CN103766325A - Eg和tcm199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法及使用方法，该EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法包括：牛精液稀释液的配制和牛精液冷冻液的配制；该EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的使用方法包括以下步骤：牛精液稀释液的配制和牛精液冷冻液的配制；采精；初次稀释；二次稀释；冷冻保存。本发明提高了牛冷冻精液的解冻活力，提高了牛人工授精受胎率，降低了牛精液稀释液的粘度、减小牛精液稀释液的颗粒；采用分子量较小，毒性较弱新一代冷冻剂替代分子量大、毒性较强的原冷冻剂；简化了操作，适用于各类规模生产条件使用。

Description

EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制及使用方法

技术领域

本发明属于牛人工授精技术领域，尤其涉及一种EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法及使用方法。

背景技术

牛的繁殖方式包括本交和人工授精，人工授精又分鲜配和冻配，利用细管冻精进行远程和集中实施人工授精是最主要的牛群繁殖方式。因此，细管冻精的质量是确保人工授精受胎率的关键环节。细管冻精的质量受供精公牛健康状况、饲养水平、精液品质、细管冻精制作环节和保存条件的影响，这些环节中除细管冻精制作外都可以进行人工控制，而细管冻精制作环节受冷冻液、冷冻方法的影响较大。常规冷冻液的冷冻保护剂为甘油和卵黄，在应用中存在粘度过大、卵黄脂肪颗粒大而不均匀，影响精子运动速率和受胎率。

近年来的研究表明，在细胞、胚胎冷冻过程中，为了克服低温对细胞、胚胎等微小生命的打击，减少或消除细胞和组织间冰晶的形成，必须在培养液中添加一定量的抗冻剂。以前使用的主要是二甲基亚砜（DMSO）或甘油（GL），但是他们均对细胞或胚胎产生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL强。乙二醇（EG）是近年发现的一种新型抗冻剂，用EG冷冻时，细胞产生的冰晶更少更小；同时发现，EG对细胞的毒副作用较小。在研究新型冷冻保护剂的试验中，已经证明利用EG代替GL可以获得更好的牛精液冷冻效果和解冻效果；TCM199代替部分卵黄后牛精液稀释液的消毒处理更加方便和易于操作，能显著降低牛精液稀释液的污染风险。

现有技术的缺点：

1、牛精液稀释液颗粒大、粘度高。现有技术的牛精液稀释液以卵黄为主，卵黄未处理而直接使用，因卵黄颗粒大，致使稀释精液和冷冻精液中的团状颗粒增加，精子往往围绕团状颗粒聚集和运动，降低了精子的运动速度，减少了游离精子，也减少了向卵子运动的精子的数量。

2、冷冻剂的分子量大，毒性较强。现有技术中使用的冷冻剂为甘油（GL），分子量大，毒性较强，形成的冰晶颗粒较大，对细胞的杀伤力较大。

3、操作技术复杂。现有技术的操作技术过于复杂，只适于工厂化生产，不适合中、小规模使用。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法及使用方法，旨在解决现有的牛精液稀释液颗粒大、粘度高；冷冻剂的分子量大，毒性较强；操作技术复杂的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法，该EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法包括：牛精液稀释液的配制和牛精液冷冻液的配制；

牛精液稀释液的配制方法包括以下步骤：

用电子天平称取TCM199 2克、三羟基氨基甲烷40克、柠檬酸20克、丙酮酸钠0.1克、果糖5克、80万单位青霉素钠1克；

将TCM199、三羟基氨基甲烷、柠檬酸、丙酮酸钠、果糖和80万单位青霉素钠装入1000毫升容量瓶中，加入双蒸水500毫升摇动溶解，待全部固形物溶解后再用双蒸水定容到1000毫升；

将定容好的牛精液稀释液进行过滤分装和标记，分装玻璃瓶必须事先高压灭菌，分装量为100毫升～200毫升；

牛精液冷冻液的配制方法包括以下步骤：

冷冻液分为第一液和第二液，第一液直接稀释鲜精，第二液用于精液平衡；

第一液配制方法：准确抽取牛精液稀释液25毫升，将其注入100ml烧杯中，再抽取精制卵黄5毫升和乙二醇0.5毫升，一并加入盛有25ml牛精液稀释液的烧杯中，用玻璃棒逆时针搅动2分钟，静置备用；

第二液配制方法：准确抽取牛精液稀释液25毫升，将其注入100ml烧杯中，再抽取精制卵黄5毫升和乙二醇2.5毫升，一并加入盛有25ml牛精液稀释液的烧杯中，用玻璃棒逆时针搅动2分钟，静置备用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的使用方法，该EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的的使用方法包括以下步骤：

第一步，首先用电子天平称取TCM199 2克、三羟基氨基甲烷40克、柠檬酸20克、丙酮酸钠0.1克、果糖5克、80万单位青霉素钠1克；将TCM199、三羟基氨基甲烷、柠檬酸、丙酮酸钠、果糖和80万单位青霉素钠装入1000毫升容量瓶中，加入双蒸水500毫升摇动溶解，待全部固形物溶解后再用双蒸水定容到1000毫升；将定容好的牛精液稀释液进行过滤分装，分装玻璃瓶必须事先高压灭菌，分装量为100毫升～200毫升，依使用量和使用频率确定配制牛精液稀释液；

第二步，按照冷冻液分为第一液和第二液，第一液直接稀释鲜精，第二液用于精液平衡；第一液配制方法：牛精液稀释液25毫升、精制卵黄5毫升、乙二醇0.5毫升，第二液配制方法：牛精液稀释液25毫升、精制卵黄5毫升、乙二醇2.5毫升，配制牛精液冷冻液；

第三步，采精，采集健康公牛的新鲜精液；

第四步，初次稀释，将已经预热到35℃的第一液按照采精量2.5倍稀释，保温箱保存或储运1小时～2小时；

第五步，二次稀释，将第二液预热到35℃，加入与初次稀释时第一液同样剂量的第二液到等温的初次稀释精液中，混匀后立即装管制成细管精液，细管精液在4℃冷藏箱平衡1.5小时后进行冷冻保存；

第六步，冷冻保存，将平衡好的细管精液用程序化冷冻仪进行冷冻，冷冻结束后对细管冻精进行抽检，合格产品移入液氮罐中进行保存和使用。

本发明提供的EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法及使用方法，通过将TCM199、乙二醇和丙酮酸钠引入到了牛精液冷冻保存中；EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的标准化生产体系有利于规模化生产和推广应用。本发明通过严格试验测定，改进了牛精液的牛精液稀释液和冷冻保护液及其使用方法，在不影响精液冷冻效果的前提下，显著提高了牛冷冻精液的解冻活力，提高了牛人工授精受胎率，在我国繁殖母牛数量下降的情况下，更具有现实推广应用价值。降低牛精液稀释液的粘度、减小牛精液稀释液的颗粒；采用分子量较小，毒性较弱新一代冷冻剂替代分子量大、毒性较强的原冷冻剂；简化了操作，适用于各类规模生产条件使用。本发明的方法简单，操作方便，显著提高了各种规模的牛精液冷冻的标准化和实用化水平；提高了牛细管冻精的解冻活力，降低了解冻精子的畸形率和提高了牛人工授精的受胎率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的牛精液稀释液的配制方法流程图；

图2是本发明实施例提供的牛精液冷冻液的配制方法流程图；

图3是本发明实施例提供的EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的使用方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例的牛精液稀释液的配制方法包括以下步骤：

S101：用电子天平准确称取TCM199 2克、三羟基氨基甲烷40克、柠檬酸20克、丙酮酸钠0.1克、果糖5克、80万单位青霉素钠1克；

S102：将上述组分装入1000毫升容量瓶中，加入双蒸水500毫升摇动溶解，待全部固形物溶解后再用双蒸水定容到1000毫升；

S103：将定容好的牛精液稀释液进行过滤分装，分装玻璃瓶必须事先高压灭菌，分装量为100毫升～200毫升，依使用量和使用频率确定。

如图2所示，本发明实施例的牛精液冷冻液的配制方法包括以下步骤：

S201：冷冻液分为第一液和第二液，第一液直接稀释鲜精，第二液用于精液平衡；第一液配制方法：牛精液稀释液25毫升、精制卵黄5毫升、乙二醇0.5毫升；

S202：第二液配制方法：牛精液稀释液25毫升、精制卵黄5毫升、乙二醇2.5毫升。

如图3所示，本发明实施例的EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的使用方法包括以下步骤：

S301：配制EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液；

S302：采精，采集健康公牛的新鲜精液；

S303：初次稀释，将已经预热到35℃的第一液按照采精量2.5倍稀释，保温箱保存或储运1小时～2小时；

S304：二次稀释，将第二液预热到35℃，加入与初次稀释时第一液同样剂量的第二液到等温的初次稀释精液中，混匀后立即装管制成细管精液，细管精液在4℃冷藏箱平衡1.5小时后进行冷冻保存。

S305：冷冻保存，将平衡好的细管精液用程序化冷冻仪进行冷冻，冷冻结束后对细管冻精进行抽检，合格产品移入液氮罐中进行保存和使用。

具体方法为：

第一步，首先用电子天平称取TCM199 2克、三羟基氨基甲烷40克、柠檬酸20克、丙酮酸钠0.1克、果糖5克、80万单位青霉素钠1克；将TCM199、三羟基氨基甲烷、柠檬酸、丙酮酸钠、果糖和80万单位青霉素钠装入1000毫升容量瓶中，加入双蒸水500毫升摇动溶解，待全部固形物溶解后再用双蒸水定容到1000毫升；将定容好的牛精液稀释液进行过滤分装，分装玻璃瓶必须事先高压灭菌，分装量为100毫升～200毫升，依使用量和使用频率确定配制牛精液稀释液；

第二步，按照冷冻液分为第一液和第二液，第一液直接稀释鲜精，第二液用于精液平衡；第一液配制方法：牛精液稀释液25毫升、精制卵黄5毫升、乙二醇0.5毫升，第二液配制方法：牛精液稀释液25毫升、精制卵黄5毫升、乙二醇2.5毫升，配制牛精液冷冻液；

第三步，采精，采集健康公牛的新鲜精液；

第四步，初次稀释，将已经预热到35℃的第一液按照采精量2.5倍稀释，保温箱保存或储运1小时～2小时；

第五步，二次稀释，将第二液预热到35℃，加入与初次稀释时第一液同样剂量的第二液到等温的初次稀释精液中，混匀后立即装管制成细管精液，细管精液在4℃冷藏箱平衡1.5小时后进行冷冻保存；

第六步，冷冻保存，将平衡好的细管精液用程序化冷冻仪进行冷冻，冷冻结束后对细管冻精进行抽检，合格产品移入液氮罐中进行保存和使用。

结合以下具体实施例对本发明的使用效果做补充说明：

依据本发明生产的牛细管冻精在甘肃省平凉市和庆阳市进行了推广应用。其中细管冻精的精子复苏率为62.85%，解冻活力为52.96%，顶体完整率为80.46%；累计推广细管冻精99000枚，平均情期受胎率达到78.70%，平均产犊率达到95.84%，均显著高于其它类型的牛细管冻精的应用效果。

本发明显著提高了各种规模的牛精液冷冻的标准化和实用化水平；提高了牛细管冻精的解冻活力，降低了解冻精子的畸形率和提高了牛人工授精的受胎率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法，其特征在于，该EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的配制方法包括：牛精液稀释液的配制和牛精液冷冻液的配制；

牛精液稀释液的配制方法包括以下步骤：

用电子天平称取TCM199 2克、三羟基氨基甲烷40克、柠檬酸20克、丙酮酸钠0.1克、果糖5克、80万单位青霉素钠1克；

将TCM199、三羟基氨基甲烷、柠檬酸、丙酮酸钠、果糖和80万单位青霉素钠装入1000毫升容量瓶中，加入双蒸水500毫升摇动溶解，待全部固形物溶解后再用双蒸水定容到1000毫升；

将定容好的牛精液稀释液进行过滤分装和标记，分装玻璃瓶必须事先高压灭菌，分装量为100毫升～200毫升；

牛精液冷冻液的配制方法包括以下步骤：

冷冻液分为第一液和第二液，第一液直接稀释鲜精，第二液用于精液平衡；

第一液配制方法：准确抽取牛精液稀释液25毫升，将其注入100ml烧杯中，再抽取精制卵黄5毫升和乙二醇0.5毫升，一并加入盛有25ml牛精液稀释液的烧杯中，用玻璃棒逆时针搅动2分钟，静置备用；

第二液配制方法：准确抽取牛精液稀释液25毫升，将其注入100ml烧杯中，再抽取精制卵黄5毫升和乙二醇2.5毫升，一并加入盛有25ml牛精液稀释液的烧杯中，用玻璃棒逆时针搅动2分钟，静置备用。

2.一种EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的使用方法，其特征在于，该EG和TCM199作为牛精液稀释液和冷冻液的的使用方法包括以下步骤：

第一步，首先用电子天平称取TCM199 2克、三羟基氨基甲烷40克、柠檬酸20克、丙酮酸钠0.1克、果糖5克、80万单位青霉素钠1克；将TCM199、三羟基氨基甲烷、柠檬酸、丙酮酸钠、果糖和80万单位青霉素钠装入1000毫升容量瓶中，加入双蒸水500毫升摇动溶解，待全部固形物溶解后再用双蒸水定容到1000毫升；将定容好的牛精液稀释液进行过滤分装，分装玻璃瓶必须事先高压灭菌，分装量为100毫升～200毫升，依使用量和使用频率确定配制牛精液稀释液；

第二步，按照冷冻液分为第一液和第二液，第一液直接稀释鲜精，第二液用于精液平衡；第一液配制方法：牛精液稀释液25毫升、精制卵黄5毫升、乙二醇0.5毫升，第二液配制方法：牛精液稀释液25毫升、精制卵黄5毫升、乙二醇2.5毫升，配制牛精液冷冻液；

第三步，采精，采集健康公牛的新鲜精液；

第四步，初次稀释，将已经预热到35℃的第一液按照采精量2.5倍稀释，保温箱保存或储运1小时～2小时；

第五步，二次稀释，将第二液预热到35℃，加入与初次稀释时第一液同样剂量的第二液到等温的初次稀释精液中，混匀后立即装管制成细管精液，细管精液在4℃冷藏箱平衡1.5小时后进行冷冻保存；

第六步，冷冻保存，将平衡好的细管精液用程序化冷冻仪进行冷冻，冷冻结束后对细管冻精进行抽检，合格产品移入液氮罐中进行保存和使用。

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