JP5557218B2 - 精子機能の検査方法 - Google Patents
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Description
(1)精子核中のトロイド内の二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(2)トロイドリンカーを切断してトロイドを核マトリックスから遊離させる工程、
(3)トロイド内のDNAを伸長させる工程、
(4)伸長したDNAを検出する工程
を含み、ここで上記(2)および(3)の工程をTriton X−100(トリトン X−100、なお「Triton」は、商標名である)を用いて行われることを特徴とする方法に関する。
(i)A/Bの値が3.0またはそれより大きい、
(ii)A/Bの値が3.0より小さく、且つ1.5またはそれより大きい、
(iii)A/Bの値が1.5より小さく、且つ1.0またはそれより大きい、
(iv)A/Bの値が1.0より小さく、且つ強染色、
(v)A/Bの値が1.0より小さく、且つ弱染色または無染色、
により分類して、前記(i)または(ii)に分類された染色像を示す精子は精子核DNAが断片化しておらず、前記(iii)、(iv)および(v)のいずれかに分類された染色像を示す精子は精子核DNAが断片化していると評価する前記精子核DNA断片化検出方法に関する。
(a)精子頭部の空胞の数および幅を測定する工程、
(b)空胞の幅(C)と精子頭部幅(D)とを比較してC/Dの値により空胞を下記分類;
(I)C/Dの値が1/2より大きい空胞(空胞L)はスコア3、
(II)C/Dの値が1/3またはそれより大きく、且つ1/2またはそれより小さい空胞(空胞M)はスコア2、
(III)C/Dの値が1/3より小さい空胞(空胞S)はスコア1、
(IV)空胞がない場合はスコア0、
により分類してスコア化する工程、
(c)下式1;
を含む精子頭部空胞測定方法に関する。
(1)精子核中のトロイド内の二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(2)トロイドリンカーを切断してトロイドを核マトリックスから遊離させる工程、
(3)トロイド内のDNAを伸長させる工程、
(4)伸長したDNAを検出する工程、
を含む(図1参照)。
(a)精子頭部の空胞の数および幅を測定する工程、
(b)精子頭部幅に対する空胞の幅の割合に基づき空胞を分類してスコア化する工程、
(c)各分類の空胞の数およびスコアにより精子頭部空胞面積スコアを算出する工程、
を含む。
[1]材料および方法
ヒト精液は、正常ボランティアおよび不妊症治療対象患者よりインフォームドコンセントを得た上で提供を受けた。精液からの精子の回収は、スイムアップ法により実施した。
正常精子について得られた染色像を図1に示す。図1は各サンプル調整工程における精子の染色像を示す。サンプル調整工程1および2で得た試料ではいずれもトロイドが核マトリックスに繋留されているためにDNAが凝集されており、そのため小さな点状の染色像が観察された(図1のパネルAおよびパネルB)。サンプル調整工程3で得た試料ではトロイドが遊離しているため、円形の染色像が観察された(図1のパネルC)。サンプル調整工程4で得た試料ではDNAが伸長しているため、大きな円形の染色像が観察された(図1のパネルD)。
正常ヒト精液および不妊症治療対象患者精液について、精子核DNA断片化を評価した結果を図5および表3に示す。
[1]材料および方法
ヒト精液は、ボランティアよりインフォームドコンセントを得た上で提供を受けた。精液からの精子の回収は、スイムアップ法により実施した。
精子頭部空胞の大きさの分類を図6に示す。ここでは、空胞の大きさを精子頭部最大幅(約5μm)に基づいて3段階に分類した(上記表2)。そして、各空胞の大きさをスコアで表した。すなわち、L、M、およびSに分類された空胞のスコアをそれぞれ3、2、および1とした。また、空胞が観察されない場合のスコアは0とした。
光学顕微鏡DIC(ノマルスキー)像による精子頭部空胞のサイズの解析画像を図7に示す。本精子検体は、1例の精液検体から複数作成した精子試料の1つの解析像である。画像には総数3の精子が認められ、これらに存在する空胞の総数は、L、MおよびSがそれぞれ2個、1個および2個であった。本精子試料から作成した精子検体37検体を測定した結果、計数した総数214の精子に存在する空胞の総数は、L、MおよびSがそれぞれ20個、47個および176個であった。本精子試料中に存在する精子頭部空胞の1精子当たりの平均数は、(20+47+176)/214=1.14と算出された。また、本精子試料の精子頭部空胞面積スコアは、上記式2から、(20×3+47×2+176×1)/214=1.54と算出された。
Claims (3)
- 精子頭部空胞を指標とする精子機能検査方法と精子核DNA断片化を指標とする精子機能検査方法との組み合わせからなる精子機能検査方法であって、
該精子頭部空胞を指標とする精子機能検査方法が、
(a)精子頭部の空胞の数および幅を測定する工程、
(b)空胞の幅(C)と精子頭部幅(D)とを比較してC/Dの値により空胞を下記分類;
(I)C/Dの値が1/2より大きい空胞(空胞L)はスコア3、
(II)C/Dの値が1/3またはそれより大きく、且つ1/2またはそれより小さい空胞(空胞M)はスコア2、
(III)C/Dの値が1/3より小さい空胞(空胞S)はスコア1、
(IV)空胞がない場合はスコア0、
により分類してスコア化する工程、および
(c)下式1;
を含む精子頭部空胞測定方法を用いて精子頭部空胞の測定を行い、精子頭部空胞の数および/または精子頭部空胞面積スコアを指標にして精子機能を評価することを特徴とする精子機能検査方法であり、かつ
該精子核DNA断片化を指標とする精子機能検査方法が、下記(A)または(B)の精子機能検査方法:
(A)精子核DNA断片化を指標にして精子機能を評価する精子機能検査方法であって、精子核DNA断片化の検出を
(1)精子核中のトロイド内の二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(2)トロイドリンカーを切断してトロイドを核マトリックスから遊離させる工程、
(3)トロイド内のDNAを伸長させる工程、
(4)伸長したDNAを色素染色した後に精子頭部に形成される円形の染色像の大きさを測定することにより、伸長したDNAを検出する工程
を含み、ここで上記(2)および(3)の工程はTriton X−100(登録商標)を用いて行われることを特徴とし、
前記染色像の幅(A)と無処理精子の頭部幅(B)とを比較してA/Bの値により染色像を下記分類;
(i)A/Bの値が3.0またはそれより大きい、
(ii)A/Bの値が3.0より小さく、且つ1.5またはそれより大きい、
(iii)A/Bの値が1.5より小さく、且つ1.0またはそれより大きい、
(iv)A/Bの値が1.0より小さく、且つ強染色、
(v)A/Bの値が1.0より小さく、且つ弱染色または無染色、
により分類して、前記(i)または(ii)に分類された染色像を示す精子は精子核DNAが断片化しておらず、前記(iii)、(iv)および(v)のいずれかに分類された染色像を示す精子は精子核DNAが断片化していると評価する、精子核DNA断片化検出方法により行う精子機能検査方法、
(B)上記(A)の精子機能検査方法であって、計測した精子総数に対する核DNA断片化精子数の割合であるDNA断片化指数(DFI)を指標にして精子機能を評価することを特徴とし、ここでDFIが10%以上であるとき精子機能が不良であると判定する精子機能検査方法、
である精子機能検査方法。 - 精子頭部空胞を指標とする精子機能検査方法と精子核DNA断片化を指標とする精子機能検査方法との組み合わせからなる精子機能検査方法であって、
該精子頭部空胞を指標とする精子機能検査方法が、
(a)精子頭部の空胞の数および幅を測定する工程、
(b)空胞の幅(C)と精子頭部幅(D)とを比較してC/Dの値により空胞を下記分類;
(I)C/Dの値が1/2より大きい空胞(空胞L)はスコア3、
(II)C/Dの値が1/3またはそれより大きく、且つ1/2またはそれより小さい空胞(空胞M)はスコア2、
(III)C/Dの値が1/3より小さい空胞(空胞S)はスコア1、
(IV)空胞がない場合はスコア0、
により分類してスコア化する工程、および
(c)下式1;
を含む精子頭部空胞測定方法を用いて精子頭部空胞の測定を行い、精子頭部空胞の数および/または精子頭部空胞面積スコアが高い精子は精子機能が不良であると判定することを特徴とする精子機能検査方法であり、かつ
該精子核DNA断片化を指標とする精子機能検査方法が、下記(A)または(B)の精子機能検査方法:
(A)精子核DNA断片化を指標にして精子機能を評価する精子機能検査方法であって、精子核DNA断片化の検出を
(1)精子核中のトロイド内の二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(2)トロイドリンカーを切断してトロイドを核マトリックスから遊離させる工程、
(3)トロイド内のDNAを伸長させる工程、
(4)伸長したDNAを色素染色した後に精子頭部に形成される円形の染色像の大きさを測定することにより、伸長したDNAを検出する工程
を含み、ここで上記(2)および(3)の工程はTriton X−100(登録商標)を用いて行われることを特徴とし、
前記染色像の幅(A)と無処理精子の頭部幅(B)とを比較してA/Bの値により染色像を下記分類;
(i)A/Bの値が3.0またはそれより大きい、
(ii)A/Bの値が3.0より小さく、且つ1.5またはそれより大きい、
(iii)A/Bの値が1.5より小さく、且つ1.0またはそれより大きい、
(iv)A/Bの値が1.0より小さく、且つ強染色、
(v)A/Bの値が1.0より小さく、且つ弱染色または無染色、
により分類して、前記(i)または(ii)に分類された染色像を示す精子は精子核DNAが断片化しておらず、前記(iii)、(iv)および(v)のいずれかに分類された染色像を示す精子は精子核DNAが断片化していると評価する、精子核DNA断片化検出方法により行う精子機能検査方法、
(B)上記(A)の精子機能検査方法であって、計測した精子総数に対する核DNA断片化精子数の割合であるDNA断片化指数(DFI)を指標にして精子機能を評価することを特徴とし、ここでDFIが10%以上であるとき精子機能が不良であると判定する精子機能検査方法、
である精子機能検査方法。 - 精液検体が男性不妊症患者由来の精液検体であるか否かを判定する方法であって、該精液検体に含まれる精子の機能を請求項1または請求項2に記載の精子機能検査方法により評価し、精子機能が不良であると評価された精液検体は男性不妊症患者由来の精液検体であると判定する方法。
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