BR112015007480B1 - métodos de separação de esperma com base no sexo de eficácia elevada. - Google Patents

Abstract

métodos de separação de esperma com base no sexo de eficácia elevada. esta divulgação se relaciona com métodos de separação de células, e particularmente métodos de separação de células que melhoram a eficácia ou produtividade de separação em um instrumento de separação de partículas utilizando um parâmetro medido de eficácia da separação. em uma forma de realização podem ser estabelecidas e mantidas produtividade mínima e pureza mínima enquanto se tenta maximizar a eficácia da separação. enquanto em outra forma de realização podem ser estabelecidas e mantidas uma eficácia da separação mínima e uma pureza mínima enquanto se tenta maximizar a produtividade de uma separação.

Description

(54) Título: MÉTODOS DE SEPARAÇÃO DE ESPERMA COM BASE NO SEXO DE EFICÁCIA ELEVADA.

(51) Int.CI.: A01N 1/02; C12N 5/076; C12N 5/071; C12Q 1/24; C12Q 1/6806.

(52) CPC: A01N 1/02; C12N 5/061; C12N 5/0612; C12Q 1/24; C12Q 1/6806.

(30) Prioridade Unionista: 05/10/2012 US 61/710,343.

(73) Titular(es): INGURAN, LLC.

(72) Inventor(es): KENNETH MICHAEL EVANS; THOMAS BOYD GILLIGAN; JOHNATHAN CHARLES SHARPE; JUAN MORENO; RAMAKRISHNAN VISHWANATH.

(86) Pedido PCT: PCT US2013028934 de 04/03/2013 (87) Publicação PCT: WO 2014/055112 de 10/04/2014 (85) Data do Início da Fase Nacional: 02/04/2015 (57) Resumo: MÉTODOS DE SEPARAÇÃO DE ESPERMA COM BASE NO SEXO DE EFICÁCIA ELEVADA. Esta divulgação se relaciona com métodos de separação de células, e particularmente métodos de separação de células que melhoram a eficácia ou produtividade de separação em um instrumento de separação de partículas utilizando um parâmetro medido de eficácia da separação. Em uma forma de realização podem ser estabelecidas e mantidas produtividade mínima e pureza mínima enquanto se tenta maximizar a eficácia da separação. Enquanto em outra forma de realização podem ser estabelecidas e mantidas uma eficácia da separação mínima e uma pureza mínima enquanto se tenta maximizar a produtividade de uma separação.

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RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de Invenção para “MÉTODOS DE SEPARAÇÃO DE ESPERMA COM BASE NO SEXO DE EFICÁCIA ELEVADA”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO [001 ] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisória dos E.U.A. No. 61/710,343 depositado a 5 de outubro, 2012, os conteúdos inteiros do qual são incorporados aqui por referência.

ÁREA TÉCNICA [002] Geralmente, esta divulgação se relaciona com métodos de separação de células, e se relaciona mais particularmente com métodos de separação que melhoram a eficácia e recuperação de esperma separado com base no sexo.

ANTECEDENTES [003] Os métodos de separação de esperma o mais amplamente usados se baseiam geralmente na detecção de diferenças quantifícáveis no conteúdo de DNA de espermatozóides portadores de cromossomo X e espermatozóides portadores de cromossomo Y. Várias modificações a citômetros de fluxo para este propósito foram descritas nas Patentes dos E.U.A. 5,135,759, 6,263,745, 7,371,517 e 7,758,81 1, cada urna das quais é incorporada aqui por referência. Em muitas espécies, esta diferença no conteúdo de DNA pode ser pequena. Nos bovinos, por exemplo, os touros Holstein têm uma diferença de cerca de 3,8 % no conteúdo de DNA, enquanto os touros Jersey têm uma diferença de cerca de 4,1 %. A natureza inexata da coloração de DNA estequiométrico torna estas pequenas diferenças difíceis de verificar e requer exposição do esperma a condições danosas ao longo de períodos de tempo.

[004| Embora Hoechst 33342 possa ser usado em concentrações não tóxicas, o esperma tem de ser incubado a temperaturas elevadas e pHs

2/53 elevados para penetração suficiente de Hoechst 33342 com uniformidade suficiente para análise ou separação. Cada uma de elevação da temperatura do esperma e mudança do pH do esperma pode contribuir para danos ao esperma. Adicionalmente, a pressão e forças de cisalhamento aplicadas ao esperma dentro de um citômetro de fluxo podem adicionalmente comprometer as membranas dos espermatozóides. Estes fatores podem acelerar a deterioração das membranas dos espermatozóides, reduzindo adicionalmente a vida de prateleira já limitada dos espermatozóides viáveis.

[005J Conformemente, os esforços de separação de espermatozóides prévios se focavam na utilização de amostras de inseminação mais pequenas e produção da maior quantidade de espermatozóides separados na menor quantidade de tempo. A Patente dos E.U.A. 6,149,867, incorporada aqui por referência, descreve métodos e dispositivos voltados para ajudar os espermatozóides a sobreviverem melhor à separação citométrica de fluxo em combinação com inseminados de dosagem reduzida. Avanços subsequentes na separação por fluxo se focaram em melhorias na detecção ou produtividade. No entanto, à medida que as velocidades e produtividades aumentavam, maiores quantidades de espermatozóides, incluindo espermatozóides viáveis do sexo desejado, eram descartadas com desperdício. Existem também compromissos adicionais entre pureza e recuperação. Por exemplo, onde a pureza desejada é maior do que 95 %, menos espermatozóides podem ser determinados com o nível de confiança requerido em comparação com purezas de 70 %, 80% ou 90 %, significando que menos espermatozóides são separados a purezas crescentemente elevadas e que mais espermatozóides viáveis são descartados com a corrente de desperdício.

[006] Existem perdas adicionais na eficácia no que diz respeito a espermatozóides viáveis descartados devido à ocorrência de eventos

3/53 coincidentes. Um evento coincidente ocorre quando dois ou mais espermatozóides estão demasiado juntos para serem separados. Em qualquer um dos eventos, todos os espermatozóides podem ser descartados com desperdício, ao passo que poderia ter sido desejável coletar algumas das ou todas aquelas células descartadas.

[007] Previamente, os problemas de recuperação eram frequentemente negligenciados, ou sujeitos a debate, tendo em vista a produtividade da separação por fluxo a bruto. O esperma de bovinos, por exemplo, é relativamente fácil de coletar e processar e podem ser desejáveis purezas elevadas nas indústrias de carne bovina e lacticínios, mesmo à custa de descarte de tanto quanto 90 % do esperma. No entanto, esta metodologia de produtividade elevada não é aceitável para esperma em quantidade limitada. Por exemplo, um animal específico poderia possuir qualidades genéticas excecionalmente desejáveis, mas poderia produzir fracas amostras de esperma para separação. Uma espécie poderia ser rara, em perigo, ou difícil de coletar, limitando a quantidade de esperma disponível para separação. Uma amostra previamente coletada pode ser conservada, mas o animal ou espécie pode já não estar disponível para coletas subsequentes. Independentemente das circunstâncias, o processo de separação de espermatozóides com desperdício é indesejável em quantidade limitada ou espermatozóides com elevado valor. Existe, portanto, uma necessidade de um método de separação de esperma viável com uma eficácia melhorada na recuperação de espermatozóides.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008] Certas formas de realização da invenção reivindicada estão resumidas em baixo. Estas formas de realização não se destinam a limitar o escopo da invenção reivindicada, mas ao invés servem como breves descrições de possíveis formas da invenção. A invenção pode englobar uma variedade de formas que diferem destes sumários.

4/53 [009] Uma forma de realização se relaciona com um método de separação eficaz de uma amostra de esperma em um instrumento de separação de partículas. O método pode começar com o passo de estabelecimento de uma corrente de fluido de revestimento no instrumento de separação de partículas e fluidificação de uma amostra de esperma na corrente de fluido de revestimento. Os espermatozóides podem ser orientados com o instrumento de separação de partículas que pode também diferenciar espermatozóides portadores de cromossomo X viáveis e/ou espermatozóides portadores de cromossomo Y viáveis do restante da amostra. Os espermatozóides portadores de cromossomo X viáveis e/ou espermatozóides portadores de cromossomo Y viáveis podem ser depois coletados. Um ou mais dos parâmetros de separação medidos no instrumento de separação de partículas podem ser determinados no instrumento de separação de partículas. Uma produtividade mínima e uma pureza mínima podem ser estabelecidas para a separação e uma eficácia da separação pode ser determinada a partir dos parâmetros de separação medidos determinados enquanto se separa. Um ou mais dos parâmetros do instrumento podem ser ajustados para aumentar a eficácia da separação enquanto se mantém a produtividade mínima e se mantém a pureza mínima.

[0101 Outra forma de realização se relaciona com um método de separação eficaz de uma amostra de esperma em um instrumento de separação de partículas que pode se iniciar com o passo de estabelecimento de uma corrente de fluido de revestimento no instrumento de separação de partículas. Uma amostra de esperma pode fluir para a corrente de fluido de revestimento. Os espermatozóides podem ser orientados com o instrumento de separação de partículas e depois diferenciados do restante da amostra como espermatozóides portadores de cromossomo X viáveis e/ou espermatozóides portadores de cromossomo Y viáveis. Os espermatozóides

5/53 portadores de cromossomo X viáveis e/ou espermatozóides portadores de cromossomo Y viáveis podem ser depois coletados. Um ou mais dos parâmetros de separação medidos podem ser determinados no instrumento de separação de partículas. Uma eficácia da separação mínima e uma pureza mínima podem ser estabelecidas. Uma produtividade pode ser determinada com base em parâmetros de separação medidos durante separação. Um ou mais dos parâmetros do instrumento podem ser depois ajustados para aumentar a produtividade enquanto se mantém uma eficácia da separação mínima e se mantém uma pureza mínima.

[011] Ainda outra forma de realização se relaciona com um método de separação eficaz de uma amostra de esperma. O método pode se iniciar com os passos de padronização da concentração de uma amostra de esperma e padronização do pH de uma amostra de esperma e pode continuar com coloração da amostra de esperma com uma única diluição para proporcionar uma amostra de esperma corado tendo uma concentração entre cerca de 160 x 10⁶ espermatozóides por microlitro e cerca de 640 x 10⁶ espermatozóides por microlitro. O esperma pode ser analisado em um instrumento de separação de partículas que é operado em um modo que interrompe a separação de quaisquer eventos coincidentes enquanto alcança pureza de pelo menos 90 %. Os espermatozóides portadores de cromossomo X viáveis e/ou espermatozóides portadores de cromossomo Y viáveis podem ser depois coletados. Entre cerca de 25 por cento e 50 por cento da amostra de esperma processada através do instrumento de separação de partículas pode ser separada ou coletada em uma população de espermatozóides portadores de cromossomo X enriquecida e/ou em uma população de espermatozóides portadores de cromossomo Y enriquecida.

|012] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

6/53 [013| A FIG. 1 ilustra um esquema de um citômetro de fluxo para separação de esperma de acordo com certas formas de realização descritas aqui.

[0141 A FIG. 2 ilustra um esquema de um chip microfluídico para separação de esperma de acordo com certas formas de realização descritas aqui.

[015| A FIG. 3 ilustra uma representação gráfica de vários parâmetros de separação adquiridos em um citômetro de fluxo enquanto se separa esperma de acordo com várias formas de realização descritas aqui.

[016] A FIG. 4 ilustra uma representação gráfica de vários parâmetros de separação adquiridos em um citômetro de fluxo enquanto se separa esperma de acordo com várias formas de realização descritas aqui.

[017[ A FIG. 5 ilustra uma representação gráfica de vários parâmetros de separação adquiridos em um citômetro de fluxo enquanto se separa esperma de acordo com várias formas de realização descritas aqui.

[018] A FIG. 6 ilustra um fluxograma de um método de acordo com certas formas de realização descritas aqui.

[019] A FIG. 7 ilustra um fluxograma de um método de acordo com certas formas de realização descritas aqui.

|020] A FIG. 8 ilustra uma representação gráfica de dados produzidos de acordo com formas de realização descritas aqui.

|021| A FIG. 9 ilustra uma representação gráfica de dados produzidos de acordo com formas de realização descritas aqui.

[022] Embora a presente invenção possa realizada com várias modificações e formas alternativas, formas de realização específicas são ilustradas nas figuras e descritas aqui por meio de exemplos ilustrativos. Deve ser entendido que as figuras e descrições detalhadas não se destinam a limitar o escopo da invenção à forma divulgada particular, mas que todas

7/53 as modificações, alternativas, e equivalentes abrangidos pelo espírito e escopo das reivindicações se destinam a estar englobados.

MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO [023] Como usado aqui, o termo parâmetro do instrumento deve ser entendido como incluindo definições se relacionando com as condições de análise e/ou separação em, de, e se relacionando com um instrumento, onde tais definições podem ser modificadas por ajustes manuais ou automáticos ao instrumento. No caso de um citômetro de fluxo, ou outros instrumentos similares, os parâmetros do instrumento podem incluir pressão da amostra, caudal da amostra, pressão de revestimento, caudal do revestimento, frequência de queda, amplitude de queda, coincidence abort logic, regiões de intercepção, lógica de separação, e outras definições similares.

[024] O termo parâmetros de separação pode incluir aquelas condições se relacionando com separação pré-formada em um instrumento de separação de partículas. Os parâmetros de separação podem incluir parâmetros de separação medidos adicionalmente a parâmetros que são determinados offline, estimados por um operador, e condições se relacionando com uma população separada de partículas ou células.

[025] Parâmetros de separação medidos podem incluir aquelas condições se relacionando com separação medida diretamente, calculada, ou determinada em um instrumento de separação de partículas enquanto se analisa e/ou separa uma população de partículas ou células. No caso de um citômetro de fluxo, ou outros instrumentos similares, os parâmetros de separação medidos podem incluir: taxa de eventos; taxa de separação; eficácia da separação; taxa de interrupção; percentagem de morte à entrada; live oriented gate percentage', razão vale em relação a pico; ou a percentagem de eventos em outras gates de separação, tais como uma Xsort gate ou uma Y-sort gate.

8/53 [026] Como usado aqui, o termo evento de coincidência pode ser entendido como um único evento em um instrumento de separação de partículas onde uma ou mais partículas ou células estão demasiado próximas para serem separadas para coleta individual, e onde somente uma das duas células ou partículas é desejável para coleta. No caso de um citômetro de fluxo com jato em ar de separação de gotículas pode ocorrer um evento coincidente quando dois espermatozóides estão próximos o suficiente tal que acabarão na mesma gotícula mas somente uma dessas duas células é desejada para coleta. Em um chip microfluídico ou separador de mudança de fluidos, um evento coincidente pode ocorrer quando duas partículas ou células estão tão próximas que qualquer mecanismo para mudar a trajetória das partículas será defletido ambas as partículas em conjunto, quando somente uma das partículas é desejável para coleta.

[027] O termo eficácia da separação pode ser entendido para se referir à recuperação partículas ou células em termos da percentagem de partículas ou células separadas ou coletadas de um grupo de células ou partículas que são analisadas. O grupo de células analisado pode ser o número total de células analisado ou pode ser um subconjunto do número total de células analisado, tal como as células analisadas determinadas como sendo viáveis ou de outro modo desejáveis para análise e potencial coleta.

[028] No que diz respeito à separação, o termo produtividade, como usado aqui, pode ser entendido para se referir ao número de partículas ou células separadas ou coletadas por unidade tempo.

[029] No que diz respeito à separação, o termo pureza pode se referir a uma percentagem real ou estimada de células ou partículas na população de partículas ou células coletadas ou separadas tendo a característica para a qual as partículas foram separadas. No caso de espermatozóides, a pureza pode se referir à percentagem de

9/53 espermatozóides portadores de cromossomo X em uma população separada quanto a espermatozóides portadores de cromossomo X ou à percentagem de espermatozóides portadores de cromossomo Y em uma população separada quanto a espermatozóides portadores de cromossomo Y independentemente da viabilidade dos espermatozóides separados.

[030] Certos aspetos divulgados aqui se relacionam com um método de separação eficaz de uma amostra de esperma em um instrumento de separação de partículas. Os instrumentos de separação de partículas podem incluir citômetros de fluxo por jato no ar, tais como o MoFlo SX, MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami FL, EUA); no entanto, outros citômetros de fluxo comercialmente disponíveis poderíam ser modificados quanto a separação de esperma também. Os citômetros de fluxos por jato no ar podem ser equipados com características orientadoras tais como bocais orientadores para orientação dos espermatozóides, óticas para iluminação uniforme de células, e/ou óticas radialmente uniformes para coleta de emissões de fluorescência de todas as células independentemente da sua orientação. Podem ser também usados citômetros de fluxo tendo diferentes câmaras de fluxo, tais como citômetros de fluxo com câmaras fechadas, ou cuvetes. Adicionalmente, dispositivos tais como chips microfluídicos com funções de separação podem ser usados de acordo com certas formas de realização descritas aqui.

[031] Algumas formas de realização descritas aqui se relacionam com o rastreio e/ou otimização da eficácia da separação, enquanto outras formas de realização descritas aqui se relacionam com rastreio da eficácia da separação e manutenção de pelo menos um limiar mínimo da eficácia da separação. Ambas as formas de realização introduzem o novo parâmetro medido de eficácia da separação em instrumentos de separação de partículas. No caso de esperma, a eficácia de separação pode ser a percentagem de espermatozóides coletados em um grupo separado em

10/53 comparação com o número total de esperma analisado, ou a percentagem de espermatozóides coletados em comparação com o número total de esperma analisado determinado como sendo espermatozóides viáveis. Quando a eficácia da separação é vista em termos da percentagem de espermatozóides coletados em relação à população total de esperma analisado pode ser entendido espermatozóides mortos, ou espermatozóides caracterizados como tendo membranas comprometidas ou não viáveis, podem contribuir para perdas significativas na eficácia da separação.

[032] Uma forma de realização descrita aqui proporciona uma combinação sinérgica incluindo metodologias de coloração que podem reduzir os números de espermatozóides mortos e que, em alguns casos, podem melhorar a capacidade de citômetros de fluxo de diferenciarem espermatozóides portadores de cromossomos X e portadores de cromossomos Y. Uma tal combinação sinérgica proporciona uma metodologia para redução drástica da quantidade de espermatozóides descartados de um sexo desejado que podem ter sido previamente descartados como mortos ou não orientados. Ainda outro aspeto benéfico da metodologia de coloração melhorada proporciona espermatozóides a concentrações mais elevadas para separação do que procedimentos de coloração em dois passos prévios. Como será descrito adicionalmente em baixo, as concentrações mais elevadas de espermatozóides podem proporcionar boas taxas de eventos para produtividade aceitável mesmo quando se opera a purezas elevadas e caudais de fluido de amostra baixos, que podem melhorar adicionalmente o alinhamento e orientação dos espermatozóides.

[033] Certos aspetos desta divulgação proporcionam métodos para melhoria da eficácia com a qual uma amostra é separada, enquanto se opera em um modo em que todos os eventos coincidentes são rejeitados. As metodologias prévias podem ter sugerido recuperação pode ser melhorada

11/53 por operação de citômetros de fluxo em um modo que aceita todos os eventos coincidentes. Um evento coincidente pode ser entendido como uma partícula detetada em um citômetro de fluxo que não pode ser separada de uma partícula indesejável, onde a partícula indesejada pode ser uma partícula do sexo errado, uma partícula morta, uma partícula não orientada, ou uma partícula não identificável de outro modo que não seria coletada. Um exemplo comum seria o caso de uma partícula desejável e uma partícula indesejável estando colocadas dentro da mesma gotícula. A maioria dos citômetros de fluxo intercepta tais partículas no interesse da conservação da pureza da amostra de esperma separado.

Obtenção e coloração de esperma para separação [034] Uma população de espermatozóides pode ser obtida na forma de sêmen puro, esperma estendido, esperma congelado-descongelado ou em suas combinações. A população de espermatozóides pode ser obtida no mesmo local onde os passos restantes são realizados, ou pode estar estendida em um tampão de esperma apropriado para transporte até uma instalação de separação. Uma vez obtido, o esperma pode ser mantido à temperatura ambiento, refrigerado, ou mesmo congelado em um tampão apropriado para uso posterior. O esperma para coloração e separação pode ser adquirido de um mamífero, ou pode ser adquirido esperma de armazenamento, tal como uma palheta congelada ou refrigerada obtida de armazenamento. Alternativamente pode ser agrupado esperma congelado ou estendido.

[035] A população de espermatozóides pode ter origem em mamíferos, tais como um mamífero não humano listado por Wilson, D.E. e Reeder, D.M., Mammal Species of the World, Smithsonian Institution Press, (1993), os conteúdos inteiros do qual são incorporados aqui por referência.

12/53 [036] Quando da coleta, ou descongelamento, ou mesmo agrupamento, o esperma pode ser checado quanto a concentração, pH, motilidade, e/ou morfologia. Adicionalmente podem ser adicionados antibióticos antes de passos de processamento adicionais.

[037| Uma vez obtido, o esperma pode ser opcionalmente padronizado até uma concentração pré-determinada e/ou na direção de um pH pré-determinado. Cada uma da concentração e pH pré-determinados pode ser específico de diferentes espécies, ou mesmo de diferentes raças de animais dentro de uma espécie. Em uma forma de realização, o esperma pode ser combinado com um tampão inicial na forma de um tampão de elevada capacidade. Tampões exemplares podem incluir TRIS citrato, citrato de sódio, bicarbonate de sódio, HEPES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP, e suas combinações. Qualquer tampão tendo uma elevada capacidade para tamponamento de pH pode ser também empregue, e pode ser usado em combinação com componentes adicionais que promovem a viabilidade dos espermatozóides tais como gema de ovo, e fontes de citratos ou ácido cítrico. Adicionalmente podem ser empregues antioxidantes e antibióticos no tampão inicial para promover a viabilidade do esperma.

|038] O tampão inicial pode estar definido a um pH pré-determinado para normalizar o pH de todas as amostras de esperma obtidas. Em uma forma de realização, o tampão é ajustado até um pH de 7,2. Adicionalmente, o sêmen pode se tornar crescentemente ácido ao longo do tempo, possivelmente devido a proteínas no fluido seminal, ou devido a subprodutos ácidos de células mortas ou morrendo. O tampão inicial introduz ligações de ligação de prótons livres (i.e., H⁺) suficientes para manter o pH próximo do alvo pré-determinado. Mesmo à luz da tendência natural do esperma de se tornar mais ácido ao longo do tempo, o tampão /53 inicial proporciona um meio para estabilização do pH ao longo de passos de processamento adicionais.

[039] Como um exemplo, a amostra de esperma pode ser diluída no tampão de elevada capacidade em razões de cerca de 1:1 a cerca de 1:10. A mistura resultante terá uma concentração de esperma muitas vezes abaixo das concentrações de esperma natural para uma espécie particular. O esperma estendido pode ser centrifugado de modo a reconcentrar o esperma, A centrifugação do esperma e remoção do sobrenadante permitem que o esperma seja reconcentrado até uma concentração pré-determinada. A concentração pré-determinada pode ser selecionada com base em passos de processamento de esperma adicionais. Por exemplo, no caso de bovinos separados quanto ao sexo, o esperma pode ser reconcentrado a entre cerca de 2400 milhões de espermatozóides por mL e cerca de 900 milhões de espermatozóides por mL para simular uma faixa de concentrações natural. Outras concentrações, tais como entre cerca de 1400 milhões de espermatozóides por mL e cerca de 2100 milhões de espermatozóides por mL, ou entre cerca de 1700 milhões de espermatozóides por mL e cerca de 2100 milhões de espermatozóides por mL, podem ser também alcançadas para processamento adicional.

[040| O ajuste da concentração e pH do esperma pode proporcionar um ponto de partida uniforme para processamento adicional. Por exemplo, um pH e concentração relativamente consistentes podem proporcionar maior previsibilidade na coloração do esperma, por exemplo com um corante seletivo quanto a DNA. Se cada amostra for ajustada até aos mesmos pH e concentração pré-determinados, menos ensaios podem ser requeridos em cada nova coleta para assegurar coloração adequada para separação com base no sexo.

|041| A população de espermatozóides incluirá espermatozóides portadores de cromossomo X e espermatozóides portadores de

14/53 cromossomo Y. Adicionalmente, cada um dos espermatozóides portadores de cromossomo X e dos espermatozóides portadores de cromossomo Y incluirá espermatozóides viáveis e espermatozóides não viáveis. Os espermatozóides viáveis podem ser considerados espermatozóides com membranas intactas enquanto os espermatozóides não viáveis podem ser considerados espermatozóides com membranas comprometidas. A distinção entre espermatozóides viáveis e espermatozóides não viáveis em separação de espermatozóides convencional é determinada com a inclusão de um corante de extinção que permeia os espermatozóides com membranas comprometidas. Os espermatozóides que tendem a estar mortos ou morrendo absorvem o corante de extinção e produzem sinais de fluorescência distintos da população de espermatozóides restante, ao passo que os espermatozóides tendo membranas intactas tendem a ser espermatozóides viáveis que prevenirão captação do corante de extinção. Os espermatozóides viáveis, na dosagem apropriada, serão geralmente capazes de alcançar fertilização em uma inseminação artificial, enquanto os espermatozóides não viáveis, ou espermatozóides com membranas comprometidas, podem ser incapazes de alcançar fertilização em uma inseminação artificial ou terão uma capacidade grandemente reduzida de a fazer. No entanto, alguns espermatozóides capazes de fertilização podem ter membranas comprometidas, e alguns espermatozóides com membranas intactas podem ser incapazes de fertilização.

[042] Quer padronizados ou não, os espermatozóides podem ser corados com um tampão de coloração para introdução de um corante seletivo quanto a DNA. No passo de coloração, pelo menos uma porção da população de espermatozóides é incubada com um tampão de coloração e um corante fluorescente seletivo quanto a DNA de modo a colorir estequiometricamente o conteúdo de DNA de cada célula na população de células. Hoechst 33342 tende a ser menos tóxico do que outros corantes

15/53 seletivos quanto a DNA. O veículo para distribuição deste corante pode estar na forma de um tampão de TALP modificado ajustado até um pH de cerca de 7,4. Hoechst 33342 é descrito na Patente dos EUA 5,135,759 e é comummente usado para este propósito. No entanto poderíam ser também usados outros corantes excitáveis por UV, bem como corantes excitáveis por luz visível, poliamidas fluorescentes, sequências de nucleotídeos fluorescentes, e anticorpos específicos quanto ao sexo.

[043] Os espermatozóides em um estado natural não são frequentemente permeáveis a tais corantes. De modo a se produzir uma coloração uniforme, o primeiro passo da coloração pode incluir incubação de pelo menos uma porção da população de espermatozóides a uma temperatura elevada em um tampão de coloração a um pH elevado adicionalmente ao corante. Exemplos de tampões de primeira coloração apropriados podem ser um TALP, TES-TRIS, TRIS citrato, citrato de sódio, ou um meio à base de EIEPES, cada um descrito em W02005/095960, incorporada aqui por referência. Um TALP modificado exemplar descrito em WO2001/37655, incorporada aqui por referência, está ilustrado na Tabela 1.

TABELA 1 - Tampão de TALP Modificado

Ingrediente Concentração

NaCI 95,0 mM

KCI 3,0 mM

NaHPO< 0,3 mM

NaHCO₃ 10,0 mM

MgCI₂6H₂O 0,4 mM

Piruvato de Na 2,0 mM

Glucose 5,0 mM

Lactato de Na 25,0 mM

HEPES 40,0 mM albumina de soro bovino 3,0 mg/mL

16/53 [044] Como um exemplo, a população de espermatozóides, ou uma porção da população de espermatozóides, podería ser diluída com o primeiro tampão até entre 640 x 10⁶ e 40 x 10⁶ espermatozoides/mL, até entre cerca de 320 x 10⁶ e 80 x 10⁶ espermatozoides/mL, ou até cerca de 160 x IO⁶ espermatozoides/mL no primeiro tampão. O corante fluorescente seletivo quanto a DNA pode ser adicionado aos espermatozóides suspensos no primeiro tampão em uma concentração de entre cerca de 10 μΜ e 200 μΜ; entre cerca de 20 μΜ e 100 μΜ, ou entre cerca de 30 μΜ e 70 μΜ. O pH do primeiro tampão pode estar entre cerca de 6,8 e 7,9; cerca de 7,1 e 7,6; ou a cerca de 7,4 de modo a ajudar a assegurar uma coloração uniforme do DNA nuclear. Aqueles com perícia ordinária na técnica apreciarão que o pH pode ser elevado com a adição de NaOH e diminuído com a adição de HC1.

[045| A população de espermatozóides pode ser incubada entre 3039 °C, entre cerca de 32-37 °C, ou a cerca de 34 °C. O período de incubação pode variar entre cerca de 20 minutos e cerca de uma hora e meia, entre cerca de 30 minutos e cerca de 75 minutos, ou durante cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos. Como um exemplo, a população de espermatozóides pode ser incubada durante cerca de 45 minutos a 34 °C. Mesmo dentro de uma única espécie, a concentração e pH dos espermatozóides e outros fatores afetando a capacidade de coloração podem variar de animal para animal. Aqueles com perícia ordinária podem apreciar variações mínimas para incubação de esperma entre espécies e mesmo entre raças ou animais da mesma raça para se alcançar coloração uniforme sem sobrecoloração de uma população de espermatozóides.

|046] Adicionalmente ao corante fluorescente seletivo quanto a DNA, um corante de extinção pode ser aplicado para o propósito de permeação de espermatozóides com membranas comprometidas e extinção dos sinais que eles produzem. Um corante de extinção de morte pode ser

17/53 entendido como incluindo corantes que se associam diferencialmente a espermatozóides com membranas comprometidas. Pode ser que esses corantes entrem nos espermatozóides com membranas comprometidas mais facilmente porque as membranas estão se desagregando ou de outro modo crescentemente porosas. Pode ser também que esses corantes de extinção de morte entrem prontamente em todos os espermatozóides e que os espermatozóides saudáveis atuem para bombear ativamente os corantes de extinção de morte para fora mais rapidamente do que os espermatozóides com membranas comprometidas. Em qualquer um dos casos, os espermatozóides com os quais os corantes de extinção de morte se associam incluem uma grande porção de espermatozóides mortes e morrendo, embora não necessariamente todos os espermatozóides mortos e morrendo. Os sinais extintos produzidos a partir de espermatozóides com membranas comprometidas tendo uma associação ao corante de extinção são distintos o suficiente dos sinais de espermatozóides saudáveis que eles podem ser removidos da análise e separação adicionais aplicados aos espermatozóides viáveis.

[047] Em uma forma de realização é realizado um segundo passo de coloração que reduz adicionalmente a concentração do esperma e introduz o corante de extinção de morte. O pH da segunda solução de coloração pode ser direcionado para alcançar um pH alvo na amostra de esperma final. Descrições exemplares de processos de coloração em dois passos são descritas no Pedido Internacional PCT Publicado WO 201 1/123166 e Pedido Internacional PCT/US12/58008, a divulgação inteira de ambos é incorporada aqui por referência.

[048] Em outra forma de realização, o corante de extinção e o corante seletivo quanto a DNA são aplicados em conjunto em um único tratamento. Em esta forma de realização, o corante de extinção é incubado em conjunto com o corante seletivo quanto a DNA a uma temperatura

18/53 elevada no TALP modificado que pode estar a um pH de 7,4. Em esta forma de realização se acredita que existe uma sinergia quando o esperma é padronizado a um pH elevado de cerca de 7,2 antes de coloração a 7,4. Deste modo, o pH ao qual o esperma é exposto permanece em uma faixa constante com variações mínimas. Porque tanto o tampão de coloração e o extensor inicial têm capacidades tamponantes elevadas se acredita que a tendência natural dos espermatozóides de se tomarem mais ácidos ao longo do tempo será evitada. Adicionalmente, por minimização das mudanças no pH vistas pelos espermatozóides se acredita que os espermatozóides estão em uma condição mais saudável para enfrentarem as várias pressões e estresses suportados no processo de separação com base no sexo.

Separação de Esperma Corado [049] Previamente, os instrumentos de separação de partículas operados para o propósito de separação de esperma se baseavam no princípio de alcance de elevados níveis de produtividade em termos de espermatozóides separados por segundo. No entanto pode ser realizada separação com elevada eficácia em uma tal máquina com o objetivo de recuperar uma porção dos espermatozóides desejados tão grande quanto possível. Ao passo que focos prévios na produtividade e/ou pureza falharem em alcançar eficácia significativa com um ejaculado. Por exemplo, um MoFlo XDP, disponível da Beckman Coulter (Miami FL, EUA), pode ser definido para taxas de eventos de cerca de 40.000 eventos por segundo, para alcance de entre cerca de 4.000 e cerca de 8.000 separações por segundo, enquanto alcança 90 por cento de pureza. No entanto pode ser alcançada produtividade (taxas de separação) mais elevada à custa de uma ou ambas de pureza e eficácia. Em uma combinação sinérgica com métodos de coloração melhorados, concentrações de esperma mais elevadas, e mortes à entrada menores, proporcionam um

19/53 veículo para melhoria das taxas de separação enquanto mantêm eficácia da separação e purezas padrão melhoradas.

[050] Quer padronizada ou não e quer corada em um único passo ou em dois passos, a população de espermatozóides pode ser separada por um instrumento de separação de partículas, tal como citômetro de fluxo. No que se refere à FIG. 1 está ilustrado um citômetro de fluxo com jato no ar (10), embora a separação possa ser realizada com chips microfluídicos ou outros tipos de citômetros de fluxo, incluindo citômetro de fluxo tendo câmaras fechadas e citômetros incorporando lasers de ablação. O citômetro de fluxo (10) inclui uma fonte de células (12) para produção de um fluxo de amostra de esperma, tal como um fluxo de amostra de esperma corado, para separação. A taxa à qual a amostra de esperma é distribuída ao bocal (14) pode ser considerada o caudal da amostra, e pode ser determinada por uma pressão de amostra aplicada à fonte de células (12). O fluxo da amostra de esperma corado é depositado dentro de um bocal (14) e introduzido em, ou flui para, uma corrente de fluido (16) do fluido de revestimento (18). O fluido de revestimento (18) pode ser fornecido por uma fonte de fluido de revestimento (20) tal que a fonte de células (12) forneça o esperma ao fluido de revestimento (18) são concorrentemente alimentados através do bocal (14). O fluido de revestimento (18) pode ser fornecido a uma taxa do fluido de revestimento que é determinada por uma pressão de revestimento aplicada na fonte do fluido de revestimento (20). Deste modo, o fluido de revestimento (18) forma uma corrente de fluido coaxialmente rodeando a amostra tendo esperma corado que sai do bocal (14) no orifício do bocal (22). Ao proporcionar um oscilador (24) que pode ser precisamente controlado com um controle do oscilador (26), ondas de pressão podem ser estabelecidas dentro do bocal (14) e transmitidas aos fluidos saindo do bocal (14) no orifício do bocal (22). Em resposta às ondas de pressão, a corrente de fluido (16) saindo do orifício do bocal (22) forma

20/53 eventualmente gotículas regulares (28) a intervalos precisos. A frequência, e em alguma medida a forma das gotículas formadas, pode ser controlada por uma frequência de queda e amplitude de queda fornecidas ao oscilador (24) ou ao controlador do oscilador (26).

1051] Cada gotícula, assim formada, retém o fluido de revestimento e a amostra de esperma que formou previamente uma porção da corrente de fluido (16). Porque os espermatozóides corados estão rodeados pela corrente de fluido (16) ou ambiente do fluido de revestimento, as gotículas (28) contêm idealmente espermatozóides individualmente isolados. No entanto, a concentração da amostra, pressão da amostra, e outros parâmetros do instrumento ditam a frequência com a qual múltiplas células ocuparão regularmente uma única gotícula, bem como as percentagens de gotículas contendo espermatozóides.

[052] O citômetro de fluxo (10) atua para separar gotículas com base nas características dos espermatozóides que se prevê estarem contidos dentro das gotículas. Isto pode ser alcançado através de um sistema sensor de células (30) em comunicação com um analisador (36). O sistema sensor de células (30) inclui pelo menos um sensor (32) responsive às células contidas dentro da corrente de fluido (16). O sistema sensor de células (30) proporciona dados ao analisador (36), que podem causar uma ação dependendo da presença relativa ou ausência relativa de uma característica das células na corrente de fluido (16). Certas características, tais como o conteúdo de DNA relativo dos espermatozóides, podem ser detetadas através de excitação com uma fonte de radiação eletromagnética (34), tal como um laser gerando um feixe de irradiação ao qual os espermatozóides corados são responsivos. A fonte de radiação eletromagnética (34) pode ser um laser operado a comprimento de onda de UV, tal como a cerca de 355 nm. Um exemplo de um tal laser pode ser um Vanguard 350 (disponível da Spectra-Physics), que opera a 350 mW. Várias óticas podem ser usadas /53 para moldar o perfil de feixe do laser, dividir o feixe em mais do que uma corrente, ou reduzir a potência do feixe a uma corrente. Exemplos não limitantes de tais óticas podem ser encontrados em WO/2004/104178 e WO/2001/85913, sendo cada uma incorporada aqui por referência.

[053] As características de espermatozóides individuais, particularmente a presença de um cromossomo X ou cromossomo Y, podem ser determinadas a partir da fluorescência produzida em resposta à fonte de radiação eletromagnética (34). Em particular, as configurações do sistema sensor de células (34) podem estar em comunicação com um analisador para proporcionar uma variedade de fluorescência em formação, tal como a fluorescência direta de um evento, a fluorescência lateral de um evento, ou a quantidade de dispersão associada a um evento. O analisador (36) pode incluir instruções escritas para análise dos sinais produzidos pelo um ou mais sensores (32) no sistema sensor de células (30). O corante fluorescente seletivo quanto a DNA se liga estequiometricamente a DNA dos espermatozóides. Porque espermatozóides portadores de cromossomo X contêm mais DNA do que espermatozóides portadores de cromossomo Y, os espermatozóides portadores de cromossomo X conseguem se ligar a uma maior quantidade de corante fluorescente seletivo quanto a DNA do que espermatozóides portadores de cromossomo Y. Assim, por medição da fluorescência emitida pelo corante ligado após excitação é possível diferenciar entre espermatozóides portadores X e espermatozóides portadores de Y. As distinções, tais como espermatozóides que são viáveis ou não viáveis, podem ser diferenciadas adicionalmente a espermatozóides orientados e não orientados pelo analisador (36) de acordo com regiões de intercepção incorporando lógica de intercepção.

1054] De modo a se alcançar separação e isolamento com base em características de esperma corado, a luz emitida pode ser detetada pelo sensor (32) e a informação alimentada a um analisador (36) acoplado a um

22/53 carregador de gotículas que carrega diferencialmente cada gotícula (28) com base nas características dos espermatozóides corados contidos dentro dessa gotícula (28). Deste modo, o analisador (36) atua para permitir que as placas de deflexão eletrostática (36) deflitam gotículas (28) com base em se elas contêm ou não a partícula ou célula apropriada.

[055] Como um resultado, o citômetro de fluxo (10) atua para separar espermatozóides corados fazendo com que as gotículas (28) contendo espermatozóides sejam direcionadas para um ou mais contentores de coleta (40). Por exemplo, quando o analisador diferencia espermatozóides com base em uma característica dos espermatozóides, as gotículas arrastando espermatozóides portadores de cromossomo X podem ser carregadas positivamente e assim defletirem em uma direção, enquanto as gotículas arrastando espermatozóides portadores de cromossomo Y podem ser carregadas negativamente e assim defletirem para o outro lado, e a corrente de desperdício (isto é, gotículas que não arrastam uma partícula ou célula ou arrastam células indesejadas ou inseparáveis) pode ser deixada não carregada e é assim coletada em uma corrente não defletida em um tubo de sucção ou similar. Alternativamente, um dos espermatozóides portadores de cromossomo X ou dos espermatozóides portadores de cromossomo Y pode ser coletado, enquanto o outro é descartado com desperdício.

[056] Um controlador (42) pode formar uma porção do analisador (36) ou pode ser um componente externo ao analisador (36). O controlador (42) ilustrado pode também representar uma coleção de controladores individuais. O controlador (42) pode receber sinais ou instruções do analisador (36) e em resposta pode modificar um ou mais parâmetros do instrumento, tais como o caudal da amostra, pressão da amostra, caudal de revestimento, pressão de revestimento, frequência de queda, ou amplitude de queda e similares. O controlador (42) pode também proporcionar uma / 53 interface para entradas do operador para ajustar manualmente o caudal da amostra, pressão da amostra, caudal de revestimento, pressão de revestimento, frequência de queda, ou amplitude de queda e similares. O analisador (36) pode incluir instruções escritas para modificação dos parâmetros do instrumento em resposta a parâmetros de separação medidos, ou as modificações a parâmetros do instrumento podem ser manualmente realizadas por um operador ajustando várias definições. As modificações aos parâmetros do instrumento podem ser levadas a cabo no analisador (36) tal como por mudança da lógica de separação, lógica de intercepção, regiões de separação, ou regiões de intercepção e outros parâmetros específicos para fazer decisões de separação no analisador. Modificações adicionais aos parâmetros do instrumento podem ser efetuadas por um controlador (42), para controle de vários componentes externos ao analisador, tal como para controle da pressão da amostra, caudal da amostra, pressão de revestimento, caudal de revestimento, frequência de queda, e amplitude de queda.

|057| Voltando-se agora para a FIG. 2, um instrumento de separação de partículas alternativo é parcialmente ilustrado na forma de um chip microfluídico (60). O chip microfluídico (60) pode incluir uma entrada de amostra (62) para introdução de amostra contendo partículas ou células em uma câmara de fluidos (64) e através de uma zona de inspeção (66). A amostra introduzida através da entrada de amostra (62) pode estar isolada de paredes de canal interiores e/ou hidrodinamicamente focada com um fluido de revestimento introduzido através de uma entrada de revestimento (68). A amostra pode ser interrogada na zona de inspeção (66) com uma fonte de radiação eletromagnética (34), tal como um laser, lâmpada de arco, ou outra fonte de eletricidade eletromagnética. A luz emitida ou refletida resultante pode ser detetada por um sensor (32) e analisada com um analisador (36), como aquele descrito na FIG. 1. Cada um da pressão de

24/53 revestimento, pressão da amostra, caudal de revestimento, e caudal da amostra no chip microfluídico pode ser manipulado de um modo similar a um citômetro de fluxo com jato no ar, por ajustes automáticos realizados pela execução de instruções escritas no analisador (36) ou por ajustes manuais realizados por um operador.

[058] Uma vez inspecionadas, as partículas ou células na câmara de fluidos (64) podem ser mecanicamente desviadas de um primeiro caminho de fluxo (70) para um segundo caminho de fluxo (72) com um separador (74), para alteração da pressão de fluido ou desvio do fluxo de fluido. Se pode também permitir que partículas ou células continuem a fluir ao longo do primeiro caminho de fluxo (70) para coleta. O separador (74) ilustrado compreende uma membrana que, quando côncava, pode desviar as partículas para o segundo caminho de fluxo (72). Outros dispositivos de mudança mecânica ou eletromecânica tais como transdutores e comutadores podem ser também usados para desviar o fluxo de partículas.

[059] A FIG. 3 ilustra um gráfico bivariado representativo de fluorescência lateral e fluorescência direta de um citômetro de fluxo com jato no ar de esperma corado, que pode ser gerado por um analisador (36). A representação visual de dados pode ser usada por um operador para receber feedback se relacionando com a amostra sofrendo separação e para demonstrar graficamente certos aspetos da lógica de separação corrente. Rl, por exemplo, pode ser vista como uma região de intercepção que pode ser aplicada à lógica de separação do citômetro de fluxo. Entrada numérica adicional pode ser proporcionada em uma exibição do analisador (36). Tal entrada numérica pode estar na forma de parâmetros de separação medidos, tais como uma taxa de eventos, uma taxa de interrupção, taxa de separação, eficácia da separação, ou a percentagem de partículas em qualquer região ou gate. Rl é ilustrada como uma região que pode ser considerada a região live oriented, porque as fronteiras de Rl incluem duas populações densas

25/53 de células que refletem uma população portadora de cromossomo X de espermatozóides e população portadora de cromossomo Y de espermatozóides intimamente relacionadas. R2 é uma região de intercepção definida em torno dos espermatozóides não viáveis, ou os espermatozóides com membranas comprometidas cuja fluorescência é extinta por um corante de extinção de morte. Embora possa ser empregue uma variedade de lógicas de separação, duas estratégias se relacionando com RI e R2 poderíam ser um primeiro passo em uma lógica de separação pela qual todos os eventos estando em RI são aceites para processamento ou intercepção adicional. Alternativamente, todos os eventos estando fora de R2 são aceites para processamento ou intercepção adicional.

[060] A FIG. 4 ilustra um gráfico univariado na forma de um histograma que pode ser produzido pelo analisador (36) e gerado em uma apresentação gráfica para um operador. Os dados ilustrados na FIG. 4 podem representar o número de ocorrência de picos de intensidade de sinal da fluorescência lateral ou direta dentro de um certo período. No caso de espermatozóides, os espermatozóides portadores de cromossomo X e os espermatozóides portadores de cromossomo Y tendem a ter picos de intensidade que variam em entre 2 e 5 %, dependendo da espécie, e esta diferença é refletida na distribuição bimodal dos picos de intensidade vista na FIG. 3. Porque os espermatozóides portadores de cromossomo X e os espermatozóides portadores de cromossomo Y tendem a ter diferentes valores de fluorescência, cada um dos picos representa ou espermatozóides portadores de cromossomo X ou espermatozóides portadores de cromossomo Y. Com base na lógica de separação aplicada dentro de uma analisador (36), a população de células no histograma pode ser somente aquelas células que se determinou serem células orientadas viáveis, tais como aquelas estando em RI na FIG. 3, ou podem representar células que não se determinou estarem mortas ou serem indesejáveis, tais como todos

26/53 os eventos exceto aqueles estando em R2, Uma variedade de parâmetros de separação pode ser derivada da informação contida dentro deste histograma. Por exemplo, o nível de distinção entre os dois picos pode proporcionar uma indicação de como uma pureza separada poderá parecer. A FIG. 4 ilustra adicionalmente medições de intensidade relativa no ponto mais baixo entre os dois grupos, que pode ser considerado um valor V e uma segunda intensidade relativa no pico ou picos do histograma em P. Uma inspeção visual de um histograma pode proporcionar ao operador uma ideia de como um citômetro de fluxo está a operar, mas instruções de computador previamente escritas para determinação de um valor P, um valor V, e uma razão de V em relação a P não foram implementadas em citômetros de fluxo. A razão vale em relação a pico pode ser determinada como um parâmetro de separação medido periodicamente durante o decurso da separação. A razão vale em relação a pico, embora não necessariamente completamente determinadora de purezas de separação, pode proporcionar um meio para se estimar rapidamente os valores de pureza, ou pela execução de instrução escrita no analisador (36), ou por inspeção visual por um operador. Altemativamente, a razão pico em relação a vale pode proporcionar um valor que pode ser utilizado de um modo similar.

[0611 Voltando-se para a FIG. 5, um segundo gráfico bimodal pode ser gerado pelo analisador (36) em resposta a sinais adquiridos pelo sistema sensor de células (30). O gráfico bimodal pode representar um primeiro eixo ilustrando o pico do valor de intensidade de um sinal de fluorescência direta ou o pico de intensidade de sinal de fluorescência lateral. Como a FIG. 4, os dados ilustrados na FIG. 5 podem ser interceptados tal que somente eventos estando em RI na FIG. 3 estejam incluídos. Alternativamente, no caso de espermatozóides, todos os eventos que não estão na gate de morte R2 podem estar também exibidos.

27/53 [062] R3 pode representar uma X-sort gate para coleta de espermatozóides portadores de cromossoma X. O termo X-sort gate pode ser usado indistintamente aqui com o termo X-gate. Com referência à FIG. 5 pode demonstrar como a mudança das dimensões das regiões de intercepção pode afetar a eficácia, pureza, e produtividade. Se a região R3 fosse expandida podería ser visto que a todos os segundos mais espermatozóides seriam separados como espermatozóides portadores de cromossomo X resultando em eficácia de separação mais elevada e produtividade mais elevada. No entanto, a expansão da gate ou região R3 começaria a incluir eventos tendo uma probabilidade aumentada de serem espermatozóides portadores de cromossomo Y. De modo a aumentar a pureza separada de espermatozóides, a região R3 pode ser tornada mais pequena e/ou movida para longe da região de cromossomo Y. A medida que menos eventos ocorrem dentro da X-sort gate, menos espermatozóides são separados na população de espermatozóides portadores de cromossomo X e aqueles que são têm uma maior probabilidade de serem de fato espermatozóides portadores de cromossomo X, significando que a pureza coletada pode ser aumentada. No entanto, tanto a eficácia, em termos de células coletadas, como a produtividade, em termos de separações por segundo, diminuirão à medida que menos eventos ocorrem na região R3. Adicionalmente, à medida que outros parâmetros do instrumento são modificados, os gráficos ilustrados das FIG. 3, FIG. 4, e FIG. 5 podem mudar em forma e natureza. Por exemplo, o aumento da pressão de uma amostra ou caudal de uma amostra pode resultar em uma redução na razão vale em relação a pico, ou pode de outro modo atenuar a distinção bimodal entre espermatozóides portadores de cromossomo X e espermatozóides portadores de cromossomo Y.

[063] Voltando-se para a FIG. 6 está ilustrado um método (200) de separação eficaz de esperma na forma de um fluxograma. O método pode

28/53 se iniciar com o passo de definição de uma pureza (210), que pode ser uma pureza limiar mínima. O limiar de pureza mínimo pode ser definido por um operador com base em um desempenho esperado de um instrumento de separação de partículas bem como com base no desempenho esperado de um ejaculado particular, ou um animal particular. Alternativamente pode ser estabelecido um limiar de pureza mínimo após uma amostra ter sido parcialmente analisada ou separada. O limiar de pureza mínimo pode ser colocado no analisador (36) para comparação contra vários parâmetros de separação medidos, ou pode ser mantido por um operador, para fazer ajuste manual ao dispositivo de separação de partículas com base em parâmetros de separação medidos. O limiar de pureza mínimo pode ser definido a cerca de 86 %, a cerca de 87 %, a cerca de 88 %, a cerca de 89 %, a cerca de 90 %, a cerca de 91 %, a cerca de 92 %, a cerca de 92 %, a cerca de 93 %, a cerca de 94 %, a cerca de 95 %, a cerca de 96 %, a cerca de 97 %, a cerca de 98 %, ou a cerca de 99 %.

1064] A produtividade pode ser definida (220) antes de a pureza ser definida, após a pureza ser definida, ou ao mesmo tempo. A produtividade pode ser determinada em termos de separações por segundo ou pode ser definida como um limiar de produtividade mínimo. Deve ser apreciado que as amostras de esperma que são coradas de um modo que reduz o número de espermatozóides mortos e são separadas a concentrações crescentes podem ser separadas a produtividades particularmente elevadas. Podem ser alcançados aumentos adicionais na produtividade por expansão das regiões de separação e redução do limiar de pureza mínimo.

[065] O limiar de produtividade mínimo pode ser definido a cerca de 3.000 separações por segundo, 3.500 separações por segundo, cerca de 4.000 separações por segundo, cerca de 4.500 separações por segundo, cerca de 5.000 separações por segundo, cerca de 5.500 separações por segundo, cerca de 6.000 separações por segundo, cerca de 6.500 separações

29/53 por segundo, cerca de 7.000 separações por segundo, cerca de 7.500 separações por segundo, cerca de 8.000 separações por segundo, cerca de 8.500 separações por segundo, cerca de 9.000 separações por segundo, cerca de 9.500 separações por segundo, cerca de 10.000 separações por segundo, cerca de 10.500 separações por segundo, cerca de 11.000 separações por segundo, cerca de 11.500 separações por segundo, cerca de 12.000 separações por segundo, cerca de 12.500 separações por segundo, cerca de 13.000 separações por segundo, cerca de 13.500 separações por segundo, ou cerca de 14.000 separações por segundo.

[066| Logo que cada um dos limiares mínimos da pureza e da produtividade estejam definidos, uma instrumento de separação de partículas pode iniciar, ou continuar, a operação de análise e separação de partículas (230). No decurso da operação, os parâmetros de separação podem ser determinados (240). Os parâmetros de separação podem incluir aquelas condições se relacionando com separação pré-formada em um instrumento de separação de partículas. Os parâmetros de separação podem incluir parâmetros de separação medidos, parâmetros que são determinados offline, parâmetros estimados por um operador, e condições se relacionando com uma população separada de partículas ou células. Os parâmetros de separação medidos podem ser determinados no analisador (36) e podem incluir aquelas condições se relacionando com separação medida diretamente, calculada, ou determinada em um instrumento de separação de partículas enquanto se analisa e/ou separa uma população de partículas ou células, tais como a taxa de eventos, taxa de separação, eficácia da separação, taxa de interrupção, percentagem de morte à entrada, live oriented gate percentage, razão vale em relação a pico, ou a percentagem de eventos em outras gates de separação, tais como uma Xsort gate ou uma Y-sort gate.

30/53 [067] Uma pureza para comparação com o limiar de pureza mínimo pode ser estimada por um operador com base nas representações gráficas geradas pelo analisador, tal como ilustrados nas FIG. 3, FIG. 4, e FIG. 5. Uma pureza pode ser também determinada offline, tal como em uma análise de pureza subsequente de núcleos de espermatozóides. A pureza pode ser também estimada com a execução de instruções escritas no analisador (36). O analisador (36) pode avaliar os parâmetros de separação medidos, tais como a razão vale em relação a pico, para estimar a pureza. Um algoritmo para estimativa da pureza pode incorporar dados empíricos baseados em razões vale em relação a pico prévias coordenados com purezas subsequentemente determinadas offline de esperma sonicado (espermatozóides sem caudal ou núcleos de espermatozóides).

|068] A produtividade determinada no analisador (36) pode ser comparada a partir dos parâmetros de separação medidos diretamente contra o limiar de produtividade mínimo (260). No caso de ambas a pureza e produtividade, determinadas de qualquer modo, estarem acima dos seus respectivos valores limiares mínimos, um ou mais parâmetros do instrumento podem ser ajustados para aumentar a eficácia de separação (280). Os parâmetros do instrumento podem ser ajustados manualmente por um operador, ou o analisador pode executar instruções escritas automaticamente para variação da pressão da amostra, do caudal da amostra, ou uma ou mais regiões de separação. Como um exemplo, onde as purezas são determinadas para estarem bem acima do limiar de pureza mínimo.

[069] Como um exemplo, a lógica de separação pode ser ajustada. A lógica de separação pode ser considerada a lógica aplicada pelo analisador (36) para se determinar que células são separadas e quais são descartadas com desperdício. A lógica de separação pode incluir uma lógica de intercepção que determina quando eventos coincidentes serão interceptados

31/53 no decurso da separação. Por exemplo, quando é desejada uma pureza elevada, todos os eventos coincidentes podem ser interceptados, ao passo que, quando é desejada produtividade elevada, pode ser aplicada uma lógica de intercepção que aceita eventos coincidentes. Dependendo da frequência e precisão com as quais a pureza é determinada, uma percentagem de eventos coincidentes pode ser também aceite.

[070] Como outro exemplo, as gates de separação ou regiões de separação podem ser modificadas. Quando ambas a pureza e a produtividade estão acima dos seus respectivos limiares, as gates de separação, tais como a gate de vida ilustrada na FIG. 3 como Rl, podem ser alargadas para incluir mais eventos. Similarmente, a X-sort gate ilustrada na FIG. 5 como R3, a Y-sort gate ilustrada na FIG. 5 como R4, ou ambas, podem ser alargadas para separar mais partículas.

1071] Em uma forma de realização, uma mudança na frequência de queda pode reduzir o número de eventos coincidentes por produção de mais gotículas em um dado período de tempo e com menos gotículas tendo mais do que uma célula. Similarmente, a amplitude de queda pode ser modificada.

|072| Em uma forma de realização, o caudal da amostra pode ser modificado quando o limiar de pureza mínimo e produtividade mínima são cumpridos. De modo a aumentar a eficácia da separação, a pressão da amostra, ou correspondentemente o caudal da amostra, pode ser reduzida. Uma tal redução no caudal da amostra aumenta a eficácia por redução do número de eventos coincidentes e melhoria do alinhamento e orientação das células. Conformemente, de modo a aumentar adicionalmente a eficácia, as regiões de separação podem ser expandidas enquanto se reduz a pressão da amostra ou caudal da amostra.

1073] O caudal do fluido em combinação com a concentração de células na amostra em conjunto afetam diretamente o parâmetro medido da

32/53 taxa de eventos. O parâmetro medido da taxa de eventos pode ser depois direcionado para melhorar a eficácia da separação. A taxa de eventos pode ser direcionada entre 2.000 e 20.000 eventos por segundo a concentrações padrão de esperma, tal como uma amostra de esperma entre 75 e 100 milhões de espermatozóides por mL. A elevadas concentrações de esperma, tal como 150 milhões de espermatozóides por mL e mais, as taxas de eventos podem ser direcionadas entre 2.000 eventos por segundo e 35.000 eventos por segundo, ou mais elevado.

1074] No caso de qualquer uma da pureza e produtividade, determinadas de qualquer modo, estarem acima dos seus respectivos valores limiares mínimos, um ou mais parâmetros do instrumento podem ser ajustados para diminuir a eficácia da separação, ou para aumentar qualquer uma da pureza ou produtividade (270). Os parâmetros do instrumento podem ser ajustados manualmente por um operador, ou o analisador pode executar instruções escritas automaticamente para variação da pressão da amostra, do caudal da amostra, ou uma ou mais regiões de separação.

[075| Como uma forma de realização exemplar, quando o limiar mínimo de produtividade é excedido, mas o limiar mínimo de pureza não, o caudal da amostra pode ser reduzido, ou uma ou mais da região de separação live oriented (RI) ou da X-sort gate (R3) ou Y-sort gate (R4) podem ser diminuídas para incluir menos eventos, incluindo aqueles eventos que tendem a estar fora da pureza requerida. Similarmente, no caso de a lógica de intercepção ter estado a operar em um modo de aceitação de coincidências pode ser trocada para um modo de rejeição de coincidências, ou para um modo que rejeita uma percentagem aumentada de eventos coincidentes. No caso de o limiar de pureza mínimo ser cumprido, mas o limiar de produção mínima não, uma ou mais regiões de separação podem ser aumentadas em tamanho para incluir mais eventos.

33/53 [076] Após quaisquer modificações, o instrumento de separação de partículas pode continuar a operar e os parâmetros de separação podem continuar a ser determinados. Ajustes podem depois proceder para melhorar incrementalmente ou maximizar a eficácia da separação. Opcionalmente, os ajustes incrementais na direção de uma eficácia da separação máxima podem parar logo que a pureza ou a produtividade se aproxime de uma margem pré-determinada dos seus respectivos limiares mínimos.

[077] No que se refere à FIG. 7 está ilustrado um método (300) de separação eficaz de esperma, enquanto se maximiza a produtividade, na forma de um fluxograma. O método pode se iniciar com o passo de definição de uma pureza (310), que pode ser uma pureza limiar mínima. O limiar de pureza mínimo pode ser definido por um operador com base em um desempenho esperado de um instrumento de separação de partículas bem como com base no desempenho esperado de um ejaculado particular, ou menos um animal particular. Alternativamente pode ser estabelecido um limiar de pureza mínimo após uma amostra ter sido parcialmente analisada ou separada. O limiar de pureza mínimo pode ser colocado no analisador para comparação contra vários parâmetros de separação medidos, ou pode ser mantido por um operador, para fazer ajuste manual ao dispositivo de separação de partículas com base em parâmetros de separação medidos. O limiar de pureza mínimo pode ser definido a cerca de 86 %, a cerca de 87 %, a cerca de 88 %, a cerca de 89 %, a cerca de 90 %, a cerca de 91 %, a cerca de 92 %, a cerca de 92 %, a cerca de 93 %, a cerca de 94 %, a cerca de 95 %, a cerca de 96 %, a cerca de 97 %, a cerca de 98 % ou a cerca de 99 %.

[078] Uma eficácia da separação pode ser definida (320) antes de a pureza ser definida, após a pureza ser definida, ou ao mesmo tempo. A eficácia da separação pode ser determinada em termos da percentagem de

34/53 espermatozóides separados ou coletados ao longo de um período de tempo em relação à população total de espermatozóides analisada durante esse período de tempo. A eficácia da separação pode ser também determinada em termos de um rendimento em células vivas. Por exemplo, a eficácia da separação pode ser determinada como a percentagem de células separadas ou coletadas ao longo de um período de tempo em relação à população de células não consideradas como estando mortas ou sendo não viáveis (i.e., todas as células fora da região R2 vista na FIG. 3).

[079] Logo que cada um dos limiares mínimos da pureza e da eficácia da separação estejam definidos, um instrumento de separação de partículas pode iniciar, ou continuar, a operação (330) de análise e separação de partículas. No decurso da operação, os parâmetros de separação podem ser determinados (340). Os parâmetros de separação podem incluir aquelas condições se relacionando com separação préformada em um instrumento de separação de partículas. Os parâmetros de separação podem incluir parâmetros de separação medidos adicionalmente a parâmetros que são determinados offline, estimados por um operador, e condições se relacionando com uma população separada de partículas ou células. Os parâmetros de separação medidos podem ser determinados no analisador (36) e podem incluir aquelas condições se relacionando com separação medida diretamente, calculada ou determinada em um instrumento de separação de partículas enquanto se analisa e/ou separa uma população de partículas ou células, tais como a taxa de eventos, taxa de separação, eficácia da separação, taxa de interrupção, percentagem de morte à entrada, live oriented gate percentage, razão vale em relação a pico, ou a percentagem de eventos em outras gates de separação, tais como uma X-sort gate ou uma Y-sort gate.

[0801 Uma pureza para comparação com o limiar de pureza mínimo (350) pode ser estimada por um operador com base nas representações

35/53 gráficas geradas pelo analisador, tal como ilustrados nas FIG. 3, FIG. 4, e FIG. 5. Uma pureza pode ser também determinada offline, tal como em uma análise de pureza subsequente de núcleos de espermatozóides. A pureza pode ser também estimada com a execução de instruções escritas no analisador (36). O analisador (36) pode avaliar os parâmetros de separação medidos, tais como a razão vale em relação a pico, para estimar a pureza. Um algoritmo para estimativa da pureza pode ser desenvolvido a partir de dados empíricos baseados em razões vale em relação a pico prévias coordenados com purezas subsequentemente determinadas offline de esperma sonicado (p.ex., espermatozóides sem caudal ou núcleos de espermatozóides).

[081] A eficácia da separação determinada no analisador (36) pode ser comparada a partir dos parâmetros de separação medidos diretamente contra o limiar de eficácia da separação mínimo (360). No caso de ambas a pureza e eficácia da separação, determinadas de qualquer modo, estarem acima dos seus respectivos valores limiares mínimos, um ou mais parâmetros do instrumento podem ser ajustados para aumentar a produtividade (380). Os parâmetros do instrumento podem ser ajustados manualmente por um operador, ou o analisador pode executar instruções escritas automaticamente para variação da pressão da amostra, do caudal da amostra, ou uma ou mais regiões de separação.

[082] Como exemplo, a lógica de separação pode ser ajustada para aumentar a produtividade. A lógica de separação pode ser considerada a lógica aplicada pelo analisador (36) para se determinar que células são separadas e quais são descartadas com desperdício. A lógica de separação pode incluir uma lógica de intercepção que determina quando eventos coincidentes serão interceptados no decurso da separação. Por exemplo, quando é desejada uma pureza elevada, todos os eventos coincidentes podem ser interceptados, ao passo que, quando é desejada produtividade de / 53 separação elevada, pode ser aplicada uma lógica de intercepção que aceita eventos coincidentes. Altemativamente pode ser também aceite uma percentagem de eventos coincidentes.

|083] Como outro exemplo, as gates de separação ou regiões de separação podem ser modificadas. Quando ambas a pureza e a eficácia da separação estão acima dos seus respectivos limiares, as gates de separação, tais como ά gate de vida ilustrada na FIG. 3 como Rl, podem ser alargadas para incluir mais eventos de modo a aumentar a produtividade. Similarmente, a X-sort gate ilustrada na FIG. 5 como R3, a Y-sort gate ilustrada na FIG. 5 como R4, ou ambas, podem ser alargadas para separar mais partículas.

[084] Em uma forma de realização, uma mudança na frequência de queda pode reduzir o número de eventos coincidentes por produção de mais gotículas em um dado período de tempo e com menos gotículas tendo mais do que uma célula. Similarmente, a amplitude de queda pode ser modificada.

[085] Em uma forma de realização, o caudal da amostra pode ser modificado quando o limiar de pureza mínimo e limiares de eficácia da separação mínimos são cumpridos. De modo a aumentar a produtividade, a pressão da amostra, ou correspondentemente o caudal da amostra, pode ser aumentada. Um tal aumento no caudal da amostra aumenta o número de eventos por unidade tempo, possivelmente em detrimento em relação à eficácia e um ligeiro detrimento em relação à pureza. De modo a aumentar adicionalmente a produtividade e eficácia da separação, embora em detrimento da pureza, as regiões de separação podem ser expandidas enquanto se aumenta a pressão da amostra, ou caudal da amostra.

[0861 O caudal do fluido em combinação com a concentração de células na amostra afeta diretamente o parâmetro medido da taxa de eventos. O parâmetro medido da taxa de eventos pode ser depois

37/53 direcionado para melhorar a eficácia da separação enquanto se maximiza a produtividade. A taxa de eventos pode ser direcionada entre 2.000 e 20.000 eventos por segundo a concentrações padrão de esperma, tal como amostra de esperma entre 75 e 100 milhões de espermatozóides por mL. A elevadas concentrações de esperma, tal como 150 milhões de espermatozóides por mL e mais, as taxas de eventos podem ser direcionadas entre 2.000 eventos por segundo e 35.000 eventos por segundo, e mais elevado.

[087] No caso de qualquer uma da pureza e eficácia da separação, determinadas de qualquer modo, estarem acima dos seus respectivos valores limiares mínimos, um ou mais parâmetros do instrumento podem ser ajustados para diminuir a produtividade, ou para aumentar qualquer uma da pureza ou eficácia da separação (370). Os parâmetros do instrumento podem ser ajustados manualmente por um operador, ou o analisador pode executar instruções escritas automaticamente para variação da pressão da amostra, do caudal da amostra, ou uma ou mais regiões de separação.

|088] Como uma forma de realização exemplar, quando o limiar mínimo de eficácia da separação é excedido, mas o limiar mínimo de pureza não, o caudal da amostra pode ser reduzido, ou uma ou mais da região de separação live oriented (RI) ou da X-sort gate (R3) ou Y-sort gate (R4) podem ser diminuídas em tamanho ou trocadas para incluir menos eventos, excluindo efetivamente mais eventos que tendem a estar fora da pureza requerida. Similarmente, no caso de a lógica de intercepção ter estado a operar em um modo de aceitação de coincidências pode ser trocada para um modo de rejeição de coincidências, ou para um modo que rejeita uma percentagem aumentada de eventos coincidentes. No caso de o limiar de pureza mínimo ser cumprido, mas o limiar de eficácia da separação mínima não, uma ou mais regiões de separação podem ser

38/53 aumentadas em tamanho ou trocadas para incluir mais eventos, incluindo mais eventos que é mais provável que cumpram o limiar de pureza.

[089] Após quaisquer modificações, o instrumento de separação de partículas pode continuar a operar e os parâmetros de separação podem continuar a ser determinados. Ajustes podem depois proceder para melhorar incrementalmente ou maximizar a produtividade. Opcionaimente, os ajustes incrementais na direção de uma produtividade máxima podem parar logo que a pureza ou a eficácia da separação se aproxime de uma margem pré-determinada dos seus respectivos limiares mínimos.

|090| Várias modificações ao método descrito nas FIG. 6 e FIG. 7 podem ser implementadas de modo a acomodar diferentes animais. No caso de bovino, um reprodutor genômico jovem pode ter uma contagem de espermatozóides mais baixa em comparação com animais mais maduros. O limiar de pureza e/ou limiar de produtividade mínimos podem ser ajustados conformemente para alcançar um uso eficaz do esperma.

[091] Exemplo 1 - padronização de amostras de esperma e coloração em um passo [092] Coleta - Foi coletado esperma de cinco touros diferentes em um programa de coleta de rotina usando uma vagina artificial. Cada touro foi coletado duas ou três vezes em um dia. Dos cinco touros, dois eram touros Jersey e três eram touros Holstein. Todos os ejaculados continham mais do que 60 % de motilidade progressiva e a concentração de esperma variava de 857 milhões de espermatozóides por ml. a 2480 milhões de espermatozóides por mL. Os ejaculados coletados do mesmo touro foram agrupados, depois divididos em nove amostras de esperma para coleta e tratamentos de coloração.

[093] Coloração - Porções de cada ejaculado de touro foram coradas com nove métodos diferentes.

39/53 [094] (A) Controle (nenhuma padronização, separação em dois passos) - Foi estabelecido um controle que não incluiu o passo de padronização de ejaculados coletados e no qual o esperma foi corado em dois passos. Antes da coloração, as amostras de esperma foram concentradas até entre 1700 milhões de espermatozóides por mL e 1800 milhões de espermatozóides por mL por centrifugação ou pela adição de um tampão de tris-gema de ovo tendo um pH de 6,8, dependendo da concentração inicial das amostras.

[095] O esperma no grupo de controle foi diluído até 160 x 10⁶ espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado, como descrito na Tabela 6, a um pH de 7,4. Cada amostra de esperma no grupo de controle foi depois incubada com 16-17 pL de Hoechst 33342 por mL (64-68 μΜ) de amostra durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, um volume igual de um segundo TALP modificado foi adicionado reduzindo a concentração até 80 x 10 espermatozóides por mL. O segundo TALP modificado inclui os componentes descritos na Tabela 1 com a adição de gema de ovo a 4 %, corante alimentar amarelo No. 6 a 50 μΜ (20 g/L) e o pH foi diminuído para 5,5 com a adição de HC1.

[096] (B) Estendido (nenhuma padronização, coloração em dois passos) - No segundo grupo, o esperma não foi padronizado, mas foi estendido com um tampão e gema de ovo a 20 %. O esperma foi depois concentrado até entre 1700 milhões de espermatozóides por mL e 1800 milhões de espermatozóides por mL do mesmo modo descrito no que diz respeito ao grupo (A). O esperma foi depois diluído até 160 x 10 espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado, e corado do mesmo modo em dois passos descrito no grupo (A).

[0971 (C) Um Passo I (nenhuma padronização, coloração em um passo com gema de ovo a 1 %) - Em um terceiro grupo, o esperma foi coletado e a concentração foi ajustada do mesmo modo como o grupo de

40/53 controle (A). Cada amostra de esperma foi depois diluída até 160 x 10⁶ espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado a um pH de

7,4. O tampão de TALP modificado foi substancialmente idêntico ao tampão descrito na Tabela 1, exceto que incluiu gema de ovo a 1 % e corante alimentar amarelo No. 6 a uma concentração de 25 μΜ. Cada amostra de esperma em este grupo foi depois incubada com 14-15 pL de Hoechst 33342 por mL (56-60 μΜ) durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, o esperma permaneceu a uma concentração de 160 x 10⁶ espermatozóides por mL.

10981 (D) Padronizado I (padronizado com tampão de gema de ovo a

%) - Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da coloração e separação. Após coleta, o esperma foi diluído 1:3 em um tampão inicial tendo um pH de 7,2 bem como uma elevada capacidade para tamponamento do pH. O tampão de elevada capacidade foi suplementado com gema de ovo a 3 %. Todas as amostras foram depois centrifugadas para diminuir a concentração de esperma até entre 1700 milhões de espermatozóides e 1800 milhões de espermatozóides por mL. O esperma padronizado foi depois corado de acordo com o método em dois passos descrito em (A).

[099] (E) Padronizado II (padronizado com tampão de gema de ovo a 10 %, coloração em dois passos) - Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da coloração do mesmo modo descrito no grupo (D), exceto que o tampão inicial foi gema de ovo a 10 %.

|0100] (F) Um Passo e Padronizado I (padronizado com tampão de gema de ovo a 3 %, coloração em um passo com gema de ovo a 1 %) - Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da separação do mesmo modo descrito no grupo (D). A /53 amostra padronizada foi depois corada com um processo de coloração em um passo como descrito no grupo (C).

|01011 (G) Um Passo e Padronizado 11 (padronizado com tampão de gema de ovo a 10 %, coloração em um passo com gema de ovo a 1 %) — Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da coloração do mesmo modo descrito no grupo (E). A amostra padronizada foi depois corada com um processo de coloração em um passo como descrito no grupo (C).

[0102] (H) Um Passo e Padronizado III (padronizado com tampão de gema de ovo a 3 %, coloração em um passo com nenhuma gema de ovo) Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da coloração do mesmo modo descrito no grupo (D). A amostra padronizada foi depois corada com um processo de coloração em um passo como descrito no grupo (C), exceto que não foi adicionado nenhuma gema de ovo ao TALP de coloração em um passo.

[0103] (I) Um Passo e Padronizado IV (padronizado com tampão de gema de ovo a 10%, coloração em um passo com nenhuma gema de ovo) Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da separação do mesmo modo descrito no grupo (E). A amostra padronizada foi depois corada com um processo de coloração em um passo como descrito no grupo (C) exceto que não foi adicionado nenhuma gema de ovo ao TALP de coloração em um passo.

[0104] Separação e aquisição de dados - Cada uma das amostras coradas foi separada em um MoFlo SX (Beckman Coulter, EUA). Aquelas amostras que foram coradas em um processo em dois passos foram separadas à concentração de 80 x 10⁶ espermatozóides por mL, e aquelas amostras que foram coradas pelo processo em um passo foram separadas à concentração de 160 x 10⁶ espermatozóides por mL. Os dados comunicados pelo citômetro de fluxo foram registrados incluindo

42/53 informação se relacionando com as taxas de separação e intercepção de subpopulações de espermatozóides. Por exemplo, a percentagem de espermatozóides interceptados como mortos, bem como as percentagens de espermatozóides interceptados como orientados vivos e sobrefaixas, foram registradas e foram calculadas as suas médias para os cinco touros.

[0105] Resultados - Uma comparação da percentagem de espermatozóides que estavam orientados, não orientados e mortos como determinado pelos parâmetros de separação estabelecidos no citômetro de fluxo está resumida na Tabela 2 em baixo.

	% de Orientados	% de Não orientados	% de Mortos	Taxa de Separação	Sobregama
A) Controle	58,29 %	18,02 %	16,89%	3500	4,32 %
B) Estendido	60,54 %	20,20 %	8,71 %	3400	10,36%
C) Um Passo I	61,04%	17,96%	12,31 %	3500	5,65 %
D) Padronizado 1	52,78 %	18,14%	9,71 %	2900	24,73 %
E) Padronizado 11	55,20 %	18,70 %	6,04 %	3200	23,44 %
F) Um Passo + Padronizado 1	57,33 %	20,35 %	5,39 %	3200	16,17%
G) Um Passo + Padronizado II	59,99 %	18,89%	5,19%	3600	16,83 %
H) Um Passo + Padronizado III	62,67 %	22,02 %	6,97 %	3800	6,23 %
I) Um Passo + Padronizado IV	63,49 %	23,16%	5,61 %	4100	5,38 %

[0106] Em comparação com o controle (A), os grupos Um Passo I (C), Padronizado I (D), e Padronizado II (E) exibiram cada um populações mortas significativamente mais baixas com reduções de 4,58 %, 7,18 % e 10,85 %, respectivamente. Com base em estas melhorias, os passos de padronização de amostras de esperma antes da coloração e modificação do processo de coloração para um único passo melhoram independentemente a capacidade dos espermatozóides de sobreviverem ao processo de separação. Adicionalmente, Um Passo e Padronizado I (F), Um Passo e Padronizado II (G), Um Passo e Padronizado III (H), e Um Passo e Padronizado IV (I) demonstram uma sinergia pela qual o efeito combinado

43/53 de padronização de um ejaculado e coloração do ejaculado em um único passo é maior do que qualquer uma das melhorias individualmente.

[0107] No que se refere à Tabela 2 pode ser visto que Padronizado 1 (D), Padronizado II (E), Um Passo e Padronizado I (F), e Um Passo e Padronizado II (G) parecerem cada um proporcionar benefícios significativos em termos redução do número de espermatozóides mortos, mas a percentagem de espermatozóides orientados não melhorou. Isto pode estar relacionado com a coluna indicada como sobrefaixa. Embora mais espermatozóides tenham sido interceptados como vivos para separação parece existir um aumento nos sinais dispersos acima das faixas de gates de separação. Este sinal pode representar espermatozóides que estão grudados ou pode representar espermatozóides que estão ligados a lípidos da gema de ovo. Em qualquer um dos casos emerge o padrão geral de que maiores quantidades de gema de ovo reduzem os números de espermatozóides, mas podem introduzir uma nova questão e um equilíbrio pode ser portanto requerido.

|0108] Exemplo 2 - padronização de amostras de esperma e coloração em um passo [0109| Coleta - Foi coletado esperma de seis touros Jersey diferentes em um programa de coleta de rotina usando uma vagina artificial. Todos os ejaculados continham mais do que 65% de motilidade progressiva e a concentração de esperma variava de 765 milhões de espermatozóides por mL a 1710 milhões de espermatozóides por mL Cada amostra de Esperma foi dividida em duas partes em tubos de 15 mL para duas coletas e tratamentos de coloração. Foram tiradas medições de pH na coleta, e em cada passo de processamento subsequente.

[0110] Coloração — Controle (nenhuma padronização, separação em dois passos) - Foi estabelecido um controle que não incluiu o passo de padronização de ejaculados coletados e no qual o esperma foi corado em

44/53 dois passos. Antes da coloração, as amostras de esperma foram concentradas até entre 1700 milhões de espermatozóides por mL e 1800 milhões de espermatozóides por mL por centrifugação ou pela adição de um tampão de tris-gema de ovo tendo um pH de 6,8, dependendo da concentração inicial das amostras.

[0111] O esperma no grupo de controle foi diluído até 160 x 10⁶ espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado, como descrito na Tabela 6, a um pH de 7,4. Cada amostra de esperma no grupo de controle foi depois incubada com 16-17 pL de Hoechst 33342 por mL (64-68 μΜ) de amostra durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, um volume igual de um segundo TALP modificado foi adicionado reduzindo a concentração até 80 x 10⁶ espermatozóides por mL. O segundo TALP modificado inclui os componentes descritos na Tabela 1 com a adição de gema de ovo a 4 %, corante alimentar vermelho No. 40 a 50 pM (20 g/L) e o pH foi diminuído para 5,5 com a adição de HC1.

[0112] Um Passo e Padronizado (padronizado com gema de ovo a 10 %, coloração em um passo com gema de ovo a um por cento) - O esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da coloração. Após coleta, o esperma foi diluído 1:3 em um tampão inicial tendo um pH de 7,2 bem como uma elevada capacidade para tamponamento do pH. O tampão de elevada capacidade foi suplementado com gema de ovo a 3 %. Todas as amostras foram depois centrifugadas para diminuir a concentração de esperma até entre 1700 milhões de espermatozóides e 1800 milhões de espermatozóides por mL.

|0113] As amostras de esperma foram depois diluídas até 160 x 10⁶ espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado a um pH de

7,4. O tampão de TALP modificado foi substancialmente idêntico ao tampão descrito na Tabela 1, exceto que incluiu gema de ovo a 1 % e corante alimentar amarelo No. 6 a uma concentração de 25 μΜ. Cada

45/53 amostra de esperma em este grupo foi depois incubada com 16-17 pL de Hoechst 33342 por mL (64-68 μΜ) durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, o espenna permaneceu a uma concentração de 160 x 10⁶ espermatozóides por mL.

|0114| Separação e aquisição de dados - Cada amostra foi separada em um MoFlo SX (Beckman Coulter, EUA). O controle foi separado à concentração de 80 x 10⁶ espermatozóides por mL, enquanto o esperma padronizado foi separado a 160 x 10⁶ espermatozóides por mL. Os dados foram comunicados pelo citômetro de fluxo e depois foi calculada a sua média para os 6 touros.

[0115| Resultados — A FIG. 3 ilustra o pH registrado do controle (A) e do ejaculado padronizado (B). Estes Valores estão refletidos na TABELA 3 em baixo. Embora o ejaculado padronizado seja sujeito a um aumento inicial, um aumento subsequente é evitado durante coloração e a seguinte queda é também evitada. Adicionalmente, a TABELA 4 ilustra benefícios similares na redução de espermatozóides mortos que foi vista no Exemplo 1. Especi ficamente, a amostra padronizada que foi corada em um passo teve 5,67 % menos espermatozóides mortos.

TABELA 3

	Inicial	Antes da Centrifugação	Após a Centrifugação	Durante a Coloração	Após a coloração	Antes de citômetro
Controle (A)	6,34	6,34	6,25	7,22	7,07	6,59
Padronizado (B)	6,34	7,12	6,85	7,18	6,98	6,98

TABELA 4

	PV	% de Orientados	% de Mortos	Taxa de Separação	Dupletos/T ripletos
Controle	1,86	52,99	14,63	35,83	21,73
Padronizado - Um Passo	1,97	57,22	8,96	37,00	24,59
Diferença	0,11	4,23	-5,67	L17	2,86

46/53 [0116] Exemplo 3 ~ a padronização de amostras de esperma e coloração em um passo reduz espermatozóides mortos

10117] Coleta - Foi coletado esperma de três diferentes touros Jersey e três diferentes touros Holstein em um programa de coleta de rotina para um total de 17 coletas. Cada ejaculado foi dividido para dois tratamentos.

|0118] Coloração — Controle (nenhuma padronização, separação em dois passos) - Foi estabelecido um controle que não incluiu o passo de padronização de ejaculados coletados e no qual o esperma foi corado em dois passos. O esperma no grupo de controle foi diluído até 160 x 10⁶ espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado, como descrito na Tabela 6, a um pH de 7,4. Cada amostra de esperma no grupo de controle foi depois incubada com 16-17 pL de Hoechst 33342 por mL (64-68 μΜ) de amostra durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, um volume igual de um segundo TALP modificado foi adicionado reduzindo a concentração até 80 x 10⁶ espermatozóides por mL. O segundo TALP modificado inclui os componentes descritos na Tabela 1 com a adição de gema de ovo a 4 %, corante alimentar vermelho No. 40 a 50 μΜ (20 g/L) e o pH foi diminuído para 5,5 com a adição de HC1.

(0119] Padronizado III e Um Passo (padronizado com tampão de gema de ovo a 3 %, coloração em um passo) - O esperma restante foi padronizado por ajuste do pH e concentração de esperma antes da coloração e separação. Após coleta, o esperma foi diluído 1:3 em um tampão inicial tendo um pH de 7,2 bem como uma elevada capacidade para tamponamento do pH. O tampão de elevada capacidade foi suplementado com gema de ovo a 3 %. A amostra de esperma foi depois diluída até 160 x 10⁶ espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado a um pH de 7,4. O tampão de TALP modificado foi substancialmente idêntico ao tampão descrito na Tabela 1, exceto que incluiu gema de ovo a 1 % e corante alimentar amarelo No. 6 a uma concentração de 25 μΜ. Cada

47/53 amostra de esperma em este grupo foi depois incubada com 14-15 pL de Hoechst 33342 por mL (56-60 μΜ) durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, o esperma permaneceu a uma concentração de 160 x 10⁶ espermatozóides por mL.

[0120] O grupo de controle foi operado através de um Legacy MoFlo SX {Beckman Coulter, Miami FL, EUA) com um digital upgrade a uma concentração de 80 x 10⁶ espermatozóides por mL, enquanto o Padronizado III e Um Passo foi separado a uma concentração de 160 x 10⁶ espermatozóides por mL. A Tabela 5 ilustra a percentagem de células na gate de morte de cada ejaculado e a média. Após separação, as percentagens de espermatozóides ocorrendo nas gates de morte (R2 vista na FIG. 3) foram indicadas para ambas as amostras.

TABELAS

Touro	Gate de Morte (%)
Número do Ejaculado	Touro	CONTROLE	UM PASSO e PADRONIZADO III
01	Touro Holstein 1	16 %	12 %
02	Touro Holstein 2	26 %	6 %
03	Touro Jersey 1	15 %	7%
04	Touro Holstein 2	19 %	3%
05	Touro Jersey 1	13 %	6 %
06	Touro Holstein 3	19 %	12 %
07	Touro Jersey 2	25 %	14 %
08	Touro Holstein 1	25 %	21 %
09	Touro Holstein 2	20 %	20 %
10	Touro Jersey 3	9 %	5 %
11	Touro Jersey 2	19 %	17 %
12	Touro Holstein 3	15 %	14 %
13	Touro Jersey 1	10 %	7 %
14	Touro Holstein 1	9 %	6 %
15	Touro Holstein 1	9 %	8 %
16	Touro Holstein 3	17 %	6 %
17	Touro Holstein 3	16 %	5 %
Média	17 %	10 %

[0121] Exemplo 4 - Otimização da eficácia da separação em citômetro de fluxo

48/53 [0122] Foi coletado esperma de um touro Holstein e corado de acordo com o protocolo de Padronizado III e Um passo descrito nos exemplos prévios. A amostra foi colocada em um Legacy MoFlo SX (Beckman Coulter, Miami FL, EUA) com urn digital upgrade. Durante separação, a pressão do fluido de revestimento foi estabelecida a 40 PSI e a frequência de queda foi definida para 64,9 KHz. A pressão da amostra foi ajustada para se direcionar a taxas de eventos de cerca de 1500, 3500, 7500, 8500, 10,000 15000, 20000, 25000, e 30000.

[0123] O ejaculado em este exemplo demonstrou uma gate de morte de cerca de 3 %-5 % que permitiu que grandes porções do esperma fossem incluídas na live oriented gate·, entre 79,1 % e 85,4 %. A lógica de separação utilizada em esta separação se focou em uma região live oriented do esperma (Rl). RI foi estabelecido por um operador para reter uma grande porção do esperma. A X-sort gate foi similarmente estabelecida por um operador com um alvo de 90 % de pureza. Os dados foram periodicamente digitalmente comunicadas para várias amostras a cada taxa de eventos. Foi calculada a média dos dados a cada taxa de eventos para proporcionar médias para produtividade (Taxa de Separação), eficácia da separação (Taxa de Separação/Taxa de Eventos), razão Vale em relação a Pico, taxa de interrupção, bem como a percentagem da população da gate de Morte (R2), a percentagem da população na live oriented gate (Rl), a percentagem da população de espermatozóides na X-Sort gate (R3), e a percentagem de espermatozóides viáveis (vivos) na X-Sort gate. Adicionalmente, as purezas foram determinadas offline para cada espermatozóide separado a cada definição de taxa de eventos. As purezas foram determinadas por sonicação das caudas de 1 milhão de espermatozóides e coletadas a cada grupo de taxas de eventos e medição em uma analisador da pureza offline. Esta medição foi realizada duas vezes para cada grupo e foi calculada a média.

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TABELA 6

	Vale/ Pico (%)	Taxa de Eventos (Hz)	Taxa de Separação (Hz)	Taxa de Separação ! Taxa de Eventos (%)	Taxa de Interrupção (Hz)	Taxa de Interrupção /Taxa de Separação	Gale de Morte (%)	LiveOriented (%)	X-Sort Gale (%)	X-Sort / Viáveis (%)	Pureza de X (%)
1	67,4 %	1722	694	40,3 %	48	7,0 %	6,4 %	82,9 %	54,1 %	57,7 %	96,0 %
2	66,6 %	3697	1361	36,8 %	141	10,4%	4,5 %	84,9 %	52,2 %	54,6 %	96,0 %
3	63,4 %	7377	2591	35,1 %	414	16,0%	2,9 %	85,4 %	50,0 %	51,5 %	95,5 %
4	63,4 %	8515	3005	35,3 %	522	17,4%	2,7 %	84,9 %	51,2%	52,6 %	95,5 %
5	62,1 %	9891	3415	34,5 %	645	18,9%	2,7 %	84,4 %	51,2 %	52,6 %	96,0 %
6	54,7 %	16686	4774	28,6 %	1306	27,4 %	2,8 %	82,8 %	47,1 %	48,5 %	93,0%
7	51,0%	19760	5080	25,7 %	1604	31,6%	2,8 %	81,8 %	44,6 %	45,9 %	91,5 %
8	47,5 %	24839	5822	23,4 %	2175	37,4%	2,8 %	80,2 %	43,5 %	44,8 %	90,0 %
9	43,9 %	29666	6332	21,3 %	2706	42,7 %	3,1 %	79,1 %	42,4 %	43,7 %	92,5 %

[0124] Voltando-se para a FIG. 8 está ilustrada uma representação gráfica de vários parâmetros de separação medidos. Em particular pode ser visto que baixas taxas de eventos reduzem as taxas de intercepção e melhoram a eficácia da separação. Em particular, a taxa de interrupção é 7 % da taxa de separação quando a taxa de eventos é 1722.

[0125] Adicionalmente, o efeito sinérgico da redução de espermatozóides mortos é ilustrado em virtude do fato de que mais do que 50 % da amostra de esperma ter sido interceptada na X-sort gate para taxas de eventos menores do que 10.000 eventos por segundo. A baixa percentagem de espermatozóides mortos em combinação com a percentagem elevada de espermatozóides orientados vivos permite intercepção de uma região R3 a ser ajustada tal que R3 invada a região da FIG. 5 onde os espermatozóides têm uma maior probabilidade de serem espermatozóides portadores de cromossomos Y do que espermatozóides portadores de cromossomo X. Mesmo quando invade ligeiramente esta região, a pureza checada pós-separação permaneceu 96 %, mesmo embora 54 % de todos os espermatozóides estivessem incluídos na X-sort gate e 57 % de todos os espermatozóides vivos estivessem incluídos na X-sort gate.

[0126| A combinação sinérgica de técnicas de coloração melhoradas em combinação com métodos de separação que se focam na eficácia pode

50/53 ser vista como proporcionando métodos de separação de espermatozóides confiáveis que podem proporcionar entre 25 % e cerca de 40 % de rendimento na população de espermatozóides total, e mantém purezas maiores do que 90 %.

[0127] Voltando-se para a F1G. 9 estão graficamente ilustrados parâmetros de separação adicionais a partir da Tabela 6, incluindo as purezas para cada grupo de taxas de eventos e a percentagem de espermatozóides na live/oriented gate (Rl) e razão pico em relação a vale. Porque uma pureza de 90 % foi o alvo por um operador, as tendências da razão pico em relação a vale não estão demonstradas na pureza medida mas estão refletidas na percentagem decrescente de espermatozóides na X-Sort Gate.

[0128] Um aspeto desta divulgação projeta citômetros de fluxo mais espacialmente eficazes, que podem permitir mais cabeças de separação em um espaço disponível, Em uma tal disposição, mais cabeças de separação de citômetro de fluxo podem estar dedicadas a uma única amostra de esperma, e cada uma pode ser operada a uma eficácia melhorada, combinando desse modo os benefícios de métodos de separação eficazes com produtividade elevada.

]0129] Como pode ser facilmente entendido a partir do acima mencionado, os conceitos básicos da presente invenção podem realizados de uma variedade de modos. A invenção envolve numerosas e variadas formas de realização de esperma separado quanto ao sexo incluindo o, mas não limitada ao, melhor modo da invenção.

[0130] Como tal, as formas de realização ou elementos particulares da invenção divulgados pela descrição ou mostrados nas figuras ou nas tabelas acompanhando este pedido não se destinam a ser limitantes, mas ao invés exemplares das numerosas e variadas formas de realização genericamente englobadas pela invenção ou equivalentes englobados no que diz respeito a /53 qualquer seu elemento particular. Adicionalmente, a descrição específica de uma única forma de realização ou elemento da invenção pode não descrever explicitamente todas as formas de realização ou elementos possíveis; muitas alternativas são implicitamente divulgadas pela descrição e figuras.

[0131] Deve ser entendido que cada elemento de um dispositivo ou cada passo de um método pode ser descrito por um termo de dispositivo ou termo de método. Tais termos podem ser substituídos onde se deseja tomar explícito a cobertura implicitamente ampla à qual esta invenção está destinada. Como apenas um exemplo deve ser entendido que todos os passos de um método podem ser divulgados como uma ação, um meio para tomar essa ação, ou como um elemento que causa essa ação. Similarmente, cada elemento de um dispositivo pode ser divulgado como o elemento físico ou a ação que esse elemento físico facilita. Como apenas um exemplo, a divulgação de separador deve ser entendida como englobando a divulgação do ato de separar - seja explicitamente discutido ou não — e, reciprocamente, existisse efetivamente divulgação do ato de separar, uma tal divulgação deve ser entendida como englobando a divulgação de um separador e mesmo um meio para separação. Tais termos alternativos para cada elemento ou passo são para ser entendidos como sendo explicitamente incluídos na descrição.

[0132] Adicionalmente, quanto a cada termo usado deve ser entendido que, a não ser que a sua utilização em este pedido seja inconsistente com tal interpretação, as definições de dicionário comuns devem ser entendidas como estando incluídas na descrição para cada termo como contido no Random House Webster’s Unabridged Dictionary, segunda edição, cada definição incorporada desse modo por referência.

[0133] Além do mais, para os propósitos da presente invenção, o termo um ou uma entidade se refere a um ou mais dessa entidade.

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Como tal, os termos um ou uma, um(a) ou mais e pelo menos um(a) podem ser usados indistintamente aqui.

[0134] Todos os valores numéricos aqui são assumidos como sendo modificados pelo termo cerca de, seja ou não explicitamente indicado. Para os propósitos da presente invenção, as faixas podem ser expressas como a partir de cerca de um valor particular até cerca de outro valor particular. Quando uma tal faixa é expressa, outra forma de realização inclui a partir de um valor particular até ao outro valor particular. A recitação de faixas numéricas pelos pontos terminais inclui todos os valores numéricos subsomados dentro dessa faixa. Uma faixa numérica de um a cinco inclui por exemplo os valores numéricos 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, e assim por diante. Será adicionalmente entendido que os pontos terminais de cada uma das faixas são significativos em relação ao outro ponto terminal, e independentemente do outro ponto terminal. Quando um valor é expresso como uma aproximação por uso do antecedente cerca de, deve ser entendido que o valor particular forma outra forma de realização.

]0135] A seção de antecedentes deste pedido de patente proporciona uma declaração da área de esforço à qual a invenção pertence. Esta seção pode também incorporar ou conter parafraseamento de certas patentes dos Estados Unidos, pedidos de patente, publicações, ou assunto da invenção reivindicada úteis no relato de informações, problemas, ou preocupações sobre o estado da tecnologia ao qual a invenção está dirigida. Não se pretende que qualquer patente dos Estados Unidos, pedido de patente, publicação, declaração ou outra informação citado ou incorporado aqui seja interpretado, compreendido ou considerado como sendo admitido como técnica prévia no que diz respeito à invenção.

[0136] As reivindicações apresentadas em esta especificação, se algumas, são deste modo incorporadas por referência como parte desta descrição da invenção, e o requerente expressamente reserva o direito de

53/53 usar todo o ou uma porção de tal conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrição adicional para suportar qualquer uma das ou todas as reivindicações ou qualquer seu elemento ou componente, e o requerente reserva expressamente adicionalmente o direito de mover qualquer porção do ou todo o conteúdo incorporado de tais reivindicações ou qualquer seu elemento ou componente da descrição para as reivindicações ou vice versa como necessário para definir a matéria para a qual é solicitada proteção por este pedido ou por qualquer pedido subsequente ou continuação, divisão, ou seu pedido de continuação em parte, ou para obter qualquer benefício de, redução em taxas nos termos de, ou para respeitar as leis de patentes, regras, ou regulamentos de qualquer país ou tratado, e tal conteúdo incorporado por referência deverá sobreviver durante a pendência inteira deste pedido incluindo qualquer subsequente continuação, divisão, ou seu pedido de continuação em parte ou qualquer sua reedição ou extensão.

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Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de separação eficaz de uma amostra de esperma em um instrumento de separação de partículas, caracterizado por compreender:

   a) o estabelecimento de uma corrente de fluido de revestimento no instrumento de separação de partículas;

   b) a fluidificação de uma amostra de esperma para a corrente de fluido de revestimento;

   c) a identificação de espermatozoides portadores de cromossomo X viáveis e/ou espermatozoides portadores de cromossomo Y viáveis na amostra de esperma;

   d) a separação dos espermatozoides portadores de cromossomo X viáveis e/ou dos espermatozoides portadores de cromossomo Y viáveis do restante da amostra de esperma;

   e) a coleta dos espermatozoides portadores de cromossomo X viáveis e/ou dos espermatozoides portadores de cromossomo Y viáveis;

   f) a determinação de um ou mais parâmetros de separação medidos no instrumento de separação de partículas, incluindo a seleção eficiente das células analisadas, onde a seleção é calculada determinando continuamente uma razão entre um número de células coletadas e um número de eventos que representam as células analisadas durante um período de tempo;

   g) o estabelecimento de um limiar de produtividade mínimo, de não menos que 3.000 seleções por segundo.

   h) o estabelecimento de um limiar de pureza mínimo, de não menos que 86% de pureza, e

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   i) o ajuste de um ou mais parâmetros do instrumento para aumentar a eficácia da separação de células analisadas enquanto se mantêm a produtividade em termos de tipo por segundo, em termos de coletas por segundo, acima do limiar de produtividade mínimo e pureza acima do limiar de pureza mínimo.

   2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os parâmetros de separação medidos serem selecionados a partir do grupo consistindo em: taxa de eventos, taxa de separação, razões do vale em relação ao pico, taxa de interrupção, percentagem de partículas na gate de morte, percentagem de partículas em uma X-sort gate, percentagem de partículas em uma Y-sort gate, e percentagem de partículas em uma oriented gate.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de ajuste de um ou mais parâmetros do instrumento compreender o ajuste de uma lógica de separação.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de ajuste de um ou mais parâmetros do instrumento compreender o ajuste de uma gate de separação.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o passo de ajuste de uma gate de separação compreender o passo de modificação de uma região de separação para coleta de espermatozoides portadores de cromossomo X e/ou uma região de separação para coleta de espermatozoides portadores de cromossomo Y para incluir mais eventos detectados representando células analisadas.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dispositivo de separação de partículas compreender um citômetro de fluxo com jato no ar e o passo de ajuste de um ou mais parâmetros do

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   3 / 5 instrumento compreende ajuste de uma frequência de queda ou ajuste de uma amplitude de queda.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de ajuste do um ou mais parâmetros do instrumento compreender a redução de uma taxa de fluxo de amostra para aumentar e aumento de uma região de separação.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a razão de espermatozoides coletados em relação ao número de espermatozoides na população de esperma separável estar entre 25 % e 50 %.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o limiar de pureza mínimo ser 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 %.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o limiar de produtividade mínimo ser definido a 3.000 separações por segundo, 3.500 separações por segundo, 4.000 separações por segundo,

    4.500 separações por segundo, 5.000 separações por segundo, 5.500 separações por segundo, 6.000 separações por segundo, 6.500 separações por segundo, 7.000 separações por segundo, 7.500 separações por segundo, 8.000 separações por segundo, 8.500 separações por segundo, 9.000 separações por segundo, 9.500 separações por segundo, 10.000 separações por segundo, 10.500 separações por segundo, 11.000 separações por segundo, 11.500 separações por segundo, 12.000 separações por segundo,

    12.500 separações por segundo, 13.000 separações por segundo, 13.500 separações por segundo, ou 14.000 separações por segundo.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de ajuste de um ou mais parâmetros do instrumento para aumentar a eficácia de separação enquanto se mantém a produtividade

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    4 / 5 mínima e se mantém a pureza mínima compreender adicionalmente os passos de estimativa de uma pureza e comparação da pureza estimada com a pureza mínima.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o passo de estimativa da pureza compreender adicionalmente o passo de avaliação das razões do vale em relação ao pico determinadas no instrumento de separação de partículas.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por as razões do vale em relação ao pico serem comparadas com dados empíricos para prever uma pureza corrente.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o passo de comparação das razões do vale em relação ao pico com dados empíricos ser realizado pela execução de instruções escritas armazenadas em um processador associado ao instrumento de separação de partículas.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente o passo de ajuste de uma concentração de esperma na amostra de esperma para otimizar a eficácia da separação.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de ajuste de um ou mais parâmetros do instrumento para aumentar a eficácia da separação enquanto se mantém a produtividade mínima e se mantém a pureza mínima compreender adicionalmente o ajuste de um ou mais parâmetros do instrumento para maximizar a eficácia da separação enquanto se mantém a produtividade mínima e se mantém a pureza mínima.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a amostra de esperma ser obtida de um mamífero tendo uma baixa produção de esperma.

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18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o mamífero compreender um reprodutor genômico jovem.

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