CN102986651A - 一种猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法包括采精、配制冷冻稀释液、稀释、平衡、冷冻、解冻以及检测等步骤，该方法通过在在颗粒冻精中，以甘油、乙二醇为抗冻剂，并添加不同量的ATP以及改进冷冻保存方法，降低猪精液的冷冻损伤，提高解冻后精子的活力，提高输精后的情期受胎率。

Description

一种猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法
技术领域
本发明涉及一种畜牧兽医生产领域。
背景技术
猪精液颗粒冷冻保存过程中，由于冷冻、解冻极易引起精子损伤，导致精子活力、顶体完整率、存活时间以及情期受胎率和平均窝产仔数等指标较低，并且现有技术中冷冻猪精液的操作程序复杂，如何稀释和冷冻精子从而更好的保护猪精液并精简程序，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，降低精子的冷冻损伤，提高解冻后的精子活力和输精后的受胎率，是本发明关注的问题。
本发明的猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法包括如下步骤：
(1)、采精：收集猪浓份精液，用纱布过滤进集精杯后，置于37℃的水浴中，并进行常规品质检查，选择无异味，色泽乳白色，精子形态正常，活力在0.7以上、密度大于1×109个/毫升的精液；
(2)、配制冷冻保护稀释液：基础液的配方为：葡萄糖8～10g、EDTA 0.1～0.2g、双蒸水100ml；冷冻保护稀释液的配方为：3％甘油、0.5％乙二醇、0.1～0.2mg/ml的ATP、20％的卵黄；
(3)、稀释：将步骤(2)得到的冷冻保护稀释液加热到37℃，并按1∶1的比例加入到步骤(1)得到的精液中，缓缓摇匀使精液稀释；
(4)、平衡：将步骤(3)得到的稀释精液装入三角瓶中，在三角瓶上塞橡胶塞；将其放入装有37℃水浴的保温水壶中，然后将水壶放入5-7℃的冰箱中，平衡3～4小时，平衡后镜检精子的活力；
(5)、冷冻：在钢质冷冻盒中倒入液氮，使液氮面距盒边缘约0.5～1.5cm处，待盒上筛网温度降至-135℃时，开始快速滴冻；滴冻完毕后，盖上保温板保温4-5分钟，然后将颗粒直接投入液氮；
(6)、解冻：事先准备两种温度的解冻水浴，第一种温度为55～65℃，第二种温度为37℃，先将冷冻颗粒从液氮中取出，迅速投入处于第一种温度水浴中的铝盒内，待其即将融化完时取出铝盒，再放入第二种温度的水浴中，融化后的精液以备检测。
(7)、检测：用常规的方法检测冻后精液的几项指标，而其存活时间是在精子解冻后，将等温的解冻稀释液按1∶1的比例加入到精液中进行稀释，然后放入37℃的水浴中，每间隔2～3小时检测其活力，直至无活精子为止。
本发明的猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法通过在猪的颗粒冷冻稀释液中添加不同的冷冻保护剂和改进冷冻保存方法，在稀释液中添加不同的冷冻保护剂的成分和改进冷冻保存方法，解冻的精子活力为0.36±0.04；顶体完整率为62.0±7.1；存活时间为28.5±3.3天；输精后的情期受胎率为87.2％，平均窝产仔数为8.6个。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更清楚的理解本发明的猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法，下面通过具体实施方式详细描述其技术方案。
本发明的猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法包括如下步骤：
1)、采精：收集猪浓份精液，用4层纱布过滤进集精杯后，置于37℃的水浴中，并进行常规品质检查，选择无异味，色泽乳白色，精子形态正常，活力在0.7以上、密度大于1×109个/毫升的精液；
2)、配制冷冻保护稀释液：基础液的配方为：葡萄糖8～10g、EDTA0.1～0.2g、双蒸水100ml；冷冻保护稀释液的配方为：3％甘油、0.5％乙二醇、0.1～0.2mg/ml的ATP、20％的卵黄。
3)、稀释：将步骤2得到的冷冻保护稀释液加热到37℃，并按1∶1的比例加入到步骤1得到的精液中，缓缓摇匀使精液稀释；
4)、平衡：将步骤3得到的稀释精液装入三角瓶中，在三角瓶上塞橡胶塞；将其放入装有37℃水浴的保温水壶中，然后将水壶放入5-7℃的冰箱中，平衡3个半小时，平衡后镜检精子的活力；
5)、冷冻：在钢质冷冻盒(直径29cm，高6cm)中倒入液氮，使液氮面距盒边缘约1cm处，待盒上筛网温度降至-135℃时，进行快速滴冻；滴冻完毕后，盖上保温板保温4-5分钟，然后将颗粒直接投入液氮；
6)、解冻：事先准备两种温度的解冻水浴(60℃和37℃)，先将冷冻颗粒从液氮中取出，迅速投入处于60℃水浴中的铝盒内，待其即将融化完时，从60℃的水浴中取出铝盒，再放入37℃的水浴中，融化后的精液以备检测。
7)、检测：用常规的方法检测冻后精液的各项指标，而其存活时间是在精子解冻后，将等温的解冻稀释液按1∶1的比例加入到精液中进行稀释，然后放入37℃的水浴中，每间隔2小时检测其活力，直至无活精子为止。
本发明的猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法通过在在颗粒冻精中，以甘油、乙二醇为抗冻剂，并添加不同量的ATP以及改进冷冻保存方法，降低猪精液的冷冻损伤，提高解冻后精子的活力，提高输精后的情期受胎率。
应当理解，上述具体实施方式仅用于描述本发明的技术方案，而不用于限定本发明，本领域技术人员可以从本发明得到技术启示，对其进行各种变型和组合，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)、采精：收集猪浓份精液，选择无异味，色泽乳白色，精子形态正常，活力在0.7以上、密度大于1×109个/毫升的精液；
(2)、配制冷冻保护稀释液：基础液的配方为：葡萄糖8～10g、EDTA 0.1～0.2g、双蒸水100ml；冷冻保护稀释液的配方为：3％甘油、0.5％乙二醇、0.1～0.2mg/ml的ATP、20％的卵黄。
(3)、稀释：将步骤(2)得到的冷冻保护稀释液加热到37℃，并按1∶1的比例加入到步骤(1)得到的精液中，缓缓摇匀使精液稀释；
(4)、平衡：将步骤(3)得到的稀释精液平衡3～4小时，平衡后镜检精子的活力；
(5)、冷冻：在冷冻盒中倒入液氮，待盒上筛网温度降至-135℃时，进行快速滴冻；滴冻完毕后，盖上保温板保温，然后将颗粒直接投入液氮；
(6)、解冻：事先准备两种温度的解冻水浴，先将冷冻颗粒从液氮中取出，迅速投入处于第一种温度水浴中的铝盒内，待其即将融化完时取出铝盒，再放入第二种温度的水浴中，融化后的精液以备检测；
(7)、检测：用常规的方法检测冻后精液的各项指标。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的采精为：收集猪浓份精液，用4层纱布过滤进集精杯后，置于37℃的水浴中，并进行常规品质检查，选择无异味，色泽乳白色，精子形态正常，活力在0.7以上、密度大于1×109个/毫升的精液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)的平衡为：将步骤3得到的稀释精液装入三角瓶中，在三角瓶上塞橡胶塞；将其放入装有37℃水浴的保温水壶中，然后将水壶放入5-7℃的冰箱中，平衡3个半小时，平衡后镜检精子的活力。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)的冷冻为：在钢质冷冻盒中倒入液氮，使液氮面距盒边缘约1cm处，待盒上筛网温度降至-135℃时，进行快速滴冻；滴冻完毕后，盖上保温板保温4-5分钟，然后将颗粒直接投入液氮。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)的解冻为：事先准备两种温度的解冻水浴，第一种温度为55～65℃，第二种温度为37℃，先将冷冻颗粒从液氮中取出，迅速投入处于第一种温度水浴中的铝盒内，待其即将融化完时取出铝盒，再放入第二种温度的水浴中，融化后的精液以备检测。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7的)检测为：用常规的方法检测冻后精液的各项指标，而其存活时间是在精子解冻后，将等温的解冻稀释液按1∶1的比例加入到精液中进行稀释，然后放入37℃的水浴中，每间隔2小时检测其活力，直至无活精子为止。
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