CN100359003C - 公牛分离精子的冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物工程技术领域，提供了一种适用于公牛分离X和Y精子的冷冻保存方法。发明采用TRIS作为缓冲溶液体系，主要包括A液和B液两部分，特别例添加了有利于保持分离精子活力的成分，专门适用于分离公牛精子的冷冻保存。通过对分离精子接收、离心浓缩、平衡以及程序降温冷冻等一系过程，在保证分离精子活力能够满足人工授精和体外受精的同时，实现分离精子在-196℃的液氮中长期保存或远距离运输，并适用于商业化生产和推广。

Description

公牛分离精子的冷冻保存方法
技术领域
本发明属生物工程技术领域，特别涉及低温生物学的方法。
背景技术
哺乳动物个体的性别在精子和卵子结合受精时由不同的染色体重新分配和组合所决定。性别的遗传基础是依赖于精子细胞的表型，若携带X染色体的精子与卵子结合，受精卵的染色体组合为XX，后代则发育为雌性；若携带Y染色体的精子与卵子结合，受精卵的染色体组合为XY，后代则发育为雄性。用分离的X或Y精子给母畜人工授精或与卵母细胞体外受精，在受精之前便可预知后代的的性别，从而达到性别控制的目的。以奶牛为例，奶牛农场主希望从其优质高产的核心群中繁殖出更多的小母牛，以增加或更新其奶牛群，通过用X精子授精就可以达到这一目的。同样，肉用牛农场主则希望通过用Y精子授精繁殖出更多的小公牛，因为牛的生长速度和肉的品质与性别有关，公牛生长速度比母牛快，而且阉公牛肉的价格较高。在品种繁育方面，如果通过性别控制产下后代的准确率在90％以上，繁育畜群数量和性状改良的速度将比无性别控制的大大提高，从而可以节省大量的时间、精力和费用。
目前，流式细胞仪法分离公牛精子的关键技术已经解决，并且已经通过人工授精和体外受精等技术产下了预知性别的动物后代。然而，这项成果要想得到大范围的产业化推广，所分离的精子必须能够长期保存和长途运输，在任何偏远的牛场或牧区都可以方便应用，精子的低温冷冻保存技术就是辅助推广分离精子的关键。本发明的目的是通过冷冻保存分离精子，实现在-196℃的液氮中长期保存或远距离运输，使得分离精子能广泛应用于当中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种适用于公牛分离X和Y精子的冷冻保存方法，保证经过性别分离的精子活力能够满足人工授精和体外受精的同时，实现分离精子在-196℃的液氮中长期保存或远距离运输，并适用于商业化生产和推广。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题：
a)收集精子
按照目前已经成熟的流式细胞仪分离精子技术对采集的精子进行染色分离，接收分离精子的试管预先加入1～5ml的A液，接收分离精子后成为含有X或Y精子的溶液，其最终含有2％～6％的卵黄。
为使分离下来的精子保持活力，A液中含有2.0～3.0％的TRIS(三羟甲基氨基甲烷)、1.0～2.0％的单水柠檬酸、0.8～1.2％果糖和15.0～25.0％的卵黄。
b)低温平衡
将步骤a)最终得到的分离精液移到5℃平衡，平衡时间2～6小时；
c)离心浓缩
离心机预冷到5℃，将步骤b)中平衡后的分离精液在3000～5000转/分钟(288～800g)速度下离心20分钟；离心结束后，弃去上清，留下100～200微升精子沉淀；将同一头公牛4小时内分离得到各个批次的精子沉淀汇合；
d)甘油平衡
预先5℃恒温B液，按照体积1∶1与步骤c)得到的精液沉淀混合，摇匀并平衡10～15分钟。
为使冷冻解冻后的分离精子保持活力，B液中含有3.0～3.5％的TRIS(三羟甲基氨基甲烷)、1.0～2.0％的单水柠檬酸、1.2～1.4％果糖、15.0～25.0％的卵黄和10.0～14.0％甘油。
e)细管分装
在0.25ml的细管上标记好公牛号、日期、精子类型(X或Y)，移入5℃恒温预冷；将步骤d)得到的精液分装到0.25ml细管中并封口；
f)程序降温
准备好程序冷冻仪，注入液氮并将起始温度设定在5℃，移入步骤e)所获的精液细管。开启程序降温冷冻，以6℃/分钟的速度降温到-10℃，恒温停留2分钟，然后再以6℃/分钟的速度降温，达到-80℃终止时，将细管投入液氮长期保存。
本发明特点
本发明的主要特点在于：
(1)本发明方法采用TRIS作为缓冲溶液体系，主要包括A液和B液两部分，二者相辅相成，特别添加了有利于保持分离精子活力的成分，专门适用于分离公牛精子的冷冻保存。
(2)以往通过常规的方法冷冻新鲜采集精液时，均是用含有卵黄的稀释液先将精液进行稀释，而后再进行冷冻；在本发明中，用流式细胞仪分离X或Y精子时，精子受到高度稀释，因而必须先离心浓缩精液，然后再加入含甘油的B液继续冷冻。
具体实施方式
实施例一：冷冻荷斯坦公牛的分离精子
a)收集精子：按常规流式细胞仪法分离荷斯坦公牛精子，接收分离精子的试管预先加入2ml的含20％卵黄的A液，接受分离精子后总体积为10ml，最终含有4.0％的卵黄；
A液的配方为：
试剂药品 质量或体积
TRIS(三羟甲基氨基甲烷) 2.792g
单水柠檬酸 1.360g
果糖 1.000g
太乐菌素100μg/ml(储存液) 0.480ml
林肯-壮观霉素300/600μg/ml(储存液) 0.480ml
庆大霉素500μg/l(储存液) 0.640ml
卵黄 20.000ml
加去离子水至100ml。
b)低温平衡：将步骤a)得到的溶液移到5℃平衡，平衡时间4小时；
c)离心浓缩：平衡结束后，步骤b)得到的溶液在5℃、3000转/分钟速度下离心20分钟；离心结束后弃去上清，留下100～200微升的沉淀，混匀；
d)甘油平衡：5℃恒温的B液按照体积1∶1与步骤c)得到的精子沉淀混合，平衡15分钟；
B液的配方：
试剂药品 质量或体积
TRIS(三羟甲基氨基甲烷) 3.146g
单水柠檬酸 1.744g
果糖 1.293g
太乐菌素100μg/ml(储存液) 0.011ml
林肯-壮观霉素300/600g/ml(储存液) 0.011ml
庆大霉素500μg/ml(储存液) 0.011ml
卵黄 20.310ml
甘油 12.000ml
加去离子水至100ml。
e)细管分装：在0.25ml的细管上标记好公牛号、日期、精子类型(X或Y)，移入5℃恒温；将步骤d)得到的精液分装到0.25ml细管中并封口；
f)程序降温：用程序冷冻仪将步骤e)所获的细管精液降温，达到-80℃终止时，将细管投入液氮长期保存。
本实施例中，对来自广西大学牧场的荷斯坦公牛J03001、PT01003在连续的两个月中分别进行了11次分离冷冻实验，解冻后具有直线运动的精子活率分别为0.41±0.026和0.39±0.019。
实施例二：冷冻水牛的分离精子
a)收集精子：按常规流式细胞仪法分离水牛精子，接收分离精子的试管预先加入1.0ml的含22％卵黄的A液，接受分离精子后总体积为10ml，最终含有2.2％的卵黄；
A液的配方为：
试剂药品 质量或体积
TRIS(三羟甲基氨基甲烷) 2.562g
单水柠檬酸 1.579g
果糖 1.100g
太乐菌素100μg/ml(储存液) 0480ml
林肯-壮观霉素300/600μg/ml(储存液) 0.480ml
庆大霉素500μg/ml(储存液) 0.640ml
卵黄 22ml
加去离子水至100ml。
b)低温平衡：将步骤a)得到的溶液移到5℃平衡，平衡时间4小时；
c)离心浓缩：平衡结束后，步骤b)得到的溶液在5℃、3000转/分钟速度下离心20分钟；离心结束后弃去上清，留下100～200微升的沉淀，混匀；
d)甘油平衡：5℃恒温的B液按照体积1∶1与步骤c)得到的精子沉淀混合，平衡15分钟；
B液的配方：
试剂药品 质量或体积
TRIS(三羟甲基氨基甲烷) 3.225g
单水柠檬酸 1.900g
果糖 1.357g
太乐菌素100μg/ml(储存液) 0.011ml
林肯-壮观霉素300/600g/ml(储存液) 0.011ml
庆大霉素500μg/ml(储存液) 0.011ml
卵黄 22.470ml
甘油 11.000ml
加去离子水至100ml。
e)细管分装：在0.25ml的细管上标记好公牛号、日期、精子类型(X或Y)，移入5℃恒温；将步骤d)得到的精液分装到0.25ml细管中并封口；
f)程序降温：用程序冷冻仪将步骤e)所获的细管精液降温，达到-80℃终止时，将细管投入液氮长期保存。
本实施例中，对来自广西畜禽品种改良站的摩拉水牛ML811和尼里水牛NL440的精液在连续的两个月中分别进行了7次和9次分离冷冻实验，解冻后具有直线运动的精子活率分别为0.35±0.035和0.36±0.022。

Claims (1)

1、一种适用于公牛分离X和Y精子的冷冻保存方法，保证经过冷冻保存的分离精子活力能够满足人工授精和体外受精的同时，实现分离精子在-196℃的液氮中长期保存或远距离运输，其特征是：
a)冷冻溶液系统包括A液和B液两部分：
A液和B液均用去离子蒸馏水配制，A液含有2.0～3.0％的TRIS、1.0～2.0％的单水柠檬酸、0.8～1.2％果糖和15.0～25.0％的卵黄以及0.48μg/ml太乐菌素、1.44μg/ml林肯霉素、2.88μg/ml壮观霉素、3.20μg/ml庆大霉素，B液含有3.0～3.5％的TRIS、1.0～2.0％的单水柠檬酸、1.2～1.4％果糖、15.0～25.0％的卵黄和10.0～14.0％甘油以及0.011μg/ml太乐菌素、0.033g/ml林肯霉素、0.066g/ml壮观霉素、0.055μg/ml庆大霉素；
b)精子收集：
按照目前已经成熟的流式细胞仪分离X和Y精子技术对采集的精子进行染色分离，接收分离精子的试管预先加入1～5ml的A液，接收分离精子后成为含有X或Y精子的溶液，其最终含有2％～6％的卵黄；
c)低温平衡：
将步骤b)最终得到的分离精液移到5℃平衡，平衡时间2～6小时；
d)离心浓缩：
步骤c)中平衡后的分离精液在5℃、3000～5000转/分钟速度下离心20分钟；离心结束后，弃去上清，留下100～200微升精子沉淀；将同一头公牛4小时内分离得到各个批次的精子沉淀汇合；
e)甘油平衡：
预先5℃恒温B液，按照体积1∶1与步骤d)得到的精液沉淀混合，摇匀并平衡10～15分钟；
f)细管分装：
在0.25ml的细管上标记好公牛号、日期、精子类型，移入5℃恒温预冷；将步骤e)得到的精液分装到0.25ml细管中并封口；
g)程序降温：
准备好程序冷冻仪，注入液氮并将起始温度设定在5℃，移入步骤f)所获的精液细管。开启程序降温冷冻，以6℃/分钟的速度降温到-10℃，恒温停留2分钟，然后再以6℃/分钟的速度降温，达到-80℃终止时，将细管投入液氮长期保存。
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