KR20070090073A - 동물 정자에서 ｄｎａ의 단편화 결정을 위한 절차 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물 정자에서 DNA 단편화의 결정 방법을 기술한다. 본 발명은 특히, DNA 변성 용액 및 선택적으로 후속의 염료로 정자를 포함하는 샘플의 처리; 단백질 변성 계면활성제를 함유하지 않는 용해 용액 및 선택적으로 후속의 염료로 처리; 정자의 크로마틴/DNA 완전성의 평가에 의해 정자의 크로마틴/DNA 완전성(integrity)을 평가하는 절차에 관계한다. 또한, 본 발명은 동물 정자의 특질을 평가하는 키트에 관계하는데, 상기 키트는 DNA 변성 용액 및 단백질 변성 계면활성제를 함유하지 않는 용해 용액을 포함한다.

크로마틴/DNA 완전성

Description

동물 정자에서 ＤＮＡ의 단편화 결정을 위한 절차{A PROCEDURE FOR THE DETERMINATION OF FRAGMENTATION OF DNA IN ANIMAL SPERM}

본 발명은 주로 생물학적 생식(biological reproduction)과 관련된 건강 분야에 이용된다. 특히, 본 발명은 동물에서 정자의 특질을 결정하기 위한 절차와 방법에 관계한다.

현재, 서방 세계에서 6%의 가임기(fertile age) 남성이 정상적인 생식을 저해하는 질환을 앓고 있다. 이런 이유로, 세계 보건 기구(WHO)에서는 국제적인 배경에서 정액 특질의 분석을 표준화하는 단일 프로토콜에서 일련의 실험실 절차를 제시해왔다. 이들 연구는 정액의 결정된 생화학적, 효소적 파라미터뿐만 아니라 특정 기능적 검사의 평가로 보충되는, 정자의 농도, 형태, 이동성의 결정에 집중되고 있다(WHO, 1999). 이들 검사는 정액의 전체 용적 및 ㎖당 정자의 농도를 측정할 수 있고, 남성의 불임이 사정액(ejaculate)에서 정자의 부재(무정자증) 또는 정자의 양의 명확한 감소(희정액증)에 기인하는 지를 진단할 수 있다. 또한, 이들 세포가 자궁강(uterine cavity)을 가로질러 난관(fallopian tube)의 바깥쪽 3/1 지점에 성공적으로 도달할 수 없게 하는 이동성 문제(무력정자증, asthenozoospermia)의 가능성을 결정한다. 또한, 이들 변이가 여성 난자의 효율적인 수정 능력을 반감시킨 다는 점에서, 정자 구성요소(머리, 목, 꼬리)의 심각한 형태 문제(기형정자증, teratozoospermia)가 존재하는 지를 분석한다. 부가적으로, 전립선과 정낭(seminal vesicle)과 같은 선(gland)의 관여(감염, 교접불능(agenesis))를 탐구한다. 마지막으로, HOS 검사(세포막의 이온 투과성) 또는 시험관내에서 정자의 진행 능력과 같은 기능적 검사로, 정액의 수정 능력에 관한 이해를 제공한다. 최종적으로, 이들 실험실 연구는 빈번하게, 호르몬 프로필, 고환 생검 및/또는 핵형(karyotype)의 결정(개체의 남성이나 여성의 유전적 상태를 정의하는 크로모좀 연구) 및/또는 분자 유전학 검사로 보충되어야 한다.

임상적, 실험적 연구에도 불구하고, 대략 30%-50%의 불임 남성에서는 불임의 원인을 결정할 수 없는데, 이를 특발성 불임(idiopathic infertility)이라 한다. 최근에, 정자 DNA의 손상이 이들 경우의 상당 부분을 설명할 수 있는 것으로 인식되고 있는데(Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000), 정자 DNA의 단편화 연구는 전문 저널에 지속적이고 활발하게 발포되고 있는 연구 주제이다(Evenson et al., 2002). 크로마틴 변이, 또는 정자의 핵 DNA에서 손상은 정자발생(spermatogenesis)동안 진행되는 DNA 패키징(DNA packaging)에서 변이의 결과로써 발생되거나, 또는 이런 변이의 결과일 수 있다(Sailer et al., 1995). 또한, 이들은 가능 아폽토시스 과정의 결과인 산화 스트레스(Aitken et al., 1998)를 유발하는 유리 라디칼에 의해 발생된 손상의 결과일 수도 있다(Gorczyca et al., 1993).

인간 정자의 크로마틴/DNA의 완전성을 평가하는 여러 방법이 존재한다. 이들에는 특히, 말단 트랜스퍼라아제(TUNEL) 또는 DNA 중합효소(in situ nick translation ISNT)와 같은 효소를 이용한, 표지된 뉴클레오티드의 동일물 도입에 의한 DNA의 in situ 파열이 포함된다(Gorczyca et al., 1993). 이들 방법은 슬라이드에 고정된 정자에 효소의 이용에 기초한다. 이런 이유로, 이들 방법의 효능은 그다지 높지 않고, 단지 이들 표지된 파괴만 효소에 접근가능한데, 이는 결과의 상대적으로 낮은 재현가능성을 유발한다. 또한, 시약의 가격이 비싸기 때문에, 이들 기술은 연구에만 이용되고 정액의 임상적 평가에는 이용되지 못하고 있다. 다른 기술은 혜성 검사법(comet assay)이다(Hughes et al., 1996). 정자는 슬라이드에서 아가로즈 마이크로겔에 포함되고 막과 단백질을 추출하는 용해 용액에 처리된다. 따라서, 핵양체(nucleoid), 다시 말하면, 단백질이 제거된 핵이 획득되는데, 여기서 DNA 루프가 스트레칭(stretching)에 의해 풀어지게 된다. 이들 핵양체는 완충액으로 채워진 탱크에서 전기영동되는데, 여기서 DNA 가닥이 음극(anode)으로 이동하여 혜성 영상을 발생시키고 머리와 꼬리가 전기영동 이동 방향으로 지향된다. 이들 혜성은 형광 현미경하에 관찰될 수 있는 형광 염료로 염색한다. 핵이 DNA 단편화를 보유하는 경우에, 이들은 대량으로 이동하여 혜성의 꼬리에 농축된다. 이는 상당히 민감한 검사법이긴 하지만 통상적인 임상적 실험에 비하여 상대적으로 많은 비용이 들고 복잡하다. 실제로, 이는 특별한 장치: 전기영동 파워 공급원과 탱크, 형광 현미경, 이들의 영상 포착과 분석 시스템을 요구한다. 이런 이유로, 이는 정액의 임상적 연구에 적용되지 않고 연구 목적에만 이용된다.

정자 DNA의 단편화 연구를 위한 현재의 참고 기술은 Evenson(SCSA: Sperm Chromatin Structure Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994)에 의한 크로마틴 구조 검사법이다. 상기 기술에서, 부유 상태의 정자는 산 변성 용액에 첨가된다. DNA 파괴가 없는 이들 정자는 이런 산 변성에 저항하고 이중 가닥 DNA으로 유지된다. 하지만, 자체적으로 단편화 DNA를 보유하는 정자는 DNA가 변성되고 단일 사슬 DNA로 전환된다. 이후, 이들은 아크리딘 오렌지(acridine orange)로 염색한다. 상기 염료는 이중 가닥 DNA와 결합하면 녹색 형광을 방출한다. 하지만, 단일 가닥의 변성 DNA를 보유하는 정자에서, 상기 형광색소(fluorochrome)는 적색 형광을 방출한다. 변성된 DNA를 보유하는 정자는 양 유형의 형광을 구별하는 유세포 분석법(flow cytometry)으로 정량한다. SCSA는 폭넓은 임상적 범위의 기술이며, 다수 환자의 평가에 이용되고 있다. 이런 시스템을 이용하여, 개체에서 단편화 DNA를 보유하는 정자가 30% 이상이면 출산까지 이어지는 임신 가능성이 1%이하인데, 이는 자연 수정뿐만 아니라 체외 생산에도 적용되는 것으로 확인되었다(Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000).

단편화 DNA를 보유하는 정자의 비율은 개체의 상이한 정자발생(spermatogenesis) 주기에서 다소간 일정하지만, 외부 요인, 또는 인플루엔자와 같은 강한 열병 현상(intense febrile episode)에 의해 변화될 수 있다(Evenson et al., 2000). 이런 방식으로, 일련의 연구를 수행하여 체외 생산 기술에 후속적으로 이용될 수 있는, 더욱 낮은 수준의 단편화를 보유하는 샘플을 선별할 수 있다. 중요하게는, 액체 질소에서 정액 샘플의 동결이 DNA 단편화 수준을 변화시키지 않기 때문에, 이런 검사법은 수정(insemination), IVF(시험관내 수정) 또는 ICSI(세포질 내 정자 주입, Intracytoplasmatic Sperm Injection)에 추후 이용될 수 있는 동결 샘플에서 수행될 수 있다. 이는 환자와 실험실에 대한 높은 작업 이점을 보유한다.

SCSA 기술은 확고하고 높은 반복재현성의 이점이 있긴 하지만, 값비싼 시스템이고 수행하기 어려우며 통상적인 실험실에서 접근하기가 용이하지 않다(De Jonge, 2002). 이런 이유로, 정자 DNA의 특질은 불임 연구에서 검증된 임상적 가치에도 불구하고, 여전히 일상적으로 평가될 수 없다.

최근에, 인간 정자의 크로마틴이 in situ에서 분산될 수 있도록 하는 기술이 앞서 보고되었는데, 이는 크로마틴을 분산시킬 수 없는 정자가 단편화 DNA를 보유한다는 것을 입증하였다(Fernandez, J.L . et al., Journal of Andrology, 2003, vol. 24, No. 1, pp.59-66; "The Sperm Chromatin Dispersion Test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation"). 이런 방법을 이용하여, 정액 샘플은 아가로즈 마이크로겔에서, 산 변성 용액, 2가지 용해 용액, 세척액으로 순차적으로 처리하고 건조시키며, 이후 염색한다. 정자 크로마틴 분산(SCD) 검사법이라고 하는 상기 기술은 과도하게 공격적인 시약과 조건을 이용한다. 전술한 방법은 일관된 결과를 제공하지 못하는데, 이는 반복 평가를 어렵게 한다. 다른 한편, 획득된 영상의 품질과 대비 및 결과의 반복재현성이 상업적으로 이용될 수 있을 만큼 충분하지 않다. 또한, 정자의 구조가 영향을 받고, 샘플에서 꼬리가 관찰되지 않는다. 이런 문제는 중요한데, 그 이유는 샘플에서 정자와 다른 세포를 용이하게 구별할 수 없고, 따라서 손상된 크로마틴/DNA를 보유하는 정자의 총수를 정량하는데 있어 후속적인 오류가 발생할 수 있기 때문이다.

이런 이유로, 동물에서 정액 특질을 연구하기 위하여 일상적으로 용이하게 이용될 수 있고, 특히 크로마틴/DNA의 완전성을 평가하는데 이용될 수 있는 신뢰성 있는 공정이 여전히 필요하다. 이런 공정은 확고하고 수행하기 용이하며 값이 저렴하고 기본 실험실에서 접근 가능해야 한다. 전술한 문제점을 해결해야 한다. 또한, 실험실 간에 균일한 결과를 제공하고 자동화에 적합해야 한다.

본 발명의 목적

본 발명의 목적은 동물에서 정자 세포의 크로마틴/DNA 완전성(integrity)을 신속하고 정확하게 평가할 수 있고, 임의의 통상적인 분석적, 수의학적(특히, 인간 생식 목적), 실험적 작업에 통합될 수 있는 방법이다.

이런 이유로, 본 발명의 목적은 동물 정자의 크로마틴/DNA 완전성을 평가하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은

a) DNA 변성 용액으로 정자를 포함하는 샘플의 처리 단계;

b) 핵 단백질을 추출하는 용해 용액으로 단일 처리 단계;

c) 정자의 크로마틴/DNA 완전성의 평가 단계를 포함하고,

상기 용해 용액은 단백질 변성 계면활성제를 함유하지 않고 정자의 꼬리를 본질적으로 파괴하지 않는다.

일반적으로, 단계 a)는 b) 단계를 선행한다.

지시된 바와 같이, 용해 용액의 선택은 본 발명의 목적을 달성하는데 중요하다. 사용될 수 없는 단백질 변성 계면활성제에는 음이온성과 양이온성 계면활성제, 예를 들면, SDS, 소듐 도데실 설페이트, 알킬 벤젠 설포네이트, 글리콜산 수화된 염 등이 포함된다. 이들은 용해 효과(lysis effect)로 막을 현저하게 파괴하고, 이 와 동시에 단백질의 변성을 유도하는 계면활성제이다. 이들은 변성 전기영동에 이용되는데, 여기서 단백질은 완전한 변성(3차원 구조의 상실)을 유발하는 이동이 진행된다. 이들은 특히, 산성 pH에서, 바람직하게는 그람-양성 박테리아에서 활발하다. 계면활성제 내에서 이들의 활성은 높다.

본 발명의 방법에서, 가급적 비-이온, 비-단백질 변성 계면활성제, 다시 말하면, 단백질을 용해시키지만 이들을 변성시키지 않는 계면활성제가 이용된다. 적절하게는, 비-이온 계면활성제는 톡틸페녹시폴리에톡시에탄올(Triton X-100), N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필) 콜라미드(bigCHAP), Brij(r)35 P, N-데카노일-N-메틸글루카민, 디지토닌(digitonin), 도데카노일-N-메틸글루카마이드, 헵타노일-N-메틸글루카마이드, 가지형 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시) 에탄올(Igepal CA-630), N-노나노일-N-메틸글루카민, Nonidet P 40, N-옥타노일-N-메틸글루카민, Span 20 용액, 폴리소르베이트 20(Tween 20)이다. 특히, Triton X-100이 선호되는데, 그 이유는 이로부터 산출되는 우수한 결과 및 이의 편의한 이용가능성 때문이다.

적절하게는, 용해 용액은 변성 없이 용해 과정을 조장할 만큼 충분한 이온 강도를 보유한다. 효과적인 용액은 1 내지 3 M의 염화나트륨, 0.001 내지 2 M의 디티오트레이톨(DTT), 0.001 내지 2 M의 2-아미노-2(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(Tris), 0.1% 내지 3%의 Triton X-100을 함유하는 용액이다. 특히 적절하게는, 용해 용액은 대략 2.5M 염화나트륨, 대략 0.2M DTT, 대략 0.2M Tris, 대략 1% Triton X-100을 함유하고, 대략 7.5의 pH를 보유하는 용해 용액이다.

DNA 변성 용액은 가급적, 산, 예를 들면, 염산, 아세트산, 질산 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 산이다. 적절하게는, DNA 변성 용액은 염산 용액이다.

본 발명에 따른 방법은 a)와 b) 단계이후 정자의 크로마틴/DNA의 완전성 평가 단계를 포함한다. 이런 평가를 위한 여러 대안이 존재하긴 하지만, 시각적인 단계가 바람직하다. 이런 목적으로, 본 발명의 절차는 가급적, a)와 b) 단계이후 샘플 염색 단계를 포함한다. 우수한 결과를 제공하고, 형성된 특징적인 할로(halo)뿐만 아니라 정자 꼬리를 가시화시키는 염료는 Wright 용액과 유사한 용액이다.

적절한 구체예에서, 정자는 현탁액과 유사한 매체, 바람직하게는 마이크로겔(microgel), 특히 아가로즈 마이크로겔에 포함된다.

또한, 본 발명은 동물 정자의 특질을 평가하는 키트에 관계하는데, 상기 키트는

a) DNA 변성 용액;

b) 핵 단백질을 추출하는 용해 용액을 포함하고,

상기 용해 용액은 단백질 변성 계면활성제를 함유하지 않고 정자의 꼬리를 본질적으로 파괴하지 않는다. 상기 키트는 전술한 본 발명에 따른 절차를 수행할 수 있다.

도 1. 본 발명의 방법에 따라 인간 정자에서 할로의 크기를 정의하는데 이용되는 파라미터. 1a: 두 부분으로 구성되고, 광범위하게 단백질이 제거된 정자 핵에 상응하는 핵양체: 중심 위치에서 코어(core)로 불리는 정자 핵 및 크로마틴/DNA 분산의 주변 할로(peripheral halo)의 반면 영상. 정자의 꼬리가 보인다. 1b: 할로와 코어 사이 경계의 더욱 우수한 시각화와 확립을 위한 릴리프 필터(relief filter). 1c: 본 발명의 방법에서 설명된 바와 같이 상이한 크기의 할로를 확립하는데 이용되는 척도의 실례로서 코어(a)의 더욱 작은 직경과 할로(b)의 두께.

도 2. 본 발명의 방법을 적용한 이후 생산된 할로의 크기에 따라 정의된 상이한 유형의 정자. 2a: 대형 할로를 보유하는 정자. 2b: 중간 크기 할로를 보유하는 정자. 2c: 소형 할로를 보유하는 정자. 2d: 할로가 없는 정자. 2e: 할로가 없고 퇴화된 정자. 2f: 전술한 정자의 상이한 유형이 관찰되는 제너럴 필드(general field).

도 3. DNA 단편화 수준을 가시화시키는 DBD-FISH 방법(a’-e’, 플루레신 레드)에 따라, DAPI(a-e, 플루레신 블루)로 염색이후 가시화된 상이한 할로 크기 및 전체 인간 게놈 DNA 프로브를 이용한 in situ 혼성화 신호 사이의 상관관계. 3a: 대형 할로 및 낮은 혼성화 신호(3a’)를 보유하는 정자. 3b: 중간 할로 및 상기한 경우보다 약간 높긴 하지만 낮은 혼성화 신호(3b’)를 보유하는 정자. 3c: 소형 할로 및 혼성화 수준에서 눈에 띄는 증가(3c’)를 보유하는 정자. 3d: 할로 없음 및 높은 수준의 혼성화(3d’)를 보이는 정자. 3e: 퇴화되고 불규칙한 혼성화 분포(3e’)를 보이는 정자.

도 4. 아래와 같은 종의 정자 샘플에 본 발명의 방법의 적용: 생쥐(Mus musculus), 황소(Bos taurus), 가자미(Scophthalmus maximus), 지렁이(Lombricus terrestris). 4a, 황소에 해당함; 4b, c, d는 생쥐에 해당함; 4e는 지렁이에 해당함; 4f는 가자미에 해당함.

도 5. 높은 수준의 루코사이토스페리미아(leucocytospermia)가 존재하는 환자로부터 샘플. 백혈구에서 꼬리 부재로 인하여, 이들 백혈구는 나머지 세포형으로부터 구별될 수 있다.

본 발명의 절차와 키트는 단편화 DNA를 보유하는 정자의 빈도 결정을 위한 간편하고 신뢰할 수 있는 시스템이다. 본 발명의 방법은 남성과학 연구실, 체외 생식 클리닉, 동물 품종 연구실에 적용될 수 있다. 또한, 이는 매우 다용한 시스템인데, 그 이유는 분석의 결과를 변화시키지 않으면서, 필요에 따라 샘플을 동결하고 이를 분석하는 것이 가능하기 때문이다.

동물 정자의 크로마틴/DNA 완전성을 평가할 수 있는 본 발명의 절차는

a) DNA 변성 용액으로 정자를 포함하는 샘플의 처리 단계;

b) 핵 단백질을 추출하는 용해 용액으로 단일 처리 단계, 상기 용해 용액은 단백질 변성 계면활성제를 함유하지 않고 정자의 꼬리를 본질적으로 파괴하지 않는다;

c) 정자의 크로마틴/DNA 완전성의 평가 단계를 포함한다.

이들 이외에, 선행 기술, 특히 Fernandez, J.L. et al. Journal of Andrology, 2003, vol. 24, No. 1, pp.59-66과 관련하여 본 발명의 절차의 근본적인 차이는 기본적으로, 용해와 염색의 범위에 있다. 따라서, 2개의 순차적인 용액 대신에 단일 용해 용액이 이용된다. SDS(음이온성 단백질 변성 계면활성제) 또는 EDTA(킬레이트화제)를 함유하지 않는다는 점에서 조성이 상이하다. 이는 Triton X-100과 같은 상대적으로 약하고 중성인 비-변성 계면활성제를 함유할 수 있다.

기술적으로, 이들 차이는 정자 꼬리의 보존을 유도한다. 이는 결정적인 개선인데, 그 이유는 이들의 검출이 핵양체의 영상이 실제로 정자로부터 유래되는지, 또는 존재할 수 있는 다른 세포형, 예를 들면, 비뇨생식기관(genito-urinary tract)으로부터 탈락 세포(desquamated cell), 염증 세포, 혈액 등에 상응하는 지를 판별할 수 있는 필수불가결한 데이터이기 때문이다. 이런 지속성은 SDS의 이용을 배제할 뿐만 아니라 공격성이 훨씬 약한 용해를 이용함으로써 달성된다.

또한, 더욱 약한 용해는 크로마틴 가닥의 풀림을 달성하고, 머리 또는 코어의 형태를 더욱 효과적으로 보호하며, 더욱 높은 밀도의 크로마틴 물질을 보유하고 더욱 강하게 염색되는 분산 할로를 획득한다. 결과적으로, 특히 Wright 염료를 이용하는 경우에, 상이한 크기의 할로의 대비와 시각화가 현저하게 개선된다.

다른 유의한 이점은 SDS와 같은 단백질 변성 계면활성제의 부재가 다른 세포 구성요소를 가시화시키는 상이한 기술과 함께 본 명세서에 개시된 기술의 순차적인 이용을 가능하게 한다는 점이다. 따라서, 전술한 방법에 따라 획득된 핵양체에서, 핵 매트릭스와 결합된 RNA의 검출뿐만 아니라 단백질, 라미닌 단백질 유형, 다른 핵 단백질의 면역검출 방법이 이용될 수 있는데, DNA가 연장됨에 따라 핵 구조의 양이 가능한 많이 유지된다. 이는 정자의 핵 구조에 관한 특정 연구 토픽에서 중요하다.

다른 부가적인 이점은 더욱 적은 양의 시약이 이용되고, 결과적으로 경제적 비용이 줄어든다는 점이다. 가령, DTT는 가격이 특히 비싸기 때문에, 실시예에서 기술된 농도의 감소(기존 문헌에서 기술된 농도의 1/4)는 비용 절약에 중요하다.

이들 내용으로부터, 본 발명의 절차는 선행 기술에 비하여 정자 핵양체의 더욱 개선되고 더욱 재현가능한 영상을 산출하는 것으로 추론된다. 이는 핵양체가 성숙 정자 또는 다른 세포형으로부터 유래되는지를 판별할 수 있는데, 할로 크기의 분류가 훨씬 정확하고 신뢰성이 있다. 결론적으로, 본 발명의 절차에 의한 샘플의 DNA 단편화 수준의 결정은 더욱 신뢰할 수 있는데, 이는 상기 절차가 적은 비용으로 일상적으로 이용될 수 있음을 의미한다. 이의 이용은 상이한 실험실, 임상적 환경, 인간 샘플, 동물 샘플의 연구를 위한 수의학 실험실에 적합하다. 이는 매우 중요한데, 그 이유는 이런 절차가 환자에 임상적으로 적용될 수 있는 검사법이기 때문이다.

샘플의 처리 단계의 순서는 임의의 순서, 예로써 DNA 변성 용액으로 첫 번째 단계, 이후 용해 용액으로 처리 단계 등으로 진행될 수 있다. 하지만, DNA 변성 용액 이전, 용해 용액 이후 샘플을 처리하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이로부터 더욱 우수한 결과가 도출되기 때문이다. 다른 구체예(용해, 이후 DNA 변성)에서, 단편화 DNA를 보유하는 정자는 상이한 방식으로 행동한다. 이런 경우에, 이들은 크로마틴/DNA의 단편을 분산시켜 더욱 큰 할로를 발생시킨다. 용해 용액으로 단일 처리만으로도 이런 행동을 충분히 관찰할 수 있긴 하지만, 할로 크기의 구별이 그다지 정확하지 않다.

본 발명의 절차는 일부 구체예 및 선택적 단계와 함께, 아래에 상세하게 기술한다. 당분야의 전문가는 본 명세서에 기술된 근본적인 측면이 유지된다면 다른 실현 방법과 가능성이 존재한다는 것을 인지할 것이다.

첫 번째 단계는 샘플의 준비이다. 이는 당분야에 공통된 절차를 이용하여 수득하고, 샘플에서 정자 농도를 결정한다. 이런 분석에 적합한 농도는 ㎖당 0.1 내지 20 x 10⁶개의 세포이다. 고도로 농축된 샘플은 배양 배지 또는 인산염/식염수 완충액(PBS) 용액 등으로 희석함으로써 적절한 농도로 조정한다.

정액 샘플은 본 발명의 절차에 따라 가공 서포트에 위치시켜 이의 평가를 용이하게 한다. 적절하게는, 이는 표준 아가로즈 필름으로 보호될 수 있는 유리 슬라이드이다. 이를 위하여, 0.2% 내지 1%의 표준 아가로즈 용액을 코프린자(Coplin jar) 또는 등가물에 담긴 증류수에서 제조한다. 이는 플라스틱 거즈로 덮고 마이크로웨이브 오븐에 위치시킨다. 마이크로웨이브 오븐을 300W 내지 1000W, 예를 들면, 500W의 파워로 설정하고, 용기를 교반시켜 아가로즈의 용해를 개선하고, 끓을 때까지 이를 방치한다. 이런 절차는 항온조(thermostaic bath)를 이용하여 수행할 수 있다. 아가로즈 용액은 완전하게 투명해지면, 10㎖ 내지 250㎖의 수직 용기에 위치시켜 제조한다. 이들 용기는 용액조에서 60℃ 내지 100℃, 예를 들면, 70℃로 미리 가열하여 아가로즈 용액을 액체 상태로 유지시킨다.

슬라이드를 아가로즈 용액에 도입하기에 앞서, 이들 슬라이드는 천으로 문질러 가능 불순물을 제거한다. 슬라이드는 슬라이드 위에 균질성 필름이 형성될 때까지, 수직으로 담그고 동결 구역에서 족집게로 1-60초간 유지시키며 끄집어내는 과정을 1 내지 10회 반복한다. 이들은 부드러운 표면, 예를 들면, 유리 또는 금속 위에 수평으로 위치시키고 1℃ 내지 15℃, 바람직하게는 4℃로 냉각한다. 슬라이드가 놓인 플레이트는 아가로즈가 슬라이드 표면에서 겔화될 때까지 4℃에서 30분간 냉동기에 위치시킨다. 냉동기로부터 트레이를 이동시키고, 플레이트와 접촉한 슬라이드 표면을 흡묵지(blotting paper)로 깨끗하게 닦는다. 이후, 슬라이드는 아가로즈가 완전히 건조되고 유리에 부착되는 미세 필름을 형성할 때까지 37℃ 내지 100℃의 온도 범위에서 건조 챔버에 수평으로 위치시킨다. 이렇게 처리된 슬라이드는 즉시 이용하거나, 또는 실온에서 적절히 밀봉된 상자에 수개월동안 보관할 수 있다.

정자를 함유하는 샘플의 가공을 용이하게 하기 위하여, 샘플은 현탁액과 유사한 특성을 갖는 매체, 예를 들면, 아가로즈 마이크로겔에 포함될 수 있다. 이런 경우에, 증류수에서 0.5% 내지 2% 농도로 낮은 융점/낮은 겔화 아가로즈 용액이 제조된다. 아가의 겔화(gelling)는 마이크로웨이브 오븐 또는 항온조에서 수행되고, 이후 항온조 또는 건조 챔버에 위치된 튜브에서 30℃ 내지 37℃ 사이로 유지된다. 정액과 아가로즈 용액은 후자가 0.3% 내지 1% 농도 범위에 존재하도록 Eppendorf 튜브 또는 등가물에서 조심스럽게 혼합한다. 가령, 70 ㎕ 아가로즈 용액 + 30 ㎕ 샘플. 아가로즈 용액은 세포 손상을 피하기 위하여 37℃ 이하가 되도록 한다.

최종적으로, 서포트 위에서 샘플을 획득하기 위하여, 1℃ 내지 15℃ 범위의 온도에서 보호 슬라이드를 유리 또는 금속의 부드럽고 차가운 표면에 위치시켜 기포 형성을 피한다. 마이크로피펫으로 5-200 ㎕의 혼합물을 한 방울 떨어뜨리고 상기 방울 위에 커버 슬립을 위치시키는 것이 권장된다. 예방책으로, 각 샘플을 이중으로 가공하고, 이런 기술이 적용될 때마다 대조 샘플을 이용하는 것이 권장된다. 슬라이드가 놓인 플레이트는 아가로즈의 적절한 겔화가 달성될 때까지 4℃에서 2 내지 30분간 냉동기에 위치시킨다. 겔화가 완결되면, 슬라이드는 마이크로겔이 손상되지 않도록 동일 냉동기로부터 매우 조심스럽게 끄집어낸다.

간편하고 반복된 취급이 가능한 샘플이 적절하게 준비되면, 이들 샘플은 DNA 변성 용액으로 처리 및 핵 단백질을 추출하는 용해 단계로 본 발명의 절차에 따라 처리한다.

바람직한 구체예에서, 샘플을 포함하는 슬라이드는 먼저, 변성 용액을 포함하는 용기에 수평 위치로 위치시킨다. DNA 변성 용액은 약한 농도의 산, 예를 들면, 아세트산, 질산, 황산, 또는 알칼리, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화바륨, 수산화칼륨일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 염산 용액은 0.01N 내지 0.5N, 바람직하게는 0.1N 내지 0.3N, 더욱 바람직하게는 대략 0.2N 농도로 사용된다. 상기 용액은 검사를 수행하는 당일에 제조되고, 슬라이드는 1℃ 내지 37℃, 바람직하게는 18℃ 내지 25℃, 더욱 바람직하게는 20-22℃ 온도에서 1 내지 15분간 DNA 변성 용액에서 배양한다.

본 발명의 공정에서 이러한 단계가 완결되면, 정자의 꼬리가 파괴되지 않을 만큼 충분히 부드럽게 샘플 용해를 수행한다. 이를 위하여, 각 슬라이드는 이를 보유하는 다른 용기에 수평 위치로 담근다.

전술한 바와 같이, 용해 용액은 크로마틴 가닥의 풀림을 달성하여 머리 부분의 형태를 더욱 효과적으로 보존하고, 결과적으로 더욱 높은 밀도의 크로마틴 물질을 보유하는 특징적인 할로를 형성하도록 선택된다. 또한, 용해 용액은 정자 꼬리의 보존을 위하여 충분히 약해야 한다. 이는 공격적인 계면활성제와 단백질 변성제를 피함으로써 달성된다. 부가적으로, 이온 농도의 조절 역시 이런 효과의 조절을 가능하게 할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 용액은 1M 내지 3M, 바람직하게는 2M 내지 3M의 염화나트륨; 0.001M 내지 2M, 바람직하게는 0.01M 내지 0.8M의 디티오트레이톨(DTT); 0.001M 내지 2M, 바람직하게는 0.01M 내지 0.4M의 2-아미노-2(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(Tris); 0.1% 내지 3%, 바람직하게는 0.5%-1.5%의 Triton X-100으로 구성된다. 상기 용액은 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 7-7.5의 pH로 조정된다.

다른 대안적 용해 용액이 존재하거나, 또는 상기 용액의 농도, 시간, 배양 온도는 이의 기능적 특성이 유지된다면 변화될 수 있다. 또한, DTT에 대한 대안으로, 베타-멀캡토에탄올 및 다른 환원제와 같은 화합물이 사용될 수 있다. Tris에 대한 대안으로, 다른 완충액, 예를 들면, Hepes, Mops, Pipes가 사용될 수 있다. Triton X-100에 대한 대안으로, 다른 중성 계면활성제가 상기한 바와 같이 사용될 수 있다.

이용되는 용액 및 샘플 유형에 따라, 제조물은 용해 용액에서 1 내지 60분간, 바람직하게는 15 내지 35분간, 더욱 바람직하게는 대략 25분간 1℃ 내지 37℃, 바람직하게는 18℃-25℃, 더욱 바람직하게는 20℃-22℃ 온도에서 배양시킨다.

전술한 공정에 대한 완전한 대안으로, 변성 용액과 용해 용액에서 배양 순서를 역전시킬 수 있다. 정자의 크로마틴에 대한 이들 효과는 손상된 크로마틴/DNA를 보유하는 정자와 나머지 정자의 구별을 가능하게 한다. 획득된 차이의 상세는 실시예 6에서 기술한다.

DNA 변성 용액과 용해 용액으로 처리이후, 제조물은 세척하여 이들 용액의 잔류물을 제거한다. 이를 위하여, 가능한 가장 약한 세척 용액을 사용하여 킬레이트화제 또는 계면활성제를 피한다. 가령, 이들은 풍부한 증류수 또는 완충액 또는 생리 식염수를 보유하는 용기에 1 내지 60분간 수평 위치로 담근다.

이후, 샘플을 탈수시킨다. 이를 위하여, 증가하는 농도의 알코올을 사용할 수 있다. 가령, 슬라이드를 들어 올리고, 5%에서 100%로 일련의 증가하는 농도의 에탄올을 보유하는 용기에 각각 30초 내지 60분간 수평 위치로 담그고, 이후 제조물을 자연 건조시킨다. 일련의 에탄올에서 배양에 대한 대안으로, 제조물은 상이한 알코올, 예를 들면, 메탄올에서 배양시켜 탈수시키거나, 또는 건조 챔버에서 자연 건조시킬 수 있다.

정액을 보유하는 건조되고 미리 가공된 슬라이드는 실온에서 수개월동안 보관 상자에 담아 보관할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 처리 공정 및 정자 크로마틴/DNA의 완전성을 평가하는 이후 단계를 분리하는데 도움이 된다. 이러한 보관은 동일한 개체로부터 얻은 여러 샘플의 상이한 시점에서 반복된 평가를 가능하게 한다.

본 발명에 따라 처리된 샘플은 평가 단계로 넘어간다. 상기한 바와 같이 정자 크로마틴/DNA의 완전성을 평가하는 여러 가능 공정이 존재한다. 이점은 본 발명에 따라 처리된 샘플이 할로(halo)를 더욱 명확하게 가시화시키고 정자의 구조, 특히 꼬리의 완전성을 유지한다는 점인데, 이는 정자를 다른 유형의 세포로부터 명확하게 구별될 수 있도록 한다.

바람직한 구체예에서, 시각적 평가를 용이하게 하는 염료가 샘플에 추가된다. 적절한 염색 조건의 선택은 고품질 영상 및 평가 결과에서 높은 지속성을 획득할 수 있다. 통상적인 투명 시야 현미경(clear field microscope) 또는 형광 현미경이 이용되는 지에 따라, 염색을 위한 여러 전략이 존재한다.

투명 시야 현미경하에 관찰을 위한 염료:

본 발명의 경우에, 이용될 수 있는 염료는 Wright, Giemsa, Orcein, Schiff 시약, Acetic Carmine, 티아진 유형, Romanowsky 유형의 혼합물, 또는 이들의 유도체이다(참조: Chromosome banding, AT Sumner, pp.90-91).

샘플 및 특히 할로의 더욱 강한 염색으로 인하여, Wright 염료와 같은 염료가 선호된다. 이들 염료로, 상이한 크기의 할로의 대비와 시각적 구별이 현저하게 개선된다. 이들은 또한, 적은 비용 및 임의 유형의 실험실에 대한 용이한 이용가능성을 보유한다. 염료의 이용은 꼬리를 가시화시킬 수 있는데, 꼬리는 형광 현미경에 이용되는 형광색소에 의한 DNA 염색에서 일반적으로 가시화되지 않는다. 이에 더하여, 이들 염료는 취급이 용이하여 적절한 염색 수준을 달성할 수 있는데, 이는 Diff-Quik 또는 유사 물질에서는 불가능하다.

Fernandez, J.L. et al. in Journal of Andrology, 2003, vol 24, No. 1, pp 59-66에 보고된 다른 염료, 예를 들면, Diff-Quik은 현저하게 약하고 배경과 비교하여 할로의 적절한 대비를 달성하지 못한다. 결과적으로, 할로가 상당히 분산되는 경우에 이의 주변 경계를 가시화시키기 어렵기 때문에, 본래 DNA를 보유하는 정자가 때때로 소형 할로로 오인되어 단편화 범주로 지정되는 오류가 발생한다. 다시 말하면, 상기 문헌의 절차는 특히 투명 시야 염색(clear field staining)에서 단편화 수준을 과대평가하는 경향이 있다. 이는 개체에 적용될 수 있는 검사법에는 상당히 부적합하다. 이런 이유로, 상기한 개선은 본 발명의 기술의 신뢰성과 명백하고 현저하게 관련된다.

샘플 염색의 구체예에서, Wright 용액(Merck 1.01383.0500)을 예로써 pH 6.88의 인산염 완충액(Merck 1.07924.1000)과 1:30 내지 30:1(v/v)의 비율로 혼합한다. 건성 마이크로겔을 보호하는 염료 층을 수평으로 가라앉힌다. 최적 대비를 달성하는 염색 시간은 30초 내지 60분이다. 염료 층을 주기적으로 취입(blowing)하는 것이 권장된다. 과도한 염료를 버리고, 슬라이드를 흐르는 물로 부드럽게 세척하고 자연 건조시킨다. 염료가 과다하면, 동일한 강도로 물에서 세척할 수 있다. 다른 가능성은 에탄올에서 염색을 제거하고 건조시키며 다시 염색하는 것이다. 특히 크로마틴의 분산 할로 영역에서 염료가 약하면, Wright 용액으로 직접 염색할 수 있다.

대안으로, 다른 염료, 예를 들면, Hemacolor 2(Merck 1.11956)와 Hemacolor 3(Merck 1.11957), Giemsa, 동일 계통의 다른 염색 용액을 이용할 수도 있다.

형광 현미경하에 관찰을 위한 염색:

형광 필터의 이용가능성에 따라, 샘플은 페이딩 방지 매체(가령, Vector H-1000)에서 DAPI 유형의 DNA에 특이적인 형광색소, Hoechst 33258, 브롬화에티디움(ethidium bromide), 요오드프로피디움(propidium iodide) 등으로 염색할 수 있다.

영구 제조물이 요구되면, 가공되고 염색된 슬라이드는 봉입제(mounting media)(가령, Entellan; Merck 1.07961)에 포함될 수 있다.

최종적으로, 세포형을 구별함으로써 정자 크로마틴/DNA의 완전성을 평가한다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 절차는 선행 기술에 비하여 이런 평가를 더욱 용이하게 한다.

현미경 플랫폼에 결합된 아날로그 또는 디지털 카메라에 의해 획득되는 영상은 직접적인 시각적 분석으로, 또는 디지털화 영상 분석 소프트웨어를 이용함으로써 조사할 수 있다.

초기에, 샘플당 최소 500개의 정자에 대한 조사가 권장되고, 아래의 기본 기준이 채택된다(참조: 도 1과 도 2):

1. 크로마틴 분산 할로가 없는 샘플(도 1).

2. 크로마틴 분산 할로가 없고 퇴화된 정자: 할로를 보이지 않는 정자들은 머리가 과립으로 단편화되거나 매우 약한 염색을 보인다(도 1).

3. 소형 분산 할로를 보유하는 정자: 코어의 하위 직경의 1/3 이하의 할로 두께(도 1).

4. 중간 크기 분산 할로를 보유하는 정자: 코어의 하위 직경의 1/3 초과이고 코어의 직경 미만(도 1).

5. 대형 분산 할로를 보유하는 정자: 할로가 코어의 하위 직경 이상인 정자(도 1).

6. 기타: 정자에 속하지 않는 세포 핵. 이들을 구별시키는 형태적 특성중의 하나는 꼬리의 부재이다.

단편화 DNA를 보유하는 정자는 크로마틴 분산 할로가 없는 정자(1), 크로마틴 분산 할로가 없고 퇴화된 정자(2), 소형 분산 할로를 보유하는 정자(3)로서 간주된다. 중간이나 대형 크로마틴 분산 할로와 DNA 단편화를 보이는 정자는 DBD-FISH 기술(DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization; Fernandez et al., 1998; 2000; 2002; Fernandez and Gons, 2002)을 이용하여 획득된 결과로부터 추론한다. 이런 절차는 단백질이 제거되고 DNA가 조절 변성된 DNA 파괴 세포 핵의 검출과 정량이 가능하다. 이런 변성은 파괴의 말단으로부터 단일 사슬 DNA의 절편을 생산하는데, 이들은 적색 형광색소로 표지된 전체 게놈 DNA 프로브를 이용한 in situ 혼성화로 검출되고 형광 현미경을 이용하여 가시화된다. 세포 DNA에서 파괴의 수준이 높을수록, 혼성화 프로브의 양이 증가하고 관찰되는 형광이 증가한다. 본 발명에 기술된 방법에 따라 가공된 샘플은 DNA에 존재하는 파괴의 가능 말단으로부터 변성 용액에 의해 생산되는 단일 사슬 DNA를 보유한다. 이런 이유로, 전체 게놈 DNA 프로브를 이용한 혼성화의 강도는 정자의 핵에 존재하는 파괴의 양과 상관한다. 이런 방식으로, 본 발명자들은 할로가 없는 핵양체, 또는 할로의 크기가 현저하게 감소된 핵양체가 DBD-FISH와 강한 라벨링(labelling)을 보인다는 것을 확인하였는데, 이런 사실은 이의 DNA의 강한 단편화를 입증한다(도 2). 나머지 핵양체는 상기 프로브와 매우 낮은 수준의 마커를 보이는데, 이는 크로마틴 처리 자체에 의한 혼성화의 깊이에 상응한다.

또한, 본 발명은 동물 정자의 크로마틴/DNA의 완전성 평가를 위한 키트에 관계한다. 상기 키트는 DNA 변성 용액 및 핵 단백질을 추출하는 용해 용액을 포함하고, 상기 용해 용액은 단백질 변성 계면활성제를 함유하지 않고 정자의 꼬리를 본질적으로 파괴하지 않는다. 선호되는 DNA 변성 용액과 용해 용액은 전술한다.

선택적으로, 키트는 예로써 아가로즈로 미리-처리된 서포트 및 샘플을 함유하는 현탁액과 유사한 특성을 보유하는 매체의 제조를 위한 용액, 예를 들면, 마이크로겔의 제조를 가능하게 하는 낮은 겔화점 아가로즈 용액을 포함할 수도 있다

본 발명의 구체예에 따른 키트의 내용물과 사용법은 아래에 상세하게 기술한다:

키트의 내용물에 관한 설명

미리-처리된 슬라이드*

낮은 겔화점 아가로즈 용액을 보유하는 Eppendorf 튜브(튜브 A)

37% HCl을 보유하는 튜브(튜브 B)

용해 용액을 보유하는 튜브(튜브 C)*. 조성: 2.5M NaCl, 0.2M DTT, 0.2M Tris, 1% Triton X-100, pH 7.5

변성 용액과 용해 용액에 대한 용기.

랜싯(Lancet)

Eppendorf 튜브용 플로트(float)

* 본 명세서에서 앞서 언급된 제조물.

필요한 재료와 장비

투명 시야 현미경 또는 형광 현미경(액침대물랜즈(immersion objective) 권장됨)

4℃ 냉동기

37℃ 배양조(Incubation bath)

플라스틱 장갑

유리 커버 슬립(18x18 ㎜, 22x22 ㎜ 또는 24x60 ㎜)

마이크로피펫(Micropipette)

배양을 위한 4개의 수평 용기

증류수

70%, 90%, 100% 에탄올

사용법

슬라이드용 샘플의 제조

1) 실온(22℃)에서 플라스크 C에 용해 용액을 집어넣는다.

2) 배양 배지 또는 PBS에서 정액 샘플을 ㎖당 5-10 x 10⁶의 농도로 희석한다. 새로운 샘플 또는 액체 질소에서 직접 동결된 샘플을 이용할 수 있다.

아가로즈 마이크로겔의 제조

3) 수직 위치에서, 낮은 겔화점 아가로즈를 보유하는 Eppendorf 튜브(튜브 A)를 부드럽게 두드려 아가로즈를 튜브 바닥에 가라앉힌다.

4) 140 ㎕의 증류수를 첨가하여 기포 형성을 피하고, 재부유시킨다.

5) 튜브 A를 플로트(float)에 도입하고, 아가로즈가 용해될 때까지 이를 뚜껑 부근에 유지시키고 90-100℃에서 물에서 5분간 유동시킨다. 대안으로, 아가로즈의 용융은 마이크로웨이브 오븐에서 수행될 수도 있다.

6) 플로트를 보유하는 튜브 A를 37℃ 항온조로 이전하고, 실온에 도달하도록 5분간 방치한다.

7) 60 ㎕의 정액 샘플을 튜브 A의 내용물에 첨가하고 재부유시킨다.

8) 미리-처리된 슬라이드를 4℃에서 차가운 표면(가령, 금속 또는 유리 시트)에 위치시킨다.

9) 슬라이드가 냉각되면, 튜브 A의 세포 현탁액을 가라앉히고 유리 커버 슬립을 위치시켜 기포 형성을 피한다. 18x18 ㎜, 22x22 ㎜ 또는 24x60 ㎜의 커버 슬립에 각각 11, 17, 50 ㎕의 소량을 떨어뜨린다.

10) 슬라이드가 놓인 차가운 시트를 냉동기에 위치시키고, 샘플을 5분간 겔화시킨다.

샘플의 가공

11) 변성 용액을 제조한다. 이를 위하여, 튜브 B의 내용물 80 ㎕를 10 ㎕의 증류수에 첨가하고 혼합하고 녹색 상자에 위치시킨다.

12) 커버 슬립을 부드럽게 이동시켜 제거하고, 직후에 상기 슬라이드를 변성 용액에 수평으로 위치시키고 실온(22℃)에서 7분간 배양한다.

13) 장갑을 이용하여 랜싯의 보조로 슬라이드를 들어올린다. 이들을 수평으로 유지시키고 10 ㎖의 용해 용액을 보유하는 백색 용기(온도 조절된 튜브 C)에 수평으로 유지시킨다. 25분간 배양한다.

14) 슬라이드를 들어 올리고 풍부한 증류수를 보유하는 용기에 수평으로 위치시켜 용해 용액을 씻어낸다. 5분간 방치한다.

15) 슬라이드를 70% 에탄올을 보유하는 용기(2분), 이후 90% 에탄올을 보유하는 용기(2 분), 최종적으로 100% 에탄올을 보유하는 용기(2분)에 수평으로 위치시킨다.

16) 자연 건조시킨다. 처리된 슬라이드가 건조되면, 이들은 실온에서 서류 캐비닛(filing cabinet)에 수개월동안 보관할 수 있다.

샘플의 염색

투명 시야 현미경하에 관찰을 위한 염색:

- Wright 용액과 인산염 완충액(1:1)을 혼합하고, 염료 층을 수평으로 가라앉혀 건성 마이크로겔을 덮는다. 5-10분간 염색하고 주기적으로 취입(blowing)한다. 웃물을 따라버리고 흐르는 물에서 부드럽게 세척하며 자연 건조시킨다. 염료가 과다하면, 에탄올에서 염료를 제거하고 건조시키며 다시 염색할 수 있다. 특히 할로에서 염료가 약하면, 추가의 Wright 용액으로 다시 염색할 수 있다.

- 다른 가능성은 Hemacolor 2 용액(Merck 1.11956)을 보유하는 코프린 자(Coplin jar)에 수직으로 5분간 배양하고 10초간 수직으로 끄집어내고, 이후 Hemacolor 3 용액(Merck 1.11957)을 보유하는 다른 코프린자에서 5분간 수직으로 배양한다. 마지막으로, 증류수에서 부드럽게 세척하고 자연 건조시킨다. 영구 제조물이 요구되면, 이는 Entallan에 적재될 수 있다.

형광 현미경하에 관찰을 위한 염색

형광 필터의 가변성(variability)에 따라, 샘플은 페이딩 방지 매체(가령, Vectashield, Vector, ref: H-1000)에서 DAPI 유형의 DNA에 특이적인 형광색소, Hoechst 33258, 브롬화에티디움(ethidium bromide), 요오드프로피디움(propidium iodide) 등으로 염색할 수 있다.

안전 수칙과 환경

제공된 용액의 흡입과 접촉을 피한다.

용액 B와 C는 염산, 디티오트레이톨, Triton X-100을 함유한다.

제조업체에 의해 제공되는 사용설명서를 참조한다.

이용된 제품을 주변 환경으로 폐기하지 않는다. 독성 제품의 보관과 처리를 위한 시설의 가이드라인을 따른다.

생물학적 샘플은 잠재적인 감염성 물질로서 취급해야 한다.

보관과 안정성

4℃에서 보관해야 하는 용액 C를 제외하고 실온에서 보관한다. 사용 기한: 이들 시약과 물질은 최소 6개월동안 안정하다. 용액 B와 C는 세워서 보관하고 적절히 밀봉한다.

본 발명은 여러 분야에 적용가능하다. 인간 적용, 예를 들면, 세미노그램(seminogram) 파라미터가 정상적인 불임 개체로부터 샘플, 반복적인 유산을 겪은 부부, 체외 생식에 이용되는 샘플, 고환의 적출(extirpation)로 인하여 체외 생식 기술에서 장래 이용을 위하여 동결(냉동-보존)되는 샘플, 종양 질환으로 인하여 화학요법 및/또는 방사선요법을 받는 환자, 정관절제술(vasectomy)을 받는 환자 등에서 이의 유용성은 명백하다.

본 발명의 절차와 키트로 수행되는 연구는 정자 공여 후보자의 선별 기준을 개선할 뿐만 아니라 정자 은행에서 공여자로부터 샘플의 주기적인 평가를 수행할 수 있다. 또한, 정액과 수정의 특질에 대한 노령의 효과를 분석하는 것도 가능하다. 이는 정자의 완전성에 영향을 줄 수 있는 질환: 열병, 감염, 정계정맥류(varicocele), 스트레스, 직장이나 사고로 유전독성 물질(genotoxic agent)(살충제, 방사선, 환경 호르몬 등)에 대한 노출로 고생하는 환자의 평가에 이용될 수 있다. 이들 개체는 또한, 주기적인 평가를 받을 수도 있다. 마지막으로, 본 발명은 기본적인 연구와 임상학적 연구에 유용하다.

유사하게, 본 발명은 수의학 실험실에도 유용하다. 상이한 동물 종, 예를 들면, 육종 수컷, 보관된 샘플, 질병 과정, 멸종위기 종의 수컷, 독성 물질에 의해 야기된 손상의 평가에서 DNA 단편화 수준을 조사할 수 있다.

본 발명은 전술된 특징의 일부를 더욱 상세하게 예시하는 일부 실시예에 기초하여 기술한다.

실시예 1:

신선한 정액 샘플에서, 전술한 방법을 적용하여 크로마틴 분산 할로(chromatin dispersion halo)를 생산한다. 이를 위하여, PBS에서 ㎖당 10 x 10⁶개의 농도로 희석된 샘플은 1% 액체 낮은 겔화점(gelling point) 아가로즈와 혼합하여 0.7% 최종 농도의 후자를 획득하였다. 마이크로겔을 슬라이드 위에서 겔화시킨 이후, 샘플은 0.08M HCl로 구성되는 변성 용액에서 22℃에서 8분간, 이후 2.5M NaCl, 0.2M DTT, 0.2M Tris, 1% Triton X-100으로 구성되는 용해 용액(pH 7.5)에서 22℃에서 25분간 배양하였다. 슬라이드는 증류수에서 5분간 세척하고 에탄올 용액조에서 탈수시키며 자연 건조시켰다. 이후, 순차적으로 동일 세포에서, 전체 게놈 DNA 프로브를 이용한 DBD-FISH(DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization; Fernandez et al., 1998; 2000; 2002; Fernandez and Gosalvez, 2002)를 수행하였다. 상기 절차는 아가로즈 마이크로겔에 담겨지고 단백질이 제거되며 DNA가 조절 변성된 세포 핵에서 DNA 파괴의 검출과 정량이 가능하다. 이런 변성은 파괴의 말단으로부터 단일 사슬 DNA의 절편을 생산하는데, 이들은 적색 형광을 방출하는 형광색소(fluorochrome)(Cy3)로 표지된 전체 게놈 DNA 프로브를 이용한 in situ 혼성화로 검출된다. 세포 DNA에서 파괴의 수준이 높을수록, 혼성화 프로브의 양이 증가하고 획득되는 적색 형광이 증가한다. 본 발명의 절차에 따라 가 공된 샘플은 DNA에 존재하는 파괴의 가능 말단으로부터 변성 용액에 의해 생산되는 단일 사슬 DNA를 보유한다. 이런 이유로, 전체 게놈 DNA 프로브를 이용한 혼성화의 강도는 정자의 핵에 존재하는 파괴의 양과 상관한다.

무작위로 획득된 250개의 세포를 산정하였다. 크로마틴 분산 할로의 DAPI 염색된 영상은 청색으로 가시화되는 분산 할로 및 적색으로 가시화되는 혼성화 신호를 동시에 가시화시키는 2개의 필터를 이용하는 냉동된 CCD 카메라로 포착하였다. 최종 목적은 크로마틴 분산 할로(chromatin dispersion halo)의 크기 및 DNA 파괴의 마커 수준 사이의 상관관계를 확립하는 것이었다. 이의 결과는 DBD-FISH를 이용하여, 크로마틴 분산 할로의 상대적 면적 및 DNA 파괴의 마커 강도 사이의 역 상관관계를 입증하였다(표 1).

할로의 상대적 면적이 감소함에 따라, 혼성화의 전체 평균 밀도(MD)가 증가한다.

결과적으로, 본 발명의 절차를 이용하여 획득되는 크로마틴 분산 할로의 크기 측정은 인간 정자의 크로마틴/DNA의 완전성의 간편하고 직접적인 평가를 제공한다.

실시예 2:

체외 생식(assisted reproduction) 기술에 이용되는 정자 공여자의 평가를 위한 보충적인 방법.

체외 수정 클리닉에서, 정액 공여자로부터 10개의 샘플을 채취하였다. 통상적인 스페르모그램(spermogram)의 보충으로, 이들 샘플에서 DNA 단편화 수준을 측정하였다. 개체당 500개의 세포를 산정하였다. 본 실시예에서, 결과는 본 발명의 크로마틴 분산 할로 검사를 적용함으로써 획득하였다. 샘플은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 아가로즈 마이크로겔에 포함시키고 산과 용해 용액에서 배양하며 세척하고 탈수시키며 자연 건조시켰다. 본 실시예에서, 염색은 투명 시야 검경(clear field microscopy)을 위하여 DAPI가 아닌 Wright 염료로 수행하였다. 이를 위하여, Wright 용액은 인산염 완충액(1:1)과 혼합하고, 염료 층을 수평으로 가라앉혀 건성 마이크로겔을 덮었다. 이는 5-10분간 염색하고 주기적으로 취입(blowing)하였다. 흐르는 물에서 세척한 이후, 자연 건조시키고 핵양체(nucleoid)를 가시화시켰다. 이들 결과는 표 2에 제시한다. 상기 군에서 평균 단편화 수준은 모든 경우에 20% 이하이었다(15.4 ± 3.1).

10명의 정액 공여자에서 획득된 할로의 크기 범주의 비율 분포. 단편화 DNA를 보유하는 정자의 비율은 소형 할로, 할로 없음, 할로 없음-퇴화의 정자 범주의 합으로 구성되었다.

실시예 3:

불임 환자의 임상적 평가

체외 생식 클리닉에서, 정액 공여자로부터 17개의 샘플을 채취하였다. 통상적인 스페르모그램(spermogram)의 보충으로, 이들 샘플에서 DNA 단편화 수준을 측정하였다. 개체당 500개의 세포를 산정하였다. 전술한 실시예에서처럼, 결과는 본 발명의 크로마틴 분산 할로 검사를 적용함으로써 획득하였다. 이들 결과는 표 3에 제시한다. 상기 군에서 평균 단편화 수준은 모든 경우에 20% 초과이었다(49.9 ± 20.7).

17명의 환자에서 획득된 할로의 크기 범주의 비율 분포. 단편화 DNA를 보유하는 정자의 비율은 소형 할로, 할로 없음, 할로 없음-퇴화의 정자 범주의 합으로 구성되었다.

실시예 4:

본 발명은 인간 정자에 영향을 주는 독성학적 손상을 평가하는데 이용하였다. 외인성과 내인성 작용제에 의한 손상.

전형적인 실례로서, 산화질소(NO) 공여 화학물질에 의해 유도되는 DNA 손상을 분석하는 연구를 제공한다. 이를 위하여, 정상적인 개체로부터 50 ㎕ 분량의 완전히 새로운 정액 샘플을 상이한 용량의 소듐 니트로프루쎄이트(sodium nitroprussate, SNP)와 함께 실온에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 처리된 샘플은 부드럽게 원심분리하고 상층액을 버리며 SNP를 세척하였다. PBS에 재부유시킨 이후, 이들 샘플은 본 발명에 기술된 방법에 따라 가공하였다.

결과는 표 4에 제시한다. NO 공여자의 농도가 증가함에 따라, 손상된 크로마틴/DNA를 보유하는 정자의 비율이 증가하였다.

DNA에 손상을 유발할 수 있는 상이한 농도의 산화질소(NO) 공여 물질로 처리된 정액의 샘플에서 획득된 할로의 크기 범주의 비율 분포. 단편화 DNA를 보유하는 정자의 비율은 소형 할로, 할로 없음, 할로 없음-퇴화의 정자 범주의 합으로 구성되었다.

실시예 5:

동결된 정액 샘플을 이용한 검사의 재현성.

크로마틴 할로 분산 수준의 분석 방법을 이용하여 샘플의 특질에 영향을 줄 수 있는 2가지 요인: 동결과 희석을 조사하였다. 이를 위하여, 상이한 공여자로부터 4개의 새로운 샘플 및 액체 질소에 동결된 분량을 분석하였다. 이들 샘플의 분석은 샘플과 실험시점 마다 최소 2회 2개의 상이한 슬라이드에서 상이한 유형의 핵양체(500개의 세포)의 직접적인 시각적 산정(direct visual count)으로 수행하였다.

산정의 재현가능성. 각 슬라이드에 수행된 상이한 측정에 대한 종류내 상관 계수(intra-class coefficient of correlation)(R)를 계산하였다. 각 세포형에 대한 지수와 2가지 산정의 평균으로 계산의 결과는 0.78과 0.92의 수치에서 변화되는데, R 수치가 0 내지 1 범위에서 변화되는 점을 고려하면, 이는 높은 재현가능성(reproducibility)이 달성된다는 것을 입증한다(표 5).

냉동. 획득된 결과는 2가지 요인(보존 방법과 샘플)의 분산 분석(analysis of variance)을 이용하여 비교한다. 새로 가공된 샘플과 액체 질소에서 동결된 샘플의 단편화 수준에서 유의한 차이(P>0.05)는 관찰되지 않았다. 동결 시간 역시 단편화 DNA를 보유하는 정자의 비율에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(표 6).

결론적으로, 직접적인 시각적 분석이후 획득된 결과의 반복재현성이 확인된다.

실시예 6:

변성 용액과 용해 용액의 배양 순서의 변경을 이용한 인간 정자의 크로마틴/DNA의 완전성 분석:

이런 변경에서, 정자는 아가로즈 마이크로겔에 위치시킨 이후, 첫 번째 단계에서 키트에서 기술된 용해 용액에서 22℃에서 25분간 배양한다. 그 다음, 슬라이드를 0.88 HCl로 구성되는 변성 용액에 22℃에서 8분간 담근다. 최종적으로, 증류수 세척이후, 이들 슬라이드는 탈수시키고 Wright 용액으로 염색하며 투명 시야 현미경(clear field microscope)을 이용하여 관찰한다.

이런 기술적 변경을 이용하면 단편화 DNA를 보유하는 정자는 상이한 방식으로 행동한다. 본 실시예에서, 이들은 크로마틴/DNA 단편을 분산시켜 더욱 큰 할로를 발생시킨다.

실시예 7:

상이한 동물의 정자 샘플에 대한 이런 방법의 적용 결과.

제안된 방법의 보편적인 특성을 평가하기 위한 목적으로, 상이한 종의 수컷 개체를 선별하고, 특유의 세포 요소로서 정자에서 DNA 단편화 수준 및 이들의 꼬리의 병렬적인 시각적 연구를 수행하였다. 정자 샘플은 아래의 종으로부터 채취하였다: 생쥐(Mus musculus), 황소(Bos taurus), 가자미(Scophthalmus maximus), 지렁이(earth worm)(Lombricus terrestris). 이들 모든 종에서, 상기 기술의 적용은 크로마틴 분산 할로를 산출하고, 정상적인 DNA를 보유하는 정자와 단편화 DNA를 보유하는 정자를 비롯한 이들 정자의 꼬리를 확인할 수 있었다(도 4). 정자의 형태 및 생산된 할로의 유형은 각 종에서 특징적이다(4a는 황소에 해당한다; 4b, c, d는 생쥐에 해당한다; 4e는 지렁이에 해당한다; 4f는 가자미에 해당한다). 단편화 DNA를 보유하는 지에 상관없이, 정자의 형태는 종마다 상이하고, 인간에서 발견되는 정자와도 상이하다. 모든 경우에, 크로마틴 분산은 일치하고 인간 정자 샘플에서 발견되는 것에 필적한다. 다시 말하면, 상이한 크기의 크로마틴 분산 할로가 생산되고 정자의 꼬리가 가시화될 수 있다.

상이한 종으로부터 할로의 형태와 크기 및 획득된 결과는 아래와 같다:

황소의 경우에, 5명의 다른 관찰자가 독립된 샘플을 분석하였다. 본 실시예에서, 각 개체별로 단편화 DNA를 보유하는 정자 핵의 비율에서 차이가 관찰되었지만, 각 관찰자별로 획득된 비율간에 차이는 관찰되지 않았다(표 7).

생쥐의 경우에, 2가지 상이한 계통: 정상 계통(M1-32NNC) 및 다른 동족(consanguineous) 계통(M2-32BC)을 이용하였다. 상이한 유형의 할로에서 획득된 비율은 정상 계통(7.1)과 동족 계통(25.1) 사이의 명백한 차이를 보여준다(표 8).

특정 가자미에서, 대형 크로마틴 분산 할로와 소형 코어를 보유하는 정자는 소형 분산 할로와 대형 코어를 보유하는 정자 및 분산 할로가 없는 다른 정자와 구별될 수 있다. 결과는 표 9에 제시한다.

지렁이의 경우에, 앞선 경우에 기술된 바와 유사한 할로의 역동적인 발생이 유도되는데, 본 실시예에서는 정자의 머리와 꼬리 역시 완전하게 구별될 수 있다. 2마리의 개체(1마리의 어린 개체 및 1마리의 성숙 개체)에서 단편화 DNA를 보유하는 정자의 예측 비율은 각각 15%와 22%이었다. 본 실시예에서, 정자 머리에 부분적인 할로 형성이 나타나는데, 이의 중요성은 현재 조사 단계에 있다(참조: 도 4).

실시예 8:

크로마틴 부분 할로, 정자 꼬리, 백혈구의 동일한 세포학적 제조물의 가시화. 정자 샘플에서 DNA의 완전성에 대한 루코사이토스페르미아(leucocytospermia)의 효과 평가.

루코사이토스페르미아(leucocytospermia)는 정액(>5 x 10⁶/㎖) 샘플에서 백혈구의 비정상적 증가를 유발하는 바람직하지 않은 침입성 과정이다. 루코사이토스페르미아는 불임 남성의 10% 내지 20%에서 확인되고 있다. 정액에 존재하는 대식세포뿐만 아니라 호중구가 산화 스트레스(oxidative stress)를 유발하고 정자에서 DNA의 손상을 초래하는 ROS(반응성 산소 종)을 발생시킬 수 있다(Omu et al., 1999; Erenpreiss et al., 2002; Henkes et al., 2003). 실제로, 루코사이토스페르미아는 정자의 특질 분석에 이용되는 고전적 파라미터의 상이한 변칙과 연관하였다. 가령, 비정상적 정자의 발생률은 루코사이토스페르미아가 없는 개체의 샘플에서 47% 정도인 반면, 루코사이토스페르미아가 존재하는 경우에 비율이 88%로 증가한다(www.clevelandclinic.org).

상이한 병인(클라미도모나스(Chlamydomonas)와 박테리아 병원체에 기인한 전립선염(prostatitis)과 감염)으로 인한 높은 수준의 루코사이토스페르미아를 보이는 5명 환자의 샘플에서, 이런 기술에 대한 반응을 조사하여 정액 샘플에 존재하는 백혈구의 비율 및 동일 샘플의 정자에서 DNA 단편화 수준을 명확하게 구별하였다. 단편화 DNA를 보유하는 정자 및 이를 보유하지 않는 정자가 이들을 특징짓는 꼬리를 나타낸다는 점에서, 이들 샘플을 동일한 처리에 적용하는 경우에 양 세포형 사이의 차이는 명백하다. 백혈구에서 꼬리의 부재는 나머지 세포형으로부터 이들을 차별화시킨다(도 5).

이런 방식으로, 샘플당 백혈구 총수 및 정자에서 DNA 단편화 수준 사이의 직접적인 상관관계를 확립할 수 있다. 표 10에서는 상이한 병인의 루코사이토스페르미아를 앓는 5명 환자의 정액 샘플에서 백혈구 수준 및 정상적인 DNA(대형과 중간; L/M)와 단편화 DNA(소형 할로와 할로 없음(S/WH))를 보유하는 정자의 비율을 제시한다.

참고문헌

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Claims (15)

1. 동물 정자의 크로마틴/DNA 완전성(integrity)을 평가하는 방법에 있어서, 상기 방법은

   a) DNA 변성 용액으로 정자를 포함하는 샘플의 처리 단계;

   b) 핵 단백질을 추출하는 용해 용액으로 단일 처리 단계;

   c) 정자의 크로마틴/DNA 완전성의 평가 단계를 포함하고,

   상기 용해 용액은 단백질 변성 계면활성제를 함유하지 않고 정자의 꼬리를 파괴하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 단계 a)는 b) 단계를 선행하거나, 또는 단계 b)와 c)를 선행하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 용해 용액은 비-이온, 비-단백질 변성 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 비-이온 계면활성제는 톡틸페녹시폴리에톡시에탄올(Triton X-100), N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필) 콜라미드(bigCHAP), Brij(r)35 P, N-데카노일-N-메틸글루카민, 디지토닌(digitonin), 도데카노일-N-메틸글루카마이드, 헵타노일-N-메틸글루카마이드, 가지형 옥틸페녹시폴리 (에틸렌옥시) 에탄올(Igepal CA-630), N-노나노일-N-메틸글루카민, Nonidet P 40, N-옥타노일-N-메틸글루카민, Span 20 용액, 폴리소르베이트 20(Tween 20), 이들의 혼합물, 바람직하게는 Triton X-100에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항 내지 4항중 어느 한 항에 있어서, 용해 용액은 1 내지 3 M의 염화나트륨, 0.001 내지 2 M의 디티오트레이톨(DTT), 0.001 내지 2 M의 2-아미노-2(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(Tris), 0.1% 내지 3%의 Triton X-100을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 용해 용액은 2.5M 염화나트륨, 0.2M DTT, 0.2M Tris, 1% Triton X-100을 함유하고, 7.5의 pH를 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항 내지 6항중 어느 한 항에 있어서, DNA 변성 용액은 산인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, DNA 변성 용액은 염산, 아세트산, 질산 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 산을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, DNA 변성 용액은 염산을 함유하는 것을 특징으로 하는 방 법.
10. 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)와 b)이후, 샘플 염색 단계가 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 염색은 Wright 형 용액으로 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항 내지 11항중 어느 한 항에 있어서, 정자를 포함하는 샘플은 현탁액과 유사한 매체, 바람직하게는 마이크로겔(microgel)에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 정자를 포함하는 샘플은 아가로즈 마이크로겔에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 동물 정자의 특질을 평가하는 키트에 있어서, 상기 키트는

    a) DNA 변성 용액;

    b) 핵 단백질을 추출하는 용해 용액을 포함하고,

    상기 용해 용액은 단백질 변성 계면활성제를 함유하지 않고 정자의 꼬리를 파괴하지 않는 것을 특징으로 하는 키트.
15. 제 14항에 있어서, 용해 용액은 1 내지 3 M의 염화나트륨, 0.001 내지 2 M의 디티오트레이톨(DTT), 0.001 내지 2 M의 2-아미노-2(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(Tris), 0.1% 내지 3%의 Triton X-100을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.

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