ES2329637A1 - Procedimiento para la determinacion de la fragmentacion del adn en microorganismos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación de la fragmentación del ADN en microorganismos. La presente invención se relaciona con un procedimiento para la determinación de la integridad del ADN en microorganismos, y un kit para la evaluación de la integridad del ADN en los mismos. Debido a que la muerte celular se traduce en fragmentación del ADN, con el presente procedimiento se puede discriminar claramente, y de forma sencilla, rápida y precisa, los niveles de fragmentación de ADN en microorganismos.

Description

Procedimiento para la determinación de la fragmentación del ADN en microorganismos.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria biotecnológica, y principalmente aquel relacionado con la microbiología, cuyo ámbito de aplicación se encuentra dentro del sector sanitario (humano, veterinario, medioambiental, y básico).

En concreto, re refiere a un procedimiento para la determinación de la integridad del ADN en microorganismos, dado que la muerte celular se traduce en fragmentación del ADN y un kit para la evaluación de la integridad del ADN en microorganismos.

Estado de la técnica

Los microbios pueden morir por diversas causas. En el caso de las bacterias, organismos de especial interés sanitario, el mecanismo final de muerte por acción de agentes antibióticos es prácticamente desconocido, seguramente por lo obvio del problema. Los antibióticos afectan procesos celulares importantes, que tarde o temprano llevarán a la muerte de la célula. A pesar del conocimiento del mecanismo inicial de acción de un antibiótico concreto, a veces no es posible discernir claramente un efecto bacteriostático o bactericida. Este cuadro acerca de la muerte celular es especialmente complicado por la reciente descripción de la presencia de una pequeña proporción de células que persisten invulnerables a los antibióticos bactericidas, a pesar de no ser mutantes y no crecer en presencia del antibiótico. Dichas células persistentes parecen explicar la alta resistencia de los biofilms y de los cultivos estacionarios a la muerte por agentes quimioterápicos.

Por otra parte, los estudios de perfil de transcripción de la totalidad de los genes de Escherichia coli, han demostrado la existencia de un grupo de genes que se inducen y otros que se reprimen de forma común tras la acción de antibióticos, siendo el mecanismo de acción muy diferente. Esto se comprobó con la ampicilina, inhibidora de la síntesis de la pared celular, y con la ofloxacina, fluoroquinolona que bloquea la ADN girasa y la topoisomerasa IV, induciendo daño directo en el ADN (Kaldalu N, Mei R, Lewis K Killing by ampicillin and ofloxacin induces overlapping changes in Escherichia coli transcription profile. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:890-896.)

Estos conocimientos sugieren que la muerte celular en bacterias, por ejemplo tras la acción de un antibiótico bactericida, podría ser un proceso programado, al igual que el fenómeno de apoptosis, presente en los organismos superiores. Un fenómeno similar ha sido descrito en levaduras unicelulares, como respuesta la acción de agentes fungicidas. La autolisis de las células bacterianas por autodigestión de la pared celular por autolisinas, tras la exposición a antibióticos o condiciones ambientales adversas, puede ser una expresión de la muerte celular programada de organismos defectuosos (Lewis K Programmed Death in Bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 2000; 64:
503-514.)

La mayor parte de estudios de acción quimioterápica se vienen evaluando de modo rutinario, desde los inicios de la microbiología, valorando el crecimiento celular como, la capacidad de producir colonias en un medio de cultivo semisólido, o de producir turbidez en un medio líquido. Este sistema además de ser relativamente largo, no evalúa el comportamiento de cada célula, sino el conjunto en general, y sólo es aplicable a aquellos microorganismos con capacidad de ser cultivables in vitro. Para estudiar el estado vital de cada célula, es necesario el uso de técnicas de microscopía o citometría. (Lecoeur H Nuclear apoptosis detection by flow cytometry: influence of endogenous nucleases. Exp Cell Res 2002; 277:1-14; Steensma DP, Timm M, Witzig TE. Flow cytometric methods for detection and quantification of apoptosis. Methods Mol Med 2003; 85:323-332).

Una posible evaluación, aunque no habitual, es valorar la permeabilidad de la pared celular y de la membrana celular, usando colorantes vitales. La célula sólo se tiñe con el colorante vital si posee una alteración de la barrera que la aísla del exterior, lo cual suele estar ligado a la lisis por choque osmótico. Sea por daño directo, a través de sistemas enzimáticos, o a través de la pérdida de la integridad de la membrana, el ADN del cromosoma del microorganismo debe fragmentarse en el proceso de muerte celular. Sin embargo, la integridad del ADN cromosómico no se ha venido evaluando como parámetro de muerte microbiana, en estudios in situ, célula a célula. Esto se debe a la ausencia de una técnica asequible, fiable y reproducible, para determinar la integridad de un ADN cromosómico de pequeño tamaño en relación con el de las células de organismos superiores.

Existen diferentes metodologías in situ, bien establecidas, para evaluar la integridad del ADN de las células de organismos superiores, en relación con el daño inducido, y con la muerte celular por apoptosis o necrosis. Entre ellas se destacan el etiquetado de roturas del ADN in situ introduciendo nucleótidos marcados en las mismas utilizando enzimas como la transferasa terminal (TUNEL) o la ADN polimerasa (in situ nick translation ISNT) (Didenko V, ed. In situ detection of DNA damage. Humana Press, Totowa, New Yersey, 2002.)

Estas metodologías se basan en el empleo de enzimas sobre las células fijadas en portaobjetos, las cuales actúan sobre extremos 3'-OH de las roturas, es decir, sin modificaciones químicas. Por dicho motivo su eficacia es irregular, resultando sólo marcadas aquellas roturas accesibles a la enzima, lo cual se traduce en una reproducibilidad relativamente baja de los resultados. Existe un único trabajo de aplicación de la técnica de TUNEL para la detección de roturas del ADN bacteriano, en Escherichia coli y la arquea Haloferax volcanii (Rohwer F and Azam F. Detection of DNA Damage in Prokaryotes by Terminal Deoxyribonucleotide Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling Appl Environ Microbiol 2000; 66:1001-1006.)

En este estudio se demostró la capacidad de detección de la fragmentación del ADN bacteriano tras infección por un fago. Sin embargo, las roturas originadas directamente por el peróxido de hidrógeno, en ciertas condiciones, no eran detectadas. Esto puede deberse a la imposibilidad de la enzima de marcar roturas con extremo 3'-OH modificados, lo cual es una dificultad de esta técnica. Por otra parte, las células deben ser fijadas para efectuar estas técnicas, lo cual afecta a la capacidad de marcaje. Además, los reactivos son caros, por lo que estas técnicas sólo se aplican en estudios de investigación, no siendo posible utilizarlas para la valoración rutinaria del daño del ADN y su degradación. Estas técnicas son relativamente largas y complejas, por lo que no se han establecido de modo habitual en microbiología, no habiéndose descrito más trabajos en relación a las mismas.

Otra técnica de microscopía para el estudio in situ, célula a célula, de la integridad del ADN, es el ensayo de cometas, o electroforesis de célula única (Olive PL, Durand RE. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry 2005; 66:1-8.)

Las células eucariotas se incluyen en un microgel de agarosa sobre un portaobjetos y se someten a soluciones lisantes para extraer las membranas y las proteínas. Se obtienen así nucleoides, es decir, núcleos desproteinizados, en los que los bucles de ADN se han relajado por la descompactación. Los nucleoides se someten a una electroforesis en una cubeta rellena de solución tampón, de tal modo que las fibras de ADN migran hacia el ánodo, constituyendo una imagen de corneta, con una cabeza y una cola en la dirección de la migración electroforética. Estos cometas se tiñen con un colorante fluorescente, para ser observados mediante microscopía de fluorescencia. Si el núcleo presenta fragmentación del ADN, gran cantidad de fragmentos del mismo habrán migrado, concentrándose en la cola del corneta. Se trata de un test bastante sensible, pero relativamente caro y complicado para un laboratorio clínico convencional. De hecho, requiere cierto instrumental no común: fuente y cubeta de electroforesis y un sistema de captación de las imágenes y de análisis de las mismas. Por todo ello, sólo se utiliza con fines de investigación. Existe un único trabajo publicado de aplicación de la técnica de cometas a pH neutro, en la bacteria Escherichia coli (Singh NP, Stephens RE, Singh H, Lai H. Visual quantification of DNA double-strand breaks in bacteria. Mutat Res 1999;
429:159-168.)

La técnica es larga y engorrosa, requiriendo múltiples incubaciones, y la interpretación de las imágenes en relación con las roturas del ADN no está clara. Por ello, tampoco se ha descrito ningún otro trabajo con esta técnica, en bacterias.

De lo descrito anteriormente, se desprende que subsiste la necesidad de un proceso fiable que pueda ser utilizado de una forma rutinaria y sencilla para el estudio in situ de la integridad de la cromatina/ADN en microorganismos. Se trata de desarrollar o adaptar una metodología mucho más rápida y eficaz para evaluar la muerte bacteriana, poniendo un especial énfasis en la muerte que se genera por, o se traduce en, la degradación del ADN. Este es pues, un campo en el que apenas se han aportado innovaciones. El proceso tiene que ser robusto, fácil de implementar, barato y accesible al laboratorio básico. Además, tiene que dar resultados homogéneos entre distintos laboratorios y ser susceptible de automatización. El ensayo de difusión del ADN guarda cierta relación con el ensayo de electroforesis de célula única, permitiendo evaluar la fragmentación del mismo. Las células inmersas en un microgel inerte de agarosa, sobre un portaobjetos, son sometidas a lisis. Si las células tienen el ADN fragmentado, los fragmentos difunden en la matriz de agarosa, a partir del núcleo inicial, mostrándose halos amplios de difusión periférica de fragmentos de ADN) (Vasquez M, Tice RR. Comparative analysis of apoptosis versus necrosis using the single cell gel (SCG) assay. Environ Mol Mutagen 1997; 29:53.). Esto se ha aplicado a células eucariotas, principalmente de tipo somático. Las células que muestran difusión de fragmentos de ADN corresponden a aquellas que han muerto por un proceso de apoptosis (Singh NP. A simple method for accurate estimation of apoptotic cells. Exp Cell Res 2000; 256:328-337.).

Algunas variantes de este ensayo se han aplicado con éxito a espermatozoides humanos y de otras especies animales, por nuestro grupo de investigación, siendo denominadas test de dispersión de la cromatina de los espermatozoides, o Sperm Chromatin Dispersion (SCD test), (Rodríguez S, Goyanes V, Segrelles E, Blasco M, Gosálvez J, Fernández JL. Critically short telomeres are associated with sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2005; 84: 843-845.; Enciso M, López-Fernández C, Fernández JL, García P, Gosálbez A, Gosálvez J. A new method to analyze boar sperm DNA fragmentation under bright-field or fluorescence microscopy. Theriogenology 2006; 65:308-316.).

Las principales diferencias de la variante del procedimiento de la presente invención, con respecto a la técnica presentada para espermatozoides son las siguientes:

- No es necesaria la primera incubación con una solución ácida, necesitándose únicamente la lisis.

- La solución para lisar espermatozoides no es activa en microorganismos como bacterias. El Triton X-100 no es activo para lisar estos microorganismos. Para ello es recomendable que la lisis contenga un detergente más fuerte, con capacidad desnaturalizante de las proteínas, como el SDS, y añadiendo EDTA, como agente quelante que ayuda a desestabilizar las paredes celulares.

Técnicamente estas diferencias se traducen en la lisis de la pared bacteriana, conservando la integridad del ADN. Esto último es importante porque el ADN bacteriano, al estar relativamente desprovisto de proteínas en relación con el de las células eucariotas, podría ser más susceptible de daño iatrogénico, generado durante la manipulación y el procesado.

El empleo de colorantes fluorescentes de alta sensibilidad, como los de la familia SYBR, por ejemplo el SYBR Gold, permiten discriminar la fibra de ADN de los nucleoides del microorganismo, y sobre todo, visualizar con precisión los pequeños fragmentos de ADN que difunden en la agarosa, en caso de fragmentación del mismo. Esto no es posible usando fluorocromos clásicos del ADN como el ioduro de propidio (IP), Bromuro de etidio, naranja de acridina, Hoechst 33258 ó 33342, o el DAPI.

Otra ventaja adicional, es que el tiempo necesario de incubación en la lisis es mucho más corto, resultando en una metodología más rápida en comparación con la descrita en espermatozoides.

En la presente invención, es primordial estabilizar el nucleoide de ADN del microorganismo, para poder ser visualizado con el microscopio de fluorescencia. Este pequeño nucleoide es muy delicado, desprendiéndose y degradándose progresiva y rápidamente al medio líquido de tinción, al ser expuesto a la luz del microscopio de fluorescencia. Este es un problema técnico fundamental que no ocurre con los nucleoides de los espermatozoides u otros tipos celulares de organismos superiores, con muchísima mayor masa. En el caso de los microorganismos, para estabilizar el nucleoide y adherirlo firmemente al portaobjetos se desarrolla un paso de incubación calórica intensa, en seco. Así, una vez secado el portaobjetos con los nucleoides, antes de la tinción, se incuba en un horno microondas a elevada potencia (750-1000W) durante 10 min. Posteriormente ya puede ser teñido y visualizado. Otra posibilidad es incubar el portaobjetos en un horno a alta temperatura 80-100ºC durante horas. Sin embargo, el uso del horno microondas acelera enormemente el proceso, ayudando a que el protocolo técnico sea de rápida ejecución. Este paso de estabilización es fundamental en la invención para que el proceso tenga un gran valor añadido en la elaboración de un producto comercial final.

De lo expuesto anteriormente, se desprende que el procedimiento de la presente invención resulta en imágenes de nucleoides de microorganismos, pudiendo discriminar claramente aquellos que contienen el ADN fragmentado. En consecuencia, con dicho procedimiento, la determinación de los niveles de fragmentación del ADN de la muestra es sencilla y fiable, lo que hace que se pueda utilizar de forma rutinaria y a un bajo coste. Su aplicación es pertinente en distintos laboratorios microbiológicos, tanto de ámbito clínico como básico, con muestras de microorganismos.

Sin embargo, nunca se ha aplicado un ensayo de estas características para determinar la integridad del ADN de microorganismos. Seria de enorme interés potencial el conseguir adaptar y ajustar esta metodología para evaluar genomas de relativamente pequeño tamaño, tras conseguir previamente lisar las paredes bacterianas, para permitir la difusión del ADN, en caso de fragmentación del mismo. Se podría disponer entonces, de una herramienta relativamente sencilla y rápida, que permitiría valorar in situ, célula a célula, la presencia de roturas del ADN en bacterias y otros microorganismos, de modo reproducible. La visualización a nivel microscópico de una molécula de ADN fragmentada tras la acción de agentes líticos, puede ser utilizada para analizar, de manera rápida, la muerte celular bacteriana. Las interesantes y múltiples aplicaciones potenciales de dicha metodología, tanto de investigación, como hospitalario, de carácter veterinario, o bien de protección del medio ambiente, se detallan a continuación:

\bullet

Monitorización de agentes con capacidad potencial para dañar y fragmentar el ADN, directa o indirectamente, físicos (radiaciones ionizantes, radiaciones ultravioleta), químicos (antisépticos, antibióticos, quimioterápicos y antimicrobianos, en general), biológicos y enzimáticos (enzimas de reparación, enzimas de restricción codificadas por módulos adicionales o fagos).

\bullet

Monitorización de susceptibilidad a fármacos antimicrobianos, tanto conocidos como nuevos.

\bullet

Determinación de la efectividad de agentes con capacidad de dañar y fragmentar el ADN en función de diferentes condiciones experimentales o ambientales.

\bullet

Monitorización del estrés a nivel de ADN en poblaciones naturales de microorganismos o en diferentes condiciones de laboratorio (nutrientes, envejecimiento, variaciones de agentes físico-químicos como temperatura, pH, presión osmótica, luz, etc.).

\bullet

Análisis de la sensibilidad a la inducción de daño del ADN de diferentes líneas salvajes y mutantes, por ejemplo cepas resistentes a antimicrobianos, así como su reparación.

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención se relaciona con un procedimiento para evaluar la integridad del ADN de los microorganismos de forma simple, rápida y precisa, y que pueda ser incorporado en la actividad rutinaria de cualquier laboratorio de investigación microbiológica.

Así pues, un primer objeto de la invención consiste en un procedimiento para evaluar la integridad del ADN de un microorganismo, que comprende las siguientes etapas:

a)

inmovilización del microorganismo sobre un portaobjetos, sin fijación, mediante inclusión del mismo en un medio inerte;

b)

tratamiento con una solución de lisis para extraer paredes celulares, membranas y proteínas, reteniendo el ADN del microorganismo;

c)

estabilización del nucleoide de ADN del microorganismo, sobre el portaobjetos; y

d)

tinción y evaluación de la integridad del ADN.

\vskip1.000000\baselineskip

Inicialmente los microorganismos se incluyen en un medio similar a una suspensión acuosa, preferentemente en un microgel inerte, especialmente en un microgel de agarosa, que se puede elaborar sobre un soporte adecuado, por ejemplo un cubreobjetos de cristal.

La selección de la solución de lisis es critica para alcanzar los objetivos de la presente invención. Es esencial usar detergentes desnaturalizantes de proteínas, aniónicos o catiónicos como por ejemplo dodecilsulfato de sodio (SDS), sulfonato de alquilbenceno, N-laurilsarcosina (sarkosil), sal hidratada del ácido glicocólico, y sus mezclas, usando preferentemente SDS. Son detergentes que provocan una gran disrupción de membranas, con efectos de lisis y a la vez son activos desnaturalizantes de proteínas. Se emplean en electroforesis desnaturalizante en las que se somete a las proteínas a migración asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). Su actividad dentro de los detergentes es alta. El uso de un detergente no fónico no desnaturalizante de proteínas, es decir un detergente que solubiliza las proteínas pero no las desnaturaliza, no suele ser efectivo para lisar eficazmente, en muchos microorganismos. La inclusión del ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) es importante, pues actúa como quelante de los cationes Mg++, que estabilizan la membrana externa de las bacterias, especialmente en la cubierta de las Gram negativas. También es posible incluir proteínas líticas, tanto de pared celular como de proteínas.

Se prefiere que la solución de lisis contenga otros agentes que favorezcan la desestabilización de las paredes celulares y extracción posterior. Se ha comprobado que una solución efectiva es la que contiene ditiotreitol (DTT) entre 0,001 y 2M, 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) 0,001 y 2M, EDTA entre 0,001 y 2M, y SDS entre 0,1 y 3%, a un pH entre 6,5 y 10,5. Particularmente apropiada, es una solución que contiene DTT alrededor de 0,1M, Tris alrededor de 0,O1M, EDTA alrededor del 0,05M y SDS alrededor del 2%, a un pH alrededor de 10.

Tras la lisis, los nucleoides de ADN deben ser estabilizados en el portaobjetos, con el fin de que no se degraden y desprendan al ser expuestos a la luz del microscopio de fluorescencia. El sistema más rápido y efectivo es incubar el portaobjetos, tras haber sido deshidratado, incubando en baños de alcoholes crecientes y secado en un horno microondas. El calor generado adhiere firmemente el nucleoide al portaobjetos. Este es un paso fundamental, específico de la presente invención. Se pueden ensayar diferentes potencias durante diferentes tiempos. Una posibilidad es emplear la potencia máxima durante 2-15 min. Otra posibilidad, menos recomendable porque alarga la duración temporal de la técnica, es incubar el portaobjetos seco en una estufa u horno, a alta temperatura, 40-100ºC, durante una o varias horas.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención tiene una etapa de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos, después de las etapas a), b) y c). Aunque hay varias alternativas para esta evaluación, se prefiere que sea visual. Con este fin preferiblemente el procedimiento incluye una etapa de tinción de la muestra después de las etapas a), b) y c). Dicha tinción, dado el relativamente pequeño tamaño del ADN de los microorganismos, debe de realizarse con un colorante de alta sensibilidad usando un microscopio con un objetivo de gran aumento (normalmente 100X). Por ello son preferibles los sistemas basados en la microscopía de fluorescencia, usando fluorocromos específicos del ADN, y concretamente aquellos que proporcionen la mejor sensibilidad y estabilidad. La relación es amplia y en continuo crecimiento. Como ejemplos se pueden citar el GelRed, EvaGreen, y otros derivados de la cianinas como las familias SYBR, las de PicoGreen, las variantes de los TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO, LO-PRO, etc.

La evaluación de los resultados puede ser llevada a cabo por el observador, asignando cada nucleoide observado a una escala de daño previamente establecida. También y de modo preferible, se puede valorar empleando un sistema de captura de imágenes digitalizadas, acoplado a un software que determine el nivel de daño, de modo cuantitativo.

Un segundo objeto de la presente invención consiste en la fabricación de un Kit para la evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos, que comprende esencialmente:

a)

portaobjetos de cristal pretratados, para soportar y retener el microgel con los microorganismos;

b)

una solución para mezclar e incluir los microorganismos en microgeles;

c)

una solución de lisis para extraer paredes, membranas y proteínas; y

d)

un fluorocromo para teñir el ADN.

\vskip1.000000\baselineskip

El Kit permite llevar a cabo el procedimiento previamente descrito.

Un tercer objeto de la presente invención, se relaciona con el desarrollo de software para la medida automatizada de los niveles de fragmentación del ADN del microorganismo.

Descripción de las figuras

Figura 1. Nucleoides procedentes de cultivo de células de Escherichia coli, obtenidos tras aplicar el procedimiento descrito en la invención. Los nucleoides intactos están compactos, aplastados sobre el portaobjetos, no apreciándose soluciones de continuidad que sugieran fragmentación del ADN. Ocasionalmente se aprecia algún nucleoide con el ADN masivamente fragmentado (arriba), que procede de una célula muerta de modo espontáneo, en el cultivo.

Figura 2. Distintos grados progresivos de daño del ADN de Escherichia coli:

a: Nucleoide intacto (nivel 0).

b: Nucleoide con discretos fragmentos periféricos de tamaño relativamente grande, tras roturas del ADN (nivel 1, daño bajo).

c: Nucleoide más relajado, ocupando mayor superficie, con discretos fragmentos periféricos de tamaño relativamente grande, tras roturas del ADN (nivel 2, daño medio).

d: Nucleoide mucho más relajado y extendido, con mayor número de fragmentos periféricos, tras roturas del ADN (nivel 3, daño alto).

e: Nucleoide con fragmentación masiva del ADN, constituido por multitud de pequeños fragmentos que difundieron en la matriz de agarosa, tras la lisis, delimitando una superficie de difusión más amplia (nivel 4, daño masivo).

Figura 3. Técnica de DBD-FISH para detectar las roturas del ADN, hibridando una sonda de ADN genómico total de Escherichia coli, marcada con Cy3 (A). El nucleoide con difusión de fragmentos presenta un intenso marcaje de los mismos, mientras que el resto de los nucleoides sólo muestran un marcaje basal muy discreto. El ADN fue contrateñido con DAPI (B).

Figura 4. Aplicación del método de la invención a una muestra de Acinetobacter baumannii. Se aprecian dos nucleoides intactos y otros dos con el ADN pulverizado en fragmentos.

Figura 5. Fragmentación masiva del ADN de Escherichia coli tras exposición de las bacterias a peróxido de hidrógeno 10 mM durante 10 min.

Figura 6. Daño del ADN de Escherichia coli, observado tras diferentes tiempos de incubación con ciprofloxacino (1 \mug/ml). a: 0 min. b: 2,5 min. c: 5 min. d: 15 min. e: 40 min. Tras 5 min. ya se precia un nivel inicial de daño, incrementándose progresivamente con los tiempos superiores de incubación.

Figura 7. Nucleoides de Escherichia coli observados tras incubación con ampicilina (300 \mug/ml) durante 20 min. (a) y tras 24 horas (b). Tras 20 min. no se aprecian fragmentos de ADN, mientras que tras 24 horas, el fondo está sembrado de fragmentos de ADN.

Figura 8. Gráficas representado la evolución del promedio del área (en pixels, eje y) del halo de difusión de fragmentos o relajación de bucles del nucleoide de Escherichia coli (A), y de la cápsula (B), en relación con el tiempo tras incubación con 10 microgramos/ml de ciprofloxacino, 40 min (eje x).

Figura 9. Esquema de la rutina a seguir para la medida -paso a paso y con toma de decisiones- de la fragmentación del ADN bacteriano con generación de informe final.

Figura 10. Una muestra de tres procesos de segmentación y delimitación de las ROIs realizado sobre una captura digital en la que se muestra un campo bacteriano que incluye 3 bacterias con ADN normal y 2 con ADN fragmentado (imagen superior izquierda). El resto de imágenes corresponden con filtrados electrónicos de la imagen original que pueden servir como estrategia a seguir para diferenciar con mayor facilidad ambos tipos celulares.

Figura 11. Representación de la densidad integrada media en 9 series experimentales distintas en las que se eligieron bacterias con ADN no fragmentado (1) y bacterias con ADN fragmentado (2). En la parte superior de la figura se muestran las medias por experimento, mientras que en la parte inferior se muestra la media global por cada grupo de acuerdo con el criterio ADN-no fragmentado (1) versus ADN-fragmentado (2).

Descripción detallada de la invención

Como se detallará a continuación, el procedimiento y Kit de la presente invención, son un sistema sencillo y fiable para la determinación de la frecuencia de microorganismos con ADN fragmentado.

\newpage

El procedimiento de la invención, que permite evaluar la integridad del ADN de un microorganismo comprende las etapas de:

a)

inmovilización del microorganismo sobre un portaobjetos, sin fijación, mediante inclusión del mismo en un medio inerte;

b)

tratamiento con una solución de lisis para extraer paredes celulares, membranas y proteínas;

c)

estabilización del ADN del nucleoide sobre el portaobjetos; y

d)

tinción y evaluación de la integridad del ADN.

A continuación se detalla el procedimiento de la invención, junto con algunas variantes y etapas opcionales. El experto en la materia entenderá que hay otros modos de realización y posibilidades siempre que se mantengan los aspectos fundamentales que se describen.

A) El primer paso es la preparación de la muestra. Mediante los procedimientos habituales en éste campo se obtiene y se comprueba la concentración de microorganismos en una muestra líquida. La concentración adecuada para el análisis oscila entre 0,1 y 20 millones de microorganismos por mililitro. Si la muestra estuviese excesivamente concentrada se ajusta a la concentración adecuada diluyéndola con medio de cultivo o con solución salina/fosfato tamponada (PBS) o similar, adecuado según el microorganismo.

Es recomendable hacer el procesado en condiciones de luminosidad baja, para evitar generar daño fotoinducido del ADN, durante las manipulaciones e incubaciones. La muestra se debe colocar sobre un soporte para su procesado según el procedimiento de la invención y para facilitar su evaluación. El soporte preferentemente es un portabjetos de cristal que se recubre con una película de agarosa estándar. Para ello, se prepara una solución de agarosa estándar entre 0,2 y 1% en agua destilada en una jarra de Coplin o similar. Se cubre con una lámina de plástico agujereada y se deposita en un horno microondas. Se regula el horno microondas a una potencia entre 300-1000W, preferentemente a 500W, agitando el envase ocasionalmente para una mejor disolución de la agarosa, dejándola hasta que hierva. Este procedimiento también se puede realizar utilizando un baño termostático. Cuando la solución de agarosa se vuelva totalmente transparente, ya estará preparada para depositarla en recipientes verticales de un contenido entre 10 y 250 ml. Estos recipientes deberán estar previamente atemperados en un baño entre 60-100ºC, preferentemente a 70ºC, para mantener la solución de agarosa en estado líquido.

Los portaobjetos deben estar limpios. Estos se sumergen verticalmente, sujetándolos con unas pinzas por la zona esmerilada, entre 1-60 segundos, retirándolos y volviéndolos a sumergir entre una y diez veces, hasta formar una película homogénea sobre el portaobjetos. Estos, se depositan horizontalmente sobre una superficie lisa y fría entre 1 y 15ºC, preferentemente a 4ºC, por ejemplo, de cristal o de metal. Esta placa, con los portaobjetos, se introduce en la nevera a 4ºC durante un mínimo de 30 min, hasta que se comprueba que la solución de agarosa ha gelificado sobre la superficie del portaobjetos. Se retiran las bandejas de la nevera y se limpia la superficie de los portaobjetos que estaba en contacto con la placa con un papel secante. Seguidamente, los portaobjetos se introducen horizontalmente en una estufa en un rango de temperaturas de 37-100ºC, hasta que la agarosa seque por completo y forme una película fina adherida al cristal. Los portaobjetos así tratados se pueden utilizar inmediatamente o almacenar en una caja bien cerrada a temperatura ambiente durante varios meses.

Para facilitar el procesamiento de la muestra que contiene los microorganismos, ésta se incluye en un medio con características similares a las de una suspensión, como por ejemplo un microgel de agarosa. En este caso se prepara una solución de agarosa de bajo punto de fusión (low melting/low gelling) a una concentración comprendida entre el 0,5 y 2% en agua destilada o tampón fosfato salino (PBS). La fusión de esta agarosa se realiza utilizando un horno microondas o un baño termostatizado, y se mantiene posteriormente entre 30 y 37ºC en un tubo introducido en un baño termostatizado o estufa. En un tubo Eppendorf o similar, se mezcla cuidadosamente la muestra y la solución de agarosa, de manera que esta última quede a una concentración entre 0,3 y 1%. Por ejemplo, 70 microlitros de la solución de agarosa + 30 microlitros de la muestra. Es importante que la temperatura de la agarosa no sea superior a 37ºC, para no dañar a los microorganismos.

Finalmente, para obtener la muestra sobre soporte, se colocan los portaobjetos recubiertos sobre una superficie lisa y fría de cristal o de metal, con una temperatura que oscile entre 1 y 15ºC, evitando formar burbujas de aire. Se recomienda depositar con una micropipeta una gota entre 5-200 microlitros de la mezcla, colocando un cubreobjetos encima de la gota. Como precaución, se recomienda procesar cada muestra por duplicado, y utilizar una muestra control cada vez que se aplique la técnica. La placa con los portaobjetos, se introduce en una nevera a 4ºC, entre 2 a 30 minutos hasta que se produzca una gelificación adecuada de la agarosa. Una vez que ha ocurrido la gelificación, se procede a retirar los cubreobjetos con mucha suavidad, dentro de la misma nevera y evitando que se dañe el microgel.

B) Una vez preparadas adecuadamente las muestras para su fácil y repetido manejo, se procede a su tratamiento de acuerdo al procedimiento de la invención con una etapa de tratamiento de lisis para extraer paredes, membranas y proteínas. Para ello, cada portaobjetos se sumerge, en posición horizontal, en un recipiente que contiene la solución lisante.

Es una realización preferida que esta solución esté compuesta por: ditiotreitol (DTT) entre 0,001 y 2M, preferentemente entre 0,01 y 0,8M; 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) entre 0,001 y 2M, preferentemente entre 0,005-0,4M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) entre 0,001 y 2M, preferentemente entre 0,01-1M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) entre 0,1 y 3%, preferentemente entre 0,5-2,5%. Esta solución se ajusta a pH entre 6,5 y 10,5, preferentemente 10, ajustado con NaOH, por ejemplo.

Existen otras soluciones de lisis alternativas, con otros aditivos extra, o bien se pueden variar las concentraciones y tiempos y temperaturas de incubación de la solución descrita siempre que se mantengan sus características funcionales fundamentales. Así, como alternativas al DTT, existen compuestos como el beta-mercaptoetanol y otros agentes reductores. Como alternativas al Tris, se pueden emplear otras soluciones tampón, tales como Hepes, Mops, Pipes. Como alternativa al EDTA se pueden emplear otros agentes quelantes, como EGTA, etc. Como alternativa al SDS, se pueden emplear otros detergentes catiónicos o amónicos, como se ha mencionado anteriormente.

Según la solución empleada y el tipo de muestra, las preparaciones se incuban en la solución de lisis entre 1 y 120 minutos, preferentemente entre 1 y 35 minutos, especialmente preferido es un tiempo alrededor de 5 minutos; y a una temperatura entre 1 y 45ºC, preferentemente 18ºC-40ºC, especialmente preferida es una temperatura de 37ºC.

Después del tratamiento con solución de lisis, las preparaciones se pueden lavar para eliminar los restos de estas soluciones. Para ello se introducen los portaobjetos horizontalmente, en una solución de lavado lo más suave posible, evitando agentes quelantes o detergentes. Por ejemplo, se sumergen en posición horizontal en un recipiente que contiene abundante agua destilada o una solución tampón o suero fisiológico durante un tiempo entre 1 y 60
minutos.

A continuación se procede a la deshidratación de la muestra. Para ello se puede utilizar soluciones de concentración creciente de alcohol. Por ejemplo, se levantan los portaobjetos y se sumergen en posición horizontal, en recipientes con series de concentración creciente de etanol, entre 5 y 100%, durante 30 segundos a 60 minutos cada una y después las preparaciones se dejan secar al aire. La temperatura de los alcoholes puede oscilar desde -20ºC a temperatura ambiente. Puede ser preferible usar alcoholes a -20ºC para mejorar la precipitación del ADN, durante 5 minutos cada uno. Como alternativas a las incubaciones en series de etanol, las preparaciones se pueden deshidratar incubando en soluciones de diferentes alcoholes como el metanol, o bien dejando secar al aire o en estufa. Es importante que el portaobjetos quede bien seco para que el ADN se adhiera al mismo, ya que suele desprenderse al ser expuesto al haz de luz incidente del microscopio de fluorescencia. Para ello es recomendable dejarlo secar a temperatura alta durante un tiempo largo. Es recomendable, por ejemplo, incubarlo a 80ºC durante al menos 60 min.

Una vez bien secos, los portaobjetos ya procesados conteniendo la muestra, se pueden guardar en cajas archivadoras a temperatura ambiente, en oscuridad, durante meses. Esto facilita la separación del proceso de tratamiento según la invención y la posterior etapa de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos. El archivado permite una evaluación repetida a diferentes intervalos de varias muestras de un mismo microorganismo.

C) Tras el secado, es crucial estabilizar y adherir firmemente el nucleoide de ADN al portaobjetos, ya que suele desprenderse al ser expuesto al haz de luz incidente del microscopio de fluorescencia. Para ello, los portaobjetos secos se incuban en un horno microondas a una potencia entre 300-1000W, preferentemente a 500W, durante 5-10 min. Una alternativa, aunque menos recomendable por su duración, es incubar los portaobjetos en un horno o estufa alta temperatura durante una a varias horas. Una vez bien secos, los portaobjetos ya procesados conteniendo la muestra, se pueden guardar en cajas archivadoras a temperatura ambiente, en oscuridad, durante meses. Esto facilita la separación del proceso de tratamiento según la invención y la posterior etapa de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos. El archivado permite una evaluación repetida a diferentes intervalos de varias muestras de un mismo microorganismo.

D) Una vez tratadas las muestras según el procedimiento descrito, se pasa a la etapa de tinción y evaluación. Hay varios procesos posibles para evaluar la integridad del ADN de los microorganismos como se ha indicado anteriormente.

En una realización preferida, se procede a una tinción de la muestra que facilita la evaluación visual. Eligiendo convenientemente las condiciones de tinción se puede obtener una alta calidad de las imágenes y una alta consistencia de los resultados de evaluación. Dado el tamaño relativamente pequeño del genoma de los microorganismos, la microscopía de fluorescencia es de elección para la visualización del ADN, dada su mayor sensibilidad.

Tinción para observación en microscopio de fluorescencia

Dependiendo de la disponibilidad de filtros de fluorescencia, las muestras se pueden teñir con fluorocromos específicos para ADN del tipo DAPI, Hoechst 33258, Bromuro de Etidio, Ioduro de Propidio, etc., Sin embargo, son de preferencia aquellos fluorocromos de mayor sensibilidad, tales como el GelRed, EvaGreen, y otros derivados de la cianinas como las familias SYBR, las de PicoGreen, las variantes de los TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO, LO-PRO, etc. La cantidad y calidad de fluorocromos se está incrementando actualmente. Para evitar la pérdida de fluorescencia, se puede incluir un medio "antifading" (por ejemplo Vectashield-Vector H-1000, DABCO; etc.). Sin embargo, estos medios suelen producir fluorescencia difusa y un fondo claro que dificulta el contraste de la imagen. Es preferible usar un fluorocromo de alta sensibilidad y relativa fotoestabilidad, montado en una solución acuosa tamponada, y evaluar la muestra con relativa rapidez, antes de su secado. Si fuese necesario, el portaobjetos se puede lavar y volver a teñir.

Finalmente se procede a la evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos.

Las imágenes obtenidas se pueden estudiar mediante análisis visual directo o bien, preferiblemente, aplicando software de análisis de imágenes digitalizadas, obtenidas mediante cámaras analógicas o bien digitales, acopladas a las plataformas de microscopía (Ejemplo 9).

Inicialmente, se recomienda el estudio de un mínimo de 500-1000 microorganismos por muestra, adoptando la siguiente escala de daño del ADN (Figura 2):

1.

Nivel 0: Microorganismos sin ADN fragmentado: el nucleoide de ADN se mantiene relativamente compacto, sin soluciones de continuidad.

2.

Nivel 1: Microorganismos con un grado bajo de daño en el ADN: el nucleoide aparece compacto, pero con discretos fragmentos periféricos de tamaño relativamente grande, tras roturas del ADN.

3.

Nivel 2: Microorganismos con un grado medio de daño en el ADN: el nucleoide más relajado, ocupando mayor superficie, con discretos fragmentos periféricos de tamaño relativamente grande, tras roturas del ADN.

4.

Nivel 3: Microorganismos con un grado alto de daño en el ADN: el nucleoide aparece mucho más relajado y extendido, con mayor número de fragmentos periféricos, tras roturas del ADN.

5.

Nivel 4: Microorganismos con ADN masivamente fragmentado: muestran un halo amplio y difuso de fragmentos más o menos puntiformes de ADN, que han difundido siguiendo un gradiente, en la matriz de agarosa.

\vskip1.000000\baselineskip

El criterio para establecer la correlación entre el tamaño de los halos por difusión de fragmentos y la fragmentación de ADN deriva de los resultados obtenidos utilizando la técnica de DBD-FISH (Fernández JL, Goyanes VJ, Ramiro-Díaz J, Gosálvez J Application of FISH for in situ detection and quantification of DNA breakage. Cytogenet Cell Genet 1998; 82:251-256; Fernández JL, Vázquez-Gundín F, Delgado A, Goyanes VJ, Ramiro-Díaz J, de la Torre J, Gosálvez J. DNA breakage detection-FISH (DBD-FISH) in human spermatozoa: technical variants evidence different structural features. Mutat Res 2000; 453:77-82; Fernández JL, Gosálvez J. Application of FISH to detect DNA damage: DNA Breakage Detection-FISH (DBD-FISH). Methods Mol Biol 2002; 203:203-216; Fernández JL, Goyanes V, Gosálvez J. DNA Breakage Detection-FISH (DBD-FISH). In: Rautenstrauss B, Liehr T, eds. FISH technology-Springer lab manual. Heidelberg: Springer-Verlag; 2002; 282-290).

Este procedimiento permite la detección y cuantificación de las roturas del ADN en núcleos de células desproteinizados y sometidos a una desnaturalización controlada del ADN. Esta desnaturalización genera tramos de ADN de cadena sencilla a partir de los extremos de rotura, los cuales son detectados mediante hibridación in situ utilizando una sonda de ADN genómico total marcada con un fluorocromo, visible mediante microscopía de fluorescencia. Cuanto mayor es el nivel de roturas en el ADN celular, mayor es la cantidad de ADN de cadena sencilla generada por la solución desnaturalizante, mayor es la cantidad de sonda hibridada y mayor la fluorescencia observada. Las muestras procesadas según la metodología descrita en la presente invención, fueron expuestas, tras la lisis, a una solución desnaturalizante alcalina 2,5 min a 22ºC. Esta solución, genera tramos de ADN de cadena sencilla a partir de los extremos de rotura que existen en el ADN. Por lo tanto, la intensidad de la hibridación utilizando una sonda de ADN genómico total, estará en relación con la cantidad de roturas presentes en el ADN bacteriano. De este modo se ha confirmado que los nucleoides relajados y con fragmentos, muestran un marcaje intenso con DBD-FISH, lo cual demuestra la intensa fragmentación de su ADN (Ejemplo 1 y Figura 3). El resto de nucleoides muestran unos niveles muy bajos de marcado con esta sonda, que se corresponden con el fondo de hibridación generado por el propio tratamiento del
nucleoide.

El protocolo descrito, es eficaz en la gran mayoría de bacterias Gram negativas. En dichas bacterias, la solución de lisis es suficiente para lisar la pared celular y observar el cromosoma bacteriano entero y la difusión de los fragmentos de ADN, en caso de fragmentación del mismo. Para analizar bacterias con pared resistente, como las Gram positivas, es necesario incubarlas en suspensión con enzimas líticos de pared, previamente a la inclusión en el microgel. Por ejemplo, los estafilococos deben resuspenderse con lisostafina (20 microgramos/ml) en tampón Tris-EDTA (TE). Los enterococos deben incubarse con una mezcla de lisozima (2 mg/ml) y mutanolisina (50 microgramos/ml) en tampón Tris-EDTA (TE). Las células de levadura se incuban en un tampón conteniendo sorbitol 1 M, EDTA 0,1 M, betamercaptoetanol 15 mM, pH 7.5, y Zimolasa (200 U/ml), Liticasa o Glucalasa (Ligozzi M Fontana R. Isolation of total DNA from bacteria and yeast. Aft J Biotech 2003; 2: 251-253).

Las incubaciones deben realizarse durante al menos 5-30 min. a 37ºC, y luego mezclar la solución de microorganismos con la agarosa de bajo punto de fusión, para incluir en microgel. Hay otras enzimas que por el momento no son tan comunes, pero que pueden ser efectivas para lisar bacterias Gram positivas, como la acromopeptidasa y, especialmente, la labiasa (Niwa T, Kawamura Y, Katagiri Y, Ezaki T. Lytic enzyme, labiase for a broad range of Gram-positive bacteria and its application to analyze functional DNA/RNA. J. Microbiol Methods 2005;
61:251-260).

Otra posibilidad es incubar con lisozima (5 mg/ml) y 24% polietilen glicol 20.000, 2 horas a 37ºC (Maassen CBM. A rapid and safe plasmid isolation method for efficient engineering of recombinant lactobacilli expressing immunogenic or tolerogenic epitopes for oral administration. Immunol Method 1999; 223: 131-136.). La lisis en gel, podría ser alcalina. El empleo de solventes orgánicos (acetona, butanol, tolueno, etc.) puede también ayudar a deshacer la pared bacteriana (Harrison STL. Bacterial cell disruption: a key unit operation in the recovery of intracellular products. Biotech Adv 1991; 9:217-240.). El empleo de sistemas mecánicos de rotura de la pared celular, mediante sonicación o agitación con partículas disruptoras, no son aconsejables, pues pueden dañar el ADN del
microorganismo.

La presente invención también contempla un Kit para la valoración de la fragmentación del ADN en microorganismos. Este Kit contiene una solución de lisis y un fluorocromo. El Kit contiene también el soporte pretratado, por ejemplo con agarosa, así como una solución para la preparación de un medio con características similares a las de una suspensión que contendrá la muestra. Por ejemplo, una solución de agarosa de bajo punto de fusión que permite la preparación de un microgel.

A continuación se detalla el contenido y modo de empleo de un Kit según una realización de la invención.

Descripción del contenido del kit

Portaobjetos pretratados*

Tubos Eppendorf conteniendo 140 microlitros de agarosa de bajo punto de fusión al 1% en agua destilada o PBS, gelificada

Tubos con solución de lisis*. Composición: Tris 0,O1M, EDTA 0,05M, DTT 0,1M, SDS 2%, pH 10 (ajustado con NaOH).

Fluorocromo

Recipiente con tapa, para incubación horizontal con la solución de lisis

Lanceta

Flotadores para tubos Eppendorf

* Preparación tal y como se menciona en la descripción

\vskip1.000000\baselineskip

Material y equipo requerido

Microscopio de fluorescencia (recomendable objetivo de inmersión)

Nevera a 4ºC

Estufa a 37ºC

Estufa o placa a 80ºC (opcional)

Baño de incubación a 37ºC

Guantes de plástico

Cubreobjetos de cristal (18x18 mm, 22x22 mm o 24x60 mm)

Micropipetas

4 cajas para incubaciones en horizontal

Agua destilada

Etanol 70%, 90%, 100%

\vskip1.000000\baselineskip

Instrucciones de uso

Preparación de una muestra por portaobjetos:

1) Poner solución de lisis en recipiente de incubación horizontal, en estufa a 37ºC, tapado.

2) Diluir la muestra de microorganismos en medio de cultivo o PBS, a una concentración de 5-10 millones por mililitro.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación del microgel de agarosa

3) Introducir el tubo Eppendorf con agarosa gelificada, en el flotador, dejándolo al nivel de la tapa, y dejar flotando 5 minutos en agua a 90-100ºC, hasta que la agarosa se funda. La fusión de la agarosa se puede realizar alternativamente en un horno microondas.

4) Transferir el tubo Eppendorf con el flotador, a un baño termostático a 37ºC, y dejar 5 minutos hasta equilibrar la temperatura.

7) Añadir 60 microlitros de la muestra de microorganismos al contenido del tubo Eppendorf y resuspender, con la micropipeta.

8) Colocar un portaobjetos pretratado en una superficie fría, a 4ºC (por ejemplo, una lámina metálica o de vidrio).

9) Una vez enfriado el portaobjetos, depositar la suspensión de microorganismos con agarosa y poner un cubreobjetos de cristal, evitando formar burbujas de aire. Se recomienda depositar una gota de 12, 20 ó 50 microlitros, para un cubreobjetos de 18x18 mm, 22x22 mm, ó 24x60 mm, respectivamente.

10) Introducir la lámina fría con el portaobjetos, en la nevera y dejar gelificar la muestra durante 5 minutos.

\vskip1.000000\baselineskip

Procesado de las muestras

11) Usando guantes, retirar el cubreobjetos, deslizándolo con suavidad, e inmediatamente introducir el portaobjetos, en horizontal, en el recipiente con la solución de lisis, tapando y dejando incubar durante 5 minutos, en la estufa o baño a 37ºC.

12) Levantar el portaobjetos con ayuda de la lanceta, usando guantes. Sujetarlo en horizontal, y depositarlo en horizontal, en una caja conteniendo abundante agua destilada o solución tampón, para lavar la solución de lisis. Dejar incubando durante 5 minutos.

13) Introducir el portaobjetos, en horizontal, en una caja con etanol 70% (5 minutos), luego en otra caja con etanol 90% (5 minutos), y finalmente en etanol 100% (5 minutos), a -20ºC.

14) Dejar secar al aire, e incubar en horno microondas a 500-1000W durante 3-10 minutos, o en su defecto, en estufa a 80ºC durante una hora como mínimo, o toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos procesados se pueden guardar en cajas archivadoras, a temperatura ambiente, en oscuridad, durante meses.

\vskip1.000000\baselineskip

Tinción de las muestras para observación en microscopio de fluorescencia

Dependiendo de la disponibilidad de filtros de fluorescencia, las muestras se pueden teñir con fluorocromos específicos para ADN del tipo EvaGreen o (verde) o GelRed (rojo). Los fluorocromos de la familia SYBR, concretamente el SYBR Gold, permiten una buena resolución, con cierta fotoestabilidad.

\vskip1.000000\baselineskip

Almacenamiento y estabilidad

Almacenar a temperatura ambiente.

Caducidad: los reactivos y materiales son estables por un periodo mínimo de 6 meses. Se recomienda que la solución de lisis se mantenga en posición vertical y bien cerrada.

Los ejemplos que a continuación se exponen, se describen como soporte de aspectos particulares de la invención, y en ningún caso para limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1 Confirmación de la presencia de roturas del ADN en los nucleoides que presentan difusión de fragmentos

En una muestra de Escherichia coli, cepa TG1, en fase de crecimiento exponencial en medio LB, a 37ºC, se aplicó la metodología descrita para producir los halos de difusión de segmentos de ADN, en aquellas con ADN fragmentado de modo espontáneo. Para ello, la muestra diluida a una concentración de 10-20 millones por mililitro, en PBS o medio LB, se mezcló con agarosa líquida de bajo punto de fusión al 1%, para obtener una concentración final de esta última, del 0,7%. Tras gelificar el microgel sobre el portaobjetos, la muestra se incubó en la solución de lisis constituida por Tris 0,01M, EDTA 0,05M, DTT 0,1M, SDS 2%, pH 10 (ajustado con NaOH), durante 5 minutos, a 37ºC. Los portaobjetos se lavaron en suero fisiológico durante 5 minutos. Posteriormente, de forma secuencial y sobre las mismas células, se procedió a efectuar el DBD-FISH (DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization; Fernández et al., 1998; 2000; 2002; Fernández y Gosálvez, 2002) utilizando una sonda de ADN genómico total de Escherichia coli. Este procedimiento permite la detección y cuantificación de las roturas del ADN en núcleos de células inmersas en microgeles de agarosa, desproteinizados y sometidos a una desnaturalización controlada del ADN. Esta desnaturalización genera tramos de ADN de cadena sencilla a partir de los extremos de rotura, los cuales son detectados mediante hibridación in situ utilizando una sonda de ADN genómico total de Escherichia coli, marcada con un fluorocromo que emite fluorescencia roja (Cy3). Cuanto mayor es el nivel de roturas en el ADN, mayor es la cantidad de ADN de cadena sencilla generada por la solución desnaturalizante, mayor es la cantidad de sonda hibridada y mayor la fluorescencia roja obtenida. Las muestras procesadas, según el procedimiento de la presente invención, contienen ADN de cadena sencilla, generado por la solución desnaturalizante, a partir de los posibles extremos de rotura que existen en el ADN. Por lo tanto, la intensidad de la hibridación utilizando una sonda de ADN genómico total, estará en relación con la cantidad de roturas presentes en el nucleoide de Escherichia coli.

Se contabilizaron 250 células obtenidas al azar. Las imágenes de tinción mediante DAPI, de los halos de dispersión de la cromatina, se capturaron utilizando una cámara CCD refrigerada empleando dos filtros para la visualización simultánea de los halos de dispersión, visibles en azul, y de la señal de hibridación, visible en rojo. El propósito era confirmar que los nucleoides con difusión de fragmentos de ADN poseen roturas del mismo. Los resultados demostraron que aquellos nucleoides con difusión de fragmentos de ADN tenían una alta intensidad de marcado de las roturas del ADN mediante DBD-FISH (Figura 3).

En consecuencia, la simple determinación de la difusión de los fragmentos de ADN, obtenidos mediante el presente procedimiento, ofrecen una estimación simple y directa de la fragmentación del ADN.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Evaluación de la fragmentación espontánea del ADN en diferentes especies bacterianas

Se tomaron 9 especies bacterianas creciendo en placa y se procedió a la determinación de la frecuencia de bacterias con fragmentación del ADN en dichas muestras. Se procesaron las siguientes especies bacterianas: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Salmonella spp., Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae.

Cada muestra se incluyó en un microgel de agarosa, realizándose tres microgeles de 18x18 mm en cada portaobjetos, cada uno correspondiendo a una especie distinta. Uno de los microgeles de cada portaobjetos correspondía al mismo cultivo de Escherichia coli, como control de procesamiento y resultados. Los portaobjetos se incubaron en la solución de lisis, se lavaron, se deshidrataron, se dejaron secar a 80ºC durante 3 horas, se tiñeron con SYBR Gold y se examinaron con el microscopio de fluorescencia. Se contabilizaron 1.000 células por especie bacteriana. Los resultados se muestran en la Tabla 1. La lisis fue efectiva para obtener nucleoides en todas las especies analizadas (Figura 4). Asimismo, se observaron células con nucleoides cuyo ADN estaba masivamente fragmentado (nivel 4), difundiendo en la matriz de agarosa, en todas las especies. Esta fragmentación era de modo espontáneo, basal, en el cultivo, no inducida por ningún agente, siendo su frecuencia variable de un cultivo a otro.

TABLA 1 Distribución de los porcentajes de células con ADN fragmentado en 6 especies bacterianas

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Evaluación de la fragmentación del ADN tras la incubación con diferentes agentes antimicrobianos. Daño por agentes exógenos

Como ejemplo ilustrativo, se presenta un estudio tratando de determinar el posible daño del ADN inducido por tres antibióticos: ampicilina, gentamicina y ciprofloxacino, y un agente generador de radicales hidroxilo, el peróxido de hidrógeno (H2O2), aplicados sobre cultivos de la cepa TG1 de Escherichia coli, sensible a todos ellos, creciendo en fase exponencial, en medio LB. Los agentes empleados tienen diferentes mecanismos de acción antimicrobiana. La ampicilina es un antibiótico beta-lactámico que afecta a la síntesis del peptidoglicano de la pared celular tras unirse a PBPs (penicillin binding proteins) y activar autolisinas. La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido que afecta a la síntesis proteica, a nivel de la subunidad 30S, uniéndose a la proteína p10, de los ribosomas bacterianos. El ciprofloxacino es un antibiótico de la familia de las quinolonas, que induce roturas de cadena doble del ADN como consecuencia de la inhibición de la ADN girasa y de la topoisomerasa IV. Los agentes se mezclaron en el medio de cultivo líquido LB, a las concentraciones y tiempos de incubación especificados en la Tabla 2. Tras dichos tiempos de incubación, las bacterias fueron procesadas según el procedimiento de la presente invención, para determinar el porcentaje de bacterias con el ADN fragmentado.

Simultáneamente, otra alícuota de las mismas se incubó con una tinción vital. Este es un test de exclusión de colorante, usando un fluorocromo verde (SYBR Green II) que se une al ADN, y que penetra en todas las células, mezclado con un fluorocromo rojo, el ioduro de propidio (IP), que sólo penetra en aquellas células con funcionalismo deficiente de la membrana, presuntamente "muertas". De este modo, las células "vivas" se tiñen de verde, al excluir el colorante rojo, mientras que las "muertas" no pueden expulsar el colorante rojo, y se tiñen con el IP. Los resultados se presentan en la Tabla 2. Tras estudiar 5.000 bacterias en cada punto experimental, se observó que la gentamicina, el ciprofloxacino y el peróxido de hidrógeno, inducían solamente un incremento muy discreto de células con membrana permeable al IP, mientras que dicho incremento era espectacular con la ampicilina. Pero la ampicilina apenas aumentaba el porcentaje de células con ADN fragmentado, al igual que la gentamicina. Sin embargo, el ciprofloxacino y el H2O2, a dosis altas, inducían la fragmentación masiva del ADN de todas las células examinadas (nivel 4, Figura 5). Este resultado demuestra que la valoración de la permeabilidad de la membrana no es un parámetro universal como indicador de vitalidad, y que el estudio del ADN puede aportar información valiosa complementaria, no proporcionada por dicha tinción, y viceversa.

TABLA 2 Porcentajes de bacterias Escherichia coli teñidas por la tinción vital y porcentaje de bacterias con ADN fragmentado, tras la acción de diferentes agentes antimicrobianos

2

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Evaluación de la sensibilidad o resistencia de un microorganismo a un determinado agente

Se muestra un estudio del efecto del ciprofloxacino a nivel del ADN, en una cepa sensible (TG1) y en otra resistente a este antibiótico, de Escherichia coli, creciendo en fase exponencial.

La concentración media inhibitoria del crecimiento (CMI), fue de 0,012 microgramos/ml. Por el contrario, la cepa resistente no era afectada en su crecimiento por la concentración máxima empleada en el test comercial (CMI>32 microgramos/ml). Se estudiaron 6 concentraciones de ciprofloxacino, aplicadas a cultivos en medio LB durante 40 min, y se procedió al estudio de la tinción vital, de modo similar al descrito en el ejemplo anterior (Tabla 3), y el nivel de daño del ADN, según el protocolo de la invención. En la cepa sensible se evidenció un muy discreto incremento de células permeables al IP, y con cápsula vacía, a medida que se aumentaba la dosis del antibiótico, a nivel de las dosis más altas empleadas. La tinción vital no detectó ningún efecto en la cepa resistente.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Porcentajes de bacterias Escherichia coli teñidas por la tinción vital, tras la exposición a dosis crecientes de ciprofloxacino, en una cepa sensible y otra resistente al antibiótico

3

El daño a nivel del ADN fue observado en la cepa sensible, y a la concentración más baja empleada en el experimento (0,5 \mug/ml). Además, con esta concentración, el nivel de daño correspondía al tipo 4, es decir, el máximo en la escala establecida previamente (Figura 2). Todos estos microorganismos mostraban el ADN masivamente fraccionado, con un halo amplio y difuso de fragmentos puntiformes de ADN, que han difundido en la matriz de agarosa, siguiendo un gradiente a partir del área central del nucleoide. Las dosis mayores de 0,5 \mug/ml no parecían modificar las imágenes de fragmentación, observándose quizás una ligera mayor difusión, especialmente en el área central del nucleoide. Esto podría indicar un efecto próximo a la saturación del daño del ADN por el ciprofloxacino.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Determinación del posible efecto de dosis bajas de ciprofloxacino, próximas a la CMI, sobre la integridad del ADN

Una vez determinado que ciprofloxacino a concentraciones elevadas induce fragmentación masiva del ADN, es interesante determinar si la técnica puede discriminar algún efecto a nivel de la integridad del ADN, tras exposición de la cepa sensible de Escherichia coli (TG1) a concentraciones bajas del antibiótico, por encima, por debajo y al nivel de la CMI (0,012 microgramos/ml). Las dosis empleadas se muestran en la Tabla 4, siendo el tiempo de incubación de 40 minutos, en fase de crecimiento exponencial, en medio LB. La Tabla 4 muestra los resultados de la tinción vital. Aunque hay una tendencia a incrementar el porcentaje de células permeables al IP, y con cápsula vacía, a medida que se incrementa la dosis, éste no es significativo con las dosis bajas empleadas

TABLA 4 Porcentajes de bacterias Escherichia coli teñidas por la tinción vital, tras la exposición a dosis bajas, crecientes, de ciprofloxacino, en una cepa sensible

4

El nivel de daño del ADN se determinó mediante el procedimiento objeto de la presente invención. La dosis más alta (0,1 microgramos/ml), por encima de la CMI, evidenció daño en todas las células analizadas. Este tendía a ser homogéneo entre las distintas células, siendo de menor magnitud que la pulverización masiva descrita en el ejemplo anterior, con dosis de 0,5 microgramos/ml y superiores. Sin embargo, el grado de daño era importante, similar al nivel 3 (Figura 2). Este nivel se califica como un grado alto de daño en el ADN. El nucleoide aparece muy relajado y extendido, con un alto número de fragmentos periféricos, tras roturas del ADN.

La dosis similar a la CMI también originó daño claro y homogéneo entre los distintos nucleoides, pero de magnitud similar al nivel 2 de la escala (Figura 2).

Corresponde a un grado medio de daño en el ADN. El nucleoide aparece relajado, ocupando mayor superficie que en el control sin tratamiento, con discretos fragmentos periféricos de tamaño relativamente grande, tras roturas del ADN.

La dosis de 0,006 microgramos/ml, la mitad de la CMI, también indujo daño claro y homogéneo entre los distintos nucleoides, siendo su magnitud intermedia entre el nivel 1 y 2, en la escala arbitraria de daño (Figura 2).

Finalmente, la dosis de 0,003 microgramos/ml, un tercio de la CMI, también indujo un daño evidente, homogéneo, pero de nivel 1. Este corresponde a un grado bajo de daño en el ADN, donde el nucleoide aparece compacto, pero con discretos fragmentos periféricos de tamaño relativamente grande, tras roturas del ADN (Figura 2).

En conclusión, el procedimiento objeto de la presente invención tiene una gran resolución, de tal modo que puede detectar incluso daño inducido por concentraciones muy bajas de ciprofloxacino, por debajo de la CMI, que no llegan a inhibir notoriamente el crecimiento bacteriano, ni a afectar a la "viabilidad" determinada por la tinción vital. Es posible que los niveles bajos de daño sean reparables por la maquinaria enzimática de reparación del ADN, permitiendo la viabilidad celular.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Determinación del tiempo mínimo de incubación con ciprofloxacino, que permite detectar daño en el ADN de la cepa sensible de Escherichia coli

La cepa TG1 de Escherichia coli, en crecimiento exponencial en medio LB, se incubó durante tiempos decrecientes: 40 min., 15 min., 5 min., 2,5 min. y 0 min., con una dosis de 1 microgramo/ml de ciprofloxacino. También se incluyó un control sin ciprofloxacino. El tiempo medio necesario para la inclusión en microgel y enfriamiento en nevera se estimó en 1,5 min. Durante este tiempo es presumible que el antibiótico esté funcionando, por lo que el tiempo de 1.5 min. debería ser sumado a cada uno de los tiempos ensayados.

Tras 40 min., todas las bacterias mostraron el ADN masivamente pulverizado (nivel 4; Figura 6). También se demostró efecto con un tiempo de 15 min. En este caso, el daño también tendía a ser homogéneo entre los diferentes nucleoides, pero siendo de mucha menos magnitud, de grado medio (nivel 2) (Figura 6). El tiempo mínimo en que se detectó un daño evidente del ADN fue el de 5 min., siendo de bajo grado (nivel 1), aunque con 2,5 min. parecía visualizarse un ligero incremento en la relajación del nucleoide con respecto al de 0 min. y al control, pero de difícil valoración.

En consecuencia, la técnica objeto de la invención permite reconocer que el daño del ADN originado por una dosis letal de ciprofloxacino, es acumulativo con el tiempo, y no instantáneo o generado en un relativamente corto espacio temporal. El tiempo mínimo de incubación, para detectar un mínimo efecto a nivel del ADN, empleando una dosis de 1 microgramo/ml, fue de 5 min.+1,5 min. = 6,5 min.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Visualización de daño del ADN, tras cultivo con antibióticos que no actúan a nivel del ADN, incubando 24 horas

Se trata de observar si, a pesar de no ver daño inicialmente a nivel del ADN, la muerte celular se traduce en fragmentación tardía del mismo. Para ello, la cepa TG1 de Escherichia coli, creciendo en fase exponencial, en medio líquido LB, se incubó 24 horas con ampicilina (300 microgramos/ml). Este antibiótico beta-lactámico afecta a la síntesis del peptidoglicano de la pared celular tras unirse a PBPs (peniciline binding proteins) y activar autolisinas. Para la comparación, una alícuota del cultivo se procesó tras 40 min. de tratamiento, tanto para la tinción vital como para la determinación del daño del ADN mediante la técnica de la invención. La Tabla 5 muestra los datos de la tinción vital. Tras 20 min. de incubación con el antibiótico beta-lactámico, aumentó claramente el porcentaje de células con pared alterada, permeable, o con aspecto de cápsula vacía. Tras un día de incubación, el incremento fue espectacular, especialmente las de aspecto de cápsula vacía, apareciendo muertas la casi totalidad, desde el punto de vista de la tinción vital.

TABLA 5 Porcentajes de bacterias Escherichia coli teñidas mediante la tinción vital, tras incubación con ampicilina

5

La determinación del daño del ADN según la técnica de la invención, demostró que tras 20 min. de incubación no se apreciaban diferencias con respecto al control. Sin embargo, tras 24 horas, la densidad de nucleoides era escasa, y mostraban un aspecto relajado, sin un área central muy definida. Lo más llamativo era la presencia masiva de fragmentos puntiformes de ADN degradado, homogéneamente esparcidos por el fondo de la preparación (Figura 7). El procedimiento objeto de la presente invención demuestra que la muerte celular, aunque no sea inicialmente debida a daño directo del ADN, puede desembocar indirectamente, con el tiempo, en daño masivo del mismo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Visualización de la evolución daño del ADN generado por ciprofloxacino en una cepa sensible de Escherichia coli. Aplicación de sistemas de análisis de imagen digital para la evaluación del daño

La cepa TG1 de Escherichia coli, en crecimiento exponencial en 400 microlitros de medio LB, se incubó con 10 microgramos/ml de ciprofloxacino, durante 40 min. Posteriormente las bacterias se centrifugaron y se resuspendieron en 400 microlitros de medio sin ciprofloxacino. Esta operación se repitió otra vez, para lavar el antibiótico. Las bacterias se incubaron durante 0, 15, 30, 60 y 90 min., tras lo cual fueron procesadas según el procedimiento de la invención. En cada tiempo se procesó simultáneamente, en el mismo portaobjetos, un control sin tratamiento antibiótico.

Tras la tinción con SYBR Gold, las imágenes fueron capturadas con una cámara CCD KX32ME refrigerada, de alta sensibilidad (Apogee Instruments, Roseville, CA). Posteriormente se realizó el análisis de las imágenes mediante una macro diseñada con el programa Visilog 5.1 (Noesis, Francia). Esto permitía la segmentación y corrección del fondo y diferencias de luminosidad en el campo. Los resultados de la superficie total de la tinción bacteriana, del área de la cápsula residual, y del halo de fragmentos o bucles dispersos del ADN (área total-área de la cápsula), en pixels, se transcribieron a un tabla Excel. Finalmente se realizó un estudio estadístico de dichos datos mediante el programa SPSS 12.5, empleando los test no paramétricos de la U de Mann-Whitney y H de Kruskal-Wallis (p<0,05).

Los resultados demostraron que las roturas de doble cadena del ADN originadas por el ciprofloxacino, son reparables si el antibiótico es eliminado del medio. Inmediatamente tras el tratamiento, el aspecto es de fragmentación alta (nivel 3-4). Tras 15 min es cuando se empieza a detectar de modo estadísticamente significativo un decremento en la superficie del halo de difusión de fragmentos, siendo estos de mayor tamaño. Este halo sigue decreciendo más lentamente durante los 30 y 60 min., presentado cada vez menos fragmentos, pasando a decrecer de modo significativo, más ampliamente, a los 90 min. (Figura 8A). En este caso ya no se aprecian fragmentos, sino halos de bucles de relajación del ADN, sin diferencias con respecto a los controles sin tratamiento (nivel 0). De este modo se ha obtenido una cinética de reparación de las roturas del ADN, siendo este totalmente reparado, en apariencia, tras 90 min. de incubación. Sin embargo, esto no supone que la reparación haya sido siempre correcta. Curiosamente, el tamaño de las cápsulas bacterianas se incrementa alrededor del doble, en promedio, tras los tiempos finales de 60 y 90 min., con respecto al resto de tiempos ensayados (Figura 8B). Este incremento es irregular, heterogéneo, entre las diferentes bacterias.

El procedimiento objeto de la presente invención demuestra un hecho de gran trascendencia clínica, esto es, la importancia del mantenimiento de las dosis correctas del antibiótico durante tiempos prolongados. Si se retira el mismo prematuramente, el daño originado inicialmente en la bacteria, puede ser revertido.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Desarrollo de software para la medida automatizada de los niveles de fragmentación del ADN

Utilizando la metodología contemplada en el ejemplo 6 de la presente invención, se ha diseñado una metodología básica que fija las bases para la caracterización morfológica de las imágenes que generan bacterias que presentan ADN fragmentado y ADN no fragmentado, utilizando sistemas convencionales de análisis de imagen. El proceso permite discriminar entre ambos tipos de bacterias de forma automática y por lo tanto objetiva.

El proceso global comprende el diseño de dos estrategias:

1) modelo de captura interactiva de imágenes y toma de decisiones en base al número de elementos analizados (Figura 9).

2) Rutina de segmentación para la selección de las ROIs (Regions Of Interest) (Figura 10).

En este ejemplo práctico, se utilizó captura directa bajo microscopio de fluorescencia (x100) utilizando una cámara CCD refrigerada monocroma de 12 bits de profundidad de color. Las imágenes se guardaron como .tiff y se procesaron utilizando el programa Scion Image (NIH IMAGE USA) de dominio público. Este programa contiene las herramientas mínimas necesarias para realizar operaciones de segmentación y es capaz de medir densidades integradas de fluorescencia en las imágenes que se procesan. La densidad integrada relaciona la suma de los distintos niveles de grises en la AOI con el área realizando una sustracción del fondo. Utilizando esta herramienta, se procesaron 9 series de experimentos en los que se capturaron 100 bacterias que contenían ADN no fragmentado y 100 con ADN fragmentado. Los resultados muestran que se generan valores muy similares entre cada una de las series cuando el criterio de agrupación y comparación es: bacterias que presentan ADN fragmentado versus bacterias que no presentan el ADN fragmentado.

Por lo tanto, es posible discriminar ambos tipos de estados que presenta el ADN bacteriano en base a apreciaciones objetivas realizadas en base a entornos de análisis de imagen.

Si bien en este caso se han medido tan solo áreas de fluorescencia e intensidades de las áreas seleccionadas, existen otros criterios, en relación con las texturas que genera cada tipo de imagen, por los que se podría caracterizar y discriminar ambas poblaciones.

Claims (20)

1. \global\parskip0.990000\baselineskip

   1. Un procedimiento para evaluar la integridad del ADN de los microorganismos que comprende las etapas de:

   a)

   inmovilización del microorganismo sobre un portaobjetos, sin fijación, mediante inclusión del mismo en un medio inerte;

   b)

   tratamiento con una solución de lisis para extraer paredes celulares, membranas y proteínas;

   c)

   estabilización del nucleoide de ADN del microorganismo, sobre el portaobjetos; y

   d)

   tinción y evaluación de la integridad del ADN.

2. 2. Un procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1, en el que la etapa a) es opcional.
3. 3. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la solución de lisis comprende un detergente fónico desnaturalizante de proteínas.
4. 4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo del dodecilsulfato de sodio (SDS), sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina (sarkosil), sal hidratada del ácido glicocólico, y sus mezclas.
5. 5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el detergente iónico es preferentemente el dodecilsulfato de sodio (SDS).
6. 6. Un procedimiento cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la solución de lisis comprende ditiotreitol (DTT) entre 0.001 y 2M; 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) entre 0.001 y 2M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) entre 0.001 y 2M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) entre 0.1 y 3%.
7. 7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que la solución de lisis se ajusta a pH entre 6,5 y 10,5.
8. 8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en el que la solución de lisis comprende preferentemente ditiotreitol (DTT) 0.1 M; (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) 0.01M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) 0.05M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) 2%.
9. 9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que la solución de lisis se ajusta a pH alrededor de 10, con NaOH.
10. 10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la tinción de la etapa d) se realiza con una solución de fluorocromo.
11. 11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra que contiene los microorganismos, se incluye en un microgel inerte.
12. 12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la muestra que contiene los microorganismos, se incluye preferentemente en un microgel de agarosa.
13. 13. Procedimiento de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos según la reivindicación 1, en el que la estabilización y adherencia del ADN del microorganismo se realiza de modo rápido, mediante calor seco, incubando el portaobjetos con la muestra lisada, en un horno microondas.
14. 14. Procedimiento de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos según la reivindicación 1, en el que la evaluación se realiza mediante análisis visual directo.
15. 15. Procedimiento de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos según la reivindicación 1, en el que la evaluación se realiza de forma automatizada mediante la aplicación de software de análisis de imágenes digitalizadas, obtenidas mediante cámaras acopladas a plataformas de microscopia.
16. 16. Un Kit para la evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos que comprende:

    a)

    portaobjetos pretratados;

    b)

    solución de agarosa;

    c)

    solución de lisis; y

    d)

    fluorocromo.

    \global\parskip1.000000\baselineskip

17. 17. Un Kit de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la solución de lisis comprende ditiotreitol (DTT) entre 0.001 y 2M; 2-amino-2(hidro)imetil)-1,3-propanediol (Tris) entre 0.001 y 2M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) entre 0.001 y 2M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) entre 0.1 y 3%.
18. 18. Un Kit de acuerdo con cualquiera de las la reivindicaciones 16 y 17, en el que la solución de lisis se ajusta a pH entre 6,5 y 10,5.
19. 19. Un Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la solución de lisis comprende preferente ditiotreitol (DTT) 0.1M; (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) 0.01M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) 0.05M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) 2%.
20. 20. Un Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que la solución de lisis se ajusta a pH alrededor de 10, con NaOH.