CN106106433B - 一种槟榔江水牛精液冷冻工艺方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及槟榔江水牛精液冷冻工艺方法领域，公开了槟榔江水牛精液制作时的一条冷冻曲线，包括下述步骤：(1)步骤一：精液的采集；(2)步骤二：精液的稀释；(3)步骤三：精液的分装与平衡；(4)步骤四：精液的冷冻；(5)步骤五：冷冻精液的解冻和镜检。该槟榔江水牛精液冷冻工艺方法的目的在于制作出一条冷冻曲线，在后期冷冻过程中，根据本曲线试验找出该品种槟榔江水牛精子在冷冻过程中不同阶段最适合的冷冻降温速率和危险温度区间，最终将其科研成果运用到生产实践中，提高生产质量和生产效率；且得出曲线V能明显提高该槟榔江水牛品种的冻后活力和降低畸形率，有效提高牛冻精生产质量和生产效率。

Description

一种槟榔江水牛精液冷冻工艺方法
技术领域
本发明涉及槟榔江水牛精液冷冻工艺技术领域，具体涉及一种槟榔江水牛精液冷冻制作时的工艺方法。
背景技术
目前中国的牛冷冻精液生产工艺是参照中华人民共和国牛冷冻精液生产技术规程(行标)施行，其冷冻精液精子的复苏率与原精的质量、稀释液的种类、稀释方法、封装温度控制及精液冷冻温度和解冻温度等因素有关。其中，精液在冷冻过程中的温度变化曲线是影响精子冷冻质量的重要因素之一，现在国内牛冷冻精液生产多采用冷冻仪器设备厂家提供的冷冻温度曲线，基本上是一条冷冻曲线用于各种品种牛的冷冻精液生产上，缺乏针对不同品种牛的专用冷冻曲线，尤其对槟榔江水牛精液冷冻曲线研究更是稀少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种槟榔江水牛精液冷冻工艺方法，我们将通过21次重复试验，每次按五组不同冷冻曲线实施冷冻，再对每组试验精子冻后的复苏率(活力、畸形率和顶体完整率)结果进行统计分析，运用统计分析原理找出精子冻后复苏率显著提高的一组，根据相对应的曲线判断出一条针对于槟榔江水牛的最佳冷冻曲线。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
上述一种槟榔江水牛精液冷冻工艺方法，具体流程为：先通过人工的方法采集槟榔江水牛精液，然后对槟榔江水牛精液进行稀释，分成五份用来实验，采用五种冷冻曲线进行冷冻，最后对冷冻的槟榔江水牛精液进行解冻和镜检。
一种槟榔江水牛精液冷冻工艺方法，包括有精液的采集、精液的稀释、精液的分装与平衡、精液的冷冻、冷冻精液的解冻和镜检，其步骤如下：
步骤一、精液的采集：先用假阴道采集公牛的精液，通过显微镜检测原精活力在0.6以上，密度在6亿以上方可进行稀释；
步骤二、精液的稀释：通过精子密度仪测量原精的密度和稀释量，使用自配的卵黄稀释液作为本次实验稀释液，放置32～34℃水浴锅中备用，按测量的稀释量进行一次稀释，稀释时应沿三角瓶的边沿缓慢倾倒；
步骤三、精液的分装与平衡：再将稀释后的精液放于32～34℃水浴中暂存10min后，在20℃室温下封装到0.25ml细管中，将封装好的精液细管分成五份，分别水平摆放在齿状冷冻架上，然后放在4℃低温平衡柜中3-4h；
其特征在于:所述还包括步骤四、精液的冷冻；所述先将平衡好的精液用下述五种冷冻曲线进行冷冻，初冻温度和冷冻结束温度均是4℃和-140℃；
五条冷冻曲线如下：
曲线Ⅰ:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-100℃,40℃/min；-100℃到-140℃，速率20℃/min；
曲线II:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-140℃,40℃/min；
曲线III:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-140℃,20℃/min；
曲线IV:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-40℃,40℃/min；-40℃到-140℃，速率20℃/min；
曲线V:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-60℃,40℃/min；-60℃到-140℃，速率20℃/min；
(5)步骤五、冷冻精液的解冻和镜检：所述最后将实验样本分别取三支置于37℃水浴锅中解冻，解冻后推入试管中混合均匀，用移液器吸取10微升滴于载玻片上加盖玻片，在38℃载物台上用200倍显微镜观察精子活力，每个样片取三个视野，三个视野活力的平均值即为该样本的活力。
优选的，所述五种冷冻曲线分别进行21个重复试验，通过外部SPSS软件包等数据处理软件进行分析和多重比较，得出第V条曲线组槟榔江水牛精液冷冻、解冻后，精子活力显著高于其它4条曲线组(P<0.05)，第Ⅰ、II、III、IV条曲线组之间精子活力无明显差异(P>0.05)。
优选的，所述第V条曲线组的精子畸形率与第Ⅰ条和第II条曲线组均存在显著差异(P<0.05)；在槟榔江水牛精子顶体完整率方面，所述五种冷冻曲线之间没有显著不同(P>0.05)；所述曲线V能明显提高该槟榔江水牛品种的冻后活力和降低畸形率，有效提高牛冻精生产质量和生产效率。
五条曲线对应的具体情况如下表所示：
曲线 重复 活力(％) 畸形率(％) 顶体完整率(％)
Ⅰ 21 31.33±2.40a 13.31±3.80a 95.01±2.61
II 21 29.10±2.89a 13.53±3.32a 96.17±2.28
III 21 28.98±4.73a 12.12±3.67 96.18±2.22
IV 21 30.79±4.91a 12.16±2.74 95.34±2.21
V 21 34.03±4.48b 10.64±5.32b 95.88±1.92
注：同一列中，不相同小写字母表示在P<0.05水平差异显著，相同小写字母或没有小写字母表示差异不显著(P>0.05)。
采用上述技术方案后，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：该槟榔江水牛精液冷冻工艺方法的目的在于制作出一条冷冻曲线，在后期冷冻过程中，根据本曲线试验找出该品种槟榔江水牛精子在冷冻过程中不同阶段最适合的冷冻降温速率和危险温度区间，最终将其科研成果运用到生产实践中，提高生产质量和生产效率。按本发明提出的曲线冷冻保存的精液，解冻后精子的存活率有效提高，增加年产精液量，显著提高了精液品质。
附图说明
图1为本发明的五条冷冻曲线图
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例，对本发明的具体实施例做进一步详细描述：
一种槟榔江水牛精液冷冻工艺方法，包括有精液的采集、精液的稀释、精液的分装与平衡、精液的冷冻、冷冻精液的解冻和镜检，其步骤如下：
步骤一、精液的采集：假阴道采集公牛的精液，通过显微镜检测原精活力在0.6以上，密度在6亿以上方可进行稀释；
步骤二、精液的稀释：通过精子密度仪测量原精的密度和稀释量，使用自配的卵黄稀释液作为本次实验稀释液，放置32～34℃水浴锅中备用，按测量的稀释量进行一次稀释，稀释时应沿三角瓶的边沿缓慢倾倒；
步骤三、精液的分装与平衡：将稀释后的精液放于32～34℃水浴中暂存10min后，在20℃室温下封装到0.25ml细管中，将封装好的精液细管分成五份，分别水平摆放在齿状冷冻架上，然后放在4℃低温平衡柜中3-4h；
步骤四、精液的冷冻：将平衡好的精液用下述五种冷冻曲线进行冷冻，初冻温度和冷冻结束温度均是4℃和-140℃；
五条冷冻曲线如下：
曲线Ⅰ:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-100℃,40℃/min；-100℃到-140℃，速率20℃/min；
曲线II:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-140℃,40℃/min；
曲线III:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-140℃,20℃/min；
曲线IV:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-40℃,40℃/min；-40℃到-140℃，速率20℃/min；
曲线V:4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-60℃,40℃/min；-60℃到-140℃，速率20℃/min；
请参阅图1，X轴为Time in mn，Y轴为℃in degree。具体每条曲线对应的XY关系如下：
步骤五、冷冻精液的解冻和镜检：最后将实验样本分别取三支置于37℃水浴锅中解冻，解冻后推入试管中混合均匀，用移液器吸取10微升滴于载玻片上加盖玻片，在38℃载物台上用200倍显微镜观察精子活力，每个样片取三个视野，三个视野活力的平均值即为该样本的活力。
同时，我们对五种冷冻曲线分别进行21个重复试验，通过SPSS软件包等数据处理软件进行分析和多重比较，发现第V条曲线组槟榔江水牛精液冷冻、解冻后，精子活力显著高于其它4条曲线组(P<0.05)，第Ⅰ、II、III、IV条曲线组之间精子活力无明显差异(P>0.05)。
另外，第V条曲线组的精子畸形率与第Ⅰ条和第II条曲线组均存在显著差异(P<0.05)；在槟榔江水牛精子顶体完整率方面，五条曲线组之间没有显著不同(P>0.05)；所述曲线V能明显提高该槟榔江水牛品种的冻后活力和降低畸形率，有效提高牛冻精生产质量和生产效率。因此，综合分析以上数据采用曲线V能明显提高该槟榔江水牛品种的冻后活力和降低畸形率，可以有效提高牛冻精生产质量和生产效率，适合该槟榔江水牛品种规模化生产。五条曲线对应的具体情况如下表所示：
曲线 重复 活力(％) 畸形率(％) 顶体完整率(％)
Ⅰ 21 31.33±2.40a 13.31±3.80a 95.01±2.61
II 21 29.10±2.89a 13.53±3.32a 96.17±2.28
III 21 28.98±4.73a 12.12±3.67 96.18±2.22
IV 21 30.79±4.91a 12.16±2.74 95.34±2.21
V 21 34.03±4.48b 10.64±5.32b 95.88±1.92
注：同一列中，不相同小写字母表示在P<0.05水平差异显著，相同小写字母或没有小写字母表示差异不显著(P>0.05)
实验中涉及的设备和器材：法国IMV卡苏公司精子密度测定仪，法国IMV卡苏公司精液灌装一体机，法国IMV卡苏公司0.25ml细管，法国IMV卡苏公司低温平衡柜，法国IMV卡苏公司digitcool型冷冻仪，日本Olympus BX43相差显微镜，冷冻仪恒温水浴锅，恒温箱。
该槟榔江水牛精液冷冻工艺方法的目的在于制作出一条冷冻曲线，在后期冷冻过程中，根据本曲线找出该品种槟榔江水牛精子在冷冻过程中不同阶段最适合的冷冻降温速率和危险温度区间，最终将其科研成果运用到生产实践中，提高生产质量和生产效率。按本发明提出的曲线冷冻保存的精液，解冻后精子的存活率有效提高，增加年产精液量，显著提高了精液品质。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作出任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案范围内。

Claims (1)

1.一种槟榔江水牛精液冷冻工艺方法，包括有精液的采集、精液的稀释、精液的分装与平衡、精液的冷冻、冷冻精液的解冻和镜检，其步骤如下：
步骤一、精液的采集：先用假阴道采集公牛的精液，通过显微镜检测原精活力在0.6以上，密度在6亿以上方可进行稀释；
步骤二、精液的稀释：通过精子密度仪测量原精的密度和稀释量，使用自配的卵黄稀释液作为本次实验稀释液，放置32～34℃水浴锅中备用，按测量的稀释量进行一次稀释，稀释时应沿三角瓶的边沿缓慢倾倒；
步骤三、精液的分装与平衡：再将稀释后的精液放于32～34℃水浴中暂存10min后，在20℃室温下封装到0.25ml细管中，将封装好的精液细管分成五份，分别水平摆放在齿状冷冻架上，然后放在4℃低温平衡柜中3-4h；
其特征在于：所述还包括步骤四、精液的冷冻：先将平衡好的精液用下述冷冻曲线V进行冷冻，初冻温度和冷冻结束温度是4℃和-140℃；
曲线V：4℃到-10℃，速率5℃/min；-10℃到-60℃，40℃/min；-60℃到-140℃，速率20℃/min；
步骤五、冷冻精液的解冻和镜检：最后将实验样本分别取三支置于37℃水浴锅中解冻，解冻后推入试管中混合均匀，用移液器吸取10微升滴于载玻片上加盖玻片，在38℃载物台上用200倍显微镜观察精子活力，每个样片取三个视野，三个视野活力的平均值即为该样本的活力。
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