ES2908261T3 - Procedimiento para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, que desde un punto vista práctico, permite determinar de forma rápida si una bacteria es sensible o resistente a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana. Asimismo, la presente invención también se relaciona con una solución de lisis de aplicación en el método anterior, que afecta de forma específica a las bacterias que presentan la pared celular dañada por la acción de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, permitiendo distinguir las bacterias sensibles de las resistentes a dicho antibiótico.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana

Campo técnico de la invención

La presente invención se engloba dentro del campo de la industria biotecnológica, y principalmente la relacionada con la microbiología, cuyo ámbito de aplicación es el sector sanitario (salud humana, salud animal, salud ambiental y salud básica). La presente invención se refiere a un procedimiento para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana que, desde un punto de vista práctico, permite determinar rápidamente si una bacteria es sensible o resistente a un antibiótico que actúa sobre la pared celular.

Antecedentes de la invención

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los agentes antimicrobianos es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. El estudio se lleva a cabo por medio de pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo objetivo principal es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o diversos agentes antimicrobianos.

Algunos de los procedimientos más utilizados en la práctica clínica diaria son (i) los procedimientos de difusión, tales como el antibiograma en disco basado en el trabajo de Bauer, Kirby et al. (Bauer A W, et al. Am. J. Clin. Pathol.

1966, 45:493 a 496) o el procedimiento de prueba de Epsilon o prueba E (AB Biodisk, Suecia), o (ii) procedimientos de dilución tales como el procedimiento de dilución en agar o el procedimiento de microdilución en caldo. Por medio de la comparación de los procedimientos de difusión con los de dilución, estos últimos son más complejos técnicamente y casi siempre más costosos, sobre todo cuando se utilizan paneles comerciales de microdilución. Los procedimientos de microdilución en medio líquido son los más utilizados en la práctica rutinaria del laboratorio de microbiología clínica.

En numerosos laboratorios, el uso de paneles comerciales se basa en el uso de sistemas semiautomáticos de incubación-lectura-interpretación; esto facilita su uso pero tiene el inconveniente de un mayor gasto. Algunas empresas han introducido en el mercado paneles en los que el medio de cultivo incluye un indicador fluorescente que permite obtener rápidamente (menos de 8 horas) los resultados. En relación con la determinación rápida de la resistencia a los antibióticos que actúan sobre la pared bacteriana, tales como los p-lactámicos, se añade al medio de cultivo un compuesto fluorogénico que puede ser metabolizado (solicitud de patente WO/1992/0197 63). Si el organismo crece con el antibiótico, el metabolismo de la bacteria conduce a la liberación del fluoróforo. Si el organismo no crece, la fluorescencia de la muestra aumenta.

Otra posibilidad es utilizar un compuesto indicador de color, tal como el tetrazolio, que provoca un cambio de color después de añadir un portador de electrones, tal como el metosulfato de fenazina, en caso de sensibilidad al antibiótico. Sin embargo, aún no hay suficientes datos que permitan sugerir el uso regular de dichos paneles.

Diversas empresas comerciales también están evaluando sistemas expertos (software) que facilitan la interpretación clínica de los resultados obtenidos; es de suponer que tales sistemas se utilizarán ampliamente en el futuro. Hoy en día hay diversos sistemas disponibles en el mercado, MicroScan WalkAway, Vitek y Wider son los más destacados. A falta de una mayor experiencia clínica con el uso de indicadores fluorescentes, el tiempo medio de respuesta para obtener la susceptibilidad de un microorganismo específico a los agentes antimicrobianos oscila, tal como en los procedimientos de difusión mencionados anteriormente, entre 18 y 24 horas.

Recientemente, se ha señalado la posibilidad de utilizar un sistema de dielectroforesis que detecte los cambios en la electrofisiología de la célula tras la administración del antibiótico (Hoettges KF, Dale JW, HughesMP. Rapid determination of antibiotic resistance in E. coli using dielectrophoresis. Phys. Med. Biol. 2007; 52:6001 a 6009). Otro desarrollo para los antibióticos que actúan sobre la pared bacteriana, tales como los p-lactámicos, consiste en detectar por medio de un sustrato específico la actividad de las enzimas citoplasmáticas que son liberadas por la célula al medio, si el antibiótico ha sido efectivo (Patente Europea EP0135023).

BACcelr8r™ es una plataforma en desarrollo por Accelr8 para identificar automáticamente microorganismos y estudiar su resistencia a los antibióticos. No utiliza el cultivo, tampoco es necesario el aislamiento de las bacterias. Funciona por medio de casetes en los que cada casete corresponde a una muestra. Utiliza un sistema automatizado con un microscopio controlado por medio de un ordenador, una cámara digital y un software de análisis. Una bomba mantiene un flujo de medio que contiene bacterias en diferentes condiciones a través del casete. El análisis de la resistencia a los antibióticos se pudo completar en 8 horas.

La solicitud de patente US2004/0014066 describe un procedimiento para detectar en una muestra la actividad de un antibiótico que afecta a la integridad de la célula que comprende (a) proporcionar un microorganismo transformado que comprende un ácido nucleico que codifica un promotor que está operablemente unido a un gen reportero heterólogo capaz de emitir una señal detectable, y (b) poner en contacto la muestra con el microorganismo transformado, (c) observar dicho microorganismo en busca de dicha señal detectable, en el que el promotor está regulado por un sistema de transducción de señales de dos componentes, en el que los componentes son (i) un receptor sensible a los cambios en la envoltura o la membrana celular del microorganismo y (ii) un factor de acción trans que se activa en respuesta a una estimulación del receptor y que regula el promotor.

Antibióticos que actúan sobre la pared bacteriana

El esqueleto de la pared celular bacteriana está formado por un heteropolímero, el peptidoglicano mureína. Esta macromolécula está formada por una secuencia alterna de N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM) unidos entre sí por medio de enlaces p-1,4. La cadena es una cadena recta y no ramificada que forma la estructura básica de la pared celular. El ácido N-acetilmurámico tiene un grupo de ácido láctico que se une a una cadena peptídica corta (tetrapéptido). Los aminoácidos típicos de esta cadena son la L-alanina, el ácido D-glutámico, el ácido m-diaminopimélico o la L-lisina o la D-alanina.

Los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared bacteriana son diferentes familias de fármacos que actúan sobre las diferentes etapas de la síntesis de la pared bacteriana:

- la cicloserina es un análogo de la D-alanina e inhibe de forma competitiva la unión de este aminoácido a las enzimas D-alanina-D-alanina sintetasa y alanina racemasa, pero impidiendo que se unan a los precursores del peptidoglicano.

- la fosfomicina bloquea la síntesis de los precursores del peptidoglicano.

- la bacitracina inhibe el reciclaje del undecaprenilo, el transportador de lípidos que lleva el peptidoglicano al exterior de la célula.

- los antibióticos glucopéptidos o glucopéptidos son una clase de péptidos con azúcares unidos a ellos, tal como en la pared celular bacteriana, que tienen una gran afinidad por los precursores de esta estructura. Los antibióticos glucopéptidos más conocidos son la vancomicina y la teicoplanina. La vancomicina ejerce su acción bactericida por medio de la inhibición de la síntesis de la pared celular bacteriana, al unirse al fragmento D-alanina-D-alanina (D-Ala-D-Ala) del pentapéptido de la pared de las bacterias Gram+, lo que bloquea la incorporación de péptidos en la pared celular. Secundariamente, la vancomicina actuaría a través de otros mecanismos como la alteración de la permeabilidad de la membrana citoplasmática y la inhibición de la síntesis de ARN, que se lleva a cabo después de que el fármaco se haya unido al peptidoglicano.

- los antibióticos p-lactámicos llevan a cabo la función bactericida por medio de la interferencia en la unión transversal o el puente interpéptido necesario para la reticulación. Inhiben la actividad de las PBP, serina proteasas o transpeptidasas, al unirse a ellas de forma irreversible.

- otros antibióticos que interfieren en la síntesis de la pared son isoniazida, etionamida y etambutol. Al igual que la cicloserina mencionada anteriormente, se utilizan en el tratamiento de las infecciones por micobacterias. La isoniazida tiene actividad bactericida en la fase de replicación activa. Afecta a la síntesis del ácido micólico, lo que interrumpe la elongación de los ácidos grasos. La etionamida también inhibe la síntesis del ácido micólico. El etambutol interfiere en la síntesis de arabinogalactanos de la pared celular. La resistencia a estos antibióticos se debe a la falta de penetración en la bacteria y/o a la modificación de sus objetivos celulares.

La resistencia a los antibióticos causa decenas de miles de muertes cada año. Muchas de estas muertes se podrían evitar con un tratamiento antibiótico adecuadamente seleccionado para su eficacia. Dados los niveles de resistencia, es necesario preparar el cultivo bacteriano, seguido por un antibiograma. Para completar lo anterior, la bacteria debe crecer normalmente durante 2 o 3 días. El antibiograma en sí suele requerir al menos un día de incubación, para las bacterias comunes de crecimiento rápido.

Para los pacientes en estado crítico en la UCI, es importante un tratamiento antibiótico rápido. Dado el retraso del antibiograma, se lleva a cabo de forma empírica. Este tratamiento es ineficaz en el 20 al 40% de los casos, y el cambio de tratamiento tras los resultados del antibiograma puede dejar de ser eficaz. En esta situación, es importante contar con un sistema de antibiograma rápido. Los antibióticos que actúan sobre la pared bacteriana, concretamente los p-lactámicos, son un grupo muy amplio y los más utilizados en la terapia antiinfecciosa. Es de gran interés disponer de sistemas de antibiograma rápido para dichos antibióticos.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Los aspectos y las realizaciones que quedan fuera de las reivindicaciones adjuntas se proporcionan como divulgación.

Descripción de la invención

Los autores de la presente invención han descubierto que una consecuencia de la actividad que los antibióticos que actúan sobre la pared celular bacteriana tienen sobre las bacterias es la liberación de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo. Para observar este efecto, los inventores incubaron una cepa de E. coli sensible a la ampicilina (un antibiótico p-lactámico) en presencia de dicho antibiótico, tras lo cual se incluyó el cultivo en diferentes microgeles en diversos portaobjetos, a los que se administró proteinasa K o ADNasa I (Ejemplos 7 y 8). Los cultivos que no fueron tratados con ampicilina no mostraron un fondo microgranular-fibrilar en la preparación (Figura 10a), mientras que en los cultivos tratados con ampicilina se observó un fondo microgranular. Cuando los cultivos tratados con ampicilina se incubaron con proteinasa K, el fondo permaneció inalterado (Figura 10f), mientras que cuando se incubaron con ADNasa I, el fondo dejó de observarse (Figura 10 d), lo que indica que el fondo observado incluye principalmente fragmentos de ADN extracelular procedentes de las células afectadas por el antibiótico. Dicho fondo no se observó cuando se utilizaron otros tipos de antibióticos, tales como las quinolonas, que no actúan sobre la pared celular.

Sin embargo, los inventores también observaron que, cuando el cultivo bacteriano es un cultivo mixto o contaminado, es decir, hay una mezcla de células sensibles o resistentes, dicho procedimiento no sería muy adecuado como criterio de discriminación estricto porque, a pesar de la liberación de fragmentos de ADN extracelular, la morfología de las bacterias no se modifica por la acción del antibiótico, es decir, tanto las bacterias sensibles como las resistentes al antibiótico muestran una pared celular aparentemente intacta. Para resolver este problema, los inventores han diseñado una solución de lisis que sólo afecta a las bacterias cuya pared celular ha sido previamente dañada por la acción de un antibiótico que actúa sobre la pared celular, y que cuando se añade al cultivo bacteriano que ha sido previamente expuesto a la acción de dicho antibiótico, provoca la liberación del nucleoide bacteriano, observándose entonces una bacteria con la pared celular dañada (Ejemplos 1 a 5). Por lo tanto, la presencia de nucleoides bacterianos tras aplicar la solución de lisis es indicativa de la presencia de bacterias sensibles al antibiótico.

En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana que comprende:

i) añadir a dicho cultivo un antibiótico que actúe sobre la pared celular bacteriana,

ii) añadir una solución de lisis al cultivo resultante de la etapa i), en el que dicha solución de lisis es una solución de lisis específica para aquellas bacterias cuya pared celular ha sido dañada por el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana, y se define como en la reivindicación 1 anexa, y

iii) determinar la presencia de nucleoide bacteriano,

en el que la presencia de nucleoide bacteriano en el medio es indicativa de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana, que comprende medir la integridad de la pared celular de dicha bacteria por medio de un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que si la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada, entonces la bacteria es sensible al antibiótico.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para diseñar una terapia antibiótica personalizada para un individuo que sufre una enfermedad bacteriana que comprende

i) aislar la bacteria causante de la enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria por medio de un procedimiento de acuerdo con la presente invención,

en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces dicho individuo puede recibir una terapia basada en un antibiótico que actúe sobre la pared celular.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana que comprende:

i) poner en contacto un cultivo que contenga una bacteria sensible a un antibiótico que actúe sobre la pared celular bacteriana en presencia del compuesto antibiótico candidato, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria por medio de un procedimiento de acuerdo con la presente invención,

en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces el compuesto antibiótico candidato es un compuesto antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para identificar una bacteria perseverante o una bacteria tolerante a un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana en un cultivo que contiene bacterias sensibles, que comprende evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en dicho cultivo por medio de un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que la bacteria cuya integridad de la pared celular no ha sido dañada se identifica como una bacteria perseverante o tolerante.

En otro aspecto, la invención se refiere a una solución de lisis caracterizada porque sólo afecta a las bacterias que tienen la pared bacteriana dañada por la acción de un antibiótico, y se define como en la reivindicación 12 anexa.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la solución de lisis de la presente invención para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende la solución de lisis de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra tres cepas diferentes de Escherichia coli, una bacteria Gram, expuestas al antibiótico plactámico, amoxicilina, junto con el inhibidor de la beta-lactamasa, ácido clavulánico, procesadas por medio de la técnica de evaluación de la integridad de la pared celular. La incubación se llevó a cabo en medio líquido Mueller-Hinton durante la fase de crecimiento exponencial a 37 °C con agitación durante 40 minutos. Las dosis de antibiótico se eligieron de acuerdo con los puntos de corte indicados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Por lo tanto, la cepa se considera sensible cuando su concentración inhibitoria mínima (CIM) es < 8/4 (8 |jg/mL de amoxicilina y 4 jg/mL de ácido clavulánico) y resistente cuando su CIM es > 32/16 (32 jg/mL de amoxicilina y 16 jg/mL de ácido clavulánico). De acuerdo con las técnicas estándar de microbiología, la primera cepa (fila superior: a, a', a") es una cepa sensible, la segunda cepa es una cepa con sensibilidad intermedia (fila central: b, b', b") y la tercera cepa es una cepa resistente (fila inferior: c, c', c"). a, b, c: control sin antibióticos. a', b', c': 8/4; 8 jg/mL de amoxicilina y 4 jg/mL de ácido clavulánico; a", b", c": 32/16; 32 jg/mL de amoxicilina y 16 jg/mL de ácido clavulánico. Los controles sin antibióticos (a, b, c) muestran las bacterias no lisadas. Después de una dosis de 8/4, sólo se lisan las bacterias de la primera cepa sensible, que muestra los nucleoides (a'). Tras una dosis de 32/16, la primera cepa sensible y la segunda cepa con sensibilidad intermedia se lisan (a" y b"), mientras que la tercera cepa resistente no se lisa (c"). Sin embargo, en algunas células aisladas se aprecian algunos daños en la pared celular. Cuando el antibiótico es eficaz, además de la liberación y propagación de nucleoides, se observa un fondo microgranular homogéneo y difuso que contiene fragmentos de ADN desprendidos por las células.

La Figura 2 muestra a Enterococcus faecalis, una bacteria Gram+ sensible al antibiótico p-lactámico, ampicilina (CIM = 4 jg/mL), tratada con diferentes dosis de ampicilina durante 60 minutos. a: control sin antibiótico; b: 4 jg/mL (CIM); c: 8 jg/mL; d: 16 jg/mL; e: 32 jg/mL. La dosis de CIM es suficiente para observar el efecto en la pared por el antibiótico y el fondo de fragmentos de ADN extracelular.

La Figura 3 muestra a Enterococcus faecium, una bacteria Gram+ resistente al antibiótico p-lactámico, ampicilina (CIM > 32), incubada con diferentes dosis de este antibiótico durante 60 minutos. a: control sin antibiótico; b: 32 jg/mL; c: 320 jg/mL. Después de 320 jg/mL, se observó un efecto en la pared de algunas células aisladas con un fondo sutil de fragmentos de ADN extracelular.

La Figura 4 muestra a E. coli que es sensible al antibiótico p-lactámico, ceftazidima, del tipo cefalosporina. La cepa fue expuesta a diferentes dosis durante 60 minutos. a: control sin antibióticos; b: 1 jg/mL (CIM); c: 8 jg/mL. El CIM da lugar al aspecto filamentoso de las células que muestran un efecto en la pared. A partir de 8 jg/mL, se observa un gran efecto sobre la pared, apreciándose claramente el fondo de fragmentos de ADN extracelular.

La Figura 5 muestra células de E. coli procedentes de un cultivo en medio líquido, que crecen en fase exponencial, sensibles a la amoxicilina/ácido clavulánico, y expuestas a una dosis alta de 32/16 durante 90 minutos. Tras el procesamiento por medio de la técnica de la invención, además de las células que muestran un efecto en la pared que libera nucleoide, y del fondo de fragmentos de ADN extracelular, se observa claramente una célula con morfología intacta (asterisco) que no ha sido afectada por el antibiótico. Esta célula se comporta como una "célula persistente".

La Figura 6 muestra gráficos que representan los porcentajes de células en cultivo, de células sin halo y de células con la pared dañada, de E. coli procedentes de un cultivo en medio líquido, que crecen en fase exponencial, sensibles a la amoxicilina/ácido clavulánico, y expuestas a una dosis alta de 32/16 durante diferentes tiempos. Se observa en la parte superior que la proporción de células no lisadas aumenta gradualmente en el cultivo a lo largo del tiempo, dado que las células afectadas por el antibiótico disminuyen gradualmente (LH: halo grande SH: halo pequeño F: lisado con ADN fragmentado). En la parte inferior, se muestra el mismo dibujo, pero cuyos datos se han normalizado en función del porcentaje de células que permanecen en el cultivo. Se observa que el porcentaje de células sin halo tiende a mantenerse constante a lo largo del tiempo, mientras que el porcentaje de células con la pared dañada disminuye gradualmente de forma similar al de las células en cultivo. Esto respalda que las células sin halo se comportan como "células persistentes".

La Figura 7 muestra células de E. coli procedentes de un cultivo en medio líquido, que crecen en fase exponencial, sensibles a la amoxicilina/ácido clavulánico, y expuestas a una dosis alta de 32/16 durante 60 minutos. Tras el procesamiento por medio de la técnica de la invención, se observaron tres células que liberan nucleoide, además del fondo típico. Uno de los nucleoides no mantiene una morfología intacta, sino que se muestra fragmentado, teñido en mucha menor medida y más difuso (asterisco), que muestra un amplio halo con pequeños fragmentos de ADN que se difunden desde el residuo bacteriano central.

La Figura 8 muestra las mismas cepas de E. coli presentadas en la Figura 1 que fueron cultivadas durante 24 horas en una placa y posteriormente durante 40 minutos en un medio líquido con una dosis de 0 (a, b, c), 8/4 (dosis baja; a', b', c') y 32/16 (dosis alta; a", b", c") de amoxicilina/ácido clavulánico. Las cepas se procesaron sin la etapa de lisis por exposición a la solución de lisis. La cepa sensible se muestra en la fila superior (a, a', a"); la cepa con sensibilidad intermedia en la fila central (b, b', b") y la cepa resistente en la fila inferior (c, c', c"). En esas condiciones de crecimiento y tras este período de incubación con el antibiótico, sólo la cepa sensible muestra el fondo microgranular-fibrilar homogéneo difuso de fragmentos de ADN extracelular que desprenden las células. Este fondo es evidente tras la dosis baja (8/4) y aumenta significativamente tras la dosis alta (32/16). Así, la cepa sensible se puede diferenciar claramente de las demás.

La Figura 9 muestra una cepa de E. coli sensible a la ampicilina que fue incubada con una dosis de 8 pg/mL de dicho antibiótico durante 60 minutos. a y b: Observación en montaje húmedo. a: cultivo de control sin antibióticos; b: cultivo tratado con ampicilina. Se observa un fondo microgranular o fibrilar difuso de fragmentos de ADN bacteriano extracelular entre las bacterias del cultivo tratado con ampicilina. c y d: cultivo fijado en metanol:ácido acético. c: cultivo de control sin antibióticos; d: cultivo tratado con ampicilina, en el que el material de fondo de ADN se observa entre las bacterias, para formar agregados de diversas formas y tamaños.

La Figura 10 muestra una cepa de E. coli sensible a la ampicilina que fue incubada con una dosis de 32 pg/mL de dicho antibiótico durante 60 minutos. Las alícuotas de un cultivo de control sin antibióticos y las alícuotas del cultivo con tratamiento de ampicilina se incluyeron en microgeles y se tiñeron con SYBR Gold. El cultivo de control sin antibióticos no muestra fondo microgranular-fibrilar en la preparación (a), mientras que el cultivo tratado con ampicilina muestra dicho fondo (b). La incubación de los microgeles con tampones que contienen las enzimas, ADNasa I (c) o proteinasa K (e), no afecta a dicho fondo. Cuando el microgel de los cultivos tratados con ampicilina se incuba con 2,5 U de ADNasa I durante 30 minutos, el fondo desaparece de la preparación (d), mientras que cuando se incuba con 2 mg/mL de proteinasa K durante 30 minutos, el fondo permanece inalterado (f). El tampón que contiene proteinasa K tiene SDS y EDTA que lisan las células. El aumento de la concentración de proteinasa K a 10 mg/mL en el mismo tampón o en agua tampoco afecta al fondo. Este experimento demuestra que el fondo corresponde a fragmentos de ADN extracelular.

La Figura 11 muestra la hibridación in situ fluorescente (FISH) con sonda de ADN genómico completo de E. coli, sobre extensiones de cultivo, fijadas en Carnoy, de dicha bacteria tratada con ampicilina durante 60 minutos. Carnoy hace que el material microgranular-fibrilar del fondo se agregue, para envolver las bacterias. Por lo tanto, la contratinción con DAPI muestra agregados del material de fondo con bacterias cuyos nucleoides se tiñen intensamente con DAPI. El material de fondo agregado también se tiñe con dicho colorante, aunque de forma más ligera (a). La sonda de ADN genómico completo hibrida tanto con los nucleoides celulares como con el material de fondo, lo que demuestra que este último corresponde a ADN bacteriano fragmentado.

La Figura 12 muestra una cepa de Acinetobacter baumannii sensible al imipenem que se incubó con 0,76 pg/mL de este antibiótico durante 1 hora. Se diluyó una alícuota del cultivo y se incluyó en un microgel de agarosa, se deshidrató en alcoholes crecientes, se secó y se tiñó con SYBR Gold. Se observa un fondo microgranular-fibrilar correspondiente a fragmentos de ADN en diferentes grados de alargamiento.

Descripción detallada de la invención

A partir del descubrimiento mencionado en la sección relativa a la Descripción de la Invención, los inventores han desarrollado una serie de aspectos inventivos que se explicarán en detalle a continuación.

Procedimientos para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana de la invención

Divulgación

Una divulgación se refiere a un procedimiento para evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria en un cultivo puro en presencia de un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana (en adelante, "primer procedimiento de la divulgación"), que comprende:

i) añadir a dicho cultivo puro de dicha bacteria un antibiótico que actúe sobre la pared celular bacteriana, y ii) determinar la presencia de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo,

en el que la presencia de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo es indicativa de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

En el contexto de la presente invención, el término "pared celular" se refiere a la pared celular que envuelve a una célula bacteriana y que está constituida por peptidoglicano de mureína, que está formado por una secuencia alterna de N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM) unidos entre sí por medio de enlaces p-1,4. Los términos "pared celular" y "pared celular bacteriana" son equivalentes y se pueden utilizar indistintamente en la presente descripción.

En la presente invención, "evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria" se entiende como la acción de determinar si los componentes o la estructura original de la pared celular bacteriana han sido dañados, o si por el contrario, sus componentes y estructura permanecen intactos tras la exposición a un agente extraño. En el contexto de la presente invención, el agente extraño es un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana, es decir, un antibiótico que bloquea la síntesis de peptidoglicano de forma que la pared celular de la bacteria resulta dañada. En la presente invención, se entiende por "cultivo puro" cualquier cultivo que contenga un único tipo de microorganismo. Los diferentes medios de cultivo, técnicas y procedimientos para la obtención de cultivos puros son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y constituyen una práctica rutinaria para los expertos en la técnica (Rotger, R. (editor), 1997, Microbiología Sanitaria y clínica, Editorial Síntesis, Madrid).

La primera etapa del primer procedimiento de la divulgación [etapa i)] comprende añadir a dicho cultivo puro de dicha bacteria un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana.

El término "antibiótico" incluye cualquier compuesto químico que elimine o inhiba el crecimiento de organismos infecciosos; como se utiliza en la presente memoria, dicho término incluye cualquier compuesto químico producido por un ser vivo, o un derivado sintético del mismo, que elimine o inhiba el crecimiento de organismos infecciosos a bajas concentraciones. Una propiedad común a todos los antibióticos es la toxicidad selectiva: la toxicidad es mayor para los organismos invasores que para los animales o seres humanos que los albergan. Los antibióticos se pueden clasificar de acuerdo con su estructura, el microorganismo al que se adhieren, su mecanismo de acción, su objetivo terapéutico, etc. En la presente invención, se entiende por "antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana" un antibiótico que interfiere en cualquiera de las etapas de la síntesis de la pared bacteriana. Una prueba para determinar si un antibiótico actúa sobre la pared celular es, por ejemplo, cualquiera de las pruebas descritas en los ejemplos de la presente solicitud de patente.

En una realización particular, el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico p-lactámico, una isoniazida, una etionamida, un etambutol, una cicloserina y un antibiótico glucopéptido.

En otra realización particular, el antibiótico p-lactámico se selecciona del grupo que consiste en penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbacefem, carbapenems, monobactamas e inhibidores de p-lactamasas.

En otra realización particular, los inhibidores de la p-lactamasa se seleccionan del grupo que consiste en ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam.

En otra realización particular, el antibiótico glucopéptido es vancomicina o teicoplanina.

Como es conocido por los expertos en la técnica, el tiempo de incubación del cultivo junto con el antibiótico puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de si el cultivo está en una fase estacionaria o de crecimiento exponencial, de si el cultivo se lleva a cabo en una placa o en un medio líquido, de la dosis de antibiótico que se añade al cultivo, etc. En general, el tiempo de incubación con el antibiótico puede oscilar entre 5 minutos y 90 minutos, preferentemente entre 20 y 60 minutos. En una realización particular, el tiempo de incubación es de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 minutos. Además, la cantidad de antibiótico que se añade al medio de cultivo también puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, la cantidad de antibiótico que se añade al medio de cultivo está comprendida entre 5 y 2.570 pg/mL, aunque preferentemente, la cantidad de antibiótico que se añade será la concentración inhibitoria mínima (ClM) para una bacteria específica. Como es sabido por los expertos en la técnica, en el estado de la técnica existen tablas estandarizadas ampliamente aceptadas en las que se enumera la CIM necesaria para inhibir un microorganismo específico. En una realización particular, la cantidad de antibiótico que se puede añadir al medio de cultivo es de 0,06, 0,038, 0,38, 4, 8, 16, 20, 32, 160, 256 o 2.560 pg/mL. Por último, la temperatura de incubación del cultivo con el antibiótico puede oscilar entre 36 °C y 38 °C, preferentemente 37 °C.

La segunda etapa del primer procedimiento de la divulgación [etapa ii)] comprende observar la presencia de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo.

Como entienden los expertos en la técnica, la presencia de fragmentos de ADN en el medio se puede determinar por microscopía o por cualquier otro procedimiento físico o químico alternativo para detectar el ADN liberado en el medio de cultivo por los microorganismos, que incluyen, sin limitación, la electroforesis, los anticuerpos, la espectrofotometría, la reacción en cadena de la polimerasa, las técnicas de hibridación, las micromatrices, la microfluídica, las nanopartículas, los puntos cuánticos, etc. Estos procedimientos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y su puesta en práctica es una práctica rutinaria para los expertos en la técnica.

Sin embargo, debido al tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de ADN, en una realización particular, la microscopía es la técnica de elección para determinar la presencia de fragmentos de ADN dada su mayor sensibilidad. Para ello, es conveniente inmovilizar una muestra del cultivo resultante de la primera etapa [etapa i)] en un portaobjetos. Por lo tanto, en una realización particular, el primer procedimiento de la divulgación comprende llevar a cabo, entre las etapas i) y ii), la etapa de inmovilizar una muestra del cultivo de la etapa i) sobre un soporte. Dicho soporte puede ser un portaobjetos. En una realización particular, dicho portaobjetos es un portaobjetos de vidrio recubierto total o parcialmente con una película de agarosa estándar. Para ello, se prepara una solución estándar de agarosa entre el 0,2 y el 1% en agua destilada en un tarro Coplin o similar; se cubre con una lámina de plástico perforada y se deposita en un horno de microondas; se ajusta el horno de microondas a una potencia comprendida entre 300 W y 1000 W, preferentemente a 500 W, agitando de vez en cuando el recipiente para una mejor disolución de la agarosa, dejándolo hervir. Este procedimiento también se puede llevar a cabo mediante el uso de un baño termostático. Cuando la solución de agarosa se vuelva completamente transparente, estará lista para ser depositada en vasos verticales con un contenido de entre 10 y 250 ml. Estos recipientes deben ser previamente templados en un baño entre 60 a 100 °C, preferentemente a 70 °C, para mantener la solución de agarosa en estado líquido. A continuación se sumergen los portaobjetos limpios en vertical, sujetándolos con unas pinzas por el área del suelo entre 1 y 60 segundos, sacándolos y sumergiéndolos de nuevo entre 1 y 10 veces, hasta formar una película homogénea en el portaobjetos. Alternativamente, en lugar de sumergir el portaobjetos en la solución de agarosa, es posible utilizar un pulverizador, dispersando la agarosa en el portaobjetos. De este modo, se puede recubrir una gran cantidad de portaobjetos en poco tiempo. Independientemente del procedimiento utilizado, los portaobjetos recubiertos con una película de agarosa se depositan horizontalmente sobre una superficie lisa y fría entre 1 y 15 °C, preferentemente a 4 °C, de vidrio o metal, por ejemplo. Esta placa con los portaobjetos se introduce en la nevera a 4 °C durante al menos 30 minutos, hasta comprobar que la solución de agarosa ha gelificado en la superficie del portaobjetos. Se sacan las bandejas del frigorífico y se limpia con papel secante la superficie de los portaobjetos que estuvo en contacto con el plato. A continuación, los portaobjetos se introducen horizontalmente en un horno a una temperatura comprendida entre 37 °C y 100 °C, hasta que la agarosa se haya secado completamente y forme una fina película adherida al vidrio. Los portaobjetos así tratados se pueden utilizar inmediatamente o almacenarse en un estuche bien cerrado a temperatura ambiente durante varios meses.

La inmovilización de una muestra del cultivo de la etapa i) en un portaobjetos preparado de la manera explicada anteriormente, requiere la preparación previa de dicha muestra. Por medio de los procedimientos convencionales en este campo, se obtiene y verifica la concentración de microorganismos en una muestra líquida. La concentración adecuada para el análisis oscila entre 0,1 y 20 millones de microorganismos por mililitro. Si la muestra estuviera demasiado concentrada, se ajusta a la concentración adecuada por medio de la disolución con medio de cultivo o con solución salina/tampón fosfato (PBS) o similar, adecuada de acuerdo con el microorganismo y de acuerdo con la estabilidad del antibiótico que se vaya a probar.

Para facilitar el procesamiento de la muestra que contiene los microorganismos, se introduce en un medio con características similares a las de una suspensión, tal como un microgel de agarosa, por ejemplo. En este caso, se prepara una solución de agarosa de bajo punto de fusión/de gelificación a una concentración comprendida entre el 0,5 y el 3% en agua destilada o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Esta agarosa se funde con un horno de microondas o un baño con control termostático, y posteriormente se mantiene entre 30 y 37 °C. en un tubo introducido en un baño con control termostático o en un horno. La muestra del cultivo y la solución de agarosa se mezclan cuidadosamente en un tubo Eppendorf o similar, de forma que esta última se encuentre a una concentración comprendida entre el 0,3 y el 2%, por ejemplo, 70 pl de solución de agarosa 30 pl de muestra. Es importante que la temperatura de la agarosa no supere los 37 °C para evitar dañar los microorganismos.

Finalmente, para obtener la muestra sobre el soporte, los portaobjetos recubiertos de agarosa se colocan sobre una superficie lisa y fría de vidrio o metal, con una temperatura comprendida entre 1 y 15 °C, para evitar la formación de burbujas de aire. Se recomienda depositar una gota (entre 2 y 200 microlitros (pL)) de la mezcla (muestra preparada del cultivo agarosa) con una micropipeta, por medio de la colocación de un cubreobjetos encima de la gota. En cada portaobjetos se pueden pipetear varias gotas, es decir, muestras del cultivo bacteriano de la etapa i). Como precaución, se recomienda procesar cada muestra por duplicado y utilizar una muestra de control cada vez que se aplique la técnica. El plato con los portaobjetos se introduce en una nevera a 4 °C durante un período de tiempo comprendido entre 2 y 30 minutos hasta que se produzca una adecuada gelificación de la agarosa. Una vez que se ha producido la gelificación, los cubreobjetos se retiran suavemente dentro del mismo frigorífico, para evitar dañar el microgel.

Posteriormente, para visualizar los fragmentos de ADN por microscopía, es conveniente estabilizar y adherir firmemente los fragmentos de ADN en el portaobjetos, dado que se pueden desprender. Para ello, los portaobjetos secos se incuban en un horno de microondas a una potencia comprendida entre 300 W y 1000 W, preferentemente a 500 W, durante un período de tiempo comprendido entre 1 y 10 minutos. Una alternativa, aunque menos recomendable por su duración, es incubar los portaobjetos en un horno o una estufa a alta temperatura durante un período de tiempo comprendido entre 1 y varias horas. Una vez que están completamente secos, los portaobjetos ya procesados que contienen la muestra se pueden almacenar en cajas de archivo a temperatura ambiente y en la oscuridad durante meses. Esto facilita la separación del proceso de tratamiento de la muestra y la etapa posterior de evaluación de la integridad de la pared celular de los microorganismos. La presentación permite una evaluación repetida a diferentes intervalos de diversas muestras de un mismo microorganismo.

Una vez tratadas las muestras y después de que los fragmentos de ADN se estabilicen y se adhieran firmemente a los portaobjetos, se pueden teñir las muestras y evaluar la integridad de la pared celular de los microorganismos. Por lo tanto, en una realización particular del procedimiento de la invención, la observación de la presencia de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo se lleva a cabo por medio de tinción. Se puede obtener una alta calidad de imagen y una alta consistencia de los resultados de la evaluación por medio de la selección adecuada de las condiciones de tinción.

La tinción o el teñido es una técnica auxiliar en microscopía para mejorar el contraste de la imagen vista a través de un microscopio. En bioquímica, esto significa añadir un colorante específico para la molécula que se va a teñir (ADN en el contexto de la presente invención) a un sustrato para calificar o cuantificar la presencia de un compuesto específico. Las tinciones se pueden utilizar, entre otros fines, para definir y examinar los orgánulos de las células individuales o para etiquetar los ácidos nucleicos en la electroforesis en gel.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos de los colorantes utilizados con frecuencia son moléculas con carga positiva (cationes) que se combinan intensamente con los componentes celulares con carga negativa, tales como ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos. Los ejemplos ilustrativos no limitantes de colorantes catiónicos incluyen el azul de metileno, el violeta de cristal y la safranina. El azul de metileno es un buen colorante sencillo que actúa rápidamente sobre todas las células bacterianas y no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares, lo que resulta especialmente útil. En ocasiones, algunos tintes sólo se tiñen mejor después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química conocida como mordiente, que no es un tinte per se. El ácido tánico es un mordiente común que se combina con un constituyente celular y lo altera de forma que ahora puede atacar al colorante. Como es conocido por los expertos en la técnica, existen técnicas en el estado de la técnica específicas para la tinción del ADN, tales como, por ejemplo, la tinción de Feulgen que consiste en someter el material a una hidrólisis con ácido clorhídrico 1 N a 60 °C o con ácido clorhídrico 5 N a temperatura ambiente y posteriormente añadir el reactivo de Schiff. Por medio de esta técnica es posible teñir los núcleos de las células bacterianas.

Como se ha indicado anteriormente, debido al tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de ADN, en una realización particular, la microscopía de fluorescencia es la técnica de elección para ver los fragmentos de ADN dada su mayor sensibilidad, para ello las bacterias deben ser teñidas con compuestos químicos específicos denominados fluoróforos o fluorocromos. Estos compuestos son capaces de emitir fluorescencia cuando son excitados con luz a una longitud de onda adecuada. Hoy en día existe toda una gama de fluorocromos que no sólo proporcionan información sobre la viabilidad de las células, sino que también muestran claramente ciertas características fisiológicas y, en algunos casos, estructurales de las bacterias. A título ilustrativo, existen fluoróforos que detectan la actividad respiratoria (por ejemplo, los derivados del tetrazolio, etc.), la actividad de las esterasas (por ejemplo, la calceína-AM, la carboxifluoresceína, etc.), el potencial de membrana (por ejemplo, la rodamina 123, el oxonol VI, las carbocianinas, etc.), la integridad de la membrana (por ejemplo, el SYTO-9, el SYTO-13, el verde Sytox, el yoduro de propidio, etc.), etc.

Por lo tanto, en una realización particular la tinción se lleva a cabo mediante el uso de uno o más fluorocromos. Por lo tanto, dependiendo de la disponibilidad de filtros de fluorescencia, las muestras se pueden teñir con fluorocromos específicos del ADN del tipo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), Hoechst 33258, Hoechst 33342, bromuro de etidio, yoduro de propidio, etc. Sin embargo, se prefieren los fluorocromos que tienen mayor sensibilidad, como GelRed, EvaGreen y otros derivados de la cianina, como las familias SYBR®, PicoGreen® (Invitrogen - Molecular Probes™), las variantes de TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO, LO-PRO, etc. Otros tipos de fluorocromos incluyen, entre otros, el azul SYTOX, la cromomicina A3, la mitramicina, el naranja de acridina, el verde SYTOX, el naranja de tiazol, el LDS 751, el 7-AAD, el naranja SYTOX y el DRAQ5.

En una realización particular, los fluorocromos se seleccionan del grupo que consiste en Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI, cromomicina A3, mitramicina, bromuro de etidio, naranja de acridina naranja de tiazol, 7-AAD, derivados de cianina y las variantes de los fluorocromos TOTO, YOYO, Bo b o , POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO y LO-PRO

La cantidad y la calidad de los fluorocromos aumenta actualmente. Para evitar la pérdida de fluorescencia, se puede incluir un medio antidesvanecimiento (por ejemplo Vectashield-Vector H-1000, DABCO; etc.). Sin embargo, estos medios suelen provocar una fluorescencia difusa y un fondo claro que dificulta el contraste de la imagen. Por lo tanto, generalmente es preferente utilizar un fluorocromo altamente sensible y relativamente fotoestable, montado en una solución acuosa tamponada, y evaluar la muestra con relativa rapidez, antes de que se seque. Si es necesario, el portaobjetos se puede lavar y teñir de nuevo.

Las imágenes obtenidas se pueden estudiar por medio de un análisis visual directo o, preferentemente, por medio de la aplicación de un software de análisis de imágenes digitalizadas obtenidas por medio de cámaras analógicas o digitales acopladas a plataformas de microscopía.

Finalmente, la integridad de la pared de los microorganismos se evalúa por medio de la determinación de la presencia de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo, en el que la presencia de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo es indicativa de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente (Descripción de la invención), cuando el cultivo bacteriano es un cultivo mixto o contaminado, es decir, hay una mezcla de células sensibles o resistentes a los antibióticos que actúan sobre la pared celular bacteriana, el primer procedimiento de la divulgación no sería muy adecuado como criterio de discriminación estricto porque tanto las bacterias sensibles como las resistentes al antibiótico muestran una pared celular aparentemente intacta. Para resolver este problema, los inventores han diseñado una solución de lisis que sólo afecta a las bacterias cuya pared celular ha sido previamente dañada por la acción del antibiótico que actúa sobre la pared celular. Esta solución de lisis se puede añadir al cultivo bacteriano que ha sido previamente expuesto a la acción de dicho antibiótico, liberándose el nucleoide bacteriano y observándose entonces una bacteria con la pared celular dañada (Ejemplos 1 a 5). Por lo tanto, la presencia de nucleoide bacteriano después de aplicar la solución de lisis es indicativa de la presencia de bacterias sensibles a dicho antibiótico que actúa sobre la pared celular.

Invención

Por lo tanto, en un aspecto la invención se refiere a un procedimiento para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana (en adelante, "segundo procedimiento de la invención"), que comprende:

i) añadir a dicho cultivo un antibiótico que actúe sobre la pared celular bacteriana,

ii) añadir una solución de lisis al cultivo resultante de la etapa i), en el que dicha solución de lisis es una solución de lisis específica para aquellas bacterias cuya pared celular ha sido dañada por el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana, y comprende un tampón con un pH comprendido entre 3 y 11,5, y

iii) determinar la presencia de nucleoide bacteriano, en el que la presencia de nucleoide bacteriano en el medio es indicativa de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

Los términos y expresiones "evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias", "pared celular" y "antibiótico que actúa sobre la pared celular" ya se han definido anteriormente en el primer procedimiento de la divulgación, y son aplicables al presente aspecto inventivo.

Además, aunque el segundo procedimiento de la invención ha sido diseñado para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias en un cultivo mixto o contaminado, los expertos en la técnica entienden que dicho segundo procedimiento de la invención también se puede aplicar a cultivos puros.

El término "cultivo puro" se ha definido anteriormente en la presente descripción. En la presente invención, un "cultivo mixto" se entiende como un cultivo bacteriano que contiene dos o más especies diferentes de bacterias. En la mayoría de los casos, la presencia de dos o más especies diferentes de bacterias en un cultivo es el resultado de la contaminación del mismo debido a una manipulación incorrecta de la muestra, por lo que en el contexto de la presente invención, los términos "cultivo mixto" y "cultivo contaminado" son equivalentes y se pueden utilizar indistintamente a lo largo de la descripción. Por lo tanto, en una realización particular del segundo procedimiento de la invención las bacterias presentes en el cultivo pertenecen a la misma especie o a especies diferentes.

Como puede ver los expertos en la técnica, las etapas i) y iii) del segundo procedimiento de la invención son comunes al primer procedimiento de la divulgación [etapas i) y ii), respectivamente]. Por lo tanto, todas las explicaciones y realizaciones particulares mencionadas anteriormente en relación con dichas etapas se aplican también al segundo procedimiento de la invención.

El segundo procedimiento de la invención comprende, además de las etapas i) y iii) [comunes a las etapas i) y ii) del primer procedimiento de la divulgación], una etapa ii) que no se encuentra en el primer procedimiento de la divulgación y que comprende la adición de una solución de lisis al cultivo resultante de la etapa i), en el que dicha solución de lisis es una solución de lisis específica para aquellas bacterias cuya pared celular ha sido dañada por el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana, y comprende un tampón con un pH comprendido entre 3 y 11.5.

La solución de lisis que afecta específicamente a las bacterias que tienen la pared celular afectada por el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana comprende básicamente una solución tampón que tiene un pH entre 3 y 11.5, pero que puede comprender adicionalmente otros componentes que incluyen, pero no se limitan a, detergentes iónicos, detergentes no iónicos, sales, etc. en diferentes proporciones.

Por lo tanto, en una realización particular, el tampón que forma parte de la solución de lisis es el tris(hidroximetil)aminometano (Tris) con fórmula (HOCH² )³ CNH² que también se puede utilizar para preparar otras soluciones tampón que incluyen, pero sin limitarse a, el tampón Tris-HCl, el tampón Tris-Gly, el tampón TAE (Trisacetato-EDTA) y el tampón TBE (Tris-borato-EDTA). El Tris tiene un pKa de 8,06 que le proporciona una capacidad tampón eficaz en un intervalo de pH comprendido entre 7,0 y 9,2. La forma más utilizada se llama Tris base (la forma básica no ionizada de la amina); a veces también se utiliza la forma ácida o clorhidrato (Tris-HCl). Otras soluciones tampón son, entre otras, Hepes, Mops, Pipes, etc. Para obtener un pH estable cercano a 11,5, se utiliza fosfato de sodio dibásico, también conocido como fosfato de hidrógeno de disodio (Na² HPO⁴ ), ácido bórico-borato, trietilamina y ácido 4-[ciclohexilamino]-1-butanosulfónico (CABS).

En otra realización particular, la solución de lisis comprende, además de la solución tampón, hasta un 3% de un detergente iónico o de un detergente no iónico.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "detergente iónico" se refiere a cualquier compuesto que tenga una porción hidrófoba y una porción hidrófíla, que forme iones con carga positiva (detergente catiónico) o iones con carga negativa (detergente aniónico) en solución y que permita obtener una emulsión. Como entienden los expertos en la técnica, los términos "detergente", "tensioactivo" y "agente tensioactivo" son sinónimos, por lo que se pueden utilizar indistintamente a lo largo de la presente descripción.

Los ejemplos de detergentes catiónicos incluyen, pero no se limitan a, sales de amonio primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias con estructura lineal o cíclica, mezclas de las mismas, tales como, por ejemplo, sales de piridina, sales de piperazina y derivados de dichas sales de amonio. El término "derivados de sales de amonio" incluye aquellas sales que incorporan en la misma estructura al menos dos grupos aminos primarios, secundarios, terciarios y/o cuaternarios, tales como, por ejemplo, las sales de guanidina, piperazina e imidazol. Esta definición comprendería también las sales de aminoácidos, tales como, por ejemplo, las sales de lisina, arginina, ornitina o triptófano. Asimismo, esta definición abarcaría las sales de amonio en las que la carga positiva, en lugar de estar en el átomo de nitrógeno, está en un átomo de fósforo, tales como, por ejemplo, yoduro de ditetradecilo(trimetilfosfonio) metilfosfonato, yoduro de ditetradecilo(butildimetilfosfonio) metilfosfonato, yoduro de ditetradecilo (yoduro de dimetilisopropilfosfonio) metilfosfonato o yoduro de ditetradecilo (trimetilarsonio) metilfosfonato de arsénico, yoduro de dioleilo (trimetilfosfonio) metilfosfonato. Los ejemplos de sales de amonio incluyen, pero no se limitan a, sales de tetraalquilamonio, sales de alquilbencildimetilamonio o sales de amonio heterocíclico, como el bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB).

Los ejemplos ilustrativos no limitantes de detergentes iónicos incluyen acil-aminoácidos, tales como ácidos acilglutámicos, acil-péptidos, sarcosinatos, tauratos, etc., ácidos carboxílicos, tales como ácidos con cadena saturada, ésteres de ácidos carboxílicos, éteres de ácidos carboxílicos, ésteres de ácidos fosfóricos, ácidos sulfónicos, tales como acil-isotianatos, alquil aril sulfonatos, alquil sulfonatos, sulfosuccinatos, etc., y ésteres de ácidos sulfúricos, tales como alquil éter sulfatos y alquil sulfatos.

En una realización particular, el detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio (SDS), sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina, hidrato de sal de ácido glicocólico y sus sales.

Los ejemplos de detergentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, polisorbatos, copolímeros de polietilenglicol y copolímeros de polipropilenglicol, tales como, por ejemplo Tween, Span, Poloxamer.

En otra realización particular, el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en toctilfenoxipolioxietanol, N,N-Bis(3-D-gluconamidopropil)colamida, Brij(r) 35 P, N-decanoil-N-metilglutamina digitonina, dodecanoil-N-metilglucamida, heptanoil-N-metilglutamida, octilfenoxipoli(etilenoxi)etanol ramificado, N-nonanoil-N-metilglucamina, Nonidet P 40, N-octanoil-N-metilglutamina, solución Span 20 y polisorbato 20.

En otra realización particular, la solución de lisis comprende además una concentración de hasta 3 M de una sal. Los ejemplos de sales que pueden formar parte de la solución de lisis de la invención incluyen, pero no se limitan a, carbonatos, cloruros, fosfatos, nitratos, nitritos, sulfatos, citratos, carboxilatos (acetatos, formatos, salicilatos, etc.). En una realización particular, la solución de lisis comprende cloruro de sodio (NaCl).

En una realización particular, la solución de lisis proporcionada por esta invención comprende entre 0,001 M y 2 M de Tris, hasta un 3% de SDS y NaCl hasta una concentración de 3 M, a un pH comprendido entre 3 y 11,5. No obstante, los expertos en la técnica entenderá que estos compuestos pueden ser sustituidos por otros equivalentes; por ejemplo, el SDS puede ser sustituido por hasta un 10% de Tritón X-100.

En otra realización particular, la solución de lisis proporcionada por esta invención comprende aproximadamente 0,2 M (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris), aproximadamente 0,025% de SDS, aproximadamente 0,5 M o 0,05 M de cloruro de sodio, y pH 10; en este caso, el SDS puede ser reemplazado con aproximadamente 5% de Triton X-100. En otra realización particular, la solución de lisis proporcionada por esta invención comprende aproximadamente 0,2 M (hidroximetil)-1,3-propanediol, aproximadamente 5% Triton X-100, aproximadamente 1 M de cloruro de sodio, y pH 10.

En otra realización particular, la solución de lisis proporcionada por esta invención comprende aproximadamente 0,3 M de fosfato de sodio dibásico, aproximadamente 2% de SDS, aproximadamente 0,05 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y pH 11,45.

De acuerdo con la solución utilizada y el tipo de muestra, las preparaciones se incuban en la solución de lisis entre 0,5 y 120 minutos, preferentemente entre 1 y 35 minutos, más preferentemente durante aproximadamente 5 minutos; y a una temperatura comprendida entre 1 °C y 45 °C, preferentemente entre 15 °C y 40 °C, más preferentemente entre 22 °C y 37 °C. En una realización particular, la incubación se lleva a cabo a una temperatura de 22 °C. En otra realización particular, la incubación se lleva a cabo a una temperatura de 37 °C.

Una vez añadida la solución de lisis al cultivo bacteriano previamente incubado en presencia de un antibiótico que actúa sobre la pared celular, se detecta la presencia de nucleoide bacteriano en el medio de cultivo [etapa iii)]. Como se ha descrito para el primer procedimiento de la divulgación, la evaluación de la presencia del nucleoide bacteriano en el medio se puede llevar a cabo por microscopía o por cualquier otro procedimiento físico o químico alternativo para detectar el ADN liberado por los microorganismos en el medio de cultivo, que incluyen, sin limitación, la electroforesis, los anticuerpos, la espectrofotometría, la reacción en cadena de la polimerasa, las técnicas de hibridación, las micromatrices, la microfluídica, las nanopartículas, los puntos cuánticos, etc. Estos procedimientos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y su puesta en práctica es una práctica rutinaria para los expertos en la técnica.

Sin embargo, en una realización particular, la detección del nucleoide bacteriano se lleva a cabo por medio de microscopía, para lo cual es necesario inmovilizar una muestra del cultivo resultante de la etapa i) [es decir, después de exponer el cultivo bacteriano a la acción del antibiótico] sobre un soporte tal como un portaobjetos, por ejemplo. En este caso, la etapa ii) del segundo procedimiento de la invención, es decir, la adición de la solución de lisis que sólo afecta a las bacterias cuya pared celular ha sido afectada por el antibiótico, se puede llevar a cabo antes o después de inmovilizar las bacterias sobre dicho soporte. Por lo tanto, en una realización particular el segundo procedimiento de la invención comprende además la inmovilización de una muestra del cultivo sobre un soporte antes o después de la etapa (ii). Los procedimientos y técnicas existentes en el estado de la técnica para la inmovilización de muestras sobre soportes, así como para la preparación de los mismos ya han sido descritos anteriormente en relación con el primer procedimiento de la divulgación y son aplicables al segundo procedimiento de la invención.

Si el tratamiento con la solución de lisis se lleva a cabo después de inmovilizar una muestra del cultivo resultante de la etapa i) en un soporte, tal como un portaobjetos, dicho portaobjetos se sumerge en posición horizontal en un recipiente que contiene la solución de lisis. Tras el tratamiento con la solución de lisis (ya comentada), las preparaciones se pueden lavar para eliminar el resto de esta solución. Para ello, los soportes se introducen en una solución de lavado lo más suave posible, para evitar agentes quelantes o detergentes; a modo de ejemplo, los soportes se pueden sumergir en posición horizontal en un recipiente que contenga mucha agua destilada o una solución tampón o suero fisiológico durante un tiempo comprendido entre 1 y 60 minutos.

A continuación, se deshidrata la muestra. Para ello, se pueden utilizar soluciones con una concentración creciente de alcohol. A modo de ejemplo, los portaobjetos se levantan y se sumergen en recipientes con una serie de concentraciones crecientes de etanol, entre el 5% y el 100%, durante 30 segundos a 60 minutos cada una y posteriormente se dejan secar al aire las preparaciones. La temperatura de los alcoholes puede oscilar entre -20 °C y la temperatura ambiente. Puede ser preferente utilizar alcoholes a -20 °C para mejorar la precipitación del ADN, durante 5 minutos cada uno. Como alternativas a las incubaciones en una serie de etanol, las preparaciones se pueden deshidratar por medio de la incubación en soluciones de diferentes alcoholes, tales como el metanol, o dejando que se sequen al aire o en un horno.

Finalmente, la presencia del nucleoide bacteriano en el medio de cultivo o en el soporte si la muestra ha sido inmovilizada se determina en la etapa iii) del segundo procedimiento de la invención.

En la presente invención, se entiende por "nucleoide bacteriano" la región que contiene ADN en el citoplasma de las células bacterianas. Las pruebas experimentales sugieren que el nucleoide está formado esencialmente por ADN (60%), con pequeñas proporciones de ARN y proteínas. Estos dos últimos componentes actúan como ARN mensajero y como proteínas reguladoras del genoma. En el estado de la técnica, el nucleoide bacteriano también se conoce como "región nuclear" o "cuerpo nuclear". Las técnicas para observar la presencia de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo descritas anteriormente también se pueden utilizar para observar el nucleoide bacteriano, como se requiere en el segundo procedimiento de la invención.

Si la técnica de elección para determinar la presencia del nucleoide bacteriano es la microscopía, entonces, como se ha descrito anteriormente en el primer procedimiento de la divulgación, es conveniente estabilizar y adherir firmemente los fragmentos de ADN a los portaobjetos, dado que se pueden desprender.

Una vez tratadas las muestras y después de que los fragmentos de ADN se estabilicen y se adhieran firmemente a los portaobjetos, se pueden teñir las muestras y evaluar la integridad de la pared celular de los microorganismos. Por lo tanto, en una realización particular del segundo procedimiento de la invención, la observación de la presencia del nucleoide bacteriano en el medio de cultivo se lleva a cabo por medio de tinción. Se puede obtener una alta calidad de imagen y una alta consistencia de los resultados de la evaluación por medio de la selección adecuada de las condiciones de tinción. Las diferentes técnicas de tinción, así como los colorantes que se pueden utilizar para visualizar el ADN por medio de microscopía, se han descrito anteriormente en la presente descripción en relación con el primer procedimiento de la divulgación y se aplican al segundo procedimiento de la invención.

Por lo tanto, en una realización particular la observación de la presencia de nucleoides bacterianos en el medio de cultivo se lleva a cabo por medio de tinción que, en una realización más particular, se lleva a cabo mediante el uso de fluorocromos que, en otra realización aún más particular, se seleccionan del grupo que consiste en Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI, cromomicina A3, mitramicina, bromuro de etidio, naranja de acridina, naranja de tiazol, 7-AAD (7-aminoactinomicina D), derivados de cianina, variantes de fluorocromos TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO y LO-PRO, etc.

La puesta en práctica del segundo procedimiento de la invención requiere, en una primera etapa, añadir a un cultivo bacteriano un antibiótico que actúe sobre la pared celular bacteriana. Cualquiera de los antibióticos descritos anteriormente en el primer procedimiento de la divulgación se puede utilizar en el segundo procedimiento de la invención. Por lo tanto, en una realización particular el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico p-lactámico (que incluyen, pero sin limitarse a, penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbacefem, carbapenems, monobactamas e inhibidores de p-lactamasas tales como ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam, etc.), una isoniazida, una etionamida, un etambutol, una cicloserina y un antibiótico glucopéptido (que incluyen, sin limitación, vancomicina o teicoplanina).

Aplicaciones de los procedimientos de la invención

Como se ha descrito anteriormente, la aplicación práctica del primer procedimiento de la divulgación y del segundo procedimiento de la invención es determinar de forma rápida y fiable si una bacteria es sensible o resistente a un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana. La evaluación de la integridad de la pared bacteriana por medio de cualquiera de los procedimientos de la invención descritos anteriormente en la presente descripción es suficiente para ese propósito.

Por lo tanto, en otro aspecto la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana que comprende las siguientes etapas: i) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria por medio de cualquiera de los procedimientos de la invención, y

ii) determinar la sensibilidad de la bacteria al antibiótico, en el que si la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada, entonces la bacteria es sensible al antibiótico.

Por el contrario, como entienden los expertos en la técnica, si la integridad de la pared celular no ha sido dañada y está intacta (no hay liberación de fragmentos de ADN extracelular o nucleoide en el medio de cultivo), entonces la bacteria no es sensible al antibiótico, la bacteria puede ser una bacteria resistente o una bacteria denominada célula persistente o tolerante. Ambos tipos de bacterias no se ven afectadas por el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana, pero se diferencian en que las bacterias resistentes tienen mutaciones en el ADN de forma que la resistencia al antibiótico es permanente, mientras que las bacterias perseverantes no tienen mutaciones en el ADN para la resistencia, es un estado funcional reversible. Por lo tanto, otras aplicaciones de los procedimientos de la invención consisten en la detección de bacterias resistentes o bacterias perseverantes en una muestra.

Por lo tanto, en otro aspecto la invención se refiere a un procedimiento para identificar una bacteria perseverante o una bacteria tolerante a un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana en un cultivo que contiene bacterias sensibles, que comprende evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en dicho cultivo por medio del segundo procedimiento de la invención, en el que la bacteria cuya integridad de la pared celular no ha sido dañada se identifica como una bacteria perseverante o tolerante.

Otra aplicación práctica de los procedimientos de la invención se relaciona con el diseño de una terapia antibiótica personalizada para un individuo que padece una enfermedad bacteriana, dado que por medio de los procedimientos de la invención se puede determinar si la bacteria que causa la enfermedad bacteriana es sensible o resistente a un antibiótico específico. Si después de aplicar cualquiera de los procedimientos de la invención se encuentra que la bacteria causante de la enfermedad bacteriana es sensible al antibiótico probado, entonces el médico puede tomar la decisión de administrar una terapia basada en dicho antibiótico al individuo que sufre dicha enfermedad bacteriana. Si, por el contrario, la bacteria causante de la enfermedad bacteriana es resistente al antibiótico probado, el médico seleccionará un tratamiento que no se base en dicho antibiótico.

Por lo tanto, en otro aspecto la presente invención se refiere a un procedimiento para diseñar una terapia antibiótica personalizada para un individuo que sufre una enfermedad bacteriana que comprende

i) aislar la bacteria causante de la enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria por medio de uno cualquiera de los procedimientos de la invención,

en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces dicho individuo puede recibir una terapia basada en antibióticos que actúan sobre la pared celular.

En la presente invención, se entiende por "individuo" un miembro de cualquier especie animal, que incluyen, pero sin limitarse a, los mamíferos, en particular, el ganado bovino (vacas, toros, bueyes, yaks, etc.), el ganado ovino (ovejas, etc.), el ganado porcino (cerdos, jabalíes, etc.), el ganado caprino (cabras, etc.), el ganado equino (caballos, yeguas, cebras, etc.), los camélidos (camellos, llamas, alpacas, etc.), conejos, liebres, bisontes, búfalos, ciervos, renos, caribúes, perros, gatos, ratones, primates no humanos (chimpancés, gorilas, orangutanes, macacos, gibones, etc.). En particular, el mamífero es preferentemente un ser humano de cualquier sexo, edad o raza. Los términos "individuo" o "sujeto" son sinónimos y se pueden utilizar indistintamente en la presente descripción.

En la presente invención, se entiende por "enfermedad bacteriana" cualquier enfermedad resultante de una infección bacteriana en un individuo. Los ejemplos de enfermedades bacterianas incluyen, sin limitación, enfermedades causadas por la infección de bacterias de los géneros Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Hemophilus y Bordetella.

La primera etapa del procedimiento para diseñar una terapia antibiótica personalizada para un individuo que sufre una enfermedad bacteriana comprende el aislamiento de la bacteria causante de dicha enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo.

Como es sabido por los expertos en la técnica, una buena selección, recolección y transporte de la muestra, así como un buen procesamiento de la misma para el correcto aislamiento de los microorganismos, son esenciales para garantizar unos buenos resultados. Por ejemplo, la muestra debe ser representativa del proceso infeccioso y se debe tomar del lugar anatómico correcto, se debe recolectar en cantidad suficiente para asegurar un examen adecuado, se deben utilizar dispositivos estériles durante la recolección, etc. Se puede encontrar más información sobre los procedimientos y materiales utilizados en la recolección de muestras en Rotger, R. (editor), 1997 (mencionado ad supra).

Además, en la presente descripción se han descrito los antibióticos que actúan sobre la pared celular y que se pueden administrar al individuo en función de la conclusión a la que se llegue.

Los expertos en la técnica entenderán que los procedimientos de la invención también se pueden utilizar para identificar nuevos compuestos antibióticos que actúen sobre la pared celular. Por lo tanto, en otro aspecto la invención se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana que comprende:

i) poner en contacto un cultivo que contenga una bacteria sensible a un antibiótico que actúe sobre la pared celular en presencia del compuesto antibiótico candidato, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria por medio de cualquiera de los procedimientos de la invención,

en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces el compuesto antibiótico candidato es un compuesto antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana.

En la presente invención, "compuesto que actúa sobre la pared celular bacteriana" se entiende como un compuesto que interfiere en cualquiera de las etapas de la síntesis de la pared celular bacteriana o afecta a su estructura. La primera etapa del procedimiento de identificación de compuestos que actúan sobre la pared celular comprende poner en contacto un cultivo de una bacteria sensible a los antibióticos que actúan sobre la pared celular en presencia del compuesto candidato. Algunos ejemplos de bacterias sensibles a los antibióticos que actúan sobre la pared celular son, entre otros, la cepa de E . col i sensible a la amoxicilina, la cepa de Enterococcus faecalis sensible a la ampicilina, la cepa de Acinetobacter baumannii sensible a la iminepen, la cepa de E. coli sensible a la ceftazidima, etc. Se puede encontrar más información sobre la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos p-lactámicos en el estado del arte (Directrices del CLSI de junio de 2010).

Solución de lisis de la invención

La presente invención se basa en que una consecuencia de la actividad que los antibióticos que actúan sobre la pared celular tienen sobre las bacterias es la liberación de fragmentos de ADN extracelular en el medio de cultivo. Además, cuando el cultivo bacteriano es un cultivo mixto o contaminado, es decir, hay una mezcla de células sensibles o resistentes, la observación de los fragmentos de ADN extracelular no sería muy adecuada como criterio estricto de discriminación porque, a pesar de la liberación de fragmentos de ADN extracelular, la morfología de las bacterias no se modifica por la acción del antibiótico, es decir, tanto las bacterias sensibles como las resistentes al antibiótico muestran una pared celular aparentemente intacta. Para resolver este problema, los inventores diseñaron una solución de lisis que sólo afecta a las bacterias cuya pared celular ha sido previamente dañada por la acción de un antibiótico que actúa sobre la pared celular.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una solución de lisis, en adelante solución de lisis de la invención, caracterizada porque sólo afecta a las bacterias que tienen la pared bacteriana dañada por la acción de un antibiótico, y se define como en la reivindicación 12 anexa.

La solución de lisis que afecta específicamente a las bacterias que tienen la pared celular dañada por el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana comprende básicamente una solución tampón que tiene un pH entre 3 y 11,5 pero que, como se describe en los aspectos inventivos precedentes, puede comprender adicionalmente otros componentes, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, detergentes iónicos, detergentes no iónicos, sales, etc. en diferentes proporciones.

Por lo tanto, en una realización particular, la solución de lisis de la invención comprende además hasta un 3% de un detergente iónico o un detergente no iónico. En una realización específica, dicho detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina, hidrato de sal de ácido glicocólico y sus mezclas. En otra realización específica, dicho detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en t-octilfenoxipolietiletanol, N,N-Bis(3-D-gluconamidopropil)colamida, Brij(r) 35 P, N-decanoil-N-metilglutamina, digitonina, dodecanoil-N-metilglutamida, heptanoil-N-metilglutamida, octilfenoxipoli(etilenoxi)etanol ramificado, N-nonanoil-N-metilglutamina, Nonidet P 40, N-octanoil-N-metilglutamina, solución Span 20 y polisorbato 20. En otra realización específica, la solución de lisis comprende además una concentración de hasta 3 M de una sal, por ejemplo, carbonatos, cloruros, fosfatos, nitratos, nitritos, sulfatos, citratos, carboxilatos (acetatos, formatos, salicilatos, etc.); en una realización particular, la solución de lisis comprende cloruro de sodio (NaCl).

En una realización particular de la invención, la solución de lisis proporcionada por esta invención comprende entre 0,001 M y 2 M de Tris, hasta el 3% de SDS, y hasta 3 M de concentración de NaCl, a un pH comprendido entre 3 y 11,5. No obstante, los expertos en la técnica entenderá que estos compuestos pueden ser sustituidos por otros equivalentes; por ejemplo, el SDS puede ser sustituido por hasta un 10% de Tritón X-100.

En otra realización particular de la invención, la solución de lisis proporcionada por esta invención comprende aproximadamente 0,2 M (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris), aproximadamente 0,025% de SDS, aproximadamente 0,5 M o 0,05 M de cloruro de sodio, y pH 10; en este caso, el SDS se puede sustituir por aproximadamente 5% de Triton X-100.

En otra realización particular de la invención, la solución de lisis proporcionada por esta invención comprende aproximadamente 0,2 M (hidroximetil)-1,3-propanediol, aproximadamente 5% de Triton X-100, aproximadamente 1 M de cloruro de sodio, y pH 10.

En otra divulgación particular, la solución de lisis comprende aproximadamente 0,3 M de fosfato de sodio dibásico, aproximadamente 2% de SDS, aproximadamente 0,05 M de ácido etilendiamino-tetraacético (EDTA) y pH 11,45. En la descripción del segundo procedimiento de la invención se pueden encontrar más detalles y explicaciones sobre las diferentes realizaciones particulares de la solución de lisis de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la solución de lisis de la invención para evaluar la pared celular bacteriana. La información relativa a cómo la solución de lisis de la invención se puede utilizar para evaluar la pared celular bacteriana se puede encontrar en la descripción del primer y segundo procedimiento de la invención.

Kit de la invención

La puesta en práctica de los procedimientos de la invención requiere una serie de componentes que se pueden proporcionar juntos en forma de paquete o kit, en adelante kit de la invención. Los componentes útiles para poner en práctica los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, la solución tampón, la solución de lisis, los colorantes, el material estéril para la recolección de muestras (bastoncillos de algodón, hisopos, pinzas, etc.), cubreobjetos y portaobjetos, agua destilada, alcoholes (etanol), etc. Además, el kit de la invención puede contener instrucciones o indicaciones que guíen a los expertos en la técnica a poner en práctica los procedimientos de la invención.

Por lo tanto, en otro aspecto la invención se refiere a un kit que comprende la solución de lisis de la invención. Los siguientes ejemplos sólo ilustran la invención y no pretenden limitarla.

Ejemplos

Materiales y procedimientos

Material y equipo necesarios

Microscopio de fluorescencia (se recomienda un objetivo de inmersión) Refrigerador a 4 °C

Horno a 37 °C

Horno o fuente a 80 °C (opcional)

Baño de incubación a 37 °C

Guantes de plástico

Cubierta de vidrio (18*18 mm, 22*22 mm o 24*60 mm)

Micropipetas

4 casos de incubación horizontal

Agua destilada

70%, 90%, 100% de etanol

Preparación de una muestra por portaobjetos

1) Colocar la solución de lisis en un recipiente de incubación horizontal tapado en una estufa a 37 °C.

2) Diluir la muestra de microorganismos en un medio de cultivo o PBS a una concentración de 5 a 10 millones por mililitro.

Preparación del microgel de agarosa

1) Introducir el tubo Eppendorf con agarosa gelificada en el flotador, dejándolo a nivel de la tapa, y dejarlo flotar durante 5 minutos en agua a 90-100 °C hasta que la agarosa se funda. La agarosa se puede fundir alternativamente en un horno de microondas.

2) Transferir el tubo Eppendorf con el flotador a un baño termostático a 37 °C, y dejarlo durante 5 minutos hasta que se equilibre la temperatura.

3) Añadir 60 |jl de la muestra de microorganismos al contenido del tubo Eppendorf y resuspender con la micropipeta.

4) Colocar un portaobjetos pretratado sobre una superficie fría a 4 °C (por ejemplo, una lámina de metal o de vidrio).

5) Una vez frío el portaobjetos, depositar la suspensión de microorganismos con agarosa y colocar un cubreobjetos de vidrio, para evitar la formación de burbujas de aire. Se recomienda depositar una gota de 12, 20 o 50 microlitros para un cubreobjetos de 18x18 milímetros, 22*22 milímetros o 24*60 milímetros, respectivamente.

6) Introducir la lámina fría con el portaobjetos en la nevera y dejar que la muestra se gelifique durante 5 minutos.

Procesamiento de las muestras

1) Retirar el cubreobjetos deslizándolo suavemente con guantes, e introducir inmediatamente el portaobjetos en posición horizontal en el recipiente con la solución de lisis, tapar y dejar incubar durante 5 minutos en la estufa o baño a 37 °C.

2) Levantar el portaobjetos con la ayuda de una lanceta mediante el uso de guantes. Sujetar el portaobjetos en posición horizontal y depositarlo horizontalmente en una caja que contenga abundante agua destilada o solución tampón para lavar la solución de lisis. Dejar incubar durante 5 minutos.

3) Introducir el portaobjetos horizontalmente en un estuche con etanol al 70% (3 minutos), posteriormente en otro estuche con etanol al 90% (3 minutos), y finalmente en etanol al 100% (3 minutos), a -20 °C.

4) Dejar secar al aire, e incubar en un horno de microondas a 500 a 1000 W durante 1 a 10 minutos, o en su defecto, en un horno a 80 °C durante al menos una hora o toda la noche. Una vez secas, las diapositivas procesadas se pueden guardar en cajas de archivo a temperatura ambiente y en la oscuridad durante meses. Tinción de muestras para su observación al microscopio de fluorescencia

Dependiendo de la disponibilidad de filtros de fluorescencia, las muestras se pueden teñir con fluorocromos específicos de ADN del tipo EvaGreen (verde) o GelRed (rojo). Los fluorocromos de la familia SYBR, concretamente SYBR Gold, permiten una buena resolución con cierta fotoestabilidad.

Almacenamiento y estabilidad

Conservar a temperatura ambiente.

Vida útil: los reactivos y materiales son estables durante un período de al menos 6 meses. Se recomienda mantener la solución de lisis en posición vertical y bien cerrada.

Determinación de la integridad de la pared celular

Una alícuota de cada muestra se diluyó hasta una concentración de 5 a 10 millones de microorganismos/mL en medio líquido Mueller-Hinton, se incubaron con el antibiótico en medio líquido Mueller-Hinton. Por otro lado, los tubos de microcentrífuga de 0,5 mL que contenían alícuotas gelificadas de agarosa de bajo punto de fusión se colocaron en un baño de agua a 90 °C-100 °C durante aproximadamente 5 minutos para fundir la agarosa completamente y posteriormente se colocaron en un baño de agua a 37 °C. A continuación, se añadieron 25 j l de la muestra diluida a dichos tubos y se mezclaron con la agarosa fundida. Se pipeteó una alícuota de 20 j l de la mezcla muestra-agarosa sobre un portaobjetos que había sido previamente recubierto (por ejemplo, con una película de agarosa) y se revistió la muestra con un cubreobjetos de 22x22 mm. El portaobjetos se colocó en un plato frío en una nevera (4 °C) durante 5 minutos para permitir que la agarosa formara un microgel con las células intactas atrapadas en él. Se retiró cuidadosamente el cubreobjetos y se sumergió inmediatamente el portaobjetos en posición horizontal en una solución de lisis durante 5 minutos a 37 °C para las bacterias Gram+ (grampositivas) y a 22 °C para las bacterias Gram-(gramnegativas). El portaobjetos se lavó horizontalmente en una bandeja con abundante agua destilada durante 3 minutos, se deshidrató incubándolo horizontalmente en etanol frío (-20 °C) a una concentración creciente (70%, 90% y 100%) durante 3 minutos en cada concentración y se secó al aire en un horno. El portaobjetos seco se incubó en un horno microondas a 750 W durante 4 minutos y el ADN se tiñó con 25 j l de SYBR Gold (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) diluido 1:400 en tampón TBE (Tris-borato 0,09 M, EDTA 0,002 M, pH 7,5) durante 2 minutos en la oscuridad, con un cubreobjetos de vidrio. Tras un breve lavado en tampón fosfato de pH 6,88 (Merck, Darmstadt, Alemania), se añadió un cubreobjetos de 24*60 mm y se observaron los portaobjetos por medio de microscopía de fluorescencia.

Microscopía de fluorescencia y análisis digital de imágenes

Las imágenes se observaron en un microscopio de epifluorescencia (Nikon E800), con un objetivo de 100x y filtros de fluorescencia adecuados para FITC-SYB^r Gold (excitación a 465 nm, emisión a 515 a 555 nm), PI-Cy3 (excitación a 540/25 nm, emisión a 605/55 nm) y DAPI (excitación a 340 a 380 nm, emisión a 435 a 485 nm). En el experimento de dosis-respuesta a la ampicilina, las imágenes se capturaron con una cámara CCD de alta sensibilidad (KX32ME, Apogee Instruments, Roseville, CA, USA). Se obtuvieron grupos de imágenes digitales de 16 bits y se archivaron como archivos .tiff. Para el análisis de las imágenes se utilizó una macro del programa Visilog 5.1 (Noesis, Gif sur Yvette, Francia). Esto permitió determinar el umbral, restar el fondo y medir el tamaño de la anchura media del halo de los nucleoides en |jm, delimitado entre el extremo periférico del nucleoide y el límite exterior del cuerpo celular. En el caso de los cuerpos celulares no reconocidos, se consideró el centroide del nucleoide como punto de referencia interno para medir la anchura del halo del nucleoide disperso.

Ejemplo 1

Confirmación de que la técnica funciona: liberación del nucleoide bacteriano y de los restos de la pared difusa y/o de los productos bacterianos en las bacterias sensibles a un antibiótico que actúa sobre la pared bacteriana

Se expusieron tres cepas diferentes de Escherichia coli al antibiótico p-lactámico, amoxicilina, junto con el inhibidor de la p-lactamasa, ácido clavulánico, y se procesaron por medio de la técnica para evaluar la integridad de la pared celular de la presente invención. Las bacterias que crecían en el medio líquido Mueller-Hinton se incubaron con el antibiótico en el medio líquido Mueller-Hinton para la fase de crecimiento exponencial a 37 °C, con agitación, durante 40 minutos. Las dosis de antibiótico se eligieron de acuerdo con los puntos de corte indicados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). De acuerdo con sus recomendaciones, una cepa se considera sensible cuando su concentración mínima inhibitoria (CMI) es < 8/4 (amoxicilina: 8 jg/mL y ácido clavulánico: 4 jg/mL) y resistente cuando su CIM es > 32/16 (amoxicilina: 32 jg/mL y ácido clavulánico: 16 jg/mL). De acuerdo con los datos de difusión en disco, una de las cepas es una cepa sensible, otra cepa es una cepa con sensibilidad intermedia y la cepa restante es una cepa resistente.

Los resultados se muestran en la Figura 1. Tras una dosis de 8/4, sólo se lisan las bacterias de la cepa sensible, que muestra los nucleoides (a'). Tras una dosis de 32/16, la cepa sensible y la cepa con sensibilidad intermedia se lisan (a" y b"), mientras que la cepa resistente no se lisa (c"). Sin embargo, en algunas células aisladas se aprecian algunos daños en la pared celular. Cuando el antibiótico es eficaz, además de la liberación y propagación de nucleoides, se observa un fondo microgranular-fibrilar homogéneo y difuso de fragmentos de ADN extracelular desprendidos por las células.

Ejemplo 2

Evaluación de la sensibilidad o resistencia a los antibióticos B-lactámicos en diversas cepas de E. coli aisladas de un hospital

Tras los resultados del experimento anterior (Ejemplo 1), se estudiaron 11 cepas diferentes de E. coli aisladas en un Servicio de Microbiología. Tras crecer en una placa con medio Mueller-Hinton durante 24 horas, se expusieron a amoxicilina junto con ácido clavulánico en medio líquido Mueller-Hinton durante 1 hora, tras lo cual se procesaron por medio de la técnica de evaluación de la integridad de la pared celular de acuerdo con la presente invención. Como en el ejemplo 1, las dosis fueron 0, 8/4 y 32/16 (amoxicilina/ácido clavulánico).

De acuerdo con el protocolo de la invención:

- Tres cepas mostraron una lisis completa de la pared y un fondo intenso de fragmentos de ADN extracelular incluso a una dosis baja (8/4), estas cepas se categorizan como sensibles.

- 5 cepas sólo mostraron una lisis completa de la pared y un fondo intenso de fragmentos de ADN extracelular a una dosis alta (32/16), estas cepas se consideran como cepas con sensibilidad intermedia.

- Dos cepas mostraron células no lisadas junto con otras moderadamente lisadas, con un fondo muy tenue o la ausencia de fondo de fragmentos de ADN extracelular a una dosis alta. Estas cepas se clasificaron como cepas resistentes.

Los resultados de la técnica fueron consistentes con los proporcionados por el Laboratorio de Microbiología.

La conclusión práctica del experimento es que las cepas sensibles se pueden distinguir claramente del resto mediante el uso de una sola dosis, concretamente la dosis baja (8/4). Esto puede simplificar en gran medida el estudio exhaustivo de múltiples cepas, dado que desde el punto de vista clínico, lo importante para tomar una decisión terapéutica es distinguir las "sensibles" de las "no sensibles". En el caso de una cepa con sensibilidad intermedia a un antibiótico específico, no se administraría dicho antibiótico y se utilizaría otro antibiótico alternativo al que la cepa es completamente sensible.

Ejemplo 3

Determinación del tiempo mínimo de incubación con un antibiótico B-lactámico que permite detectar un efecto sobre la pared en la cepa sensible y la cepa con sensibilidad intermedia de E. coli. Evaluación de las bacterias procedentes del cultivo en placa o del cultivo líquido

Una cepa sensible, una cepa con sensibilidad intermedia y otra cepa resistente de E. coli se expusieron a amoxicilina junto con ácido clavulánico en medio líquido de Mueller-Hinton y se procesaron por medio de la técnica para evaluar la integridad de la pared celular de la presente invención. Las dosis (amoxicilina/ácido clavulánico) fueron: 8/4 (baja) y 32/16 (alta). Los tiempos de incubación con el antibiótico fueron de 5, 10, 20, 30, 40, 60 y 75 minutos.

A) Se observó lo siguiente cuando las bacterias procedían de un cultivo en placa de 24 horas:

- En la cepa sensible, se observó un efecto muy sutil a la dosis alta (32/16) con un cierto fondo de fragmentos de ADN extracelular y una sutil lisis celular a partir de los 20 minutos. Este sutil efecto se observó 40 minutos después de la dosis baja (8/4), mientras que fue algo mayor con la dosis alta. El efecto se hizo máximo con un fondo sutil de fragmentos de ADN extracelular y la lisis de prácticamente todas las células 60 minutos después de la dosis baja, y un fondo y lisis extensos después de la dosis alta.

- La cepa con sensibilidad intermedia empezó a mostrar un efecto claro mucho más tarde que la cepa sensible, 60 minutos y sólo después de la dosis alta (32/16). Este efecto fue más evidente a partir de los 75 minutos. - La cepa resistente no mostró ningún efecto, aunque 75 minutos después de la dosis alta (32/16), algunas células aisladas se lisaron moderadamente tal como en la Figura 1c".

B) Se observó lo siguiente cuando las bacterias procedían de un cultivo líquido en fase de crecimiento exponencial:

- En la cepa sensible, se empezó a observar un efecto después de 10 minutos. Esto fue muy sutil en la dosis baja (8/4) y más prominente con la dosis alta (32/16). La intensidad del efecto aumentó progresivamente, a los 30 minutos el efecto fue muy similar al observado a los 60 minutos en bacterias procedentes de un cultivo en placa.

- La cepa con sensibilidad intermedia empezó a mostrar un efecto claro mucho más tarde que la cepa sensible, a los 30 a 40 minutos y sólo después de la dosis alta (32/16). Este efecto fue más evidente a partir de los 60 minutos.

- La cepa resistente no mostró ningún efecto, aunque 60 minutos después de la dosis alta (32/16), algunas células aisladas se lisaron moderadamente tal como en la Figura 1c".

En conclusión:

1) El estado de crecimiento de las bacterias influye en la sensibilidad al antibiótico. Es bien sabido que las células que no crecen y que están en fase estacionaria reducen considerablemente su sensibilidad a los antibióticos p-lactámicos.

2) Desde el punto de vista práctico, para distinguir con seguridad las cepas sensibles de E. coli de las demás, basta con incubarlas con el antibiótico durante 30 minutos si están en fase de crecimiento exponencial (cultivo líquido fresco), o durante 40 a 60 minutos si proceden de un cultivo en placa de 24 horas. Si la placa es más antigua o el cultivo líquido ha alcanzado la fase exponencial, el tiempo de incubación de la muestra de bacterias con el antibiótico en un medio líquido se puede prolongar durante varias horas. Al evaluar las muestras clínicas, es recomendable procesar simultáneamente una cepa sensible, una cepa con sensibilidad intermedia y una cepa resistente como un control de la actividad antibiótica y de la eficacia de la técnica. Ejemplo 4

Determinación de la sensibilidad o resistencia de diferentes gérmenes Gram+ y Gram- a diferentes antibióticos betalactámicos (penicilinas, cefalosporina y carbapenem)

Diferentes cepas bacterianas cultivadas en una placa con medio Mueller-Hinton durante 24 horas fueron expuestas posteriormente a un antibiótico p-lactámico durante 60 minutos en medio líquido Mueller-Hinton a 37 °C, bajo agitación, y finalmente fueron procesadas por medio de la técnica de evaluación de la integridad de la pared celular de acuerdo con la presente invención.

Las cepas y los antibióticos utilizados fueron:

Gram+

Enterococcus faecalis. Cepa sensible a la ampicilina (CIM = 4) y resistente a la bencilpenicilina (CIM > 32). Enterococcus faecium. Cepa resistente a la ampicilina (CIM > 32) y a la bencilpenicilina (CIM > 32).

Gram-Acinetobacterbaumannii. Cepa resistente a imipenem (CIM > 32) y a ceftazidima (CIM > 32).

Acinetobacter baumannii. Cepa sensible al imipenem (CIM = 0,38) y con sensibilidad intermedia a la ceftazidima (CIM = 12).

Escherichia coli. Cepa sensible a la ceftazidima (CIM = 1) con sensibilidad intermedia a la ampicilina (CIM = 16). Escherichia coli. Cepa resistente a la ampicilina (CIM > 256) y a la ceftazidima (CIM = 32).

Las dosis de antibiótico aplicadas fueron 0, la CIM determinada en el Laboratorio de Microbiología por medio de la técnica de microdilución y/o E-test, y las de los puntos de corte de sensibilidad y resistencia indicados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para cada cepa. También se utilizó una dosis 10 veces superior a la CIM. Los puntos de corte de los antibióticos varían para cada cepa:

Enterococcus. Ampicilina < 8 (Sensible) > 16 (Resistente)

Acinetobacter. Ceftazidima < 8 (Sensible) > 32 (Resistente)

Imipenem < 4 (Sensible) > 16 (Resistente)

E. coli. Ampicilina < 8 (Sensible) > 32 (Resistente)

Ceftazidima < 8 (Sensible) > 32 (Resistente)

Resultados

Gram+

■ Enterococcus faecalis. Cepa sensible a la ampicilina (CIM = 4) y resistente a la bencilpenicilina (CIM > 32).

- Incubación con ampicilina: 0, 4 (CIM), 8, 12, 16, 40 pg/mL. Tras la incubación con una dosis de 4 pg/mL (CIM), se observó el efecto sobre la pared en la mayoría de las células, que se lisaron de forma heterogénea con un fondo sutil que contenía fragmentos de ADN. Muy lisado: 35%; moderadamente lisado: 25%; lisado con ADN fragmentado: 12%; no lisado: 28%. Se observó un resultado similar tras incubar con una dosis de 8, 12 y 16 pg/mL. Después de una dosis de 40 pg/mL, el fondo se vuelve muy tenue con muy pocas células, el 63% no se lisan, el 15% tienen un pequeño halo que indica un efecto en la pared, el 20% tienen un gran halo de lisis, y el 2% se lisan con nucleoide de ADN fragmentado (Figura 2).

- Incubación con bencilpenicilina: 0, 0,06, 16, 32, 320 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 16 pg/mL, se observa un cierto fondo que aumenta un poco después de incubar con dosis de 32 y 320 pg/mL. Tras incubar con una dosis de 16 pg/mL, hay un 4,5% de células lisadas con un gran halo. el 81% de las células no se lisan. Después de incubar con una dosis de 32 pg/mL: 4% con un gran halo y 4% lisado con nucleoide con ADN fragmentado. El 65% de las células no se lisan. Después de incubar con una dosis de 320 pg/mL: El 72,3% no está lisado y el 25% tiene un pequeño halo. Después de incubar con una dosis de 16, 32 y 320 pg/mL, se observan numerosas cápsulas vacías y débiles: 0,5-1,5%.

■ Enterococcus faecium. Cepa resistente a la ampicilina (CIM > 32) y a la bencilpenicilina (CIM > 32).

- Incubación con ampicilina: 0, 8, 12, 16, 32 (CIM), 320 pg/mL. Tras incubar con una dosis de 320 pg/mL, se observa cierto efecto con un fondo sutil con un 7,5% de células muy lisadas, un 1% de células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, un 2% de células con un pequeño halo y un 89% no lisadas (Figura 3).

- Incubación con bencilpenicilina: 0, 0,06, 16, 32, 320 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 320 pg/mL, no hay fondo pero se observa un 5% de células muy lisadas. Las células restantes no se lisan. Gram-■ Acinetobacter baumannii. Cepa resistente a imipenem (CIM > 32) y a ceftazidima (CIM > 32). Esta cepa muestra un fondo muy sutil de referencia.

- Incubación con imipenem: 0, 4, 8, 16, 32, 320 pg/mL. Tras la incubación con una dosis de 16 pg/mL, no hay fondo de fragmentos de ADN extracelular, y se observa un 1% de células con un halo grande, un 1% de células con un halo pequeño y un 0,5% de células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado. Tras la incubación con una dosis de 32 pg/mL, se observa un resultado similar al de la incubación con una dosis de 16 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 320 pg/mL, se observa un fondo sutil de fragmentos de ADN extracelular, pero el 92% de las células no están lisadas, el 2,5% de las células lisadas con un pequeño halo, el 3,5% de las células muy lisadas y el 2% de las células lisadas con nucleoide con ^a Dⁿ fragmentado. Las células no lisadas son más grandes y redondas.

- Incubación con ceftazidima: 0, 8, 20, 32, 256, 2,560 pg/mL. Tras la incubación con una dosis de 8 pg/mL, el 22% de las células son muy alargadas y filamentosas. En las dosis posteriores, el 90% de las células son filamentosas. Después de incubar con una dosis de 20 y 32 pg/mL: El 84,5% de las células muestran un halo pequeño, el 1,5% de las células muestran un halo grande, sin fondo de fragmentos de ADN extracelular. Después de incubar con una dosis de 256 pg/mL: El 32,3% de las células están muy lisadas, el 63% de las células muestran un pequeño halo, el 4,7% no están lisadas, con un fondo sutil. Tras incubar con una dosis de 2.560 pg/mL, persiste el mismo fondo, el 5% de las células no se lisan, el 6,5% de las células muestran un halo pequeño, el 63,5% de las células muestran un halo grande y el 25% se lisan con nucleoides con ADN fragmentado.

■ Acinetobacter baumannii. Cepa sensible al imipenem (CIM = 0,38) con sensibilidad intermedia a la ceftazidima (CIM = 12). Esta cepa no tiene un fondo de referencia.

- Incubación con imipenem: 0, 0,038, 0,38 (CIM), 4, 8, 16 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 0,038 pg/mL, hay un pequeño fondo. El 75,7% de las células no están lisadas y sólo hay un 1,4% de células con un halo grande y un 22,9% de células con un halo pequeño. Después de 0,38 pg/mL, hay un fondo claro. El 75,7% de las células están muy lisadas con un halo grande, el 5,9% de las células tienen un halo pequeño y el 7,4% están lisadas con nucleoide con ADN fragmentado. Tras la incubación con una dosis de 4, 8 y 16 pg/mL, se observa el fondo y numerosas cápsulas vacías tenues (12% a una dosis de 4 pg/mL; 19,5% a una dosis de 8 pg/mL; 15% a una dosis de 16 pg/mL) . Hay numerosas células lisadas con nucleoides con ADN fragmentado (66% a una dosis de 4 pg/mL; 69,5% a una dosis de 8 pg/mL; 73,5% a una dosis de 16 pg/mL) . Hay pequeñas células con un gran halo (13,5% a una dosis de 4 pg/mL; 6% a una dosis de 8 pg/mL; 5% a una dosis de 16 pg/mL) y algunas células no lisadas (8,5% a una dosis de 4 pg/mL; 5% a una dosis de 8 pg/mL; 6,5% a una dosis de 16 pg/mL).

- Incubación con ceftazidima: 0, 8, 12 (CIM), 20, 32, 120 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 8 pg/mL, hay un 82% de células filamentosas con un total del 40% de células lisadas con un pequeño halo y un 1% de células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, sin fondo. Tras incubar con una dosis de 12 pg/mL (CIM) y 20 pg/mL, hay un 95% de células filamentosas, con un 94,5% y 91,5% de células lisadas con un halo pequeño, respectivamente, y un 1,5% y 3% de células lisadas con un halo grande, respectivamente, y un 4% y 5,5% de células no lisadas, respectivamente; con una dosis de 12 pg/mL, hay un fondo sutil que aumenta tras una dosis de 20 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 32 pg/mL, hay más fondo, 90% de células alargadas y 88% de células lisadas con un halo pequeño, 6% de células lisadas con un halo grande y 6% de células no lisadas. Tras la incubación a una dosis de 120 pg/mL, se observa un amplio fondo y hay un 91% de células filamentosas y un 23% de células lisadas con un halo grande, un 67% de células lisadas con un halo pequeño, un 36% de células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado y un 7% de células no lisadas

■ Escherichia coli. Cepa sensible a la ceftazidima (CIM = 1) con sensibilidad intermedia a la ampicilina (CIM = 16).

- Incubación con ampicilina: 0, 8, 16 (CIM), 20, 32, 160 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 8 pg/mL, ya se observa un amplio fondo y el 55% de las células están fuertemente lisadas, además del 9% lisado con nucleoide con ADN fragmentado. Después de incubar con una dosis de 16 pg/mL (CIM): 60,4% de células lisadas con un gran halo, 5,7% de células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, 22,6 cápsulas vacías, 11,3% de células no lisadas. Después de incubar con una dosis de 20 pg/mL: hay muy pocas células. El 47,3% de las células muestran un gran halo, el 8,6% son células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, el 31,2% cápsulas vacías y el 12,9% células no lisadas. Después de incubar con una dosis de 32 y 160 pg/mL, hay muy pocas células, habiendo un 54% de cápsulas vacías.

- Incubación con ceftazidima: 0, 1 (CIM), 8, 10, 20, 32 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 1 pg/mL, hay un 99% de células filamentosas, un 97% fuertemente lisadas con algo de fondo (Figura 4). Tras incubar con una dosis de 8 pg/mL, el resultado es similar al obtenido al incubar con una dosis de 1 pg/mL, pero con más fondo. Tras la incubación con una dosis de 10 pg/mL, se obtiene un 76,5% de células bien lisadas, un 11% de células lisadas con nucleoide con a Dn fragmentado y un 10,5% de cápsulas vacías con amplio fondo. Después de incubar con una dosis de 20 y 32 pg/mL, el daño es excesivo con un 25,3% de cápsulas vacías y un 20% de células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, un 52,7% de células bien lisadas y un 2% de células no lisadas.

■ Escherichia coli. Cepa resistente a la ampicilina (CIM>256) y a la ceftazidima (CIM = 32).

- Incubación con ampicilina: 0, 8, 20, 32, 256, 2560 pg/mL. Tras la incubación con una dosis de 256 pg/mL, sólo se observa un 0,5% de células lisadas y un 1% de lisados con nucleoide con ADN fragmentado, sin fondo, similar al valor de referencia y a las dosis precedentes. Tras incubar con una dosis de 2.560 pg/mL, las células son más alargadas aunque no filamentosas; el 13% de las células están muy lisadas, el 5% moderadamente lisadas, el 1,5% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado y el 4% con cápsulas vacías, con un fondo sutil.

- Incubación con ceftazidima: 0, 8, 20, 32 (CIM), 320 pg/mL. Después de incubar con una dosis de 8 pg/mL, hay un 13% de células filamentosas, sólo un 1% de células bien lisadas. Después de incubar con una dosis de 20 pg/mL, hay un 99% de células filamentosas, un 94% no lisadas; un 5% de células bien lisadas y sin fondo. Tras la incubación con una dosis de 32 pg/mL, hay un 98% de células filamentosas, un 92% de células no lisadas, un 4% de células bien lisadas, un 3% de células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, un 1% de cápsulas vacías, con un fondo sutil. Tras incubar con una dosis de 320 pg/mL, se observa un fondo sutil con un 99% de células filamentosas y un 95% de células moderadamente lisadas, un 3,5% muy lisadas, un 0,5% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado y un 1% no lisadas.

Ejemplo 5

Detección in situ de células persistentes en la población bacteriana y cuantificación de su frecuencia El fenómeno de la persistencia después de los tratamientos antibióticos tiene un gran interés clínico. En una población de cepas bacterianas, a pesar de ser sensibles al antibiótico, puede haber algunas células que toleren el antibiótico sin tener ningún mecanismo de resistencia conocido, dichas células están inactivas o son de crecimiento lento. Después de retirar el antibiótico, algunas de estas células podrían volver a crecer y podrían ser responsables de la infección recurrente cuando se recibe un tratamiento antibiótico discontinuo. Estos células persistentes se pueden encontrar en una baja proporción cuando las bacterias crecen exponencialmente, pero su frecuencia aumenta cuando entran en la fase estacionaria y durante la formación de biofilms (Lewis K. Persister cells, dormancy andinfectious disease. Nat. Rev. Microbiol. 2007;5:48 a 56).

En el caso de los antibióticos p-lactámicos, se considera que las células persistentes carecen o tienen desactivado el sistema de autolisis de la pared que se activa después del tratamiento antibiótico. La metodología de la invención podría revelar estas células, para de ese modo dotarla de un gran valor. Se podrían detectar en cultivos que contienen células sensibles a un antibiótico de una manera mucho más sencilla que otros procedimientos existentes en la actualidad, tales como el seguimiento del crecimiento celular por medio de técnicas de microscopía de lapso de tiempo o citometría de flujo. Estas metodologías son complejas, laboriosas, costosas y no se pueden utilizar a nivel clínico (Roostalu J, Joers A, Luidalepp H, Kaldalu N, Tenson T. Cell division in Escherichia coli cultures monitored at single cell resolution. BMC Microbiol. 2008;8:68).

La Figura 5 muestra células de una cepa sensible de E. coli procedentes de un cultivo en medio líquido, que crecen en fase exponencial, sensible a la amoxicilina/ácido clavulánico, y expuestas a una dosis alta (32/16) durante 90 minutos. Además de las células con la pared afectada y del fondo de fragmentos de ADN extracelular, se observa claramente una célula con morfología intacta que no ha sido afectada en absoluto por el antibiótico y que lógicamente debe corresponder a una célula persistente.

Dado que las células persistentes no crecen, su proporción relativa en el portaobjetos debe aumentar progresivamente a medida que aumenta el tiempo de incubación con el antibiótico y las células sensibles desaparecen gradualmente del cultivo. Este fenómeno también se podría producir cuando la cepa se incuba con dosis progresivamente crecientes de antibiótico durante un tiempo determinado. En realidad, si los resultados se ajustaran a la cantidad de células presentes tras la incubación con el antibiótico, las células sin halo (células persistentes) se mantendrían constantes independientemente de la dosis de antibiótico o del tiempo de incubación con el mismo, dado que no crecen, mientras que el resto de células sensibles con halo disminuirían progresivamente al desaparecer del cultivo. Con estos dos tipos de experimentos, entre otros, se puede determinar si las células no lisadas corresponden a células persistentes.

A) Incubación con dosis creciente de antibiótico. Una cepa de E. coli sensible a la ampicilina se incuba con dosis crecientes del antibiótico durante 60 minutos. La Tabla 1 muestra que el porcentaje de células no lisadas aumenta con la dosis de antibiótico, mientras que el porcentaje de células lisadas disminuye en consecuencia. Si se ajustan a la DO 600 relativa, es decir, al número relativo de células en el cultivo después de cada dosis, se observa que la proporción relativa de células no lisadas tiende a situarse entre 5 y 8,5, mientras que la proporción relativa de células lisadas disminuye considerablemente a medida que aumenta la dosis.

Tabla 1

B) Incubación con antibiótico durante períodos de tiempo crecientes. Se incubó una cepa de E. coli sensible a la amoxicilina/ácido clavulánico con una dosis de antibiótico de 32/16 durante 24 horas. Las alícuotas a estudiar se extrajeron del cultivo durante los tiempos especificados en la Figura 6. La parte superior de la Figura 6 muestra que la proporción de células no lisadas aumenta gradualmente en el cultivo a lo largo del tiempo, dado que las células afectadas por el antibiótico disminuyen gradualmente. De hecho, la curva de la caída del porcentaje de células con halo es similar a la caída del porcentaje de células en cultivo, medida por medio de una cámara de Neubauer. Si el porcentaje de células de cada tipo se normaliza con respecto al porcentaje de células que permanecen en cultivo, el nivel de células sin halo tiende a permanecer constante a lo largo del tiempo, mientras que el nivel de células con pared dañada disminuye progresivamente, de forma similar a las células en cultivo (Figura 6, parte inferior).

En conclusión, ambos tipos de experimentos indican que las células sin halo permanecen en el cultivo con antibiótico a lo largo del tiempo y con diferentes dosis crecientes de antibiótico. Esto apoya su estatus de persistencia, dado que no crecen ni se ven afectados por el antibiótico, su frecuencia debe ser independiente de la dosis de antibiótico y del tiempo de incubación con el antibiótico.

Ejemplo 6

Determinación de nucleoides con ADN fragmentado exclusivamente en células con pared celular afectada por el antibiótico

Una cepa sensible y otra cepa con sensibilidad intermedia de E. coli en crecimiento exponencial fueron expuestas a amoxicilina junto con ácido clavulánico en medio líquido Mueller-Hinton. La dosis fue de 32/16 (amoxicilina/ácido clavulánico). El tiempo de incubación con el antibiótico fue de 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas y 6 horas. Simultáneamente, se procesó un control de la cepa sin antibióticos.

La frecuencia de nucleoides con ADN fragmentado se determinó de acuerdo con el protocolo descrito por Tamayo et al. (Tamayo M, Santiso R, Gosálvez J, Bou G, Fernández JL. Rapid assessment of the effect of ciprofloxacin on chromosomal DNA from Escherichia coli using an in situ DNA fragmentation assay. BMC Microbiology 2009; 9: 69). Este protocolo lisa todas las células independientemente del estado de su pared. Es una técnica adecuada para evaluar el estado del ADN nucleoide de todas las células de una población. Por otra parte, también se determinó dicho nucleoide en las preparaciones procesadas para reconocer un efecto sobre la pared celular de acuerdo con el protocolo de la presente invención. Este procedimiento no es adecuado porque no permite estimar el estado del ADN en las células no lisadas, cuya pared celular no se ve afectada por el antibiótico. Sin embargo, dado que en este experimento la mayoría de las células se ven afectadas por el antibiótico, esto permite estimar la fragmentación del ADN exclusivamente en las células con pared dañada. Esto es importante porque permite evaluar la teoría que indica que las células que tienen la pared celular afectada por el antibiótico generarían una respuesta tardía que acabaría afectando también al ADN nucleoide, que posteriormente se fragmentaría durante el proceso de muerte celular, posiblemente produciendo radicales libres de oxígeno (Kohanski, MA, Dwyer DJ, Hayete B, Lawrence CA, Collins JJ. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell 2007;130:797 a 810) . La Figura 7 muestra diversas células procesadas con el procedimiento para determinar un efecto sobre la pared celular. Uno de los nucleoides tiene el ADN fragmentado. A diferencia de los nucleoides intactos, estos últimos se tiñen más ligeramente, lo que ocupa una mayor superficie debido al halo de difusión del fragmento de ADN desde el área central bacteriana o residual.

Ejemplo 7

Determinación de la sensibilidad o resistencia a un antibiótico B-lactámico sin utilizar la lisis, por medio de la evaluación del fondo de fragmentos de ADN extracelular en la preparación

Cuando las bacterias se procesan sin la etapa de incubación en la solución de lisis, todas estas bacterias están prácticamente intactas, independientemente de que sean afectadas por el antibiótico. Sin embargo, si tras una incubación adecuada con la dosis límite de antibiótico para las cepas sensibles, se observa en la preparación un fondo microgranular-fibrilar homogéneo y difuso que contiene fragmentos de ADN desprendidos por las células, se puede saber claramente si la cepa es o no sensible. Esta evaluación del fondo sin utilizar la lisis para observar el efecto sobre la pared celular se puede llevar a cabo por medio de la tinción con fluorocromo del material incluido en el microgel o el material no incluido en el microgel, ya sea fijado o fresco.

En el caso de un cultivo puro, la evaluación del fondo que contiene fragmentos de ADN presentes en la preparación hecha sin utilizar la lisis puede ser suficiente para determinar si una cepa es sensible o resistente después del tiempo de incubación adecuado con el antibiótico específico de la pared bacteriana. Esto puede acelerar aún más el tiempo para obtener el resultado cuando el tiempo es apremiante debido a la urgencia clínica.

A) Material incluido en el microgel

El líquido con las células se incluye en un microgel de agarosa que se deshidrata en alcoholes y/o se seca al aire o en un horno y se tiñe con fluorocromo. Es el mismo proceso descrito en detalle anteriormente, pero sin incubación con solución de lisis. Los antecedentes se pueden evaluar rápidamente tras los 15 a 20 minutos que se tarda en llevar a cabo la técnica. Los preparativos son permanentes. El resultado se muestra en la Figura 8, que muestra las mismas cepas presentadas en la Figura 1, cultivadas durante 24 horas en una placa y posteriormente incubadas durante 40 minutos con una dosis de amoxicilina/ácido clavulánico de 0, 8/4 (baja) y 32/16 (alta). Este sistema abreviado no permite detectar los células persistentes de la propia cepa bacteriana, ni distinguir las células sensibles de las resistentes, en el caso de un cultivo mixto o contaminado. Además, la intensidad del fondo de fragmentos de ADN extracelular depende de la concentración de bacterias sensibles. Si hay una pequeña concentración, el fondo puede ser muy tenue o casi inobservable. Así, una cepa de E. coli sensible a la amoxicilina/ácido clavulánico incubada con una concentración elevada (32/16) muestra, a partir de una DO 600 de 0,07, un fondo muy claro tras 15 minutos de incubación (DO 600: 0,071; 42,5 millones de células por mL, medido por medio de una cámara de Neubauer; 5,62% de células viables) y el fondo se mantiene intenso hasta las 2 horas de incubación (DO 600: 0,033; 14,5 millones de células por mL; 3,77% de células viables). El fondo se vuelve pobre después de 3 y 4 horas (OD 600: 0,037 y 0,033 respectivamente; 14 millones de células por mL tanto a las 3 como a las 4 horas; 0,38 % de células viables tanto a las 3 como a las 4) y deja de observarse a las 6 horas (DO 600: 0,035; 13,5 millones de células por mL; 0,13% de células viables). Aunque el total de células se mantiene entre un 40 y 30% con respecto a las células iniciales desde los 60 minutos hasta las 6 horas, la intensidad del fondo que contiene fragmentos de ADN disminuye gradualmente durante ese tiempo hasta que deja de ser detectable, posiblemente debido a la degradación del mismo.

B) Material fijo

Una alícuota del cultivo sin antibiótico y otras alícuotas con las dosis de antibiótico se pueden mezclar con un agente de fijación. Se pueden utilizar agentes de fijación alcohólicos, agentes de fijación aldehídicos o agentes de fijación cetónicos tales como metanol, etanol, acetona, formaldehído, glutaraldehído, así como ácido acético, ácido pícrico, cloruro de mercurio, ion dicromato, tetróxido de osmio, etc., y mezclas tales como el metanol:el ácido acético en una proporción de 3:1, por ejemplo, y el líquido de Carnoy. En el caso del formaldehído, la solución puede ser una solución acuosa del 0,1 al 50%, preferentemente al 10%. En el caso de los demás agentes de fijación, se pueden utilizar en diferentes proporciones, desde el 0,1 hasta el 100%. Se recomienda una proporción del 5 al 10% de una solución acuosa que contenga microorganismos y del 95 al 90% de agente de fijación. La ventaja de la fijación frente a la observación en soporte húmedo es que el material se puede almacenar durante más tiempo y observarse cuando sea oportuno. Se extiende una gota (unos pocos microlitros) en el portaobjetos y se deja secar. A continuación se añade el fluorocromo SYBR Gold (1:400), se coloca un cubreobjetos y se examina el portaobjetos. El formaldehído sólo conserva el fondo durante un corto período de tiempo, por lo que no se recomienda. Otros agentes de fijación son más duraderos y dan una imagen clara del fondo.

Se prefiere el metanol:ácido acético. Con el metanol:ácido acético, el material se extiende más fácilmente sobre el portaobjetos, el material de fondo y las bacterias se adhieren mejor al vidrio, mientras que con los otros agentes de fijación lo más probable es que se desprendan durante la tinción, dado que no se incuba previamente con calor seco. El fondo de fragmentos de ADN extracelular se observa como un agregado disperso (Figura 9). La extensión del material fijado en el portaobjetos tarda entre 8 y 10 minutos en secarse, aunque cuando el portaobjetos se coloca en una placa o en un horno a 37 °C se seca en 5 minutos. Si el metanol:ácido acético (3:1) es del 95%, el secado después de extender la gota es rápido, en menos de 1 minuto. Aunque los materiales son sencillos, los fijadores no ofrecen grandes ventajas en cuanto a la preparación y el tiempo de observación, con respecto a la preparación de microgeles, que también es permanente. Por lo tanto, en vista de una primera determinación rápida de sensibilidad o resistencia provisional, la operatividad de la fijación o del uso del microgel es prácticamente similar.

C) Material fresco

Se añade el fluorocromo a una alícuota del cultivo, se coloca un cubreobjetos y se examina directamente el portaobjetos bajo el microscopio de fluorescencia. Por ejemplo, se añaden 2 pl de fluorocromo SYBR Gold (1:400) a aproximadamente 10 pl de cultivo líquido con bacterias. Esto se lleva a cabo en cultivos con antibióticos que actúan sobre la pared celular, que incluyen un cultivo de control sin antibióticos. En el cultivo con el antibiótico, además de las bacterias flotantes, se observa un material microfilamentoso o granular intercelular difuso en continuo movimiento browniano, que corresponde al fondo emitido por las bacterias sensibles (Figura 9). Esta determinación en un minuto de la sensibilidad o resistencia al antibiótico que actúa sobre la pared celular es la más rápida y sencilla. En cualquier caso, depende de la concentración celular, de la capacidad de la célula sensible para liberar material celular, de la pureza de la cepa, del tiempo de incubación con el antibiótico, de la dosis de éste, etc. A veces se puede observar una bacteria lisada que libera un nucleoide de ADN, pero la mayoría de las bacterias no se comportan así. La técnica no permite detectar las células persistentes de la propia cepa bacteriana, ni distinguir las células sensibles de las resistentes, en el caso de un cultivo mixto o contaminado. Por último, la calidad de la imagen no es tan clara y nítida como en el caso de la inclusión en microgel, y la preparación no es permanente, por lo que no se puede almacenar y examinar en el futuro a menos que no se congele.

Cuando las bacterias que crecen en un medio líquido con un antibiótico específico para la pared al que son sensibles se centrifugan, las bacterias se acumulan formando gránulos, mientras que los fragmentos de ADN extracelular permanecen en la fracción sobrenadante. Una alícuota de esta fracción sobrenadante se puede teñir con el fluorocromo a evaluar, en una observación de montaje húmedo o fijarse o procesarse en un microgel. Por lo tanto, también se obtiene información rápida sobre la sensibilidad o la resistencia al antibiótico. La evaluación de este fondo de fragmentos de ADN extracelular se puede llevar a cabo no sólo por medio de la microscopía, sino también por medio de cualquier otro procedimiento físico o químico alternativo de detección de ADN (electroforesis, anticuerpos, espectrofotometría, reacción en cadena de la polimerasa, técnicas de hibridación, micromatrices, microfluidos, nanopartículas, puntos cuánticos, etc.).

Ejemplo 8

Evaluación de la naturaleza del fondo microgranular-fibrilar observado en las preparaciones de cultivos con bacterias sensibles a los antibióticos específicos de la pared celular

Para investigar la naturaleza del fondo microgranular-fibrilar observado en las preparaciones de los cultivos que contienen bacterias sensibles a los antibióticos específicos de la pared celular, se llevó a cabo una digestión in situ con enzimas (proteinasa K y ADNasa I), una hibridación fluorescente in situ (FISH) y una tinción en microgel del cultivo diluido.

A) Incubación in situ con proteinasa K, una enzima que degrada las proteínas, y con ADNasa I, una enzima que digiere el ADN

El experimento se llevó a cabo con una cepa de E. coli sensible a la ampicilina y una cepa de A. baumanii sensible al imipenem. La primera cepa se incubó con 32 pg/mL de ampicilina y la segunda cepa con 0,76 pg/mL de imipenem durante 60 minutos en medio líquido Mueller-Hinton a 37 °C con agitación. Tras la incubación, cada cultivo con las células se incluyó en microgeles en el portaobjetos. En cada portaobjetos se colocó un microgel que contenía el cultivo de control sin antibiótico y 2 microgeles que contenían el cultivo tratado con antibiótico. El tamaño de cada microgel corresponde a un cubreobjetos de 18x18 mm. Los microgeles de algunos portaobjetos se lavaron en un tampón de proteinasa K (1% de SDS, 2 mM de EDTA) y los microgeles de otros portaobjetos se lavaron en un tampón de ADNasa I (20 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 2 mM de MgCh). En el primero, uno de los microgeles que contenía el cultivo tratado con ampicilina se incubó sólo con un tampón de proteinasa K y el otro microgel que contenía el cultivo tratado con ampicilina se incubó con 5 pl de 2 mg/mL de proteinasa K, en el tampón del mismo. En los portaobjetos lavados con un tampón de ADNasa I, uno de los microgeles que contenía el cultivo tratado con ampicilina se incubó sólo con un tampón de ADNasa I y el otro microgel que contenía el cultivo tratado con ampicilina se incubó con 5 pl de 2,5 U de ADNasa I, en el tampón del mismo. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 30 minutos a 37 °C en una cámara húmeda. A continuación, los portaobjetos se lavaron en agua destilada, se deshidrataron en alcoholes crecientes, se secaron y se tiñeron con SYBR Gold (1:400).

Resultado:

Los cultivos no tratados con ampicilina o imipenem no mostraron un fondo microgranular-fibrilar en la preparación (Figura 10a). Los cultivos tratados con ampicilina o imipenem mostraron el fondo que se mantuvo en los microgeles incubados exclusivamente con los tampones de las enzimas (Figura 10b, 10c y 10e). Cuando se incubó con proteinasa K, el fondo no cambió (Figura 10f), mientras que cuando se incubó con ADNasa I, el fondo desapareció (Figura 10d). El aumento de la concentración de proteinasa K a 10 mg/mL en el mismo tampón o en agua tampoco produce un efecto sobre el fondo, ya sea en un microgel o en una extensión en Carnoy. Esto indica que el fondo observado incluye principalmente fragmentos de ADN extracelular procedentes de células afectadas por el antibiótico. Este antecedente no se observa cuando se utilizan otros tipos de antibióticos, como las quinolonas. B) Hibridación fluorescente in situ (FISH) con sonda de ADN genómico completo de E. coli

Un cultivo de E. coli sensible a la ampicilina se incubó con 32 pg/mL de dicho antibiótico durante 60 minutos en medio líquido Mueller-Hinton a 37 °C bajo agitación. se mezclaron 50 pl del cultivo 950 pl con metanol:ácido acético (3:1) y se extendieron en portaobjetos. Tras el secado al aire, los portaobjetos se sumergieron 5 minutos en metanol:ácido acético (3:1) (líquido Carnoy) y se dejaron secar. A continuación, se incubaron en alcoholes al 70%, 90% y 100% a -20 °C durante 5 minutos cada uno y se dejaron secar. El ADN presente en los portaobjetos se desnaturalizó incubándolos en formamida al 75%/2XSSC, pH 7, a 67 °C durante 90 segundos. A continuación, se pasaron de nuevo por alcoholes al 70%, 90% y 100% a -20 °C durante 5 minutos cada uno y se dejaron secar. En cada una de ellas, a nivel del área de propagación, se pipetearon microlitros de sonda de a Dn genómico completo de E. coli marcado con biotina (4,3 ng/pl en formamida al 50%, 2XSSC, sulfato de dextrano al 10%, 100 mM de fosfato de sodio, pH 7), poniendo un cubreobjetos de 18x18 mm. La sonda se incubó durante la noche en una cámara de humedad. La sonda no hibridada se lavó en formamida al 50%/2XSSC, pH 7, dos lavados de 5 minutos y posteriormente en 2XSSC, pH 7, dos lavados de 3 minutos cada uno, a 37 °C. Para revelar la sonda hibridada, los portaobjetos se incubaron en una solución de bloqueo de anticuerpos (5% BSA, 4XSSC, 0,1% Triton X-100) durante 5 minutos a 37 °C y posteriormente en estreptavidina-Cy3 (1:200, en 1% BSA, 4XSSC, 0,1% Triton X-100) durante 30 minutos. Los portaobjetos se tiñeron con DAPI (1 pg/mL en Vectashield) y se examinaron al microscopio de fluorescencia. Resultado:

La contratinción con DAPI muestra que en las preparaciones fijadas en Carnoy se observan en el fondo agregados que pueden rodear a las células bacterianas cuyos nucleoides están teñidos con DAPI. El colorante del ADN penetra fácilmente debido a la ausencia de pared en dichas células. El DAPI también tiñe el fondo agregado pero de forma más ligera (Figura 11a). Al examinar la señal de hibridación de la sonda, se observa que los nucleoides de las células, carentes de pared debido al tratamiento antibiótico, hibridan con la sonda de ADN genómico completo. El fondo agregado muestra una intensa señal de hibridación (Figura 11b), lo que demuestra de forma concluyente que corresponde a ADN bacteriano.

C) Tinción del microgel que contiene un cultivo diluido de Acinetobacter baumannii sensible al imipenem Un cultivo de A. baumannii sensible al imipenem se incubó con 0,76 pg/mL de dicho antibiótico durante 60 minutos en medio líquido Mueller-Hinton a 37 °C con agitación. Una alícuota de dicho cultivo se diluyó 10 veces y se incluyó en un microgel sin utilizar lisis, se deshidrató en alcoholes crecientes, se secó y se tiñó con SYBR Gold. La dilución permitió observar con mayor detalle el aspecto del fondo microgranular-fibrilar, que corresponde a fragmentos de ADN en diferentes niveles de alargamiento, desde el aspecto momentáneo retirado hasta el aspecto fibrilar extendido (Figura 12).

Resultado:

El fondo microgranular-fibrilar observado en el medio de cultivo del microorganismo cuando el antibiótico específico de la pared celular ha sido eficaz corresponde a fragmentos de ADN extracelular liberados por el microorganismo.

Conclusiones

En conjunto, los resultados obtenidos en los Ejemplos 1 a 8 muestran claramente la eficacia de los procedimientos proporcionados por la presente invención para la determinación rápida in situ de la sensibilidad o resistencia bacteriana a los antibióticos que actúan sobre la pared celular, por ejemplo, por medio de la inhibición de la biosíntesis del peptidoglicano. Dichos resultados se han verificado en pruebas llevadas a cabo con diferentes microorganismos (por ejemplo, Acinetobacter baumanii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella spp., Morganella morganii, Proteus mirabilis, Salmonella spp., Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, y Staphylococcus aureus) procedentes de aislados clínicos recolectados en el hospital de A Coruña (España) de diferentes pacientes y antibióticos inhibidores de la síntesis de peptidoglicanos (por ejemplo, ampicilina, ceftazidima, imipenem, penicilina y vancomicina) como mencionan Santiso et al. (Santiso et al., BMC Microbiology 2011, 11:191), cuyo contenido se incorpora por referencia.

La técnica para evaluar la integridad de la pared celular proporcionada por esta invención es un procedimiento rápido y sencillo que permite distinguir las cepas resistentes y sensibles a los antibióticos que actúan sobre la pared celular, por ejemplo, por medio de la interferencia en la biosíntesis del peptidoglicano. Esta metodología puede ser útil no sólo a nivel clínico sino también para llevar a cabo estudios básicos sobre el mecanismo de acción de los antibióticos que actúan sobre la pared celular.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana que comprende:

i) añadir a dicho cultivo un antibiótico que actúe sobre la pared celular bacteriana,

ii) añadir una solución de lisis caracterizada porque sólo lisará las bacterias cuya pared bacteriana haya sido dañada por la acción de un antibiótico, tendrá un pH comprendido entre 3 y 11,5 y comprenderá (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris), cloruro de sodio y un detergente seleccionado entre dodecilsulfato de sodio (SDS) o t-Octilfenoxipolietoxianol, en la que la concentración de Tris entre 0,001 M y 2 M de Tris, la concentración de cloruro de sodio es de hasta 3 M, y la concentración del detergente es de hasta 3% de SDS o de hasta 10% de t-Octilfenoxipolietoxianol, al cultivo resultante de la etapa i),

iii) determinar la presencia de nucleoide bacteriano en el cultivo, y opcionalmente

iv) antes o después de la etapa ii), inmovilizar una muestra del cultivo en un soporte,

en el que las bacterias presentes en el cultivo pertenecen a la misma especie o a especies diferentes y en el que la presencia de nucleoides bacterianos en el cultivo es indicativa de que la integridad de la pared celular de las bacterias ha sido dañada por el antibiótico.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la determinación de la presencia de fragmentos de ADN extracelular o del nucleoide bacteriano en el medio de cultivo se lleva a cabo por medio de tinción.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la tinción se lleva a cabo mediante el uso de uno o más fluorocromos.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico p-lactámico, una isoniazida, una etionamida, un etambutol, una cicloserina y un antibiótico glucopéptido.

5. Un procedimiento para determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana, que comprende las siguientes etapas:

i) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria por medio de un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y

ii) determinar la sensibilidad de la bacteria al antibiótico, en la que si la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada, entonces la bacteria es sensible al antibiótico.

6. Un procedimiento para diseñar una terapia antibiótica personalizada para un individuo que sufre una enfermedad bacteriana que comprende

i) aislar la bacteria causante de la enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúe sobre la pared celular bacteriana por medio de un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces dicho individuo puede recibir una terapia basada en el antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana.

7. Un procedimiento para identificar un compuesto antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana que comprende:

i) poner en contacto un cultivo que contenga una bacteria sensible a un antibiótico que actúe sobre la pared celular bacteriana en presencia del compuesto antibiótico candidato, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria por medio de un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces el compuesto antibiótico candidato es un compuesto antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la solución de lisis comprende Tris, cloruro de sodio y SDS, en el que la concentración de Tris está entre 0,001 M y 2 M de Tris, la concentración de cloruro de sodio está entre 0,05 M y 3 M, y la concentración de SDS está entre 0,025% y 3%.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la solución de lisis comprende Tris 0,2 M, SDS 0,025%, cloruro de sodio 0,5 M o 0,05 M, y tiene un pH de 10.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la solución de lisis comprende Tris, cloruro de sodio y t-Octilfenoxipolietoxiethanol, en el que la concentración de Tris está entre 0,001 M y 2 M Tris, la concentración de cloruro de sodio está entre 0,05 M y 3 M, y la concentración de t-Octilfenoxipolietoxiethanol está entre 5% y 10%.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la solución de lisis comprende Tris 0,2 M, aproximadamente 0,5 M o 0,05 M, o cloruro de sodio 1 M, 5% de t-Octilfenoxipolietoxianol, y tiene un pH de 10.

12. Una solución de lisis caracterizada porque sólo lisará las bacterias que tengan la pared bacteriana dañada por la acción de un antibiótico, en el que la solución tiene un pH entre 3 y 11,5 y comprende Tris, cloruro de sodio y SDS, en el que la concentración de Tris está entre 0,001 M y 2 M de Tris, la concentración de cloruro de sodio es de hasta 3 M y la concentración de SDS es de hasta 3%.

13. La solución de lisis de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la concentración de cloruro de sodio es de 0,05 M a 3 M y la concentración de SDS es de 0,025 % a 3%.

14. La solución de lisis de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la solución tiene un pH de 10 y comprende:

- 200 mM Tris

- 0,05 o 0,5 M de cloruro de sodio, y

- 0,025% SDS.

15. Una solución de lisis caracterizada porque sólo lisará las bacterias que tengan la pared bacteriana dañada por la acción de un antibiótico, en el que la solución tiene un pH entre 3 y 11,5 y comprende Tris, cloruro de sodio y t-Octilfenoxipolietoxianol, en el que la concentración de Tris está entre 0,001 M y 2 M Tris, la concentración de cloruro de sodio es de 0,05 M a 3 M y la concentración de t-Octilfenoxipolietoxianol es de 5% a 10%.

16. La solución de lisis de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la solución tiene un pH de 10 y comprende:

- 200 mM Tris

- aproximadamente 0,5 M o 0,05 M, o 1 M de cloruro de sodio, y

- 5% de t-Octilfenoxipolietoxiethanol.

17. Uso de una solución de lisis como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12 a 16, para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.

18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la solución de lisis es la definida en la reivindicación 14 o 16.

19. Un kit que comprende una solución de lisis de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, para poner en práctica el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

20. Uso de un kit como se define en la reivindicación 19, para llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.