PT2080811E - Método para a determinação da fragmentação de adn em microrganismos - Google Patents
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Description
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DESCRIÇÃO
"MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA FRAGMENTAÇÃO DE ADN EM MICRORGANISMOS" A presente invenção pertence ao campo da indústria biotecnológica e, principalmente, diz respeito a microbiologia, pertencendo o âmbito do pedido de patente de invenção ao sector da prestação de cuidados de saúde (humano, veterinário, ambiental e básico).
Especificamente, diz respeito a um processo para a determinação da integridade de ADN em microrganismos, uma vez gue a morte celular significa a fragmentação de ADN, e a um estojo para avaliar a integridade de ADN em microrganismos.
Estado da técnica
Os micróbios podem morrer devido a diferentes causas. No caso das bactérias, que são organismos com um interesse especial em termos de saúde, o mecanismo final de morte devido à acção de agentes antibióticos é virtualmente desconhecido, provavelmente devido à evidência do problema. Os antibióticos afectam processos importantes das células, os quais, mais cedo ou mais tarde, irão provocar a morte da célula. Apesar do conhecimento do mecanismo inicial de acção de um antibiótico especifico, por vezes não é possivel distinguir claramente um efeito bacteriostático ou bactericida. Esta imagem de morte celular é particularmente complicada devido à recente descrição da presença de uma pequena proporção de células persistentes invulneráveis a antibióticos bactericidas, embora tais sejam mutantes e não 2 cresçam na presença do antibiótico. As referidas células persistentes parecem explicar a elevada resistência a morte de biofilmes e de culturas estacionárias por acção de agentes quimioterapêuticos.
Além disso, estudos dos perfis de transcrição de todos os genes de Escherichia coli demonstraram a existência de um grupo de genes que são induzidos e de outros que são reprimidos de um modo habitual após a acção dos antibióticos , sendo o mecanismo de acção bastante diferente. Tal verifica-se com ampicilina, um inibidor da síntese da parede celular, e com ofloxacina, uma fluoroquinolona que bloqueia a girase e topoisomerase IV de ADN, induzindo danos directos no ADN (Kaldalu N, Mei R, Lewis K. Killing by ampicillin and ofloxacin induces overlapping changes in Escherichia coli transcription profile. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:890-896).
Tal conhecimento sugere que a morte celular em bactérias, por exemplo, após a acção de um antibiótico bactericida, pode ser um processo programado, tal como o fenómeno de apoptose presente em organismos superiores. Um fenómeno semelhante foi descrito em leveduras de células individuais como resposta à acção de agentes fungicidas. A autólise de células bacterianas por autodigestão da parede celular por autolisinas após exposição a antibióticos ou a condições ambientais adversas podem ser uma expressão da morte celular programada de organismos defeituosos (Lewis K. Programmed Death in Bactéria. Microbiol Mol Biol Rev 2000; 64: 503-514).
Desde o início da microbiologia, a maior parte dos estudos de acção quimioterapêutica foram avaliados de um modo rotineiro, avaliando o crescimento celular como a 3 capacidade para produzir colónias num meio de cultura semi-sólido ou para provocar turvação num meio liquido. Para além de ser relativamente longo, este sistema não avalia o comportamento de cada célula, mas sim do grupo em geral, e é apenas aplicável aos microrganismos com capacidade de serem desenvolvidos em cultura in vitro. Para se estudar a etapa de vida de cada célula, é necessário utilizar técnicas de microscopia ou de citometria. (Lecoeur H. Nuclear apoptosis detection by flow cytometry: influence of endogenous nucleases. Exp Cell Res 2002; 277:1-14; Steensma DP, Timm M, Witzig TE. Flow cytometric methods for detection and quantification of apoptosis. Methods Mol Med 2003; 85 : 323-332) .
Uma avaliação possível, embora não usual, consiste em avaliar a permeabilidade da parede celular e da membrana celular utilizando corantes vitais. A célula é apenas corada com o corante vital caso apresente uma alteração da barreira que a isola do exterior, o que está normalmente associado à lise por choque osmótico. Quer seja por dano directo através de sistemas enzimáticos quer através da perda de integridade da membrana, o ADN do cromossoma do microrganismo terá de ser fragmentado no processo de morte celular. No entanto, a integridade de ADN cromossómico não foi ainda avaliada como parâmetro de morte microbiano em estudos célula-a-célula in situ. Tal deve-se à ausência de uma técnica exequível, fiável e reprodutível para a determinação da integridade de ADN cromossómico de tamanho pequeno em relação ao de células de organismos superiores. Há diferentes metodologias in situ bem estabelecidas para avaliar a integridade de ADN de células de organismos superiores em relação a danos induzidos e à morte celular 4 por apoptose ou necrose. A marcação de quebras de ADN in situ por introdução de nucleótidos marcados nestes, utilizando enzimas, tais como transferase terminal (TUNEL) ou a ADN polimerase (nick translation in situ, ISNT) são enfatizadas entre tais metodologias (Didenko V, ed. In situ detection of DNA damage. Humana Press, Totowa, New Jersey, 2002) .
Tais metodologias são baseadas na utilização de enzimas em células fixadas em lâminas, enzimas essas que actuam sobre as extremidades 3'-OH das quebras, isto é, sem modificações quimicas. Por tal razão, a sua eficácia é irregular, sendo marcadas apenas aquelas quebras acessíveis à enzima, o que significa uma reprodutibilidade relativamente reduzida dos resultados. Existe apenas um trabalho no qual a técnica TUNEL é aplicada para a detecção de quebras de ADN bacteriano em Escherichia coli e na archaea Haloferax volcanii (Rohwer F e Azam F. Detection of DNA Damage in Prokaryotes by Terminal Deoxyribonucleotide Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling. Appl Environ Microbiol 2000; 66:1001-1006).
Este estudo demonstrou a capacidade de detectar a fragmentação de ADN bacteriano após infecção por um fago. No entanto, as quebras provocadas directamente por peróxido de hidrogénio em determinadas condições não foram detectadas. Tal pode ser devido à impossibilidade da enzima de marcar quebras com extremidades 3'-OH modificadas, o que constitui um problema desta técnica. Além disso, é necessário fixar as células para se poder realizar estas técnicas, o que afecta a capacidade de marcação. Além do mais, os reagentes são caros, pelo que estas técnicas apenas são aplicadas em estudos de pesquisa, não sendo 5 possível a sua utilização para a avaliação de rotina de danos e deterioração de ADN. Estas técnicas são relativamente longas e complexas , pelo que não são normalmente utilizadas em microbiologia e não foi descrito outro trabalho em relação a estas.
Uma outra técnica de microscopia para o estudo célula-a-célula in situ da integridade de ADN é o ensaio cometa ou electroforese de célula individual (Olive PL, Durand RE. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry 2005; 66:1-8).
As células eucarióticas são incluídas num microgel de agarose numa lâmina e são submetidas a soluções de lise para extrair as membranas e as proteínas. São assim obtidos nucleoides, isto é, núcleos desproteinizados, nos quais as espiras de ADN se encontram relaxadas devido a descompactação. Os nucleoides são submetidos a electroforese num tanque carregado com solução tampão, de um modo tal que as fibras de ADN migram no sentido do ânodo, formando uma imagem de cometa com uma cabeça e uma cauda na direcção de migração electroforética. Estes cometas são corados com um corante fluorescente para ser possível a sua observação por meio de microscopia de fluorescência. Caso o núcleo apresente fragmentação de ADN, então uma grande quantidade dos seus fragmentos terá migrado, estando concentrados na cauda do cometa. É um teste bastante sensível mas relativamente caro e complicado para um laboratório clínico convencional. De facto, requer determinados instrumentos incomuns: fonte de alimentação e tanque de electroforese e um sistema para a captura e análise de imagens. Pelo referido antes, é apenas utilizado para fins de pesquisa. Existe apenas um trabalho publicado 6 no qual a técnica de cometa é aplicada a pH neutro na bactéria Escherichia coli (Singh NP, Stephens RE, Singh H, Lai H. Visual quantification of DNA double-strand breaks in bactéria. Mutat Res 1999; 429:159-168). A técnica é longa e complicada, requerendo múltiplas incubações, e a interpretação das imagens em relação às quebras de ADN não é clara. Assim sendo, não foi descrito qualquer outro trabalho com esta técnica em bactérias. A partir do descrito antes, deduz-se que existe ainda a necessidade de um processo fiável que possam ser utilizado de um modo rotineiro e simples para o estudo in situ da integridade de cromatina/ADN em microrganismos. Deverá ser desenvolvida ou adaptada uma metodologia que seja mais rápida e mais eficaz para se avaliar a morte bacteriana, dando especial importância à morte que é gerada ou que se traduz em degradação de ADN. Este constitui assim um campo em que dificilmente são proporcionadas quaisquer inovações. 0 processo deverá ser robusto, de fácil implementação, barato e acessível para um laboratório básico. Além do mais, deverá proporcionar resultados homogéneos entre laboratórios diferentes e deverá ser capaz de ser automatizado. 0 ensaio de difusão de ADN é algo parecido com o ensaio de electroferese de célula individual, permitindo a avaliação da sua fragmentação. As células imersas num gel de agarose inerte, numa lâmina, são submetidas a lise. Caso as células apresentem ADN fragmentado, então os fragmentos irão difundir-se na matriz de agarose a partir do núcleo inicial, sendo observados halos da difusão de fragmentos de ADN periféricos (Vasquez M, Tice RR. Comparative analysis of apoptosis versus necrosis using the single cell gel (SCG) assay. Environ Mol 7
Mutagen 1997; 29:53). Tal foi aplicado a células eucarióticas, principalmente do tipo somático. As células que apresentam difusão de fragmentos de ADN correspondem àquelas que morreram devido a um processo apoptótico (Singh NP. A simple method for accurate estimation of apoptotic cells. Exp Cell Res 2000; 256:328-337).
Algumas variantes deste ensaio foram aplicadas com sucesso a espermatozóides humanos e a espermatozóides de outras espécies animais por este grupo de pesquisa e são designadas por Dispersão de cromatina espermática (teste SCD), (Rodriguez S, Goyanes V, Segrelles E, Blasco M, Gosálvez J, Fernández JL. Critically short telomeres are associated with sperm DNA fragmentation. Fértil Steril 2005; 84: 843-845; Enciso M, López-Fernández C, Fernández JL, Garcia P, Gosálbez A, Gosálvez J. A new method to analyze boar sperm DNA fragmentation under bright-field or fluorescence microscopy. Theriogenology 2006; 65:308-316).
As principais diferenças da variante do processo da presente invenção em relação à técnica descrita para espermatozóides são as seguintes: - a primeira incubação com uma solução ácida não é necessária, sendo apenas necessária a lise; - a solução para efectuar a lise dos espermatozóides não é activa em microrganismos do tipo bactéria. O Triton X—10 0 não é activo para efectuar a lise destes microrganismos. Para este propósito, para a lise, é recomendável que contenha um detergente mais forte com a capacidade de desnaturar proteínas, tal como SDS, e adicionar EDTA como agente quelante, auxiliando a destabilização das paredes celulares.
Tecnicamente, tais diferenças significam a lise da parede bacteriana, conservando a integridade do ADN. Este último ponto é importante, pois como o ADN bacteriano é relativamente pobre em proteínas em comparação com o ADN de células eucarióticas, poderá ser mais susceptível a danos iatrogénicos gerados durante o manuseamento e o processamento. A utilização de corantes fluorescentes bastante sensíveis, tais como aqueles da família de SYBR, por exemplo, 'SYBR Gold', permite a discriminação da fibra de ADN dos nucleoides do microrganismo e, em particular, observar com precisão os pequenos fragmentos de ADN difundidos em agarose, no caso de fragmentação desse ADN. Tal não é possível utilizando os fluorocromos de ADN clássicos, tais como iodeto de propídio (IP), brometo de etídio, laranja de acridina Hoechst 33258 ou 33342, ou DAPI.
Uma outra vantagem suplementar consiste no facto de o tempo de incubação necessário para a lise ser muito mais reduzido, proporcionando uma metodologia muito mais rápida em comparação com a descrita para espermatozóides.
Na presente invenção, é essencial estabilizar o nucleoide de ADN do microrganismo para que este seja observado com o microscópio de fluorescência. Este pequeno nucleoide é muito delicado, estando separado, e degrada-se progressiva e rapidamente no meio liquido de coloração quando exposto à luz do microscópio de fluorescência. Tal constitui um problema técnico essencial que não ocorre com os nucleoides de células espermáticas ou outros tipos de células de organismos superiores com uma massa muito superior. No caso dos microrganismos, para se estabilizar o nucleoide e para que este adira firmemente à lâmina, é 9 efectuado um passo de incubação seco de calor intenso. Assim, após secagem da lâmina com os nucleoides, antes da coloração, esta é incubada num forno de micro-ondas de elevada potência (750W-1000W) durante 10 minutos. Esta pode ser subsequentemente corada e observada. Uma outra possibilidade consiste em incubar a lâmina num forno a elevada temperatura, 80°C-100°C, durante horas. No entanto, a utilização do micro-ondas acelera enormemente o processo, auxiliando a execução do protocolo técnico rapidamente. Este passo de estabilização é essencial para a invenção, de modo que o processo possui um elevado valor adicionado para a preparação de um produto final comercial.
Com base no referido antes é possível deduzir que o processo da presente invenção proporciona imagens de nucleoides de microrganismos, sendo possível discriminar claramente aquelas que contêm ADN fragmentado. Assim sendo, com o referido processo, a determinação dos níveis de fragmentação da amostra é simples e fiável, o que permite que este seja utilizado de um modo rotineiro e com um custo baixo. A sua aplicação é relevante em diferentes laboratórios clínicos e de microbiologia básica com amostras de microrganismos.
No entanto, um ensaio com estas características nunca foi aplicado para a determinação da integridade de ADN de microrganismos. A adaptação e o ajuste desta metodologia para avaliar genomas com um tamanho relativamente pequeno, após se ter alcançado anteriormente a lise das paredes bacterianas para permitir a difusão de ADN no caso de fragmentação de tal ADN, tem um enorme potencial de interesse. Assim, uma ferramenta relativamente simples e rápida estaria disponível, a qual permitiria a avaliação, 10 in situ, célula a célula, da presença de quebras de ADN em bactérias e em outros microrganismos, de um modo reprodutível. A visualização ao nível microscópico de uma molécula de ADN fragmentada após a acção de agentes líticos pode ser utilizada para analisar rapidamente a morte de células bacterianas. As múltiplas aplicações interessantes potenciais da referida metodologia em aplicações protecção de pesquisa, hospitalares, veterinárias ou ambientes, são a seguir apresentadas em pormenor: • monitorização de agentes com capacidade potencial de danificar e fragmentar, directa ou indirectamente, ADN, os quais são físicos (radiações ionizantes, radiações ultravioletas), químicos (agentes anti-sépticos, antibióticos, quimioterapêuticos e microbianos, em geral), biológicos e enzimáticos (enzimas de reparação, enzimas de restrição codificadas por módulos ou fagos suplementares); • monitorização da susceptibilidade para fármacos antimicrobianos conhecidos e novos; • determinação da eficácia de agentes com a capacidade de danificar e fragmentar ADN, em função de diferentes condições experimentais ou ambientais; • monitorização do stress ao nível de ADN em populações de microrganismos naturais ou em diferentes condições laboratoriais (nutrientes, envelhecimento, variações de agentes físico-químicos, tais como temperatura, pH, pressão osmótica, luz, etc.); • análise da sensibilidade a indução de danos de ADN de diferentes linhas selvagens e mutantes, por exemplo, estirpes resistentes a agentes antimicrobianos, bem como a sua reparação. 11
Descrição da invenção 0 objecto da presente invenção diz respeito a um processo para a avaliação da integridade de ADN de microrganismos de um modo simples, rápido e preciso, e que possa ser incorporado na actividade rotineira de qualquer laboratório microbiológico de pesquisa.
Assim, um primeiro objecto do pedido de patente de invenção consiste num processo para a avaliação da integridade de ADN de um microrganismo, o qual compreende os passos seguintes: a) imobilizar o microrganismo numa lâmina, sem fixação, por meio da sua inclusão num meio inerte; b) tratar com uma solução de lise para extrair as paredes celulares, membranas e proteínas, mantendo o ADN do microrganismo; c) estabilizar o nucleoide de ADN do microrganismo na lâmina e d) corar e avaliar a integridade do ADN.
Os microrganismos são inicialmente incluídos num meio semelhante a uma suspensão aquosa, de preferência, um microgel inerte, em particular, um microgel de agarose, o qual pode ser preparado num suporte adequado, por exemplo, uma capa coberta de vidro. A escolha da solução de lise é crítica para se atingir os objectivos da presente invenção. É essencial utilizar detergentes de desnaturação proteica aniónicos ou catiónicos, tais como dodecil-sulfato de sódio (SDS), sulfonato de alquilbenzeno, N-lauril-sarcosina (sarcosilo), sal hidratado de ácido glicólico, e suas misturas, e, de preferência, utilizar SDS. Estes são detergentes que provocam uma elevada disrupção da membrana com efeito de 12 lise e, em simultâneo, são agentes activos de desnaturação proteica. Também são utilizados em electroforese de desnaturação, em que as proteínas são submetidas a migração, garantindo a desnaturação completa (perda da estrutura tridimensional). A sua actividade com detergentes é elevada. A utilização de um detergente de desnaturação não proteico não iónico, isto é, um detergente que dissolve as proteínas mas que não as desnatura, não é normalmente eficiente para uma lise eficaz em muitos microrganismos. A inclusão de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) é importante uma vez que este actua como um agente quelante do catião Mg++, catiões esses que estabilizam a membrana exterior de bactérias, em particular, no revestimento de bactérias Gram-negativas. Também é possível incluir proteínas líticas, quer da parede celular quer de proteínas.
De preferência, a solução de lise contém outros agentes que favorecem a destabilização das paredes celulares e subsequente extracção. Verificou-se que uma solução eficaz é aquela que contém ditiotreitol (DTT) entre 0,001 M e 2 M, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) entre 0,001 M e 2 M, EDTA entre 0,001 M e 2 M e SDS entre 0,1% e 3%, a um pH compreendido entre 6,5 e 10,5. É particularmente adequada uma solução que contenha DTT a cerca de 0,1 M, Tris a cerca de 0,01 M, EDTA a cerca de 0,05 M e SDS a cerca de 2%, a um pH de cerca de 10.
Após a lise, os nucleoides de ADN têm de ser estabilizados na lâmina de modo que não se degradem e se separem quando expostos à luz do microscópio de fluorescência. 0 sistema mais rápido e eficaz consiste em submeter a lâmina a incubação, após ter sido desidratada, 13 efectuando a incubação em banhos de álcool crescentes e secagem num forno de micro-ondas. 0 calor gerado faz aderir firmemente o nucleótido à lâmina. Tal constitui um passo especifico essencial da presente invenção. É possível testar diferentes potências para tempos diferentes. Uma possibilidade consiste em utiliza a potência máxima durante 2 a 15 minutos. Uma outra possibilidade, que é menos recomendável uma vez que faz aumentar a duração da técnica, consiste em incubar a lâmina seca num forno ou forno de secagem a uma temperatura elevada, 40°C-100°C, durante uma ou várias horas. 0 processo de acordo com a invenção apresenta um passo de avaliação da integridade do ADN de microrganismos, após os passos a) , b) e c) . Embora existam diversas alternativas para esta avaliação, é preferível que esta seja visual. Para este propósito, o processo compreende um passo de coloração da amostra após os passos a) , b) e c) . Dado o tamanho relativamente pequeno do ADN dos microrganismos, a referida coloração deverá ser efectuada com um corante extremamente sensível, utilizando um microscópio com lentes de elevada ampliação (normalmente 100X). Assim sendo, são preferíveis os sistemas com base em microscopia de fluorescência utilizando fluorocromos específicos para ADN e, em particular, aqueles que proporcionam a melhor sensibilidade e estabilidade. A lista é extensa e cresce continuamente. A título de exemplo, é possível referir GelRed, EvaGreen e outros derivados de cianina, tais como as famílias SYBR, aqueles da PicoGreen, as variantes de TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO, LO-PRO, etc.. 14 A avaliação dos resultados pode ser efectuada pelo observador, atribuindo a cada nucleoide observado uma escala de danos previamente estabelecida. De preferência, também pode ser avaliada utilizando um sistema para a captura de imagens digitalizadas, acoplado a uma aplicação informática que determine quantitativamente o nível de danos.
Um segundo objecto da presente invenção consiste na produção de um estojo para a avaliação da integridade de ADN de microrganismos, o qual compreende essencialmente: a) lâminas de vidro pré-tratadas para suportar e manter o microgel com os microrganismos; b) uma solução para misturar e incluir os microrganismos nos microgeles; c) uma solução de lise para extrair as paredes, membranas e proteínas e d) um fluorocromo para corar o ADN. 0 estojo permite a execução do processo anteriormente descrito.
Um terceiro objecto do presente pedido de patente de invenção diz respeito ao desenvolvimento de uma aplicação informática para a medição automatizada dos níveis de fragmentação de ADN do microrganismo.
Descrição das figuras A figura 1 mostra nucleoides de uma cultura de células de Escherichia coli, obtidos após aplicação do processo descrito na invenção. Os nucleoides intactos estão compactados, achatados na lâmina, sugerindo as soluções de continuidade que não foi observada fragmentação de ADN. Um nucleoide com o ADN massivamente fragmentado (anterior) 15 proveniente de uma célula morta espontaneamente é ocasionalmente observado na cultura. A figura 2 mostra diferentes graus progressivos de danos no ADN de Escherichia coli: a: nucleoide intacto (nível 0); b: nucleoide com fragmentos periféricos discretos com um tamanho relativamente grande, após quebras de ADN (nível 1, danos reduzidos); c: nucleoide mais relaxado, ocupando uma superfície maior, com fragmentos periféricos discretos com um tamanho relativamente grande, após quebras de ADN (nível 2, danos médios); d: nucleoide muito mais relaxado e estendido, com um número elevado de fragmentos periféricos, após quebras de ADN (nível 3, danos elevados); e: nucleoide com fragmentação massiva de ADN, formado por múltiplos fragmentos pequenos que estão difundidos na matriz de agarose, após lise, delimitando uma superfície de difusão mais larga (nível 4, danos massivos). A figura 3 mostra a técnica de DBD-FISH para a detecção de quebras de ADN, hibridando uma sonda de ADN de Escherichia coli genómica total marcada com Cy3 (A) . O nucleoide com difusão de fragmentos apresenta uma marcação intensa, ao passo que os restantes nucleoides apenas apresente uma marcação de linha de base muito discreta. O ADN foi submetido a contracoloração com DAPI (B). A figura 4 mostra a aplicação do método da invenção a uma amostra de Acinetobacter baumannii. São apresentados dois nucleoides intactos e dois outros nucleoides com ADN esmagados em fragmentos. 16 A figura 5 mostra a fragmentação massiva de ADN de Escherichia coli após exposição da bactéria a peróxido de hidrogénio 10 mM durante 10 minutos. A figura 6 mostra os danos no ADN de Escherichia coli, observados após diferentes tempos de incubação com ciprofloxacina (1 pg/mL). a: 0 minuto; b: 2,5 minutos; c: 5 minutos; d: 15 minutos; e: 40 minutos. Decorridos 5 minutos, já é observado um nível inicial de danos, aumentando progressivamente para tempos de incubação mais longos. A figura 7 mostra nucleoides de Escherichia coli observados após incubação com ampicilina (300 pg/mL) durante 20 minutos (a) e decorridas 24 horas (b). Não são observados fragmentos de ADN após 20 minutos, ao passo que decorridas 24 horas, o fundo está coberto com fragmentos de ADN. A figura 8 mostra gráficos que ilustram a evolução média em área (em pixels, eixo dos yy) do halo de difusão de fragmentos ou do relaxamento do arco do nucleoide de Escherichia coli (A) e da cápsula (B) , em relação ao momento após incubação com 10 microgramas/mL de ciprofloxacina, 40 minutos (eixo dos xx). A figura 9 mostra o diagrama da rotina a seguir para a medição passo-a-passo e o processo de decisão para a fragmentação de ADN bacteriano com criação de um relatório final. A figura 10 mostra uma amostra dos três processos para a segmentação e delimitação dos ROI efectuados com captura digital que mostram o campo bacteriano, incluindo 3 bactérias com ADN normal e 2 bactérias com ADN fragmentado (imagem superior esquerda). As restantes imagens 17 correspondem aos filtros electrónicos da imagem original que podem ser úteis como estratégia a seguir para se distinguir mais facilmente entre ambos os tipos de células. A figura 11 mostra a densidade integrada média em 9 séries experimentais diferentes, em que foram escolhidas bactérias com ADN não fragmentado (1) e bactérias com ADN fragmentado (2). A parte superior da figura mostra as médias por experiência, ao passo que a parte inferior mostra a média global por grupo de acordo com o critério de ADN fragmentado (1) versus ADN fragmentado (2) .
Descrição minuciosa da invenção 0 processo e o estojo da presente invenção são descritos nas reivindicações anexas e dizem respeito a um sistema simples e fiável para a determinação da frequência de microrganismos com ADN fragmentado. 0 processo de aplicação que permite a avaliação da integridade do ADN de um microrganismos, compreende os passos que consistem em: a) imobilizar o microrganismo numa lâmina, sem o fixar, por meio da sua inclusão num meio inerte; b) tratar com uma solução de lise para extrair as paredes celulares, membranas e proteínas; c) estabilizar o nucleoide de ADN na lâmina e d) corar e avaliar a integridade do ADN. A seguir, descreve-se mais minuciosamente o processo da invenção, bem como de algumas variantes e passos facultativos. Será evidente para um especialista na matéria que existem outras variantes e possibilidades, desde que os aspectos essenciais descritos sejam mantidos. 18 A) 0 primeiro passo consiste na preparação da amostra. Por meio dos processos usuais na especialidade, a concentração de microrganismos numa amostra liquida é obtida e verificada. A concentração adequada para a análise está compreendida entre 0,1 e 20 milhões de microrganismos por mililitro. Caso a amostra esteja concentrada excessivamente, então esta é ajustada para a concentração adequada por meio da sua diluição com o meio de cultura ou com uma solução de soluto salino tamponada com fosfato (PBS) ou semelhante, adequada de acordo co o microrganismo. É recomendável efectuar o processamento sob condições de luminosidade reduzida para evitar danos no ADN fotoinduzidos durante o manuseamento e as incubações. A amostra deverá ser colocada num suporte para o seu processamento de acordo com o processo da invenção e para facilitar a sua avaliação. De preferência, o suporte é uma lâmina de vidro que é revestida com uma película de agarose padrão. Para tal fim, prepara-se uma solução padrão de agarose com um título entre 0,2% e 1% em água destilada, num jarro de Coplin ou semelhante. Cobre-se com uma folha de plástico perfurada e coloca-se num forno de micro-ondas. Ajusta-se o forno de micro-ondas a uma potência compreendida entre 300W e 1000W, de preferência, a 500W, agitando o recipiente ocasionalmente para uma melhor dissolução em agarose. Este processo também pode ser efectuado utilizando um banho termostático. Quando a solução de agarose se torna completamente transparente, esta está pronta para se colocar em recipientes verticais com um teor compreendido entre 10 mL e 250 mL. Estes recipientes deverão ser previamente aquecidos num banho a uma temperatura compreendida entre 60°C e 100°C, de 19 preferência, a 70°C, para se manter a solução de agarose no estado líquido.
As lâminas deverão ser limpas. Estas são submersas verticalmente, segurando-as com pinças pela área de fundo durante 1 a 60 segundos, removendo-as então e submergindo-as novamente entre uma e dez vezes, até se formar uma película homogénea na lâmina. Estas são depositadas horizontalmente numa superfície lise e arrefecida entre 1°C e 15°C, de preferência, a 4°C, por exemplo, de vidro ou de metal. Este tabuleiro com as lâminas é introduzida num frigorifico a 4°C durante pelo menos 30 minutos, até se verificar que a solução de agarose gelificou sobre a superfície da lâmina. Os tabuleiros são então removidos do frigorífico e a superfície das lâminas que esteve em contacto com o tabuleiro é limpa com papel mata-borrão. As lâminas são então introduzidas horizontalmente num forno de secagem a uma temperatura compreendida entre 37°C e 100°C, até secar completamente a agarose e formar uma película fina aderida ao vidro. As lâminas assim tratadas podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas numa caixa bem fechada à temperatura ambiente durante vários meses.
Para facilitar o processamento da amostra que contém os microrganismos, esta é introduzida num meio com características semelhantes à de uma suspensão, tal como, por exemplo, um microgel de agarose. Neste caso, prepara-se uma solução de agarose de baixo ponto de fusão/baixo ponto de gelificação numa concentração compreendida entre 0,5% e 2% em água destilada ou em soluto salino tamponado com fosfato (PBS). Esta agarose é fundida utilizando um forno de micro-ondas ou um banho termostatizado, e é subsequentemente mantida entre 30°C e 37°C num tubo 20 introduzido num banho termostatizado ou forno de secagem. Num tubo de Eppendorf ou semelhante, a amostra e a solução de agarose são cuidadosamente misturadas, de um modo tal que a última esteja numa concentração compreendida entre 0,3% e 1%; por exemplo, 70 microlitros da solução de agarose + 30 microlitros da amostra. É importante que a temperatura de agarose não seja superior a 37°C, para não danificar os microrganismos.
Por último, para se obter a amostra no suporte, as lâminas revestidas são colocadas numa superfície lisa e arrefecida de vidro ou de metal, com uma temperatura compreendida entre 1°C e 15°C, evitando a formação de bolhas de ar. É recomendada o depósito com o auxílio de uma micropipeta de uma gota com 5 a 200 microlitros da mistura, colocando uma capa de cobertura no topo da gota. Como precaução, é recomendado o processamento de cada amostra em duplicado e a utilização de uma amostra de controlo de cada vez que a técnica é aplicada. O tabuleiro com as lâminas é introduzido num frigorífico a 4°C, durante 2 a 30 minutos, até ocorrer uma gelificação adequada da agarose. Após a gelificação ter tido lugar, as capas de cobertura são removidas gentilmente dentro do frigorífico, evitando danos no microgel. B) Depois das amostras terem sido adequadamente preparadas para o seu manuseamento fácil e repetido, estas são tratadas de acordo com o processo da invenção num passo de tratamento de lise para se extrair as paredes, membranas e proteínas. Para tal fim, cada lâmina é submersa numa posição horizontal num recipiente que contém a solução de lise. 21
De acordo com uma variante preferida, esta solução é formada por: ditiotreitol (DTT) entre 0,001 M e 2 M e, de preferência, entre 0,01 M e 0,8 M; 2-amino-2-(hidroxi-metil)-1,3-propanodiol (Tris) entre 0,001 M e 2 M e, de preferência, entre 0,005 M e 0,4 M; ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA) entre 0,001 M e 2 M e, de preferência, entre 0,01 M e 1 M; e dodecil-sulfato de sódio (SDS) entre 0,1% e 3% e, de preferência, entre 0,5% e 2,5%. Ajusta-se o pH desta solução até um valor compreendido entre 6,5 e 10,5 e, de preferência, 10, por exemplo, ajustando com NaOH. Há outras soluções de lise alternativas, com outros aditivos suplementares, ou então as concentrações e tempos de incubação e temperaturas da solução descrita podem ser variados desde que as suas características funcionais essenciais sejam mantidas. Assim, como alternativas a DTT refere-se compostos tais como beta-mercaptoetanol e outros agentes redutores. Como alternativas a Tris, é possível utilizar outras soluções tampão, tais como Hepes, Mops, Pipes. Como alternativa a EDTA, é possível utilizar outros agentes quelantes, tais como EGTA, etc.. Como alternativas a SDS, é possível utilizar outros detergentes catiónicos ou aniónicos, tal como referido anteriormente.
Em conformidade com a solução utilizada e com o tipo de amostra, as preparações são mantidas a incubar na solução de lise durante 1 a 120 minutos, de preferência, durante 1 a 35 minutos e, de um modo particularmente preferido, durante cerca de 5 minutos; e a uma temperatura compreendida entre 1°C e 45°C, de preferência, entre 18°C e 40°C e, de um modo particularmente preferido, a uma temperatura de 37°C. 22
Após o tratamento com a solução de lise, as preparações podem ser lavadas para se eliminar os resíduos destas soluções. Para este fim, as lâminas são introduzidas horizontalmente numa solução de lavagem que é tão neutra quanto possível, evitando agentes quelantes ou detergentes. Por exemplo, são submersas numa posição horizontal num recipiente que contém uma quantidade abundante de água destilada ou de uma solução tampão ou de soluto salino fisiológico durante um intervalo de tempo compreendido entre 1 e 60 minutos. A amostra é então desidratada. Para tal fim, é possível utilizar concentrações crescentes de álcool. Por exemplo, as lâminas são levantadas e submersas numa posição horizontal em recipientes com um conjunto de concentrações crescentes de etanol, entre 5% e 100%, durante 30 segundos a 60 minutos cada, deixando-se então as preparações secar ao ar. A temperatura dos álcoois pode estar compreendida entre -20°C e a temperatura ambiente. Pode ser preferível utilizar os álcoois a -20°C para melhorar a precipitação de ADN, durante 5 minutos cada. Como alternativa às incubações em conjuntos de etanol, as preparações podem ser desidratadas por incubação em soluções de diferentes álcoois, tais como metanol, ou deixando secar ao ar ou secar num forno de secagem. É importante que a lâmina esteja completamente seca de modo que o ADN adira a esta, visto que, normalmente, este separa-se quando exposto ao feixe de luz incidente do microscópio de fluorescência. Para tal fim, é recomendável permitir que esta seca a uma temperatura elevada durante um intervalo de tempo alargado. Por exemplo, é recomendável que esta seja mantida a incubar a 80°C durante pelo menos 60 minutos. 23
Depois de estarem completamente secas, as lâminas já processadas que contêm a amostra podem ser armazenadas em caixas de carga à temperatura ambiente e no escuro, durante meses. Tal facilita a separação do processo de tratamento de acordo com a invenção e o passo subsequente de avaliação da integridade do ADN dos microrganismos. A carga permite uma avaliação repetida a diferentes intervalos de diversas amostras de um e do mesmo microrganismo. C) Após a secagem, é crucial estabilizar e fixar firmemente o nucleoide de ADN à lâmina, visto que este se separa normalmente quando exposto ao feixe de luz incidente do microscópio de fluorescência. Para tal fim, as lâminas secas são mantidas a incubar num forno de micro-ondas a uma potência de 300W a 1000W, de preferência, a 500W, durante 5 a 10 minutos. Como alternativa, embora menos recomendável devido à sua duração, é possível manter a incubar as lâminas num forno ou num forno de secagem a uma temperatura elevada durante um ou várias horas. Após estarem completamente secas, as lâminas já processadas que contêm a amostra podem ser armazenadas em caixas de carga à temperatura ambiente e no escuro, durante meses. Tal facilita o processo de tratamento de acordo com a invenção e o passo subsequente de avaliação da integridade do ADN dos microrganismos. A carga permite uma avaliação repetida a diferentes intervalos de diversas amostras de um e do mesmo microrganismo. D) Após o tratamento das amostras de acordo com o processo descrito, é efectuado o passo de coloração e avaliação. Existem diversos processos possíveis para a avaliação da integridade do ADN dos microrganismos, tal como indicado anteriormente. A amostra é corada, facilitando a avaliação visual. Por meio da escolha adequada das condições de coloração, é possível obter uma qualidade elevada das imagens e uma consistência elevada dos resultados de avaliação. Devido ao tamanho relativamente pequeno do genoma dos microrganismos, é seleccionada a microscopia de fluorescência para a visualização do ADN, devido à sua sensibilidade superior.
Coloração para observação sob um microscópio de fluorescência
Dependendo da disponibilidade de filtros de fluorescência, as amostras podem ser coradas com fluorocromos específicos para ADN do tipo DAPI, Hoechst 33258, brometo de etídio, iodeto de propídio, etc.. No entanto, são preferidos fluorocromos com uma sensibilidade superior, tais como GelRed, EvaGreen e outros derivados de cianida, tais como as famílias SYBR, aqueles da PicoGreen, as variantes de TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO, LO-PRO, etc.. Presentemente, a quantidade e a qualidade de fluorocromos está a aumentar. Para se prevenir a perda de fluorescência, é possível incluir um meio anti-desvanecimento (por exemplo, o vector Vectashield H-1000, DABCO; etc.). No entanto, estes meios provocam normalmente uma fluorescência difusa e uma imagem de fundo límpida, o que torna difícil o contraste da imagem. É preferível a utilização de um fluorocromo bastante sensível e relativamente fotoestável, montado numa solução aquosa tamponada e avaliar a amostra de um modo relativamente rápido, antes que seque. Se necessário, a lâmina pode ser lavada e novamente corada. 25
Por último, a integridade do ADN dos microrganismos é avaliada.
As imagens obtidas podem ser estudadas através de uma análise visual directa ou, de preferência, por meio de uma aplicação informática para a análise de imagens digitalizadas obtidas através de câmaras analógicas ou digitais acopladas a plataformas de microscopia (exemplo 9) . 0 estudo de pelo menos 500 a 1000 microrganismos por amostra é inicialmente recomendado, adoptando a seguinte escala de danos no ADN (figura 2). 1. Nível 0: microrganismos sem ADN fragmentado: é nucleoide de ADN é mantido relativamente compacto, sem soluções de continuidade. 2. Nível 1: microrganismos com um nível reduzido de danos no ADN: o nucleoide parece compacto, mas com fragmentos periféricos discretos com um tamanho relativamente grande, após quebras de ADN. 3. Nível 2: microrganismos com um nível médio de danos no ADN: o nucleoide está mais relaxado, ocupando uma superfície maior, com fragmentos periféricos discretos com um tamanho relativamente grande, após quebras de ADN. 4. Nível 3: microrganismos com um grau elevado de danos no ADN: o nucleoide parece muito mais relaxado e estendido, com um número elevado de fragmentos periféricos, após quebras de ADN. 5. Nível 4: microrganismos com ADN massivamente fragmentado: apresentam um halo amplo e difuso de mais ou menos fragmentos de ADN punctiformes que se difundiram de acordo com um gradiente na matriz de agarose. 26 0 critério para se estabelecer a correlação entre o tamanho dos halos devido a difusão de fragmentos e a fragmentação de ADN é determinado a partir dos resultados obtidos utilizando a técnica de DBD-FISH (Fernández JL, Goyanes VJ, Ramiro-Díaz J, Gosálvez J. Application of FISH for in situ detection and quantification of DNA breakage. Cytogenet Cell Genet 1998; 82:251-256; Fernández JL, Vázquez-Gundin F, Delgado A, Goyanes VJ, Ramiro-Díaz J, de la Torre J, Gosálvez J. DNA breakage detection-FISH (DBD-FISH) in human spermatozoa: technical variants evidence different structural features. Mutat Res 2000; 453:77-82; Fernández JL, Gosálvez J. Application of FISH to detect DNA damage: DNA Breakage Detection-FISH (DBD-FISH). Methods Mol Biol 2002; 203:203-216; Fernández JL, Goyanes V, Gosálvez J. DNA Breakage Detection-FISH (DBD-FISH). In: Rautenstrauss B, Liehr T, eds. FISH technology-Springer lab manual. Heidelberg: Springer-Verlag; 2002; 282-290).
Este processo permite a detecção e quantificação das quebras de ADN em núcleos de células desproteinizadas submetidas a desnaturação controlada de ADN. Tal desnaturação gera secções de ADN de cadeia individual a partir das extremidades de quebra, as quais são detectadas por meio de hibridação in situ utilizando uma sonda de ADN genómica total marcada com um fluorocromo, o qual é visível através de microscopia de fluorescência. Quanto maior foi o nível de quebra no ADN da célula, maior é a quantidade de ADN de cadeia individual gerada pela solução de desnaturação, maior é a quantidade de sonda hibridada e maior é a fluorescência observada. As amostras processadas de acordo com a metodologia descrita na presente invenção foram expostas, após a lise, a uma solução alcalina de 27 desnaturação durante 2,5 minutos a 22°C. Esta solução gera secções de ADN de cadeia individual a partir das extremidades de quebra existentes no ADN. Assim sendo, a intensidade de hibridação, utilizando uma sonda de ADN genómica total, irá estar relacionada à quantidade de quebras presentes no ADN bacteriano. Assim, confirmou-se que os nucleoides relaxados com fragmentos apresentam uma marcação intensa com DBD-FISH, o que demonstra a fragmentação intensa do seu ADN (exemplo 1 e figura 3) . Os restantes nucleoides apresentam níveis de marcação bastante reduzidos com esta sonda, o que corresponde à hibridação de referência gerada pelo tratamento actual do nucleoide. 0 protocolo descrito é eficaz na maior parte de bactérias Gram-negativas. Nas referidas bactérias, a solução de lise é suficiente para lisar a parede celular e se observar o cromossoma bacteriano inteiro a difusão de fragmentos de ADN no caso da fragmentação de tal ADN. Para se analisar bactérias com uma parede resistente, tal como as bactérias Gram-positivas, é necessário mantê-las a incubar em suspensão com enzimas líticas de parede, antes da inclusão no microgel. Por exemplo, os estafilococos têm de ser re-suspensos com lisotafina (20 microgramas/mL) em tampão Tris-EDTA (TE). Os enterococos têm de ser mantidos a incubar com uma mistura de lisozima (2 mg/mL) e mutanolisina (50 microgramas/mL) em tampão Tris-EDTA (TE). As células de levedura são mantidas a incubar num tampão que contém sorbitol 1 M, EDTA 0,1 M, beta-mercaptoetanol 15 mM, pH 7,5, e zimolase (200 U/mL) , liticase ou glucalase (Ligozzi M, Fontana R. Isolation of total DNA from bactéria and yeast. Afr J Biotech 2003; 2: 251-253). 28
As incubações deverão ser efectuadas durante pelo menos 5 a 30 minutos a 37°C e a solução de microrganismo deverá ser misturada com a agarose de baixo ponto de fusão a incluir no microgel. Há outras enzimas que no momento não são tão comuns, mas que podem ser eficazes para a lise de bactérias Gram-positivas, tais como acromopeptidase e, em particular, labiase (Niwa T, Kawamura Y, Katagiri Y, Ezaki T. Lytic enzyme, labiase for a broad range of Gram-positive bactéria and its application to analyze functional DNA/RNA. J. Microbiol Methods 2005; 61:251-260).
Uma outra possibilidade consiste em mantê-las a incubar com lisozima (5 mg/mL) e polietileno-glicol 20000 a 24% durante 2 horas a 37°C (Maassen CBM. A rapid and safe plasmid isolation method for efficient engineering of recombinant lactobacilli expressing immunogenic or tolerogenic epitopes for oral administration. J Immunol Method 1999; 223: 131-136.). O gel de lise pode ser alcalino. A utilização de solventes orgânicos (acetona, butanol, tolueno, etc.) também pode auxiliar a quebra da parede bacteriana (Harrison STL. Bacterial cell disruption: a key unit operation in the recovery of intracellular products. Biotech Adv 1991; 9:217-240.). a utilização de sistemas mecânicos para a quebra da parede celular por meio de ultrassons ou de agitação com disrupção de partículas não são recomendáveis, uma vez que podem danificar o ADN do microrganismo. A presente invenção também contempla um estojo para testar a fragmentação de ADN em microrganismos. Este estojo contém uma solução de lise e um fluorocromo. O estojo também contém, por exemplo, o suporte pré-tratado com agarose, bem como uma solução para preparar um meio com 29 características semelhantes às de uma suspensão que irá conter a amostra, por exemplo, uma solução de agarose de baixo ponto de fusão, que permita a preparação de um microgel. 0 conteúdo e o modo de utilização de um estojo de acordo com uma variante da invenção são a seguir descritos mais minuciosamente.
Descrição do conteúdo do estojo 30
Capa de cobertura de vidro (18 x 18 mm, 22 x 22 mm ou 24 x 60 mm)
Micropipetas 4 caixas para incubações horizontais Água destilada
Etanol a 70%, 90%, 100%
Instruções para utilização
Preparação de uma amostra por lâmina. 1) Colocar a solução de lise num recipiente coberto para incubação horizontal num forno de secagem a 37°C. 2) Diluir a amostra de microrganismos em meio de cultura ou PBS a uma concentração de 5 a 10 milhões por mililitro.
Preparação do microgel de agarose 3) Introduzir o tubo de Eppendorf com agarose gelificada no flutuador, mantendo-o ao nivel da tampa, e deixá-lo a flutuar durante 5 minutos em água a 90°C-100°C, até a agarose fundir. Em alternativa, a agarose pode ser fundida num forno de micro-ondas. 4) Transferir o tubo de Eppendorf com o flutuador para um banho termostático a 37°C e deixá-lo durante 5 minutos até a temperatura estar em equilíbrio. 7) Adicionar 60 microlitros da amostra de microrganismo ao conteúdo do tubo de Eppendorf e colocar novamente em suspensão, utilizando a micropipeta. 8) Colocar uma lâmina pré-tratada sobre uma superfície fria a 4°C (por exemplo, uma folha de metal ou de vidro). 9) Após a lâmina ter arrefecido, depositar a suspensão de microrganismos com agarose e colocar uma capa de 31 cobertura de vidro, evitando a formação de bolhas de ar. 0 depósito de uma gota de 12, 20 ou 50 microlitros é recomendado para uma capa de cobertura de 18 x 18 mm, 22 x 22 mm ou 24 x 60 mm, respectivamente. 10) Introduzir a folha fria com a lâmina no frigorifico e deixar a amostrar gelificar durante 5 minutos.
Processamento das amostras 11) Utilizando luvas, remover a capa de cobertura deslizando-a e introduzir imediatamente a lâmina horizontalmente no recipiente com a solução de lise, cobrir e manter a incubar durante 5 minutos no forno de secagem ou num banho a 37°C. 12) Levantar a lâmina com o auxilio do bisturi utilizando luvas. Mantê-la numa posição horizontal e colocá-la horizontalmente numa caixa gue contém uma quantidade abundante de água destilada ou de solução tampão para lavar a solução de lise. Manter a incubar durante 5 minutos. 13) Introduzir a lâmina horizontalmente numa caixa com etanol a 70% (5 minutos), depois numa outra caixa com etanol a 90% (5 minutos) e, por último, em etanol a 100% (5 minutos), a -20°C. 14) Deixar secar ao ar e manter a incubar num forno de micro-ondas a 500W-1000W durante 3 a 10 minutos ou, por defeito, num forno de secagem a 80°C durante pelo menos uma hora ou de um dia para o outro. Após secas, as lâminas processadas podem ser armazenadas em caixas de carga à temperatura ambiente, no escuro, durante meses. 32
Coloração das amostras para observação num microscópio de fluorescência
Dependendo da disponibilidade de filtros de fluorescência, as amostras podem ser coradas com fluorocromos específicos de ADN do tipo EvaGreen (verde) ou GelRed (vermelho) . Os fluorocromos da família SYBR, em particular, SYBR Gold, permitem uma boa resolução com uma certa fotoestabilidade.
Armazenamento e estabilidade Armazenamento à temperatura ambiente.
Período de semi-vida: os reagentes e materiais são estáveis durante um período de pelo menos 6 meses. É recomendado que a solução de lise seja mantida numa posição vertical e bem fechada. Os exemplos a seguir apresentados são descritos como suporte de aspectos particulares da invenção e não deverão em qualquer caso limitar o seu âmbito.
Exemplo 1: confirmação da presença de quebras de ADN nos nucleoides que apresentam difusão de fragmentos.
Aplicou-se a metodologia descrita numa amostra da estirpe TG1 de Escherichia coli numa fase de crescimento exponencial em meio LB a 37°C, para se produzir halos de difusão de segmentos de ADN espontaneamente naqueles com ADN fragmentado. Para tal fim, misturou-se a amostra diluída até uma concentração de 10 a 20 milhões por mililitro em meio PBS ou LB com agarose líquida de baixo ponto de fusão a 1% para se obter uma concentração final desta última de 0,7%. Após a gelificação do microgel na lâmina, manteve-se a amostra a incubar na solução de lise 33 formada por Tris 0,01 M Tris, EDTA 0,05 M, DTT 0,1 M, SDS a 2%, pH 10 (ajustado com NaOH) , durante 5 minutos a 37°C. Lavou-se as lâminas em soluto salino fisiológico durante 5 minutos. Subsequentemente, formou-se DBD-FISH (DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization; Fernández et al., 1998; 2000; 2002; Fernández e Gosálvez, 2002) sequencialmente nas células actuais utilizando uma sonda de ADN de Escherichia coli genómica total. Este processo permite a detecção e quantificação de quebras de ADN no núcleo de células imersas nos microgeles de agarose que estejam desproteinizadas e submetidas a desnaturação de ADN controlada. Esta desnaturação gera secções de ADN de cadeia individual a partir das extremidades da quebra, as quais são detectadas por meio de hibridação in situ utilizando uma sonda de ADN de Escherichia coli genómica total marcada com um fluorocromo que emite fluorescência vermelha (Cy3) . Quando maior for o nível de quebra no ADN, maior será a quantidade de ADN de cadeia individual gerada pela solução de desnaturação, maior será a quantidade de sonda hibridada e maior será a fluorescência vermelha obtida. De acordo com o processo da presente invenção, as amostras processadas contêm ADN de cadeia individual gerado pela solução de desnaturação a partir de possíveis extremidades de quebra que existam no ADN. Assim sendo, a intensidade de hibridação utilizando uma sonda de ADN genómica total irá estar relacionada com a quantidade de quebras presentes no nucleoide de Escherichia coli.
Contou-se 250 células obtidas aleatoriamente. Capturou-se imagens de coloração com DAPI dos halos de dispersão de cromatina por meio da utilização de uma câmara CCD arrefecida utilizando dois filtros para a visualização 34 simultânea dos halos de dispersão, visíveis em azul, e do sinal horizontal, visíveis em vermelho. 0 propósito foi confirmar que os nucleoides com difusão de fragmentos de ADN possuem quebras de um tal ADN. Os resultados demonstraram que os nucleoides com difusão de fragmentos de ADN apresentam uma intensidade de marcação elevada das quebras de ADN por através de DBD-FISH (figura 3).
Assim sendo, a simples determinação da difusão de fragmentos de ADN, sendo tais fragmentos obtidos por meio do presente processo, proporciona uma estimativa simples e directa de fragmentação de ADN.
Exemplo 2: avaliação de fragmentação espontânea de ADN em diferentes espécies de bactérias.
Tomou-se nove espécies de bactérias em desenvolvimento numa placa e determinou-se a frequência de bactérias com fragmentação de ADN nas referidas amostras. Foram subtidas a processamento as seguintes espécies de bactérias: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Salmonella spp., Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae.
Manteve-se a incubar cada amostra em microgel de agarose, sendo efectuados três microgeles de 18 x 18 mm em cada lâmina, cada um deles correspondendo a diferentes espécies. Um dos microgeles de cada lâmina correspondia à mesma cultura de Escherichia coli, como resultado e como controlo do processamento. Manteve-se as lâminas a incubar na solução de lise, lavou-se, desidratou-se, deixou-se secar a 80 °C durante 3 horas, corou-se com SYBR Gold e examinou-se com o microscópio de fluorescência. Contou-se 35 mil células por espécie de bactéria. Os resultados estão apresentados no quadro 1. A lise foi eficaz para se obter nucleoides em todas as espécies analisadas (figura 4). Também foram observadas células com nucleoides cujo ADN estava massivamente fragmentado (nivel 4), difundindo-se na matriz de agarose, em todas as espécies. Esta fragmentação ocorreu de um modo espontâneo na cultura e não foi induzido por qualquer agente, tendo a sua frequência variado de uma cultura para a outra.
Quadro 1
Distribuição das percentagens de células com ADN fragmentado em 6 espécies de bactérias Microrganismo Fragmentação de ADN Escherichia coli 5,24 Proteus mirabilis 5, 91 Acinetobacter baumannii 39,59 Pseudomonas aeruginosa 3,35 Salmonella spp. 5 Stenotrophomonas maltophilia 6,29
Exemplo 3: avaliação da fragmentação de ADN após incubação com diferentes agentes antimicrobianos. Danos provocados por agentes exógenos.
Como exemplo ilustrativo, é apresentado um estudo para se tentar determinar os possíveis danos no ADN induzidos por três antibióticos: ampicilina, gentamicina e ciprofloxacina, e um agente gerador de radicais hidroxilo, peróxido de hidrogénio (H2O2), aplicados a culturas da estirpe TG1 de Escherichia coli, que é sensível a todos eles, em crescimento na fase exponencial em meio LB. Os 36 agentes utilizados possuem mecanismos de acção antimicrobiana diferentes. A ampicilina é um antibiótico de beta-lactama que afecta a síntese de peptidoglicano na parede celular após ligação a PBP (proteínas de ligação a penicilina) e que activa as autolisinas. A gentamicina é um antibiótico de aminoglicósido que afecta a síntese de proteínas ao nível da subunidade 30S, ligando-se à proteína plO de ribossomas bacterianos. A ciprofloxacina é um antibiótico da família de quinolona, que induz quebras de cadeia dupla de ADN como resultado da inibição de girase e toposiomerase IV de ADN. Misturou-se os agentes no meio de cultura LB líquido nas concentrações e tempos de incubação especificadas no quadro 2. Decorridos os referidos tempos de incubação, processou-se as bactérias de acordo com o processo da presente invenção para se determinar a percentagem de bactérias com ADN fragmentado.
Em simultâneo, manteve-se a incubar uma sua outra aliquota com uma coloração vital. Este é um teste de exclusão de corante, utilizando um fluorocromo verde (SYBR Green II) que se liga a ADN e que penetra todas as células, misturado com um fluorocromo vermelho, iodeto de propídio (IP) , que apenas penetra as células com um funcionalismo membranar deficiente, presumidamente células "mortas". As células "vivas" estão assim coradas de verde, uma vez que excluem o corante vermelho, ao passo que as células "mortas" não podem expelir o corante vermelho e estão coradas com IP. Os resultados estão apresentados no quadro 2. Após estudar 5000 em cada ponto experimental, observou-se que a gentamicina, a ciprofloxacina e o peróxido de hidrogénio apenas induziram um aumento muito discreto de células com uma membrana permeável a IP, ao passo que o 37 referido aumento foi espectacular com ampicilina. Embora a ampicilina dificilmente aumentou a percentagem de células com ADN fragmentado, tal como a gentamicina. No entanto, a ciprofloxacina e o H202, a doses elevadas, induziram uma fragmentação massiva de ADN de todas as células examinadas (nível 5, figura 5). Este resultado demonstra que a avaliação da permeabilidade da membrana não constitui um parâmetro universal como indicador de vitalidade e que o estudo de ADN pode proporcionar informação valiosa suplementar que não é fornecida pelo referida coloração e vice-versa.
Quadro 2
Percentagens de bactérias de Escherichia coli coradas com coloração vital e percentagem de bactérias com ADN fragmentado após a acção de diferentes agentes antimicrobianos
Agente Coloração vital Fragmentação Permeável Cápsulas vazias de ADN Controlo 0,50 0,05 0,30 Ampicilina pg/mL] (40 min. [300 ) 50,00 5, 00 4,20 Gentamicina pg/mL] (40 min. [300 ) 10,00 0,50 3,70 Ciprofloxacina pg/mL] (40 min. [25 ) 5, 00 0,30 100,00 H202 [10 mM] min. ) (10 5, 00 0,30 100,00
Exemplo 4: avaliação da sensibilidade ou resistência de um microrganismos a um determinado agente. É apresentado um estudo do efeito de ciprofloxacina ao nível do ADN numa estirpe sensível (TG1) e uma outra 38 estirpe resistente de Escherichia coli a este antibiótico, em crescimento na fase exponencial. A concentração inibitória média (MIC) do crescimento foi de 0,012 microgramas/mL. Pelo contrário, o crescimento da estirpe resistente não foi afectado pela concentração máxima utilizada no teste comercial (MIC > 32 microgramas/ /mL). Estudou-se seis concentrações de ciprofloxacina aplicadas a culturas em meio LB durante 40 minutos e efectuou-se o estudo da coloração vital de um modo semelhante ao descrito no exemplo anterior (quadro 3) e estudou-se o nivel de danos no ADN de acordo com o protocolo da invenção. Na estirpe sensível, observou-se um aumento muito discreto de células permeáveis a IP e com uma cápsula vazia à medida que se aumentou a dose de antibiótico até ao nível de dose utilizado mais elevado. A coloração vital não detectou qualquer efeito na estirpe resistente.
Quadro 3
Percentagens de bactérias de Escherichia coli coradas pela coloração vital após exposição a doses crescentes de ciprofloxacina numa estirpe sensível e em outra estirpe resistente ao antibiótico
Coloração vital*** Dose de Estirpe sensível Estirpe resistente ciprofloxacina Permeável Cápsulas Permeável Cápsulas vazias vazias Controlo (0,00 pg/mL) 0,40 0,00 0,66 0,03 0,50 pg/mL 0,95 0,05 0, 65 0,00 1,00 pg/mL 1, 04 0,00 0,72 0,10 2,50 pg/mL 2,60 0,15 0,87 0,10 5,00 pg/mL 2,67 0,24 1,08 0,10 10,00 pg/mL 3, 60 0,48 0,82 0,15 39
Observou-se danos ao nível de ADN na estirpe sensível e na concentração mais reduzida utilizada na experiência (0,5 pg/mL) . Além disso, a esta concentração, o nível de danos corresponde ao tipo 4, isto é, o máximo na escala estabelecida anteriormente (figura 2). Todos estes microrganismos apresentaram ADN massivamente fragmentado, com um halo amplo e difuso de fragmentos de ADN punctiformes que difundiram na matriz de agarose de acordo com um gradiente desde a área central do nucleoide. Doses superiores a 0,5 pg/mL não pareceram modificar as imagens de fragmentação, sendo possivelmente observada uma difusão ligeiramente superior, em particular, na área central do nucleoide. Tal pode indicar um efeito perto da saturação dos danos no ADN provocados por ciprofloxacina.
Exemplo 5: determinação do possível efeito de doses reduzidas de ciprofloxacina, perto do MIC, sobre a integridade de ADN.
Após ter sido determinado que a ciprofloxacina a concentrações elevadas induz uma fragmentação massiva de ADN, é interessante determinar se a técnica pode descriminar qualquer efeito ao nível da integridade de ADN após a exposição da estirpe sensível (TG1) de Escherichia coli (TG1) a concentrações reduzidas do antibiótico anterior, inferiores e ao nivel de MIC (0,012 microgramas/ /mL). As doses utilizadas são apresentadas no quadro 4, sendo o tempo de incubação de 40 minutos na fase de crescimento exponencial em meio LB. O quadro 4 mostra os resultados da coloração vital. Embora exista uma tendência de aumento da percentagem de células permeáveis a IP e com 40 cápsulas vazias à medida que a dose é aumentada, tal não é significativo com as doses reduzidas utilizadas.
Quadro 4
Dose de ciprofloxacina Coloraçao vital Estirpe sensível Permeável Cápsulas vazias Controlo (0,00 yg/mL) 1,30 0, 60 0,003 yg/mL 1,50 0,70 0,006 yg/mL 2, 10 0,76 0,012 yg/mL 2,30 1,06 0,100 yg/mL 2,40 1,40
Percentagens de bactérias de Escherichia coli coradas por coloração vital após a exposição a doses reduzidas crescentes de ciprofloxacina numa estirpe sensível
Determinou-se o nível de danos no ADN por meio do processo objecto da presente invenção. A dose mais elevada (0,1 microgramas/mL) , superior ao MIC, apresentou danos em todas as células analisadas. Tais danos tendem a ser homogéneos entre as diferentes células, apresentando uma magnitude inferior do que o esmagamento massivo descrito no exemplo anterior, com doses de 0,5 microgramas/mL e superiores. No entanto, o grau de danos foi considerável, semelhantes ao nível 3 (figura 2). Este nível é qualificado como um nível elevado de danos no ADN. O nucleoide parece muito relaxado e estendido, com um grande número de fragmentos periféricos após quebras de ADN. A dose semelhante ao MIC também provocou danos claros e homogéneos entre os diferentes nucleoides, mas com uma magnitude semelhante ao nível 2 da escala (figura 2) . 41
Corresponde a um grau médio de danos no ADN. 0 nucleoide parece relaxado, ocupando uma superfície mais ampla do que o controlo sem tratamento, com fragmentos periféricos discretos com um tamanho relativamente grande, após quebras de ADN. A dose de 0,006 microgramas/mL, metade da MIC, também induziu danos claros e homogéneos entre os diferentes nucleoides, sendo a sua magnitude intermediária entre o nível 1 e 2, na escala de dano arbitrária (figura 2).
Por último, a dose de 0,003 microgramas/mL, um terço da MIC, também induziu danos evidentes, embora de nível 1. Tal corresponde a um grau reduzido de danos no ADN, em que o nucleoide parece compacto, mas com fragmentos periféricos discretos com um tamanho relativamente grande, após quebras de ADN (figura 2).
Em conclusão, o processo objecto da presente invenção possui uma elevada resolução, de um modo tal é mesmo possivel detectar os danos induzidos por concentrações muito reduzidas de ciprofloxacina, inferiores a MIC, que não inibem significativamente o crescimento bacteriano nem afectam a "viabilidade" determinada pela coloração vital. É possível que os níveis reduzidos de danos possam ser reparados por maquinaria enzimática de reparação de ADN, permitindo a viabilidade da célula.
Exemplo 6: determinação do tempo de incubação mínimo com ciprofloxacina que permite a detecção de danos no ADN na estirpe sensível de Escherichia coli.
Manteve-se a incubar a estirpe TG1 de Escherichia coli em crescimento exponencial em meio LB durante períodos de tempo decrescentes: 40 minutos, 15 minutos, 5 minutos, 42 2.5 minutos e 0 minutos, com uma dose de 1 micrograma/mL de ciprofloxacina. Também se incluiu um controlo isento de ciprofloxacina. 0 tempo médio necessário para a inclusão num microgel e arrefecimento num frigorifico foi estimado como sendo de 1,5 minutos. É possível presumir que o antibiótico está a trabalhar durante este tempo, pelo que o tempo de 1,5 minutes deverá ser adicionado a cada um dos tempos testados.
Decorridos 40 minutos, todas as bactérias apresentaram ADN massivamente esmagado (nível 4; figura 6) . Um efeito também demonstrado com um tempo de 15 minutos, neste caso, o dano também tendeu a ser homogéneo entre os diferentes nucleoides, mas apresentando uma magnitude muito inferior de um nível médio (nível 2) (figura 6). O tempo mínimo para o qual foram detectados danos evidentes no ADN foi de 5 minutos, apresentando um nível reduzido de danos (nível 1), embora com 2,5 minutos pareceu ser observado um ligeiro aumento no relaxamento do nucleoide em comparação com o tempo de 0 minutos e com o do controlo, embora fosse difícil avaliar.
Assim sendo, a técnica objecto da invenção permite reconhecer que os danos no ADN provocados por uma dose de ciprofloxacina letal são acumulativos ao longo do tempo e não são instantâneos ou gerados num período de tempo relativamente curto. 0 tempo mínimo de incubação para se detectar um efeito mínimo ao nível de ADN utilizando uma dose de 1 micrograma/mL foi de 5 minutos + 1,5 minutos = 6.5 minutos. 43
Exemplo 7: observação de danos no ADN após cultura com antibióticos que não actuam ao nível do ADN, incubação durante 24 horas. 0 propósito consistem em observar se, embora não observando danos inicialmente ao nível do ADN, a morte celular significa uma fragmentação tardia desse ADN. Para esse fim, manteve-se a incubar a estirpe TG1 de Escherichia coli, em crescimento na fase exponencial em meio Lb líquido, durante 24 horas com ampicilina (300 microgramas/ /mL). Este antibiótico de beta-lactama afecta a síntese de peptidoglicano na parede celular após ligação a PBP (proteínas de ligação a penicilina) e activa autolisinas. Para a comparação, processou-se uma aliquota de cultura após 40 minutos de tratamento, tanto para a coloração vital como para a determinação de danos no ADN por meio da técnica da invenção. 0 quadro 5 mostra os dados da coloração vital. Após 20 minutos de incubaçao com o antibiótico de beta-lactama, a percentagem de células com uma parede alterada, permeável ou com uma aparência de cápsula vazia, aumentaram claramente. Após um dia de incubação, o aumento foi espectacular, em particular, as células com a aparência de uma cápsula vazia, parecendo praticamente todas mortas segundo o ponto de vista da coloração vital. 44
Quadro 5
Percentagens de bactérias de Escherichia coli coradas por meio da coloração vital após incubação com ampicilina
Coloração vital Agente 20 minutos 24 horas Permeável Cápsulas vazias Permeável Cápsulas vazias Controlo 0,32 0,20 0,90 25, 10 Ampicilina 5,22 0, 67 17,29 75, 97 A determinação dos danos no ADN de acordo com a técnica da invenção demostrou que as diferenças não foram observadas no que diz respeito ao controlo após 20 minutos de incubação. No entanto, decorridas 24 horas, verificou-se uma pequena densidade de nucleoides e estes apresentaram uma aparência relaxada, sem uma área central bem definida. O que foi mais inquietante foi a presença massiva de fragmentos de ADN degradados punctiformes distribuídos homogeneamente sobre o fundo da preparação (figura 7) . O processo objecto da presente invenção demonstra que a morte celular, embora não seja inicialmente provocada por danos directos no ADN, pode dar origem indirectamente a danos massivos no ADN ao longo do tempo.
Exemplo 8: observação da evolução de danos no ADN gerados por ciprofloxacina numa estirpe sensível de Escherichia coli . Aplicação de sistemas de análise de imagens digitais para avaliar os danos. Manteve-se a incubar a estirpe TG1 de Escherichia coli , em crescimento exponencial em 400 microlitros de meio LB, com 10 microgramas/mL de ciprofloxacina, durante 40 minutos. Subsequentemente, submeteu-se as bactérias a centrifugação e colocou-se novamente em suspensão em 400 45 microlitros de meio isento de ciprofloxacina. Repetiu-se novamente esta operação para se lavar o antibiótico. Manteve-se as bactérias a incubar durante 0, 15, 30, 60 e 90 minutos, tendo sido depois processadas de acordo com o processo da invenção. Em simultâneo, processou-se um controlo sem tratamento com antibiótico na mesma lâmina, de cada vez.
Depois de se corar com SYBR Gold, capturou-se as imagens com uma câmara CCD KX32ME arrefecida de elevada sensibilidade (Apogee Instruments, Roseville, CA) . Subsequentemente, analisou-se as imagens por meio de um macro concebido com a aplicação informática Visilog 5.1 (Noesis, França). Tal permitiu a segmentação e correcção das diferenças de fundo e de luminosidade no campo. Os resultados da superfície total de coloração bacteriana, da área da cápsula residual e do halo de arcos e fragmentos de ADN dispersos (área total - área da cápsula), em pixels, foram transcritos para uma tabela de Excel. Por último, foi conduzido um estudo estatístico dos referidos dados por meio da aplicação informática SPSS 12.5, utilizando o teste de Mann-Whitney U não paramétrico e o teste de Kruskal-Wallis H (p < 0,05) .
Os resultados demonstraram que as quebras de ADN de cadeia dupla provocadas por ciprofloxacina podem ser reparadas caso o antibiótico seja eliminado do meio. Imediatamente após o tratamento, é possível observar uma elevada fragmentação (nível 3-4) . Uma diminuição na superfície do halo de difusão de fragmentos começa a ser detectada de um modo estatisticamente significativo decorridos 15 minutos, apresentando tais fragmentos um tamanho maior. Este halo continua a diminuir mais 46 lentamente durante 30 3 60 minutos, apresentando cada vez menos fragmentos, diminuindo mais significativamente, mais amplamente, decorridos 90 minutos (figura 8A) . Neste caso, os fragmentos deixam de ser detectados e, em vez disso, os arcos de relaxamento de ADN não apresentam diferenças em relação aos controlos sem tratamento (nível 0) . Foi assim obtida uma cinética de reparação de quebras de ADN, sendo tal ADN totalmente reparado em termos de aparência decorridos 90 minutos de incubação. No entanto, tal não significa que a reparação tenha sido sempre correcta. Curiosamente, o tamanho das cápsulas bacterianas aumenta cerca do dobro, em média, após os tempos finais de 60 e de 90 minutos, em comparação com os restantes tempos testados (figura 8B). Tal aumento é irregular e heterogéneo entre as diferentes bactérias. O processo objecto da presente invenção demonstra um facto clinicamente bastante importante, isto é, a importância de manter as doses correctas de antibiótico durante tempos prolongados. Caso tal antibiótico seja retirado prematuramente, os danos causados inicialmente na bactéria podem ser revertidos.
Exemplo 9: desenvolvimento de uma aplicação informática para a medição automatizada dos níveis de fragmentação de ADN
Utilizando a metodologia contemplada no exemplo 6 da presente invenção, foi concebida uma metodologia básica fixando a base para a caracterização morfológica das imagens geradas por bactérias que possuem ADN fragmentado e ADN não fragmentado, utilizando sistemas de análise de imagens convencionais. O processo permite a descriminação 47 entre ambos os tipos de bactérias automaticamente e, por tal motivo, objectivamente. 0 processo global compreende a concepção de duas estratégias: 1) um modelo para capturar interactivamente imagens e tomar decisões com base no número de elementos analisados (figura 9); 2) uma rotina de segmentação para seleccionar as ROI (regiões de interesse) (figura 10).
Neste exemplo prático, utilizou-se a captura directa com um microscópio de fluorescência (xlOO), utilizando uma câmara CCD monocromática arrefecida com uma profundidade de cor de 12 bit. As imagens foram guardadas como . tiff e foram processadas utilizando o programa Scion Image de domínio público (NIH IMAGE USA) . Este programa contém as ferramentas mínimas necessárias para efectuar as operações de segmentação e pode medir densidades de fluorescência integradas nas imagens que são processadas. A densidade integrada relaciona a soma dos diferentes níveis de cinzento no AOI com a área, efectuando uma subtração do fundo. Utilizando esta ferramenta, foram processadas 9 séries de experiência, em que foram capturadas 100 bactérias que contêm ADN não fragmentado e 100 bactérias com ADN fragmentado. Os resultados mostram que são gerados valores muito semelhantes entre cada uma das séries quando o critério de selecção de grupos e de comparação é: bactérias que possuem ADN fragmentado versus bactérias que não possuem ADN fragmentado.
Assim sendo, é possível discriminar os dois tipos de estados de ADN bacteriano com base em observações 48 objectivas efectuadas com base em ambientes de análise de imagens.
Embora neste caso apenas tenham sido medidas as áreas de fluorescência e as intensidades das áreas seleccionadas, há outros critérios no que diz respeito às texturas geradas por cada tipo de imagem, sendo assim possível caracterizar e discriminar ambas as populações. 49
REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.
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Claims (13)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para avaliar a integridade de ADN de microrganismos que compreende os seguintes passos sequenciais: a) imobilizar o microrganismo numa lâmina, sem fixação, por meio da sua inclusão num meio inerte; b) tratar com uma solução de lise não desnaturante de ADN, que possui um pH compreendido entre 6,5 e 10,5, para extrair as paredes celulares, membranas e proteínas, em que o detergente que está compreendido na referida solução de lise é um detergente de desnaturação de proteínas iónico, c) estabilizar o nucleoide de ADN do microrganismo na lâmina secando a amostra por meio de calor de secagem, incubar a lâmina com a amostra lisada num forno de micro-ondas e d) corar com um corante bastante sensível e avaliar a integridade do ADN.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o detergente iónico é um detergente seleccionado entre o conjunto constituído por dodecil-sulfato de sódio (SDS), sulfato de alquilbenzeno, lauril-sarcosina (sarcosilo), sal hidratado de ácido glicólico e suas misturas.
3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 2, em que a solução de lise compreende ditiotreitol (DTT) entre 0,001 M e 2 M; 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3- propanodiol (Tris) entre 0,001 M e 2 M; ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) entre 0,001 M e 2 M e dodecil-sulfato de sódio (SDS) entre 0,1% e 3%. 2
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a solução de lise compreende, de preferência, ditiotreitol (DTT) 0,1 M; (hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) 0,01 M; ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) 0,05 M e dodecil-sulfato de sódio (SDS) a 2%.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que o pH da solução de lise é ajustado até um pH de cerca de 10 com NaOH.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra que contém os microrqanismos é incluída num microgel inerte e, de preferência, um microgel de agarose.
7. Processo para a avaliação da integridade de ADN de microrganismos de acordo com a reivindicação 1, em que a avaliação é efectuada por meio de uma análise visual directa.
8. Processo para a avaliação da integridade de ADN de microrganismos de acordo com a reivindicação 1, em que a avaliação é efectuada de um modo automatizado por meio da utilização de uma aplicação informática para a análise de imagens digitalizadas, obtidas através de câmaras acopladas a plataformas de microscopia.
9. Utilização de um estojo para efectuar o método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido estojo compreende: a) lâminas pré-tratadas; b) solução de agarose; 3 c) solução de lise que compreende um detergente de desnaturação de proteínas iónico e d) fluorocromo.
10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a solução de lise compreende ditiotreitol (DTT) entre 0,001 M e 2 M; 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) entre 0,001 M e 2 M; ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) entre 0,001 M e 2 M e dodecil-sulfato de sódio (SDS) entre 0,1% e 3%.
11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 e 10, em que o pH da solução de lise é ajustado para um valor de pH entre 6,5 e 10,5.
12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que a solução de lise compreende, de preferência, ditiotreitol (DTT) 0,1 M; (hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) 0,01 M; ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) 0,05 M e dodecil-sulfato de sódio (SDS) a 2%.
13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, em que o pH da solução de lise é ajustado até um pH de cerca de 10 com NaOH.
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