨체, (c) 첨체 유실(비-완전)으로 분류했다.
4. 통계적 분석
현장 시험에 사용된 3마리의 황소에서 전체적으로 균형이 잡힌 19개의 상이한 냉동 데이타로부터의 데이타를 분석했다. 처리 효과(선별 대 대조표준)를 고정 효과로서 황소를 사용하여 분산 분석에 의해 평가했다.
5. 결과
해동후 전진적으로 운동하는 정자의 퍼센트는 선별 동안 죽은 정자를 제거했음에도 불구하고 선별된 정자(46%, 표 8)보다 비-선별된 정자(50%)에 대해서 유의하게 더 높았다(P<0.05). 그러나, 완전 첨체를 가지는 정자의 퍼센트는 다르지 않았다. 선별은 대조표준에 비해 첨체를 유실한 정자의 퍼센트를 증가시켰지만, 또한 손상된 첨체를 가지는 정자의 퍼센트를 감소시켰다(P<0.05). 완전 첨체의 퍼센트(P<0.05), 비-완전 첨체의 퍼센트(P<0.01), 및 해동후 전진적 운동성(P<0.01)에 대해 황소들 사이에 유의한 차이가 있었다. 해동후 운동성(P<0.01)에 대해 황소x선별 효과가 있었지만, 다른 반응에 대해서는 아니었다. 황소 A 및 B로부터 선별된 정자와 비-선별된 정자 사이의 해동후 운동성의 차이는 거의 0이었다. 황소 C에 대해서는 선별된 정자가 대조표준 정자보다 운동성이 10% 포인트(19%) 더 낮았다.
6. 결론
평균적으로 선별된 냉동 정자에 대한 전진적 운동성의 시각적 추정은 대조표준 정자보다 약간 더 낮았지만(4% 포인트, 8%), 한 황소에 대해서는 이 차이가 더 컸다. 이들 평가는 해동후 대략 10분에서 행했다. 작은 평균 차이는 2시간 인큐베이션 후의 비-완전 첨체에 대한 것과 일관되었다. 손상된 첨체를 가지거나 또는 첨체를 유실한 정자는 비운동성이기 쉽다. 선별된 샘플의 비-완전 첨체를 가지는 정자의 퍼센트의 증가는 선별에 관련된 도는 실제 선별 전 또는 후 동결보존에 관련된 손상을 나타낸다. 아마도, 선별은 손상된 첨체를 첨체 유실로 전환시켰던 것 같다. 정자 품질 평가의 표준 과정에 기초하면, 이들 유동-선별된 정자의 수정 잠재력이 대부분의 황소에서 심각히 손상되었다고 가정할 만한 근거는 없었다.
실시예 7
성별-선택 및 20% 난황-트리스 희석제를 사용한 황소 정자의 동결보존
목적: 유동-선별된 황소 정자의 동결보존을 위한한 프로토콜을 제공한다.
1. 수집 및 사출액 평가
실시예 1A에 설명된 대로 사출액을 수집 제조한다. >75% 형태적으로 정상인 정자를 가지는 황소로부터의 사출액을 선택한다. 전진적으로 운동하는 정자의 퍼센트를 시각적으로 추정한다(>60% 전진적 운동성을 가지는 사출액이 선별을 위해 최선이다). 가공하지 않은 정액에 다음과 같이 항생제를 첨가한다: 최종 농도 100㎍ /ml의 티로신, 최종 농도 500㎍/ml의 젠타마이신, 및 최종 농도 300/600㎍/ml의 린코-스펙틴.
2. 염색 및 선별 준비
가공하지 않은 정액 샘플에 항생제를 첨가한 후, 염색하기 전에 15분 내지 20분간 방치한다. 실시예 2에 설명된 대로 샘플을 염색한다.
3. 선별
90% 순도의 선별 게이트를 설정하여, X- 및 Y-형 정자에 대해 모두 선별한다. 각 튜브가 최대 20ml의 총부피(또는 선별 당 최대 2시간)를 함유하거나, 또는 최종 선별된 정자 농도가 6x105/ml이 될때까지 20% 난황-트리스 A-분획 희석제(실시예 2 참조) 2ml를 함유하는 50ml 팔콘 튜브에 정자를 선별한다. 추가의 20% 난황-트리스 A-분획 포착 완충액을 난황의 최종 퍼센트가 적어도 3%가 되도록 선별후 및 냉각전에 첨가해야 한다.
4. 냉동 준비
선별 후 선별된 샘플을 90분에 걸쳐 5℃로 냉각한다. 냉각후 20% 난황 트리스 B-분획 희석제(실시예 2 참조)를 15분 간격으로 단계적으로(x2) 첨가한다. 정자 샘플에 첨가된 트리스 B-분획 희석제의 최종 부피는 트리스 A-분획 희석제의 부피와 동일해야 한다. 트리스 B-분획 희석제를 첨가한 후 정자 샘플의 총부피는 27ml의 총부피를 초과하지 않아야 한다.
트리스 B-분획 희석제를 정자 샘플에 첨가한 후, 850xg으로 20분간 원심분리하여 샘플을 농축한다. 상청액을 아스피레이션하고, 대략 150㎕ 정자 펠렛을 남긴다. 정자를 재현탁하고 각 개별 황소의 정자를 모은다.
5. 냉동
완전 난황-트리스 희석제(6% 글리세롤)을 첨가하여 20x106/ml의 최종 정자 농도를 달성한다. 실시예 2에 설명된 대로 냉동을 위해 0.25ml 염화폴리비닐 스트로에 희석된 정자를 패키지한다.
실시예 8
현장 연구에서 유동-선별된 냉동된 황소 정자의 수정능력 평가
재료 및 방법
정액 수집 및 프로세싱
수정능력이 알려지지 않은 어린 황소로부터의 정액을 인공질에 의해 수집했다(실시예 1A 참조). 분광광도계로 정자 농도를 측정하고, 전진적 정자 운동성을 평가한 후, 정자를 약 135 내지 약 150mW의 레이저 입사 파워를 사용하여 90% 순도로 성별-형에 의해 선별했다는 것을 제외하고, 실시예 2에 설명된 대로 정액을 프로세싱하여 선별했다. 평형화 시간이 약 3시간이었다는 것을 제외하고, 프로세싱 및 냉동을 실시예 2에서처럼 달성했다. 코넬 유니버셜 희석제(Seidel GE Jr., Theriogenology 1997; 48:1255-1264)를 현장 시험 1, 2, 및 3에서 액체 정액을 위해 사용했다. 현장 시험 2 및 3에서 냉동된 정액을 위해 사용된 희석제는 최종 글리세롤 농도가 7%인 2.9% Na시트레이트 + 20% 난황이었다(실시예 1 참조). 현장 시험 4 내지 11을 위해 정액을 200mM 트리스, 65mM 시트르산, 56mM 프럭토스, 20% 난황, 및 최종 글리세롤 농도 6%로 구성된 트리스-기제 희석제중에 냉동했다(실시예 2 참조). 유동 세포계측기에 사용된 시스 유체는 시험 1, 2, 및 3에 대해 2.9% Na시트레이트(실시예 4 참조)이고, 나머지 시험에 대해서는 트리스 완충액(실시예 2 참조)이었다.
정자를 스트로의 중심에 50ul만큼 작은 칼럼이 있는 0.25mi 프렌치 스트로에 패키지했다. 희석 효과를 최소화하기 위해 적어도 107정자/ml만큼의 적은 부피를 사용했다. 대부분의 시험에서, 정자가 없는 희석제의 칼럼을 스트로로 아스피레이션하여 먼저 면마개를 적신 후, 다음에 작은 공기의 칼럼, 다음에 암수감별된 정자를 아스피레이션했다. 정자를 냉동했을 때, 각 배치로부터의 1개 스트로를 우량 대조표준을 위해 30초간 35℃의 물에서 해동했고, 해동후 25% 미만의 전진적 운동성을 가지는 배치는 폐기했다. 각 배치로부터의 암수감별된 정자의 샘플을 초음파처리하고, 유동 세포계측기로 분석하여 암수감별의 정확도를 평가했다.
미산우 관리 및 인공수정
사용된 미산우는 상이한 관리가 실행된 6개의 광범위하게 산재된 생산 단위안에 있었다. 계절 및 품중 차이는 실험의 이질성에 더 기여했다(표 9). 가능한 처리 및 대조표준을 미산우가 수정 시설에 들어가자 마자 수정자 및 황소 범위내에서 계통적으로 교체했다.
발정을 4가지 방식 중 1가지로 동기화했다(표 9): (1) 500mg의 멜렌게스테롤 아세테이트(MGA)를 14일간 2.3kg의 곡물에 매일 공급한 후, 25mg의 프로스타글란딘 F2α(Lutalyse, Upjohn, Kalamazoo, MI, USA)를 MGA의 마지막 공급일 후 17, 18 또는 19일에 근육내 주사했다(MGA/PG); (2) 25mg의 프로스타글란딘 F2α를 단독 주사했다(PG); (3) 20 또는 25mg의 프로스타글란딘 F2α를 12일 간격으로 근육내 주사했다(PG/PG); 또는 (4) 50 또는 100Tg의 GnRH를 근육내 주사한 후, 7일후에 25mg 의 프로스타글란딘 F2α을 주사했다(GnRH/PG).
미산우를 발정한 아침 및 저녁에서 서있는 채로 시각적으로 검사했지만, 발정 개시 후 대략 1/2 또는 1일에서 16:00 이후의 저녁에만 수정시켰다. 수정을 종래대로 자궁체(uterine body)에서, 또는 비외상성 배전달 껍질(IMV, Minneapolis, USA)을 사용하여 각 자궁각(uterine horn)에서 반씩 행했다. 후자의 경우에, 정액을 비외과적 배전달과 동일하게, 외상 없이 달성할 수 있는 한 앞쪽 멀리 자궁각의 더 큰 만곡부를 지나 부착시켰다. 대부분의 경우 정액을 앞쪽 1/3과 중앙돌기 사이에 부착시켰다.
대부분의 실험은 성별-형에 대해 정자를 선별("암수감별")하는데 사용된 것과 동일한 황소로부터의 20 또는 40x106정자/용량을 사용하여 자궁체에 수정된 냉동 정자 대조표준을 포함했다. 이 대조표준은 특이적 현장 시험 조건하에서, 미산우의 고유한 정상적 수정능력 뿐만 아니라, 사용된 황소의 수정능력 및 수정자 기술의 복합적 추정으로서 사용된다. 또한, 어떤 시험은 저용량, 비-암수감별된 대조표준 그룹을 포함했다. 때로 대조표준 수정 수는 암수감별된 정자에 대한 더 많은 정보를 얻기 위해 각 처리에 사용된 수의 1/2 또는 2/3으로 계획했다. 냉동된 암수감별된 대조표준 정자를 35 내지 37℃ 수욕에서 20 내지 30초간 해동했다. 여러 가지 다른 세부사항은 표 9에 요약한다.
임신을 수정후 28 내지 37일 또는 수정후 56 내지 92일에서 초음파에 의해 진단했으며, 이때에 태아의 성별을 수정 처리 또는 대조표준을 알지 못한 채로 Curran, S., Theriogenology 1991; 36:809-814에 설명된 대로 대부분의 시험에서 측정했다. 태어난 송아지의 성별은 태아-성별 진단과 거의 동일했다. 데이타를 연속성에 대해 보정된 1 자유도계 Chi 제곱에 의해 분석했으며, 2-테일 테스트를 1-테일이 특이적이지 않은 경우에 사용했다. 5%보다 적은 수정을 수정 처리의 오차, 생식로의 명백한 감염, 자궁경부 횡단 실패 등으로 인해 도태시켰다. 실험들로부터 동물을 도태시키기 위한 결정은 수정후 곧 행해지며, 절대 임신 진단을 기초로 하지 않는다.
결과 및 토의
소무리의 유전적 요구에 황소를 일치시켜야 하는 것, 황소의 수정능력 정보를 이용할 수 없는 것, 제한된 미산우수, 시험에서 전체적으로 동일한 수정자를 이용할 수 없는 것, 어떤 시험에서의 심한 날씨, 초기 시험에서 제한된 양의 암수감별된 정액, 일부가 발정 동기화시에 약 55일까지 임신되는 것으로 드러난 2세트의 미산우 등과 같은, 연구의 논리적인 면에 의해 제약된 11번의 연속하는 이질성 현장 시험로부터의 데이타를 나타낸다. 4마리의 황소 및 3명의 수정자까지를 각 시험에 포함시켰고, 이로써 집단을 표본화하여 그 결과를 1 이상의 황소 또는 기술자에 적용시킬 수 있다. 그러나, 수정능력에서의 황소-대-황소 차이를 엄밀하게 평가하기에는 불충분한 데이타가 생성되었다.
대부분의 미산우 세트는 우리 연구실로부터 140 내지 250km에 위치한 사육중인 소무리로부터였다. 어떤 시험에서 수정자들간 임신율에 유의한 차이는 없었지만, 수정자 당 사육수가 적었으므로, 다수의 수정에서는 차이가 검출될 가능성이 있다.
발정 동기화 방법은 시험 범위내에서 비교하지 않았고. 그래서 이들 방법간에 임신율을 비교할 수 없었다. 임신율은 사용된 4가지의 동기화 과정 모두에 대해 만족스러운것 같았다.
수정이 하루 1번 행해졌으므로, 발정한 저녁에 미산우를 발정이 검출된 후 대략 24시간에서 수정시켰다. 모든 시험에 모인 암수감별된 정자를 사용한 이들 미산우의 임신율은 203/414(49.0%)였고, 이것은 발정한 아침에, 즉 발정 검출 후 반나절에 수정된 헤퍼의 임신율인 266/568(45.4%)와 유의한 차이(P>0.1)가 없었다. 나중의 수정이 가지는 더 높은 수정능력에 대한 이런 경향은 더 적은 수정능력의 황소가 사용되거나, 더 적은 정자수가 사용되거나, 또는 조건이 다른 식으로 차선적일 때, 정상적으로 추천된 것보다 나중에 수정하는 것이 바람직하다는 다른 연구로부터의 발견과 일치했다.
처리에 의한 임신율 및, 이용할 수 있는 경우의 송아지 성별을 표 10 내지 20에 나타낸다. 이 목적은 시험 8을 제외하고 암컷 자손을 얻기 위한 것이었으며, 정확도는 시험 1, 3, 8. 9. 10 및 11에서 각각 95%, 83%, 90%, 83%, 82%, 및 94%였다. 나머지 시험에서 태아 또는 출생 성별은 임신 진단의 타이밍, 태아의 암수감별에서 기술자를 이용할 수 없는 것 때문에, 및/또는 송아지가 아직 태어나지 않았기 때문에 이용할 수 없었다. 이것은 이 연구의 주목적이 저용량으로 수정된 유동 -선별된 정자의 수정능력을 측정하는 것이었기 때문에 주요하게 고려되지 않았다.
암수감별의 정확도를 선별 파라미터를 맞춤으로써 50 내지 95+%에서 실질적으로 바람직한 어떤 수준으로 조정할 수 있다. 그러나, 더 높은 정확도는 특히 Y-염색체 정자에 대해 단위 시간 당 더 적은 수의 선별된 정자를 야기했다. 90% 정확도는 통상의 작업을 위해 불충분했다.
각 현장 시험로부터의 주요 발견을 차례로 요약할 것이다. 총정자수가 표제목에 주어진다. 전진적으로 운동하는 정자의 수는 보통 이들 값의 30% 내지 50%였다. 현장 시험 1(표 10)에서 적은 수의 비-암수감별된 정자를 사용한 자궁각 수정을 사용한 임신율은 정상 정자수를 가지는 대조표준과 유사함을 확인했다. 비냉동 된 암수감별된 정자(42%)를 사용한 64 내지 67일 임신율은 선별된 정자와 동일하게 희석, 염색 및 원심분리된 정자를 사용한 비-암수감별된 액체 대조표준의 12% 포인트 이하였다. 암수감별의 정확도는 95%였으며, 암수감별된 정자로부터 태어난 송아지의 성별은 태아의 성별 진단과 정확하게 일치했고, 대조표준의 태아를 암수감별하는데 1번의 실수가 있었다. 수태중의 2개월과 출산예정일 사이에 유산은 없었고, 암수감별된 정자 처리로부터의 19마리 송아지 모두 정상적이었고 살아남았다. 암수감별된 정액 처리에 대해서, 황소 N1, N2, 및 N3에 대한 2개월 임신율은 각각 41, 44, 및 40%였다. 발정한 미산우 중 아침에 39%(13/33), 그리고 발정한 미산우 중 저녁에 50%(6/12)가 임신되었다.
현장 시험 2(표 11)는 동결보존 동안 죽은 정자의 수에 대해 조정한다면, 암수감별된 냉동 정자를 사용한 결과가 암수감별된 비냉동 정자와 유사하다는 첫번째 증거를 제공했다. 또한, 5℃ 대 18℃에서 저장된 암수감별된 정자간 임신율에 차이는 없었다. 개별 황소로부터의 암수감별된 정액의 수정후 2+ 개월에서 임신율은 22% 내지 40% 임신의 범위였다(P>0.05). 수태중의 1개월과 2개월 사이에서 배상실은 암수감별된 및 대조표준 임신에 대해 매우 유사했다. 출산 데이타는 이 시험의 39마리 미산우로부터 이용가능했으며, 2개월에서 임신한 미산우(30마리의 암수감별된 임신, 9 대조표준)는 각각 정상 기간 수태 후 출산했다.
현장 시험 3(표 12)에서 암수감별된 냉동 정자가 합리적인 임신율을 야기한다는 것을 확인했다. 정자의 암수감별 정확도를 다시 확인했지만, 태어난 송아지와 비교하여 태아를 암수감별하는데 4개의 오차가 있었다. 태어난 송아지의 정확한 성별을 나타낸다. 다시, 수태중의 2개월과 출산예정일 사이에 유산은 없었다. 황소 N8, N9, AN5, 및 AN4의 암수감별되고 비냉동된, 및 암수감별되고 냉동 정자에 대해 평균한 임신율은 각각 24, 31, 50, 및 60%였다(P<0.1).
현장 시험 4, 5 및 6(표 13, 14 및 15)을 3개의 상이한 그룹의 미산우를 사 용하여 동일한 위치에서 행했다. 불행하게도, 개인적 스케쥴, 각 황소로부터의 암수감별된 정액의 이용가능성 등과 같은, 현장 시험의 변동으로 인해 각 시험을 유사하게 반복하는 것이 불가능했다. 시험 5와 6 사이의 광범위하게 상이한 임신율은 조건이 시험들 사이에서 달랐다는 것을 예시한다. 시험 6에서 미산우 중 일부는 그것들이 자연교미하는 달 후 임신하는데 실패했기 때문에 이용가능했다. 이들 시험 조건하에서 임신율은 1.5와 3.0x106 암수감별된 냉동 정자/용량 사이에서 매우 유사했다. 더욱이, 자궁각 수정의 장점은 없었다. J2 20/ 28(71%)의 임신율이 J4, 15/39(38%)보다 더 높았던 시험 5(P<0.05)를 제외하고, 황소들간 임신율에 유의한 차이(P>0.05)는 없었다. 시험 4 및 6에서 J4가 J2보다 수치제어적이지만 유의하지는 않은(P>0.1) 더 높은 임신율을 가졌던 바와 같이, 이 차이는 시험들간에 일관되지 않았다.
시험 7(표 16)을 위해서, 단지 1명의 수정자만을 스케쥴 조정으로 인해 이용할 수 있었다. 이것은 자궁체 수정에 대한 자궁각의 확실한 장점을 나타냈던 유일한 시험이다. 이 시험 조건하에서 이 수정자에 대해, 55% 이상의 미산우(22% 포인트)가 자궁체보다 자궁각에서, 수정된 암수감별된 냉동된 정액을 사용하여 임신되었다. 실제 차이는 이들 수단에 대한 넓은 신뢰구간 때문에 더 작을 수 있다. 자궁체 및 자궁각 수정을 비교했던 모든 다른 시험(5, 6, 9 및 11)에서, 임신율은 이 기술자 뿐만 아니라 다른 기술자에 대해 두 방법 모두 매우 유사했다.
시험 7에 사용된 황소 중 하나로부터의 정액을 선별 전에 약 20℃에서 절연 박스에서 항공편으로 몬타나로부터 희석 없이 선적했으며, 선적 시간은 6시간이었다. 2마리 황소로부터의 암수감별된 정자의 임신율은 실질적으로 동일했으며, 비선적 정액 49%, 선적 정액 52%였다. Hoechst 33342를 사용한 정자의 염색성이 희석제를 사용한 희석에 의해 변하기 때문에, 정액은 희석제로 희석하지 않았고, 선적 동안 냉각하지 않았다. 더욱이, 다른 연구에서(실시예 4 참조), 수집과 유동-선별 사이에 주위 온도에서 순수하게 저장한 정자는 그것을 희석하는 것보다 더 우수하다고 판명되었다.
현장 시험 8(표 17)은 성장 촉진제를 주입하지 않은 사육장 미산우에 관한 것이었으며, 임신이 진단되었을 때 그들은 유산했고, 그래서 출산 데이타는 이용할 수 없었다. 이 실험은 효과적인 암수감별이 또한 수컷 방향으로 행해질 수 있음을 예시한다. 2마리 황소의 임신율은 50% 및 61%였다.
현장 시험 9(표 18)는 3.0 대 1.5x106 암수감별된 냉동 정자/수정 용량의 확실한 장점을 나타내기 위한 유일한 시험이었다. 이 장점은 두 수정자 모두에서 사실이었다. 2마리 황소로부터의 암수감별된 정자의 임신율은 62% 및 75%였다.
암수감별된 냉동된 정액을 사용한 현장 시험 10(표 19)에서의 임신율은 대조표준과 유사했으며, 이 시험에 대한 정자 암수감별의 정확도는 단지 82%였지만, 이것은 목표로 한 90% 정확도와 유의한 차이는 아니었다. 암수감별된 정액의 임신율은 황소 AN4, AN7, 및 AN8에 대해 각각 54, 66, 및 50%였다(P>0.1). 이 시험에서 수정된 미산우 중 18마리는 현장 시험 1의 암수감별된 정자로부터의 결과인 송아지였다.
1x10 및 1.5x106 정자 용량을 모았던 것을 제외하고, 처리들이 동일했던 시험으로부터의 데이타를 조합했다.
암수감별된 정자를 사용한 임신율은 7 내지 20 배 이상의 정자를 사용한 실험 범위내에서 일반적으로 암수감별되지 않은 대조표준의 70% 내지 90%였다. 이 차이는 더 최근의 시험에서 줄어들었으며, 이것은 아마도 개선된 암수감별 및 정자 -프로세싱 과정을 가능한 반영하는 것이다.
어떤 시험에서, 미산우를 수정후 1개월 및 2개월에서 초음파에 의해 임신에 대해 시험했다. 이 구간에서 임신 상실은 암수감별(23/261, 8.8%) 대 대조표준 (9/145, 6.2%) 정자 처리에 대해 유사했으며, 이것은 암수감별로 인한 유전적 손상이 최소인 한 측정치이다. 초기 시험의 대부분의 소가 팔렸고, 나중의 시험의 소들이 아직 출산하지 않았기 때문에, 출산 정보를 단지 소수의 임신한 미산우로부터 얻었다. 암수감별된 정액으로부터 비롯하여 생산된 송아지 집단은 대조표준 집단과 차이가 없는 것 같다.
결론
소들에서 성별 비율은 유동 세포계측기/세포 선별기를 사용하여 DNA 내용에 근거하여 정자를 선별하고, 이어서 냉동보존하고 비교적 통상적으로 인공수정함으로써 어느 한쪽 성별 중 약 90%까지 왜곡될 수 있다. 암수감별된 정자로부터의 결과인 송아지는 정상인 것 같다. 이들 연구에서 대부분의 황소에 대해, 1.0 내지 1.5x106 암수감별된 냉동 정자를 사용한 임신율은 종래대로 수정된 20 또는 40x106 냉동 정자를 사용한 비-암수감별된 대조표준의 70% 내지 90%였다. 이들 결과를 적절히 프로세싱된 정액을 사용하여 잘 훈련된 수정자에 의해 번식된 잘 관리된 미산 우에도 적용한다. 표준 자궁체 수정과 비교하여 자궁각에서 양쪽으로 암수감별된 정자를 수정하는 것에 작은 장점이 있을 수 있다.
본 발명은 어떤 특이한 방법 및 재료에 관하여 본원에 논의된 필요성을 가진다. 이들 특이한 방법 및 재료에 대한 논의가 결코 본 발명의 범위에 대한 어떤 제한을 구성하지 않으며, 본 발명의 목적을 달성하는데 적합한 어떤 및 모든 다른 재료 및 방법으로 확대된다는 것이 이해되어야 한다.
설명된 모든 특허 및 공보는 그것 전체가 본원에 참고자료로 포함된다.
Claims (37)
- 선택된 비사람 정자 샘플을 얻는 단계;초기 희석제를 첨가하고, 유동 세포계측법에 의해 정자를 선택하는 단계;상기 선택된 정자 샘플을 냉각하는 단계;상기 선택된 정자 샘플로부터 정자를 분리하여 분리된 정자를 생성하는 단계;상기 분리된 정자에 최종 희석제를 첨가하여 정자 현탁액을 생성하는 단계; 및상기 정자 현탁액을 냉동하는 단계를 포함하는 정자의 동결보존 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 선택된 정자 샘플이 공급원 샘플에 존재하는 정자 중 특징에 대해 선택된 일부 정자를 포함하며, 선택된 정자 샘플중의 정자 농도가 공급원 샘플에서보다 더 낮은 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 선택된 정자 샘플이 성별-선택된 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 선택된 정자 샘플이 포유류 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 선택된 정자 샘플이 소 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 선택된 정자 샘플이 말 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 선택된 정자 샘플이 돼지 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 선택된 정자 샘플이 유동 세포계측법, 자기 기술, 칼럼 기술, 중량 기술, 생화학적 기술, 정자의 운동성에 기초한 기술, 정자의 전기적 성질에 기초한 기술, 및 그것들의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터의 방법에 의해 선택된 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 냉각이 5℃로 선택된 정자 샘플의 온도를 감소시킴에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 냉각이 60분 내지 240분에 걸쳐 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 선택된 정자 샘플에 첨가되는 최종 희석제가 각각 저온보호물질에 더하여 몰랄삼투농도를 유지하고 pH를 완충하는 성분, 냉각 쇼크를 감소시키고 정자의 수정능력을 보존하는 유기 물질, 에너지원, 정자 수정능획득을 용이하게 하는 물질, 및 항생제 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 저온보호물질이 이당류, 삼당류, 및 그것들의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 저온보호물질이 글리세롤, 디메틸 술폭시드, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 그것들의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 몰랄삼투농도를 유지하고 pH를 완충하는 상기 성분이 염을 포함하는 완충액, 탄수화물을 함유하는 완충액, 및 그것들의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 몰랄삼투농도를 유지하고 pH를 완충하는 상기 성분이 나트륨 시트레이트, 트리스[히드록시메틸]아미노메탄, N-트리스[히드록시메틸]메틸-2-아미노에탄술폰산, 모노소듐 글루타메이트, 밀크, HEPES 완충 배지, 및 그것들의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 유기 물질이 난황, 난황 추출물, 밀크, 밀크 추출물, 카세인, 알부민, 레시틴, 및 그것들의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 에너지원이 글루코스, 프럭토스, 만노스, 및 그것들의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 단당류인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 항생제가 티로신, 젠타마이신, 린코마이신, 린코-스펙틴, 스펙티노마이신, 페니실린, 스트렙토마이신, 및 그것들의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 최종 희석제의 첨가 후, 정자 샘플 및 정자 현탁액이 각각 글리세롤, 나트륨 시트레이트, 트리스[히드록시메틸]아미노메탄, 난황, 프럭토스, 및 하나 이상의 항생제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 최종 희석제의 첨가 후, 상기 정자 샘플 및 정자 현탁액이 각각 글리세롤, 나트륨 시트레이트, 난황, 및 하나 이상의 항생제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 최종 희석제의 첨가 후, 상기 정자 샘플 및 정자 현탁액이 각각 글리세롤, 난황, 밀크, 프럭토스, 및 하나 이상의 항생제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 희석제가 6.5 내지 7.5 범위의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 정자가 원심분리에 의해 상기 선택된 정자 샘플로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 24 항에 있어서, 상기 원심분리가 적어도 50% 내지 90%의 정자 회수를 허용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 냉동 전 상기 현탁액중의 정자 농도가 1x106/ml 내지 300x106/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
- 공급원 샘플에 존재하는 비사람 정자 중 유동 세포계측법에 의해 특징에 대해 선택된 일부 정자를 포함하는 냉동된 선택된 정자 샘플.
- 제 27 항에 있어서, 상기 냉동된 선택된 정자 샘플이 성별-선택된 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동된 선택된 정자 샘플.
- 제 27 항에 있어서, 상기 냉동된 선택된 정자 샘플이 포유류 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동된 선택된 정자 샘플.
- 제 29 항에 있어서, 상기 냉동된 선택된 정자 샘플이 소 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동된 선택된 정자 샘플.
- 제 29 항에 있어서, 상기 냉동된 선택된 정자 샘플이 말 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동된 선택된 정자 샘플.
- 제 29 항에 있어서, 상기 냉동된 선택된 정자 샘플이 돼지 정자를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동된 선택된 정자 샘플.
- 삭제
- 삭제
- 제 27 항에 있어서, 상기 냉동된 선택된 정자 샘플이선택된 정자 샘플을 얻는 단계;초기 희석제를 첨가하는 단계;상기 선택된 정자 샘플을 냉각하는 단계;상기 선택된 정자 샘플로부터 정자를 분리하여 분리된 정자를 생성하는 단계;상기 분리된 정자에 최종 희석제를 첨가하여 정자 현탁액을 생성하는 단계; 및상기 정자 현탁액을 냉동하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 냉동된 선택된 정자 샘플.
- 제 27 항의 냉동된 선택된 정자 샘플의 사용을 포함하는 인공수정 또는 생체외수정 방법.
- 제 36 항에 있어서, 저용량 인공수정을 위한 상기 냉동된 선택된 정자 샘플의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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