CN103262837A - 一种家畜精液冷冻保护剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种家畜精液冷冻保护剂及其应用，所述冷冻保护剂包括A液和B液，A液包含葡萄糖、乙二胺四乙酸、二水柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、青霉素、链霉素，B液包含果糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、青霉素、链霉素、甘油、DMF、乙二醇、蛋黄。本发明是对现有常用的三种冷冻剂甘油、乙二醇、DMF进行优化组合，实现三种冷冻保护剂最佳的协同配伍效果。筛选出的能够提高家畜精液冷冻保存效果的冷冻保护剂组合，能有效延长家畜精子超低温冷冻保存存活效率以及有利于维持精子顶体完整性，可以在家畜养殖领域广泛推广应用，具有良好的市场效应和社会效应。

Description

一种家畜精液冷冻保护剂及其应用

技术领域

本发明涉及家畜人工授精的改良技术领域，具体涉及一种能够提高家畜冷冻精液品质的冷冻保护剂及其制备方法。

背景技术

精液冷冻保存是指将精液经过特殊处理后置于液氮（-196℃）或干冰（-79℃）中，使得精子的代谢活动状态暂时停止，从而可达到长时间保存该物种种质资源，切实发挥良种公畜的遗传资源的目的。该技术可以大大提高优良公畜的利用率，减少饲养量，节约成本，可直接帮助农牧民增产增收。同时还可以缓解目前国内人畜争粮问题，减少温室气体排放，降低由于退耕还草引起的种植业生产压力。该技术使得优良基因不受时间、地域的限制，是一种能把优秀的遗传资源广泛传播的有效手段。

虽然家畜精液冷冻技术在家畜育种以及种质资源保存等方面都有重要意义，但是家畜的精液冷冻保存技术目前很难推广应用，主要是由于家畜精子本身对温度变化特别敏感，在冷冻过程中极易损伤，从而使家畜冷冻精液生产难度系数加大，解冻后精子复苏率低，导致母畜的受胎率低、窝产仔数少。该技术难题严重制约着家畜品种的改良和育种进程。

发明内容

本发明的目的是针对现有问题与不足，提供一种能有效延长家畜精子超低温冷冻保存存活效率以及有利于维持精子顶体完整性的家畜精液冷冻保护剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种家畜精液冷冻保护剂，包括A液和B液，所述A液每升包含以下物质：40-60g葡萄糖，1-2g乙二胺四乙酸，3-6g二水柠檬酸钠，0.5-3g碳酸氢钠，0.1-0.5g氯化钾，8×10⁵-1.2×10⁶IU青霉素，8×10⁵-1.2×10⁶IU链霉素；所述B液每升包含以下物质：17.5-28g果糖，14-24g三羟甲基氨基甲烷，7-16g柠檬酸，8×10⁵-1.2×10⁶IU青霉素，8×10⁵-1.2×10⁶IU链霉素，1-5%甘油，1-5%DMF，1-5%乙二醇，18-25%蛋黄。

优选地，所述A液每升包含以下物质：50g葡萄糖，1.5g乙二胺四乙酸，4g二水柠檬酸钠，1g碳酸氢钠，0.1g氯化钾，1×10⁶IU青霉素，1×10⁶IU链霉素；所述B液每升包含以下物质：21.9g果糖，18.25g三羟甲基氨基甲烷，10.95g柠檬酸，1×10⁶IU青霉素，1×10⁶IU链霉素，2%甘油，2%DMF，2%乙二醇，20%蛋黄。

本发明的另一个目的是提供一种精液冷冻保护剂在提家畜生产性能上的应用。其包括步骤：

步骤一制备A液：

将40-60g葡萄糖，1-2g乙二胺四乙酸，3-6g二水柠檬酸钠，0.5-3g碳酸氢钠，0.1-0.5g氯化钾，8×10⁵-1.2×10⁶IU青霉素，8×10⁵-1.2×10⁶IU链霉素，加蒸馏水稀释到1L，混匀后消毒。

步骤二制备B液：

将17.5-28g果糖，14-24g三羟甲基氨基甲烷，7-16g柠檬酸，8×10⁵-1.2×10⁶IU青霉素，8×10⁵-1.2×10⁶IU链霉素，1-5%甘油，1-5%DMF，1-5%乙二醇，18-25%蛋黄，加蒸馏水稀释到1L，混匀后消毒。

步骤三冻存精液：

1）收集精子活率在75％以上的精液，离心去上清后加入37℃预热的与精子等体积的A液，放入装有37℃水的烧杯中，置于17℃恒温箱中平衡2h；

2）取出再离心去上清后加入17℃预热的B液，放入装有17℃水的烧杯中，置于4℃冰箱中平衡2h；

3）将平衡好的B精液混合液装入0.25ml冷冻细管中，放入程序降温仪中，从4℃开始，1℃/min，降到-6℃，取出，置于液氮上熏蒸15min，装袋置于液氮罐中冻存。

优选为，步骤一制备A液：

将50g葡萄糖，1.5g乙二胺四乙酸，4g二水柠檬酸钠，1g碳酸氢钠，0.1g氯化钾，1×10⁶IU青霉素，1×10⁶IU链霉素，加蒸馏水稀释到1L，混匀后消毒。

步骤二制备B液：

将21.9g果糖，18.25g三羟甲基氨基甲烷，10.95g柠檬酸，1×10⁶IU青霉素，1×10⁶IU链霉素，2%甘油，2%DMF，2%乙二醇，20%蛋黄，加蒸馏水稀释到1L，混匀后消毒。

步骤三冻存精液：

1）收集精子活率在75％以上的精液，离心去上清后加入37℃预热的与精子等体积的A液，放入装有37℃水的烧杯中，置于17℃恒温箱中平衡2h；

2）取出再离心去上清后加入17℃预热的B液，放入装有17℃水的烧杯中，置于4℃冰箱中平衡2h；

3）将平衡好的B精液混合液装入0.25ml冷冻细管中，放入程序降温仪中，从4℃开始，1℃/min，降到-6℃，取出，置于液氮上熏蒸15min，装袋置于液氮罐中冻存。

上述制备A、B液的步骤中的消毒方式是用0.22μM的微滤膜抽滤。

消毒后的A、B液放置在5℃下贮存备用。

在本发明中，甘油亲水性强，可在水结晶过程中限制和干扰水分子晶格的排列，抑制水形成冰晶，使水处于过冷状态，降低水形成结晶的温度。研究表明家畜的精液对甘油浓度高低特别敏感，本发明通过调整甘油的浓度获得满意的冻后存活率。N,N一二甲基甲酰胺(N，N一Dimethvlformamide，DMF)属于低分子量(73.1)酸胺类化合物，具有甘油的类似特性。乙二醇（EG）是一种常见的防冻剂，加入EG对精子顶体具有一定的保护作用。

本发明将甘油、DMF以及EG作为主要成分进行组合筛选合理配置，并与其他成分进行优化组合，配比后的冷冻保护剂既具有三种冷冻保护剂的优势，如甘油和DMF都能够降低水形成结晶的温度，EG对精子的顶体具有较好的保护作用，又相互互补解决了单独使用时的缺陷，如有的家畜的精液对甘油的浓度比较敏感，在解冻后家畜精子低成活率上获得了良好的效果，解决了猪精液冷冻解冻后存活率低的难题，形成了协同作用。该发明有利于家畜冷冻精液的推广应用，且具有良好的市场价值和社会价值。

具体实施方式：

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

实施例1

步骤一制备A液：

将50g葡萄糖，1.5gEDTA，4g二水柠檬酸钠，1g碳酸氢钠，0.1g氯化钾，1×10⁶IU青霉素，1×10⁶IU链霉素，加蒸馏水稀释到1L，搅拌混匀得到A液。用0.22μM的微滤膜抽滤消毒后，在5℃下贮存，备用。

步骤二制备B液

将21.9g果糖，18.25g三羟甲基氨基甲烷，10.95g柠檬酸，1×10⁶IU青霉素，1×10⁶IU链霉素，2%甘油，2%DMF，2%乙二醇，20%蛋黄，加蒸馏水稀释到1L，搅拌混匀得到B液。用0.22μM的微滤膜抽滤消毒后，在5℃下贮存，备用。

步骤三冻存精液：

选择繁殖力高的大约克种公猪，采用手握法采精。收集精子丰富部分，立即测精液密度和活率，收集精子活率在75％以上的精液约50mL，37℃保温箱2小时内运至实验室。

1）取一定体积的精液放于15ml离心管中，在800g的转速下离心10min，去上清，加入37℃预热的与精子等体积的A液，放入装有37℃水的烧杯中，置于17℃恒温箱中平衡2h；

2）取出上述混合液后，在转速800g的转速下离心10min，去上清；加入等体积17℃预热的B冷冻液，放入装有17℃水的烧杯中，置于4℃冰箱中平衡2h；

3）将平衡好的B精液混合液装入0.25ml冷冻细管中，放入程序降温仪中，从4℃开始，1℃/min，降到-6℃，取出，置于液氮上熏蒸15min，装袋置于液氮罐中冻存。

将按上述过程冷冻保存过的猪精液冷冻管置于37℃水浴锅中30秒解冻，测定精子的密度、显微镜下检测精力活率以及通过植物凝集素-PI染色检测顶体完整性。结果表明：猪精液冷冻解冻后密度为1-1.8亿/ml，活率为0.38-0.44，顶体完整率为43-48%。结果证实，该猪精液冷冻保存液冷冻保存猪精液可有效提高冷冻精子解冻后的存活率。

实施例2

按照实施例1的步骤制备不同主要组成的精液冷冻保护剂，用于比较试验，各试验B液中的甘油、DMF和乙二醇的终浓度如表1所示，其他成分相同。

按照实施例1的方法，将不同配置的精液冷冻保护剂用于猪精液冻存试验，每个配置做三个重复，结果如表2所示。

表1不同实验组B液中的主要成分

组别	甘油	DMF	乙二醇
				实验组1	6%
实验组2		6%
				实验组3			6%
实验组4	3%	3%
				实验组5	2%	4%
实验组6		3%	3%
				实验组7	3%		3%
实验组8	1%	2%	3%
				实验组9	2%	2%	2%
实验组10	3%	2%	1%

表2不同混合比例对猪冷冻精子品质的影响

组别	解冻后活率（%）	顶体完整率（%）
			实验组1	33.56±1.13	36.61±0.75
实验组2	32.92±0.92	35.62±1.19
			实验组3	29.20±1.38	32.89±1.53
实验组4	32.03±1.61	36.54±0.89
			实验组5	34.94±0.89	36.25±0.97
实验组6	29.51±1.73	33.96±1.71
			实验组7	32.28±0.42	35.84±0.44
实验组8	34.95±0.71	36.43±1.19
			实验组9	41.20±1.94	45.71±2.13
实验组10	35.85±0.90	39.16±1.25

经显著性检验，实验组9解冻后活率相对于实验组1～8表现为极显著(p<0.01)，相对于实验组10表现为显著(p<0.05)，实验组10解冻后活率相对于实验组1～4和6～8表现为极显著(p<0.01)，相对于实验组5表现为显著(p<0.05)；实验组9顶体完整率相对于实验组1～8表现为极显著(p<0.01)，相对于实验组10表现为显著(p<0.05)，实验组10解冻后活率相对于实验组1～8表现为显著(p<0.05)。可见，本发明精液冷冻保护剂能够提高精液冷冻保存存活效率以及有利于维持精子顶体完整性。

Claims (5)

1.一种家畜精液冷冻保护剂，其包括A液和B液，

所述A液每升包含以下物质：40-60g葡萄糖，1-2g乙二胺四乙酸，3-6g二水柠檬酸钠，0.5-3g碳酸氢钠，0.1-0.5g氯化钾，8×10⁵-1.2×10⁶IU青霉素，8×10⁵-1.2×10⁶IU链霉素；

所述B液每升包含以下物质：17.5-28g果糖，14-24g三羟甲基氨基甲烷，7-16g柠檬酸，8×10⁵-1.2×10⁶IU青霉素，8×10⁵-1.2×10⁶IU链霉素，1-5%甘油，1-5%DMF，1-5%乙二醇，18-25%蛋黄。

2.根据权利要求1所述的家畜精液冷冻保护剂，其特征在于，所述A液每升包含以下物质：50g葡萄糖，1.5g乙二胺四乙酸，4g二水柠檬酸钠，1g碳酸氢钠，0.1g氯化钾，1×10⁶IU青霉素，1×10⁶IU链霉素。

3.根据权利要求1或2所述的家畜精液冷冻保护剂，其特征在于，所述B液每升包含以下物质：21.9g果糖，18.25g三羟甲基氨基甲烷，10.95g柠檬酸，1×10⁶IU青霉素，1×10⁶IU链霉素，2%甘油，2%DMF，2%乙二醇，20%蛋黄。

4.权利要求1～3任一项所述的家畜精液冷冻保护剂在提高家畜冷冻精液品质上的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）收集精子活率在75％以上的精液，离心去上清后加入37℃预热的与精子等体积的A液，放入装有37℃水的烧杯中，置于17℃恒温箱中平衡2h；

2）取出再离心去上清后加入17℃预热的B液，放入装有17℃水的烧杯中，置于4℃冰箱中平衡2h；

3）装入0.25ml冷冻细管中，放入程序降温仪中，从4℃开始，1℃/min，降到-6℃，取出，置于液氮上熏蒸15min，装袋置于液氮罐中冻存。