ES2237473T3 - Procedimiento de crioconservacion de celulas de esperma seleccionadas. - Google Patents
Procedimiento de crioconservacion de celulas de esperma seleccionadas.Info
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Abstract
Un método para la crioconservación de esperma que consiste en: (a) obtener una muestra de esperma; (b) añadir un extendor inicial y seleccionar esperma por citometría de flujo, realizándose dicha adición y selección en cualquier orden; (c) enfriar dicha muestra de esperma seleccionado; (d) aislar el esperma de dicha muestra de esperma seleccionado fría para producir esperma frío aislado; (e) añadir el extendor final a dicho esperma aislado frío para producir una suspensión de esperma fría; y (f) congelar dicha suspensión de esperma.
Description
Procedimiento de crioconservación de células de
esperma seleccionadas.
La presente invención se refiere a un método para
congelar esperma seleccionado para una característica en
particular, así como a una muestra de esperma seleccionada
congelada y a métodos para el uso de dicha muestra. La invención es
particularmente útil para conservar esperma de sexo
seleccionado.
Hace más de medio siglo, se introdujo la
inseminación artificial en los Estados Unidos como herramienta de
reproducción comercial para diversas especies de mamíferos. Aunque
la inseminación artificial estaba inicialmente limitada a regiones
relativamente cercanas al sitio de la recogida de esperma, los
avances en la crioconservación y almacenamiento de esperma han
facilitado una distribución y comercialización extendida de esperma
con fines de inseminación artificial o fertilización in
vitro.
Otras mejoras en las técnicas de recogida,
selección, crioconservación, almacenamiento y manejo de esperma de
mamífero han potenciado la capacidad de los criaderos de producir
animales con los rasgos deseados. Por ejemplo, los avances en la
selección de esperma de mamíferos basados en ligeras diferencias en
características físicas ha hecho posible separar el esperma en
función del tipo de sexo, es decir, seleccionar células que
contienen el cromosoma X ó Y. Esta técnica permite al criador
manipular el porcentaje relativo de esperma de tipo X- o Y en una
muestra y determinar así el sexo de la progenie. La capacidad de
seleccionar esperma en función del tipo de sexo u otra
característica deseable proporciona una importante herramienta para
acelerar el progreso genético; aumentar la eficacia de producción y
conseguir una mayor flexibilidad en la gestión de ganado. Una total
explotación de esta herramienta, no obstante, depende de la
capacidad de congelar y almacenar esperma seleccionado.
Se dispone de una serie de métodos para
seleccionar células; sin embargo, la selección y el posterior
tratamiento de esperma presenta desafíos únicos ya que el esperma
no tiene la capacidad de reparar ADN y también por la morfología del
esperma. Cada esperma tiene un acrosoma que recubre la cabeza y la
cola, que son importantes para la fertilidad y que son
relativamente susceptibles de lesión física. Por otra parte, la
fertilidad de esperma disminuye cuanto mayor es el tiempo
transcurrido entre la recogida y el uso. Dado que la mayoría de los
métodos de selección de los que se dispone implican tensiones
físicas y suponen tiempo, típicamente el esperma seleccionado está
en cierto modo comprometido en comparación con células no
seleccionadas. La fertilidad se puede reducir además si la técnica
de selección implica una dilución significativa. Se ha sugerido que
este "efecto de dilución" puede deberse a la pérdida de
componentes protectores en el plasma seminal.
La citometría de flujo es un método de selección
particularmente eficaz que se ha empleado para clasificar esperma
según el tipo de sexo. Sin embargo, el esperma clasificado está
sujeto a tensiones más allá de las que se encuentran normalmente en
la inseminación artificial convencional o en los protocolos de
fertilización in vitro. En particular, la citometría de flujo
supone tiempo y, dadas las limitaciones físicas de los citómetros
de flujo, es necesario diluir el esperma para la clasificación a
niveles que no son óptimos para el almacenamiento (normalmente en
el orden de 10^{5}-10^{6}/ml). Asimismo, el
esperma clasificado destinado a inseminación artificial debe
concentrarse para que se puedan utilizar el envasado convencional y
el equipo de envío. La necesidad de una etapa de concentración
expone por tanto el esperma que ya está en cierto modo comprometido
a tensiones adicionales.
En la patente EE.UU. Nº 4.474.875 se describe un
método para controlar el sexo de la progenie de mamíferos separando
el esperma en fracciones que tienen las características sexuales
deseadas e inseminando artificialmente a la hembra para producir
una progenie del sexo deseado. El esperma se separa aplicando una
fuerza o fuerzas flotantes a una mezcla de esperma en un medio
nutriente de modo que se produzca la separación con arreglo a la
densidad del esperma. En BR 9704313 se describe un método para la
separación de esperma de mamífero según el sexo, pudiéndose
crioconservar después dicho esperma.
La congelación de esperma también reduce
invariablemente la fertilidad, la motilidad y/o viabilidad y,
aunque las técnicas para congelar esperma no seleccionado son muy
conocidas, no se ha descrito aún ninguna técnica para la
crioconservación de esperma seleccionado.
La presente invención proporciona un método para
crioconservar esperma que ha sido seleccionado para una
característica determinada. En particular, la invención proporciona
un método para la crioconservación de esperma que comprende:
(a) obtención de una muestra de esperma;
(b) adición de un extendedor inicial y selección
del esperma por citometría de flujo, realizándose dicha adición y
selección en cualquier orden;
(c) enfriado de dicha muestra de esperma
seleccionada;
(d) aislamiento del esperma de dicha muestra de
esperma fría seleccionada para producir esperma frío aislado;
(e) adición de extendedor final a dicho esperma
aislado frío para producir una suspensión fría de esperma; y
(f) congelación de dicha suspensión de
esperma.
Este método es particularmente útil para la
criconservación de esperma seleccionado a través de un método que
tiene como resultado la dilución del esperma, ya que el método
proporciona el aislamiento del esperma de una muestra de esperma
seleccionada, seguido de la adición de un extendedor final al
esperma aislado para producir una suspensión que tiene la
concentración de esperma deseada. En un modo de realización
preferible, se emplea el método para congelar esperma de sexo
seleccionado.
La presente invención proporciona también una
muestra de esperma congelado que ha sido seleccionado para una
característica en particular, como por ejemplo tipo de sexo, por
citometría de flujo. En los modos de realización preferibles, la
muestra de esperma congelado incluye esperma de mamífero, como por
ejemplo, esperma humano, bovino, equino, porcino, ovino, de alce y
de visón.
La muestra de esperma seleccionado congelado se
puede utilizar en diversas aplicaciones. En particular, se puede
descongelar la muestra y utilizar para fertilización. Por
consiguiente, la invención incluye también un método para usar la
muestra de esperma seleccionada congelada para inseminación
artificial o fertilización in vitro.
La presente invención permite la crioconservación
de esperma que ha sido seleccionado para una característica en
particular, facilitando el almacenamiento y/o envío de muestras de
esperma seleccionado a lugares distantes del lugar de recogida. La
descongelación produce esperma viable que se puede utilizar en
procedimientos como inseminación artificial ("IA") y en
fertilización in vitro ("FIV"). Este resultado fue
sorprendente dada la fragilidad del esperma sobre la que se tiene
bastante documentación. Los investigadores anteriores habían
demostrado que las tensiones asociadas con los diversos métodos de
selección o con la crioconservación tenían como resultado pérdidas
significativas en la fertilidad y/o viabilidad. Los autores de la
presente invención han demostrado, por primera vez, que los
embarazos se pueden conseguir con esperma que ha sido seleccionado
por citometría de flujo y después congelado.
La invención supone un importante avance en la
gestión de ganado, donde la selección de esperma para uso en tales
procedimientos se puede emplear para aumentar la producción de
progenie con los rasgos deseables. Por ejemplo, la selección para
obtener esperma portador de cromosoma X o Y permite el control
sobre el sexo de la progenie, lo que es ventajoso para los
productores de animales como ganado vacuno. La selección de sexo
también encuentra aplicación en la cría de animales valiosos (v.g.,
caballos de exposición o de carreras) o animales en peligro de
extinción. La capacidad para congelar esperma seleccionado, tal
como proporciona la invención, permitirá el uso extendido de dichos
métodos de selección, por ejemplo, para aumentar la eficacia de
producción de ganado, así como la calidad.
El término "acrosoma" o "capuchón
acrosómico" se refiere al capuchón que cubre la mitad anterior
de la cabeza del esperma y que contiene las enzimas necesarias para
la penetración del óvulo.
El término "tipo de sexo" se refiere al tipo
de cromosoma sexual presente en el esperma (es decir, el cromosoma
X ó Y).
El término "capacitación" se refiere a los
cambios específicos que experimenta un esperma para desarrollar la
capacidad para fertilizar los óvulos, tales como cambios
enzimáticos en la superficie del acrosoma que conducen a la
liberación de enzimas acrosómicas que facilitan la penetración del
esperma en el óvulo.
Tal como se utiliza en referencia al esperma, el
término "crioprotector" se refiere a una molécula que protege
el esperma durante un ciclo de
congelado-descongelado, promoviendo la supervivencia
y retención de la capacidad fertilizante.
El término "efecto de dilución" se refiere
al rápido descenso de la motilidad y/o viabilidad del esperma
cuando se diluye mucho.
Tal como se utiliza aquí, el término
"selección" se refiere a un método en virtud del cual se
subdivide la muestra en función de la presencia o ausencia de una
característica específica (a no ser que el contexto lo dicte de otra
forma). Así pues, una "muestra de esperma seleccionado" es una
muestra obtenida sometiendo una muestra de origen a selección para
unas características específicas. Una muestra de esperma
seleccionado se enriquece por lo tanto, en relación con la muestra
de origen, para obtener esperma que tiene la característica
específica.
El término "clasificación" se utiliza en la
presente invención para describir un método de selección que se
lleva a cabo utilizando un clasificador celular activado por
fluorescencia (FACS).
El término "extendedor" se refiere a
cualquier medio que tienda a conservar la viabilidad de esperma. El
término "extensión" se refiere a la dilución de esperma con un
extendedor.
El término "extendedor inicial" se refiere a
un medio utilizado para extender el esperma antes de la etapa de
aislamiento del método de la presente invención.
El término "extendedor final" se refiere a
un medio utilizado para extender el esperma antes de la etapa de
congelación del método de la invención.
Una "sustancia orgánica" en un extendedor
tal como se ha descrito aquí es cualquier sustancia orgánica que
tienda a reducir el impacto de frío y conserva la fertilidad del
esperma.
Una "fuente de energía" en un extendedor tal
como se ha descrito aquí es cualquier sustancia o sustrato que
pueda utilizar el esperma para el mantenimiento y/o motilidad de la
célula.
El término "osmolalidad", tal como se
utiliza aquí, es una medida de la presión osmótica de partículas de
soluto disueltas en una solución acuosa (v.g., un extendedor). Las
partículas de soluto incluyen tanto iones como moléculas no
ionizadas. La osmolalidad se expresa como la concentración de
partículas activas osmóticamente (v.g., osmoles) disueltas en 1 kg
de agua.
La primera etapa del método de crioconservación
de la invención incluye la obtención de una muestra de esperma
seleccionado previamente, así como someter la muestra de origen a
cualquier método de selección adecuado. El esperma de cualquier
especie se puede seleccionar y congelar con arreglo al método de la
invención. El método se puede llevar a cabo con esperma de animales
domesticados, sobretodo ganado, así como con esperma de animales
salvajes (v.g., especies en peligro de extinción). Preferiblemente,
la muestra de esperma seleccionada contiene esperma de mamífero. Se
prefieren en particular esperma humano, bovino, equino, porcino,
ovino, de alce y de visón.
Generalmente, la muestra de esperma seleccionada
contiene esperma normal viable. Para este fin, el eyaculado del que
se obtiene el esperma tiene típicamente al menos aproximadamente un
50%, preferiblemente al menos aproximadamente un 75% de esperma
morfológicamente normal. En estos modos de realización, generalmente
al menos aproximadamente un 40%, preferiblemente al menos
aproximadamente 60% del esperma en el eyaculado presenta una
motilidad progresiva.
La citometría de flujo es un método para separar
células de poblaciones mixtas basado en el manchado diferencial con
tintes fluorescentes o la unión a moléculas etiquetadas con
fluorescente, tales como anticuerpos o ácidos nucleicos. En la
clasificación celular activada por fluorescencia ("FACS"), se
"clasifican" las células en poblaciones diferentes basándose en
la intensidad de fluorescencia con radiación. FACS puede utilizarse
para selección de sexo del esperma ya que el cromosoma X contiene
ligeramente más ADN que el cromosoma Y. Cuando se mancha el esperma
con un tinte de unión a ADN fluorescente, el esperma que lleva
cromosoma X absorbe más tinte que el esperma que lleva cromosoma Y,
según lo cual se pueden separar las dos poblaciones por FACS. Esta
estrategia fue explicada en la patente EE.UU. Nº 4.362.246 y se
desarrolló significativamente en la patente EE.UU. Nº 5.135.759
(publicada para Johnson). La separación se ha mejorado a través del
uso de citómetros de flujo de alta velocidad, como el citómetro de
flujo MoFlo® producido por Cytomation, Inc (Ft. Collins, CO) y se
describe en las patentes EE.UU. Nº 5.150.313; 5.602.039; 5.602.349
y 5.643.796, así como en la publicación PCT Nº WO 96/12171.
El método de selección utilizado para obtener la
muestra de esperma seleccionada conserva la viabilidad de esperma.
Dada la relativa fragilidad del esperma, las técnicas de citometría
de flujo normales deberían modificarse por lo general para
clasificar el esperma. Más específicamente, la citometría de flujo
implica manchado, dilución e interrogación de células con luz.
Todas estas etapas representan tensiones que pueden reducir la
viabilidad del esperma. La sensibilidad del esperma a estas
tensiones puede variar entre una especie y otra e incluso entre un
individuo y otro de la misma especie. Dichas sensibilidades han
sido documentadas o se pueden determinar fácilmente a través de
estudios empíricos, como los descritos en los ejemplos
1-5.
Las modificaciones que mejoran la viabilidad se
describen en las publicaciones de patente ya citadas. Por ejemplo,
en la publicación PCT Nº WO 99/33956 (solicitud Nº PCT/US98/27909)
se describen procedimientos que proporcionan mejores sistemas de
protección y colectores para la clasificación de esperma. Asimismo,
los ejemplos 1 a 7, más adelante, describen procedimientos
ilustrativos para el manchado y clasificación de esperma. En el
ejemplo 3 se describe un estudio de los efectos de intensidad de
láser y concentración de tinte en la motilidad
post-descongelado de esperma congelado clasificado.
Este estudio indica que el uso de intensidades de láser más bajas
durante la clasificación pueden aumentar la motilidad
post-descongelado.
La muestra de esperma seleccionado puede contener
diversos componentes además del esperma y a menudo contendrá
componentes añadidos para proteger el esperma durante el proceso de
selección. En el caso de FACS, la muestra de esperma seleccionado
puede contener componente(s) de las soluciones utilizadas
para el manchado y la clasificación (v.g., el fluido de protección
y el tampón de atrapado).
Por otra parte, la muestra de esperma
seleccionado contiene típicamente un extendedor o un fragmento de
extendedor. Por ejemplo, se conocen agentes de extensión de "dos
etapas" que incluyen "fracción A" que carece de glicerol y
"fracción B" que contiene glicerol. En primer lugar, se añade
la fracción A, seguido de la adición de un volumen equivalente de
la fracción B. Durante la primera etapa, frecuentemente se divide
la fracción B en al menos dos partes alícuotas y se añade
sucesivamente; por ejemplo, se añade la parte alícuota de la
segunda fracción B 15 minutos después de la primera.
Si no están presentes componentes de extendedor,
típicamente se añade el extendedor o fracción de extendedor a la
muestra de esperma seleccionado antes de aislar el esperma de la
muestra. Si solamente están presente algunos componentes de
extendedor, se pueden añadir opcionalmente componentes adicionales
para que la muestra de esperma seleccionado incluya un extendedor o
fracción de extendedor completo antes de la etapa de aislamiento. En
los modos de realización ilustrativos, se clasifica por citometría
de flujo el esperma bovino con el fin de producir una muestra de
esperma seleccionado que incluya la fracción A de un extendedor
(véase ejemplos 2, 3 y 4). Si se desea, se puede añadir después la
fracción B a la muestra de esperma seleccionado antes de la etapa
de aislamiento (véase ejemplo 5). El extendedor (o fracción de
extendedor) de la etapa previa al aislamiento se denomina
"extendedor inicial" para distinguirlo del "extendedor
final" empleado para la extensión del esperma aislado antes del
congelado. Dado que la muestra de esperma seleccionado se
selecciona utilizando FACS, el extendedor inicial se puede unir al
fluido de protección empleado para la clasificación. En el ejemplo
4 se indican ejemplos de fluidos de protección unidos y
extendedores unidos.
Un extendedor adecuado para su uso en la muestra
de esperma seleccionado incluye un vehículo fisiológicamente
aceptable. El vehículo fisiológicamente aceptable es típicamente
acuoso y en los modos de realización preferibles incluye agua
desionizada. Los extendedores contienen comúnmente uno o más de los
siguientes componentes adicionales: un crioprotector, un componente
que mantiene la osmolalidad y tampona el pH, una sustancia orgánica
que previene el impacto del frío y preserva la fertilidad del
esperma, un detergente que actúa sinérgicamente con determinadas
sustancias orgánicas para aumentar la conservación del esperma, una
fuente de energía que puede utilizar fácilmente el esperma, un
antioxidante, que protege el esperma del impacto del frío, una
sustancia que facilita la capacitación del esperma y uno o más
antibióticos.
Aunque los crioprotectores útiles para la
invención no están limitados a los que actúan a través de un
mecanismo en particular, la mayoría de los crioprotectores
convencionales actúan, al menos en parte, reduciendo la
deshidratación intracelular. Específicamente, el congelado va
acompañado de un aumento de la concentración de soluto en el medio
que rodea el esperma. Este aumento de la concentración del soluto
extrae el agua desde las células, lo que aumenta la concentración
de electrolito intracelular. Entre los ejemplos de ciroprotectores
se incluyen glicerol, sulfóxido de dimetilo, etilen glicol, propilen
glicol, y similares. El crioprotector adecuado para su uso en un
extendedor determinado puede variar dependiendo de las especies de
las que se deriva el esperma. Por ejemplo, el glicerol es adecuado
para su uso en la crioconservación de esperma humano y bovino, pero
generalmente no se utiliza para la crioconservación de esperma
porcino o de conejo. Dichas preferencias son muy conocidas para
muchos espermas valiosos a nivel comercial y se pueden determinar
empíricamente para otros tipos de esperma.
El extendedor útil en la invención incluye
opcionalmente uno o más componentes que ayudan a mantener la
osmolalidad y proporcionan capacidad de tamponado. En los modos de
realización preferibles de la invención, la osmolalidad del
extendedor se aproxima a la de los fluidos fisiológicos. Más
preferiblemente, la osmolalidad del extendedor se encuentra en el
intervalo de aproximadamente 280 mOsm a aproximadamente 320 mOsm.
El pH también se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo
fisiológicamente aceptable, más preferiblemente en el intervalo de
aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5.
Las sustancias útiles para mantener la
osmolalidad y el pH dentro de estos intervalos son muy conocidas
dentro de la especialidad y se puede añadir al extendedor como un
sólido o ya en solución. Por lo tanto, se puede emplear un tampón
que contenga una sal, un hidrato de carbono o una combinación de
ellos para este fin. Entre los ejemplos específicos se incluyen
tampones de citrato sódico,
tris[hidroximetil]aminometano, y ácido
TES(N-Tris[hidroximetil]metil-2-aminoetanosulfónico),
y glutamato monosódico; leche; medio tamponado con HEPES, y
cualquier combinación de ellos. El componente empleado para ayudar
a mantener la osmolalidad y proporcionar capacidad de tamponado en
una aplicación en particular puede variar dependiendo de otros
componentes o el extendedor y, en algunos casos, en las especies de
las que se deriva el esperma. La selección de dicho componente para
su uso en la presente invención se encuentra, sin embargo, dentro
del nivel de experiencia en la técnica.
Asimismo, se pueden incluir en el extendedor una
o más sustancias orgánicas que protejan el esperma contra el
impacto del frío y ayuden a preservar la capacidad fertilizante.
Dichas sustancias son muy conocidas y a veces se describen como
"crioprotectores no penetrantes". Los especialistas en la
técnica pueden determinar fácilmente la sustancia orgánica adecuada
para cada aplicación en particular del método de crioconservación
aquí descrito. Por ejemplo, se pueden incluir en el extendedor
sustancias orgánicas que contengan constituyentes protectores (v.g.
lipoproteínas, fosfolípidos, lecitina) que según se cree reducen el
impacto del frío y el efecto de dilución. Entre las sustancias
orgánicas adecuadas se incluyen disacáridos, trisacáridos y
combinaciones de ellos. Entre los ejemplos de sustancias orgánicas
se incluyen yema de huevo, un extracto de yema de huevo, leche, un
extracto de leche, caseína, albúmina, lecitina, colesterol y
cualquier combinación de ellos.
El extendedor también puede incluir un
detergente. Se ha descrito que los detergentes iónicos alquílicos,
como dodecil sulfato sódico (SDS), actúan sinérgicamente con la
yema de huevo para mejorar la protección contra el impacto del
frío. Se pueden emplear también otros detergentes útiles en la
crioconservación de células en el extendedor, dependiendo la
selección de un detergente en particular para una aplicación
específica del nivel de especialidad en la técnica a la luz de las
instrucciones aquí facilitadas. Véase, v.g., el ejemplo 5.
Preferiblemente, el extendedor incluye una fuente
de energía que es aprovechada fácilmente por el esperma. En
ausencia de una fuente de energía, el esperma puede oxidar los
fosfolípidos intracelulares y otros componentes celulares. Así
pues, la inclusión de una fuente de energía en el extendedor protege
las reservas intracelulares y los componentes celulares. Tal como
se conoce dentro de la técnica, los azúcares, en particular
monosacáridos, proporcionan una fuente de energía conveniente, si
bien se puede emplear cualquier fuente de energía convencional en
el extendedor. Entre los ejemplos de monosacáridos útiles en el
extendedor se incluyen glucosa, fructosa y/o manosa.
Se pueden incluir opcionalmente uno o más
antioxidantes en el extendedor para proporcionar protección
adicional contra el impacto del frío. Entre los ejemplos de
antioxidantes se incluyen hidroxitolueno butilado (BHT), sus
derivados y similares. Sin embargo, se pueden emplear también otros
antioxidantes útiles en la crioconservación de células en el
extendedor, dependiendo la selección de un antioxidante en
particular para una aplicación específica del nivel de experiencia
en la técnica a la luz de las instrucciones aquí facilitadas.
El extendedor puede contener además una sustancia
que facilite la capacitación del esperma. Se conocen diversas
sustancias que facilitan la capacitación en la técnica pudiéndose
emplear cualquiera de ellos en el extendedor. Entre los ejemplos se
incluyen enzimas como alfa amilasa, beta amilasa, beta
glucuronidasa, que se pueden utilizar en combinación, si se
desea.
Finalmente, el extendedor incluye preferiblemente
un antibiótico, ya que un crecimiento de bacterias sustancial puede
amenazar la viabilidad de esperma y aumentar el riesgo de infección
en el huésped en la inseminación artificial o en los procedimientos
de fertilización in vitro. Se puede emplear también
cualquiera entre diversos antibióticos útiles en la crioconservación
de células en el extendedor. La selección de un antibiótico
adecuado depende de la especie de la que se obtiene el esperma, los
procedimientos que participan en la obtención y el manejo de la
muestra de esperma, así como los microorganismos específicos a los
que se dirige. Entre los ejemplos de antibióticos se incluyen
tilosina, gentamicina, lincomicina, espectinomicina,
linco-espectina (una combinación de lincomicina y
espectinomicina), penicilina, estreptomicina y ticarcilina, que se
pueden utilizar solos o en combinación. Sin embargo, los
especialistas en esta técnica podrán determinar fácilmente otros
antibióticos adecuados para su uso en el extendedor.
A continuación, se explican ejemplos de
extendedores con mayor detalle, así como en los ejemplos.
La concentración de esperma es típicamente
inferior en la muestra de esperma seleccionado que en la muestra de
origen y, tal como se ha indicado anteriormente, cuando se emplea
FACS, la dilución es significativa. Una clasificación típica según
el tipo de sexo puede producir una muestra que contiene esperma a 6
x 10^{5} células/ml de tampón de atrapamiento. Dado que dicha
baja concentración no es óptima para el almacenamiento (al menos
para la mayoría de las especies sometidas a ensayo), generalmente
el método de criconservación de la invención concentra la muestra
de esperma seleccionado.
La tercera etapa en el método de crioconservación
implica el enfriado de la muestra de esperma seleccionado,
típicamente, reduciendo la temperatura a una velocidad controlada.
El enfriado demasiado rápido puede causar impacto de frío, lo que
puede tener como resultado una pérdida de la integridad de la
membrana y la función celular. La severidad de los efectos del
impacto de frío varía de una especie a otra y depende de factores
como la velocidad de enfriado y el intervalo de temperatura. En
condiciones de enfriado controladas adecuadas, el esperma se puede
adaptar a los efectos térmicos. En el ejemplo 2, entre otros, se
describen las condiciones para el enfriado de esperma bovino y la
determinación de las condiciones adecuadas para el enfriado de
esperma de otras especies depende del nivel de experiencia en la
técnica.
En un modo de realización preferible de la
invención, la muestra de esperma seleccionado se enfría típicamente
a una temperatura comprendida entre aproximadamente 22ºC y
aproximadamente 5ºC y el enfriado se lleva a cabo generalmente
durante un período de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente
24 horas, preferiblemente durante un período de aproximadamente 90
minutos a aproximadamente 240 minutos, siendo sobre todo preferible
durante un período de aproximadamente 90 minutos a aproximadamente
120 minutos. El enfriado se puede llevar a cabo a través de
cualquier método conveniente, incluyendo simplemente la colocación
de la muestra de esperma seleccionado en un entorno a 5ºC.
Tras la extensión inicial de la muestra de
esperma seleccionado, se aísla esperma de la muestra utilizando un
método de aislamiento suficientemente suave que proporcione al
menos aproximadamente un 50% de recuperación de esperma, más
preferiblemente aproximadamente 75% a aproximadamente 90% de
recuperación de esperma, siendo sobre todo preferible
aproximadamente de 80% a aproximadamente 90% de recuperación de
esperma. Durante la etapa de aislamiento, el esperma enfriado
deberá mantenerse generalmente frío, es decir, a entre
aproximadamente 1 y aproximadamente 8ºC y preferiblemente próximo a
4 ó 5ºC.
Se puede utilizar cualquiera de los diversos
métodos adecuados para recuperar células de una suspensión para
aislar el esperma, incluyendo por ejemplo, filtración,
sedimentación y centrifugado. En un modo de realización preferible e
ilustrativo, la muestra de esperma seleccionado se reparte en
partes alícuotas en tubos de 50 ml en volúmenes que no exceden
aproximadamente 27 ml, preferiblemente entre aproximadamente 20 y
aproximadamente 27 ml. Se lleva a cabo el centrifugado a
aproximadamente 4ºC, a aproximadamente 850 x g, durante
aproximadamente 20 minutos. Preferiblemente, la etapa de
centrifugado proporciona al menos aproximadamente un 50% a
aproximadamente 90% de recuperación de esperma, más preferiblemente
de aproximadamente 60% a aproximadamente 90% de recuperación de
esperma, siendo sobre todo preferible de aproximadamente 70% a
aproximadamente 90% de recuperación de esperma. Tras el
aislamiento, se elimina el sobrendante y se suspende el pellet por
agitación con torbellino suavemente o aspiración repetida a 4ºC. A
continuación, se determina la concentración de esperma de manera
típica (v.g., utilizando un hemacitómetro).
Tras el aislamiento, se reparte el esperma, si se
desea, y se extiende con el extendedor final hasta una
concentración apropiada para el congelado. La concentración del
esperma tras la extensión final y antes del congelado se encuentra
preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 1 x 10^{6}
/ml a aproximadamente 300 x 10^{6} /ml, más preferiblemente
aproximadamente 10 x 10^{6}/ml a aproximadamente 50 x 10^{6}
/ml, siendo sobre todo preferible aproximadamente 10 x 10^{6} /ml
a aproximadamente 20 x 10^{6} /ml.
La descripción del extendedor inicial anterior
también se aplica al extendedor final, que puede ser igual o
diferente al extendedor inicial. En los modos de realización en
particular, la composición de la muestra de esperma extendida con
el extendedor final es sustancialmente similar (si no la misma) a la
composición de la muestra de esperma tras la adición del extendedor
inicial.
En un modo de realización preferible de la
invención, se utiliza un extendedor de yema de
huevo-Tris. Después de la adición del extendedor, la
suspensión de esperma comprende glicerol (crioprotector); ácido
cítrico y tris[hidroximetil]aminometano (tampón);
yema de huevo (sustancia orgánica); fructosa (fuente de energía),
tilosina, gentamicina y lincoespectina (antibióticos). Las
concentraciones aproximadas típicas de estos componentes tras la
adición del extendedor final al esperma aislado son:
| Glicerol: | 4-8% vol/vol |
| Ácido cítrico: | 55-75 mM |
| Tris[hidroximetil]aminometano: | 190-210 mM |
| Yema de huevo: | 5-25% vol/vol |
| Fructosa: | 45-65 mM |
| Tilosina: | 25-100 \mug/ml |
| Gentamicina: | 200-300 \mug/ml |
| Linco-espectina: | 100-400 \mug/ml* |
| * 100-400 \mug/ml lincomicina y 100-400 \mug/ml espectinomicina |
En una variante de este modo de realización
particularmente adecuado para congelar esperma bovino, las
concentraciones de estos componentes tras la adición del extendedor
final al esperma aislado son aproximadamente 6% (vol/vol) de
glicerol, aproximadamente 65 mM de ácido cítrico, aproximadamente
200 mM de Tris[hidroximetil]aminometano,
aproximadamente 20% (vol/vol) de yema de huevo, aproximadamente 56
mM de fructosa, aproximadamente 50 \mug/ml de tilosina,
aproximadamente 250 \mug/ml de gentamicina, y aproximadamente
150/300 \mug/ml de linco-espectina (es decir, 150
\mug/ml de lincomicina y 300 \mug/ml de espectinomicina) en
agua desionizada.
En un modo de realización alternativo, se emplea
un extendedor de yema de huevo-citrato. Tras la
adición del extendedor, la suspensión de esperma comprende glicerol
(crioprotector); citrato sódico (tampón), yema de huevo (sustancia
orgánica); tilosina, gentamicina y linco-espectina
(antibióticos). Las concentraciones típicas aproximadas de estos
componentes tras la adición del extendedor final del esperma
aislado son:
| Glicerol: | 4-8% vol/vol |
| Citrato sódico: | 60-80 mM |
| Yema de huevo: | 5-25% vol/vol |
| Tilosina: | 25-100 \mug/ml |
| Gentamicina: | 200-300 \mug/ml |
| Linco-espectina: | 100-400 \mug/ml* |
| * 100-400 \mug/ml lincomicina y 100-400 \mug/ml espectinomicina |
A modo de ejemplo, las concentraciones
preferibles para congelar esperma bovino son aproximadamente 7%
(vol/vol) de glicerol, aproximadamente 72 mM de citrato sódico,
aproximadamente 20% (vol/vol) de yema de huevo, aproximadamente 50
\mug/ml de tilosina, aproximadamente 250 \mug/ml de gentamicina
y aproximadamente 250/300 \mug/ml de lincoespectina.
En otro modo de realización alternativo, se
emplea un extendedor de yema de
huevo-TES-Tris
("EY-TEST"). Tras la adición del extendedor, la
suspensión de esperma comprende glicerol (crioprotector), yema de
huevo y leche calentada, v.g., leche homogeneizada que contiene
1,25% de fructosa con 10% de glicerol (sustancias orgánicas),
tilosina, gentamicina y lincoespectina (antibióticos). Las
concentraciones aproximadas típicas de estos componentes tras la
adición del extendedor final al esperma aislado son:
| Glicerol: | 3-7% vol/vol |
| Ácido Tris[hidroximetil-metil]-2-aminoetanosulfónico | 140-170 mM |
| Tris[hidroximetil]aminometano; | 60-80 mM |
| Yema de huevo: | 5-25% vol/vol |
| Fructosa: | 5-12 mM |
| Tilosina: | 50-150 \mug/ml |
| Gentamicina: | 400-600 \mug/ml |
| Linco-espectina: | 200-700 \mug/ml* |
| * 200-700 \mug/ml lincomicina y 200-700 \mug/ml espectinomicina |
A modo de ejemplo, las concentraciones
preferibles para congelar esperma bovino son aproximadamente 5%
(vol/vol) de glicerol, aproximadamente 158 mM ácido
Tris[hidroximetil-metil]-2-aminoetanosulfónico,
aproximadamente 72 mM de
Tris[hidroximetil]aminometano, aproximadamente 20%
(vol/vol) de yema de huevo, aproximadamente 8 mM de fructosa,
aproximadamente 100 \mug/ml de tilosina, aproximadamente 500
\mug/ml de gentamicina y aproximadamente 300/600 \mug/ml de
linco-espectina.
En otro modo de realización más alternativo de la
presente invención, se emplea un extendedor de leche. Tras la
adición del extendedor, la suspensión de esperma comprende glicerol
(crioprotector), leche homogeneizada calentada (sustancia
orgánica); fructosa (fuente de energía); y tilosina, gentamicina y
linco-espectina (antibióticos). Las concentraciones
típicas aproximadas de estos componentes tras la adición del
extendedor final al esperma aislado son:
| Leche homogeneizada: | 90% (vol/vol) |
| Glicerol: | 3-7% (vol/vol) |
| Fructosa: | 1,25% (peso/vol) |
| Tilosina: | 50 \mug/ml |
| Gentamicina: | 250 \mug/ml |
| Linco-espectina: | 250/300 \mug/ml* |
| * 250-300 \mug/ml lincomicina y 250-300 \mug/ml espectinomicina |
A modo de ejemplo, las concentraciones
preferibles para congelar esperma bovino son aproximadamente 90% de
leche, aproximadamente 10% (vol/vol) de glicerol, aproximadamente
1,25% de fructosa (peso/vol?), aproximadamente 50 \mug/ml de
tilosina, aproximadamente 250 \mug/ml de gentamicina y
aproximadamente 250 /300 \mug/ml de
linco-espectina.
Se pueden emplear otros extendedores utilizados
de manera convencional como extendedores finales para congelar
esperma seleccionado. Se han descrito diversos extendedores
optimizados para su uso en la congelación de esperma de diversas
especies, siendo muchos de ellos comerciales. Los extendedores para
congelado para esperma equino consisten típicamente en leche, yema
de huevo, diversos azúcares, electrolitos y crioprotectores. En
Squires, EL., y cols., Cooled and Frozen Stallion Semen Animal
Reprod. and Biotechnology Laboratory Bulletin Nº 69, capítulo
8, "Seminal Extenders" pp. 49-51 (julio de
1999) se describen ejemplos de extendedores de congelación.
La extensión de la muestra de esperma produce una
suspensión de esperma que se transfiere después a contenedores para
congelado. Si se pretende utilizar el esperma para fertilización,
se reparten en partes alícuotas convenientemente las células en
dosis individuales suficientes para conseguir la fertilización. La
dosis requerida puede variar sustancialmente de una especie a otra y
o bien es muy conocida (v.g., para ganado y caballos) o bien se
puede determinar fácilmente. En el caso de esperma bovino
seleccionado según sexo, las dosis convenientes oscilan entre
aproximadamente 1,0 x 10^{6} esperma y aproximadamente 3,0 x
10^{6} esperma.
Se puede emplear cualquier contenedor adecuado
para el congelado, incluyendo por ejemplo una ampolla, un vial y
una paja. El esperma destinado a IA se congela típicamente en pajas
(v.g., pajas de 0,25 ml o 0,50 ml) diseñadas para su uso con una
pistola de inseminación. Preferiblemente, se introduce en la paja un
bolo de extendedor seguido, sucesivamente por aire, esperma, aire y
extendedor de manera que el esperma queda flanqueado en cada lado
por un espacio de aire, que separa el esperma del bolo de
extendedor en cada extremo de la paja.
Antes del congelado, se deja equilibrar el
esperma a aproximadamente 5ºC. Preferiblemente, se deja equilibrar
el esperma durante un período comprendido entre aproximadamente 1
hora y aproximadamente 18 horas, más preferiblemente entre
aproximadamente 3 horas y aproximadamente 18 horas siendo sobre todo
preferible entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 6 horas
(véase ejemplo 2).
Tras el equilibrio, se puede emplear cualquier
método de congelado convencional, siempre y cuando la velocidad de
congelado no sea demasiado rápida (es decir, que no exceda
aproximadamente 0,5ºC/minuto). Preferiblemente, la velocidad de
congelado es aproximadamente 0,5ºC/minuto. A modo de ejemplo, en un
modo de realización preferible, el esperma se coloca en vapor de
nitrógeno líquido estático y se lleva a cabo el congelado en tres
etapas diferentes a lo largo de un período de aproximadamente 10
minutos. En la primera etapa de congelado, se enfría el esperma de
aproximadamente 5ºC a aproximadamente -15ºC a una velocidad de
aproximadamente 40ºC/minuto a aproximadamente 65ºC/minuto. En la
segunda etapa de congelado, se enfría el esperma a entre
aproximadamente -15ºC y aproximadamente -60ºC a una velocidad de
aproximadamente 25ºC/minuto a aproximadamente 35ºC/minuto. En la
tercera etapa, se sumerge en nitrógeno líquido a aproximadamente
-100ºC.
Además de un método de congelado, la invención
proporciona una muestra de esperma congelada que incluye esperma
seleccionado de una muestra de origen para una característica
particular por citometría de flujo. El esperma puede ser de
cualquier especie, incluyendo las que se han explicado anteriormente
en relación con el método de congelado. La invención abarca esperma
congelado seleccionado para una característica a través de un
método adecuado, como por ejemplo los antes descritos. Entre los
modos de realización preferibles se incluyen esperma seleccionado
según el sexo congelado, humano bovino, equino, porcino, ovino, de
alce y de visón. La selección de sexo se realiza preferiblemente
utilizando citometría de flujo, tal como se ha descrito de forma
general anteriormente.
También dentro del marco de la descripción, se
incluye un contenedor que contiene una muestra de esperma congelada
según la invención. El contenedor puede estar formado de cualquier
material que no reaccione con la muestra de esperma congelada y
puede tener cualquier forma u otra característica que facilite el
uso de la muestra para la aplicación pretendida. Para las muestras
destinadas para su uso para IA, por ejemplo, el contenedor es
convenientemente una paja (v.g., una paja de 0,25 ml a 0,5 ml)
diseñado para su uso con una pistola de inseminación. Se sella el
contenedor de una forma que sea adecuada para conservar la muestra
a una temperatura de almacenamiento pretendida, que es típicamente
por debajo de -80ºC. Las pajas de 0,25 ml pueden sellarse, por
ejemplo, con polvo PVC, ultrasónicamente, o con un tapón de
algodón-polivinilo y/o una bola de acero inoxidable
(BB).
Dado que la muestra de esperma congelado de la
invención se descongela típicamente antes de su uso, la descripción
proporciona también una muestra de esperma seleccionado,
previamente congelada, descongelada y un contenedor que incluye
dicha muestra descongelada.
La muestra de esperma seleccionado congelado de
la invención es adecuada para su uso en cualquiera de los métodos
en los que se utiliza el esperma. La muestra se puede descongelar y
utilizar en cualquier método de fertilización convencional como
inseminación artificial o fertilización in vitro. El
descongelado se lleva a cabo de la misma manera que el esperma no
seleccionado congelado. Brevemente, se sumerge la paja que contiene
el esperma congelado en un baño de agua mantenido a una temperatura
de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 37ºC durante un período
de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 segundos. Después del
descongelado, el depósito de semen (es decir, inseminación) se lleva
a cabo con arreglo a los procedimientos convencionales, teniendo
cuidado de proteger el esperma de las fluctuaciones del
entorno.
Objetivo: determinar el efecto de la
concentración de esperma en la motilidad de esperma para esperma
diluido no congelado, no clasificado pero muy diluido.
1. Recogida de muestra de origen. Se
recogió esperma de toros siguiendo un plan de recogida de rutina
utilizando una vagina artificial tal como se describe en Schenk, J.
Proc. 17th NAAB, p. 48.58 (1998), y Saack RG, Proc NAAB Tech Conf
AI Reprod. 41:22-27 (1972). Todos los eyaculados
utilizados contenían más de 50% de esperma progresivamente motil y
más de un 75% de esperma morfológicamente normal. Se añadieron
antibióticos al eyaculado en bruto tal como se describe en Shin S.,
Proc NAAB Tech Conf. AI Reprod. 11:33-38 (1986)
dentro de un plazo de 15 minutos desde la recogida y se determinó
la concentración de esperma utilizando un espectofotómetro.
2. Métodos. Se diluyó el esperma de 4
toros a 1,25, 2,5, 5, 10, 15 y 20 x 10^{6}/ml utilizando un
extendedor de yema de huevo-citrato (EYC) preparado
con 20% de yema de huevo (vol/vol) en 72 mM de citrato sódico, 50
Tg/ml de tilosina, 250 Tg/ml de gentamicina, y 250/300 Tg/ml de
linco-espectina. Se preparó cada muestra por
duplicado (2 tubos/dilución/toro) y constituyó un volumen total de
8 ml por tubo. Se incubaron las muestras durante 60 minutos a 22ºC,
tras lo cual se centrifugaron utilizando una centrífuga de cubo
oscilante (Eppendorf, Modelo # 5810R) a 600 x g durante 10 minutos
para concentrar el esperma. Tras el centrifugado, no se extrajo el
sobrenadante de uno de los grupos de los tubos por duplicado; se
volvió a suspender el esperma en el mismo medio y a la
concentración original por aspiración suave repetida utilizando una
pipeta serológica de 5 ml. (El segundo grupo de los tubos por
duplicado fue utilizado en el ejemplo 1B). A continuación, se
enfriaron las muestras de esperma a 5ºC a 0,2C /min durante 90
minutos. El esperma fue denominado "esperma no lavado". Se
incubaron todas las muestras a 5ºC durante 24 horas después de la
recogida.
3. Evaluación de motilidad: Tras la
incubación, se calentaron las muestras a 37ºC utilizando un
incubador de bloque seco durante 10 minutos antes de la
determinación de la motilidad. Para este experimento, se determinó
una estimación en ciego del porcentaje del esperma progresivamente
motil para cada muestra. Se determinó la motilidad de esperma
progresiva subjetivamente para cada subclase con un solo observador
(x200, microscopía de contraste de fase); otra persona preparó los
portaobjetos del microscopio al azar de manera que el observador no
conociera los tratamientos.
4. Análisis estadístico. Se analizaron los
datos por análisis de varianza (SAS Institute, Cary, North
Carolina) teniendo en cuenta los factores de los toros y la
concentración de dilución inicial. Se realizaron análisis por
separado para cada tiempo de incubación. A continuación, se
sometieron a ensayo las tendencias de dilución utilizando
contrastes lineares (log).
5. Resultados. Los datos para esperma no
lavado (tabla 1) revelaron relaciones lineales (log) (P<0,01)
para ambos tiempos de incubación. Los porcentajes de esperma motil
aumentaron a medida que aumentó la concentración de esperma de 1,25
x 10^{6}/ml a 10 x 10^{6}/ml, pero hubo poca diferencia
después. El término cúbico fue significativo (P<0,05) durante 24
horas y marginalmente significativo (P<0,1) para incubaciones de
48 horas. Hubo un efecto del factor toro (P<0,01) en ambos
tiempos.
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siguiente)
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| ^{a} (log) lineal (P<0,01) y efectos cúbicos (P<0,05). |
| ^{b} (log) lineal (P<0,01) y efectos cúbicos (P<0,1). |
| ^{c,d,e} Las medias dentro de las columnas sin superíndices comunes difieren (P<0,05). |
| ^{f}\surderror medio cuadrático de ANOVA + \surd N (SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.) |
1. Recogida de la muestra de origen. En
este experimento se utilizó el segundo grupo de tubos por duplicado
que contenían las muestras preparadas en el ejemplo 1A.
2. Métodos. Se diluyeron los espermas, se
incubaron y se concentraron por centrifugado como en el ejemplo 1A.
Tras el centrifugado, se aspiraron 7,1 ml del sobrenadante de cada
tubo eliminando la mayor parte del plasma seminal y dejando el
esperma en un pellet de 900 \mul. Se diluyó el esperma con EYC
(véase ejemplo 1A) para preparar suspensiones de esperma de 10 x
10^{6}/ml o 20 x 10^{6} /ml. A continuación, se enfriaron las
muestras a 5ºC durante 90 minutos como en el ejemplo 1A.
3. Evaluación de motilidad. Se calentaron
las muestras y se evaluaron para determinar la motilidad progresiva
como en el ejemplo 1A.
4. Análisis estadístico. Se analizaron los
datos como en el ejemplo 1A. Por otra parte, se analizaron los
datos en el ejemplo 1B para determinar la concentración de
incubación a 5ºC.
5. Resultados. Los datos para el esperma
lavado (tabla 2) no revelaron ningún efecto significativo del
tratamiento cuando se evaluó el esperma al cabo de 24 horas. Sin
embargo, tras un almacenamiento durante 48 h a 5ºC, se produjeron
efectos de los factores toro, dilución inicial, concentración de
incubación y toro por incubación (P<0,05). Permaneció más esperma
motil cuando se mantuvo a 20 x 10^{6} ml que a 10 x 10^{6} (31%
frente a 20%; P >0,05). Diluciones iniciales de 1,25, 2,5 y 5 x
10^{6} de esperma/ml tuvieron como resultado una menor motilidad
progresiva que 10 x 10^{6} esperma/ml (P<0,05) con medias del
efecto principal correspondientes de 19, 20, 27 y 37% de
esperma
motil.
motil.
| \begin{minipage}[t]{150mm} ^{a} La concentración a 20 x 10^{6} esperma/ml fue superior (P<0,05) a 10 x 10^{6} esperma/ml tras 48 horas de almacenamiento. \end{minipage} |
| También, la dilución inicial a 10 x 10^{6} fue superior a las diluciones inferiores (P<0,05). |
| \begin{minipage}[t]{150mm} errores típicos distribuidos (^{f}\surd error medio cuadrático de ANOVA + \surd N fueron 4,0 para incubaciones durante 24 h y 2,8 para incubaciones durante 48 h). \end{minipage} |
| ^{b} tendencia lineal (log) significativa (P<0,06). |
La alta dilución de esperma y el enfriado tuvo
como resultado una sustancial reducción en el porcentaje de esperma
motil, independientemente de la presencia o eliminación de plasma
seminal. No obstante, este efecto de dilución se atenuó en gran
medida al concentrar el esperma diluido a 10 x 10^{6}/ml e incluso
más a 20 x 10^{6}/ml antes del almacenamiento a 5ºC. El esperma
de algunos toros toleró la dilución mejor que el esperma de otros
toros; sin embargo, las diferencias encontradas entre los toros son
típicas. El esperma extremadamente diluido se podría comprometer
durante la clasificación, en parte, por la eliminación de los
compuestos protectores en el plasma seminal.
Objetivo: evaluar el efecto de los tiempos de
equilibrio (3, 6 y 18 h, 5ºC) antes del congelado en esperma
clasificado por citometría de flujo.
Se replicó el experimento que se expone a
continuación en su totalidad utilizando los mismos toros:
1. Recogida de muestra de origen. Se
recogió el esperma de 4 toros y se preparó tal como se describe en
el ejemplo 1A.
i) Preparación de solución de reserva de
manchado: se preparó una solución de reserva de 8,89 mM Hoechst
33342
(bis-bencimida-H-33342;
#190305, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) en agua desionizada.
ii) Procedimiento de manchado de esperma:
Se diluyó esperma en un tampón TALP modificado (tabla 3) a 400 x
10^{6} esperma/ml. Tras la dilución, se añadió tinte Hoechst
33342 a las suspensiones de esperma a una concentración de 224
\muM. Después de añadir la mancha a las suspensiones de esperma,
se incubaron las manchas durante 60 minutos a 34ºC. Tras la
incubación, se diluyó el esperma a 100 x 10^{6}/ml con TALP que
contenía 2,67% de yema de huevo clarificada y 0,002% de tinte
colorante comestible (FD&C440) que apaga la fluorescencia de
Hoechst 33342 en esperma con membranas celulares comprometidas,
permitiendo descartarlo durante el proceso de clasificación. Justo
antes de la clasificación por citometría flujo, se filtraron las
muestras por gravedad a través de un filtro de malla de nilon de 40
\mum para eliminar los restos y/o el esperma apelmazado.
b) Clasificación. Se utilizó un láser de
argón de dos líneas que operaba a 351 y 364 nm y 150 mW para
excitar el tinte Hoechst 33342. El citómetro de flujo/clasificador
celular utilizado fue un SX MoFlo® (Cytomation, Inc., Fort Collins,
CO, EE.UU.) que funcionaba a 50 psi. Se utilizó un fluido de
protección a base de Tris, que consistió en
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris; 197,0 mM;
#T-1503, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU),
monohidrato de ácido cítrico (55,4 mM; #C-7129,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU) y fructosa (47,5 mM;
#F-0127, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
EE.UU.). Se añadieron antibióticos de referencia al fluido de
protección a base de Tris que consistieron en 0,58 g/L de
penicilina y 0,05 g/L de sulfato de estreptomicina.
Se clasificó el esperma a través de un proceso
denominado "clasificación en masa" que permite una rápida
acumulación de grandes cantidades de esperma de manera que se
puedan llevar a cabo ejemplos a gran escala dentro de un período de
tiempo razonable. Se pasó el esperma a través del citómetro de flujo
en las condiciones de operación normales con la excepción de que se
recogieron todas las gotas que contenían esperma viable en un solo
tubo en lugar de clasificarlas en dos tubos en función de
características específicas (v.g., clasificación según tipo de
sexo). Se clasificó el esperma en función de la viabilidad; según
esto, se excluyó el esperma que tenía membranas de plasma
comprometidas durante la clasificación en masa.
Se mantuvo el esperma manchado a 22 \pm 1ºC
durante la clasificación. Se recogió el esperma clasificado en masa
en tubos de plástico de 50 ml que contenían 2 ml de extendedor de
yema de huevo-Tris al 20% preparado con 20% de yema
de huevo (vol/vol) en 200 mM de Tris, 65 mM de ácido cítrico, 56 mM
de fructosa, 50 Tg/ml de tilosina, 250 Tg/ml de gentamicina y
150/300 Tg/ml de linco-espectina en agua
desionizada. Se denominó el extendedor de yema de
huevo-Tris "fracción A Tris" para indicar la
falta de glicerol en este punto del procedimiento. Se recogió el
esperma en tubos para que contuvieran 12 ml y aproximadamente 6 x
10^{6} de esperma. A continuación, se incubó el esperma a 22ºC
durante 1 a 3 horas para estimular condiciones de una clasificación
en función del tipo de sexo.
c) Preparación para congelado. Tras la
incubación, se enfrió el esperma clasificado a 5ºC durante un
período de 70 minutos. Después del enfriado, se repartió el
contenido de los dos tubos y se transfirió a una centrífuga de cubo
oscilante refrigerada ajustada a 5ºC y se centrifugó a 850 x g
durante 20 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, se
continuó el proceso a 5ºC añadiendo aproximadamente 150 \mul de
extendedor fracción A Tris a aproximadamente 150 \mul de pellet
de esperma para llevar la concentración del esperma a
aproximadamente 40 x 10^{6}/ml. Se repartió el esperma de toros
individuales y se diluyó inmediatamente con un volumen equivalente
de extendedor yema de huevo-Tris que contenía 12%
(v/v) de glicerol ("fracción B Tris"). Se añadió la fracción
Tris-B a la suspensión de esperma con 2 volúmenes
equivalentes a intervalos de 15 minutos para ajustar la
concentración final de esperma en 20 x 10^{6}/ml. La
concentración de glicerol final del extendedor de yema de
huevo-Tris completa que contenía el esperma fue 6%
(v/v).
d) Equilibrio y congelado. Se envasó el
esperma extendido en pajas de policloruro de vinilo de 0,25 ml para
congelarlo según los procedimientos de rutina sobre rejillas en
vapor nitrógeno líquido estático. Se congelaron las dos pajas de
cada uno de los 4 toros tras un período de equilibrio total de 3, 6
y 18 horas a 5ºC.
3. Evaluación de motilidad tras el
descongelado. Se descongelaron las pajas en un baño de agua de
37ºC durante 30 segundos. Se prepararon estimaciones en ciego de
motilidad progresiva tras la incubación de muestras a 37ºC durante
0, 1 y 2 horas después del descongelado. Cada uno de dos
observadores estimó la motilidad de esperma progresiva de cada una
de las dos pajas de semen. Estas cuatro estimaciones en ciego para
cada unidad experimental representa un submuestreo.
4. Análisis estadístico. Estadísticamente,
se analizaron las submuestras como un subgráfico del gráfico
principal de cuadrados mínimos ANOVA para analizar los efectos del
observador y la interacción entre el observador y el tratamiento. N
se refiere al número de unidades experimentales, no submuestras; se
calcularon los errores típicos en función de la media de las 4
submuestras a partir del error medio cuadrático de ANOVA y la
cantidad de unidades experimentales; se presentan las medias de
cuadrados mínimos.
Se evaluaron los efectos de tratamiento a través
de ANOVAS independientes para cada tiempo de incubación. El modelo
incluyó toros como efecto aleatorio y tiempo de equilibrio y
observador como efectos fijos; el subgráfico consistió en las
condiciones del observador e interacciones relacionadas.
5. Resultados. Los tiempos de equilibrio
de 3 - o 6 horas fueron superiores a 18 h (tabla 4), en función del
porcentaje de esperma progresivamente motil, durante 0 a 1 h
(P<0,01) pero no 2 h de incubación post descongelado. Los
efectos del toro fueron evidentes a tiempos de incubación de 1 y 2
horas (P<0,05), pero no a 0 h. No hubo interacción significativa
(P<0,1) entre el toro y el tiempo de equilibrio ni hubo un
efecto de observador significativo para todas las respuestas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| ^{a} # H3375, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU. |
| ^{b} # US70195, fracción V; Amersham /Life Science, Cleveland, OH, EE.UU. |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| \begin{minipage}[t]{145mm} ^{a,b} dentro de las columnas, las medias sin superíndices comunes difieren (P<0,5), HSD de Tukey. \end{minipage} |
| ^{c} errores típicos distribuidos |
| \surderror medio cuadrático de ANOVA + \surdN |
6. Conclusión. Los resultados no indicaron
diferencias en la motilidad de esperma post descongelado entre 3 y
6 horas de tiempo de equilibrio total a 5ºC, pero se produjo un
descenso significativo en la motilidad de esperma tras 18 horas de
equilibrio a 5ºC antes del congelado. El intervalo de 3 a 6 horas
permite la repartición de 2 tandas de clasificación de 3 horas
consecutivas para el congelado de esperma sin disminuir la
motilidad post-descongelado.
Dado que la interacción entre el toro y tiempo de
equilibrio no fue significativa, fue adecuado un equilibrio de 3 a
6 horas, con la salvedad de que se utilizaron solamente 4 toros. Se
esperó que el tiempo de equilibrio óptimo para una minoría de toros
fuera >6 h.
Objetivo: evaluar los efectos de la concentración
de tinte Hoechst 33342 en combinación con la intensidad del láser
en el esperma clasificado por citometría flujo.
1. Recogida de la muestra de origen. Se
recogieron espermas de 6 toros y se prepararon tal como se ha
descrito en 1A.
a) Diseño experimental. Se utilizaron un
eyaculado (2 toros) y 2 eyaculados en diferentes días (4 toros) en
un diseño 2 por 2 más control.
b) Manchado y clasificación. El manchado,
la preparación para la clasificación y la clasificación del esperma
se llevaron a cabo tal como se ha descrito en el ejemplo 2, con la
excepción de que se añadió tinte Hoechst 33342 a las suspensiones
de esperma hasta una concentración final de 149 TM o 224 TM; y se
clasificaron en masa los espermas con el láser funcionando a 100 mW
o 150 mW de potencia incidente. Se recogió el esperma clasificado
en masa en tubos de plástico de 50 ml, tal como se ha descrito en
el ejemplo 2. Se recogieron cuatro tubos que contenían
aproximadamente 15 x 10^{6} de esperma total/por tubo durante 1
hora para cada toro. Se incubó el esperma clasificado durante 1 hora
a 22ºC para simular un tiempo de clasificación más largo.
c) Preparación para el congelado. Tras la
incubación, se repartió el esperma como se indica en el ejemplo 2.
A continuación, se concentró el esperma por centrifugado a 5ºC a
850 x g durante 20 minutos. Después de separar el sobrenadante, se
añadieron 150 \mul de extendedor fracción Tris-A a
cada 150 \mul de pellet de esperma a 5ºC. Se suspendieron todos
los pellet de esperma por aspiración suave y repetida y se
repartieron los espermas de toros individuales. Se añadió el
extendedor fracción B Tris por etapas, tal como se ha descrito en
el ejemplo 2. Se preparó un control no manchado y no clasificado
para cada toro a 20 x 10^{6} esperma/ml en extendedor Tris que
contenía 6% de glicerol y se enfrió a 5ºC al mismo tiempo que se
preparaba esperma clasificado en masa.
d) Equilibrio y congelado Se envasaron el
control y el esperma clasificado en pajas de policloruro de vinilo
de 0,25 ml tal como se ha descrito en el ejemplo 2, se equilibrio a
5ºC durante 3 horas y después se congeló de manera
convencional.
3. Evaluación de motilidad
post-descongelado. Se descongelaron las pajas y
se evaluaron tal como se ha descrito en el ejemplo 2.
4. Análisis estadístico. En el ejemplo 2
se proporciona una descripción general del análisis estadístico.
Específicamente, se evaluaron los efectos del tratamiento por
ANOVA. El modelo incluyó la concentración de tinte, la intensidad
de láser y los toros en el gráfico principal, un observador y las
interacciones relacionadas en el subgráfico. Los toros fueron
considerados como un efecto aleatorio y los demás factores como
fijos.
5. Resultados. Los efectos de los toros
fueron significativos para los porcentajes de esperma
progresivamente motil inmediatamente después del descongelado
(P<0,1) y tras 1 hora y 2 horas de incubación a 37ºC (P<0,05).
No hubo ningún efecto de la concentración de tinte o el toro por
concentración de tinte en la motilidad de esperma en ningún tiempo
de incubación. Considerando a los toros como un efecto aleatorio,
150 mW de potencia de láser tuvo como resultado una motilidad de
esperma post-descongelado inferior a 100 mM a 0 h de
incubación (P<0,1), pero no a otros tiempos de incubación (tabla
5). Si se consideran los toros como efectos fijos, 150 mW de
potencia tuvieron como resultado una motilidad de esperma inferior
que 100 mW (P<0,05) en los 3 tiempos de incubación. Hubo un
efecto del toro por potencia de láser (P<0,05) en la motilidad
de esperma a 1 h, pero no a las 0 h o 2 h de tiempo de incubación.
Asimismo, una mayor potencia de láser tuvo como resultado una menor
motilidad del esperma que el control (P<0,05) a las 0 h y 1 h de
tiempo de incubación (tabla 5). Hubo un efecto del observador
significativo a tiempos de incubación de 1h, pero no a 1 h o 2 h.
No hubo interacción entre el observador y el tratamiento
(P>0,1).
\newpage
Efecto. Efectos de intensidad de
láser y concentración de tinte en la motilidad
post-descongelado
(%)
| ^{a} Efecto principal significativo (P<0,1) y difiere del control (P<0,05). |
| ^{b} Difiere del control (P<0,05) |
| ^{c} error típico distribuido \surd error medio cuadrático de ANOVA + \surdN |
6. Conclusión. Los porcentajes de esperma
progresivamente motil post-descongelado fueron
disminuyendo según el proceso de manchado y clasificación. La
intensidad de láser más alta fue más dañina que la intensidad de
láser más baja No hubo ningún efecto de la concentración de tinte en
motilidad de esperma post-descongelado. Así pues,
la excitación del tinte Hoechst 33342 unido a esperma a
intensidades de láser inferiores es menos dañina y el manchado de
esperma a una concentración de tinte más alta no tuvo ningún efecto
negativo en la motilidad post-descongelado. El daño
observado fue presumiblemente para el aparato de motilidad de
esperma.
Objetivo: (1) evaluar tres tratamientos previos a
la clasificación para esperma; y (2) evaluar las combinaciones de
fluido de protección y extendedor para la crioconservación de
esperma clasificado por citometría de flujo.
Se replicó el experimento que se indica a
continuación en su totalidad:
1. Recogida de muestra de origen. Se
recogió el esperma de 4 toros y se preparó tal como se ha descrito
en el ejemplo 1A.
a) Diseño experimental. Se diseñó un
experimento factorial de 3 (tratamientos previos a la
clasificación) por 3 (agentes de extensión) por 2 (fluidos de
protección) por 4 (toros) por 2 (observadores) para determinar el
mejor procedimiento para retener el esperma antes de la
clasificación, y para evaluar tres extendedores para
crioconservación del esperma clasificado.
b) Preparación y manchado de muestra. Se
trató del siguiente modo esperma recién cogido de 4 toros del
siguiente modo:
- (1)
- se diluyó a 400 x 10^{6} /ml en TALP modificado (véase el ejemplo 2, tabla 3) y se manchó durante 1 hora a 34ºC antes de la clasificación en masa ("Diluido - 0 h");
- (2)
- Se incubó neto a 22ºC durante 3 horas antes de la dilución, se manchó y se clasificó ("neto - 3 h"); o
- (3)
- se diluyó y se manchó como "diluido 0 h" y después se incubó a 22ºC durante 3 horas antes de la clasificación en masa ("Diluido - 3 h").
c) Extendedores. Se compararon los
siguientes extendedores de congelación: EYC (véase ejemplo 1) que
contenía 7% de glicerol, yema de huevo-Tris (véase
ejemplo 2) que contenía 6% de glicerol y yema de
huevo-TES-Tris (TEST) que contenía
5% de glicerol. La "Fracción A" de EYC se refiere al extendedor
EYC que no contiene glicerol y la "fracción B" de EYC se
refiere a extendedor EYC que contiene el doble de la concentración
de glicerol deseada final (es decir, 14%). Por lo tanto, cuando se
combinan las fracciones EYC A y B en un volumen equivalente, el
extendedor de EYC final contiene 7% de glicerol. Las fracciones
Tris A y B se denominan de manera similar, y se describen el ejemplo
2. Se prepara el extendedor TEST como un extendedor completo que
contiene 5% de glicerol; por lo tanto, no hay fracciones "A" y
"B" para TEST.
d) Fluido de protección. El fluido de
protección consistió o bien en 98,6 mM de dihidrato de citrato
sódico (#S279-3, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) o
bien en Tris tal como se ha descrito en el ejemplo 2. Ambos tipos
de fluido de protección fueron ajustados a un pH 6,8; la
osmolalidad fue aproximadamente 270 a 280 mOsm/kg. Se utilizó el
fluido de protección Tris para recoger esperma que se extendió
después en extendedores para congelado de yema de
huevo-Tris y TEST. El fluido de protección que
contenía 98,6 mM de dihidrato de citrato sódico fue utilizado para
recoger esperma que se extendería después en el extendedor para
congelación EYC.
e) Clasificación. Se clasificaron en masa
aproximadamente 58 x 10^{6} de esperma para cada combinación de
tratamiento previo a la clasificación, fluido de protección y
extendedor tal como se ha descrito en el ejemplo 2 utilizando 150
mW de potencia de láser incidente. Para cada clasificación, se
recogió esperma durante aproximadamente 1 hora. Después de la
clasificación, se incubaron las muestras a 22ºC durante 2 horas
para simular una clasificación de 3 horas.
f) Preparación para congelado. Tras la
incubación, se repartió el esperma tal como se ha descrito en el
ejemplo 2. Después del enfriado, se centrifugaron las muestras a
5ºC a 850 x g durante 20 minutos. Cada muestra consistió en 28 ml
de volumen total y se introdujo en un tubo de plástico de 50 ml.
Después de eliminar el sobrenadante, se retorno
el esperma a una cámara de frío de 5ºC para extensión. Se
extendieron las muestras a 40 x 10^{6} /ml por depósito de 131
\mul de la suspensión de esperma en 69 \mul de extendedor
fracción A -EYC, yema de huevo fracción A-Tris, o
TEST. Inmediatamente después, se ajustaron las suspensiones a 20 x
10^{6} esperma/ml con la adición del extendedor que contenía
glicerol unido (es decir, EYC fracción B, Tris fracción B) o TEST.
Se añadieron los extendedores fracción B a sus muestras
correspondientes por etapas (2 x) a intervalos de 15 minutos tal
como se ha descrito en el ejemplo 2. Se añadió TEST al esperma por
etapas de la misma manera que los agentes de extensión EYC fracción
B y Tris.
g) Equilibrio y congelado. Se envasaron
los espermas en pajas de policloruro de vinilo de 0,25 ml, se
equilibraron durante 3 horas a 5ºC y después se congelaron en vapor
de nitrógeno líquido estático.
3. Evaluación de motilidad
post-descongelado. Las evaluaciones de
descongelado y el post-descongelado del esperma
fueron realizadas tal como se ha descrito en el ejemplo 2.
4. Análisis estadístico. En el ejemplo 2
se proporciona una descripción general de análisis estadístico.
Específicamente, se evaluaron los efectos del tratamiento a través
de análisis individuales de varianza para cada tiempo de incubación
post-descongelado. El gráfico principal incluyó el
tratamiento previo a la clasificación, extendedores y toros; el
subgráfico consistió en observadores e interacciones asociadas. Se
consideraron los toros como efecto aleatorio y los demás factores
como fijos. El experimento en su totalidad fue replicado dos veces.
Se utilizó el ensayo HSD de Tukey para medias separadas.
5. Resultados. La motilidad progresiva
post-descongelado de esperma clasificado en masa
estuvo afectada (P<0,05) por el extendedor y los toros en cada
tiempo de incubación post-congelado y por el
procedimiento previo a la clasificación a 0 h de incubación (tabla
6). No hubo diferencias debido a los fluidos de protección
(P<0,05). En la incubación a las 0 h de
post-congelado, el uso de un tratamiento de 3 horas
neto tuvo como resultado una mayor motilidad de esperma después del
congelado y el descongelado en comparación con los otros dos
tratamientos de manchado previos a la clasificación (P<0,05);
tabla 6). Sin embargo, los procedimientos previos a la
clasificación no fueron estadísticamente significativos tras la
incubación post-descongelado del esperma durante 1
ó 2 horas con toros considerados como efecto aleatorio. Es un dato
importante que en estos dos momentos de incubación, se produjeron
interacciones significativas entre tratamiento previo a la
clasificación y el toro (P<0,05). Por otra parte, el tratamiento
previo a la clasificación tendría un efecto significativo en todos
los tiempos de incubación post-descongelado si se
consideraran los toros como efectos fijos.
Inmediatamente después del descongelado (0 h),
TEST fue el mejor extendedor, pero después de 1 ó 2 horas de
incubación a 37ºC, Tris fue el mejor extendedor. Es un dato
importante que no se produjo interacción entre el tratamiento previo
a la clasificación y el extendedor para ninguna respuesta. Hubo
efectos del observador (P<0,01) en todos los tiempos de la
incubación, pero no hubo interacciones entre el observador y el
tratamiento. Se produjo una interacción entre el toro y el
extendedor (P<0,05) en los 3 tiempos de incubación.
| \begin{minipage}[t]{145mm} ^{a,b,c.} las medias dentro de las columnas, dentro de los efectos principales, sin superíndices comunes difieren (P<0,05).\end{minipage} |
| ^{d} error típico distribuido = \surderror medio cuadrático de ANOVA + \surdN |
6. Conclusión. Este estudio demuestra que
mantener el esperma neto durante 3 horas antes de la dilución, el
manchado y la clasificación fue mejor que la dilución inmediata y
el manchado 0 h y 3 horas después. Así pues, con 3 horas en la
clasificación, es mejor continuar con una nueva parte alícuota del
eyaculado original que se mantuvo neto 3 horas y después se manchó,
que continuar con la muestra original de esperma manchado y
mantenido a 400 x 10^{6} esperma /ml.
A pesar de que el extendedor TEST proporcionó la
motilidad post-congelado más alta a 0 h, Tris fue
el extendedor superior cuando se sometió a tensión el esperma por
incubación a 37ºC. Cada uno de los fluidos de protección funcionó
igual de bien para cada extendedor. En función de estos resultados,
los autores de la invención han incorporado el uso de fluido de
protección Tris en combinación con extendedor de congelación Tris
en su procedimiento de operación convencional.
Objetivo: evaluar el efecto de la adición de
dodecil sulfato sódico ("SDS") al extendedor de congelación en
esperma clasificado por citometría de flujo.
1. Recogida de muestra de ensayo. Se
recogió el esperma de 6 toros y se preparó tal como se describe en
el ejemplo 1A.
2. Métodos. Se extendió el esperma de cada
uno de los 6 toros a 20 x 10^{6}/ml en extendedor Tris huevo
entero al 20% ("WET") que contenía 0, 0,03, 0,06, 0,09 o 0,12
por ciento de SDS, envasado en pajas y congelado. Se preparó
extendedor WET utilizando 3,028 g de
Tris[hidroximetil]aminometano, 1,78 g de monohidrato
de ácido cítrico y 1,25 g de fructosa por cada 100 ml de agua
doblemente destilada, a la que se añadió 20% de huevo entero
(vol/vol). Se preparó el extendedor WET a un pH de aproximadamente
7,0 para contener una concentración de glicerol final de
aproximadamente 6% (vol/vol). El extendedor WET también contenía
1000 IU de penicilina "G" sódica y 100 Tg de sulfato de
estreptomicina/ml.
3. Resultados. Las medias correspondientes
(n = 1 muestra de cada uno de los 6 toros) fueron respectivamente
51, 51, 50, 51 y 48% de esperma motil progresivo aproximadamente 10
minutos post-descongelado. En función de estos
estudios, se utilizó un 0,06 por ciento de SDS en el ejemplo
5B.
1. Recogida de muestra de origen. Se
recogió el esperma de 8 toros y se preparó tal como se ha descrito
en el ejemplo 1A.
2. Métodos. Se estudio la motilidad
post-descongelado para esperma congelado en
extendedores yema de huevo-Tris (véase ejemplo 2) y
WET (véase ejemplo 5A) con y sin 0,06% de SDS. El contenido final
de glicerina para ambos extendedores fue 6%.
a) Manchado, preparación para clasificación,
clasificación. Se prepararon muestras de esperma manchadas a
partir de un eyaculado de cada uno de los 8 toros tal como se ha
descrito en el ejemplo 2. Se clasificó en masa el esperma manchado
utilizando fluido de protección Tris, tal como se ha descrito en el
ejemplo 2, con la excepción de que se llevó a cabo la clasificación
utilizando 135 mW de potencia de láser incidente. Se recogió el
esperma clasificado en un tubo de plástico de 50 ml que contenía 2
ml de tampón de congelación fracción A para cada uno de los
extendedores; se recogieron 15 x 10^{6} de esperma clasificado
total (25 ml) para cada tratamiento y se incubaron durante 1 hora a
22ºC para simular una clasificación más prolongada.
b) Preparación para congelado. A
continuación, se enfrió el esperma diluido a 5ºC durante 90
minutos. Se añadió por etapas un volumen equivalente del extendedor
fracción B apropiado (2 x) a intervalos de 15 minutos para cada tubo
de plástico de 50 ml que contenía esperma clasificado. Se
concentraron partes alícuotas de 25 ml/tratamiento con extendedor
por centrifugado durante 20 minutos a 850 x g en una centrífuga
refrigerada. Se eliminó el sobrenadante dejando un pellet de
esperma de 600 TI, que fue suspendido por agitación con torbellino
suave durante 15 segundos. No se añadió más extendedor al pellet de
esperma ya que la suspensión que contenía el pellet contenía ya
glicerol. La concentración de la suspensión de esperma fue
aproximadamente 20 x 10^{6}/ml. Se preparó un control no
clasificado no manchado para cada toro a 20 x 10^{6} esperma/ml
en extendedor de yema de huevo- Tris que contenía 6% de glicerol. Se
colocó el control en una cámara de frío a 5ºC al mismo tiempo que
se producía la clasificación en volumen.
c) Equilibrio y congelado. Se envasó el
esperma clasificado en masa y el control y se congelaron al mismo
tiempo. Se envasó el esperma en pajas de policloruro de vinilo de
0,25 ml, se equilibró durante aproximadamente 3 horas a
aproximadamente 6 horas a 5ºC y después se congeló en vapor
nitrógeno líquido estático.
3. Evaluación de motilidad
post-congelado. Las evaluaciones del
descongelado y post-descongelado del esperma fueron
realizadas tal como se ha descrito para el ejemplo 2 con la
excepción de que se evaluó la motilidad progresiva 0,5 y 2,0 h
después de la incubación.
4. Análisis estadístico. En el ejemplo 2
se facilita una descripción general del análisis estadístico.
Específicamente, se evaluaron los efectos del tratamiento a través
de análisis de varianza individuales para cada tiempo de
incubación; el modelo incluyó toro y extendedor en el gráfico
principal y las interacciones entre el observador y factores
relacionados en el subgráfico. Se determinaron las diferencias a
través del ensayo de la diferencia menos significativa.
5. Resultados. El extendedor afectó
(P<0,05) en la motilidad progresiva del esperma tras 0,5 o 2
horas de incubación post-descongelado (tabla 7). A
0,5 h, WET más SDS tuvo como resultado una motilidad inferior que
Tris con SDS. A las 2 horas, todos los tratamientos con esperma
clasificado en masa fueron peores que el esperma de control no
clasificado. No se produjeron efectos significativos en el toro y
el observador (P<0,01) en ambos tiempos de incubación, pero no se
produjeron interacciones entre el observador y el tratamiento.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
| ^{a,b} las medias dentro de las columnas sin superíndices comunes difieren (P<0,05). |
| ^{c}\surderror medio cuadrático de ANOVA + \surdN |
6. Conclusión. La inclusión de SDS en
extendedores Tris o WET no benefició la calidad del esperma según
se determina por estimaciones visuales de la motilidad tras el
descongelado. Asimismo, los resultados del uso de extendedores WET
y Tris fueron similares, ya que WET resultó igual de eficaz que Tris
para la crioconservación de esperma bovino clasificado.
Objetivo: evaluar la calidad
post-descongelado de esperma clasificado en función
de la integridad acrosómica.
1. Recogida de muestra de origen. Se
recogió el esperma de 3 toros y se preparó tal como se ha descrito
en el ejemplo 1A.
2. Métodos. Se manchó, trató y clasificó
esperma de control no clasificado y clasificado del mismo eyaculado
tal como se ha descrito en el ejemplo 2 con la excepción de que el
esperma fue clasificado según el tipo de sexo a un nivel de pureza
del 90%. Se recogió esperma clasificado en un volumen de
aproximadamente 20 ml y se recogió a 5ºC durante 90 minutos
(0,2ºC/min). Después del enfriado, se añadió un volumen equivalente
de extendedor yema de huevo-Tris B (ejemplo 2) al
esperma clasificado en 2 volúmenes equivalentes a intervalos de 15
minutos. El centrifugado y la aspiración del sobrenadante fueron
realizados tal como se ha descrito en el ejemplo 5. Tras el
centrifugado y la aspiración, se añadió extendedor de yema de
huevo-Tris que contenía 6% de glicerol (v/v) al
pellet de esperma para conseguir una concentración del esperma de
aproximadamente 20 x 10^{6} /ml. Se realizaron el congelado y el
descongelado tal como se ha descrito en el ejemplo 2 con la
excepción de que el tiempo de equilibrio fue aproximadamente 3
horas.
3. Evaluación de motilidad
post-descongelado. Se llevaron a cabo
estimaciones visuales del porcentaje de esperma de motilidad
progresiva a 37ºC aproximadamente 10 minutos después del
descongelado. Se valoró la integridad acrosómica del esperma
utilizando microscopía de contraste por interferencia diferencial
(x1000) tras 2 horas de incubación a 37ºC. Se trató el esperma con
40 mM de fluoruro sódico, se manchó y se examinaron 100 espermas por
tratamiento. Se clasificaron los acrosomas como (a) acrosoma
intacto, (b) acrosoma hinchado o dañado, o (c) acrosoma perdido (no
intacto).
4. Análisis estadístico. Los datos
analizados fueron de 19 fechas de congelación diferentes
completadas con 3 toros utilizados en pruebas de campo. Se
evaluaron los efectos de tratamiento (clasificado frente a control)
a través de un análisis de varianza con los toros como efecto
fijo.
5. Resultados. El porcentaje de esperma
progresivamente motil post-descongelado fue
significativamente más alto (P<0,05) para esperma no clasificado
(50%) que para esperma clasificado (46%; tabla 8) a pesar de la
eliminación de esperma muerto durante la clasificación. No obstante,
el porcentaje de esperma con un acrosoma intacto no fue diferente.
La clasificación aumentó el porcentaje de esperma que le faltaba un
acrosoma, pero también redujo el porcentaje de esperma con un
acrosoma dañado, en relación con el esperma de control (P<0,05).
Hubo diferencias significativas entre los toros en cuanto al
porcentaje de acrosomas intactos (P<0,05), porcentaje de
acrosomas no intactos (P<0,01) y motilidad progresiva
post-descongelado (P<0,01). Se dio un efecto de
toro según clasificación para la motilidad
post-descongelado (P<0,01) pero no para las
demás respuestas. De los toros A y B, las diferencias en la
motilidad post-descongelado entre esperma
clasificado y no clasificado fueron cercanas a cero; para el toro
C, el esperma clasificado estuvo a un porcentaje de 10 puntos menos
(19%) en motilidad que el esperma de control.
| ^{a,b} las medias de columna con diferentes superíndices difieren (P<0,05). |
6. Conclusión: Las estimaciones visuales
de motilidad progresiva para esperma congelado, clasificado por
término medio fueron ligeramente inferiores (4 puntos de
porcentaje; 8%) que el esperma de control, aunque esta diferencia
fue mayor para un toro. Estas evaluaciones se realizaron
aproximadamente 10 minutos después del descongelado. La pequeña
diferencia media se corresponde con la de los acrosomas no intactos
al cabo de 2 horas de incubación. El esperma con un acrosoma dañado
o con falta de un acrosoma tienen probabilidad de no ser motiles.
El mayor porcentaje de esperma con un acrosoma no intacto, para
muestras clasificadas, indica daños asociados con la clasificación o
con la crioconservación antes o después de la clasificación real.
Presumiblemente, la clasificación convirtió los acrosomas dañados
en acrosomas perdidos. Basándose en los procedimientos
convencionales para la evaluación de la calidad de esperma, no hay
fundamento para asumir que el potencial fertilizante de este
esperma clasificado por citometría de flujo estuviera severamente
comprometido para la mayoría de los toros.
Objetivo: proporcionar un protocolo para la
crioconservación de esperma de toro clasificado por citometría de
flujo.
1. Recogida y valoración de eyaculado. Se
recogieron y se prepararon eyaculados tal como se describe en el
ejemplo 1A. Se seleccionaron eyaculados de los toros con <75% de
esperma normal morfológicamente. Se estimó visualmente el
porcentaje de esperma progresivamente motil (los eyaculados que
tienen motilidad progresiva >60% son mejores para
clasificación). Se añadieron antibióticos al semen en bruto del
siguiente modo: tilosina a una concentración final de 100
\mug/ml, gentamicina a una concentración final de 500 \mug/ml y
linco-espectina a una concentración final de 300/600
\mug/ml.
2. Manchado y preparación para
clasificación. Tras la adición de los antibióticos a la muestra
de semen en bruto, se dejó un lapso de 15-20 minutos
antes del manchado. Se mancharon las muestras tal como se describe
en el ejemplo 2.
3. Clasificación. Se clasificó el esperma
de tipo X- y de tipo Y, estableciendo puertas de clasificación para
un 90% de pureza. Se clasificó el esperma en tubos Falcon de 50 ml
que contenían 2 ml de extendedor de fracción A yema de
huevo-Tris (véase ejemplo 2) hasta que cada tubo
incluyó un máximo de 20 ml de volumen total (o un máximo de 2 horas
por clasificación) y la concentración de esperma clasificado final
fue 6 x 10^{5}/ml. Adviértase que se debe añadir tampón de
atrapado de fracción A-yema de
huevo-Tris al 20% después de la clasificación y
antes del enfriado para que el porcentaje final de la yema de huevo
sea al menos 3%.
4. Preparación para congelado. Después de
la clasificación, se enfriaron las muestras clasificadas a 5ºC
durante un período de 90 minutos. Después del enfriado, se añadió
un 20% de extendedor fracción B yema de huevo-Tris
(véase ejemplo 2) por etapas (2 x) a intervalos de 15 minutos. El
volumen final de extendedor de fracción B Tris añadido a la muestra
de esperma deberá ser igual al volumen de extendedor fracción A
Tris. El volumen total de la muestra de esperma tras la adición de
extendedor fracción B Tris no deberá exceder 27 ml del volumen
total.
Tras la adición del extendedor fracción B Tris a
la muestra de esperma, se concentró la muestra por centrifugado
durante 20 minutos a 850 x g. Se aspiró el sobrenadante dejando
aproximadamente 150 \mul de pellet de esperma. Se resuspendió el
esperma y se repartió el esperma para cada toro por separado.
5. Congelado. Se añadió extendedor de yema
de huevo-Tris (6% de glicerol) para conseguir una
concentración de esperma final de 20 x 10^{6}/ml. Se envasó el
esperma extendido en pajas de policloruro de vinilo de 0,25 ml para
el congelado tal como se ha descrito en el ejemplo 2.
Se recogió semen de toros jóvenes de fertilidad
desconocida a través de una vagina artificial (véase ejemplo 1A).
Después de determinar la concentración de esperma con un
espectrofotómetro y de la evaluación subjetiva de la motilidad de
esperma progresiva, se trató el semen y se clasificó tal como se ha
descrito en el ejemplo 2, con la excepción de que se clasificó el
esperma según el tipo de sexo a un 90% de pureza utilizando una
potencia incidente de láser de aproximadamente 135 a
aproximadamente 150 mW. El tratamiento y el congelado se llevaron a
cabo igual que en el ejemplo 2, con la excepción de que el tiempo de
equilibrio fue aproximadamente 3 horas. Se utilizó un Extendedor
Cornell Universal (Seider GE Jr. Theriogenology 1997; 48:
1255-1264) para semen líquido en las pruebas de
campo 1, 2, 3. Para el semen congelado en las pruebas de campo 2 y
3, el extendedor utilizado fue 2,9% de citrato Na + 20% de yema de
huevo con una concentración de glicerol final de 7% (véase ejemplo
1). Para las pruebas de campo 4 a 11, el esperma fue congelado en
extendedor a base de Tris compuesto por 200 mM Tris, 65 mM de ácido
cítrico, 56 mM de fructosa, 20% de yema de huevo y una
concentración de glicerol final de 6% (véase ejemplo 2). El fluido
de protección utilizado en el citómetro de flujo fue 2,9% de
citrato Na (véase ejemplo 4) para las pruebas 1, 2 y 3 y un tampón
Tris para el resto de las pruebas (véase ejemplo 2).
Se envasaron los espermas en pajas French de 0,25
mi en columnas de 50 ul en el centro de la paja. Para reducir al
mínimo los efectos de la dilución, se utilizaron volúmenes bajos
para que hubiera al menos 10^{7} de esperma/ml. En la mayoría de
las pruebas, se aspiró una columna de extendedor sin esperma para
introducirla en la paja primero para humedecer el tapón de algodón,
seguido de una pequeña columna de aire y después el esperma
clasificado según sexo. Cuando estuvo congelado el esperma, se
descongeló una paja de cada tanda en agua a 35ºC durante 30
segundos para el control de calidad descartándose menos de un 25% de
motilidad progresiva pos-descongelado. Se sometió a
sonicación una muestra de esperma seleccionado según el sexo para
cada tanda y se analizó por citometría de flujo para determinar la
precisión de la selección según sexo.
Las terneras utilizadas estaban en 6 centros de
producción bastante dispersadas con diferentes prácticas de
gestión. Las diferencias dadas por las distintas razas y estaciones
del año contribuyeron además a la heterogeneidad de los
experimentos (tabla 9). Siempre que fue posible, se alternaron los
tratamientos y los controles sistemáticamente dentro de los toros
dentro de inseminadores a medida que las terneras fueron entrando
en las instalaciones de inseminación.
Se sincronizó el celo en una de las 4 formas que
se indican (tabla 9). (1) 500 mg de acetato de melegeterol (MGA)
introducido diariamente en 2,3 kg de grano durante 14 días seguido
de una inyección i.m. de 25 mg de prostaglandina F_{2}\alpha
(Lutalyse, Upjohn, Kalamazoo, MI, EE.UU.) 17,18 o 19 días después
del último día de alimentación con MGA (MGA/PG); (2) una sola
inyección de 25 mg de prostaglandina F_{2}\alpha i.m. a
intervalos de 12 días (PG/PG) o (4) 50 o 100 Tg de GnRH inyectado
im.m., seguido de 25 mg de prostaglandina F_{2}\alpha 7 días
después (GnRH/PG).
Se examinaron a simple vista las terneras para
establecer las mañanas y tardes de celo, pero se las inseminó
solamente por las tardes después de las 16:00, aproximadamente ½ o
1 día después del inicio del celo. La inseminación se realizó o
bien en el cuerpo uterino de manera convencional, o a mitad camino
del cuerno uterino utilizando protecciones de transferencia de
embrión atraumáticas (IMV, Minneapolis, MN, EE.UU.). En este último
caso, se depósito el semen una vez pasada la curva más grande del
cuerno uterino en la posición más anterior posible que se pudo sin
trauma, idénticamente a la transferencia de embrión no quirúrgica.
En la mayoría de los casos, se depositó el semen entre los cornu
tercero anterior y medio.
La mayoría de los experimentos incluyeron un
control de esperma congelado inseminado en el cuerpo uterino con 20
ó 40 x 10^{6} esperma/dosis de los mismos toros utilizados para
la clasificación de esperma según tipo de sexo
("clasific.sexo"). Este control sirvió como estimación
compuesta de la fertilidad intrínseca normal de las terneras en
condiciones de prueba de campo específicas así como la fertilidad
de los toros utilizados y las capacidades de los inseminadores.
Algunas pruebas incluyeron también un grupo de control no
clasificado por sexo de baja dosis. En ocasiones, se planificó que
el número de inseminaciones de control fuera ½ o 2/3 del número
utilizado para cada tratamiento para obtener más información sobre
el esperma clasificado según sexo. Se descongeló el esperma de
control y el clasificado según sexo congelados durante 20 a 30
segundos en un baño de agua a 35ºC a 37ºC. En la tabla 9 se resumen
otros detalles más.
Se diagnosticó la preñez por ultrasonido 28 a 37
días después de la inseminación y/o 56 a 92 días después de la
inseminación, momento en el cual se determinó el sexo del feto en
la mayoría de las pruebas, tal como describe Curran, S.
Theriogenology 1991; 36: 809-814, sin que el
operador conociera los tratamientos o controles de inseminación.
Los sexos de los becerros nacidos fueron casi idénticos al
diagnóstico del sexo del feto. Se analizaron los datos por cuadrado
Chi grado único de libertad para continuidad; se utilizaron ensayos
de 2 colas aunque se especifica el de 1 cola. Menos de un 5% de las
inseminaciones fueron desechadas debido a errores en el tratamiento
de inseminación, franca infección del tracto reproductor, por no
haber atravesado el cuello del útero, etc. Las decisiones sobre los
animales retirados de los experimentos fueron adoptadas después de
la inseminación y en ningún caso se basaron en un diagnóstico de
preñez.
Los datos presentados son de 11 pruebas de campo
heterogéneas consecutivas, limitadas por aspectos logísticos de los
estudios, tales como encajar a los toros dentro de las necesidades
genéticas de la manada, la falta de disponibilidad de información
sobre fertilidad en los toros, el número limitado de terneras, la
falta de disponibilidad de los mismos inseminadores en todas las
pruebas, el tiempo metereológico duro en algunas pruebas, limitadas
cantidades de semen clasificado según sexo en las primeras pruebas,
2 grupos de terneras en los que algunas resultaron preñadas
aproximadamente 55 días en el momento de la sincronización del
celo, etc. Hasta 4 toros y 3 inseminadores participaron en cada una
de las pruebas; esto nos permitió hacer un muestreo de las
poblaciones para asegurar que los resultados se aplicaban a más de
un toro o técnico; sin embargo, los datos producidos fueron
insuficientes para evaluar las diferencias entre de toro a toro en
la fertilidad de forma rigurosa.
La mayoría de los grupos de terneras derivaron de
manadas de cría localizadas a 140 a 250 km del laboratorio. No hubo
diferencias significativas en los índices de preñez entre los
inseminadores en ninguna prueba, pero el número de crías por
inseminador fue bajo, y es probable que se pudieran detectar
diferencias con un mayor número de inseminaciones.
Los métodos de sincronización de celo no fueron
comparados dentro de las pruebas, de manera que no fue posible
comparar los índices de preñez entre estos métodos. Los índices de
preñez aparecieron como satisfactorios para los cuatro
procedimientos de sincronización utilizados.
Dado que las inseminaciones se realizaron una vez
al día, las terneras en celo por la tarde fueron inseminadas
aproximadamente 24 horas después de detectarse el celo. El índice
de preñez para estas terneras con esperma clasificado según sexo
repartido en todas las pruebas fue 203/414 (49,9%), que no fue
significativamente diferente (P>0,1) del de las terneras en celo
por las mañanas y por tanto inseminadas medio día después de la
detección del celo 266/586 (45,4%). Esta tendencia para una mayor
fertilidad con una inseminación más tardía está de acuerdo con las
conclusiones extraídas de otro estudio según las cuales es
preferible inseminar más tarde que lo recomendado normalmente con
toros de fertilidad inferior, cuando se utilizan cantidades de
esperma bajas, o cuando las condiciones están por debajo de lo
óptimo de otra forma.
En las tablas 10 a 20 se exponen los índices de
preñez según los tratamiento y, cuando se dispone de ello, el sexo
del feto o el ternero. El objetivo consistió en obtener progenie
femenina, a excepción de la prueba 8; la precisión fue del 95%,
83%, 90%, 83%, 82% y 94% en las pruebas 1, 3, 8, 9, 10 y 11,
respectivamente. En el resto de las pruebas, no se dispuso de los
sexos de los fetos o de nacimiento por el cronometraje del
diagnóstico de embarazo, la falta de disponibilidad de personas
especializadas en determinar el sexo de los fetos y/o porque los
becerros no habían nacido todavía. No fue gran problema porque el
principal objetivo de este estudio fue determinar la fertilidad de
esperma clasificado por citometría de flujo inseminado en dosis
bajas.
La precisión del sexo se puede ajustar a
virtualmente cualquier nivel deseado entre 50 y 95% ajustando los
parámetros de clasificación. No obstante, una mayor exactitud tiene
como resultado una menor cantidad de esperma clasificado por tiempo
unitario, en particular para esperma de cromosoma Y. Un 90% de
precisión es suficiente para el trabajo de rutina.
Las principales conclusiones de cada prueba de
campo se resumen a continuación. Debe advertirse que la cantidad de
esperma total se indica en los encabezamientos de la tabla; la
cantidad de esperma progresivamente motil fue normalmente de 30 a
50% de estos valores. La prueba de campo 1 (tabla 10) confirmó que
los índices de preñez con inseminación en cuerno uterino utilizando
una baja cantidad de esperma no clasificado por sexos fueron
similares a los controles con cantidades de esperma normales. El
día 64 a 67 el índice de preñez con esperma clasificado por sexo
sin congelar (42%) estuvo a un porcentaje de 12 puntos por debajo
del control líquido no clasificado según sexos con esperma diluido,
manchado y centrifugado idénticamente al esperma clasificado. La
precisión de la determinación del sexo fue 95%; el sexo de los
becerros nacidos a partir de esperma clasificado según sexos se
correspondió con el diagnóstico de sexo de los fetos con exactitud;
hubo un error en la determinación del sexo de los fetos de los
controles. No hubo abortos entre los 2 meses de gestación y el
término, y los 19 becerros del tratamiento de esperma según sexo
fueron normales y sobrevivieron. Para el tratamiento de semen
clasificado según sexo, los índices de preñez de 2 meses para los
toros N1, N2 y N3 fueron 41, 44 y 40%, respectivamente; 39% (13/33)
de las terneras en celo por la mañana y 50% (6 /12) en celo por la
tarde quedaron preñadas.
| ^{a,b} las relaciones de sexo sin superíndices comunes difieren (P<0,02). |
La prueba de campo 2 (tabla 11) proporcionó las
primeras evidencias de que los resultados con esperma congelado
clasificado por sexo son similares a los de esperma sin congelar
clasificado por sexo si se realizan los ajustes en la cantidad de
esperma eliminado durante la criconservación. Asimismo no hubo
diferencia en los índices de preñez entre el esperma clasificado por
sexo almacenado a 5ºC frente a 18ºC. Los índices de preñez a 2+
meses tras la inseminación para semen clasificado por sexos de
toros individuales osciló entre 22 y 42% de embarazos (P>0,05).
La pérdida embriónica entre 1 y 2 meses de gestación fue muy
similar para los embarazos con clasificación según sexo y el
control. Se dispuso de los datos de los becerros de 39 terneras para
esta prueba; cada una de las terneras (30 embarazos
de sexo determinado, 9 controles) preñadas a los 2 meses parieron tras un período de gestación de duración normal.
de sexo determinado, 9 controles) preñadas a los 2 meses parieron tras un período de gestación de duración normal.
| ^{a} sin diferencias significativas, X^{2}. |
La prueba de campo 3 (tabla 12) confirmó que el
esperma congelado con clasificación de sexo tuvo como resultado
unos índices de preñez razonables. La precisión de la determinación
del sexo del esperma fue confirmada de nuevo; no obstante, hubo 4
errores en la determinación del sexo de los fetos en los becerros
nacidos; se presentan los sexos reales de los becerros nacidos.
También en este caso, no hubo abortos entre 2 meses de gestación y
término. Los índices de preñez calculados como media para el
esperma clasificado por sexo, no congelado y clasificado por sexo
congelado para los toros N8, N9, AN5 y AN4 fueron 24, 31, 50 y 60%,
respectivamente (P<0,1).
| ^{a,b} las medias sin superíndices comunes difieren (P<0,05). |
| \begin{minipage}[t]{155mm} ^{c,d} El porcentaje de becerros de tratamientos de clasificación de sexo (83%) difirieron del grupo de control, P<0,05, 1-cola, X^{2} \end{minipage} |
Se realizaron las pruebas de campo 4, 5 y 6
(tablas 13, 14, 15) en la misma localización con 3 grupos
diferentes de terneras. Desgraciadamente, no fue posible replicar
cada una de las pruebas de manera similar debido a factores
indeterminados de las pruebas de campo, tales como el personal de
planificación, la disponibilidad de semen clasificado por sexos de
cada toro, etc. Los índices de preñez ampliamente diferentes entre
las pruebas 5 y 6 ilustran que las condiciones fueron diferentes
entre las pruebas. Algunas de las terneras en la prueba 6 no se
preñaron tras un mes de apareo natural. En las condiciones de estas
pruebas, los índices de preñez fueron muy similares entre 1,5 y 3,0
x 10^{6} esperma congelado clasificado según sexo/dosis. Por otra
parte, la inseminación uterina-cuerno no tuvo
ventaja. No hubo una diferencia significativa (P<0,05) en los
índices de preñez entre los toros salvo en la prueba 5 en la que el
índice de preñez de J2, 20/28 (71%) fue superior a la de J4, 15/39
(38%) (P<0,05). Esta diferencia no se correspondió de una prueba
a otra, ya que J4 tuvo índices de preñez más altos numéricamente
pero no significativamente (P>0,1) que J2 en las pruebas 4 y
6.
| ^{a,b} las medias sin superíndices comunes difieren (P<0,01) |
| \begin{minipage}[t]{155mm} *seis terneras preñadas los días 30 a 33 fueron vendidas antes del segundo diagnóstico de preñez; se ha dado por supuesto que siguieron preñadas. \end{minipage} |
| ^{a} no hay diferencias significativas. |
| ^{a,b} Las medias sin superíndices comunes difieren (P<0,05). |
\newpage
Para la prueba 7 (tabla 6) sólo se dispuso de un
inseminador debido a la replanificación. Fue la única prueba en la
que se demostró una ventaja convincente de la inseminación en el
cuerno del útero con respecto a la inseminación en el cuerpo del
útero. Para este inseminador en las condiciones de la prueba, un
55% más de las terneras (porcentaje de 22 puntos) quedaron preñadas
con semen congelado de sexo clasificado inseminado en los cuernos
del útero que en el cuerpo del útero. La verdadera diferencia pudo
ser más pequeña ya que hay amplios intervalos de confianza en estas
medias. En todas las demás pruebas (5, 6, 9 y 11) en las que no se
comparó la inseminación en cuerpo y en cuerno, los índices de
preñez fueron muy similares para ambos métodos para este técnico,
al igual que para otros.
Se envió el semen de uno de los toros utilizados
en la prueba 7 sin dilución desde Montana por vía aérea en una caja
aislada a \sim20ºC antes de la clasificación; el tiempo de envío
fue 6 horas. Los índices de preñez para el esperma clasificado
según sexo de los dos toros fue virtualmente idéntico, 49% para el
semen sin enviar y 52% para el semen enviado. No se diluyó el semen
con extendedor y no se enfrió para el envío ya que las propiedades
de manchado del esperma con Hoechst 33342 se altera por la dilución
con extendedores. Por otra parte, en otros estudios (véase ejemplo
4), la clasificación de semen neto a temperatura ambiente entre la
recogida y la clasificación por citometría de flujo fue considerada
superior que diluirlo.
| ^{a,b} las medias sin superíndices comunes difieren (P<0,01). |
La prueba de campo 8 (tabla 17) se refiere al
lote de terneras a las que no se implantó promotores del
crecimiento; en el momento en que se diagnosticó la preñez,
abortaron de manera que no se dispone de datos sobre los partos.
Este experimento ilustra que se puede determinar eficazmente el
sexo en la dirección del macho. Los índices de preñez para los 2
toros fueron 50 y 61%.
| ^{a} sin diferencias significativas |
La prueba de campo 9 (tabla 18) fue la única
prueba en la que se demostró una ventaja convincente de 3,0 frente
a 1,5 x 10^{6} esperma clasificado según sexo congelado/por dosis
de inseminación. Esta ventaja se comprobó para ambos inseminadores.
Los índices de preñez para esperma clasificado según sexo de los 2
toros fueron 62 y 75%.
| \begin{minipage}[t]{155mm} ^{a} 3,0 x 10^{6} esperma con clasificación según sexo presentó un índice de preñez más alto (80%) que 1,5 x 10^{6} de esperma con clasificación de sexo (55%), P <0,05, 1-cola X^{2}. \end{minipage} |
Los índices de preñez en la prueba de campo 10
(tabla 19) con semen congelado clasificado según sexo, fueron
similares a los controles; la precisión de la clasificación por
sexo de esta prueba fue solamente 82%, sin embargo, no es
significativamente diferente de la precisión 90% objetivo. Los
índices de preñez para semen clasificado por sexos fueron 54, 66, y
50% para los toros AN4, AN7, y AN8, respectivamente (P>0,1). 18
de las terneras inseminadas en esta prueba fueron los becerros que
resultaron del esperma de sexo clasificado en la prueba de campo
1.
| ^{a} sin diferencias significativas |
| ^{a} sin diferencias significativas, X^{2} |
| \begin{minipage}[t]{155mm} ^{b} 16 de 17 (94%) fetos de los tratamientos de semen clasificado por sexo fueron hembras; 2 estaban demasiado profundos en la cavidad del cuerpo como para determinar su sexo por ultrasonido. \end{minipage} |
Los datos de las pruebas fueron combinados en
cuyos tratamientos fueron idénticos a excepción 1 x 10 y 1,5 x
10^{6} dosis de esperma fueron repartidas (tabla 21).
Los índices de preñez con esperma clasificado por
sexos fueron generalmente 70-90% de controles sin
clasificación por sexos dentro de los experimentos con 7 a 20 veces
más de esperma. La diferencia fue menor en las pruebas más
recientes, posiblemente reflejando procedimientos de tratamiento y
clasificación de esperma de esperma mejorados.
En algunas pruebas, se examinaron las terneras
para determinar si estaban preñadas por ultrasonido al mes y a los
dos meses tras la inseminación. Las pérdidas de preñez en este
intervalo fueron similares (P>0,1) para (23/261); 8,8%) frente
al control (9/145; 6,2%) de tratamientos de esperma, que es una
medida de que el daño genético debido a la clasificación por sexos
es mínima. La información sobre los partos fue obtenida únicamente
en algunas de las terneras preñadas ya que la mayoría del ganado de
las pruebas anteriores fue vendido y las de las pruebas posteriores
no habían parido aún. La población de terneros producidos hasta la
fecha a partir del semen clasificado por sexos parece no tener
diferencia de la población de controles.
Las relaciones de sexo en el ganado se pueden
distorsionar en un 90% o bien según el sexo por clasificación del
esperma en función del contenido de ADN con un citómetro de
flujo/clasificador de sexo seguido de crioconservación e
inseminación artificial relativamente de rutina. Los becerros que
resultan del esperma clasificado por sexos parece normal. Para la
mayoría de los toros de estos estudios, los índices de preñez con
1,0 a 1,5 x 10^{6} de esperma congelado, clasificado por sexo
fueron 70 a 90% de los controles sin clasificación por sexos con 20
o 40 x 10^{6} de esperma congelado inseminado convencionalmente.
Estos resultados se aplican a terneras bien gestionadas criadas por
inseminadores expertos utilizando semen tratado apropiadamente.
Puede haber una pequeña ventaja sobre la inseminación de esperma
clasificado por sexos bilateralmente en los cuernos uterinos en
comparación con la inseminación en el cuerpo uterino
convencional.
La presente invención ha sido descrita hasta aquí
haciendo referencia a determinados métodos de realización y
materiales específicos. Debe entenderse que la explicación de estos
métodos y materiales específicos no constituye en absoluto una
limitación del alcance de la presente invención que se extiende a
cualquier método y material alternativo adecuado para su realización
para conseguir los fines de la presente invención.
Claims (34)
1. Un método para la crioconservación de esperma
que consiste en:
(a) obtener una muestra de esperma;
(b) añadir un extendor inicial y seleccionar
esperma por citometría de flujo, realizándose dicha adición y
selección en cualquier orden;
(c) enfriar dicha muestra de esperma
seleccionado;
(d) aislar el esperma de dicha muestra de esperma
seleccionado fría para producir esperma frío aislado;
(e) añadir el extendor final a dicho esperma
aislado frío para producir una suspensión de esperma fría; y
(f) congelar dicha suspensión de esperma.
2. El método de la reivindicación 1 en el que
dicha muestra de esperma seleccionado comprende una porción del
esperma presente en una muestra de origen, estando seleccionada
dicha porción de esperma para una característica y siendo dicha
concentración de esperma en la muestra de esperma seleccionado más
baja que en la muestra de origen.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2 en el que
dicha muestra de esperma seleccionado consiste en esperma
clasificado según el sexo.
4. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3 en el
que dicha muestra de esperma seleccionado consiste en esperma de
mamífero.
5. El método de la reivindicación 4 en el que
dicha muestra de esperma seleccionado consiste en esperma
bovino.
6. El método de la reivindicación 4 en el que
dicha muestra de esperma seleccionado consiste en esperma
equino.
7. El método de la reivindicación 4, en el que
dicha muestra de esperma seleccionado consiste en esperma
porcino.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el enfriado se lleva a cabo
reduciendo la temperatura de la muestra de esperma seleccionado a
aproximadamente 5ºC.
9. El método de la reivindicación 8 en el que el
enfriado se lleva a cabo durante un período de aproximadamente 60
minutos a aproximadamente 240 minutos.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el extendedor final añadido a
dicha muestra de esperma seleccionado incluye, además de un
crioprotector, uno o más de los siguientes componentes:
un componente que mantiene la osmolalidad y
tampona pH, una sustancia orgánica que reduce el impacto de frío y
preserva la fertilidad del esperma, una fuente de energía, una
sustancia que facilita la capacitación de esperma y un
antibiótico.
11. El método de la reivindicación 10 en el que
el crioprotector se selecciona del grupo que consiste en
disacáridos, trisacáridos y cualquier combinación de ellos.
12. El método de la reivindicación 10, en el que
dicho crioprotector se selecciona del grupo que consiste en
glicerol, sulfóxido de dimetilo, etilen glicol, propilen glicol y
cualquier combinación de ellos.
13. El método de la reivindicación 10 en el que
dicho componente que mantiene la osmolalidad y tampona el pH se
selecciona del grupo que consiste en un tampón que incluye una sal,
un tampón que contiene un hidrato de carbono y cualquier
combinación de ellos.
14. El método de la reivindicación 10 en el que
dicho componente que mantiene la osmolalidad y tampona el pH se
selecciona del grupo que consiste en citrato sódico,
Tris[hidroximetil]aminometano, ácido
N-Tris[hidroximetil]metil-2-aminoetanosulfónico,
glutamato monosódico, leche, medio tamponado con HEPES, y cualquier
combinación de ellos.
15. El método de la reivindicación 10 en el que
dicha sustancia orgánica se selecciona del grupo que consiste en
yema de huevo, un extracto de yema de huevo, leche, un extracto de
leche, caseína, albúmina, lecitina y cualquier combinación de
ellos.
16. El método de la reivindicación 10 en el que
la fuente de energía es un monosacárido seleccionado del grupo que
consiste en glucosa, fructosa, manosa y cualquier combinación de
ellos.
17. El método de la reivindicación 10 en el que
dicho antibiótico se selecciona del grupo que consiste en tilosina,
gentamicina, lincomicina, linco-espectina,
espectinomicina, penicilina, estreptomicina y cualquier combinación
de ellos.
18. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 en el que tras la adición del extendedor
final, la muestra de esperma y la suspensión de esperma,
respectivamente, comprenden glicerol, citrato sódico,
Tris[hidroximetil]aminometano, yema de huevo, fructosa
y uno o más antibióticos.
19. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 en el que tras la adición del extendedor
final, dicha muestra de esperma y suspensión de esperma, comprenden
glicerol, citrato sódico, yema de huevo y uno o más
antibióticos.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 en el que, tras la adición del extendedor
final, dicha muestra de esperma y suspensión de esperma comprenden
glicerol, yema de huevo, leche, fructosa y uno o más
antibióticos.
21. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 en el que dicho extendedor final tiene un pH
dentro del intervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente
7,5.
22. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el esperma se aísla de dicha
muestra de esperma seleccionado por centrifugado.
23. El método de la reivindicación 22 en el que
dicho centrifugado permite al menos de aproximadamente un 50% a
aproximadamente un 90% de recuperación de esperma.
24. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la concentración de esperma
en dicha suspensión antes del congelado es aproximadamente 1 x
10^{6}/ml a aproximadamente 300 x 10^{6}/ml.
25. Una muestra de esperma seleccionado congelado
que comprende una porción del esperma presente en una muestra de
origen, seleccionándose dicha porción de esperma para una
característica por citometría de flujo.
26. La muestra de esperma seleccionado congelado
de la reivindicación 25 consistiendo dicha muestra de esperma
seleccionado congelado en esperma seleccionado según sexo.
27. La muestra de esperma seleccionado congelado
de la reivindicación 25 ó 26 consistiendo dicha muestra de esperma
seleccionado congelado en esperma de mamífero.
28. La muestra de esperma seleccionado congelado
de la reivindicación 27 consistiendo dicha muestra de esperma
seleccionado congelado en esperma bovino.
29. La muestra de esperma seleccionado congelado
de la reivindicación 27 consistiendo dicha muestra de esperma
seleccionado congelado en esperma equino.
30. La muestra de esperma seleccionado congelado
de la reivindicación 27 consistiendo dicha muestra de esperma
seleccionado congelado en esperma porcino.
31. La muestra de esperma seleccionado congelada
de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30 en la que dicha
muestra de esperma seleccionado congelado se produce a través de un
método que consiste en:
(a) obtener una muestra de esperma;
(b) añadir un extendor inicial y seleccionar
esperma por citometría de flujo, realizándose dicha adición y
selección en cualquier orden;
(c) enfriar dicha muestra de esperma
seleccionado;
(d) aislar el esperma de dicha muestra de esperma
seleccionado fría para producir esperma frío aislado;
(e) añadir el extendor final a dicho esperma
aislado frío para producir una suspensión de esperma fría; y
(f) congelar dicha suspensión de esperma.
32. Un método que consiste en el uso de la
muestra de esperma seleccionado congelada de cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 31 para fertilización in vitro.
33. Uso de la muestra de esperma seleccionado
congelada de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 para la
fabricación de una formulación para inseminación artificial.
34. Uso de la reivindicación 3 en el que la
inseminación artificial es inseminación artificial de baja
dosis.
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