SK7222002A3 - Method of cryopreserving selected sperm cells - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka metódy mrazenia spermií vybraných pre určité vlastnosti ako aj mrazenie vzoriek vybraných spermií a metódy použitia týchto vzoriek. Vynález je užitočný pre uchovanie spermii, vybraných podľa pohlavia.

Doterajší stav techniky

Viac ako pred polstoročím sa umelé vykonávať v USA ako komerčný rozmnožovací oplodnenie začalo nástroj pre rôzne druhy cicavcov. Na začiatku bolo umelé oplodnenie limitované oblasťou, ktorá bola relatívne blízko k miestu, kde sa vykonával zber spermií. Pokroky v kryoprezervácii distribúciu komercializáciu spermií, používaných pre umelé oplodnenie alebo oplodnenie in vitro.

Ďalšie zlepšenie v zbere spermií cicavcov, výberu, kryoprezervácii, skladovaní a technikách zaobchádzania zvýšilo schopnosť chovateľov získať požadované vlastnosti zvierat.

Napríklad, pokrok vo jemnom rozdiele vo spermií cicavcov založený na fyzikálnych charakteristikách výbere umo ž n i1 rozdeliť spermie ná základe pohlavia, t.j. vybrať spermie, ktoré obsahujú X alebo Y chromozóm. Táto technika umožnila chovateľom ovplyvniť relatívne percento X a Y chromozómov vo tak určovať pohlavie. Schopnosť vybrať spermie na pohlavia alebo inej požadovanej charakteristiky dôležitý nástroj pre urýchlenie genetického pokroku, vzorke a základe poskytuje zvýšenie účinnosti produkcie a dosiahnutie väčšej flexibility v starostlivosti o dobytok. Úplné využitie tohto nástroja však závisí na schopnosti zmraziť a skladovať vybrané spermie.

Dostupný je celý rad metód pre výber buniek, avšak tento výber a následné spracovanie spermií predstavuje unikátny pokrok, lebo spermie nie sú schopné DNA reparácie a tiež pre morfológiu spermií. Každá spermia má akrozóm, ktorý zakrýva hlavičku a chvostík a ktorý je dôležitý pre oplodnenie a ktorý je relatívne náchylný na fyzikálne poškodenie. Navyše, fertilita spermií klesá s predlžujúcou sa dobou medzi odberom a použitím. Pretože najdostupnejšie metódy výberu zahrnujú fyzikálne stresy a sú časovo náročné, vybrané spermie sú do určitej miery kompromitované v porovnaní s neselektovanými spermiami. Fertilita môže byť ďalej znížená, pokiaľ selekčná technika zahrnuje podstatnú dilúciu. Odhaduje sa, že tento dilúčny efekt môže byť spôsobený stratou protektívnych komponentov v seminálnej plazme.

Prietoková cytometria je veľmi účinná selekčná metóda, ktorá sa používala na výber spermií podľa typu pohlavia. Avšak vybrané spermie sú znevýhodnené pri arteficiálnej inseminácii alebo pri in vitro oplodňovacom protokole v porovnaní s tými, ktoré boli normálne časovo náročná a získané. Navyše prietoková cytometria je pre fyzikálne obmedzenie prietokových cytometrov musia byť spermie pre výber ktorá nie je optimálna pre skladovanie 10⁶/ml) . Navyše, vybrané spermie, u rozriedené (bežne na ktorých je arteficiálneho oplodnenie musia byť mohlo byť použité bežné balenie a na úroveň, radovo 10⁵predpoklad koncentrované tak, aby doručovacie zariadenie.

Nutnosť kroku koncentrovania teda vystavuje do istej miery kompromitované spermie ďalšiemu fyzikálnemu stresu.

Mrazenie spermií tiež znižuje fertilitu, pohyblivosť a/alebo životnosť a aj keď techniky pre mrazenie neselektovaných spermií sú dobre známe, žiadna technika pre kryoprezerváciu vybraných spermií nebola opísaná.

Podstata vynálezu

Prezentovaný vynález umožňuje kryoprezerváciu spermii, ktoré boli vybrané podľa určitých charakteristík, uľahčuje skladovanie a/alebo dopravu vzoriek vybraných spermií do miest vzdialených od miesta zberu. Roztopením sa získajú životaschopné spermie, ktoré možno použiť v procedúrach ako je arteficiálne oplodnenie („Al”) a in vitro fertilizácia („1VF). Tieto výsledky sú prekvapujúce, lebo je dobre dokumentovaná fragilita spermií. Výskumníci demonštrovali, že záťažami spojenými s rôznymi metódami selekcie alebo kryoprezervácie dochádza k významnému poklesu fertility a/alebo životaschopnosti. Prezentovaný vynález ukázal, že tehotenstvo môže byť dosiahnuté pomocou spermií, ktoré boli selektované a následne zmrazené.

Vynález predstavuje významný pokrok v chove dobytka, kde výber spermií na použitie v takých procedúrach môže byť využitý na produkciu potomstva, ktoré má požadované vlastnosti. Napríklad, výber na získanie spermií, ktoré majú chromozóm X alebo Y umožňuje kontrolu pohlavia potomstva, čo je výhodné pre produkciu zvierat ako je hovädzí dobytok. Výber pohlavia tiež nachádza uplatnenie v chove cenných (napríklad dostihové kone) alebo ohrozených zvierat. Schopnosť zmraziť vzorky vybraných spermií, ktoré vynález poskytuje, umožní široké použitie selekčných metód, napríklad na zvýšenie efektívnosti produkcie dobytka rovnako ako na zvýšenie kvality chovov.

Definícia

Termín „akrozóm alebo „akrozomálna čiapočka” sa vzťahuje na čiapočku, ktorá zakrýva prednú polovicu hlavičky spermie a ktorá obsahuje enzýmy, potrebné na penetráciu vajíčka.

Termín „sex-typ” sa vzťahuje na typ pohlavného chromozómu, ktorý je prítomný v spermii (napríklad X alebo Y chromozóm).

Termín „kapacitácia sa vzťahuje na špeciálne zmeny spermie, ktorá vyvíja schopnosť oplodniť vajíčko; tieto zmeny zahrnujú zmeny enzýmov na povrchu akrozómu, ktoré spôsobujú vylúčenie akrozomálnych enzýmov, uľahčujúcich penetráciu spermie do vajíčka.

Termín „kryoprotektant sa vzťahuje na molekulu, ktorá ochraňuje spermiu v priebehu cyklu zmrazovania a roztopenia, čím napomáha jej prežitie a udržiava fertilizačnú schopnosť.

Termín „dilúčny efekt sa vzťahuje na rýchly pokles pohyblivosti a/alebo životaschopnosti spermií, ak sú výrazne rozriedené.

Termín „selekcia sa vzťahuje na metódu, v ktorej sú vzorky rozdelené na základe prítomnosti alebo neprítomnosti určitej vlastnosti (pokiaľ z kontextu nevyplýva niečo iné). Teda „vzorka selektovaných spermií je vzorka, získaná po podrobení zdrojovej vzorky selekcii pre špecifickú vlastnosť. Selektovaná vzorka spermií je teda obohatená vzhľadom na zdrojovú vzorku spermiami, ktoré majú špecifické vlastnosti.

Termín „triedenie sa používa na opis selekčnej metódy vykonávanej s použitím triediča fluorescenciou aktivovaných bunie k (FASC) .

Termín „extender sa vzťahuje na akékoľvek médium, ktoré zachováva životaschopnosť spermií. Termín „extenzia sa vzťahuje na rozriedenie spermií pomocou extendra.

Termín „začiatočný (iniciálny) extender sa vzťahuje na médium, ktoré sa používa na extenziu spermií pred izolačným krokom metódy tohto vynálezu.

Termín „konečný (finálny) extender sa vzťahuje na médium, ktoré sa používa na extenziu spermií pred zmrazovacím krokom metódy tohto vynálezu.

„Organická substancia v extendri opisuje akúkoľvek organickú substanciu, ktorá má sklon znižovať chladiaci šok a zachovať fertilitu spermií.

„Energetický zdroj v extedre opisuje akýkoľvek substrát alebo substanciu, ktoré spermie môžu používať na udržanie buniek a/alebo pohyblivosti.

Termín „osmolalita je meranie osmotického tlaku rozpustených častíc roztoku vo vodnom roztoku (napríklad v extendri). Častice roztoku zahrnujú oboje, ióny aj neiónizované molekuly. Osmolalita je vyjadrená ako koncentrácia osmoticky aktívnych častíc (napríklad osmolov) rozpustených v 1 kilograme vody. '

Metóda kryoprezervácie

Vynález opisuje metódu kryoprezervácie vybraných spermií a zahrnuje 'nasledujúce kroky:

1) získanie a selekciu vzoriek spermií,

2) ochladenie vzoriek vybraných spermii,

3) izoláciu spermií zo vzoriek vybraných spermií,

4) pridanie finálneho extendra do izolovaných spermií na vytvorenie suspenzie spermií,

5) zmrazenie suspenzie spermií.

Získanie vzoriek vybraných spermií

Prvý krok kryoprezervačnej metódy vynálezu je získanie vzoriek predtým vybraných spermií, rovnako ako podrobenie zdrojovej vzorky vhodnej selekčnej metóde. Spermie akéhokoľvek druhu môžu byť vybrané a zmrazené podľa metódy tohto vynálezu. Metóda môže byť vykonávaná so spermiami domestikovaných zvierat, predovšetkým dobytka, rovnako ako so spermiami divoko žijúcich zvierat (napríklad ohrozených druhov). Uprednostňuje sa, aby vzorka obsahovala spermie cicavcov. Ľudské spermie, bovinné, konské, ovčie, losie a bizónie sú preferované.

Všeobecne, vzorka vybraných spermií obsahuje normálne, životaschopné spermie. Ejakulát, z ktorého sú spermie získané, má typicky okolo 50% a lepšie najmenej 75% morfologicky normálnych spermií. V týchto telieskach bežne najmenej 40% a lepšie najmenej 60% spermií v ejakuláte vykazuje rastúcu pohyblivosť.

Dostupná je široká škála metód pre výber buniek z mixovanej populácie, ktorá zahrnuje napríklad výber buniek, založený na väzbe buniek alebo bunkových komponentov s protilátkami, časticami protilátok alebo ďalšími väzbovými partnermi a rôzne zafarbenie.

Vynález sa uvádza so selekčnou technikou založenou na rozdielnom type pohlavia a pre tento vynález podľa pohlavia vyberané spermie môžu byť získané s použitím akéhokoľvek selekčného postupu, ktorý používa výhody mierneho rozdielu medzi X a Y typom spermií. Príkladom metódy, založenej na rozdiele pohlavia sú magnetické techniky (pozri napríklad US Patent č. 4 276 139), stĺpcové techniky (pozri napríklad US Patent č. 5 414 537), gravimetrické techniky (pozri napríklad US Patent č. 3 894 529, obnovený Patent č. 32 350, US Patent č. 4 092 229, 4 067 965 a 4 155 831). Selekcia podľa pohlavia, založená na rozdiele v elektrických vlastnostiach, je opísaná v US Patente č. 4 083 957 a o technike selekcie, ktorá je založená na rozdiele v elektrických a gravimetrických vlastnostiach sa diskutuje v US Patente č. 4 225 405, 4 698

142 a 4 74 9 4 56. US Patent č. 4 009 260 a 4 339 434 opisuje selekciu založenú na rozdieloch motility. Biochemické techniky, založené na protilátkach sú opísané v US Patentoch č. 4 511 661, 4 99 283, 3 687 803, 4 191 749 a 4 448 767, pričom US Patenty č. 5 021 224, 5 346 990, 5 439 362 a 5 660 997 opisujú selekciu, založenú na rozdiele v membránových proteinoch buniek.

Prietoková cytometria je uprednostňovaná metóda, ktorá sa používa na separáciu buniek zo zmiešanej populácie a je založená na rôznom zafarbení fluorescenčnými farbami alebo fluorescenčné poznačenej molekuly, napríklad protilátky alebo nukleovej kyseliny. V triediči fluorescenciou aktivovaných bunkách (FASC), sa bunky „triedia do rôznych populácii na základe intenzity fluorescencie pri ožiarení. FASC sa môže používať na selekciu spermií podľa pohlavia, lebo chromozóm X obsahuje viac DNA ako chromozóm Y. Keď sú spermie zafarbené pomocou fluorescenčného farbiva, ktoré sa viaže na DNA, spermie, ktoré nesú chromozóm X absorbujú viac farbiva ako spermie, ktoré nesú chromozóm Y a týmto spôsobom môžu byť rozdelené 2 populácie buniek pomocou FACS. 0 tomto postupe sa diskutuje v US Patente č. 4 362 264 a podstatne je rozšírený v US Patente 5 135 759 (vydaný Johnsonovi). Rozdeľovanie môže byť umocnené použitím prietokového cytometra s vysokou rýchlosťou, ako je MoFlo® prietokový cytometer, , ktorý vyrába Cytomation, inc. (Ft. Collins, CO) a je opísaný v US Patente č. 5 150 313, 5 602 039, 5 602 349 a 5 643 769 tak, ako v PCT Publication č. WO 96/12171.

Selekčná metóda založená na získaní vzorky vybraných spermii je predovšetkým tá, ktorá dokáže uchovať životaschopnosť spermií. Normálna prietoková cytometrická technika by mala byť všeobecne modifikovaná na delenie spermií a to pre relatívnu fragilitu spermií. Presnejšie, prietoková cytometria obsahuje farbenie, riedenie (dilúciu) a vystavenie buniek svetlu. Všetky tieto kroky predstavujú záťaž a môžu znižovať životaschopnosť spermií. Citlivosť spermií na tieto druhy záťaže môže byť rôzna pri rôznych druhoch a dokonca aj medzi jednotlivými jedincami toho istého druhu. Táto citlivosť musí byť alebo dokumentovaná, alebo môže byť ľahko určená pomocou empirických štúdií, ako je opísané v príkladoch 1-5.

Modifikácie, ktoré zvyšujú životaschopnosť spermií sú opísané v horeuvedených patentových publikáciách. Napríklad, postup, ktorý uvádza zlepšenie puzdra a zberného systému na riadenie spermií je opísaný v PC Publication Co. WO 99/33956 (aplikácia č. PCT/US98/27909). Ďalej príklady 1-7 uvedené nižšie, opisujú postupy na farbenie a rozdeľovanie spermií. Príklad 3 v štúdii opisuje účinok laserovej intenzity a koncentráciu farbiva na motilitu vybraných zmrazených spermii po roztopení.

Vzorka vybraných spermii obsahuje rad ďalších častí okrem spermií a často obsahuje komponenty, ktoré sú pridávané na ochranu spermií v priebehu procesu výberu. V prípade FACS, vzorka vybraných spermií môže obsahovať komponent(y) roztokov, ktoré sa používajú na farbenie a triedenie (napríklad tekutinu puzdra a nárazník na zachytenie).

Vzorka vybraných spermii navyše obsahuje typický extender, alebo frakcie extendrov. Napríklad sú veľmi dobre známe dvojstupňové extendre, keď „frakcii A chýba glycerol a „frakcia B obsahuje glycerol. Frakcia A je najprv pridávaná k spermiám a nasleduje pridanie rovnakého objemu frakcie B. Pri tomto kroku je frakcia B väčšinou rozdelená do najmenej 2 rovnakých častí a podávaná postupne, t.j. druhá časť frakcie B je podaná 15 minút po prvej.

Keď nie sú prítomné žiadne extendrové komponenty, potom je extender alebo jeho frakcie pridávané k typicky selektovanej vzorke spermií predtým, ako sú spermie izolované zo vzorky. Ak sú prítomné len niektoré komponenty extendra, dodatočné komponenty môžu byť pridané podľa voľby tak, aby vybrané spermie obsahovali kompletný extender alebo extendrové frakcie pred krokom izolácie. V exemplárnych vzorkách, hovädzie spermie, sú rozdeľované prietokom tak, že vyrobené vzorky selektovaných spermii obsahujú tiež frakciu extendra (pozri príklad 2, 3 a 4). V prípade potreby frakcia B extendra môže byť pridaná k vzorke pred krokom izolácie (pozri príklad 5). Podávanie extendra pred izoláciou (alebo frakcia extendra) sa označuje „iniciálny extender'', aby sa odlíšil od „finálneho extendra, používaného na extenziu izolovaných spermií pred zmrazením. Ak bola vzorka vybraných spermií vybraná pomocou FACS, iniciálny extender môže byť vyrovnaný do tekutiny puzdra, používaného na rozdeľovanie. Príklady vyrovnávacej tekutiny puzdra a extendre sú detailne opísané v príklade 4.

Extender vhodný na použitie pre vzorku vybraných spermii obsahuje fyziologicky prijateľný nosič. Fyziologicky prijateľný nosič je typicky vodový a v preferovaných aplikáciách obsahuje deiónizovanú vodu. Vhodný extender často obsahuje jeden alebo viac z nasledovných komponentov: kryoprotektant komponentu, ktorý udržiava osmolalitu a vyrovnáva pH, anorganickú substanciu, ktorá zabraňuje šoku z chladu a uchováva fertilitu spermií, detergent, ktorý pôsobí synergicky s niektorými substanciami tak, aby zvýšil ochranu spermií, zdroj energie, ktorý môže spermie využívať, antioxidant, ktorý chráni spermie pred šokom z chladu, substanciu, ktorá umocňuje kapacitu spermií a jedno alebo viac antibiotík.

Aj keď kryoprotektanty, vhodné pre tento vynález nie sú obmedzené len na tie, ktoré účinkujú s určitým mechanizmom, najbežnejšie kryoprotektanty účinkujú aspoň sčasti obmedzením intracelulárnej dehydratácie. Presnejšie, zmrazenie je sprevádzané vzostupom koncentrácie roztoku v okolí spermie. Tento vzostup koncentrácie roztoku ťahá vodu z buniek, čím zvyšuje intracelulárnu elektrolytovú koncentráciu.

k r yop ro t e k t a nt ov obsahujú glycerol, dymetyl sulfoxid, propylénglykol a pod. Kryoprotektant vhodný na použitie v danom eztendrí sa môže líšiť v závislosti na druhu, od ktorého sú spermie získavané. Napríklad, glycerol je vhodný na použitie kryoprezervácie ľudských a hovädzích spermií, ale bežne sa nepoužíva na kryoprezerváciu bravčových a králičích spermií. Tieto preferencie sú dobre známe pre mnohé komerčne hodnotné spermie a možno ich ľahko určiť empiricky pre ďalšie typy spermií.

Extender vhodný pre tento vynález obsahuje jeden alebo viac komponentov, ktoré pomáhajú udržiavať osmolalitu a zaisťujú nárazníkovú kapacitu. V preferovaných uskutočneniach tohto vynálezu, osmolalita extendra je približne rovnaká ako osmolalita fyziologickej tekutiny. Uprednostňuje sa osmolalita extendra v rozmedzí okolo 280mOsm až do 300m0sm. Hodnota pH je tiež prednostne vo fyziologicky prijateľnom rozmedzí, najlepšie v rozmedzí medzi 6,5 až 7,5.

Látky, ktoré pomáhajú udržiavať osmolalitu a pH v tomto rozmedzí sú dobre známe a môžu byť pridávané do extendra v pevnom skupenstve alebo ako roztok. Nárazníkové systémy, ktoré obsahujú soli ako karbohydrát, alebo kombináciu z nich, môžu byť z týchto dôvodov používané. Zvláštne príklady zahrnujú citrát sodný, tri(hydroxymetyl)aminometán a TES (N-tris(hydroxymetyl)metyl-2-aminometansulfónovú kyselinu) a pufre glutamátu sodného; mlieko; HEPES-pufrovacie médium; a akékoľvek ich kombinácie. Komponenty používané na to, aby pomohli udržať osmolalitu a zaistili pufrovaciu kapacitu sa môžu v určitej aplikácii líšiť v závislosti na ďalších komponentoch extendra a v niektorých prípadoch na druhu, z ktorého sú spermie odobraté. Výber týchto komponentov na použitie v prezentovanom vynáleze je však na úrovni šikovnosti v odbore.

Jedna alebo viac organických látok, ktoré ochraňujú spermie pred šokom z chladu a pomáhajú zachovať fertilizačnú kapacitu, môžu byť tiež zahrnuté v extendri.

Také substancie sú dobre známe a kryoprotektant. V niekedy sa označujú ako prípade vedomosti v odbore je ľahké určiť organickú látku, vhodnú na zvláštne vykonávanie kryoprezervačnej metódy, ktorá je tu opísaná. Napríklad organická substancia, ktorá obsahuje protektívne časti (napríklad lipoproteíny, fosfolipidy, lecitín), o ktorých sa domnievame, že znižujú dopad šoku z chladu a dilúčneho efektu, môžu byť pridané do extendra. Vhodná organická substancia obsahuje disacharidy, trisacharidy a niektoré ich kombinácie. Príklady organických substancii zahrnujú vaječný žĺtok, výťažok z vaječného žĺtka, mlieko, mliečny extrakt, kaseín, albumín, lecitín, cholesterol a niektorú ich kombináciu.

Extender môže tiež obsahovať detergent. Uvádza sa, že alkylové iónické detergenty, ako je dodekylsulfát sodný (SDS), účinkujú zhodne sa vaječným žĺtkom a zvyšujú ochranu proti šoku z chladu. Ďalšie detergenty, vhodné na kryoprezerváciu môžu byť tiež používané v extendri a výber zvláštneho detergentu na špecifické uplatnenie závisí od stupňa šikovnosti vzhľadom k uvedenému návodu. Pozri príklad 5.

Uprednostňuje sa, aby extender obsahoval zdroje energie, ktoré spermie môžu ľahko využívať. Pri neprítomnosti energetických zdrojov môžu spermie utilizovať intracelulárne fosfolipidy a ďalšie látky. Pridanie energetického zdroja do extendra ochráni intracelulárne rezervy a bunkové komponenty. Je dobre známe, že cukry, predovšetkým monosacharidy poskytujú vhodný zdroj energie, pretože ďalšie konvenčné zdroje energie sa môžu použiť v extendri. Príklady monosacharidov, vhodných na použitie v extendri zahrnujú glukózu, fruktózu a/alebo manózu.

V extendri môže byť zahrnutý jeden alebo viac antioxidantov na zabezpečenie ďalšej ochrany proti šoku z chladu.

Príklady antioxidantov zahrnuj ú butylovaný hydroxytoluén (BTH), jeho deriváty a podobne. Užitočné môžu byť ďalšie antioxidanty, ktoré sú umiestnené v extendri a výber príslušného antioxidantu na špecifické použitie závisí od vedomosti v odbore, s prihliadnutím na uvedené doporučenie.

Extender môže tiež obsahovať látky, ktoré napomáhajú kapacite spermií. Je známy rad facilitátorov kapacitácie a každý môže byť použitý v extendri. Príklady zahrnujú enzýmy ako je alfa amyláza, beta amyláza, beta glukoronidáza, ktoré môžu byť použité aj v kombinácii, pokiaľ je to žiaduce.

Nakoniec extender prednostne obsahuje antibiotiká, lebo bakteriálny rast môže podstatne narušiť životaschopnosť spermií a zvýšiť riziko infekcie hostiteľa pri arteficiálnej inseminácii alebo in vitro fertilizačnej procedúre. Ktorékoľvek z antibiotík vhodné na použitie v kryoprezervácii buniek môže byť tiež použité v extendri. Výber vhodného antibiotika závisí na druhu, od ktorého sú spermie získané, procedúre získania, na zachádzaní so vzorkou spermií a na špecifickom mikroorganizme, ktorý má byť zasiahnutý. Príklad antibiotík zahrnuje tylozín, gentamycín, linkomycín, spektinomycín, linko-spektín (kombinácia linkomycínu a spektinomycínu), penicilín, streptomycín a tikarcilín, ktoré sa môžu použiť samostatne alebo v kombinácii. Samozrejme, odborník v uvedenom odbore môže ľahko určiť ďalšie antibiotiká vhodné na použitie v extendri.

Príklady extendrov sú detailnejšie opisované nižšie a v príkladoch uskutočnenia.

Koncentrácia spermií je typicky nižšia vo vzorke vybraných spermií ako v zdrojovej pokiaľ sa používa FACS, vzorke a ako bolo uvedené vyššie, rozriedenie je významné.

Typické rozdelenie založené na type vzorky, ktoré obsahujú spermie pohlavia spermií môže v koncentrácii 6 x

10⁵ ; vyrobiť buniek/ml zachyteného pufra. Také nízke koncentrácie nie sú vhodné na skladovanie (aspoň nie pre kryoprezervačná metóda vynálezu všeobecne väčšinu testovaných druhov), koncentruje vzorky vybraných spermií.

Chladenie vzorky vybraných spermií

Druhý krok v kryoprezervačnej metódy zavádza chladenie vzorky selektovaných spermií, typicky, pokles teploty kontrolovanú rýchlosťou. Príliš rýchle chladenie môže privodiť šok z chladu, ktorý môže vyústiť do straty integrity membrány a straty funkcie bunky. Závažnosť účinku šoku z chladu kolíše od druhu k druhu a závisí na chladenia a teplotné rozmedzie.

faktoroch, ako je rýchlosť kontrolovaných

Pri vhodne podmienkach chladenia termálny sú spermie schopné sa efekt. Príklad 2 medziiným adaptovať na opisuje podmienky na chladenie chladenie hovädzích spermii a určuje spermií ďalších druhov v rámci vhodné podmienky na vedomosti v odbore.

V preferovaných aplikáciách tohto vynálezu je vzorka vybraných spermií ochladená typicky z 22°C a chladenie prebieha počas doby od 60 minút do 24 hodín, lepšie od 90 minút do asi 240 minút, a najlepšie od 90 minút do asi 120 minút. Chladenie môže byť uskutočnené akoukoľvek konvenčnou metódou, vrátane jednoduchého umiestnenia vzorky vybraných spermii do prostredia s teplotou 5°C.

Izolácia buniek spermií zo vzorky vybraných spermií

Po iniciálnej extenzii vzorky vybraných spermií, sú spermie izolované zo vzorky s použitím dostatočne jemnej izolačnej metódy, ktorá zaisťuje návratnosť spermií najmenej 50%, lepšie od 75% do 90% a najlepšie od 80% do 90%. V priebehu kroku izolácie by ochladené spermie mali zostať v chlade, medzi asi 1 a cca 8°C, najlepšie blízko medzi 4 a 5°C.

Môže byť použitá akákoľvek metóda, ktorá je vhodná na znovuzískanie a izoláciu spermií zo suspenzie, vrátane napríklad filtrácie, sedimentácie a centrifugácie. V príklade preferovanej aplikácie sa vzorka vybraných spermií rozdelí do 50 ml skúmaviek v objeme, ktorý neprevyšuje 27 ml a lepšie medzi 20 a 27 ml. Centrifugácia separovania pri 4°C, pri 850 g počas 20 minút. Prednostne centrifugačný krok zaisťuje najmenej od 50% do 90% návratnosť spermií, lepšie od 60% do 90% a najlepšie od 70% do 90%. Po izolácii je supernatant odstránený a sediment je jemným vírením suspendovaný alebo opakovane aspirovaný pri 4°C. Koncentrácia spermií je potom typicky určená (napríklad pomocou hemacytometru).

Finálna extenzia izolovaných spermií

Po izolácii sú spermie extendované s finálnym extendrom na koncentráciu vhodnú pre mrazenie. Preferovaná koncentrácia spermií po finálnej extenzii a pred mrazením je v rozmedzí 1 x

10⁶/ml až 300 x 10⁶/ml, lepšie 10 x 10⁶/ml až 50 x 10⁶/ml a najlepšie 10 x 10⁶/ml až 20 x 10⁶/ml.

Horeuvedený opis iniciálneho extendra možno tiež aplikovať na finálny extender, ktorý môže byť rovnaký alebo odlišný od iniciálneho extendra. Vo zvláštnom uskutočnení, zloženie vzorky spermií s finálnym extendrom je v podstate podobné (pokiaľ nie dokonca rovnaké), ako zloženie vzorky spermií po pridaní iniciálneho extendra.

V prednostnom vyjadrení vynálezu sa používa extender vaječný žítok-Tris. Po pridaní extendra obsahuje suspenzia spermií glycerol (kryoprotektant); kyselinu citrónovú a tri(hydroxymetyl)aminometán (pufor); vaječný žĺtok (organickú substanciu); fruktózu (energetický zdroj); tylozín, gentamycin a linkospektin (antibiotiká). Typické približné koncentrácie po pridaní finálneho extendra do izolovaných spermii sú:

Komponenty extendra vaječný žítok-Tris

Glycerol 4-8% (objemových)

Kyselina citrónová 55-75 mM tri(hydroxymetyl)aminometán 190-210 mM vaječný žĺtok 5-25% (objemových) fruktóza 45-65 mM tylozín 25-100 ug/ml gentamycin 200-300 ug/ml linko-spektín 100-400 ug/ml* *100-400 ug/ml linkomycin a 100-400 ug/ml spektomycin

Koncentrácia týchto komponentov po pridaní finálneho extendra do izolovaných spermii je pri obmenách tohto uskutočnenia okolo 6% (objemových) glycerolu, okolo 65 mM kyseliny citrónovej, okolo 200 mM tri(hydroxymetyl) )aminometánu, okolo 20% (objemových) vaječného žĺtka, okolo 56 mM fruktózy, okolo 50 ug/ml tylozínu, okolo 250 ug/ml gentamycínu a okolo 150/300 ug/ml linko-spektínu (to je 150 ug/ml linkomycínu a 300 ug/ml spektomycínu) v deionizovanej vode.

V alternatívnom uskutočnení je používaný extender vaječný žítok-citrát. Po pridaní extendra obsahuje suspenzia spermií glycerol (kryoprotektant); citrát sodný (pufor); vaječný žĺtok (organická substancia); tylozín, gentamycín a linko-spektín (antibiotiká). Typické približné koncentrácie po pridaní finálneho extendra do izolovaných spermií sú:

Komponenty extendra vaječný žítok-citrát

Glycerol

Citrát sodný vaječný žĺtok tylozín gentamycín linko-spektín

4- 8% (objemových)

60-80 mM

5- 25% (objemových

25-100 ug/ml

200-300 ug/ml

100-400 ug/ml* *100-400 ug/m'l linkomycin a 100-400 ug/ml spektomycin

Príklad uprednostňovanej koncentrácie pre mrazenie hovädzích spermií je okolo 7% (objemových) glycerolu, okolo 72 inM citrátu sodného, okolo 20% (objemových) vaječného žĺtka, okolo 50 ug/ml tylozínu, okolo 250 ug/ml gentamycínu a okolo 250/300 ug/ml linko-spektínu.

V alternatívnom uskutočnení je používaný extender vaječný žítok-TES-Tris (EY Test). Po pridaní extendra obsahuje suspenzia spermií glycerol (kryoprotektant); vaječný žĺtok a zohriate mlieko, napríklad homogenizované mlieko obsahujúce 1,25% fruktózy s 10% glycerolu (organická substancia); tylozín, gentamycín a linko-spektín (antibiotiká). Typické približné koncentrácie po pridaní finálneho extendra do izolovaných spermii sú:

Komponenty extendra vaječný žítok-TES-Tris

Glycerol 3-7% (objemových)

Tris(hydroxymetyl-metyl)aminoetánová kyselina

140-170 mM tri(hydroxymetyl)aminometán 60-80 mM vaječný žĺtok 5-25% (objemových) fruktóza 45-65 mM tylozín 50-150 ug/ml gentamycin 400-600 ug/ml linko-spektín 200-700 ug/ml* *200-700 ug/ml linkomycín a 200-700 ug/ml spektomycín

Príklad uprednostňovanej koncentrácie pre mrazenie hovädzích spermií je okolo 5% (objemových) glycerolu, okolo 158 mM Tris(hydroxymetyl-metyl)aminoetánovej kyseliny, okolo 72 mM tri(hydroxymetyl)aminometánu, okolo 20% (objemových) vaječného žĺtka, okolo 8 mM fruktózy, okolo 100 ug/ml tylozínu, okolo 500 ug/ml gentamycínu a okolo 300/600 ug/ml linko-spektínu.

V ďalšom alternatívnom uskutočnení je používaný mliečny extender. Po pridaní eztedra suspenzia spermií obsahuje glycerol (kryoprotektant); zohriate mlieko, homogenizované mlieko (organickú substanciu); tylozín, gentamycin a linko-spektín (antibiotiká). Typické približné koncentrácie týchto komponentov po pridaní finálneho extendra do izolovaných spermií sú:

Komponenty mliečneho extendra

Homogenizované mlieko

90% (objemových)

Glycerol

Fruktóza

Tylozín

3-7% (objemových)

1,25% (hmotnostných) ug/ml gentamycín linko-spektín

250 ug/ml

250-300 ug/ml* *250-300 ug/ml linkomycín a 250-300 ug/ml spektomycín

Príklady uprednostňovanej koncentrácie pre mrazenie hovädzích spermií sú okolo 90% mlieka, okolo 10% (objemových) glycerolu, okolo 1,25% fruktózy (hmotnostných?) okolo 50 ug/ml tylozínu, okolo 250 ug/ml gentamycínu a okolo 250/300 ug/ml linko-spektínu.

Ako finálny extender na mrazenie vybraných spermií 'sa môžu štandardne použiť ešte ďalšie extendre. Bol opísaný rad extendrov, ktoré sú optimálne na mrazenie spermií od rôznych druhov a mnohé sú komerčne dostupné. Mraziace extendre pre konské spermie typicky obsahujú mlieko, vaječný žĺtok, rôzne cukry, elektrolyty a kryoprotektant. Príklady mraziacich extendrov sú opísané v práci Squiresa EL et. al, Cooled and ŕrozen Stallion Semen Animal Reprod. And Biotechnology Laboratory, Bulletin No 69, Chapter 8, „Seminal Extenders, pp. 49-51 (July 1999) .

Ľkvilibrácia a mrazenie spermií

Extenzia vzorky spermií vyrobí suspenziu spermii, ktorá je potom prenesená do kontajnerov určených na mrazenie. Ak sa predpokladá, že spermie budú použité na fertilizáciu, potom sú bunky výhodne rozdelené do jednotlivých individuálnyvh dávok, ktoré budú postačujúce na dosiahnutie, fertilizácie. Požadovaná dávka môže podstatne kolísať druh od druhu a je dobre známa (napríklad pre dobytok alebo pre kone) alebo môže byť lahko určená. V prípade hovädzích, spermií, vybraných na základe pohlavia, vhodná dávka kolíše v rozmedzí od 1 x 10⁶ do 3 x 10⁶ spermií.

Vhodný zásobník, ktorý sa môže použiť na mrazenie zahrnuje napríklad ampule, odberové rúrky. Spermie, s ktorými sa počíta na použitie pre Al sú zmrazované v odberových rúrkach (napríklad 0,25 ml alebo 0,50 ml odberové rúrky), ktoré sú upravené pre inseminačný revolver. Uprednostňovaná úprava je táto: bolus extendra je vtiahnutý do odberovej rúrky, nasleduje vzduch, spermie, vzduch a extender tak, že spermie sú chránené na obidvoch stranách vzduchom, ktorý ich oddeľuje na obidvoch stranách odberovej rúrky od bolusu extendra.

Bežne je možné spermie pred mrazením ustáliť na 5°C. Prednostne sa dovoľuje ustáliť spermie na dobu v rozmedzí medzi 1 hodinou a 18 hodinami, lepšie medzi 3 hodinami a 18 hodinami, najlepšie medzi 3 hodinami a 6 hodinami (pozri príklad 2).

Po ustálení nasleduje nejaká štandardná zmrazovacia metóda, ktorá zaisťuje, že zmrazovanie nebude prebiehať príliš rýchlo (napríklad nebude presahovať asi 0,5°C/minútu). Uprednostňovaná je rýchlosť zmrazovania okolo 0,5°C/minútu. V príkladoch uprednostňovaného uskutočnenia sú spermie umiestnené do statickej tekutej dusíkatej pary a mrazenie sa vykonáva v troch oddelených fázach pri perióde asi 10 minút. V prvej fáze zmrazovania sú spermie ochladené asi z 5°C na -15°C rýchlosťou od 40°C/minútu do 60°C/minútu. V druhej fáze mrazenia sú spermie chladené asi z -15°C na -60°C rýchlosťou od 25°C/minútu do 35°C/minútu. V tretej fáze sú spermie ponorené do tekutého dusíka pri asi -100°C.

Vzorky vybraných spermií

Vynález zaisťuje v dodatku k mraziacim metódam zmrazenú vzorku spermií, vrátane výberu spermií zo zdrojovej vzorky podľa určitých vlastností. Spermie môžu byť od akéhokoľvek druhu, vrátane tých, ktoré boli spomenuté vyššie, s referenciami pre mraziacu metódu. Vynález zahrnuje mrazené vzorky spermii, vybrané podľa nejakej charakteristiky akoukoľvek výhodnou metódou, opísanou vyššie. Uprednostňované opisy zahrnujú zmrazené vybrané ľudské, bovinné, konské, bravčové, ovčie, losie alebo bizónie spermie. Výber na základe pohlavia je prednostne vykonávaný s použitím prietokovej cytometrie, ako bolo všeobecne opísané vyššie.

Predmetom vynálezu je tiež zásobník, ktorý obsahuje zmrazené vzorky spermií podľa tohto vynálezu. Zásobník môže byť vyrobený z akéhokoľvek materiálu, ktorý nereaguje s mrazenými vzorkami spermií a môže byť rôzneho tvaru alebo vlastnosti, ktorá uľahčuje použitie vzorky pre aplikáciu. Napríklad pre vzorky, ktoré budú použité pre IA je ako kontajner výhodná odberová rúrka (napríklad 0,25 ml alebo 0,5 ml odberová rúrka), ktorá je upravená na použitie s inseminačným revolverom. Zásobník je zapečatený akýmkoľvek spôsobom, ktorý je vhodný pre zachovanie vzorky v predpokladanej skladovacej teplote, ktorá je bežne pod 80°C. Odberové rúrky s obsahom 0,25 ml môžu byť zapečatené napríklad ultrasonograficky, z bavlny a polyvinylu a/alebo (BE) .

PVC prachom, alebo zátkami nerezovými oceľovými guličkami

Pretože zmrazené vzorky opísané v tomto vynáleze' sú typicky rozmrazené pred použitím, .vynález tiež obsahuje rozmrazovanie predtým zmrazených vzoriek vybraných spermií a zásobníka, ktorý zahrnuje rozmrazovaciu vzorku.

Metóda použitia vzorky vybraných spermii

Zmrazený výrobok vybraných spermií podľa tohto vynálezu je vhodný na použitie v akejkoľvek metóde, kde sú používané spermie. Vzorka môže byť rozmrazená a použitá k akejkoľvek konvenčnej fertilizačnej metóde, ako je arteficiálna inseminácia alebo in vitro fertilizácia. Rozmrazovanie sa vykonáva rovnakým spôsobom, ako pre zmrazené neselektované spermie. Odberová rúrka, ktorá obsahuje zmrazenú vzorku spermií sa ponorí do vodného kúpeľa s teplotou asi 35°C až

37°C na dobu asi 20 až 30 sekúnd. Po roztopení sa vykoná umiestnenie semena (napríklad inseminácia) podľa štandardných postupov, ktoré sa starajú o ochranu spermii pred výkyvmi okolitého prostredia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Účinok dilúcie na spermie

Cieľ: určiť účinok koncentrácie spermií na pohyblivosť spermii pre nezmrazené a netriedené, ale vysoko rozriedené spermie

A. Účinok dilúcie na nepremyté spermie

1. Odobratie zdrojovej vzorky. Spermie boli odobraté býkom podľa rutinného zberového protokolu s použitím arteficiálnej vagíny ako opisuje Schenk J., Proc 17^th NAAB, p. 48-58 (1998) a Saacke RG, Proc NAAB Tech Conf Al Reprod. 41:22-27 (1972). Všetky ejakuláty bežne obsahujú viac ako 50% vysoko pohyblivých a viac ako 75% morfologicky normálnych spermií. K surovému ejakulátu boli pridané antibiotiká ako opisuje Shí.n S., Proc NAAB Tech Conf Al Reprod. 11:33-38 (1986) v priebehu

1.5 minút po zbere a koncentrácia spermií sa určila s použitím spektrofotometrie.

2. Metóda. Spermie od 4 býkov boli rozriedené na 1,25, 2,5, 5,

10, 15 a 20 x 10⁶/ml, s použitím extendra vaječný žltok-citrát (EYC), ktorý bol pripravený z 20% vaječného žĺtka (objemových) v 72 mM citráte sodnom, 50 Tg/ml tylozinu, 250 Tg/ml gentamycínu a 250/300 Tg/ml linko-spektínu. Každá vzorka bola pripravená dvojmo (2 skúmavky/rozriedenie/býk) a obsahovali 8 ml celkového objemu na skúmavku. Všetky vzorky boli inkubované počas 60 minút pri 22°C, potom boli centrifugované s použitím centrifúgy (Eppendorf, Model # 5810R) pri 600x g počas 10 minút, aby došlo ku koncentrácii spermií. Po centrifugácii sa z jednej sady duplikátu neodstránil supernatant; spermie boli resuspendované v rovnakom médiu a na pôvodnú koncentráciu opakovanou jemnou ašpiráciou 5 ml sérologickou pipetou. (Druhá sada duplikátu skúmaviek sa použila v príklade 1B). Vzorky spermií sa potom ochladili na 5°C v priebehu 90 minút

rýchlosťou 0,2°C/minútu .	Tieto	spe	rmie	boli	označené ako
nepremyté spermie. Všetky 24-48 hodín po zbere.	vzorky	sa	inkubovali	pri 5°C počas
3.; Posúdenie motility.	Predtým,	ako	sa	posudzovala

pohyblivosť, vzorky sa zohriali na 37°C s použitím suchého blokového inkubátora na 10 minút. Pre tento pokus sa určil pre každú vzorku jednoduchý, slepý odhad percenta rastúcej pohyblivosti spermií. Progresívna pohyblivosť spermií sa určovala subjektívne pre· každú podtriedu jedným pozorovateľom (x 200, fázový kontrastný mikroskop); ďalšia osoba pripravovala mikroskopický náter randomizovaným spôsobom, preto pozorovateľ nebol upozornený na ošetrenie.

. Štatistická analýza. Údaje boli spracované analýzou rozptylu (SAS institue, Čary, North Carolina) s faktormi býka a počiatočným rozriedením koncentrácie. Oddelená analýza bola vykonaná pre každú dobu inkubácie. Dilúčne trendy sa testovali s (log) lineárnymi kontrastami.

5. Výsledky. Údaje pre nepremyté spermie (tabuľka 1) overili (log) lineárnu závislosť (p < 0,01) pre obidva inkubačné časy. Percento pohyblivých spermií sa zvyšovalo s rastúcou koncentráciou spermií z 1,25 10⁶/ml do 10 x 10⁶/ml, ale tu bol malý rozdiel. Kubický termín bol signifikantný (p < 0,05) pre 24 hodinovú a marginálne signif ikantný (p < 0,1) pre 48 hodinovú inkubáciu. Bol prítomný efekt býka (p < 0,1) pri obidvoch časoch.

Tabuľka 1.

Účinok chladenia na motilitu nepremytých spermií pri ochladení na 5°C.

Inkubácia pri 5°C
Dilúcia (106/ml) 24 hodín3 48 hodínb
1,25	18c	0c
2,25	38c,d	6Š3
5,0	56d	31d,e
10,0	61d	42e
15,0	55d	44e
20	58d	41e
S.E.f	5, 6	6,4

³ (log)lineárny (p < 0,01) a kubické efekty (p < 0,05) ^b(log)lineárny (p < 0,01) a kubické efekty (p < 0,1) ^c,d,epriemery so stĺpcami bez všeobecného nadpisu sa líšia (p<0,05) ^fýchyba priemeru štvorca ANOVA + Vn (SAS inštitút, Čary, NC, USA)

B. Účinok dilúcie na premyté spermie

1. Odobratie zdrojovej vzorky. Druhá sada z dvojice skúmaviek, ktoré obsahujú vzorky pripravené z príkladu 1A sa použila pre tento experiment.

2. Metóda. Spermie boli rozriedené, inkubované a koncentrované ako v príklade IA. Nasledovala centrifugácia, ašpirovalo sa

7,1 ml supernatantu z každej skúmavky, odstránila sa väčšina seminálnej plazmy a zostali tak spermie v 900-ul peletách. Spermie sa rozriedili s EYC (pozri príklad IA), aby sa pripravila suspenzia spermií 10 x 10⁶/ml. Tieto vzorky boli ochladené na 5°C počas 90 minút ako v príklade IA.

3. Posúdenie motility. Vzorky boli zohriate a pripravené na rastúcu motilitu ako v príklade IA.

4. Štatistická analýza. Údaje boli analyzované ako v príklade

IA. Navyše, údaje v príklade

IB boli posudzované aj na inkubačnú koncentráciu pri 5°C.

5. Výsledky.

Údaje signifi kantný hodinách. Po efekt pre premyté ošetrenia, spermie pokiaľ nevykazovali sa hodnotili žiadny po 24 dobe skladovania hodín pri 5°C však bol prítomný efekt býka, počiatočného rozriedenia, inkubačná koncentrácia a býka podľa inkubačnej koncentrácie (p<0,05). Viac spermii zostalo pohyblivých, pokiaľ sa držali pri 20 x 10 7ml ako pri 10 x 10⁶/ml (31% versus 20%, p<0,05).

Počiatočné rozriedenie 1,25, 2,5 a 5 ’ x 10⁶ spermií/ml rezultovalo v nižšej progresívnej pohyblivosti ako 10 x 10⁶/ml (p<0,05), s príslušným hlavnými efektívnym priemerom 19, 20, 2Ί a 37% motilných' spermií.

Tabuľka 2.

Kumulatívny účinok premytia, rozriedenia, koncentrácie a chladenia na progresívnu motilitu spermií (%)

Koncentrácia spermií	Skladovanie pri 5°C“koncentrácia spermií a trvanie skladovania
(lO'/ml 1 hod. 37°C	) v priebehu preinkubácie pri
24 hodín	4 8 hodín“
20 x 107ml	10 X 10'7ml	20 x 107ml	10 x 107ml
1,25	45	49	24	15
2,5	51	40	29	11
5, 0	54	54	32	21
10, 0	51	50	40	34
15,0	60		41
20,0	55		40

^aKoncentrácia 20 x 10^G/ml je lepšia (p < 0,05) ako 10 x 107ml po 48 hodinách skladovania.

Tiež iniciálne rozriedenie na 10 x 107ml je lepšie ako nižšie rozriedenie (p < 0,05).

Polovičné štandardné chyby (Vchyba priemeru štvorca-ANOVA + a/N) boli 4,0 pre 24 hodín a 2,8 pre 48 hodín inkubácie.

^bsignif ikantný (log) lineárny trend (p < 0,06).

6. Záver. Velké rozriedenie spermii a ochladenie vedie k podstatnému zníženiu percenta pohyblivých spermií, nezávisle na prítomnosti alebo odstránení seminálnej plazmy. Tento dilúčny efekt je však viac vyjadrený pri koncentrovaní spermií na 10 x 10^B/ml a dokonca viac pri koncentrovaní na 20 x 10'^J/ml pred skladovaním pri 5° C. Spermie od niektorých býkov tolerujú dilúciu lepšie ako spermie iných býkov; nájdené rozdiely v býkoch sú však typické. Extrémne rozriedené spermie môžu byť čiastočne znevýhodnené pri skladovaní odstránením protektívnych zlúčenín seminálnej plazmy.

Príklad 2

Účinok ekvilibračnej doby pred zmrazením triedených spermií Ciel: overiť účinok ekvilibračnej doby (3, 6 a 18 hodín, 5°C) pred zmrazením na prietokom triedené spermie

Nasledujúci experiment sa celý opakuje a používa rovnakých býkov

1. Odobratie zdrojovej vzorky. Spermie od 4 býkov boli odobraté a pripravené ako v príklade IA.

2. Metóda.

a) Farbenie a príprava na triedenie.

i) Príprava farbenia skladového roztoku: skladový roztok s

8,89mM Hoechst 33342 (bis-benzimid H-33342;# 190305, INC

Biomedicals Inc., Aurora. OH) sa pripraví v deiónizovanej vode.

ii) Procedúra farbenia spermií: spermie sú rozriedené v modifikovanom TALP pufre (tabuľka 3) na 400 x 10^h spermií/ml. Nasleduje dilúcia a pridanie Hoechst 33342 farbiva do suspenzie spermii v koncentrácii 224 uM. Potom, čo sa pridá farbivo k suspenzii spermii, vzorka sa inkubuje počas 60 minút pri 34°C. Po inkubácii sú spermie rozriedené na 100 x 10⁶ spermií/ml s TALP, ktorý obsahuje 2,67% vyčisteného vaječného žĺtka a 0,002% potravinového farbiva (FD&C#40), ktoré hasí fluorescenciu Hoechst 33342 v spermiách s kompromitovanou bunkovou membránou a dovoľuje, aby boli vyradené v priebehu triediaceho procesu. Tesne pred prietokovým triedením je vzorka filtrovaná gravitačnou jednotkou cez 40 um nylonový sieťový filter, aby sa odstránila tkanivová drvina a alebo poškodené spermie.

b) Triedenie. Dvojlinkový argónový laser, ktorý pracuje v 351 a 364 nm a 150 mW sa používa na exitáciu 'Hoechst 33342 farbiva. Prietokový cytometer/bunkový triedič, SX MoFlo® (Cytomation, ľne., Fort Collins, CO, USA), ktorý pracuje na 50 psi. Tekutina založená na Tris sa používa a je zložená z Tri (hydroxymetyl)aminometán monohydrátu (Tris; 197, OmM; #C-7129, Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, USA), monohydrát kyseliny citrónovej (55,4mM #C-7129, Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, USA) a fruktóza (47,5 mM #0-7129, Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, USA). Do tekutiny založenej na Tris sa tiež pridávajú základné antibiotiká, 0,58g/l penicilínu a 0,05 g/l sulfátu streptomycínu. Spermie sa delia procesom, ktorý sa označuje ako objemné triedenie, ktorý dovoľuje rýchle nahromadenie veľkého množstva spermií, preto široká škála príkladov môže byť vykonaná v rozumnom čase. Spermie prechádzajú prietokovým cytometrom pri štandardných pracovných podmienkach s tým rozdielom, že všetky kvapky, ktoré obsahujú životaschopné spermie sa vložia do .jednej skúmavky skôr, ako sa rozdelia do 2 skúmaviek podľa špecifickej vlastnosti (napríklad delenie podľa typu pohlavia). Spermie sú rozdelené na základe životaschopnosti; presnejšie, spermie, ktoré majú poškodenú plazmatickú membránu sú vylúčené v priebehu procesu objemového triedenia. Farbené spermie sa udržiavajú pri teplote 22 ± 1°C v priebehu triedenia. Objemovo roztriedené spermie sa vložia do plastikových 50 ml skúmaviek, ktoré obsahujú 2 ml 20% vaječný žítok-Tris extendra, ktorý je pripravený z 20% vaječného žĺtka (objemové) v 200 mM Tris, 65mM kyseliny citrónovej, 56 mM fruktózy, 50 Tg/ml tylozinu, 250 Tg/ml gentamycinu a 150/300 Tg/ml linko-spektinu v deiónizovanej vode. Vaječný žítok-Tris extender sa označuje ako Tris-A frakcia, aby sa vyznačil chýbajúci glycerol na tomto bode procedúry. Spermie sa vložia do skúmaviek tak, aby obsahovali 12 ml a približne 6 x 10⁶ spermií. Spermie sa následne inkubujú pri 22°C počas 1 až 3 hodín, aby sa napodobnili podmienky triedenia na základe typu pohlavia.

c) Príprava na zmrazenie. Po inkubácii nasleduje ochladenie roztriedených spermií na 5°C počas 70 minút. Po ochladení sú dve skúmavky umiestnené do mraziacej otočnej centrifúgy, nastavenej na 5°C a skúmavky sa centrifugujú pri 850 g počas 20 minút. Potom sa odstráni supernatant a proces pokračuje po pridaní 150ul frakcie A extendra Tris k asi 150ul peletám spermií pri 5°C tak, aby sa vytvorila koncentrácia spermií asi 40 x 10⁶. Spermie od individuálnych býkov sa odoberú a okamžite rozriedia s rovnakým množstvom extendra vaječný žítok-Tris, ktorý obsahuje 12% (objemových glycerolu („Tris B frakcia'')· Táto Tris B frakcia sa pridá k suspenzii spermií ako 2 rovnaké objemy v 15 minútových intervaloch tak, aby sa stanovila výsledná koncentrácia spermií 20 x 10⁵. Konečná koncentrácia glycerolu kompletného extendra vaječný žítok-Tris, ktorý obsahuje spermie je 6% (objemových).

d) Ekvilibrácia a mrazenie. Extendované spermie sa potom balia do 0,25 ml brčiek, ktoré sú z polyvinylchloridu, aby boli zmrazené rutinným postupom na mriežkach v statickej tekutej dusíkatej pare. Odberové rúrky od každého zo 4 býkov boli zmrazené po 3, 6a 18 hodinách celkového ekvilibračného času pri 5°C.

3. Overenie pohyblivosti po roztopení. Odberové rúrky sú podrobené topeniu vo vodnom¹ kúpeli pri 37°C. Slepý odhad progresívnej motility sa vykonáva po inkubácii vzoriek pri 37°C počas 0, 1 a 2 hodín po roztopení. ' Každý z 2 pozorovateľov odhaduje progresívnu motilitu spermií z každej z dvoch brčiek so spermiami. Tieto štyri odhady predstavujú pre každú experimentálnu jednotku predvzorkovanie.

4. Štatistická analýza. Štatisticky boli vzorky ' analyzované ako stredná hodnota grafu najmenších kvadrátov ANOVA, aby sa analyzoval interakcie jednotiek, efekt nejakého pozorovateľa a liečby. N sa vzťahuje na počet nie predvzoriek; štandardná chyba pozorovateľa x experimentálnych sa počítala na základe priemerov 4 predvzoriek z chyby štvorca priemeru ANOVAs a počtu experimentálnych jednotiek; najmenšie kvadráty priemerov sa prezentovali. Efekt ošetrenia sa overoval oddelene ANOVAs pre každý inkubačný čas. Model zahrnoval býkov ako randomizovaný efekt a ekvilibračný čas a pozorovateľov ako dané efekty; subgraf bol konzistentný s termínom pozorovateľ a vztiahnutej interakcie.

5. Výsledky. 3 alebo 6 hodinová ekvilibračná metóda bola lepšia ako 18 hodín (tabuľka 4), na základe percenta progresívne pohyblivých spermií pre 0 a 1 hodinu (p < 0,01), ale nie pre 2 hodiny inkubácie po roztopení. Účinky býka boli jasné pre 1 a 2 hodiny inkubačného času (p < 0,05), ale nie pre čas 0. Nebola žiadna .signifikäntná (p < 0,1) interakcia býka s časom ekvilibrácie, ani nebol prítomný signifikantný efekt pozorovateľa pre ktorúkoľvek odpoveď.

Tabuľka 3.

Modifikovaný TALP pufor

Ingrediencie	Koncentrácie
Na Cl	95,0 mM
K Cl	3, 0 mM
NaHPO<j	0, 3 mM
NaHCO3	10,0 mM
MgCl2 . 6 H2O	0,4 mM
Na Pyruvát	2,0 mM
Glukóza	5,0 mM
Na Laktát	25,0 mM
HEPESa	4 0,0 mM
Bovinný sérový albumín13	3,0 mg/ml
Gentamycín sulfát	30,0 ug/ml

^a#H3375, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. ^b#US70195, Frakcia V; Amersham/Life Scinece, Cleveland OH, USA.

Tabuľka 4.

Efekt predmraziaceho ekvilibračného času na progresívnu motilitu po roztopení (%)

Ekvilibrácia pri 5°C	Inkubácia	ori 37°C po roztopení
0 hod.	1 hod.	2 hod.
3 hod.	41a	36a,b	16
6 hod.	41a	37a	18
18 hod.	35b	31b	12
S.E.C	1,5	CO o	2,0

^{а, b}V stĺpcoch znamenajú bez všeobecného nadpisu Tukey HSD. ^cPolovičná štandardná chyba.

Vchyba priemeru štvorca ANOVA + a/n.

б. Záver. Výsledky neukazujú žiadny rozdiel v motilite spermií po roztopení pri ekvilibračnom čase 3 a 6 hodín a teplote 5°C, ale je viditeľný významný pokles motility spermií po 18 hodinách ekvilibrácie pri 5°C pred zmrazením. 3 a 6 hodinové rozmedzie dovoľuje zber 2 po sebe nasledujúcich 3 hodinových triediacich sériách pre mrazenie spermií bez poklesu motility po roztopení.

Pretože interakcia býka a ekvilibračného času nie je signifikantná, 3 a 6 hodinová ekvilibrácia je adekvátna s tým, že sa používajú len 4 býci. Optimálny ekvilibračný čas pre menšinu býkov sa odhaduje na viac ako 6 hodín.

Príklad 3

Účinok koncentrácie farbiva a sily laseru na vybrané spermie

Ciel: overenie účinku koncentrácie farbiva Hoechst 33342 v kombinácii s intenzitou laseru na prietokom vybrané spermie

1. Zber	zdrojovej vzorky.	Spermie	sa odoberú 6 býkom a
pripravia	sa rovnako, ako je	opísané v	príklade IA.
2. Metóda.
a) Design	experimentu. Jeden	ej akulát	(2 býci) a 2 ejakuláty
z rôznych	dní (4 býci) sa	použijú	v designe 2 a 2 plus
kontrola.

b) Farbenie a výber. Farbenie, príprava na triedenie, triedenie spermií sa vykonáva podľa opisu v príklade 2 s výnimkou toho, že farbivo Hoechst 33342 sa pridávalo do suspenzie spermií v konečnej koncentrácii 149 TM alebo 224 TM; a spermie boli vo veľkom roztriedené pomocou laseru, ktorý pracoval na 100 mW alebo 150 mW incidencie sily. Vo veľkom roztriedené spermie sa vložili do 50 ml plastikových skúmaviek ako je opisované v príklade 2. 4 skúmavky, ktoré obsahovali približne celkovo 15 x 10⁶ spermii sa od každého býka odobrali v priebehu 1 hodiny. Roztriedené spermie sa inkubovali 1 hodinu pri 22°C, aby sa napodobnil dlhší čas triedenia.

c) Príprava na mrazenie. Po inkubácii nasledovalo chladenie spermií ako v príklade 2. Spermie sa koncentrovali centrifugáciou pri 850 x g počas 20 minút. Potom sa odstránil supernatant a proces pokračoval po pridaní 150ul frakcie A extendra Tris k asi 150ul peletám spermií pri 5°C. Všetky pelety so spermiami sa suspendovali jemne opakovane vykonávanou reaspiráciou a odobrali sa spermie od individuálnych býkov. Tris- B frakcia extendra sa pridala po krokoch ako je opísané v príklade 2. Nefarbené, netriedené kontroly pre každého býka sa pripravili v Tris extendri, ktorý obsahoval 6% glycerol v koncentrácii 20 x 10⁶ a boli ochladené na 5°C, pokiaľ neboli pripravené vo veľkom triedené spermie.

d) Ekvilibrácia a mrazenie. Kontroly a triedené spermie boli zabalené do 0,25 ml polyvinylchloridových brčiek, ako je opísané v príklade 2, ekvilibrované na 5°C počas 3 hodín a potom konvenčné zmrazené.

3. Posúdenie motility po roztopení. Odberové rúrky boli rozmrazené a obsah kontrolovaný tak, ako je opísané v príklade 4 .

4. Štatistická analýza. Všeobecný opis štatistickej analýzy bol uvedený v príklade 2. Špecificky sa sledoval efekt ošetrenia pomocou ANOVA. Tento model zahrnoval koncentráciu farbiva, intenzitu laseru a býka ako hlavné parametre, pozorovateľov a vztiahnuté interakcie ako vedľajšie. Býci boli považovaní ako randomizovaný efekt a ďalšie faktory ako fixné.

5. Výsledky. Efekty býka boli signifikantné pre percento progresívne pohyblivých spermií okamžite po roztopení (p < 0,1) a hodinu a dve hodiny po inkubácii pri 37°C (p < 0,05). Nebol prítomný žiadny efekt koncentrácie farbiva alebo býka podľa koncentrácie farbiva na motilitu spermií v akomkoľvek inkubačnom čase. S býkmi, s ktorými sa uvažovalo ako randomizovaný efekt, 150 mW laserovej energie rezultovalo na nižšiu motilitu spermií po roztopení ako 100 mW (p < 0,05) vo všetkých troch inkubačných časoch. Bol prítomný efekt býka podľa laserovej energie (p < 0,05) na motilitu spermií v prvej, ale nie v druhej a tretej hodine. Tiež vysoká energia laseru viedla k motilite spermií ako pri kontrolách (p < 0,05) v 0 a jednej hodine inkubácie (tabuľka 5). Signifikantný efekt pozorovateľa bol v prvej hodine inkubácie, ale nie v. druhej (P < 0,1).

Tabuľka 5.

Účinok intenzity laseru a koncentrácie farbiva na motilitu spermií po roztopení (!)

Priemer hlavného účinku	Inkubácia pri 37°C
0 hod.	1 hod.	2	hod.
Kontrola	49	44	33
Koncentrácia farbiva
14 9 uM	41	39	30
224 uM	42	39	30
Intenzita laseru
100 mW	46	42	33
150 mW	38a		27
S.E.C	2,2	1,2	1,3

^aSignifikantný hlavný účinok (p < 0,1) a rozdiel oproti kontrolám (p < 0,05).

^bRozdiel oproti kontrolám (p < 0,05).

^cPolovičná štandardná chyba Vchyba priemeru štvorca ANOVA + ÝN.

6. Závery. Percento progresívnej motility spermií po roztopení je porušené farbením a procesom triedenia. Vyššia intenzita laseru je viac devastujúca ako intenzita nižšia. Nebol pozorovaný žiadny efekt koncentrácie farbiva na pohyblivosť spermií po roztopení. Teda, excitácia spermii pomocou väzby farbiva Hoechst 3342 pri nižších laserových intenzitách je menej devastujúca a farbenie spermií pri vyšších koncentráciách farbiva nemá žiadny zničujúci účinok na motilitu spermií po roztopení. Poškodenie bolo pozorované najmä v oblasti pohyblivosti spermií.

Príklad 4

Zhodnotenie procedúry pred triedením a farbením a výber extendra pre kryoprezerváciu spermií

Ciel: (1) overenie účinku troch ošetrení spermií pred triedením a (2) overenie kombinácie tekutiny puzdra a extendra pre kryoprezerváciu prietokom roztriedených spermií.

1. Zber zdrojovej vzorky. Odoberú sa spermie od 4 býkov a pripravia sa rovnako ako je opísané v príklade IA.

2. Metóda.

a) Design experimentu. Vykonal sa 3(ošetrenie pred triedením) podľa 3(extendre) podľa 2(tekutina puzdra) podľa 4(býci) podľa 2 (pozorovateľ) faktoriálny experiment na určenie najlepšej procedúry pri zachádzaní so spermiami pred triedením overenie troch extendrov pre kryoprezerváciu vybraných spermií.

b) Farbenie a príprava vzoriek: čerstvo odobraté spermie od 4 býkov boli ošetrené nasledujúcim spôsobom:

(1) Rozriedené na 400 x 10⁶/ml v modifikovanom TALP (pozri príklad 2, tabuľka 3) a farbené počas 1 hodiny pri 34°C pred objemových triedením („rozriedenie - 0 hodín);

(2) Inkubované na vyrovnanie pri 22°C počas 3 hodín pred dilúciou, zafarbené a roztriedené („úprava - 3 hodiny); alebo (3) Rozriedené a zafarbené ako „rozriedenie - 0 hodín a potom inkubované pri 22°C počas 3 hodín pred objemovým triedením („rozriedenie - 3 hodiny);

b) Extendre. Porovnávali sa nasledujúce mraziace extendre: EYC (pozri príklad 1), ktorý obsahuje 7% glycerolu, vaječný žítokTris (pozri príklad 2), ktorý obsahuje 6% glycerolu a vaječný žítok-TES-Tris (TEST), ktorý obsahuje 5% glycerolu. EYC „frakcia A” sa vzťahovala na EYC extender, ktorý neobsahoval žiadny glycerol a EYC „frakcia B” sa vzťahovala na EYC extender, ktorý obsahoval dvojnásobok finálnej, požadovanej koncentrácie glycerolu (napríklad 14%). Teda, pokial sa skombinovala frakcia EYC A a EYC B v rovnakom. pomere, finálny EYC extender obsahoval 7% glycerolu. Tris A a B frakcie sa označujú rovnako ako je opísané v príklade 2. TEST extender sa pripraví ako kompletný extender, ktorý obsahuje 5% glycerolu; teda nie je žiadna A ani B frakcia extendra TEST.

d) Tekutina puzdra. Tekutina puzdra bola alebo 98,6 mM dihydrát citrátu sodného (#S279—3, Fisher Scientific, Fair Lawn NJ), alebo tris, ako je opísané v príklade 2. Obidva typy tekutiny puzdra boli adjustované na pH 6,8; osmolälita bola okolo 270 - 280 mOsm/kg.

spermií, ktoré boli ďalej žítok-Tris a zmrazovacieho

Tris sa používal na odobratie umiestnené do extendra vaječný extendra TEST. Tekutina puzdra, ktorá obsahovala 6,8 mM dihydrát citrátu sodného sa používala na zber spermií, ktoré boli následne extendované v EYC zmrazovacom extendri.

e) Triedenie. Približne 58 x 10⁶ spermií bolo objemovo roztriedených pre každú kombináciu ošetrenia pred triedením tak, ako sa opisuje v príklade 2, s použitím 150 mW incidenčnej laserovej energie. Pre každé triedenie sa spermie odobrali v priebehu hodiny. Po roztriedení sa vzorky inkubovali pri 22°C počas 2 hodín, aby simulovali 3 hodinové triedenie.

f) Príprava na zmrazenie. Po inkubácii nasledovalo chladenie spermií, ako je opísané v príklade 2. Po ochladení boli vzorky centrifugované pri 5°C pri 850 x g počas 20 minút. Každá vzorka obsahovala 28 ml celkového objemu a vzorky boli zabalené do 50 ml plastikových skúmaviek. Potom, čo bol odstránený supernatant, spermie sa vrátili do chladnej miestnosti s teplotou 5°C na extenziu. Vzorky sa extendovali na 40 x 10^{5 6}/ml uložením 131 ul suspenzie spermií do 69 ul A frakcie extendra EYC, A frakcia extendra vaječný žítok-Tris alebo TEST extendra. Suspenzie boli okamžite adjustované na 20 x 10^e/ml spermií pridaním príslušného extendra, ktorý obsahoval glycerol (napríklad B frakcia extendra EYC, B frakcia extendra tris) alebo TEST. B frakcie extendrov sa pridali do zodpovedajúcich vzoriek po krokoch (2x) v 15 minútových intervaloch, ako sa opisuje v príklade 2. TEST extender sa pridal k spermiám po krokoch rovnakým spôsobom ako B frakcia EYC a Tris extendrov.

g) Ekvilibrácia a mrazenie. Kontroly a roztriedené spermie boli zabalené do 0,25 ml polyvinylchloridových brčiek ako je opísané v príklade 2, ekvilibrované na 5°C počas 3 hodín a potom zmrazené v statickej pare tekutého dusíka.

3. Posúdenie motilíty po roztopení. Posúdenie spermií po roztopení bolo vykonané tak, ako je opísané v príklade 2.

4. Štatistická analýza. Všeobecný opis štatistickej analýzy bol uvedený v príklade 2. Špecificky sa sledoval efekt ošetrenia pomocou ANOVA pre jednotlivé časy po roztopení. Hlavná os zahrnovala ošetrenie pred triedením, extendre a býka; podos pozorovateľov a asociované interakcie. Býci boli považovaní za randomizovaný efekt, ostatné faktory fixné. Celý experiment sa opakoval dvakrát. Tukey HSD test sa použil pre oddelené priemery.

5. Výsledky. Progresívna motilita spermií po roztopení bola ovplyvnená (p < 0,05) extendrom a býkmi pri každom inkubačnom čase po roztopení a procedúrou pred triedením v čase 0 hodín inkubácie (tabuľka 6). Rozdiel nebol prítomný pre rôzne tekutiny puzdra (p < 0,05). V čase inkubácie 0 hodín po roztopení, použitie 3 hodinového ošetrenia viedlo k pohyblivéjším spermiám po roztopení ako posledné 2 ošetrenia farbením pred triedením (p < 0,05; tabuľka 6). Procedúry pred triedením neboli štatisticky signifikantné na inkubáciu spermií po roztopení počas 1 a 2 hodin, ak bol býk považovaný za randomizovaný efekt. Pri týchto 2 inkubačných časoch bolo dôležité, že bol signifikantný efekt ošetrenia pred triedením podľa interakcie býka (p < 0,05). Ošetrenie pred triedením by bolo signifikantné vo ' všetkých inkubačných časoch po roztopení, pri posúdení býkov ako fixného efektu. Ihneď po roztopení (0 hodín) TEST bol najlepší extender, ale po 1 a 2 hodinách inkubácie pri 37°C bol najlepší extender Tris. Je dôležité, že nebola žiadna interakcia ošetrenia pred triedením a extendrom. Bol prítomný účinok pozorovateľov (p < 0,01) pri všetkých inkubačných časoch, ale žiadne interakcie pozorovateľ, ošetrenie. Bola interakcia býk, extender (p < 0,05) pri všetkých 3 inkubačných časoch.

Tabuľka 6.

Hlavný účinok ošetrenia pred triedením a mraziaceho extendra na motilitu spermii po roztopení (%)

Procedúra pred triedením	Inkubácia pri 37 °C
Extender	0 hod.	1 hod.	2 hod.
Rozriedenie -0 hodín	Priemer	39a	32	22
Úprava -3 hodiny	Priemer	4 3b	36	25
Rozriedenie -3 hodiny	Priemer	38a	31	19
Priemer	EYC	36a	29a	17a
Priemer	Tris		39*	29*
Priemer	TEST	44c	33a	20a
S.E.d		0,8	0,8	0,7

^a,^b,^cPriemer v stĺpcoch, v hlavných účinkoch, bez všeobecného nadpisu sa rozlišuje (p < 0,05).

^dPolovičná štandardná chyba >/chyba priemeru štvorca ANOVA + Vn.

6. Závery. Táto štúdia dokázala, že udržiavať spermie upravené počas 3 hodín pred rozriedením, farbením a triedením je lepšie, ako okamžitá dilúcia a farbenie 0 hodín alebo za 3 hodiny. Počas 3 hodín do triedenia je najlepšie pokračovať s novými podielmi originálneho ejakulátu, ktorý bol udržiavaný upravený počas 3 hodín a potom zafarbený, ako pokračovať s originálnou vzorkou spermií zafarbených a udržiavaných v koncentrácii 400 x 10⁶ spermií/ml.

Aj keď TEST extender vykazoval najvyššiu pohyblivosť spermií po roztopení v čase 0, tris bol najlepší extender, keď spermie boli vystavené inkubácii pri 37°C. Akákoľvek tekutina puzdra sa chovala rovnako pri použití všetkých extendrov. Na základe týchto výsledkov sme zaradili použitie tekutiny puzdra Tris s kombináciou extendra Tris pre mrazenie do štandardného pracovného postupu.

Príklad 5

Účinok aditív extendra na triedené spermie

Cieľ: overenie účinku pridania dodekyl sulfátu sodného („SDS) do mraziaceho extendra na prietokom vybrané spermie

A. Overenie účinku koncentrácie SDS v mraziacom extendri

1. Zber zdrojovej vzorky. Odoberú sa spermie od 6 býkov a pripravia sa rovnako, ako je opísané v príklade 1A.

2. Metóda. Spermie od každého zo 6 býkov sa extendovali na x 10⁶/ml v 20% celkovom vaječný-Tris extendri (LWET), ktorý obsahoval 0, 0,03, 0,06, 0, 09 alebo 0,12 percent SDS a boli zabalené do brčiek a zamrazené. WET extender sa pripravil s použitím 3,028 g Tris(hydroxymetyl)aminometánu, 1,78 g monohydrátu kyseliny citrónovej a 1,25 g fruktózy v 100 ml dvakrát destilovanej vody, k tomu sa pridalo 20% celého vajca (objemových %). WET extender sa pripravil na pH okolo 7,0 a obsahoval konečnú koncentráciu glycerolu okolo 6% (objemových). WET extender tiež obsahoval 1000 U1 sodnej soli penicilínu G a 100 Tg sulfátu streptomycinu/ml.

3. Výsledky. Priemery (n = 1 vzorka od každého zo 6· býkov) boli 51, 51, 50, 51 a 48% progresívne pohyblivých spermií približne 10 minút po roztopení. Na základe týchto výsledkov bola použitá 0,05 percentná SDS v príklade 5B.

B. Overenie účinku 0,06 % SDS v rôznych mraziacich extendroch na motilitu prietokom triedených spermií po roztopení.

1. Zber zdrojovej vzorky. Spermie sa odoberú od 8 býkov a pripravia rovnako, ako je opísané v príklade IA.

2. Metóda. Študovala sa motilita po roztopení v spermiách mrazených vo vaječný žítok-Tris extedri (pozri príklad 2) a WET extendri (pozri príklad 5A) s a bez 0,06% SĎS. Konečný obsah glycerolu v obidvoch extendroch bol 6%.

a) Farbenie a príprava na triedenie, triedenie. Zafarbené vzorky spermií boli pripravené z ejakulátu od každého z 8 býkov, ako sa opisuje v príklade 2. Zafarbené spermie boli objemovo roztriedené s použitím tekutiny puzdra Tris, ako sa opisuje v príklade 2, s výnimkou toho, že triedenie sa dosahovalo s použitím energie laseru 135 mW. Vybrané spermie sa vložili do 50 ml plastikových skúmaviek, ktoré obsahovali 2 ml A frakcie mraziaceho pufra pre každý extender, 15 x 106 triedených spermií (25 ml) pre každé ošetrenie bolo odobraté a inkubované počas 1 hodiny pri 22°C, aby sa simulovalo ďalšie triedenie.

b) Príprava na mrazenie. Rozriedené spermie boli potom chladené na 5°C v priebehu 90 minút. Rovnaký obsah príslušnej frakcie B extendra sa po častiach (2x) pridal v 15 minútových intervaloch do každej 50 ml plastikovej skúmavky, ktorá obsahovala triedené spermie. Rovnaké diely s obsahom 25 ml ošetrené extendrom sa koncentrovali centrifugáciou počas 20 minút pri 850 x g v chladiacej centrifúge. Supernatant sa odstránil a zostali 600 TI pelety spermií, ktoré sa rozpustili jemným trepaním za 15 minút. Nepridával sa žiadny ďalší extender k peletám spermií, pokiaľ suspenzia peliet spermii obsahovala už glycerol. Koncentrácia spermií v suspenzii bola približne 20 x 10⁶/ml. Nefarbené, netriedené kontroly pre každého býka sa pripravili v koncentrácii 20 x 10°spermií/ml v extendri vaječný žítok-Tris, ktorý obsahoval 6% glycerol. Kontroly sa umiestnili do miestnosti 5°C chladnej, pričom prebiehalo objemové triedenie.

c) Ekvilibrácia a mrazenie. Kontroly a triedené spermie boli zabalené a zmrazené v rovnakom čase. Spermie boli zabalené do 0,25 ml polyvinylchloridových brčiek, ekvilibrované na 5°C počas 3 až 6 hodín a potom zmrazené v statickej pare tekutého dusíka.

3. Posúdenie motility po roztopení. Overenie spermií pri topení a po roztopení sa vykonávalo tak, ako je opísané v príklade 2, s výnimkou toho, že progresívna motilita sa hodnotila 0,5 a 2 hodiny po inkubácii.

4. Štatitická analýza. Všeobecný opis štatistickej analýzy bol uvedený v príklade 2. Špecificky sa sledoval efekt ošetrenia pomocou ANOVA pre jednotlivé časy inkubácie. Hlavná os zahrnovala extendre a býka, podos pozorovateľov a vztiahnuté interakcie. Rozdiel v priemeroch sa určoval najmenším signifikantým diferenčným testom.

5. Výsledky. Progresívna motilita spermii po roztopení bola ovplyvnená (p < 0,05) extendrom po 0,5 alebo 2 hodinách inkubácie po roztopení (tabuľka 7). V čase 0,5 hodiny WEA a SDS mali horšie výsledky pohyblivosti spermií ako Tris a SDS. Počas 2 hodiny všetky druhy ošetrenia pri objemovo triedených spermiách boli horšie, ako pri netriedených kontrolných spermiách. Prítomný bol signifikantný efekt býka a pozorovateľa (p < 0,01) pri obidvoch inkubačných časoch, ale žiadna interakcia pozorovateľ, ošetrenie.

Tabuľka 7.

Účinok extendra na progresívnu motilitu (%) po roztopení

Extender	Inkubácia pri 37°C
extender	0 hodín
Tris (žiadny výber)	42a	41a
Tris w/o SDS	40a,b	35b
Tris w/SDS	42a	37^
WET w/o SDS	40a'b	35b
WET w/SDS	38b	35a
S.E.C	1,0	1,2

^a'^bPriemer v stĺpcoch bez všeobecného nadpisu sa líši (p < 0,05). ^cPolovičná štandardná chyba Vchyba priemeru štvorca ANOVA + ^N.

6. Závery. Zahrnutie SDS do Tris alebo WET extendra nemá prínos pre kvalitu spermií, ktorá sa odhaduje vizuálne určením motility po roztopení. Tiež výsledky dosiahnuté s použitím WET alebo Tris extendra sú podobné, teda WET sa javí byť rovnako účinný ako Tris pri kryoprezervácii triedených bovinných spermií.

Príklad 6

Kvalita spermií oddelených podľa pohlavia pomocou prietokového triedenia pre oblasť štúdií

Cieľ: overenie kvality spermií po roztopení na základe integrity akrozómu

1. Zber zdrojovej vzorky. Odoberú sa spermie od 3 býkov a pripravia sa rovnako, ako je opísané v príklade IA.

2. Metóda. Spermie triedené a netriedené, kontrolné z rovnakého ejakulátu sa zafarbili a triedili, ako je opísané v príklade 2 okrem toho, že spermie boli triedené podía typu pohlavia na hladine čistoty 90%. Vybrané spermie sa vložili do objemu asi 20 ml a boli ochladené na 5°C v priebehu 90 minút (0,2°C/min.). Po ochladení sa pridal k triedeným spermiám rovnaký objem extendra vaječný žítok-Tris B (pozri príklad 2) v 2 rovnakých Centrifugácia a ako sa opisuje objemoch ašpirácia v 15 minútových intervaloch.

supernatantu sa

Tris, ktorý dosiahnutá v príklade pridal k spermiám obsahoval supernatantu sa vykonala

2. Po výsledná

Zmrazenie

6% glycerolu koncentrácia centrifugácii a extender vaječný (objemových) tak, spermií okolo sa vykonalo tak, ako sa ekvilibračný čas bol okolo rovnako, ašpirácii žítokaby bola x 10⁶ spermii/ml. opisuje v príklade 2 okrem toho, a roztopenie že hodín.

3. Overenie motility po roztopení. Vizuálny odhad percenta progresívne pohyblivých spermií sa vykonával pri 37° C približne 10 minút po roztopení. Integrita akrozómu spermií sa odhadovala pomocou diferenciálneho interferenčného kontrastného mikroskopu (x 1000) po 2 hodinách inkubácie pri 37°C. Spermie boli ošetrené 40mM fluoridom sodným, urobil sa vlhký náter a 100 spermií pri ošetrení sa prezrelo. Akrozómy boli klasifikované ako (a) intaktné, (b) nápuchnutý alebo poškodený akrozóm a (c) chýbajúci akrozóm (na intaktný).

4. Štatistická analýza. Analyzovaných 19 rôznych údajov mrazenia bolo bilancovaných pre 3 býkov a boli použité v oblasti štúdií. Efekty ošetrenia (triedenia oproti kontrolám) sa overovali pomocou ANOVAs s býkmi ako fixným efektom.

5. Výsledky. Percento progresívne pohyblivých spermií po roztopení bolo signifikantne vyššie (p < 0,05) pre netriedené spermie (50%) ako pre triedené spermie (46%, tabuľka 8) napriek tomu, že boli v priebehu triedenia odstránené mŕtve spermie.

Percento nelíšilo.

Triedenie akrozóm, ale tiež akrozómom . vzhľadom spermií s intaktným akrozómom sa však zvyšovalo percento spermií, ktorým chýbal znižovalo percento spermií s poškodeným spermie (p < 0,05). Bol na kontrolné signifikantný rozdiel v percente intaktných akrozómov (p <

0,05), v percente neintaktných akrozómov (p progresívnej motilite po roztopení (p < 0,01)

Efekt býka podľa triedenia pre motilitu spermií bol (p < 0,01), ale pre ostatné odpovede nie.

< 0,01) a medzi býkmi.

po roztopení

Pre býkov A a B rozdiel pre motilitu spermií po roztopení medzi triedenými a netriedenými spermiami bol temer 0; pre býka C triedené spermie boli 10 percentných bodov nižšie (19%) v motilite ako kontrolné spermie.

Tabuľka 8.

Účinok triedenia na motilitu (%) po roztopení a stav akrozómu

	Stav akrozómu
Intaktný	Zničený	Poškodený	Motilita po roztopení
Kontrolné	64a	20a	15a	50a
Triedené	65a	14a	21a	.4 6b

^aPriemer v stĺpcoch, bez všeobecného nadpisu sa líši (p < 0,05).

6. Závery. Vizuálny odhad progresívnej motility pre triedené, mrazené spermie bol v priemere nižší (4 percentné body; 8%), ako pre kontrolné spermie, aj keď tento rozdiel bol väčší u jednotlivého býka. Tieto vyšetrenia sa vykonávali približne 10 minút po roztopení. Malý priemerný rozdiel je konzistentný s tým, čo bolo zistené,pre neintaktné akrozómy po 2 hodinách inkubácie. Spermie s poškodenými alebo chýbajúcimi akrozómami sa stávajú skôr nepohyblivými. Zvýšené percento spermii s neintaktným akrozómom pre triedené vzorky znamená poškodenie spojené s triedením kryoprezervácie pred alebo po aktuálnom triedení. Predpokladajme, že triedenie zmení poškodený akrozóm na chýbajúci. Na základe štandardných postupov na overenie kvality spermií tu nie je žiadny podklad pre predpoklad, že fertilizačný potenciál týchto prietokom triedených spermií by mal byť ťažko kompromitovaný pre väčšinu býkov.

Príklad 7

Výber podlá pohlavia a kryoprézervácia býčich spermií pomocou 20% extendra vaječný žítok-Tris

Ciel: zadanie protokolu pre kryoprezerváciu prietokom triedených spermií

1. Zber a ohodnotenie ejakulätu. Odober a priprav ejakulát ako je opísané v príklade IA. Odober ejakulát od tých býkov, ktorí majú viac ako 75% morfologicky normálnych spermií. Vizuálne odhadové percento progresívne pohyblivých spermií (ejakuláty, ktoré majú viac ako 60% sú najlepšie pre triedenie) . Pridaj antibiotiká k surovému semenu nasledujúcim spôsobom: tylozín v konečnej koncentrácii 100 ug/ml, gentamycín v konečnej koncentrácii 500 ug/ml a linko-spektín v konečnej koncentrácii 300/600 ug/ml.

2. Farbenie a príprava na triedenie. Následne po pridaní antibiotík k surovej vzorke spermií meraj čas 15-20 minút pred farbením. Vzorku zafarbi tak, ako je opísané v príklade 2.

3. Triedenie. Roztrieď obidva typy spermií, X aj Y spermie, s nastavením triediacich vstupov na 90% čistotu. Spermie roztrieď do 50 ml skúmaviek Falcon, ktoré obsahujú 2 ml 20¾ extendra vaječný žítok-Tris, frakcia A (pozri príklad 2), pokiaľ každá skúmavka neobsahuje maximálne 20 ml celkového objemu (alebo maximálne 2 hodiny na triedenie) a konečná koncentrácia roztriedených spermií je 6 x 10⁵/ml. Pamätaj, že dodatočný 20% extender vaječný žítok-Tris, frakcia A zachytávajúca kúpele sa musí dodať po triedení a pred chladením tak, že výsledná koncentrácia vaječného žĺtka je najmenej .3%.

4. Príprava na mrazenie. Následne po triedení ochlaď roztriedenú vzorku na 5°C v priebehu periódy 90 minút. Po ochladení pridaj 20% extender vaječný žítok-Tris, frakcia B (pozri príklad 2) po krokoch (2x) v 15 'minútových intervaloch. Konečný objem Tris, frakcia B extendra, ktorý sa· pridal do vzorky spermií by mal byť rovnaký ako objem Tris, frakcia A extendra. Celkový objem vzorky spermií po dodaní Tris, frakcia B extendra by nemal presiahnuť 27 ml. Potom, ako sa pridá Tris, frakcia B extendra do vzorky spermií, koncentruj vzorku centrifugáciou počas 20 minút pri 850 x g. Ašpiruj supernatant a nechaj pelety spermií asi 150 ul. Resuspenduj spermie a odober spermie od každého individuálneho býka.

5. Mrazenie. Pridaj kompletný extender vaječný žítok-Tris (6% glycerolu), aby bola dosiahnutá konečná koncentrácia spermií 20 x 10⁶/ml. Zabaľ extendované spermie do 0,25 ml polyvinylchloridových brčiek na zmrazenie, ako sa opisuje v príklade 2.

Príklad 8

Overenie fertility prietokom triedených, mrazených spermií v oblasti štúdií

Materiál a metódy

Zber bolo a spracovanie semena

Semeno od mladých býkov, u ktorých nie je známa fertilita, odobraté

Po určení pomocou arteficiálnej vagíny (pozri príklad IA). koncentrácie spermií spektrofotometrom a subjektívnym semeno bolo overením progresívnej roztriedené, spracované v príklade 2, okrem toho, že pohyblivosti spermii, ako je opísané spermie boli roztriedené podlá na úrovni

90% čistoty s použitím incidenčnej

135 do približne 150 mW.

typu pohlavia energie laseru od približne

Spracovanie a zmrazenie sa vykonalo podlá opisu v príklade 2, okrem toho, že ekvilibračný čas bol okolo 3 hodín. Extender Cornell Universal (Seidel GE Jr., Theriogenology 1255 - 1264) sa použil v oblasti štúdií 1,2 a 3 semeno. Pre mrazené semeno v štúdiách 2 a 3 bol extendrom 2,9% Na citrát + 20% vaječný žĺtok príklad 1). Pre štúdiu 4 až založenom na Tris, ktorý bol kyseliny citrónovej, 56 mM

1997; 48:

pre tekuté používaným s konečnou koncentráciou glycerolu 7% (pozri sa spermie mrazili v extendri zložený z fruktózy,

200 mM Tris, 65 mM

20% vaječného žĺtka 6% (pozri príklad 2). v prietokovej a finálnej koncentrácie glycerolu používala citrátu (pozri príklad 4)

Tekutina puzdra, ktorá sa cytometrii bola zložená z 2,9% Na pre štúdiu 1,2 a 3 a z Tris pufra pre zostávajúce štúdie (pozri príklad 2).

Spermie sa zabalili do 0,25 French brčiek v stĺpcoch tak malých, ako 50 ul, ktoré boli v strede odberovej rúrky. K minimalizácii dilúČneho efektu sa používali malé objemy tak, že bolo najmenej 10⁷ spermií/ml. Vo väčšine štúdií stĺpca extendra so spermiami sa odberové rúrky plnili tak, že najprv bola vlhká bavlnená látka, malým stĺpcom vzduchu a až spermiami. Keď boli spermie zvlhčená extendrom, nasledovaná potom podľa pohlavia triedenými zamrazené, jedna odberová rúrka z každej várky bola rozmrazená v kúpeli 35°C teplej vody počas sekúnd pre kontrolu kvality a série s progresívnou motilitou spermií po roztopení menšou ako 25%, sa vyradili. Vzorky spermií roztriedených podľa pohlavia boli sonografované a analyzované prietokovou cytometriou na určenie presnosti rozčlenenia podľa pohlavia.

Ošetrenie jalovíc a umelé oplodnenie.

Používané jalovice boli zo 6 široko rozložených výrobných jednotiek, s rôznymi spôsobmi riadenia. Rozdiely Sezónne a chovné prispievali k heterogenite experimentu (tabuľka 9). Pokiaľ bolo možné, systematicky sa menili býci a inseminátori, pri vstupe jalovíc do inseminačných zariadení.

Estrus bol synchronizovaný jedným zo 4 spôsobov (tabuľka 9): (1) 500 mg acetátu melengestrola (MGA) podávaného v krmive v 2,3 kg zrna počas 14 dní, potom nasledovala i.m. injekcia 25 mg prostaglandinu F₂a (Lutalyse, Upjohn, Kolamazoo, Ml, USA) 17, 18, 19 deň) po poslednom dni kŕmenia MGA (MGA/PG); (2) jednotlivé injekcie 25 mg prostaglandinu F₂a (PG); (3) 20 alebo 25 mg prostaglandinu F₂a podanie i.m. injekcií v 12 denných intervaloch (PG/PG) alebo (4) 50 alebo 100 Tg GnRH podané i.m. injekcií, potom nasledovalo 25 mg prostaglandinu F₂a po 7 dňoch (GnRH/PG).

Jalovice boli vyšetrené vizuálne ráno a večer, či nastúpil estrus, ale inseminácia bola vykonávaná len poobede po 16 hodine, približne alebo 1 deň po nástupe estrusu. Inseminácia sa vykonávala alebo rutinným spôsobom do maternicového tela, alebo polovica do rohu utero s použitím atraumatického transferového sheata (IMV, Minneapolis, MN, USA) . V druhom prípade bolo semeno umiestnené tak, že minulo veľkú kurvatúru rohu utero a bolo umiestnené čo najviac dopredu ako bolo možné bez traumy rovnako, ako sa vykonáva nechirurgický transfer embryí. Vo väčšine prípadov bolo semeno umiestnené medzi prednú tretinu a stred cornuy.

Väčšina experimentov zahrnovala kontrolovanú insemináciu mrazených spermií do tela utero s dávkou 20 alebo 40 x 10⁶ spermií/ml od rovnakého býka, ktorý sa použil na triedenie spermii podľa typu pohlavia. Tieto kontroly slúžili ako vzorka pre odhad vnútorný, normálnej fertility jalovíc ovplyvnenej špecifickými podmienkami štúdie, rovnako ako fertility použitých býkov a zručnosti inseminátorov. Niektoré štúdie zahrnovali nízko dávkované kontroly, neroztriedené podľa pohlavia. Niekedy bol počet kontrolných inseminácií plánovaný na % alebo 2/3 z počtu, ktorý sa použil pre každé ošetrenie na to, aby sa získalo viac informácií o spermiách triedených podľa pohlavia. Mrazené spermie triedené podľa pohlavia a kontroly boli rozmrazené počas 20 až 30 sekúnd v kúpeli s teplotou medzi 35 až 37°C. Rôzne ďalšie podrobnosti sú zhrnuté v tabuľke 9.

Tehotenstvo sa diagnostikovalo ultrasonograficky medzi 28 a 37 dňom po inseminácií a/alebo 56 až 92 deň po inseminácií. V tomto období bolo určené vo väčšine štúdií pohlavie, ako sa opisuje v Curran, S., Theriolgenology 1991; 36: 809 - 814 bez toho, aby vyšetrujúci vedel, aký bol spôsob inseminácie, alebo či išlo o kontroly. Pohlavie teliat, ktoré sa narodili, bolo takmer zhodné s pohlavím diagnostikovaným pri fétuse. Údaje sa analyzovali Chi kvadrátom s jedným stupňom voľnosti; 2-koncové testy sa používali, pokiaľ nebol 1- koniec. Menej ako 5% inseminácií bolo vyradených pre chybu v postupe pri inseminácií, otvorenej infekcii reprodukčného traktu, zlyhaní uzáveru cervixu atď. Rozhodnutie o vyradení zvieraťa z experimentu bolo vždy vykonané krátko po inseminácií, nebolo nikdy založené na diagnóze tehotenstva.

Tabuľka 9.

Procedurálne detaily z oblasti štúdií

Štúdie	Dátum inseminácie	Chov jalovíc	Použití býci	Inseminátor	Synchronizácia estrusu	Komentár
1	5/20-23 1997	Angus	Nl, N2, AN4	A, B	MGA/PG	Vr.nízko dávkovaných kontrol
2	2/18-5/22, 1998	Angusprenesene	N3, N4, N5, N6	C, D	PG/PG	Nízko dávkované, ale nie normálne kontroly, niektoré jalovice tehotné , a niektoré potratili pri synchronizácii
3	6/2-6/5, 1998	Angus	AN4,AN5, N7,N8,	B, D	MGA/PG
4	2/10-13, 1999	Holstein	J2, J4	C, D	PG	Veími tažké blato, sneh, vietor, zima,dážď
5	2/24-26, 1999	Holstein	J2, J4, J5	C, B, D	PG/PG
6	4/14-16, 1999	Holstein	J2, J3, J4, J5	C, D	PG	Niektoré jalovice boli reprodukčné
7	4/27-5/1, 1999	Holstein Angus prenesene	ANI, AN4	C	MGA/PG	Semeno od jedného bý -ka bolo dopravené 6 hodín pred triedením pre zlépočasie
8	4/21-23, 1999	Angus prenesene	Hl, H2	E	MGA/PG	Jalovice veľmi kŕmené
9	5/5-8, 1999	Červený Angus	AR1,AR2	C, F	MGA/PG
10	5/31-6/2, 1999	Angus	AN4,AN7, AN8	B, D	GnRH/PG
11	7/28-30, 1999	Holstein	H2, H3	C, D	PG/PG	Prvá replikácia dostupná v oveľa väčšej štúdii

Výsledky a diskusia

Prezentované údaje sú z 11 po sebe idúcich, heterogénnych štúdií, ktoré vyplývali z logických aspektov týchto štúdií, ako je nutnosť mať výber býkov pre genetické potreby stáda, nedostupnosť informácií o fertilite býkov, limitovaný počet jalovíc, nedostupnosť rovnakých inseminátorov v priebehu všetkých štúdií, nevyhovujúce počasie, limitované množstvo podľa pohlavia vybraného semena v skorých štúdiách, 2 sady jalovíc, v ktorých niektoré otehotneli až do 55 dní od synchronizácie estrusu, atď. Až 4 býci a 3 inseminátori boli zahrnutí do každej štúdie; to umožňovalo vzorkovať populáciu na overenie výsledkov, aplikovaných na viac ako jedného býka alebo technika; boli však produkované insuficiétne údaje na to, aby bola overená rozdielnosť medzi jednotlivými býkmi vo fertilite.

Väčšina sád jalovíc bola z laboratória od 140 do

250 km.

chovných stád, vzdialených

Nebol signifikantný rozdiel od v podiele tehotenstva medzi jednotlivými inseminátormi v akejkoľvek štúdii, ale počet chovov na inseminátora bol nízky a rozdiely by možno boli znateľné pri väčšom počte inseminátorov.

Metódy synchronizácie estrusu sa neporovnávali medzi štúdiami, nebolo teda možné posúdiť pomer tehotenstva medzi týmito metódami. Podiel tehotenstva sa javil byť dostatočný pre všetky použité synchronizačné postupy.

Pretože sa inseminácia vykonávala raz denne, jalovice, ktoré boli v estruse večer, boli oplodnené približne 24 hodín potom, čo bol estrus detekovaný. Podiel tehotenstva týchto jalovíc pomocou spermií triedených podľa pohlavia bol vo všetkých štúdiách 203/414 (49%) a toto sa signifikantne nelíšilo (p < 0,1) od tých jalovíc, ktoré boli inseminované pol dňa po detekcii estrusu 266/586 (45,4%). Táto tendencia pre vyšší podiel tehotenstva pri oddialení inseminácie je v súlade s nálezmi ďalších výskumov, a je teda preferované vykonávať insemináciu neskôr, ako je normálne doporučované pri nízko fertilných býkoch, keď sa používajú nízke počty spermií, alebo keď podmienky sú z nejakého iného dôvodu suboptimálne.

Pomer tehotenstva podľa spôsobu ošetrenia a, pokiaľ bolo dostupné, pohlavia fétusa alebo teľaťa, sú prezentované v tabuľke 10 až 20. Cieľom bolo získať samičie pohlavie, okrem štúdie 8; výsledok bol presne na 95%, 83%, 90%, 83% a 94% v zodpovedajúcej štúdii 1,3,8,9,10 a 11. . V zostávajúcich štúdiách nebolo' pohlavie fétusa alebo pri. narodení dostupné pre časovanie diagnostiky tehotenstva, nedostupnosti osôb, ktoré by boli znalé v rozlíšení sexu zárodkov a/alebo preto, že telatá sa ešte nenarodili. Toto nebol hlavný záujem, pretože hlavný cieľ štúdie bol, určiť fertilitu prietokom triedených spermií, podávaných v nízkej dávke.

Presnosť triedenia podľa pohlavia môže byť nastavená na ktorúkoľvek úroveň medzi 50 a 95+% podľa nastavenia parametrov triedenia. Vyššia presnosť však vedie k nižšiemu počtu spermií, roztriedených počas jednotky času, zvlášť pre Y chromozóm, ktorý nesie spermie. Presnosť 90% je postačujúca pre rutinnú prácu.

Hlavné výsledky z každej oblasti štúdie boli postupne zhrnuté. Všimnite si, že celkové počty spermií sú dané v záhlaví tabuľky; počty progresívne pohyblivých spermií boli bežne 30 -50% z týchto hodnôt. Oblasť štúdie 1 (tabuľka 10) potvrdila, že pomer tehotenstva pri spôsobe inseminácie do rohu utero a s použitím nižších počtov podľa pohlavia netriedených spermií je podobný, ako pri kontrolách s normálnymi počtami spermií. Pomer tehotenstva v 64 až 67 dni s nezmrazenými spermiami, ktoré boli roztriedené podľa pohlavia bol 12 percentných bodov pod pomerom tehotenstva, ktoré bolo docielené s tekutými kontrolnými spermiami, ktoré boli rozriedené, farbené a centrifugované rovnako, ako triedené spermie. Presnosť triedenia podľa pohlavia bola 95%; pohlavie narodených teliat s použitím podľa pohlavia triedených spermií sa presne zhodovalo s diagnózou pohlavia zárodku; bola 1 chyba pri -určení pohlavia fétusa pri kontrolách. Nebol žiadny potrat medzi 2 mesiacom gestácie a termínom a všetkých 19 teliat zo spermii triedených podľa pohlavia bolo normálnych a prežilo. Pre spermie ošetrené podľa pohlavia zodpovedajúci pomer tehotenstva pre býky Nl, N2 a N3 bol 41, 44 a 40%; 39% (13/33) jalovíc, ktoré otehotneli, bolo v estruse ráno a 50% (6/12) jalovíc bolo v estruse večer.

Tabuľka 10.

Výsledky v oblasti štúdie 1 -Angus jalovice vo Wyomingu, 1997

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 31 až 33	Počet tehotenstiev v dňoch 64 až 67	Počet samičích teliat
Triedené podľa pohlavia 5°C/ roh maternice	3 x 105	45	22 (44%)	19(42%)	18(95%)a
Kontroly 5°C/ roh maternice	3 x 105	28	15(54%)	15(54%)	5 (53%)b
Mrazené kontroly/telo maternice	40 x 106	29	16(55%)	15(52%)	11 (73%) a' b

Pomer pohlavia bez všeobecného nadpisu sa líši (p < 0,02).

Oblasť štúdie 2 (tabuľka 11) podáva prvý doklad, že výsledky so spermiami triedenými podľa pohlavia a zmrazenými sú podobné, ako tie so spermiami podľa pohlavia triedenými, ale nezmrazenými, ak je uskutočnená úprava pre počet spermií, ktoré sú zabité pri kryoprezervácii. Nebol tiež žiadny rozdiel medzi podielmi tehotenstva pri použití podľa pohlavia triedených spermií skladovaných pri 5 alebo 18°C. Podiel tehotenstva v druhom mesiaci po inseminácii podľa pohlavia triedených spermií pre jednotlivé býky kolísal medzi 22 a 42% tehotenstiev (p < 0,05). Strata embryí medzi 1 a 2 mesiacom gestácie bola podobná pre tehotenstvo podľa pohlavia triedených spermií a kontroly. Údaje od teliat boli dostupné od 39 jalovie z tejto štúdie; každá z jalovie (30 tehotenstiev pomocou podľa pohlavia triedených spermií, 9 kontrol), ktoré boli tehotné v 2 mesiaci, porodili teľa s normálnou dĺžkou gestácie.

Tabuľka 11.

Výsledky v oblasti štúdie 2 - prenesené hovädzie jalovice do

Colorada, 1998

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet j alovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 30 až 35a	Počet tehotenstiev v dňoch 59 až 92 a
Kontroly 5°C/ roh maternice	5 x 105	58	27(47%)	24(41%)
Triedené podľa pohlavia 5°C/ roh maternice	5 x 105	51 .	17(33%)	16(31%)
Triedené podľa pohlavia 18’C/ roh' maternice	5 x 105	46	16(35%)	12 (26%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/ roh maternice	1 x 106	87	29(33%)	28(32%)

^aNie je signifikantný rozdiel, x²⁷

Oblasť štúdie 3 (tabuľka 12) potvrdzuje, že použitie zmrazených, podľa pohlavia triedených spermií vedie k primeranému podielu tehotenstiev. Presnosť podľa pohlavia triedených spermii bola znova potvrdená, boli však 4 chyby pri určení pohlavia zárodku vzhľadom na pohlavie narodených teliat; uvádzané je .aktuálne pohlavie narodených teliat. Znova nebol prítomný žiadny potrat medzi 2 mesiacmi gestácie a termínom. Podiel tehotenstva priemerovaný podľa pohlavia triedených spermií, nemrazených a podľa pohlavia triedených spermií, mrazených spermií na býka N8, N8 a AN5 a AN4, bol 24, 31, 50, respektíve 60% (p < 0,1).

Tabuľka 12.

Výsledky v oblasti štúdie 3 - Angus jalovice vo Wyomingu, 1998

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 62 až 65	Počet samičích teliat
Triedené podľa pohlavia 18°C/ roh maternice	5 x 105	37	11(30%)a	10(91 %)c
Triedené podľa pohlavia mrazené/ roh maternice	1 x 106	35	18 (51%)a,b	14 (78%)c
Mrazené, kontroly/telo maternice	40 x 106	37	27 (73%)b	16(59%)d

^a,bPriemer bez všeobecného nadpisu sa líši (p < 0, 05) .

^c,dPercento samičieho pohlavia teliat z ošetrenia pomocou spermií triedených podľa pohlavia (83%) sa líši od kontrolnej skupiny.

p < 0,05, 1 - chvost, X².

Oblasť štúdií 4, 5 a 6 (tabuľky 13, 14, 15) boli uskutočnené v rovnakej lokalite s 3 rozdielnymi skupinami jalovíc. Avšak nebolo možné opakovať každú štúdiu pre rôznorodosť oblastí štúdií, ako bola riadiaca osoba, dostupnosť triedených spermií podľa pohlavia od každého býka atď. Veľmi rozdielny podiel tehotenstva medzi štúdiami 5 a 6 ilustruje, že podmienky boli v štúdiách rozdielne. Niektoré z jalovíc v štúdii 6 boli dostupné, pretože zlyhali v schopnosti otehotnieť ešte po mesiaci prirodzeného partnerstva. Pri podmienkach týchto štúdií, podiel tehotenstva bol podobný, medzi 1,5 a 3,0 x 10⁶ podľa pohlavia triedených štúdií, mrazených/v dávke. Nebola tiež výhodná inseminácia do rohu utero. Nebola žiadna signifikantná diferenciácia (p > 0,05) v podieli tehotenstiev medzi býkmi okrem štúdie 5, v ktorej bol podiel tehotenstva od J2 20/28 (71%). Bol vyšší ako pri J4 15/39 (38%) (p < 0,05). Tento rozdiel nebol konzistentný medzi jednotlivými štúdiami, pretože J4 mal numericky viac, ale nie signifikantne (p > 0,1) vyšší podiel tehotenstva ako J2 v štúdiách 4 a 6.

Tabuľka 13.

Výsledky štúdie 4 - Holstein jalovice v Colorade, 1999

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 30 až 33	Počet tehotenstiev v dňoch 64 až 67*
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	1,5 x 106	55	36 ( 65%) a' b	36 (65%)a' b
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	3 x 106	52	27 (52%)a	26 ( 50%)a
Mrazené, kontroly/telo maternice	20 x 106	55	45(82%)b	43(78%)b

^a,^bPriemer bez všeobecného nadpisu sa líši (p < 0,01).

*Šesť jalovíc tehotných v 30 až 33 týždni boli riešené pred diagnózou druhého tehotenstva; bol predpoklad, že zostávajúce sú tehotné.

Tabuľka 14.

Výsledky v oblasti štúdie 5-Holstein jalovice v Colorade, 1999

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 33 až 35a	Počet tehotenstiev v dňoch 60 až 62a
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	1,5 x 106	23	12(52%)	12(52%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	3 x 106	25	15(60%)	14(56%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	1,5 x 106	25	15(60%)	12(48%)

Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	3, 0 x 106	25	17(68%)	15(60%)
Kontroly mrazené/telo maternice	20 x 106	30	20(67%)	19(63%)

^aŽiadny signifikantný rozdiel.

Tabuľka 15.

Výsledky v oblasti štúdie 6-Holstein jalovice v Colorade, 1999

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 31 až 34	Počet tehotenstiev v dňoch 60 až 63
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	1,5 x 106	27 '	11 (41%)a	9(33%)a
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	3 x 106	.25	10(40%)a	9(36%)a
Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	1,5 x 106	24	8 ( 33%)a	7(29% )a
Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	3,0 x 106	24	10 ( 42%)a	8(33%)a
Kontroly mrazené/telo maternice	20 x 106	24	18 (75%)b	17(71%)b

^a,bPriemery bez všeobecného nadpisu sa líšia (p < 0,05).

Pre štúdiu Ί (tabuľka 16) bol z dôvodu naplánovania štúdie dostupný len 1 inseminátor. Toto bola jediná štúdia, ktorá podala presvedčivý dôkaz o inseminácii aplikovanej do rohu maternice oproti aplikácii do tela maternicového. V prípade tohto inseminátora v uvedených podmienkach štúdie bolo o 55% viac jalovíc (22 percentných bodov) tehotných pomocou spermií triedených podľa pohlavia a mrazených, pokiaľ boli inseminované do rohu maternicového a nie do tela. Skutočný rozdiel by mohol byť menší, pretože je tu široký konfidenčný interval nad týmito priemermi. Vo všetkých ostatných štúdiách (5,6,9 a 11), v ktorých je porovnávaná metóda inseminácie do tela a rohu maternicového, bol podiel tehotenstva veľmi podobný pre obidve metódy pre tohto technika rovnako ako pre ostatných technikov.

Semeno od jedného býka, používané v štúdii 7 bolo dopravené bez dilúcie z Monatany letecky v chladenom boxe pri -20°C pred triedením, dopravný čas bol ·6 hodín. Pomer tehotenstva podľa pohlavia triedených spermií od dvoch býkov bol takmer identický, 49% pre býka, kde nebola potrebná doprava semena a 52 pre býka, kde bola nutná doprava semena. Semeno nebolo pred transportom riedené pomocou extendra a nebolo chladené, pretože farbiace vlastnosti spermii pri farbení pomocou Hoechst 33’342 sa pri použití extendra po rozriedení menia. Navyše, v ďalších štúdiách (pozri príklad 4) bol dokázané, že skladovať semeno upravené pri vhodnej teplote medzi zberom a triedením pomocou prietoku je lepšie, ako ho rozriediť.

Tabuľka 16.

Výsledky v oblasti štúdie 7 - prenesené hovädzie jalovice do Colorada, 1999

Ošetreníe/miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 33 až 37
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	l,5x 106	86	34(40%)a
Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	l,5x 106	86	53 ( 62%)b
Kontroly mrazené/ telo maternice	20 x 106	35	18 (51%)a'b

^a,bPriemery bez všeobecného nadpisu sa líšia (p < 0,01).

Oblasť štúdie 8 (tabuľka 17) sa týka prekrmovaných jalovie, ktoré neboli implantované s rastovými urýchľovačmi; v čase, keď bolo diagnostikované tehotenstvo, bol uskutočnený potrat, preto údaje o teľatách nie sú k dispozícii. Tento experiment ilustruje, že účinný výber podía pohlavia môže byť vykonaný v smere samca. Podiel tehotenstiev pre obidvoch býkov bol 50 a 61%.

Tabuľka 17.

Výsledky v oblasti štúdie 8 - Angus jalovice v Nebraske, 1999

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovie	Počet tehotenstiev3 v dňoch 74 až 76	Počet samčích zárodkov
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	1,0 x 106	18	7(39%)	6(86%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	1,0 x 106	18	13(78%)	12(92%)

^aŽiadny signifikantný rozdiel.

Oblasť štúdie 9 (tabuľka 18), bola jediná štúdia, ktorá ukazovala presvedčivú výhodu pri použití 3,0, oproti 1,5 x 10⁶ podľa pohlavia triedených, mrazených spermii/v inseminačnej dávke. Táto výhoda bola zrejmá pre obidvoch inseminátorov. Podiel tehotenstiev pre podľa pohlavia triedené spermie od 2 býkov bol 62 a 75%.

Tabuľka 18.

Výsledky v oblasti štúdie 9 - Červený Angus jalovice v Nebraske, 1999

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 60 až 63a	Počet samičích zárodkov
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	1,5 x 106	15	8(53%)	7(88%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	3 x 106	14	12(86%)	9(75%)

Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	1,5 x 106	16	9(56%)	7(78%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	3 x 106	16	12(75%)	11(92%)
Kontroly mrazené/telo maternice	20 x 106	30	21(70%)	13(62%)

*3x 10⁶ podľapohlavia triedených spermii malo vyšší podiel tehotenstva (80%), ako 1,5 x 10⁶ podľa pohlavia triedených spermií (55%).

p < 0,05, 1 - chvost, X².

Podiel tehotenstva v štúdií 10 (tabuľka 19) pomocou podľa pohlavia triedených, mrazených spermií bol podobný ako pri kontrolách; presnosť roztriedenia týchto spermií podľa pohlavia bola len 82%, čo ale nie je signifikantne odlišné od cieľovej presnosti 90%. Podiel tehotenstva pre podľa pohlavia triedených spermií bol 54, 66 a 50% pre býka AN4, AN7 a AN8 (p < 0,1). Osemnásť jalovíc, ktoré boli použité pre insemináciu v tejto štúdii, boli teľatá, ktoré sa narodili ako výsledok zo štúdie 1.

Tabuľka 19.

Výsledky z oblasti štúdie 10- Angus jalovice vo Wyomingu, 1999

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 61 až 63a	Počet samičích zárodkov
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	1,0 x 106	44	26(59%)	23(85%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/ telo maternice	3 x 106	43	23(53%)	17 (74%)

Kontroly mrazené/telo maternice

20 x 106

35

20(57%)

12(57%)

^aŽiadny signifíkantný rozdiel.

Tabuľka 20.

Výsledky v oblasti štúdie 11-Holstein jalovice v Colorade,1999

Ošetrenie/ miesto	Počet spermií	Počet jalovíc	Počet tehotenstiev v dňoch 28 až 33a	Počet tehotenstiev v dňoch 28 až 33a,b
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	1,0 x 106	12	8(67%)	7(58%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/telo maternice	3 x 106	12	6(50%)	4(33%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	1,0 x 106	7	4(57%)	4(57%)
Triedené podľa pohlavia mrazené/roh maternice	3 x 106	7	4(57%)	4(57%)
Kontroly mrazené/telo maternice	20 x 106	9	4(44%)	3(33%) 1

^aŽiadny signifikantný rozdiel X².

^a'^b16 zo 17 (94%) zárodkov z ošetrenia pomocou podľa pohlavia triedených spermií bolo samičích; 2 boli príliš hlboko v telesnej dutine na určenie pohlavia pomocou ultrazvuku.

Údaje zo štúdií, kde ošetrenie bolo rovnaké okrem 2 x 10 a

1,5 x 10⁶dávka spermií, boli kombinované.

Tabuľka 21.

Metá - súhrn z kombinovaných štúdií s mrazeným, podľa pohlavia triedeným semenom a mrazenými kontrolami.

Kombinácia		Počet spermií/	Počet	Počet teho-
štúdií		miesto	jalovíc	tenstiev
5,	6, 9, 11		l,0-l,5x 106/telo	77	36(47%)
			3xl06/telo	76	38(50%)
			1,0-1,5xl06/roh	72	32(44%)
			3xl06/roh	72	39(54%)
			20x106/telo, kontroly	93·	61(66%)
4,	5, 6,	9,	1,0-1,5xl06/telo	176	98(56%)
10,	11		3xl06/telo	171	88(51%)
			20xl06/telo, kontroly	183	124 (68%)
5,	6, 7,	9,	1,5xl06/telo	163	70(43%)
lľ			1,5xl06/roh·	158	85(54%)
			20x106/telo, kontroly	128	79(62%)

Podiel tehotenstiev v experimentoch pomocou podľa pohlavia triedených spermií bol všeobecne 70-90% toho, ako pomocou kontrol bez triedenia pohlavia so 7 až 20 násobným množstvom spermií. Táto diferencia bola menšia v neskorších štúdiách, čo možno odráža zlepšenie výberu podľa pohlavia a procedúry prípravy spermií.

V niektorých štúdiách boli jalovice vyšetrované na tehotenstvo pomocou ultrazvuku v obidvoch, 1 a 2 mesiaci po inseminácii. Strata tehotenstva v tomto intervale bola rovnaká (p < 0%, 1) pre spermie podľa pohlavia triedené (23/261; 8,8%) versus kontroly (9/145; 6,2%), čo je jeden z parametrov, ktorý ukazuje, že genetické poškodenie je minimálne. Informácie o telatách sa získali len od niekoľkých tehotných jalovíc, pretože väčšina dobytka z predchádzajúcich štúdií bola predaná a tie z posledných štúdií sa ešte nenarodili. Populácia teliat produkovaných k dátumu, kým sa objavili podľa pohlavia triedené spermie sa nezdala byť odlišná od populácie kontrolnej.

Priemyselná využiteľnosť

Pomer pohlavia dobytka môže byť zmenený až na 90% zastúpenia určitého pohlavia pomocou triedených spermii na základe obsahu DNA pomocou prietokovej cytometrie/triediča buniek, po ktorom nasleduje kryoprezervácia a relatívne rutinná inseminácia. Tel’atá, ktoré sa narodia zo spermií triedených podľa pohlavia, sa javia byť normálne. Pre väčšinu býkov v týchto štúdiách sa podiel úspešných tehotenstiev, dosiahnutých pomocou zmrazených, podľa pohlavia triedených spermií v množstve 1,0 až 1,5 x 10⁶ pohyboval medzi 70 až 90% toho, čo je dosahované s netriedenými kontrolami mrazených spermií v množstve 20 až 40 x 10⁶, ktoré sú používané na konvenčnú insemináciu. Tieto výsledky sa aplikujú na dobré chovy jalovíc, ošetrené dobre trénovaným inseminátorom, s použitím semena, vyrobeného vlastným malá výhoda vykonávať insemináciu do spracovaním. Môže byť obidvoch rohov utero v porovnaní so spôsobom inseminácie štandardne, do tela maternice. Je potrebné diskutovať o podľa referencií špecifických prezentovanom metód a materiálov. Je vynáleze potrebné rozumieť, že diskusia týchto špecifických metód a materiálov v žiadnom prípade nedáva akékoľvek limity v zmysle prezentovaného vynálezu, ktorý sa rozširuje na akékoľvek a na všetky alternatívne materiály a metódy, ktoré sú vhodné na uskutočnenie záverov prezentovaného vynálezu.

Všetky opísané patenty a publikácie sú včlenené podľa referencii v ich úplnosti.

Claims (1)

1. Patentové nároky

   1. t Metóda kryoprezervácie spermií, v y ý m, že zahrnuje: z n a čuj úca sa a) získanie vybranej vzorky spermií; - b) chladenie uvedenej vzorky spermií; c) izolovanie spermií z uvedenej vzorky na vytvorenie izolovaných spermií; d) pridanie finálneho extendra do uvedenej vzorky spermií na vytvorenie suspenzie spermií; e) mrazenie uvedenej suspenzie spermií. 2. Metóda podlá nároku l,vyznaču j ú c a sa tým, že

   vybraná vzorka spermii obsahuje časť spermií prítomných v zdrojovej vzorke, tú časť spermií vybranú podlá vlastností a kde koncentrácia selektovaných spermií vo vzorké je nižšia ako v zdrojovej vzorke.

   3. Metóda podľa nároku 1,vyznačuj úca s a t ý m, že vybraná vzorka spermií obsahuje vybrané spermie podľa pohlavia. 4. Metóda podľa nároku 1,vyznačuj úca s a t ý m, že vybraná vzorka spermií zahrnuje spermie cicavcov. 5. Metóda podľa nároku 4,vyznačuj úca s a t ý m, že vybraná vzorka spermií zahrnuje spermie bovinné. 6. Metóda podľa nároku 4,vyznačuj úca s a t ý m, že vybraná vzorka spermií zahrnuje spermie konské. 7. Metóda podľa nároku 4,vyznačuj úca s a t ý m, že vybraná vzorka spermií zahrnuje spermie prasiat. 8. Metóda podľa nároku 1,vyznačuj úca s a t ý m, že

   vybraná vzorka spermií zahrnuje spermie vybrané metódou, zo skupiny metód zahrnujúcich prietokovú cytometriu, magnetické techniky, stĺpcové techniky, gravimetrické techniky, biochemické techniky, techniku založenú na motilite spermií, techniku založenú na elektrických vlastnostiach spermií a ich kombinácii.

   9. Metóda podľa nároku 8,vyznačujúca sa tým, že vzorka spermií bola vybraná pomocou prietokovej cytometrie.

   10. Metóda podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že chladenie sa vykonáva znižovaním teploty vzoriek vybraných spermií na 5°C.

   11. Metóda podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že chladenie sa vykonáva v priebehu približne 60 až 240 minút.

   12. Metóda podľa nároku l,v yznačujúca sa tým, že finálny extender pridávaný do uvedenej vzorky vybraných spermií obsahuje, pri doplnení do kryoprotektantu jednu alebo viac, z nasledujúcich časti; komponent, ktorý udržuje osmolalitu a pufruje pH, anorganickú zlúčeninu, ktorá znižuje chladový šok a udržiava fertilitu spermií, zdroj energie, zlúčeninu, ktorá facilituje kapacitami spermií a antibiotikum.

   13. Metóda podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedený kryoprotektant je vybraný zo skupiny, zloženej z disacharidov, trisacharidov a akejkoľvek ich kombinácie.

   14. Metóda podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedený kryoprotektant je vybraný zo skupiny, zloženej z glycerolu, dimetyl sulfoxidu, etylén glycerolu, propylén glycerolu a akejkoľvek ich kombinácie.

   15. Metóda podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedený komponent, ktorý udržiava osmolalitu a pufruje pH je vybraný zo skupiny, zloženej z pufrov obsahujúcich soli, z pufrov obsahujúcich karbohydrát a niektoré ich kombinácie.

   16. Metóda podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedený komponent, ktorý udržuje osmolalitu a pufruje pH je vybraný zo skupiny zloženej z citrátu sodného, tris(hydroxymetyl)aminometánu, N-tris(hydroxymetyl)mety1-2-aminometánsulfonovej kyseliny, glutamátu monosodného, mlieka, pufrovacieho média HEPES a niektoré ich kombinácie.

   17. Metóda podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedený organický komponent je vybraný zo skupiny, ktorá sa skladá z vaječného žĺtka, výtažku z vaječného žĺtka, mlieka, výťažku z mlieka, kaseínu, albumínu, lecitínu a niektoré ich kombinácie.

   18. Metóda podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedený zdroj energie je monosacharid, vybraný zo skupiny zahrnujúcej glukózu, fruktózu, manózu a niektorú ich kombináciu.

   19. Metóda podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedené antibiotikum je vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje tylozín, linkômycín, linko-spektín, spektinomycin, penicilín, streptomycín a niektorú ich kombináciu.

   20. Metóda podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že po pridaní finálneho extendra vzorka spermií, resp. suspenzia spermii, obsahuje glycerol, citrát sodný, tris(hydroxymetyl)aminometán, vaječný žĺtok, fruktózu a jedno alebo viac antibiotík.

   21. Metóda podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že po pridaní finálneho extendra vzorka spermií a resp. suspenzia spermií obsahuje glycerol, citrát sodný, vaječný žĺtok a jedno alebo viac antibiotík.

   22. Metóda podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že po pridaní finálneho extendra vzorka spermií obsahuje glycerol., vaječný žĺtok, mlieko, fruktózu a jedno alebo viac antibiotík.

   23. Metóda podľa nároku 1, vyznačuj úca sa t ý m, že uvedený extender má pH v rozmedzí okolo 6 ,5 až 7,5. 24. Metóda podľa nároku 1, vyznačuj úca sa t ý m, že sa spermie izolujú z uvedenej vzorky vybraných spermií

   pomocou centrifugácie.

   25. Metóda podľa nároku 24, vyznač ujúca sa t ý m, že centrifugácia umožňuj e návratnosť spermií najmenej 50%, až 90%. 26. Metóda podľa nároku 1, vyznač ujúca sa t ý m, že koncentrácia spermií v suspenzii pred mrazením je od

   približne 1 x 10⁶/ml až do 300 x 10⁶/ml.

   27. Vzorka vybraných mrazených spermii, vyznačuj úca sa t ý m, že zahrnuje časť spermií prítomných v zdrojovej vzorke a časť spermii je vybraná podľa vlastností.

   28. Vzorka vybraných mrazených spermií podľa nároku 27, v y znač u j ú c a s a tým, že vzorka vybraných mrazených spe rmii obsahuje vybrané spermie podľa pohlavia. 29. Vzorka vybraných mrazených spermií podľa nároku 27, v y znač u j ú c a sa tým, že vzorka vybraných

   mrazených spermií obsahuje spermie cicavcov.

   30. Vzorka vybraných mrazených spermií podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že vzorka vybraných mrazených spermií obsahuje spermie bovinné.

   31. Vzorka vybraných mrazených spermií podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že vzorka vybraných mrazených spermií obsahuje spermie konské.

   32. Vzorka vybraných mrazených spermií podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že vzorka vybraných mrazených spermií obsahuje spermie prasiat.

   33. Vzorka vybraných mrazených spermií podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že metóda používaná pre výber vzorky vybraných spermií zahrnuje techniku zo skupiny skladajúcej sa z prietokovej cytometrie, magnetickej techniky, gravimetrickej techniky, biochemickej techniky, stĺpcovej techniky, techniky založenej na motilite spermií, techniky založenej na elektrických vlastnostiach spermií a z ich kombinácie.

   34. Vzorka vybraných mrazených spermií podľa nároku 33, vyznačujúca sa tým, že vzorka vybraných mrazených spermií zahrnuje spermie, ktoré sa vybrali pomocou prietokovej cytometrie.

   35. Vzorka vybraných mrazených spermií podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že vzorka vybraných mrazených spermií sa vyrobí pomocou metódy, ktorá zahrnuje:

   a) získanie vzorky vybraných spermií;

   b) chladenie uvedenej vzorky vybraných spermii;

   c) izoláciu spermií z uvedenej vzorky vybraných produkciu izolovaných spermií;

   d) pridanie finálneho extendra do uvedených spermií na produkciu suspenzie spermií;

   e) mrazenie uvedenej suspenzie spermií.

   36. Metóda podlá nároku 27, vyznačuj úca že zahrnuje použitie vzorky vybraných mrazených umelú insemináciu alebo in vitro fertilizáciu.

   37. Metóda podlá nároku 36, vyznačuj úca že používa uvedenú vzorku vybraných mrazených umelú insemináciu s použitím nízkej dávky.