CN101810163A - 一种食蟹猴精液冷冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食蟹猴精液冷冻方法。该方法要求精液样品新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：1)食蟹猴精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制；2)精液稀释；3)精液分装；4)精液平衡；5)精液冷冻；6)冷冻精液的解冻。本发明的优点是：利用本发明技术，食蟹猴精液冷冻解冻中，精子冷冻解冻后活率和复苏率分别达到45％和62％，可以充分发挥优良雄性食蟹猴的繁殖效率，也可以保存优良食蟹猴的遗传基因，同时为其他珍惜濒危灵长类动物精子冷冻保存研究提供经验借鉴。

Description

一种食蟹猴精液冷冻方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体是一种食蟹猴精液冷冻方法。

背景技术

至今并未发现有与本发明相同或相似的报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种食蟹猴精液冷冻方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种食蟹猴精液冷冻方法，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：

1.食蟹猴精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制

1)冷冻稀释液配方

冷冻稀释液由葡萄糖111.0mmol/L、TES 52.3mmol/L、Tris 16.5mmol/L、蔗糖5.8mmol/L、乳糖58.4mmol/L、体积浓度为20％的卵黄、体积浓度为5％的甘油、青霉素10 000 0IU和硫酸链霉素50000IU组成；

2)稀释液的配制

准确称量1)配方的药品至事先经过灭菌过的平底烧瓶中；准备新鲜鸡蛋1～2只，鸡蛋壳、镊子、手先用75％的酒精消毒，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋气室面，倒掉蛋清，抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心，按体积浓度为20％抽取卵黄上清液放到平底烧瓶中；最后用去离子水定容1L，混匀后用NaOH或HCl调节稀释液pH至7.0～7.2，置于4℃冰箱中待用；

2.精液稀释

1)精液一次稀释

食蟹猴精液一经采出来后，马上用不含甘油的稀释液作10～20倍的稀释，然后快速将精液运送回实验室；

2)精液二次稀释

一次稀释好的精液送回实验室后，一边轻轻地摇晃精液一边缓慢的滴进甘油，使最终甘油浓度为5％(v/v)，稀释后的精子活力不应低于0.70；

3.精液分装

取出麦管，放在紫外线下照射15min消毒，用专用的精液分装器把稀释好的精液吸到麦管中，不要吸得太满，预留0.5～1.0cm长的空气段，吸好后用酒精灯封口；

4.精液平衡

把分装好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡0.5h；

5.精液冷冻

打开冷冻程序仪，设定冷冻程序：4℃～2℃，-1℃/min；2℃～2℃，5min；2℃～-90℃，-8℃/min；把液氮慢慢倒进冷冻程序仪液氮瓶中，运行程序，当运行到5℃时，投入平衡好的精液麦管，让冷冻程序自动运行；当程序运行结束后马上投入液氮中，在-196℃条件下贮存；

6.冷冻精液的解冻

打开恒温水浴锅，把温度升至37℃，把冷冻麦管投入轻轻搅拌解冻，解冻复苏后，取少量精液检查精子的活力，重复检查两次结果取平均值。

本发明的优点是：利用本发明技术，食蟹猴精液冷冻解冻中，精子冷冻解冻后活率和复苏率分别达到45％和62％，可以充分发挥优良雄性食蟹猴的繁殖效率，也可以保存优良食蟹猴的遗传基因，同时为其他珍惜濒危灵长类动物精子冷冻保存研究提供经验借鉴。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例

1.精子冷冻保存与解冻复苏

稀释后的新鲜精液经过精子图像分析仪分析，检出精子活力≥70％的新鲜精液用于本研究。合格的新鲜精液用0.25ml麦管分装后放入4℃冰箱中平衡不同时间。用程序降温仪降温，结束后马上投入液氮中(-196℃)贮存。解冻时将麦管从液氮中迅速取出，直接投入37℃水浴中迅速搅动使精子解冻复苏。

2.精子功能的检测

1)精子运动度的检测新鲜精液稀释后以及解冻复苏后，取5μl精液置于37℃预热的Makler精子计数板上，利用精子图像分析仪(CASA)检查精子的活力，重复检查2次，结果取平均值。

2)精子质膜完整性的检测

伊红Y水实验法：10μl精液与40μl 1g/L伊红Y水溶液于载玻片上混匀，覆盖玻片，静置1～2min，显微镜下(×400)观察精子肿胀弯曲情况，计数200个精子，算出肿胀弯曲率。

计算公式：肿胀弯曲率(％)＝(弯曲肿胀精子数/总精子)×100％。

3)精子顶体完整率检查

用考马斯亮蓝R250染色液对精子进行染色。精子悬液离心(1500r/min5min)，沉淀以4％甲醛PBS溶液悬浮固定10min，离心去上清，PBS洗涤2次；适量PBS悬浮沉淀，吸取20μl精子悬液涂片、晾干(或电吹风吹干)，精子涂片用0.05％考马斯亮蓝(CBB)染色液滴玻片或入染色缸中浸染30min，三蒸水冲洗玻片，晾干，中性树脂封片。将制备好的涂片在显微镜(1000倍油镜)下观察。每份样品制作2个涂片，每个涂片观察200个以上的精子(分左、右二个区)，取2片的平均值，2片的变异系数不得大于20％，若超过应重新制片。

4)畸形精子检查

畸形率是指异常精子的百分率，固定及染色方法同(2.3)。精子畸形率(％)＝(畸形精子数P精子总数)×100％。其中畸形精子种类有：巨型精子、短小精子、双头或双尾精子、精子头部残缺或与尾部分离、尾部变曲等。

3.实验设计

实验一：在稀释液中加入5％甘油，冷冻前平衡不同时间(30、60、90、120min)。

实验二：根据实验一的结果，在稀释液中加入不同浓度(3％、5％、7％、11％)甘油，冷冻前平衡30min。

4.统计分析

所得数据进行反正弦转换，利用SAS 6.12版的一般线形模型Duncan’s多重比较进行分析。

5.结果与分析

1)不同平衡时间对食蟹猴精液冷冻效果的影响实验重复10次，结果见表1，可以看出，平衡时间为30min组的精子解冻后活力(42.10％±8.46％)明显高于90min、120min组(30.60％±14.07％、27.89％±8.39％)，差异显著(P＜0105)。平衡30min的精子复苏率(57.97％±9.96％)也显著高于(P＜0.05)90min、120min组的精子复苏率(42.13％±18.84％、38.54％±13.65％)。平衡30min组的精子解冻后活力、复苏率均比平衡60min组的(33.60％±11.04％、36.35％±14.39％)好。各平衡时间组精子的膜完整率、顶体完整率、畸形率差异不显著。结果显示，食蟹猴精液平衡30min后进行冷冻，冻后效果最好。

表1不同平衡时间对食蟹猴精液冷冻效果的影响

同一列数据上标不同字母表示差异显著(a、b：P＜0.05)。

2)不同甘油浓度对食蟹猴精液冷冻效果的影响

实验重复10次，结果如表2所示，甘油浓度为3％、5％时，解冻后精子活力(45.47％±15.47％、45.97％±10.54％)显著高于11％组(31.40％±16.58％)，差异显著(P＜0.05)。

表2不同甘油浓度对食蟹猴精液冷冻效果的影响

同一列数据上标不同字母表示差异显著(a、b：P＜0105)。

甘油浓度为3％、5％时的精子复苏率(61.91％±20.15％、62.50％±13.93％)也显著高于(P＜0.05)11％组的精子复苏率(42.53％±22.39％)。3％、5％组的精子冷冻后活力、复苏率均比7％组的(41.13％±13.82％、56.14％±18.70％)要好，但差异并不显著(P＞0105)。各甘油浓度组间的畸形率、顶体完整率、精子膜完整率差异不显著，实验结果显示，甘油浓度为3％、5％时对食蟹猴精液冷冻效果最好。

Claims (1)

1.一种食蟹猴精液冷冻方法，其特征在于，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：

1)食蟹猴精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制

1.1)冷冻稀释液配方

冷冻稀释液由葡萄糖111.0mmol/L、TES 52.3mmol/L、Tris 16.5mmol/L、蔗糖5.8mmol/L、乳糖58.4mmol/L、体积浓度为20％的卵黄、体积浓度为5％的甘油、青霉素100000IU和硫酸链霉素50000IU组成；

1.2)稀释液的配制

准确称量1.1)配方的药品至事先经过灭菌过的平底烧瓶中；准备新鲜鸡蛋1～2只，鸡蛋壳、镊子、手先用75％的酒精消毒，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋气室面，倒掉蛋清，抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心，按体积浓度为20％抽取卵黄上清液放到平底烧瓶中；最后用去离子水定容1L，混匀后用NaOH或HCl调节稀释液pH至7.0～7.2，置于4℃冰箱中待用；

2)精液稀释

2.1)精液一次稀释

食蟹猴精液一经采出来后，马上用不含甘油的稀释液作10～20倍的稀释，然后快速将精液运送回实验室；

2.2)精液二次稀释

一次稀释好的精液送回实验室后，一边轻轻地摇晃精液一边缓慢的滴进甘油，使最终甘油浓度为5％(v/v)，稀释后的精子活力不应低于0.70；

3)精液分装

取出麦管，放在紫外线下照射15min消毒，用专用的精液分装器把稀释好的精液吸到麦管中，不要吸得太满，预留0.5～1.0cm长的空气段，吸好后用酒精灯封口；

4)精液平衡

把分装好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡0.5h；

5)精液冷冻

打开冷冻程序仪，设定冷冻程序：4℃～2℃，-1℃/min；2℃～2℃，5min；2℃～-90℃，-8℃/min；把液氮慢慢倒进冷冻程序仪液氮瓶中，运行程序，当运行到5℃时，投入平衡好的精液麦管，让冷冻程序自动运行；当程序运行结束后马上投入液氮中，在-196℃条件下贮存；

6)冷冻精液的解冻

打开恒温水浴锅，把温度升至37℃，把冷冻麦管投入轻轻搅拌解冻，解冻复苏后，取少量精液检查精子的活力，重复检查两次结果取平均值。