PT1710320E - Método para determinação da fragmentação de adn em espermatozóides de animais - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA FRAGMENTAÇÃO DE ADN EM ESPERMATOZÓIDES DE ANIMAIS"

Descrição

ÁREA DA INVENÇÃO

Esta invenção tem a sua área de aplicação no sector da saúde, em especial a área relacionada com a reprodução biológica, em especial descreve os procedimentos e métodos para a determinação da qualidade do esperma em animais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Actualmente, 6% dos homens em idade fértil, nos paises ocidentais, possuem algum tipo de doença que evita a reprodução normal. Com esta finalidade, a Organização Mundial de Saúde (OMS) juntou uma série de procedimentos laboratoriais num único protocolo que harmoniza a análise à qualidade do esperma ao nível internacional. Estes estudos estão centrados na determinação da concentração, morfologia (Ankem Murali K et al. "Novel assay for determining DNA organization in human spermatozoa: Implications for male factor infertility" Urology, vol.59, n°4, April 2002) e motilidade do espermatozóide, complementada com a avaliação de certos testes funcionais, assim como de determinados parâmetros bioquímicos e enzimáticos (US-A-5801058) do sémen (OMS, 1999) . Este grupo de testes pode estimar o -2- volume total do mesmo e a concentração de espermatozóides por milímetro e pode ser diagnosticado se a infertilidade do homem é devida à ausência (azoospermia) ou à nítida diminuição (oligospermia) da quantidade de espermatozóides no ejaculado. Determina também a possibilidade da existência de problemas de motilidade (astenospermia) que torna impossível que estas células atravessem a cavidade uterina e consigam alcançar o terço exterior das trompas de Falópio. É também analisado se existem problemas graves de morfologia dos seus elementos (cabeça, pescoço, cauda) (teratozoospermia), visto que estas variações têm repercussões na capacidade para uma fertilização eficaz do óvulo feminino. Além disso, explora também a participação das glândulas, tais como a próstata e vesículas seminais (infecções, agenesia). Por último, com testes funcionais tais como o teste HOS (permeabilidade iónica da membrana celular) ou a capacidade de progressão do espermatozóide in vitro, eles dão uma ideia da capacidade de fertilidade do sémen. Finalmente, estes estudos laboratoriais têm por vezes que ser complementados com perfis hormonais, biópsia testicular e/ou a determinação do cariótipo (estudo do cromossoma que define a condição hereditária do sexo masculino ou feminino de um indivíduo) e/ou testes genéticos moleculares.

Apesar de estudos clínicos e laboratoriais, a causa da infertilidade não pode ser determinada em cerca de 30% a 50% dos homens inférteis, designada por infertilidade idiopática. Recentemente, foi reconhecido que os danos do ADN do esperma poderiam explicar a elevada percentagem destes casos (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000), de tal modo que o estudo da fragmentação do ADN é objecto -3- de investigação activa com continuas publicações em revistas especializados (Evenson et al., 2002). Podem ocorrer anomalias da cromatina, ou mesmo danos no ADN nuclear do espermatozóide, ou mesmo ser o resultado de anomalias no empacotamento de ADN que ocorre durante a espermatogénese (Sailer et al., 1995). Existe ainda a possibilidade de poderem ser o resultado de danos produzidos por radicais livres que provocam stress oxidativo (Aitken et al., 1998), uma consequência de um possível processo de apoptose (Gorczyca et al., 1993).

Existem métodos diferentes para a avaliação da integridade da cromatina/ADN dos espermatozóides humanos. Entre estes terá que se salientar a ruptura de ADN in situ através da introdução de nucleótidos marcados no espermatozóide usando enzimas, tais como a terminal transferase (TUNEL) ou ADN polimerase (nick translation in situ, ISNT) (Gorczyca et al., 1993). Estes métodos são baseados no uso de enzimas no espermatozóide fixado em lâminas de microscópio. Por este motivo, a sua eficiência não é muito elevada, a enzima apenas têm acesso às zonas marcadas de ADN com rupturas, o que conduz a uma reprodutibilidade relativamente baixa dos resultados. Os reagentes são também dispendiosos, por isso as técnicas são apenas utilizadas na investigação, não sendo possível utilizá-las para a avaliação clínica do sémen. Outra técnica é o ensaio comet (Hughes et al., 1996). O espermatozóide é incluído num microgel de agarose numa lâmina e é sujeito às soluções de lise para extrair as membranas e as proteínas. Desse modo, são obtidos os nucleóides, ou seja, núcleos desproteinizados, nos quais as espirais de ADN foram desenroladas devido ao alongamento. -4-

Os nucleótidos são sujeitos a electroforese num recipiente cheio de solução tampão, de tal modo que os filamentos de ADN migram para o ânodo, originando uma imagem de um cometa (comet), com uma cabeça e uma cauda na direcção da migração electroforética. Estes "cometas" são sujeitos a coloração com um corante fluorescente, a ser observado sob um microscópio de fluorescência. Se o núcleo possuir uma fragmentação de ADN, uma grande quantidade deles terá migrado, e estará concentrado na cauda do cometa. Trata-se de um teste bastante sensível, mas também relativamente dispendioso e complicado para um laboratório clínico convencional. De facto, exige um equipamento especialmente invulgar: fonte de alimentação da electroforese e um recipiente, um microscópio de fluorescência e um sistema de captação de imagens e a análise do mesmo. Por todos estes motivos, tal também não é aplicável ao estudo clínico do sémen e é utilizado apenas para fins de investigação. A actual técnica de referência para o estudo da fragmentação de ADN do espermatozóide é o ensaio da estrutura da cromatina por Evenson (SCSA: Sperm Chromatin Structure Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994) . Nesta técnica, os espermatozóides em suspensão são adicionados a uma solução de ácido desnaturante. Estes espermatozóides sem rupturas no seu ADN são resistentes a este ácido desnaturante, mantendo a sua cadeia dupla de ADN. Contudo, os espermatozóides com ADN fragmentado desnaturam eles mesmos o seu ADN, sendo transformado numa cadeia simples de ADN. São depois sujeitos a coloração com acridina cor de laranja. Este corante emite um verde fluorescente quando se liga à cadeia dupla de ADN. Contudo, no espermatozóide com ADN desnaturado, num único filamento, -5- este fluorocromo emite uma fluorescência vermelha: Os espermatozóides com ADN desnaturado são quantificados utilizando uma citometria de fluxo, para distinguir entre os dois tipos de fluorescência. A SCSA é uma técnica com amplo âmbito clinico, tendo sido avaliado um grande número de pacientes. Com este sistema, foi estabelecido que quando um indivíduo possui 30%, ou mais, de espermatozóides com ADN fragmentado, a sua probabilidade de uma gravidez chegar ao fim é inferior a 1%, e isto aplica-se na fertilização natural, assim como na reprodução assistida (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000). A percentagem de esperma com ADN fragmentado pode ser mais ou menos constante nos diferentes ciclos da espermatogénese de um indivíduo, mas pode também ser devido a factores exógenos, ou, por exemplo, após um forte episódio febril, tal como influenza (Evenson et al., 2000). Deste modo, podem ser feitos estudos em série, seleccionando as amostras com um nível baixo de fragmentação, para posteriormente serem utilizadas em técnicas de reprodução assistida. É importante ter em conta que congelar amostras de sémen em nitrogénio líquido não altera os níveis de fragmentação de ADN. Por isso, este teste pode ser efectuado em amostras congeladas, podendo ser mais tarde utilizadas na inseminação, IVF (fertilização in vítro) ou ICSI (Injecção Intracitoplasmática de Espermatozóides). Este tem uma grande vantagem operacional para o paciente e o laboratório. A técnica SCSA, apesar de robusta e altamente reproduzível, é um sistema dispendioso, difícil de implementar, e não muito acessível ao laboratório de rotina (De Jonge, 2002) . Por este motivo, a qualidade do ADN do -6- esperma não pode ainda ser rotineiramente avaliada, apesar do valor clínico verificado no estudo da infertilidade.

Recentemente, o nosso grupo de investigação descreveu uma técnica que permite que a cromatina do esperma humano seja dispersa in situ, demonstrando que esses espermas são incapazes de dispersar a cromatina contida no ADN fragmentado (Fernandez, J.L. et al., Journal of Andrology, 2003, vol.24, N°.l, pp.59 a 66; "The Sperm Chromatin Dispersion Test: a simple methos for the determination of sperm DNA fragmentation"). Com este método, as amostras de esperma são sequencialmente tratadas em microgel de agarose com uma solução ácida desnaturante, com duas soluções de lise e com uma lavagem de modo que possam ser depois secas e tingidas. Esta técnica, designada teste de Dispersão de Cromatina no Esperma (SCD), utiliza reagentes e condições excessivamente agressivos. O método descrito não fornece resultados consistentes, que tornam difíceis avaliações repetidas. Por outro lado, a qualidade e contraste das imagens obtidas e a reprodutibilidade dos resultados não são suficientemente bons para permitirem a aplicação comercial. Também, a estrutura do espermatozóide é afectada e a cauda não é visível nas amostras. Este problema é importante, pois o espermatozóide não pode ser facilmente distinguido das outras células na amostra, com o consequente erro na quantificação do número de espermatozóides com ADN/cromatina danificado.

Por isso, existe ainda a necessidade de um processo fiável que possa ser rotineira e facilmente utilizado para o estudo da qualidade do sémen em animais e, em especial, para avaliar a integridade da cromatina/ADN. O processo tem que ser robusto, fácil de implementar, barato e acessível -7- ao laboratório mais básico. Terá que solucionar os problemas anteriormente mencionados. Terá também que fornecer resultados homogéneos entre laboratórios e ser adequado para automação.

OBJECTO DA INVENÇÃO 0 objecto da invenção é um método rápido e preciso para a avaliação da integridade da cromatina/ADN das células de esperma em animais e que pode ser incluído na actividade rotineira de qualquer laboratório analítico, veterinário ou específico para reprodução humana.

Deste modo, um objecto da invenção é um método para avaliar a integridade da cromatina/ADN do esperma do animal compreendendo: a) uma fase de tratamento da amostra que contém o esperma, com uma solução desnaturante de ADN; b) uma única fase de tratamento com uma solução de lise para extrair proteínas nucleares; c) uma fase para avaliar a integridade da cromatina/ADN do esperma, caracterizada pelo facto de a solução de lise não conter um detergente desnaturante de proteína e essencialmente a cauda do esperma não é destruída.

Regra geral, é preferível que a fase a) preceda a b) .

Tal como indicado, a selecção da solução de lise é essencial para atingir os objectivos da invenção. Dentre os detergentes desnaturantes da proteína que não devem ser utilizados, temos os detergentes aniónicos e catiónicos, por exemplo SDS, docecil sulfato de sódio, alquil benzeno -8- sulfonato, ácido glicólico e sal hidratado, etc. Existem detergentes que rompem muito as membranas, com um efeito de lise e, ao mesmo tempo, activos na desnaturação das proteínas. Estes são utilizados na electroforese desnaturante, em que as proteinas são sujeitas à migração, garantindo a desnaturação completa (perda da estrutura tridimensional). Eles são especialmente activos num pH ácido, de preferência em bactérias Gram negativas. A sua actividade nos detergentes é elevada.

No método da invenção, será de preferência utilizado um detergente não-iónico desnaturante de proteínas, ou seja, um detergente que solubilize as proteínas mas não as desnature. Dentre estes são preferidos o toctilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100), N, N-bis (3-D-Gluconamidopropilo) colamida (bigCHAP), Brikj(r)35 P, N-decanoil-N-metilglucamina, digitonina, dodecanoil-N-metiloglucamina, heptanoil-N-metilglucamina, octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol ramificado (Igepal CA-630), N-Nonano-N-metilglucamina, Nonidet P 40, N-Octanol-N-metilglucamina, solução Span 20, Polissorbato 20 (Tween 20) . Triton X-100 é especialmente preferido devido aos seus bons resultados e à sua fácil disponibilidade. É preferível que a solução de lise possua força iónica suficiente para facilitar o processo de lise sem desnaturante. Verificámos que uma solução eficaz é aquela que contém entre 1M e 3M de cloreto de sódio, ditiotreitol (DTT) entre 0,001M e 2M, 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3 propanediol (Tris) entre 0,001M e 2M e Triton X-100 entre 0,1% e 3%. Especialmente adequada é uma solução que contenha NaCl a cerca de 2,5M, DTT a cerca de 0,2M, Tris a cerca de 0,2M, Triton X-100 a cerca de 1% e pH a cerca de -9- 7,5. A solução desnaturante de ADN é, de preferência, ácida, por exemplo de um ácido seleccionado do grupo dos ácidos clorídrico, acético, nítrico ou misturas destes. De preferência, deverá ser uma solução de ácido clorídrico. 0 método de acordo com a invenção possui uma avaliação da fase de integridade da cromatina/ADN do esperma após as fases a) e b). Apesar de estas serem várias alternativas para esta avaliação, é preferível que seja visual. Com este objectivo, o procedimento deverá incluir, de preferência, uma fase de coloração da amostra após as fases a) e b). Um corante que oferece excelentes resultados e permite que a cauda do esperma seja visualizada, assim como a formação do halo característico, é uma solução semelhante à de Wright.

Numa variação preferida, os espermas estão incluídos num veículo idêntico a uma suspensão, de preferência num microgel, em especial num microgel de agarose. A invenção diz também respeito a um Kit para avaliar a quantidade de esperma animal, compreendendo: a) uma solução desnaturante de ADN; b) uma solução de lise para extrair as proteínas nucleares; caracterizadas pelo facto de a solução de lise não conter um detergente desnaturante da proteína e por essencialmente não destruir as caudas do esperma. 0 Kit permite a execução do procedimento de acordo com a invenção atrás descrita.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS -10-

Figura 1. Parâmetros utilizados para a definição das dimensões de halos no esperma humano, de acordo com a metodologia da invenção, la: O nucleóide, que corresponde ao núcleo extensivamente desproteinizado do esperma, composto por duas partes: a silhueta do núcleo do esperma, designada núcleo, numa posição central, e o halo periférico da dispersão da cromatina/ADN. A cauda do esperma é visível. lb: Um filtro de descarga para uma melhor visualização e determinação dos limites entre o halo e o núcleo. lc: Diâmetro mais pequeno do núcleo, (a) e espessura do halo, (b), como uma amostra das medidas utilizadas para estabelecer as diferentes dimensões dos halos, tal como explicado na metodologia da invenção.

Figura 2: Diferentes tipos de espermatozóides definidos de acordo com as dimensões do halo produzido após a aplicação da metodologia da invenção. 2a: Espermatozóide com um halo de grandes dimensões. 2b: Espermatozóide com um halo de dimensões médias, 2c: Espermatozóide com um halo de pequenas dimensões. 2d: Espermatozóide sem halo. 2e: Espermatozóide sem halo e degradado. 2f: Área geral na qual são observados os diferentes tipos de espermatozóides previamente descritos.

Figura 3: Correlação entre as diferentes dimensões de halo visualizadas após a coloração com DAPI (a-e, fluoresceína azul) e o sinal de hibridação in situ utilizando a pesquisa de ADN genómico humano total, de acordo com a metodologia DBD-FISH (a'-e', fluoresceína vermelha) para visualizar o nível de fragmentação de ADN. 3a: Esperma com halo e sinal de hibridação fraco (3a'). 3b: Esperma com halo médio e sinal de hibridação fraco, apesar -li de ligeiramente mais alto do que no caso anterior (3')· 3c: Esperma com um halo pequeno e um incrível aumento no nível de hibridação (3c') . 3d: Esperma sem halo e um elevado nível de hibridação (3d'). 3e: Esperma degradado e demonstrando uma distribuição de hibridação irregular (3e') .

Figura 4: Aplicação do método da invenção às amostras de esperma das seguintes espécies: rato (Mus musculus), touro (Bos taurus), pregado (Scophthalmus maximus) e minhoca (Lombricus terrestris) . 4a, corresponde a um touro; 4b, c, d correspondem a um rato; 4e corresponde à minhoca; 4f corresponde ao pregado.

Figura 5: Amostra de um paciente com a presença níveis elevados de leucocitospermia. É observada a ausência de uma cauda nos leucócitos, o que lhes permite serem diferenciados do resto dos tipos de células.

DESCRIÇÃO DETALHADAS DA INVENÇÃO

Tal como será descrito em pormenor, o procedimento e o Kit da invenção são um sistema simples e fiável para a determinação da frequência de esperma com ADN fragmentado. A metodologia é aplicável em laboratórios de andrologia e clínicas de reprodução assistida e laboratórios de criação animal. Ξ também um sistema muito versátil pois é possível congelar as amostras e analisá-las quando necessário, sem provocar alterações nos resultados da análise. 0 procedimento da invenção, que permite a avaliação da integridade da cromatina/ADN e o esperma de um animal, compreende: a) uma fase de tratamento da amostra que contém o -12- esperma, com uma solução desnaturante de ADN; b) uma única fase de tratamento com uma solução de lise para extrair proteínas nucleares, que não contém um detergente desnaturante de proteína e, essencialmente não destrói as caudas do esperma; c) uma fase de avaliação da integridade da cromatina/ADN do esperma.

Entre outras, as principais diferenças do procedimento da invenção, no que diz respeito ao estado da técnica e em especial Fernandez, J.L. et al. Journal of Andrology, 2003, vol.24, 1, pp.59 a 66, estão basicamente no campo da lise e coloração. Assim, é utilizada uma única solução de lise, em vez de duas sequenciais. A composição é diferente, visto que não contém SDS (detergente desnaturante da proteína aniónica) ou EDTA (agente quelante). Pode incluir um detergente relativamente macio, neutro e não-desnaturante, tal como o Triton X-100.

Tecnicamente, estas diferenças conduzem à preservação das caudas do esperma. E um melhoramento essencial, pois a sua detecção é uma informação indispensável para poder discriminar se as imagens dos nucleóidenucleóides provêm mesmo do esperma ou correspondem aos tipos de células exteriores que podem estar presentes, por exemplo, células descamadas do tracto urogenital, células inflamatórias, sanguíneas, etc. Esta persistência é obtida utilizando uma lise muito menos agressiva, assim como a exclusão da utilização de SDS.

Também, a lise mais suave atinge o desdobramento dos filamentos de cromatina, preservando melhor a morfologia da cabeça ou do núcleo, e obtendo a dispersão de halos com uma densidade mais elevada de material de -13- cromatina, resultando neles uma coloração mais intensa. Como resultado, o contraste e a visualização dos diferentes tamanhos de halos são muito melhorados, especialmente quando é utilizada a coloração de Wright.

Outra vantagem significativa é a ausência de um detergente desnaturante da proteína, tal como SDS, permitindo a utilização sequencial da técnica aqui descrita com outros que permitem a visualização de outros elementos celulares. Deste modo, nos nucleóidenucleóides obtidos, de acordo com a metodologia descrita, podem ser aplicados métodos para a imunodetecção de proteínas, tipos de proteína laminina e outras proteínas nucleares, assim como a detecção do ARN associado à matriz nuclear, à medida que o ADN é alongado, sendo a quantidade da estrutura nuclear mantida o mais possível. Isto é importante nalguns tópicos de investigação da estrutura nuclear do esperma.

Outra vantagem adicional é a utilização de uma quantidade baixa de reagentes e, consequentemente, com menos custos financeiros. Por exemplo, o DTT é especialmente dispendioso, e a redução da concentração descrita nos exemplos (um quarto do descrito no artigo) tem um custo significativo. 0 que se pode concluir com tudo o que foi declarado é que o procedimento da patente resulta em imagens muito melhoradas e mais reproduzíveis dos nucleóidenucleóides do esperma relativamente ao estado da técnica. É possível discriminar se os nucleóides provêm, ou não, de esperma maduro ou de outros tipos de células, e a classificação das dimensões do halo é muito mais precisa e fiável. Consequentemente, com o procedimento da patente, a determinação dos níveis de fragmentação de ADN da amostra é -14- muito mais fiável, o que significa que pode ser rotineira e simplesmente utilizado com um baixo custo. A sua aplicação é relevante em laboratórios diferentes, no cenário clinico e nas amostras de seres humanos, assim como nos laboratórios veterinários para o estudo de amostras de animais. Isto é muito importante, pois trata-se de um teste com uma possivel aplicação clinica a pacientes. A sequência de fases do tratamento da amostra pode ser efectuada em qualquer ordem, primeiro com uma solução desnaturante de ADN, seguida por uma fase de tratamento com uma solução de lise, ou vice-versa. Mas é preferível tratar a amostra antes com a solução desnaturante de ADN e depois com a solução de lise, pois obtém-se melhores resultados. Noutra variação (lise seguida por desnaturação do ADN) os espermatozóidess com o ADN fragmentado têm um comportamento diferente. Neste caso, eles dispersam fragmentos de cromatina/ADN, dando origem a halos de grandes dimensões. Mesmo um único tratamento com uma solução de lise pode ser suficiente para observar este comportamento, apesar de a discriminação das dimensões do halo não ser muito precisa. 0 procedimento da invenção é estabelecido em baixo em pormenor, juntamente com algumas variações e fases opcionais. Os entendidos na técnica irão compreender que existem outras maneiras de execução e outras possibilidades desde que os aspectos fundamentais descritos sejam mantidos. A primeira fase é a da preparação da amostra. Esta é obtida com a utilização de procedimentos comuns a esta área e a concentração de esperma na amostra é determinada. A concentração adequada para esta análise varia entre 0,1 e 20 milhões de células por milímetro. Se a amostra for -15- altamente concentrada, ela deverá ser ajustada a uma concentração adequada através da diluição com um meio de cultura ou com uma solução tampão de fosfato/salina (PBS) ou idêntica. A amostra de sémen tem que ser colocada num suporte para o seu processamento de acordo com o procedimento da invenção e para tornar a sua avaliação mais fácil. Esse suporte deverá ser, de preferência, uma lâmina de vidro que pode ser tapada com uma película de agarose padrão. Para tal, é preparada uma solução entre 0,2% e 1% de agarose padrão em água destilada num frasco Coplin, ou idêntico. Deverá ser tapado com uma gaze de plástico e colocado num forno microondas. O forno microondas deverá ser colocado entre 300W a 1000W, por exemplo 500W, agitando o recipiente para dissolver a agarose, deixando-a até que ferva. Este procedimento pode ser efectuado utilizando um banho termostático. Quando a solução de agarose ficar completamente transparente, será então preparada colocando-a em recipientes verticais de entre lOml e 250ml. Estes recipientes deverão ser previamente aquecidos entre 60°C a 100°C, por exemplo 70°C, num banho, para manter a solução de agarose no estado líquido.

Antes de introduzir as lâminas na solução de agarose, estas devem ser limpas esfregando-as com um pano para eliminar possíveis impurezas. As lâminas são imersas na vertical, sendo seguradas com pinças na área congelada, durante 1 a 60 segundos, sendo retiradas e novamente imergidas entre 1 a 10 vezes, até à formação de uma película homogénea na lâmina. As lâminas são colocadas na horizontal numa superfície macia, por exemplo um vidro ou metal, e arrefecidas entre 1°C e 15°C, de preferência 4°C. -16-

Este prato com as lâminas, é colocado no frigorífico a 4°C durante 30 minutos, até que se verifique que a agarose se transformou em gel na superfície das lâminas. Os tabuleiros são removidos do frigorífico e a superfície da lâmina que esteve em contacto com o prato é limpa com papel mata-borrão. A seguir, as lâminas são colocadas na horizontal numa câmara de secagem a uma temperatura na ordem doa 37°C a 100°C, até que a agarose esteja completamente seca e forme uma película fina aderente ao vidro. As lâminas assim tratadas podem ser imediatamente utilizadas ou armazenadas numa caixa bem fechada a uma temperatura ambiente durante vários meses.

Para tornar o processamento da amostra que contém o esperma mais fácil, esta pode ser incluída num meio com características semelhantes às da suspensão, tais como, por exemplo, um microgel de agarose. Neste caso, é preparada uma solução de agarose de fusão/gelificação a baixa temperatura, a uma concentração entre 0.5% e 2% em água destilada. A gelificação deste agar é efectuada num forno microondas ou num banho termostático, e é depois mantida entre 30°C e 37°C num tubo colocado num banho termostático ou numa câmara de secagem. O sémen e a solução de agarose são cuidadosamente misturados num tubo Eppendorf, ou idêntico, de maneira que este último esteja numa concentração de entre 0.3% e 1%. Por exemplo, 70 microlitros de solução de agarose + 30 microlitros da amostra. É importante que a solução de agarose não esteja acima dos 37°C, de modo a não danificar as células.

Finalmente, para que a amostra fique por cima do suporte, as lâminas tapadas são colocadas numa superfície macia e fresca de vidro ou metal, com uma temperatura que -17- varia entre 1°C e 15°C, evitando a formação de bolhas de ar. É recomendável depositar uma pequena quantidade de cerca de 5 a 200 microlitros da mistura com uma micropipeta, colocando uma lamela por cima. Como precaução, é recomendável processar cada amostra em duplicado, e utilizar uma amostra de controlo cada vez que a técnica é aplicada. O prato com as lâminas é colocado num frigorifico a 4°C, entre 2 a 30 minutos até ser produzida a gelificação adequada da agarose. Logo que ocorre a gelificação, as lâminas são então retiradas, muito devagar, do mesmo frigorifico e deverá ser assegurado que o microgel não é danificado.

Assim que as amostras são adequadamente preparadas para o ensaio e manuseamento repetido, são então tratadas de acordo com o procedimento da invenção com a fase de tratamento com a solução desnaturante de ADN e uma fase lise para extrair as proteínas nucleares.

Numa variação preferida, as lâminas com a amostra são primeiro colocadas na horizontal num recipiente que contém a solução desnaturante. A solução desnaturante de ADN pode ser um ácido, por exemplo uma solução de ácido acético, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ou alcalina, como por exemplo uma solução de hidróxido de sódio, hidróxido de bário, hidróxido de potássio, em fracas concentrações. Numa variação preferida, é utilizada uma solução de ácido clorídrico numa concentração que varia entre 0,01N e 0,5N, de preferência entre 0,1N e 0,3N, especialmente preferível é uma concentração de cerca de 0,2N. É recomendável que esta solução seja preparada no mesmo dia que seja efectuado o teste e as lâminas mantidas na solução desnaturante de ADN entre 1 a 15 minutos a uma temperatura entre 1°C e -18- 37°C, de preferência 18°C a 25°C, e preferencialmente 20 a 22°C.

Logo que esta parte do processo esteja concluída, a lise da amostra é depois efectuada com uma única solução de lise, suficientemente macia de modo a não destruir as caudas do esperma. Por este motivo, cada lâmina é imersa, na horizontal, noutro recipiente que contenha a solução.

Tal como anteriormente mencionado, a solução de lise é seleccionada de tal modo que atinja a exposição dos filamentos de cromatina preservando melhor a morfologia da secção da cabeça e, desse modo, a formação dos halos característicos com uma densidade mais elevada de material da cromatina. Deverá também ser suficientemente suave para a preservação das caudas do esperma. Tal é obtido ao serem evitados detergentes agressivos e desnaturantes da proteína. Adicionalmente, o controlo da concentração iónica pode também permitir a modulação deste efeito.

Numa variação preferida, esta solução é composta por: cloreto de sódio entre 1M e 3M, de preferência entre 2M e 3M; ditiotreitol (DTT) entre 0.001M e 2M, de preferência entre 0,01M e 0,8M; 2-amino-2(hidroximetilo)-1,3-propanodiol (Tris) entre 0,001M e 2M, de preferência entre 0,01M e 0,4M; e Triton X-100 entre 0,1% e 3%, de preferência entre 0,5%—1,5%. Esta solução é ajustada ao pH entre 6,5 e 8,5, de preferência 7-7,5.

Existem outras soluções lise alternativas, ou as concentrações e tempos e temperaturas de incubação da solução podem variar desde que sejam mantidas as suas características funcionais. Também, como alternativas ao DTT, existem compostos como o beta-mercaptoetanol e outros agentes de redução. Como alternativas ao Tris, podem ser -19- utilizadas outras soluções tampão, tais como Hepes, Mops, e Pipes. Como uma alternativa ao Triton X-100, podem ser utilizados outros detergentes neutros, tal como anteriormente mencionado.

Dependendo da solução empregue e o tipo de amostra, os preparados são incubados na solução de lise durante entre 1 e 60 minutos, de preferência entre 15 e 35 minutos, sendo que um periodo de cerca de 25 minutos é preferível; e a uma temperatura ambiente entre 1°C e 37°C, de preferência entre 18°C a 25°C, sendo que uma temperatura entre 20°C a 22°C é especialmente preferível.

Como uma alternativa total ao processo anteriormente descrito, a ordem de incubação nas soluções desnaturantes e lise podem ser invertidas. Os efeitos na cromatina do esperma permitem também que o esperma com cromatina/ADN danificado seja descriminado do restante esperma. Os pormenores das diferenças obtidas serão descritos no Exemplo N° 6.

Após o tratamento com solução desnaturante de ADN e com a solução de lise, os preparados podem ser lavados para eliminar os restos destas soluções. Por este motivo, é utilizada a solução mais suave possível, evitando agentes quelantes ou detergentes. Por exemplo, eles são imersos na horizontal num recipiente com água destilada em abundância ou uma solução tampão ou salina fisiológica durante um período de tempo entre 1 e 60 minutos. A amostra é depois desidratada. Para tal podem ser utilizadas concentrações elevadas de álcool. Por exemplo, as lâminas são também levantadas e imergidas na horizontal, em recipientes com uma série de concentrações elevadas de etanol, entre 5% e 100%, cada uma durante 30 segundo a 60 -20- minutos, e depois os preparados são deixados a secar ao ar. Como uma alternativa às incubações numa série de etanol, os preparados podem ser desidratados através de incubação em diferentes álcoois como o metanol, ou mesmo deixados a secar ao ar ou numa câmara de secagem.

Assim que se encontram secas, as lâminas que contêm a amostra de sémen, já processadas podem ser armazenadas em caixas de armazenamento à temperatura ambiente durante meses. Isto ajuda a separar o processo de tratamento de acordo com a invenção e a próxima fase de avaliação da integridade da cromatina/ADN do esperma. O armazenamento permite avaliações repetidas em diferentes intervalos de tempo de várias amostras do mesmo indivíduo.

Assim que as amostras são tratadas de acordo com a invenção, elas passam para a fase de avaliação. Existem vários processos possíveis para avaliar a integridade da cromatina/ADN do esperma, tal como anteriormente indicado. A vantagem é a de que as amostras tratadas de acordo com a invenção são muito mais transparentes para permitirem visualizar se o halo e a estrutura do esperma foram mantidos, em especial a integridade das caudas, permitindo-lhes claramente distinguir os outros tipos de células.

Numa variação preferida é aplicado um corante à amostra, facilitando a avaliação visual. A escolha das condições de coloração adequadas pode possibilitar a obtenção de imagens de elevada qualidade e uma elevada consistência nos resultados de avaliação. Existem várias estratégias para coloração, dependendo se for utilizado um microscópio convencional, um microscópio de campo ou um microscópio de fluorescência. -21-

Coloração para a observação com um microscópio de campo

Neste caso, as colorações que foram aqui utilizadas são, Wright, Giemsa, Orcein, reagente Schiff, carmim acético, tipos de tiazina e misturas de tipos Romanowsky ou derivados do anteriormente mencionado (ver bandeamento cromossomático por AT Summer, pp. 90 a 91).

Os corantes como os Wright são preferidos devido à coloração mais intensa da amostra e, em especial, dos halos. Com estes corantes, o contraste e a descriminação visual dos halos de diferentes tamanhos são significativamente melhorados. Têm também a vantagem do baixo custo e fácil disponibilidade para qualquer tipo de laboratório. O seu uso permite que as caudas sejam visualizadas, visto que estas não são habitualmente visíveis nos corantes ADN com os fluorocromos utilizados para microscópios de fluorescência. É importante realçar que este corante é muito fácil de manusear para obter o nivel de coloração desejado, um facto que não é possível com Diff-Quik ou outros idênticos.

Outros corantes, tais como Diff-Quik, descritos por Fernandez, J.L. et al. in Journal of Andrology, 2003, vol.24, No.l, pp59 a 66, são consideravelmente mais fracos e não atingem um contraste adequado do halo relativamente ao fundo. Consequentemente, quando o halo é muito disperso, é normalmente difícil visualizar o seu contorno periférico, fazendo-se, por vezes, confusão com um halo pequeno, atribuindo-se, assim, a categoria de fragmentação a um esperma que contém ADN intacto. Ou seja, o procedimento da -22- publicação tem uma tendência para sobrestimar os níveis de fragmentação, em especial na coloração de campo. Isto é relativamente estranho para um teste com aplicação possível em indivíduos. Por isso, é óbvio que esta melhoria possui enorme relevância na fiabilidade da técnica.

Numa variação da coloração da amostra, a solução de Wright (Merck 1.01383.0500) é misturada com uma solução tampão de fosfato por exemplo com um pH 6,88 (Merck 1.07924.1000) numa taxa de 1:30 e 30:1 (v/v). Uma camada de coloração é depositada na horizontal, devendo tapar o microgel seco. O tempo de coloração para obter um contraste óptimo varia entre 30 segundos e 60 minutos. É recomendável soprar ocasionalmente a camada de coloração. O excesso de coloração é decantado, as lâminas são cuidadosamente lavadas com água corrente e deixadas a secar. Se o corante for excessivo, pode ser lavado, com a mesma intensidade, em água. Outra possibilidade é descolorar com etanol, secar e colorar novamente. Se o corante for fraco, em especial na área de dispersão dos halos da cromatina, pode ser novamente directamente colorada com a solução de Wright.

Como alternativas, podem ser utilizados outros corantes tais como Hernacolor 2 (Merck 1.11956) e Hernacolor 3 (Merck 1.11957), Giemsa, assim como outras soluções de coloração da mesma família.

Coloração para a mesma observação sob microscópio de fluorescência:

Dependendo da disponibilidade dos filtros de fluorescência, as amostras podem ser coloradas com fluorocromos específicos para o ADN do tipo DAPI, Hoechst 33258, brometo de etídio, iodeto propidium, etc., num meio -23- fixador (por exemplo, Vector H-1000).

Se forem desejados preparados permanentes, as lâminas processadas e coloradas podem ser incluídas no meio de montagem (por exemplo, Entellen; Merck 1.07961).

Finalmente, a integridade da cromatina/ADN do esperma é avaliada pelo procedimento de distinção dos tipos de células. Tal como foi já mencionado, o procedimento da invenção torna esta avaliação muito mais fácil no que diz respeito ao estado da técnica.

As imagens obtidas podem ser estudadas por análise visual directa ou por software de análise de imagens de aplicação digital, obtidas pela utilização de câmaras analógicas ou digitais, ligadas às plataformas do microscópio.

No início, é recomendável o estudo do mínimo de 500 espermatozóides por amostra, adoptando os seguintes critérios básicos (ver Figura 1 e Figura 2). 1. Espermatozóide sem halo de dispersão de cromatina (Figura 1) . 2. Espermatozóide sem halo de dispersão de cromatina e degradado: aqueles que não demonstram um halo, possuem uma cabeça fragmentada em grânulos ou demonstram uma coloração muito fraca (Figura 1). 3. Espermatozóide com halo de dispersão de dimensões reduzidas: a espessura do halo é inferior ou igual a 1/3 do diâmetro mais pequeno do núcleo (Figura 1). 4. Espermatozóide com halo de dispersão de dimensões médias: a espessura do halo é entre: mais do que 1/3 do diâmetro mais pequeno do núcleo e inferior ao diâmetro do núcleo (Figura 1) . 5. Espermatozóide com halo de dispersão de grandes -24- dimensões: espermatozóide em que o halo é maior ou igual ao diâmetro mais pequeno do núcleo (Figura 1). 6. Outros: núcleos celulares que não pertencem ao espermatozóide. Uma das características morfológicas que os distingue é a ausência de uma cauda.

Os espermatozóides com ADN fragmentado podem ser considerados aqueles sem halo de dispersão da cromatina 1, aqueles que estão presentes sem halo de dispersão da cromatina e degradados 2, e aqueles com um halo de dispersão de pequenas dimensões 3. Os espermatozóides com um halo de dispersão da cromatina de dimensões médias ou grandes e ADN fragmentado derivam dos resultados obtidos com a utilização da técnica DBD-FISH (Hibridação Fluorescência de Detecção da Ruptura de ADN In Situ; Fernandez et al., 1998; 2000; 2002; Fernandez e Gonzalez, 2002). Este procedimento permite a detecção e quantificação de rupturas do núcleo celular do ADN, desproteinizado e sujeito à desnaturação controlada do ADN. Esta desnaturação origina ADN de cadeia simples das extremidades das rupturas, detectadas por hibridação in situ utilizando uma pesquisa de ADN genómico total marcada com um fluorocromo, visivelmente utilizando um microscópio de fluorescência. Quando o nível de rupturas na célula de ADN é elevado, mais elevada é a quantidade da sonda hibridizada e a fluorescência observada. As amostras processadas de acordo com o método descrito nesta invenção contêm ADN de cadeia simples, originada pela solução desnaturante, a partir de possíveis extremidades das rupturas existentes no ADN. Por isso, a intensidade da hibridização utilizando a sonda de ADN genómicogenómico total, será em relação à quantidade de rupturas presentes no núcleo do espermatozóide. Deste modo -25- confirmámos que os nucleóides sem halo, ou com um halo de dimensões reduzidas, demonstram uma marcação intensa com DBD-FISH, demonstrando a fragmentação intensa do seu ADN (Figura 2). Os restantes nucleóides demonstram níveis muito baixos de marcador com esta sonda, correspondendo à profundidade de hibridação pelo próprio tratamento da cromatina. A invenção contempla também um Kit para a avaliação da integridade da cromatina/ADN de esperma animal. Este Kit contém uma solução desnaturante de ADN, uma solução de lise para extrair as proteínas nucleares, caracterizada na medida em que a solução de lise não contém um detergente desnaturante da proteína e essencialmente não destrói as caudas do esperma. As soluções desnaturantes de ADN preferidas e as soluções lise preferidas são descritas em cima.

Opcionalmente, o Kit pode também conter o suporte previamente tratado, por exemplo com agarose, assim como uma solução para a preparação de um meio com características semelhantes a uma suspensão que poderá conter a amostra. Por exemplo, uma solução de agarose de baixo ponto de gelificaçãogelificação que permite a preparação de um microgel. 0 conteúdo e as instruções para a utilização de um Kit de acordo com uma variação da invenção encontram-se a seguir detalhados:

Descrição do conteúdo do Kit Lâminas previamente tratadas*

Tubos Eppendorf com agarose de baixo ponto de gelificaçãogelificação, tubo (A)

Tubo com HC1 a 37% , tubo (B) -26-

Tubos com solução de lise, tubo C*. Composição: 2, 5M NaCl, 0,2M DTT, 0,2M Tris, 1% Triton X-100, pH 7,5

Recipientes de processamento para a solução desnaturante e para a solução de lise. Lanceta Flutuadores para os tubos Eppendorf * Preparação tal como anteriormente referida na descrição.

Material e equipamento necessário

Microscópio de campo claro ou de fluorescência (recomendada objectiva de imersão ) Frigorífico a 4°C Banho de incubação a 37°C Luvas de plástico

Lamelas de vidro (18xl8mm, 22x22mm ou 24x60mm) Micropipetas 4 recipientes horizontais para incubação Água destilada

Etanol a 70%, 90%, 100%

Instruções de utilização

Preparação de uma amostra para as lâminas 1) Retire um frasco C para colocar a solução de lise à temperatura ambiente (22°C) 2) Dilua a amostra de sémen no meio de cultura ou PBS, num concentrado de 5 a 10 milhões por milímetro. Podem ser utilizadas amostras frescas ou directamente congeladas em nitrogénio líquido.

Preparação do microgel de agarose 3) Perfure cuidadosamente um tubo Eppendorf com agarose em baixo ponto de gelificação (Tubo A), na -27- vertical, para depositar a agarose no fundo do tubo. 4) Adicione 140 microlitros de água destilada, evitando a formação de bolhas, e coloque novamente em suspensão. 5) Introduza o Tubo A no flutuador, deixando-o ao nivel da tampa, e deixe-o a flutuar 5 minutos em água a uma temperatura de 90 a 100°C, até que a agarose seja dissolvida. A fusão da agarose pode ser alternativamente efectuada num forno microondas. 6) Transfira o Tubo A com o flutuador, para um banho termostático de 37°C, e deixe durante 5 minutos para atingir a temperatura. 7) Adicione 60 microlitros da amostra de sémen no conteúdo do Tubo A e coloque novamente em suspensão. 8) Coloque uma lâmina previamente tratada numa superficie fria, a 4°C (por exemplo, uma folha de metal ou de vidro). 9) Assim que as lamelas tiverem arrefecido, deposite a suspensão de células do Tubo A e coloque uma lamela de vidro, evitando a formação de bolhas de ar. É recomendável depositar uma pequena quantidade de 11, 17 e 50 microlitros para uma lamela de 18xl8mm, 22x22mm ou 24x60mm, respectivamente. 10) Coloque a folha fria com as lâminas no frigorífico e deixe a amostra a gelificar durante 5 minutos.

Processamento das amostras 11) Prepare a solução desnaturante. Para tal, adicione 80 microlitros do conteúdo do Tubo B em 10 microlitros de água destilada, misture e coloque-a na caixa verde. -28- 12) Remova as lamelas, deslizando-as levemente, e imediatamente coloque a lâmina, na horizontal, na solução desnaturante e deixe a incubar durante 7 minutos à temperatura ambiente (22°C). 13) Levante as lamelas com o auxilio de uma pinça, utilizando luvas. Mantenha-as na horizontal, e coloque-as na horizontal no recipiente branco com 10 ml de solução de lise (Tubo C a esta temperatura). Incube durante 25 minutos. 14) Levante as lâminas e coloque-as na horizontal num recipiente com água destilada abundante para retirar a solução de lise. Deixe durante 5 minutos. 15) Coloque as lâminas, na horizontal, num recipiente com etanol a 70% (2 minutos), depois com etanol a 90% (2 minutos), e, finalmente, com etanol a 100% (2 minutos). 16) Deixe a secar ao ar. Assim que as lâminas processadas estão secas podem ser guardadas em armários, à temperatura ambiente durante meses.

Coloração das amostras

Coloração para observação em microscópio de campo claro: - Misture a solução de Wright com a solução tampão de fosfato (1:1), e deposite a camada de coloração, na horizontal, que irá cobrir o microgel seco. Deixe a colorir durante 5 a 10 minutos, soprando-a ocasionalmente. Decante, lave cuidadosamente com água corrente e deixe a secar. Se a coloração for excessiva, pode ser descolorada em etanol, seca e novamente colorida. Se a coloração for fraca, em especial nos halos, pode ser novamente colorida com mais -29- solução Wright .

Outra possibilidade é a incubação durante 5 minutos, na vertical, num frasco Coplin com solução Hemacolor 2 (Merck 1.11956), deixada a escorrer na vertical durante 10 segundos e depois incubando noutro frasco Coplin, na vertical, com solução Hemacolor 3 (Merck 1.11957), durante 5 minutos. Finalmente, lavar cuidadosamente com água destilada e deixar secar. Caso seja desejado um preparado permanente, tal pode ser efectuado em Entallan.

Coloração para a observação sob um microscópio de fluorescência

Dependendo da variabilidade de filtros de fluorescência, as amostras podem ser coloridas com fluorocromos específicos para o ADN do tipo DAPI, Hoechst 33258, Brometo de etidio, iodeto propidium, etc., num meio fixador (por exemplo Vectashield, Vector H-1000).

Segurança e ambiente

Evitar a inalação e o contacto com as soluções fornecidas.

As soluções B e C contêm ácido clorídrico, ditiotreitol e Triton X-100.

Consultar as especificações fornecidas pelos fabricantes. Não eliminar os produtos utilizados para o ambiente. Siga as orientações do Centro para armazenamento e despejo de produtos tóxicos.

As amostras biológicas devem ser manuseadas como potencialmente infecciosas. -30-

Armazenamento e estabilidade

Armazene à temperatura ambiente, excepto a solução C que deverá ser armazenada a 4°C. Data de validade: os reagentes e materiais são estáveis durante um período mínimo de 6 meses. É recomendável que as soluções B e C sejam mantidas na vertical e bem vedadas.

Esta invenção tem diferentes áreas em que a sua aplicação é relevante. A sua utilização em aplicações no humano é óbvia. Por exemplo, nas amostras de indivíduos inférteis cujos parâmetros de sémen são normais, em casais com abortos repetidos, em amostras utilizadas para a reprodução assistida, em amostras com o objectivo de serem congeladas (criopreservação) para futura utilização em técnicas de reprodução assistida devido a extirpação dos testículos. Também em pacientes sujeitos a quimioterapia e/ou radiação devido a doenças oncológicas, e antes de efectuarem uma vasectomia. O estudo efectuado com o procedimento e o Kit da invenção pode melhorar os critérios de selecção dos candidatos dadores de esperma, assim como complementar a avaliação periódica das amostras de dadores, nos bancos de esperma. É também possível analisar o efeito da idade avançada na qualidade do sémen e na fertilidade. A sua aplicação é interessante para a avaliação de pacientes com doenças que poderiam afectar a integridade do esperma: febre, infecções, varicocele, stress, exposição a agentes genotóxicos no trabalho ou acidental (pesticidas, radiação, estrogénios no ambiente, etc.), tratamentos hormonais, ou exposição repetida a muito calor (profissões associadas a fornos quentes, cerâmica, vidro, ou condutores de -31- veículos). Estes indivíduos podem também ser periodicamente avaliados. Por último, a invenção é útil na investigação básica e clínica.

Do mesmo modo, a invenção é também útil nos laboratórios veterinários. É possível estudar o nível de fragmentação de ADN em diferentes espécies animais, por exemplo machos reprodutores, nas amostras armazenadas, nos processos de doenças, nos machos das espécies em perigo de extinção e na avaliação de danos causados por agentes tóxicos.

EXEMPLOS A invenção será descrita com base nalguns exemplos que irão ilustrar com maior pormenor algumas das características anteriormente descritas.

Exemplo 1:

Na amostra de sémen fresco, a metodologia descrita é aplicada para produzir halos de dispersão de cromatina. Para tal, a amostra a uma concentração diluída de 10 milhões por mililitro, em PBS, foi misturada 1% de agarose líquida de baixo ponto de gelificação, para obter uma concentração final de 0,7% da última. Após o microgel ter gelificado sobre a lâmina, a amostra foi incubada a 22°C durante 8 minutos na solução desnaturante composta por 0,08M HC1, e depois na solução de lise composta por 2,5M de NaCl, 0,2M de DTT, 0,2M de Tris, 1% de Triton X-100, de pH 7,5, durante 25 minutos, a 22°C. As lâminas foram lavadas em água destilada durante 5 minutos, foram desidratadas em -32- banhos de etanol, e foram secadas ao ar. Depois, sequencialmente e nas mesmas células, foi efectuada DBD-FISH (Hibridação Fluorescência de Detecção da Ruptura de ADN In Situ; Fernandez et al., 1998; 2000; 2002; Fernandez e Gonzalez, 2002), com a utilização da sonda de ADN genómico total. Este procedimento permite a detecção e quantificação de rupturas do ADNdo núcleo celular imerso em microgel de agarose, desproteinizado e sujeito a um desnaturamento controlado do ADN. Estes procedimentos desnaturantes originam secções de ADN de cadeia simples das extremidades das rupturas, detectadas por hibridação in situ utilizando uma sonda de ADN genómico total marcada com um fluorocromo que emite fluorescência vermelha (Cy3). Quanto maior é o número de rupturas na célula de ADN, maior é a qualidade do ADN de cadeia simples produzido pela solução desnaturante, maior é a quantidade da sonda hibridizada e maior é a fluorescência vermelha obtida. As amostras processadas de acordo com o procedimento desta invenção contêm ADN de cadeia simples, produzido pela solução desnaturante, de possíveis pontas das rupturas do ADN. Por isso, a intensidade da hibridização com a sonda de ADN genómico total, será em relação à quantidade de rupturas presentes no núcleo do esperma.

Foi efectuada a contagem aleatória de 250 células. As imagens de coloração DAPI dos halos de dispersão da cromatina foram captadas com a utilização de uma câmara CCD refrigerada com dois filtros para visualizar os halos de dispersão, visíveis a azul, e o sinal de hibridização, visível a vermelho, em simultâneo. O objectivo final foi estabelecer uma correlação entre as dimensões dos halos de dispersão da cromatina e o nível do marcador das rupturas -33- de ADN. Os resultados demonstraram uma correlação inversa entre a área relativa dos halos de dispersão da cromatina e a intensidade do marcador das rupturas de ADN utilizando um DBD-FISH (Tabela 1).

Tabela 1 HALO GRANDE Área/total Halo Total MD Meio 0,85 13, 07 Desvio padrão 0,05 7,35 Contagem 154 154 HALO MÉDIO Área/total Halo Total MD Meio 0,73 24, 85 Desvio padrão 0,07 12,52 Contagem 38 38 HALO PEQUENO Área/total Halo Total MD Meio 0,48 180,28 Desvio padrão 0,14 117,82 Contagem 22 22 SEM HALO Área/total Halo Total MD Meio - 407,34 Desvio padrão - 252,69 Contagem 29 29 DEGRADADO Área/total Halo Total MD Meio - 101 Desvio padrão - 86 Contagem 7 7

Observa-se que à medida que a área relativa do halo diminui, é produzido um aumento no meio de densidade total (MD) da hibridização.

Como resultado, a simples determinação das dimensões dos halos de dispersão da cromatina, obtidos com o nosso procedimento, oferece uma estimativa simples e directa da integridade da cromatina/ADN do esperma humano. -34-

Exemplo 2:

Um método complementar para a avaliação de dadores de esperma utilizado nas técnicas de reprodução assistida.

Numa clinica de reprodução assistida, foram obtidos 10 amostras de dadores de sémen. Como complemento ao espermograma de rotina, o nível de fragmentação de ADN foi determinado nestas amostras. Foi efectuada a contagem de 500 células por indivíduo. Neste caso, os resultados foram obtidos através da aplicação do teste de halos de dispersão da cromatina da invenção. As amostras foram incluídas no microgel de agarose, foram incubadas nas soluções ácida e de lise, foram lavadas, desidratadas e deixadas a secar, tal como descrito no Exemplo 1. Neste caso, a coloração não foi feita com DAPI mas com coloração Wright, para microscopia de campo claro. Para tal, a solução de Wright foi misturada com solução tampão de fosfato (1:1), e foi colocada uma camada de coloração, na horizontal, tapando o microgel seco. Foi colorido durante 5 a 10 minutos, soprando-se ocasionalmente. Após a lavagem com água corrente, foi deixada a secar e os núcleos foram visualizados. Os resultados são demonstrados na Tabela 2. O nível médio de fragmentação neste grupo foi inferior a 20% em todos os casos (15.4±3.1).

Tabela 2

Amostra N2 % Células halo grandes % Células halo médias % Células halo pequenas % Células sem halo % Células degradadas % Células fragmentadas nl 76,2 7,4 10,2 5,0 1,2 16,4 n2 74,4 7,0 11,2 7,4 - 18, 6 -35- n3 72,6 16,4 6,2 00 - 11, 0 n4 78,6 6, 0 7,4 6, 6 1,4 15, 4 n5 81,6 5, 8 7,0 5,4 0,2 12, 6 n6 69,4 11,0 12, 6 6,0 1,0 19, 6 n7 73,2 7,2 9,6 8,8 1,2 19, 6 n8 80,2 5,4 8,4 5,0 1,0 14, 4 n9 85,2 2, 6 5,0 6,8 0,4 12,2 nlO 79,8 5, 6 6,8 7,0 0,8 14, 6

Distribuição das percentagens das categorias de dimensões dos halos obtidos em 10 dadores de sémen. A percentagem de sémen com ADN fragmentado foi composta pela soma das categorias de sémen com halo pequeno, sem halo e sem halos degradados.

Exemplo 3:

Avaliação clínica de pacientes inférteis.

Numa clinica de reprodução assistida, foram obtidas 17 amostras de dadores de esperma. Como complemento ao espermograma de rotina, o nivel de fragmentação de ADN foi determinado nestas amostras. Foi efectuada a contagem de 500 células por indivíduo. Tal como no exemplo anterior, os resultados foram obtidos através da aplicação do teste de halos de dispersão da cromatina da invenção. Os resultados são demonstrados na Tabela 3. O nivel médio de fragmentação neste grupo foi superior a 20% em todos os casos (49,9±20,7) . -36-

Tabela 3

Amostra N2 % Células halo grandes % Células halo médias % Células halo pequenas % Células sem halo % Células degradadas % Células fragmentadas pi 47, 0 12,0 16, 2 22,4 2,4 41,0 p2 38, 4 3,2 15, 2 42,2 1,0 58,4 P3 39, 6 1,6 13, 2 44,6 1,0 58,8 p4 53, 4 10,6 11, 0 17,6 7,4 36, 0 p5 42, 4 5, 2 15, 2 35, 8 1,4 52,4 p6 50, 0 5, 8 10, 0 32,9 1,2 44,2 p7 39, 0 11,2 22, 6 21,2 6,0 49, 8 P8 60, 6 4,8 9, 4 22,8 2,4 34,6 p9 69, 4 3,2 7,4 19, 0 1,0 27,4 plO 60, 6 4,4 10, 4 24,0 0,6 35, 0 pll 11, 3 3,0 6, 0 75,8 4,0 85, 8 pl2 65, 6 4,2 2,4 24,4 3,4 30,2 p!3 16, 7 11,9 24, 3 46, 8 0,3 71,4 pl4 8,4 4,4 18, 6 67,0 1,6 87,2 pl5 64, 7 8, 2 11, 2 13, 7 2,2 27,1 ρΐβ 14, 6 5, 0 10, 6 63, 4 6,4 80,4 p!7 65, 8 5, 8 9, 4 17,4 1,6 28,4

Distribuição das percentagens das categorias de dimensões dos halos obtidos em 10 pacientes. A percentagem de sémen com ADN fragmentado foi composta pela soma das categorias de sémen com halo pequeno, sem halo e sem halos degradados.

Exemplo 4:

A invenção foi utilizada para avaliar os danos toxicológicos que afectam o esperma humano. Danos por agentes exógenos e endógenos. Como um exemplo ilustrativo foi apresentado um estudo que analisou danos no ADN -37- induzidos por um agente químico dador de óxido nítrico (NO). Para tal, aliquotas de 50 microlitros de uma amostra de sémen totalmente fresco de um indivíduo normal foram incubadas durante 1 hora, à temperatura ambiente, com diferentes doses de nitroprussiato de sódio (SNP). As amostras tratadas foram então suavemente centrifugadas, descartando o sobrenadante, para lavar a SNP. Após nova suspensão em PBS, as amostras foram processadas de acordo com o método descrito nesta invenção.

Os resultados são apresentados na Tabela 4. Poderá observar-se que as concentrações do dador NO aumentaram, e a percentagem de esperma com cromatina/ADN danificado aumentou.

Tabela 4

Concentração de SNP (microM) % Células halo grandes % Células halo médias % Células halo pequenas % Células sem halo % Células degradadas % Células fragmentadas 0,0 61,8 14, 1 12, 0 12,1 0,0 24,1 62,5 38, 0 23, 2 19, 6 19,2 0,0 38,8 125 21, 8 24, 2 32, 6 23,1 0,0 55,7 250 14, 9 19, 0 40, 3 30,1 0,0 70,4 500 3,8 22, 5 39, 6 34,1 0,0 73,7

Distribuição das percentagens das categorias de dimensões dos halos obtidos numa amostra de sémen tratado com diferentes concentrações de um agente dador de óxido nítrico (NO), com capacidade para produzir danos no ADN. A percentagem de esperma com ADN fragmentado foi composta pela soma das categorias de sémen com halo pequeno, sem halo e sem halos degradados. -38-

Exemplo 5:

Reprodutibilidade do ensaio utilizando amostras de sémen congelado.

Foram estudados dois factores que poderiam afectar a qualidade das amostras, tais como a congelação e a diluição, utilizando a metodologia por análise do grau de dispersão do halo da cromatina. Para tal, foram analisadas 4 amostras frescas de diferentes dadores, e aliquotas congeladas em nitrogénio liquido. A análise das amostras foi efectuada por contagem de visualização directa dos diferentes tipos de nucleóides (500 células), em duas lâminas diferentes e um mínimo de duas vezes, por amostra e ponto experimental.

Reprodutibilidade da contagem. O coeficiente intra-classe de correlação (R) foi calculado para as diferentes medições efectuadas em cada lamela. Os resultados dos índices para cada tipo de célula e cálculos com a média de duas contagens variou entre os valores 0,78 e 0,92, e dado que os valores R variam entre 0 e 1, demonstra que foi obtida uma elevada reprodutibilidade (Tabela 5).

Tabela 5

Meio Limites de Confiança 95% % Diferença células halo grandes -0,78 (-1,98; 0,42) % Diferença células halo médias 0,56 (-0,17; 1,29) % Diferença células halo pequenas 0,36 (-0,48; 1,20) % Diferença células sem halo -0,19 (-0,88; 0,50) % Diferença células com halo e degradadas 0, 04 (-0,35; 0,43) -39- % Diferença células com ADN 0,21 (-0,67; 1,09) degradado

Congelação. Os resultados obtidos foram comparados com a utilização de uma análise de variação de dois factores (método de preservação e amostragem). Foi demonstrado que não houve diferenças significativas (P>0,05) no nível de fragmentação das amostras frescas e congeladas em nitrogénio líquido processadas. Nem tão pouco o tempo de congelação pareceu afectar a proporção de esperma com ADN fragmentado (Tabela 6).

Tabela 6

Amostra Estado da Amostra Meio Desvio padrão 1 A. Fresca 19, 58 0,22 A. Congelada 20,20 1, 48 2 A. Fresca 13,38 1, 87 A. Congelada 13,39 1,86 3 A. Fresca 12,75 3, 04 A. Congelada 11, 53 1, 92 4 A. Fresca 22,13 0,74 A. Congelada 21,56 2, 68

Concluindo, a reprodutibilidade dos resultados obtidos após análise de visualização directa é demonstrada.

Exemplo 6:

Análise da integridade da cromatina/ADN do esperma humano utilizando a variação da ordem na incubação das soluções desnaturante e de lise:

Nesta variação, após a colocação de espermas nos -40- microgéis de agarose, estes foram incubados, numa primeira fase, na solução de lise descrita no Kit, durante 25 minutos a 22°C. As lâminas foram então imersas na solução desnaturante composta por 0,88 HC1, durante 8 minutos, a 22°C. Finalmente, após a lavagem com água destilada, as lâminas foram desidratadas e coloridas com a solução de Wright, e observadas com um microscópio de campo claro.

Com esta técnica de variação, o comportamento dos espermas com ADN fragmentado foi diferente. Neste caso, dispersaram fragmentos de cromatina/ADN, dando origem a halos maiores.

Exemplo 7:

Resultados da aplicação da metodologia nas amostras de esperma de animais diferentes.

Com o objectivo de avaliar o carácter universal da metodologia proposta, foram seleccionados indivíduos macho de espécies diferentes para efectuar o estudo dos níveis de fragmentação de ADN no esperma e a visualização paralela das suas caudas como um elemento celular de distinção. Foram obtidas amostras de esperma das seguintes espécies: rato (Mus musculus), touro (Bos taurus), pregado (Scophthalmus maximus) e minhoca (Lombricus terrestris) . Em todas as espécies, a aplicação da técnica produziu halos de dispersão da cromatina e as suas caudas puderam ser reconhecidas, incluindo aquelas com ADN normal, assim como aquelas que estavam fragmentadas (Figura 4) . A forma do esperma e o tipo de halo produzido é característica em cada espécie (4a corresponde ao touro; 4b, c, d correspondem ao rato; 4e corresponde à minhoca; 4f corresponde ao pregado). -41- A morfologia do esperma, quer contivesse ou não ADN fragmentado, é diferente entre espécies e, por sua vez, diferente à encontrada em humanos. Em todos os casos, a dispersão de cromatina é paralela e comparável à encontrada no caso das amostras de esperma humano. Ou seja, os halos de dispersão da cromatina de diferentes tamanhos e a cauda do esperma podem ser visualizados. A morfologia e o tamanho dos halos de diferentes espécies e os resultados obtidos foram os seguintes:

No caso do touro, foram analisadas amostras independentes com 5 observadores diferentes. Neste caso, foram encontradas diferenças na percentagem de núcleos de esperma com ADN fragmentado por cada indivíduo, mas não foram observadas diferenças entre as percentagens obtidas entre cada observador (Tabela 7).

Tabela 7 TOTAL % Grandes % Médias % Pequenas % Sem halo % Degradadas % Fragmentadas Obl-500 75, 8 9,8 7,2 7,2 0 14,4 Ob2-500 77 7,2 12 3,6 0,2 15,8 Ob3-500 77 8 9,8 5 0,2 15 Ob4-500 72,8 11,4 8,8 7 0 15,8 Ob5-500 73 11,2 8,2 7,6 0 15,8 500 75,1 9,4 9,1 5,9 0,1 15,3 Obl-500 80,6 10 6,2 3,2 0 9,4 Ob3-500 82,2 8 6 3,8 0 9,8 Ob4-500 82,4 8,4 6,2 3 0 9,2 500 81,7 8,8 6,1 3,3 - 9,5 Obl-500 71,2 6,2 10, 8 11, 4 0,4 22,6 Ob2-500 70,8 4, 6 14 10, 6 0 24,6 Ob3-500 75 5, 6 12 7,2 0,2 19,4 Ob5-500 72,2 6, 8 14, 2 6,4 0,4 21 500 72,3 5,7 12,7 8,6 0,3 21,8 -42-

Ob2-500 85,2 8,4 3,8 2, 6 0 6,4 Ob3-500 84,4 10 3,2 2,4 0 5,6 Ob4-500 80,8 12,8 4 2,4 0 6,4 500 83,4 10,2 3,7 2,5 0 6,1

No caso do rato, foram utilizadas duas estirpes diferentes, uma normal (M1-32NNC) e outra consanguínea (M2-32BC). As percentagens obtidas para os diferentes tipos de halos demonstram diferenças nítidas entre uma estirpe normal (7,1) e uma consanguínea (25,1) (Tabela 8).

Tabela 8 TOTAL % Grandes % Medias % Pequenas % Sem halo % Degradadas % Fragmentadas M2-32BC 63 11, 5 18,1 6,9 0,1 25, 1 M1-32NNC 86,2 6,5 4,6 2, 5 0,2 7,1

No caso específico do pregado, o esperma que tinha grandes halos de dispersão da cromatina e um núcleo pequeno puderam ser distinguidos daqueles que tinham um halo de dispersão pequeno e um grande núcleo, e, finalmente, outros sem um halo de dispersão. Os resultados são demonstrados na Tabela 9.

Tabela 9 % Halo grande/ Núcleo Pequeno % Halo Pequeno/ Núcleo Grande % Apenas Cabeça Sem Halo 94 LO 0,4 92,8 7 0,2 95, 6 4 0,4 94,1 5,4 0,3 72,2 25, 2 2, 6 71, 6 25, 4 3 -43- 77 20,2 2, 8 73,6 23,5 2,8 75,2 18, 4 6, 4 71,2 22 6, 8 78 15 7 74,7 18,2 6,7

No caso da minhoca, é produzida uma produção dinâmica de halos idênticos aos descritos nos casos anteriores, e, neste caso, a cabeça do esperma e a sua cauda podem também ser perfeitamente distinguidos. A percentagem estimada de esperma que contém ADN fragmentado nos 2 indivíduos estudados (um jovem e um maduro) foi de 15% e 22%, respectivamente. Neste caso, as cabeças do esperma parecem ter uma formação parcial de halo, sendo que a significância está actualmente em fase de investigação (Ver Figura 4e).

Exemplo 8:

Visualização do mesmo preparado citológico dos halos de dispersão de cromatina, caudas de esperma e leucócitos. Avaliação do efeito da leucocitospermia na integridade do ADN nas amostras de esperma. A leucocitospermia é um processo invasivo indesejado que conduz ao aumento anormal de leucócitos em amostras de fluido seminal (>5xl06/ml) . A leucocitospermia tem sido detectada em entra 10% e 20% de homens inférteis. Parece que os neutrófilos, assim como os macrófagos, presentes no sémen podem produzir ROS (Espécies Reactivas ao Oxigénio) provocando stress oxidativo, resultando em -44- danos no ADN do esperma (Omu et al., 1999; Erenpreiss et al., 2002; Henkes et al., 2003). De facto, a leucocitospermia foi associada a diferentes anormalidades dos parâmetros clássicos utilizados na análise da quantidade de esperma. Por exemplo, enquanto a incidência de esperma anormal ocorre em apenas 47% das amostras de indivíduos sem leucocitospermia, a percentagem aumenta para 88% quando a leucocitospermia está presente (www, c 1 e ve 1 a n cl c 1 i n i c . o r g) .

Numa amostra de 5 pacientes, com niveis elevados de leucocitospermia de etiologia diferente (prostatite e infecções devido a chlamydomonas e agentes bacterianos), a resposta à técnica foi estudada para diferenciar, inequivocamente, a percentagem de leucócitos presentes nas amostras de sémen e os niveis de fragmentação de ADN no esperma das mesmas amostras. A diferença, entre ambos os tipos de células, quando as células são sujeitas ao mesmo tratamento, é nitida, dado que os espermas com ADN fragmentado, assim como aqueles que não o têm, mostram a cauda que os caracteriza. A ausência de uma cauda nos leucócitos permite-nos diferenciá-los dos restantes tipos de células (Figura 5).

Deste modo, pode ser estabelecida uma correlação directa entre o número de leucócitos por amostra e os niveis de ADN fragmentado no esperma. A Tabela 10 mostra o nivel de leucócitos nas amostras de sémen de 5 pacientes afectados por leucocitospermia de diferentes etiologias e a percentagem de esperma com ADN normal (grandes e médios; UM) e fragmentados (halo pequeno e sem halo (S/WH)). -45-

Tabela 10 % Leucócitos % Células halo G/M % Células halo P/Sem Amostra 1 6,1 73, 9 20 Amostra 2 15, 5 55, 3 29,2 Amostra 3 17 48,2 34,8 Amostra 4 22 31,7 46,3 Amostra 5 25, 6 30,5 43, 9 -46-

REFERÊNCIAS

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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o EPO nega qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição • US 5801058 A [0002]

Literatura não relacionada com patentes citada na descrição • Ankem Murali K et al. Novel assay for determining DNA organization in human spermatozoa: Implications for male factor infertility. Urology, April 2002, vol. 59 (4 [0002] • Fernandez, J.L. et al. The Sperm Chromatin Dispersion Test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. Journal of Andrology, 2003, vol. 24 (1), 59-66 [0007] • Fernandez, J.L. et al. Journal of Andrology, 2003, vol. 24 (1), 59-66 [0022] [0050] • AT Sumner. Chromosome banding, 90-91 [0048] • Aitken RJ; Gordon E; Harkiss D. Relative impact of oxidative stress on the 15 functional competence and genomic integrity of human spermatozoa. Biol. Reprod., 1998, vol. 59, 1037-1046 [0104] • De Jonge C. The clinicai value of sperm nuclear DNA assessment. Hum. Fértil., 2002, vol. 5, 51-53 [0104] -50- • Erenpreiss J; Hlevicka S; Zalkalns J; Erenpreisa JJ.

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Lisboa, 26/02/2010

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para avaliar a integridade da cromatina/ADN dos espermatozóides de um animal, que compreende: a. uma fase de tratamento da amostra que contém os espermatozóides, com uma solução desnaturante de ADN; b. uma única fase de tratamento com uma solução de lise para extrair proteínas nucleares, sendo que o detergente constante na dita solução de lise é um detergente não iónico, e não desnaturante de proteínas; e c. uma fase de avaliação da integridade da cromatina/ADN do espermatozóide com base em medições do tamanho do halo dos espermatozóides.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o detergente não iónico ser seleccionado a partir do grupo de toctilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100), N, N-bis (3-D-Gluconamidopropilo) colamida (bigCHAP), Brikj(r)35 P, N-decanoil-N-metilglucamina, digitonina, dodecanoil-N-metiloglucamina, heptanoil-N-metilglucamina, octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol ramificado (Igepal CA-630), N-Nonano-N-metilglucamina, Nonidet P 40, N-Octanol-N-metilglucamina, solução Span 20, Polissorbato 20 (Tween 20) e suas misturas, de preferência Triton X-100.
3. 3. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por a solução de lise ser composta por cloreto de sódio entre 1 e 3M, ditiotretiol (DTT) entre -2- 0,001 e 2M, 2-amino-2(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) entre 0,001M e 2M e Triton X-100 entre 0,1% e 3%.
4. 4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por a solução de lise ser composta por cloreto de sódio 2,5M, DTT 0,2M, Tris 0,2M, 1% de Triton X-100 e um pH de 7,5.
5. 5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por a solução desnaturante de ADN ser ácida.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a solução desnaturante de ADN ser composta por um ácido seleccionado a partir de ácido clorídrico, ácido acético, ácido nitrico ou misturas destes .
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a solução desnaturante de ADN ser composta por ácido clorídrico.
8. 8. Método de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado por após as fases a) e b) existir uma fase de coloração da amostra.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a coloração ser feita com uma solução tipo Wright. -3-
10. 10. Método de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado por a amostra que contém espermatozóides ser incluida num meio idêntico a uma suspensão, de preferência um microgel.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a amostra que contém espermatozóides ser incluida num microgel de agarose.
12. 12. A utilização de uma solução desnaturante de ADN e uma solução de lise no método da reivindicação 1, caracterizado por o detergente incluído na dita solução de lise ser um detergente não iónico, não desnaturante de proteínas.
13. 13. A utilização, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a solução de lise compreender cloreto de sódio entre 1M e 3M, ditiotretiol (DTT) entre 0,001M e 2m, 2-amino-2(hidroximetil)-1,3 propanodiol (Tris) entre 0,001M e 2M e Triton X-100 entre 0,1% e 3%. Lisboa, 26/02/2010