SU1056008A1 - Проточный цитофлуориметр - Google Patents

Abstract

ПРОТОЧНЫЙ .ЦИТОФЛУОРИМЕТР, содержащий флугоресцентный микроскоп , форсунку дл  подачи и гидродинамической фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему дл  отвода жидкости с клетками, отличающийс  тем, что, с целью .повышени  точности и .производительности измерений, форсунка размеще на no;q покровньм стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачивающегос  материала, прикрепленной к нижней поверхности покровного стек ,ла под объективом микроскопа, при- р чем дл  обеспечени  стационарного потока жидкости с клетками рассто - |//% ние от кра  п тна жидкости на покров-||/| ном стекле до места прикреплени  полости составл ет величину 0,5 1 ,0 от ширины п тна.

Description

сл

о:

00

Изобретение относитс  к технической физике, а именно к аналитической микроскопии, в частности к приборам дл  биологии и медицины , и наиболее эффективно может быть использовано дл  скоростного автоматического анализа содержани , клеточных компонентов и иву-чени  их физико-химического состо ни  путем измерени  флуоресцентных характеристик большого числа отдельных клеток. Известен проточный цитофлуориметр на базе флуоресцентного мик . роскопа, предназначенный дл  автоматической регистрации флуоресцентных параметров отдельных клето в составе, клеточной суспензии со скоростью измерени  до нескольких тыс ч клеток в секунду. В этом при боре взвесь исследуемых клеток пос тупает из капилл ра в проточную ка меру, расположенную на предметном столике микроскопа и проходит е током жидкости в горизонтальном на правлении с большой скорост;ью чере поле зрени  микрообъектив В моме прохождени  клетки перед микрообъе тивом, сфокусированном на определенную плоскость, осуществл етс  освещение клетки возбуждающими луч ми от источника света на выходе д , чика излучени  фотометрической насадки формируетс  импульс, амплиту которого пропорциональна интенсивности флуоресценции. Система регис рации проводит анализ амплитудного распределени  импульсов и выдает Гистограмму распределени  клеток inb интенсивности их свечени . Стаб ;лизаци  положени  горизонтального (потока клеток при их прохождении в поле зрени  объектива.осуществл етс  с noMoatbK гидродинамической ф кусировки: в камере дод давлением создаетс  горизонтальный ток жидкости , в центре которого располагаетс  капилл р с исследуемыми клетками ll и 2 . Недостатком указанного прибора  вл етс  мала  стабильность положени  клеток относительно объектива, в результате чего клетки вькод т за пределы глубины резкости микрообъе тива, что приводит к уменьшению точности измерени . Другим недостат ком прибора  вл етс  невозможность использовани  в нем высокоапертурных иммерсионных объективов, .имеющих обычно малое рабочее состо ние не позвол ющее сфокусироватьс  на измер емые клетки через стенку камеры и слой жидкости, наход щийс  перед клетками. Наиболее близким по техничес1КОЙ сущности к предлагаемому  вл етс  проточный цитофлуориметр, со держащий флуоресцентный микроскоп, форсунку дл  подачи и гидродинамичной фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему дл  отвода жид-, кости с клетками. В этом устройстве стабильный горизонтальный поток клеток в плоскости фокусировки инвертированного микроскопа.обеспечи .ваетс  гидродинамической фокусировкой клеток в струе жидкости, падающей, под углом на верхнюю поверхность покровного стекла и собираемой с него с помощью отсасывающего насоса з . Недостатком этой конструкции прибора  вл етс  невозможность использовани  в нем обычных (неинвертированных ) флуоресцентных микроскопов , которые в частности комплектуютс  светосильными высокоапертурньми иммерсионными микрообъективамй , необходимыми дл  точных флуориметрических измерений. Другим недостатком известной конструкции  вл етс  необходимость использовани  в ней принудительного (с помощью насоса ) отвода жидкости с клетками со дна .камеры, что усложн ет конструкцию камеры и пони сает надежность и точность измерени  и удобства ее ; эксплуатации. Целью изобретени   вл етс  повышение точности и производительности измерений. Дл  достижени  цели в проточном цитофлуориметре, содержащем флуоресцентный микроскоп, форсунку дл  подачи и гидродинамической фокусировки жидкости с исследуемыми клетками , покровное стекло микроскопа, систему дл  отвода.жидкости с клетками , форсунка размещена под покровкым стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачивающего материала, прикрепленной к нижней поверхности -покровного стекла под объективом микроскопа , причем дл  обеспечени  стационарного потока жидкости с клетками рассто ние от кра  п тна жидкости на покровном стекле до места прикреплени  полости составл ет величину 0,5-1,0 от ширины п тна. На чертеже показана принципиальна  схема проточного цитофлуориметра . Проточна  камера состоит из корпуса 1 и размещенной в ней форсунки 2, Вдоль оси форсунки расположен капилл р 3, по которому подаетс  суспензи  клеток. Корпус форсунки имеет патрубок 4 дл  подачи воды в форсунку. На корпусе камеры закрепл етс  покровное стекло 5, Полоска смачивающегос  материала б закрепл етс  в верхней части корпуса каме- , ры и касаетс  нижней поверхности

покровного стекла, В нижней части корпуса камеры имеетс  патрубок 7 дл  стока воды. Проточна  камера крепитс  на предметном столике 8 флуоресцентного микроскопа. Функциональна  схема проточного цитофлуориметра включает- микрообъектив 9, источник 10 света, коллектор 11, полевую диафрагму 12, светофильтры 13 дл  выделени  возбуждающего света, светофильтр 14 дл  выделени  света флуоресценции, интерференционную светоделительную пластинку 15, фотоэлектронный умножитель 16, спектрометрический усилитель 17, многоканальный анализатор 1В импульсов ;

Проточный цитофлуориметр работает следукицим образом.

Суспензи  клеток, предварительно меченых флуоресцирующим красителем , подаетс  с посто нной скоростью в центральный капилл р 3 форсунки 2. Одновременно через патрубок 4 в форсунку под давлением 0,6-0,8 атм поступает вода, котора  обтекает центральный капилл р 3, пр этом за счет гидродинамической фокусировки клетки в суспензии выстраиваютс  вдоль оси форсунки. Таким образом, формируетс  ламинарна  коаксиальна  стру  диаметром 150 мкм, вдоль оси которой выстраивацотс  клетки суспензии. Эта стру , несуща  клетки, направл етс  снизу ввер под углом 60-70 на нижнюю поверхность покровного стекла 5.

В месте падени  на покровное стекло стру  расплющиваетс  и образует п тно эллипсовидной формы, длина и ширина которого завис т |от внутреннего диаметра форсунки, угла падени  струи на покровное стекло и давлени  подачи жидкости, На определенном рассто нии от кра  п тна по току жидкости .(0,5-1,10 от ширины п тна) .прикрепл етс  полоса смачивающегос  материала 6, с помощью которой жидкость с клетками самото со.м стекает с покровного стекла на дно камеры и затем через патрубок 7 удал етс  из нее. Рассто ние , на котором прикрепл етс  полока 6, достаточно дл  того, чтобы бьшо исключено возникновение значительной турбулентности при ударе жидкости о полоску, и в то же врем  это рассто ние не слишком велико , иначе на нижней поверхности покровного стекла до полоски будет

|равномерный ток жидкости. Дл  обеспечени  стационарного потока жид- кости рассто ние от кра  п тна жидкости на покровном стекле до места прикреплени  полоски должно составл ть величину 0/5-1,0 от ширины п тна, что при диаметре выходного отверсти  форсунки 150 мкм, угле паде.ни  жидкости на покровное стекло 60-70° и давлении подачи жидкости

0 0,6-0,8 атм соответствует 1-2 мм и общему рассто нию от места Дс1дени  I струи до места прикреплени  полоски смачивающего материала 3-4 мм. При этом в поле зрени  микрообъектива

5 9 формируетс  стабильный поток клеток , во врем  нахождени  клетки в после зрени  объектива возбуждаетс  флуоресценци  красител , св занного с определенным внутриклеточным ве .ществом (например, ДНК, белком).

0 Источником возбуждающего флуоресценцию света  вл етс  ртутна  лампа 10. Свет от нее собираетс  коллектором 11 и при noMOuyi интерференционной светоделительной пластинки 15 направ5 л етс  через микрообъектив 9 на исследуемые клетки. Светофильтры 13 и 14 вьщел ют полосы возбуждени  и флуоресценции соответственно. Фотоэлект ронный умножитель 16 преобразует

0 световые сигналы свечени  клеток, пересекающих поле зрени  микроско-.па , в электрические, которые затем усиливаютс  с помощью спектрометрического усилител  17 и поступают на

5 вход многоканального амплитудного анализатора 18. В результате амплитудного анализа получаетс  гистограмма распределени  измер емого в клетках вещества.

0

Таким образом, предлагаемое устройство может быть установлено нг предметном столике любого серийного флуоресцентного микроскопа, прев5 раща : его при соответствующей комплектации прс 1ьвш1енности электронными блоками в прибор дл  скоростного автоматического анализа свойств клеток. Кроме того, это устройство проще известного по конструкции

0 и в изготовлении, так как насос, примен емый в известном устройстве дл  отвода жидкости с клетками, заменен полоской смачивающегос  материала, благодар  чему сбор ско5 пившейс  на покровном стекле жидкости с клетками осуществл етс  самотоком.

Claims (1)

154) ПРОТОЧНЫЙ .ЦИТОФЛУОРИМЕТР, содержащий флуоресцентный микроскоп, форсунку для подачи и гидродинамической фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жидкости с клетками, отличающийся тем, что, с целью .повышения точности и .производительности измерений, форсунка размещена под; покровньм стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачивающегося материала, прикрепленной к нижней поверхности покровного стекла под объективом микроскопа, причем для обеспечения стационарного потока жидкости с клетками расстояние от края пятна жидкости на покров ном стекле до места прикрепления полости составляет величину 0,5 1,0 от ширины пятна.