CN103946389A - 用于评价细菌细胞壁完整性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下用于评价存在于培养物中的细菌的细胞壁完整性的方法,从实用的角度出发,该方法允许快速地确定细菌是否对作用于细胞壁的抗生素敏感或耐受。同样地,本发明还涉及适用于前述方法的裂解溶液,具体地影响具有被作用于细菌细胞壁的抗生素损坏的细胞壁的细菌,这允许从对所述抗生素耐受的细菌中区分对所述抗生素敏感的细菌。
Description
技术领域
本发明涵盖在生物技术产业领域内,并且主要涉及微生物学,其应用范围是在卫生部门(人类健康、动物健康、环境健康和基础健康)中。本发明涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价存在于培养物中的细菌细胞壁的完整性的方法,从实用的角度出发,该方法允许快速地确定细菌是否对作用于细胞壁的抗生素敏感或耐受。
背景技术
关于微生物对抗微生物药剂的敏感性的研究是临床微生物学实验室最重要的职责之一。该研究通过敏感性测试或抗菌谱(antibiogram)进行,其主要目的是在实验室中评价微生物对一个或几个抗微生物药剂的响应(反应,response)。
一些在日常临床实践中最常用的方法包括(i)扩散法,如基于Bauer、Kirby等人工作的圆盘-培养皿抗菌素谱(disc-dish antibiogram)(Bauer AW,等人.Am.J.Clin.Pathol.1966,45:493-496)或ε-测试或E-测试法(ABBiodisk,瑞典),或(ii)稀释法,如琼脂稀释法或肉汤微量稀释法。通过比较扩散法与稀释法,后者在技术上更为复杂,而且几乎总是更加昂贵,特别是当使用商业微量稀释板时。液体培养基中的微量稀释法是常规临床微生物学实验室实践中最常用的方法。
在许多实验室中,商业板的使用是基于使用半自动的孵育-读数-判读(incubation-reading-interpretation)系统;这促进了它们的应用,但具有增加支出的缺点。一些公司已经在市场上推出板,其中培养基包含允许快速获取(少于8小时)结果的荧光指示剂。关于对作用于细菌壁的抗生素(如β-内酰胺类)的耐受性的快速测定,将可代谢的荧光化合物添加到培养基中(专利申请WO/1992/019763)。如果有机体在抗生素下生长,那么细菌的代谢作用导致荧光团的释放。如果有机体不生长,那么样品的荧光增加。
另一种可能性是使用颜色指示剂化合物如四唑,在对抗生素敏感的事件中,在添加电子载体如吩嗪硫酸甲酯后,其会引起颜色的变化。然而,仍然没有足够的数据来允许建议常规应用这种板。
几个商业公司也正在评价专家系统(软件),该专家系统促进所获得结果的临床解释;假设在未来广泛使用这样的系统是安全。在当今市场上几个系统是可获得的,MicroScan WalkAway、Vitek和Wider是最突出的系统。缺乏较多的使用荧光指示剂的临床经验时,如上面提到的扩散方法中,用于获得特定微生物对抗微生物剂的易感性的平均响应时间的范围在18和24小时之间。
最近,已指出利用双向电泳系统的可能性,其检测施用抗生素后细胞在电生理学方面的变化(Hoettges KF,Dale JW,HughesMP.Rapiddetermination of antibiotic resistance in E.coli using dielectrophoresis.PhysMed Biol2007;52:6001-6009)。
对于作用于细菌壁的抗生素如β-内酰胺类的另一个开发由通过特定基质检测由细胞释放到培养基中的细胞质酶的活性组成,如果该抗生素已被实施(effective)(欧洲专利EP0135023)。
BACcelr8rTM是由Accelr8正在开发的平台,用于自动识别微生物并研究其对抗生素的耐受性。它不使用培养物,细菌的分离也不是必要的。它通过多个盒的方式工作,其中每个盒对应于一个样品。它使用具有由计算机、数字相机和分析软件控制的显微镜的自动化系统。泵在不同条件下维持含细菌的培养基经过盒的流。可在8小时内完成抗生素耐受性分析。
专利申请US2004/0014066描述了用于检测样品中影响细胞完整性的抗生素活性的方法,其包括(a)提供包含编码启动子的核酸的转化的微生物,该核酸被可操作地连接到能够发出可检测信号的异源报告基因,并且(b)使样品与转化的微生物接触,(c)观察所述微生物的所述可检测信号,其中该启动子由双组分信号转导系统调控,其中所述组分为(i)对微生物的细胞被膜或细胞膜的变化敏感的受体及(ii)反式作用因子,其响应于受体引起的刺激而激活并调控启动子。
作用于细菌壁的抗生素
细菌细胞壁的骨架由杂聚物、胞壁质肽聚糖构成。该大分子由N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)和N-乙酰胞壁酸(NAM)通过β-1,4键彼此结合的交替序列而形成。形成细胞壁的基本结构的链为直的、无支链的链。该N-乙酰胞壁酸具有与短肽链(四肽)连接的乳酸基团。此链的典型氨基酸包括L-丙氨酸、D-谷氨酸、间-二氨基庚二酸或L-赖氨酸或D-丙氨酸。
抑制细菌壁合成的抗生素是作用于细菌壁合成不同步骤的不同家族的药物:
-环丝氨酸是D-丙氨酸类似物并竞争性地抑制该氨基酸与酶D-丙氨酸-D-丙氨酸合成酶和丙氨酸消旋酶的结合,从而防止它们结合到肽聚糖前体。
-磷霉素阻断肽聚糖前体的合成。
-杆菌肽抑制十一异戊烯基(undecaprenyl)、运送肽聚糖至细胞外的脂质载体的回收利用。
-葡糖肽(glucopeptide)或葡糖肽类抗生素是一类糖结合到其上(如在细菌细胞壁中)的肽,其具有对这种结构的前体的高亲和力。最知名的糖肽类抗生素是万古霉素和替考拉宁(teicoplanin)。万古霉素通过抑制细菌细胞壁合成、结合到革兰氏阳性菌壁上的五肽的D-丙氨酸-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)片段、阻断肽与细胞的结合来执行其杀菌作用。其次,万古霉素能通过其他机制如破坏细胞质膜的渗透性及抑制RNA合成而见效,这是在药已结合到肽聚糖后进行的。
-β-内酰胺类抗生素通过干扰交联所必需的横向结合或肽间桥(interpeptide bridge)来执行杀菌作用。其通过以不可逆方式结合至PBPs、丝氨酸蛋白酶或转肽酶来抑制它们的活性。
-干扰细胞壁合成的其他抗生素为异烟肼、乙硫异烟胺和乙胺丁醇。如同上面提到的环丝氨酸,它们被用于分枝杆菌感染的治疗。异烟肼具有在活跃复制期内的杀菌活性。其影响分枝菌酸(mycolic acid)的合成,打断脂肪酸的伸长。乙硫异烟胺也抑制分枝菌酸的合成。乙胺丁醇干扰细胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成。对这些抗生素的耐受性的原因在于缺乏渗透进入细菌和/或修饰它们的细胞靶标。
抗生素耐受导致每年数万的死亡。使用正确选择有效性的抗生素治疗来避免这些死亡中的许多。考虑到耐受水平,有必要制备细菌培养物,随后制备抗菌谱。为了完成以上所述,细菌必须通常生长2-3天。对于普通的快速生长的细菌,抗菌谱本身通常需要至少一天的培育。
对于IUC中病情危急的患者,迅速的抗生素治疗是重要的。考虑到抗菌谱的延迟,其以经验为主地进行。这种治疗在20%-40%的病例中是无效的,而在得到抗菌谱的结果后治疗的改变可能不再有效。在这种情况下,得到快速的抗菌谱系统是重要的。作用于细菌壁的抗生素,特别是β-内酰胺类,是一个非常大的群体,且最常被用于抗感染治疗中。对得到这些抗生素的快速抗菌谱系统非常感兴趣。
发明内容
本发明的作者已经发现,对于细菌,作用于细菌细胞壁的抗生素的活性的一个后果是将胞外DNA片段释放到培养基中。为了观察这种作用,本发明人在所述抗生素的存在下孵育对氨苄青霉素(β-内酰胺类抗生素)敏感的大肠杆菌菌株,之后在几个载玻片上将培养物包含在不同的微凝胶中,向其中给予蛋白酶K或DNA酶I(实施例7和实施例8)。未用氨苄青霉素处理的培养物没有在制备物中显示出微粒状-纤维状背景(图10a),而在用氨苄青霉素处理的培养物中观察到了微粒状背景。当用蛋白酶K孵育用氨苄青霉素处理的培养物时,背景保持不变(图10f),而当用DNA酶I孵育它们时,不再观察到背景(图10d),表明所观察到的背景主要包含源于受抗生素作用的细胞的胞外DNA片段。当使用不作用于细胞壁的其他类型的抗生素如喹诺酮类时,未观察到所述背景。
然而,本发明人还观察到,当细菌培养物是混合的培养物或受污染的培养物时,即,存在敏感性细胞或耐受细胞的混合物时,所述方法将不是非常适合作为严格的判别标准,因为尽管释放了胞外DNA片段,但细菌的形态未被抗生素的作用改变,即,细菌对抗生素的敏感性的和耐受的细菌均显示出明显完整的细胞壁。为了解决这个问题,本发明人已经设计了只影响其细胞壁已被作用于细胞壁的抗生素的作用预先破坏的细菌的裂解溶液,并且当加入到已预先暴露于所述抗生素的作用下的细菌培养物中时,引起细菌类核(拟核,nucleoid)的释放,然后观察到具有受损细胞壁的细菌(实施例1到5)。因此,应用裂解溶液后细菌类核的存在是对抗生素敏感细菌的存在的指示。
因此,在一个方面,本发明涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价纯培养物中细菌细胞壁完整性的方法,其包括:
ⅰ)将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述细菌的所述纯培养物中,和
ⅱ)确定培养基中胞外DNA片段的存在,
其中培养基中胞外DNA片段的存在指示该细菌细胞壁的完整性已被破坏。
在另一方面,本发明涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价存在于培养物中的细菌细胞壁的完整性的方法,其包括:
ⅰ)将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述培养物中,
ⅱ)将裂解溶液加入到产生自步骤i)的培养物中,其中所述裂解溶液是对那些细胞壁已被作用于细菌细胞壁的抗生素破坏的细菌特异的裂解溶液,并包含pH在3至11.5之间的缓冲液,和
ⅲ)确定细菌类核的存在,
其中,培养基中细菌类核的存在指示该细菌细胞壁的完整性已被破坏。
在另一方面,本发明涉及确定细菌对作用于细菌细胞壁的抗生素的敏感性的方法,其包括通过根据本发明所述的方法测量所述细菌细胞壁的完整性,其中,如果细菌细胞壁的完整性已被破坏,那么该细菌是对抗生素敏感的。
在另一方面,本发明涉及设计为患细菌性疾病的个体定制的抗生素疗法的方法,其包括
ⅰ)从源自所述个体的样品中分离引起细菌性疾病的细菌,和
ⅱ)通过根据本发明所述的方法来评价所述细菌细胞壁的完整性,
其中,如果所述细菌细胞壁的完整性已被破坏,那么所述个体可接受基于作用于细胞壁的抗生素的疗法。
在另一方面,本发明涉及鉴定作用于细菌细胞壁的化合物的方法,其包括:
ⅰ)在候选化合物的存在下接触含有对作用于细菌细胞壁的抗生素敏感的细菌的培养物,和
ⅱ)通过根据本发明所述的方法来评价所述细菌细胞壁的完整性,
其中,如果所述细菌细胞壁的完整性已被破坏,那么该候选化合物是作用于细菌细胞壁的化合物。
在另一方面,本发明涉及鉴定含敏感性细菌的培养物中的持留菌(persister bacterium)或对作用于细菌细胞壁的抗生素具有耐药性的细菌的方法,其包括通过根据本发明所述的方法评价存在于所述培养物中的细菌细胞壁的完整性,其中,细胞壁完整性未被损坏的细菌被鉴定为持留菌或耐受菌。
在另一方面,本发明涉及裂解溶液,其特征在于,其仅影响具有被抗生素的作用破坏的细菌壁的细菌,其包含缓冲液且pH在3和11.5之间。
在另一方面,本发明涉及用于评价细菌细胞壁完整性的本发明裂解溶液的应用。
在另一方面,本发明涉及包括本发明的裂解溶液的试剂盒。
附图说明
图1示出通过评价细胞壁完整性的技术处理的三种不同的革兰氏-细菌大肠杆菌的菌株,那些菌株被暴露于β-内酰胺类抗生素阿莫西林和β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸中。孵育是在对数生长期过程期间在37℃下在穆勒-欣顿(Mueller-Hinton)液体培养基中搅拌40分钟。根据由临床和实验室标准化研究所(CLSI)指示的截取点(cutoff point)来选择抗生素的剂量。因此,当菌株的最低抑制浓度(MIC)为≤8/4(8μg/mL阿莫西林和4μg/mL克拉维酸)时其被认为是敏感的而当菌株的MIC为≥32/16(32μg/mL阿莫西林和16μg/mL克拉维酸)时其被认为是耐受的。根据标准微生物学技术,第一个菌株(顶行:a、a'、a″)是敏感菌株,第二个菌株是具有中间(中度,intermediate)敏感性的菌株(中间行:b、b'、b″),而第三个菌株是耐受菌株(底行:c、c'、c″)。a、b、c:无抗生素对照。a'、b'、c':8/4;8μg/mL阿莫西林和4μg/mL克拉维酸;a″、b″、c″:32/16;32μg/mL阿莫西林和16μg/mL克拉维酸。无抗生素对照(a、b、c)示出了非裂解细菌。8/4的剂量后,仅第一个敏感菌株的细菌被裂解,示出了类核(a')。32/16的剂量后,第一个敏感菌株和具有中间敏感性的第二个菌株被裂解(a″和b″),而第三个耐受菌株未裂解(c″)。然而,一些细胞壁破坏可见于一些分离的细胞中。当抗生素有效时,除了类核的释放和扩散外,观察到含有由细胞释出的DNA片段的扩散均匀的微粒状背景。
图2示出用不同剂量的氨苄青霉素处理60分钟的革兰氏+细菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis),该粪肠球菌对β-内酰胺类抗生素氨苄青霉素(MIC=4μg/mL)敏感。a:无抗生素对照;b:4μg/mL(MIC);c:8μg/mL;d:16μg/mL;e:32μg/mL。MIC剂量足以通过抗生素和胞外DNA片段的背景观察到对壁的影响。
图3示出用不同剂量的氨苄青霉素孵育60分钟的革兰氏+细菌屎肠球菌(Enterococcus faecium),该屎肠球菌耐受β-内酰胺类抗生素氨苄青霉素(MIC>32)。a:无抗生素对照;b:32μg/mL;c:320μg/mL。320μg/mL后,用胞外DNA片段的精细(subtle)背景观察到了对一些分离细胞的壁的影响。
图4示出对头孢菌素类型的β-内酰胺类抗生素头孢他啶(ceftazidime)敏感的大肠杆菌。该菌株被暴露于不同剂量下60分钟。a:无抗生素对照;b:1μg/mL(MIC);c:8μg/mL。MIC引起细胞的丝状外观,显示出对壁的影响。8μg/mL后,观察到了对壁的高度影响,清晰地看到胞外DNA片段的背景。
图5示出源自液体培养基中的培养物、在对数期生长、对阿莫西林/克拉维酸敏感、并暴露于高剂量的32/16下90分钟的大肠杆菌细胞。使用本发明的技术处理后,除了显示对释放类核的壁的影响的细胞和胞外DNA片段的背景外,清楚地观察到未受抗生素影响的具有完整形态的细胞(星号)。这种细胞行为类似“持留菌”。
图6示出描绘源自液体培养基中的培养物、在对数期生长、对阿莫西林/克拉维酸敏感、并暴露于高剂量的32/16下不同时间的大肠杆菌的培养物中、无光晕的细胞和具有受损壁的细胞的细胞百分比曲线图。由于受抗生素影响的细胞逐渐降低,在顶部观察到在培养物中非裂解细胞的比例随着时间的推移逐渐增加(LH:大光晕+SH:小光晕+F:具有片段化DNA的裂解)。在底部,示出相同的附图,但其中的数据已根据培养物中剩余的细胞百分比被归一化。据观察,无光晕细胞的百分比随着时间的推移趋于保持恒定,而具有受损壁的细胞的百分比以类似于培养物中细胞的方式逐渐降低。这支持无光晕细胞行为类似“持留菌”。
图7示出源自液体培养基中的培养物、在对数期生长、对阿莫西林/克拉维酸敏感、并暴露于高剂量的32/16下60分钟的大肠杆菌细胞。使用本发明的技术处理后,除典型的背景之外,观察到了释放类核的三种细胞。类核中的一个未维持完整的形态,而显示是片段化的,染色到非常少的程度且更扩散(星号),示出具有扩散自中央细菌残留物的小DNA片段的大光晕。
图8示出在图1中呈现的相同大肠杆菌菌株,其在培养皿上被培养24小时,然后在阿莫西林/克拉维酸剂量为0(a、b、c)、8/4(低剂量;a'、b'、c')和32/16(高剂量;a″、b″、c″)的液体培养基中培养40分钟。该菌株不用通过暴露于裂解溶液的裂解步骤处理。顶行示出敏感菌株(a、a'、a″);具有中间敏感性的菌株在中间行(b、b'、b″)而耐受菌株在底行(c、c'、c″)。在这些生长条件下和在用抗生素孵育时间段之后,仅敏感菌株示出由细胞释出的胞外DNA片段的扩散的均匀微粒-纤维状背景。这种背景在低剂量(8/4)后是明显的,且在高剂量(32/16)后显著增加。因此可以清楚地将敏感菌株与其他菌株区分。
图9示出用8μg/mL剂量的所述抗生素孵育60分钟的大肠杆菌的氨苄青霉素敏感菌株。a和b:湿涂片观察。a:无抗生素对照培养物;b:用氨苄青霉素处理的培养物。胞外细菌DNA片段的扩散微粒状或纤维状背景见于用氨苄青霉素处理的培养物里的细菌之中。c和d:固定在甲醇:乙酸中的培养物。c:无抗生素的对照培养物;d:用氨苄青霉素处理的培养物,其中DNA的背景材料见于细菌之中,形成了各种形状和大小的聚集体。
图10示出用32μg/mL剂量的所述抗生素孵育60分钟的大肠杆菌的氨苄青霉素敏感菌株。无抗生素对照培养物的等分试样和用氨苄青霉素处理的培养物的等分试样被包在微凝胶中,并用SYBR Gold染色。该无抗生素的对照培养物在制备物中未显示出微粒状-纤维状背景(a),而用氨苄青霉素处理的培养物显示出所述背景(b)。用含酶的(DNA酶I(c)或蛋白酶K(e))的缓冲液孵育微凝胶,不影响所述背景。当用2.5U DNA酶I孵育用氨苄青霉素处理的培养物的微凝胶30分钟时,该背景从制备物中消失(d),而当用2mg/mL蛋白酶K孵育它30分钟时,该背景保持不变(f)。含有蛋白酶K的缓冲液具有裂解细胞的SDS和EDTA。在相同缓冲液中或在水中增加蛋白酶K的浓度至10mg/mL不影响背景。该实验表明该背景对应于胞外DNA片段。
图11示出经过培养物的延伸(extension)、固定在Carnoy中,用氨苄青霉素处理60分钟的所述细菌的大肠杆菌全基因组DNA探针的荧光原位杂交(FISH)。Carnoy使背景的微粒状-纤维状材料聚集,以包围细菌。因此,用DAPI的复染(counterstaining)显示出背景材料与细菌的聚集,该细菌的类核被DAPI强烈染色。聚集的背景材料也被所述染料染色,虽然较轻度(a)。全基因组DNA探针与细胞的类核和背景材料均杂交,表明后者对应于片段化的细菌DNA。
图12示出用0.76μg/mL的亚胺培南(imipenem)孵育1小时的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的亚胺培南敏感菌株。将培养物的等分试样稀释并包在琼脂糖微凝胶中,在渐增的醇中脱水,干燥并用SYBRGold染色。可见对应于不同程度延长的DNA片段的微粒状-纤维状背景。
具体实施方式
基于在涉及发明内容的部分中提到的发现,本发明人已经开发了一系列创造性方面,将在下面详细说明。
本发明的评价细菌细胞壁完整性的方法
在一方面,本发明涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价纯培养物中细菌细胞壁完整性的方法(以下称为“本发明的第一种方法”),其包含:
ⅰ)将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述细菌的所述纯培养物中,和
ⅱ)确定培养基中胞外DNA片段的存在,
其中培养基中胞外DNA片段的存在指示该细菌细胞壁的完整性已被破坏。
在本发明的上下文中,术语“细胞壁”是指包围细菌细胞的由胞壁质肽聚糖构成的细胞壁,其由N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)和N-乙酰胞壁酸(NAM)通过β-1,4键彼此结合的交替序列而形成。术语“细胞壁”和“细菌细胞壁”是等价的,并且能够贯穿本说明书可互换地使用。
在本发明中,“评价细菌细胞壁的完整性”应被理解为确定细菌细胞壁的原始成分或结构是否已被破坏,或是否相反,在暴露于外源试剂后其成分和结构保持完整的操作。在本发明的上下文中,外源试剂是作用于细菌细胞壁的抗生素,即,阻断肽聚糖合成使得细菌的细胞壁被破坏的抗生素。
在本发明中,“纯培养物”应被理解为包含单一类型微生物的任何培养物。用于获得纯培养物的不同培养基、技术和方法在现有技术中是众所周知的,且对本领域技术人员来说是常规操作(Rotger,R.(主编),1997,Microbiología Sanitaria y clínica,Editorial Síntesis,Madrid)。
本发明的第一种方法的第一个步骤[步骤i)]包括将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述细菌的所述纯培养物中。
术语“抗生素”包括消除或抑制感染性有机体生长的任何化学化合物;如本文所用,所述术语包括在低浓度下消除或抑制感染性有机体生长的、由生命体产生的任何化学化合物,或它们的合成衍生物。所有抗生素的共同性质是选择性毒性:对入侵有机体的毒性大于对持留(hosting)它们的动物或人类的毒性。可根据它们的结构、它们附着的微生物、它们的作用机理、它们的治疗靶标等来分类抗生素。在本发明,“作用于细菌细胞壁的抗生素”应被理解为影响任何细菌细胞壁合成步骤的抗生素。确定抗生素是否作用于细胞壁的测试是,例如,在本专利申请的实施例中描述的任何测试。
在一个具体实施方式中,作用于细菌细胞壁的抗生素选自由以下组成的组:β-内酰胺类抗生素、异烟肼、乙硫异烟胺、乙胺丁醇、环丝氨酸和糖肽类抗生素。
在另一具体实施方式中,β-内酰胺类抗生素选自由以下组成的组:青霉素、头孢菌素、头霉素、碳头孢烯(carbacephem)、碳青霉烯(carbapenem)、单酰胺菌素(monobactam)和β-内酰胺酶抑制剂。
在另一具体实施方式中,β-内酰胺酶抑制剂选自由克拉维酸、舒巴坦(sulbactam)和他唑巴坦(tazobactam)组成的组。
在另一具体实施方式中,糖肽类抗生素为万古霉素或替考拉宁。
如由本领域技术人员已知的,用抗生素孵育培养物的时间可在很宽的范围内变化,其取决于培养物处于静止期或对数生长期、取决于培养在培养皿上或在液体培养基中进行、取决于被添加到培养物中的抗生素剂量等。通常,用抗生素孵育时间范围可从5分钟到90分钟、优选从20到60分钟。在一个具体实施方式中,孵育时间为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80分钟。此外,待添加到培养基中的抗生素的量也可在很宽的范围内变化;然而,在一个具体实施方式中,待添加到培养基中的抗生素的量在5μg/mL至2,570μg/mL之间,虽然优选地,待添加的抗生素的量将是特定细菌的最小抑制浓度(MIC)。如本领域技术人员已知的,在现有技术水平中存在被广泛接受的标准化的表,其中列出抑制特定微生物所必需的MIC。在一个具体实施方式中,可以被添加到培养基中的抗生素的量为0.06、0.038、0.38、4、8、16、20、32、160、256或2,560μg/mL。最后,用抗生素一起培养的孵育温度范围可在36℃和38℃之间,优选37℃。
本发明的第一种方法的第二个步骤[步骤ii)]包括观察培养基中胞外DNA片段的存在。
如本领域技术人员所理解的,可以通过显微镜或通过用于检测由微生物释放到培养基中的DNA的任何其他替代的物理或化学方法来确定培养基中DNA片段的存在,该其他替代的物理或化学方法包括,但不限于,电泳、抗体、分光光度法、聚合酶链式反应、杂交技术、微阵列(microarray)、微流体(microfluidics)、纳米颗粒、量子点(quantum dot)等。这些方法在现有技术水平中是众所周知的,且将该方法付诸实践是现有技术中本领域技术人员的常规操作。
然而,由于DNA片段的相对小的尺寸,在一个具体实施方式中,考虑到显微镜较高的灵敏度,其是确定DNA片段的存在的首选技术。为此,在载玻片上固定来自第一个步骤[步骤i)]产生的培养物的样品是合适。因此,在具体实施方式中,本发明的第一种方法包括在步骤i)和ii)之间进行在载体上固定来自步骤i)培养物的样品的步骤。
所述载体可是载玻片。在一个具体实施例中,所述载玻片是用标准的琼脂糖膜完全地或部分地包覆的玻璃载片。为此,科普林氏缸(Coplin jar)等中制备在蒸馏水中的0.2%到1%的标准琼脂糖溶液;其覆盖有穿孔塑料片并在微波炉中沉积;该微波炉被调节至300W至1000W、优选500W的功率,为了更好地溶解琼脂糖偶尔搅拌该容器,让其煮沸。也可使用恒温浴执行此方法。当琼脂糖溶液变得完全透明时,其将随时可被放置于容量为10ml至250ml的立式容器中。这些容器必须预先在60-100℃之间、优选70℃的水浴中保温(回火,temper),以维持该琼脂糖溶液为液体状态。然后将干净的载玻片垂直浸没,用镊子在底部区域附近握持1秒至60秒,取出它们并再次浸没1次至10次,直到在载玻片上形成均匀的膜。可替代地,除了在琼脂糖溶液中浸没载玻片外,还可以使用喷雾器使琼脂糖分散在载玻片上。因此可以在短时期内涂覆大量的载玻片。无论使用哪种方法,涂覆有琼脂糖膜的载玻片在1℃至15℃之间、优选在4℃下,被水平地放置在光滑和冷的表面上,例如,该表面由玻璃或金属制成。具有载玻片的培养皿被放入4℃冰箱中至少30分钟,直到确认该琼脂糖溶液已经在载玻片的表面上胶凝。将托盘从冰箱中取出并用吸水纸清洁与培养皿接触的载玻片的表面。然后将该载玻片水平地放入在37℃至100℃之间的温度下的烘箱中,直到琼脂糖已完全干燥并形成附着在玻璃上的精细膜。这样处理过的载玻片可以立即使用或于室温下在密闭良好的容器中储藏数月。
在以上面说明的方式制备的载玻片上固定来自步骤i)培养物的样品,需要事先制备所述样品。通过该领域中的常规方法,获得并验证液体样品中微生物的浓度。适合用于分析的浓度范围在每毫升10万和2千万个微生物之间。如果样品被过于浓缩,则通过将其用培养基或用生理盐水/磷酸盐缓冲溶液(PBS)等稀释而调整到适当的浓度,根据该微生物和根据待测抗生素的稳定性是适当的。
例如,为促进含有微生物的样品的处理,将其引入具有类似于悬浮液的特性的培养基中,如琼脂糖微凝胶。在这种情况下,在蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备浓度为0.5%至3%的低熔点/低胶凝点琼脂糖溶液。使用微波炉或恒温控制浴熔融该琼脂糖,随后保持在30和37℃之间引入恒温控制浴或微波炉中的管中。将来自培养物的样品和琼脂糖溶液在Eppendorf管或类似物中小心地混合,使得后者的浓度为0.3%至2%之间,例如,70μL的琼脂糖溶液+30μL的样品。琼脂糖的温度不超过37℃是十分重要的,以防止破坏微生物。
最后,为了获得载体上的样品,在1℃至15℃的温度下,将用琼脂糖涂覆的载玻片放置在光滑且冷的玻璃或金属表面上,以防止形成气泡。建议用微量移液器放置一滴(2微升至200微升(μL))的该混合物(由培养物+琼脂糖制备的样品),将盖玻片置于该液滴的顶部。数滴,即来自步骤i)的细菌培养物的样品,可被吸取在每个载玻片上。作为预防措施,建议一式两份处理每个样品并在每次应用该技术时使用对照样品。将具有载玻片的培养皿放入4℃冰箱中,持续2至30分钟的时期,直到发生琼脂糖的合适的胶凝化。一旦胶凝化发生,在同一冰箱内将盖玻片轻轻去除,以防止破坏微凝胶。
随后,通过显微镜观察DNA片段,DNA片段稳定和牢固地附着在载玻片上是适当的,因为它们可变得分离(detach)。为此,在微波炉中将干燥的载玻片以300W至1000W、优选500W的功率下孵育1分钟至10分钟的一段时间。可替代地,虽然由于其持续时间而较不推荐,是在熔炉或烘箱中在高温下孵育载玻片1小时至数小时的一段时间。一旦它们完全干燥,含有样品的已经处理过的载玻片可在室温下、在黑暗中存储在档案柜(filing cases)中数月。这有利于使样品处理步骤和评价微生物细胞壁的完整性的后续步骤分开。归档允许在不同的时间间隔重复评价一个个体和相同微生物的数个样品。
一旦样品被处理及DNA片段被稳定和牢固地附着在载玻片上后,可将样品染色并且可以评价微生物细胞壁的完整性。因此,在本发明方法的具体实施方式中,通过染色进行培养基中胞外DNA片段存在的观察。可通过适当选择染色条件来获得高图像质量和高评价结果的一致性。
着色或染色是显微镜方法中的辅助技术,以提高通过显微镜看到的图像的对比度(contrast)。在生物化学中,这意味着将待染色分子(本发明的上下文中的DNA)的特异性染料添加到基质中用于使特定化合物的存在定性或定量。使用着色剂的最主要的目的是用于确定和检查个体细胞中的细胞器或用于在凝胶电泳中标记核酸。
大多数染料是对微孔材料(cellular material)具有某些特定亲和力的有机化合物。许多常用的染料是带正电荷的分子(阳离子),其与带负电荷的细胞成分、如核酸和酸性多糖强烈地结合。阳离子染料的非限制示例性实例包括亚甲基蓝、结晶紫(crystal violet)和番红(safranin)。亚甲基蓝是很好的简单染料,其迅速作用于所有细菌细胞且不产生如此强烈以致掩盖细胞的详情的颜色,这是特别有用的。有时,一些染料仅在细胞已被称为媒染剂(mordant)的另一种化学物质处理后才更好地染色,媒染剂本身不是染料。单宁酸是一种普通媒染剂,其与细胞成分结合并改变该细胞成分,使得其现在可攻击染料。如本领域技术人员已知的,在现有技术中存在用于使DNA染色的技术,如,例如,由用1N盐酸在60℃下或用5N盐酸在室温下使材料经受水解,然后加入希夫试剂(Schiff reagent)组成的福尔根(Feulgen)染色。通过这种技术染色细菌细胞的细胞核是可能的。
如上面所指出的,由于DNA片段的相对小的尺寸,在一个具体实施方式中,考虑到荧光显微镜较高的灵敏度,其是观察DNA片段的首选技术,为此,细菌必须用被称为荧光团或荧光染料的特定化学化合物染色。当这些化合物在合适的波长下用光激发时能够发射荧光。当前存在整个范围的荧光染料,其不仅提供有关细胞活力(cell viability)的信息,而且清晰地示出细菌的某些生理特性和在一些情况下的结构特征。通过图示的方式,存在检测以下的的荧光团:呼吸活性(例如,四唑鎓(tetrazolioum)衍生物等)、酯酶活性(例如,钙黄绿素-AM、羧基荧光素(carboxyfluoresceine)等)、膜电位(例如,若丹明123、氧杂菁(oxonol)VI、羰花青(carbocyanine)等)、膜完整性(例如,SYTO-9、SYTO-13、Sytox绿(Sytox green)、碘化丙啶等)等。
因此,在具体实施方式中通过使用一种或更多荧光染料来进行染色。因此,取决于荧光滤光片的可利用性,样品可用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)型、赫斯特(Hoechst)33258型、赫斯特33342型、溴化乙啶型、碘化丙啶型等DNA特异性荧光染料染色。然而,具有较高灵敏度的荧光染料,例如GelRed、EvaGreen、和其他花菁衍生物,例如(Invitrogen-Molecular ProbesTM)系列及TOTO、YOYO、BOBO、POPO、JOJO、LOLO、SYTOX、PO-PRO、BO-PRO、YO-PRO、TO-PRO、JO-PRO、PO-PRO、LO-PRO的变体等是优选的。其他类型的荧光染料包括,但不限于,SYTOX蓝、色霉素A3、光神霉素、吖啶橙、SYTOX绿、噻唑橙、LDS751、7-AAD、SYTOX橙、DRAQ5。
在一个具体实施方式中,荧光染料选自由以下组成的组:赫斯特33342、赫斯特33258、DAPI、色霉素A3、光神霉素、溴化乙啶、吖啶橙、噻唑橙、7-AAD、花菁衍生物和荧光染料TOTO、YOYO、BOBO、POPO、JOJO、LOLO、SYTOX、PO-PRO、BO-PRO、YO-PRO、TO-PRO、JO-PRO、PO-PRO和LO-PRO的变体。
当前荧光染料的数量和质量正不断增加。为了防止荧光的损失,可以包括防衰减介质(antifading medium)(例如Vectashield-Vector H-1000、DABCO等)。然而,这些介质通常会导致弥漫性荧光和光背景,使图像的对比变得困难。因此,通常优选使用高度灵敏且相对光稳定的荧光染料,将其安置在水性缓冲溶液中,并在其干燥前相对快地评价样品。如果必要的话,载玻片可经洗涤并再次染色。
获得的图像可通过直接目视分析或,优选地,通过应用分析数字化图像的软件进行研究,该数字化图像通过连接到显微镜平台的数码相机或类似物获得。
最后,通过确定培养基中胞外DNA片段的存在来评价微生物的壁的完整性,其中,培养基中胞外DNA片段的存在指示该细菌的细胞壁的完整性已被破坏。
然而,如上面提到的(发明内容),当细菌培养物是混合的或受污染的培养物,即,存在对作用于细菌细胞壁的抗生素是敏感的或耐受的细胞的混合物时,本发明的第一种方法将不是非常适合作为严格的判别标准,因为对抗生素的敏感性和耐受的细菌均示出明显完整的细胞壁。为了解决这个问题,本发明人已经设计了只影响其细胞壁已被作用于细胞壁的抗生素的作用预先破坏的细菌的裂解溶液。该裂解溶液可被加入到已预先暴露于所述抗生素的作用下的细菌培养物中,使细菌类核被释放,然后观察到具有受损细胞壁的细菌(实施例1到5)。因此,应用该裂解溶液后细菌类核的存在是对作用于细胞壁的所述抗生素敏感的细菌的存在的指示。
因此,在另一个方面,本发明涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价存在于培养物中的细菌细胞壁的完整性的方法(在下文中,“本发明的第二种方法”),其包括:
ⅰ)将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述培养物中,
ⅱ)将裂解溶液加入到产生自步骤i)的培养物中,其中所述裂解溶液是对那些细胞壁已被作用于细菌细胞壁的抗生素破坏的细菌特异的裂解溶液,并包含pH在3至11.5之间的缓冲液,和
ⅲ)确定细菌类核的存在,
其中,培养基中细菌类核的存在指示该细菌细胞壁的完整性已被破坏。
术语和表达方式“评价细菌的细胞壁的完整性”、“细胞壁”和“作用于细胞壁的抗生素”已在上面的本发明的第一种方法中被限定,并适用于本发明的方面。
此外,虽然本发明的第二种方法已被设计用于评价混合培养物或受污染培养物中细菌细胞壁的完整性,但本领域技术人员应理解所述的本发明的第二种方法还可应用到纯培养物中。
在本说明书中,术语“纯培养物”已在上文被限定。在本发明中,“混合培养物”应被理解为含有两种或更多不同种类细菌的细菌培养物。在大多数情况下,培养物中两个或更多不同种类细菌的存在原因在于由于不正确的样品处理导致的培养物的污染,所以在本发明的上下文中,术语“混合培养物”和“污染的培养物”是等价的,并且能够贯穿本说明书可互换地使用。因此,在本发明的第二种方法的一个具体实施方式中,存在于培养物中的细菌属于同一种类或不同种类。
如可被本领域技术人员看出的,本发明的第二种方法的步骤i)和iii)是与本发明的第一种方法[步骤i)和ii),分别]共有的。因此,所有先前提到的涉及所述步骤的说明和具体实施例也适用于本发明的第二种方法。
本发明的第二种方法除了步骤i)和ⅲ)[与本发明的第一种方法的步骤i)和ii)共有]外,包括未在本发明的第一种方法中出现的包括将裂解溶液加入到产生自步骤i)的培养物中的步骤ii),其中所述裂解溶液是对那些细胞壁已被作用于细菌细胞壁的抗生素破坏的细菌特异的裂解溶液,并包含pH在3和11.5之间的缓冲液。
具体地,该裂解溶液影响具有被作用于细菌细胞壁的抗生素影响的细胞壁的细菌,其主要包含pH在3和11.5之间的缓冲液,但其还可以以不同比例包含其他组分,包括,但不限于,离子型去污剂、非离子型去污剂、盐等。
因此,在具体实施方式中,作为裂解溶液一部分的缓冲液是具有式(HOCH2)3CNH2的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris),其也可被用于制备其他溶液,包括,但不限于,Tris-HCl缓冲液、Tris-Gly缓冲液、TAE(Tris-乙酸-EDTA)缓冲液和TBE(Tris-硼酸-EDTA)缓冲液。Tris具有8.06的pKa,这为其提供了在范围为7.0至9.2之间的pH下有效的缓冲能力。最常用的形式被称为Tris碱(胺的非离子化的基本形式);有时也使用酸形式或盐酸盐(Tris-HCl)。其他缓冲溶液包括,但不限于,Hepes、Mops、Pipes等。为了获得接近11.5的稳定pH,使用也被称为磷酸氢二钠的二盐基性磷酸钠(dibasic sodium phosphate)(Na2HPO4)、硼酸-硼酸盐、三乙胺和4-[环己基氨基]-1-丁烷磺酸(CABS)。
在另一具体实施方式中,除缓冲溶液外,裂解溶液包含上达至3%的离子型去污剂或非离子型去污剂。
如本文所用,术语“离子型去污剂”是指具有疏水部分和亲水部分的任何化合物,其在溶液中形成带正电的离子(阳离子去污剂)或带负电的离子(阴离子去污剂),并且其允许获得乳状液。如本领域技术人员所理解的,术语“去污剂”、“表面活性剂(surfactant)”和“表面的活性试剂(surface active agent)”是同义的,因此它们可贯穿本说明书互换地使用。
阳离子去污剂的实例包括,但不限于,具有线性或环状结构的伯铵盐、仲铵盐、叔铵盐和季铵盐、它们的混合物,如,例如,吡啶盐、哌嗪盐,及所述铵盐的衍生物。术语“铵盐的衍生物”包括在同一结构中结合至少两个伯氨基、仲氨基、叔氨基和/或季氨基的盐,如,例如,胍盐、哌嗪盐和咪唑盐。此限定也将包括氨基酸盐,例如,赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐或色氨酸盐。同样地,此定义将涵盖铵盐,其中正电荷是在磷原子上,而不是在氮原子上,如,例如,碘化双十四烷基(三甲基乙基膦)甲基膦酸酯(ditetradecyl(trimethylethylphosphonio)methylphosphonate iodide)、碘化双十四烷基(丁基二甲基膦)甲基膦酸酯(ditetradecyl(butyldimethylphosphonio)methylphosphonate iodide)、碘化双十四烷基(碘化二甲基异丙基膦)甲基膦酸酯(ditetradecyl(dimethylisopropylphosphonio iodide)methylphosphonate iodide)或碘化双十四烷基(三甲基砷)甲基膦酸砷(arsenic ditetradecyl(trimethylarsonio)methylphosphonate iodide)、碘化二油基(三甲基膦)甲基膦酸酯(dioleyl(trimethylphosphonio)methylphosphonate iodide)。铵盐的实例包括,但不限于,四烷基铵盐、烷基苄基-二甲基-铵盐或杂环铵盐,如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
离子型去污剂的非限制示例性实例包括酰基-氨基酸如酰基-谷氨酸,酰基-肽、肌氨酸酯、牛磺酸酯等,羧酸如具有饱和链的酸、羧酸酯、羧酸醚、磷酸酯,磺酸如酰基-异硫氰酸酯(acyl-isothianates)、烷基芳基磺酸酯、烷基磺酸酯、磺基琥珀酸酯等,以及硫酸酯如烷基醚硫酸酯和烷基硫酸酯。
在一个具体实施方式中,离子型去污剂是选自由十二烷基硫酸钠(SDS)、烷基苯磺酸酯、月桂酰肌氨酸(laurylsarcosine)、甘氨胆酸盐水合物(glycocholic acid salt hydrate)和它们的盐组成的组的去污剂。
非离子型去污剂的实例包括,但不限于,聚山梨醇酯、聚已二醇共聚物和聚丙二醇共聚物,例如吐温(Tween)、司盘(Span)、泊洛沙姆(Poloxamer)。
在另一具体实施方式中,非离子型去污剂选自由以下组成的组:叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇(t-octylphenoxypolyethoxyethanol)、N,N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺(N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide)、Brij(r)35P、N-癸酰基-N-甲基谷氨酰胺(N-decanoyl-N-methylglutamine)、洋地黄皂苷、十二酰基-N-甲基葡糖酰胺(dodecanoyl-N-methylglucamide)、庚酰基-N-甲基谷氨酰胺(heptanoyl-N-methylglutamide)、支链的辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(octylphenoxypoly(ethyleneoxy)ethanol)、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺(N-nonanoyl-N-methylglucamine)、Nonidet P40、N-辛酰基-N-甲基谷氨酰胺(N-octanoyl-N-methylglutamine)、司盘20溶液和聚山梨醇酯20。
在另一具体实施方式中,裂解溶液进一步包含上达至3M浓度的盐。可为本发明的裂解溶液的一部分的盐的实例包括,但不限于,碳酸盐、氯化物、磷酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐(乙酸盐、甲酸盐、水杨酸盐等)。在一个具体实施方式中,裂解溶液包含氯化钠(NaCl)。
在一个具体实施方式中,在包含在3至11.5之间的pH下,本发明提供的裂解溶液包含0.001M至2M的Tris、上达至3%的SDS和上达至3M的浓度的NaCl。然而,本领域技术人员应理解,这些化合物可被替换为其他等效的化合物;例如,可用上达至10%的Triton X-100代替SDS。
在另一具体实施方式中,本发明提供的裂解溶液包含约0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇(Tris)、约0.025%的SDS、约0.5M或0.05M的氯化钠,且pH为10;在这种情况中,可用约5%的Triton X-100代替SDS。
在另一具体实施方式中,本发明提供的裂解溶液包含约0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇、约5%的Triton X-100、约1M的氯化钠,且pH为10。
在另一具体实施方式中,本发明提供的裂解溶液包含约0.3M的磷酸氢二钠、约2%的SDS、约0.05M的乙二胺四乙酸(EDTA),且pH为11.45。
根据所使用的溶液和样品的类型,在裂解溶液中在0.5分钟至120分钟之间、优选在1至35分钟之间、更优选约5分钟;并在1℃至45℃之间、优选在15℃至40℃之间、更优选在22℃至37℃之间的温度下孵育制备物(preparation)。在一个具体实施方式中,在22℃的温度下进行孵育。在另一具体实施方式中,在37℃的温度下进行孵育。
一旦裂解溶液被加入到预先在作用于细胞壁的抗生素的存在下孵育的细菌培养物中,培养基中细菌类核的存在即被检测到[步骤iii)]。如本发明的第一种方法所描述的,可通过显微镜或通过用于检测由微生物释放到培养基中的DNA的任何其他替代的物理或化学方法来进行培养基中细菌类核存在的评价,该其他替代的物理或化学方法包括,但不限于,电泳、抗体、分光光度法、聚合酶链式反应、杂交技术、微阵列、微流体、纳米颗粒、量子点等。这些方法在现有技术水平中是众所周知的,且将该方法付诸实践是本领域技术人员的常规操作。
然而,例如,在具体实施方式中,借助于显微镜进行细菌类核的检测,为此,有必要使来自由步骤i)[即,使细菌培养物暴露于抗生素的作用下后]产生的培养物的样品固定在载体如载玻片上。在这种情况下,本发明的第二种方法的步骤ii),即,加入仅影响细菌细胞壁已受抗生素影响的细菌的裂解溶液,可在使细菌固定于所述载体上之前或之后进行。因此,在具体实施方式中,本发明的第二种方法进一步包括在步骤(ii)之前或之后使来自培养物的样品固定在载体上。已在涉及本发明的第一种方法的上文中描述了在现有技术中存在的使样品固定在载体上、以及制备固定于载体上样品的方法和技术,且它们适用于本发明的第二种方法。
如果在使来自由步骤i)产生的培养物的样品固定于载体如载玻片上之后进行使用裂解溶液的处理,则所述载玻片以水平位置被浸没在含有裂解溶液的容器中。在用裂解溶液处理(如上所述)之后,可以洗涤该制备物以除去剩余的该溶液。为此,将载体放入尽可能温和的洗涤溶液中,避免使用螯合剂或去污剂;作为说明,该载体可以水平位置被浸没在含有大量的蒸馏水或缓冲溶液或生理盐水(physiological serum)的容器中,持续1至60分钟的时间。
此后,将样品脱水。为此,可使用具有渐增的乙醇浓度的溶液。例如,将载玻片提起并浸没于具有一系列在5%和100%之间渐增的乙醇浓度的容器中,每个浓度30秒到60分钟,然后空气干燥该制备物。乙醇的温度范围可从-20℃到室温。可优选使用-20℃下的乙醇以提高DNA沉淀,每次5分钟。作为在一系列乙醇中孵育的替代选择,可通过在不同的醇如甲醇的溶液中孵育制备物,或允许空气干燥或在烘箱中干燥而脱水。
最后,如果样品已被固定,那么在本发明的第二种方法的步骤iii)中确定培养基中或载体上细菌类核的存在。
在本发明中,“细菌类核”被理解为在细菌细胞的细胞质中含有DNA的区域。实验证据表明,类核基本上由DNA(60%)与小比例的RNA和蛋白质一起组成。后两个组分充当信使RNA和基因组调控蛋白。在现有技术水平下,细菌类核也被称为“核区”或“核小体”。如本发明的第二种方法中所要求的,上述观察培养基中胞外DNA片段的存在的技术也可被用于观察细菌类核。
如果所选择的用于确定细菌类核的存在的技术是显微镜方法,那么,如上文本发明的第一种方法中所述,使DNA片段稳定和牢固地附着于载玻片上是合适的,因为它们可变得分开。
一旦样品被处理并且在DNA片段被稳定和牢固地附着在载玻片上后,可将样品染色并可对微生物细胞壁的完整性进行评价。因此,在本发明的第二种方法的具体实施方式中,通过染色进行培养基中细菌类核存在的观察。可通过适当选择染色条件来获得高图像质量和高评价结果的一致性。已在上面涉及本发明的第一种方法的本说明书中描述可被用于通过显微镜方法来观察DNA的不同染色技术以及染料,且它们适用于本发明的第二种方法。
因此,在一个具体实施方式中,通过染色的方式进行观察培养基中细菌类核的存在,在更具体的实施方式中,其是通过使用荧光染料进行的,在另一个仍然更具体的实施方式中,其选自由以下组成的组:赫斯特33342、赫斯特33258、DAPI、色霉素A3、光神霉素、溴化乙啶、吖啶橙、噻唑橙、7-AAD(7-氨基放线菌素D)、青色素衍生物、及荧光染料TOTO、YOYO、BOBO、POPO、JOJO、LOLO、SYTOX、PO-PRO、BO-PRO、YO-PRO、TO-PRO、JO-PRO、PO-PRO和LO-PRO的变体等。
在第一步骤中,将本发明的第二种方法付诸实践需要将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到细菌培养物中。任何在上面本发明的第一种方法中描述的抗生素可用于本发明的第二种方法。因此,在一个具体实施方式中,作用于细菌细胞壁的抗生素选自由以下组成的组:β-内酰胺抗生素(包括,但不限于,青霉素、头孢菌素、头霉素、碳头孢烯、碳青霉烯、单酰胺菌素和β-内酰胺酶抑制剂,例如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等)、异烟肼、乙硫异烟胺、乙胺丁醇、环丝氨酸和糖肽类抗生素(包括,但不限于,万古霉素或替考拉宁)。
本发明的方法的应用
如上所述,本发明的第一和第二种方法的实际应用是以快速和可靠的方式确定细菌是否对作用于细菌细胞壁的抗生素是敏感的或耐受的。通过本说明书中任何上述的本发明的方法来评价细菌壁的完整性足以用于这一目的。
因此,在另一方面,本发明涉及用于确定细菌对作用于细菌细胞壁的抗生素的敏感性的方法,其包括通过任何本发明的方法评价所述细菌细胞壁的完整性,其中,如果细菌细胞壁的完整性已被破坏,那么该细菌是对抗生素敏感的。相反,如本领域技术人员所理解的,如果细胞壁的完整性没有被损坏并且它是完整的(没有将胞外DNA片段或类核释放到培养基中),那么该细菌是对抗生素不敏感的,该细菌可是耐受菌或被称为持留菌或耐性菌的细菌。这两种类型的细菌均不受作用于细菌细胞壁的抗生素影响,但它们的不同之处在于耐受菌具有DNA突变,使得该抗生素耐受是永久的,而持留菌没有耐受的DNA突变,它是可逆的功能状态。因此,本发明的方法的其他应用由检测样品中耐受菌或持留菌组成。
因此,在另一方面,本发明涉及鉴定含有敏感细菌的培养物中持留菌或对作用于细菌细胞壁的抗生素耐受的细菌的方法,其包含通过本发明的第二种方法评价存在于所述培养物中的细菌细胞壁的完整性,其中细胞壁完整性没有被损坏的细菌被鉴定为持留菌或耐受菌。
本发明的方法的另一种实际应用涉及为患有细菌性疾病的个体设计定制的抗生素疗法,因为可以通过本发明的方法来确定引起细菌性疾病的细菌对特定抗生素是敏感的或耐受的。如果在应用任何本发明的方法后,发现引起细菌性疾病的细菌对测试的抗生素敏感,那么医生可做出对患所述细菌性疾病的个体给予基于所述抗生素的疗法的决定。相反,如果引起细菌性疾病的细菌对测试的抗生素是耐受的,那么医生会选择不基于所述抗生素的疗法。
因此,在另一方面,本发明涉及设计为患细菌性疾病的个体定制的抗生素疗法的方法,其包括
ⅰ)从源自所述个体的样品中分离引起细菌性疾病的细菌,和
ⅱ)通过根据本发明所述的任何一种方法来评价所述细菌细胞壁的完整性,
其中,如果所述细菌细胞壁的完整性已被破坏,那么所述个体可接受基于作用于细胞壁的抗生素的疗法。
在本发明中,“个体”应理解为许多的任何动物种类,包括,但不限于,哺乳动物,特别是,牛畜(母牛、公牛、阉牛、牦牛等)、羊畜(绵羊等)、猪畜(家猪、野猪等)、山羊牲畜(山羊等)、马类或马畜(马、母马、斑马等)、驼科动物(camelids)(骆驼、美洲驼、羊驼等)、家兔、野兔、野牛、水牛、梅花鹿(deer)、驯鹿、北美驯鹿、狗、猫、老鼠、非人灵长类(黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、猕猴(macaques)、长臂猿等)。特别地,所述哺乳动物优选地为任何性别、年龄或种族的人类。术语“个体”或“受试者”是同义词,并且可贯穿本说明书可互换地使用。
在本发明中,“细菌性疾病”应理解为由个体上的细菌感染产生的任何疾病。细菌性疾病的实例包括,但不限于,由以下菌属的细菌感染引起的疾病:埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、李斯特菌属(Listeria)、气杆菌属(Aerobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、衣原体属(Chlamydia)、支原体属(Mycoplasma)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrio)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、色杆菌属(Chromobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、嗜血杆菌属(Hemophilus)和鲍特氏菌属(Bordetella)。
设计为患细菌性疾病的个体定制的抗生素疗法的方法的第一个步骤包括从源自所述个体的样品中分离引起所述细菌性疾病的细菌。
如本领域技术人员已知的,良好的样品选择、收集和运输,以及正确分离微生物的良好的样品处理对确保良好的结果来说是必不可少的。例如,样品必须是感染过程的代表、并且必须从正确的解剖学部位采集、必须采集足够量以保证合适的检查、在采集过程中必须使用无菌设备等。更多关于样品采集中使用的方法和材料的信息可在Rotger,R.(编者),1997(在上文中提到的)中找到。
此外,已在本说明书的上文中描述作用于细胞壁和取决于得到的结论可被施加给个体的抗生素。
本领域技术人员应理解,本发明的方法也可用于鉴定作用于细胞壁的新抗生素类化合物。因此,在另一方面,本发明涉及鉴定作用于细菌细胞壁的化合物的方法,其包括:
ⅰ)在候选化合物的存在下接触含有对作用于细菌细胞壁的抗生素敏感的细菌的培养物,和
ⅱ)通过本发明的任何方法评价所述细菌细胞壁的完整性,
其中,如果所述细菌细胞壁的完整性已被破坏,那么该候选化合物是作用于细菌细胞壁的化合物。
在本发明中,“作用于细菌细胞壁的化合物”应理解为干扰细菌细胞壁合成的任何步骤或影响其结构的化合物。
用于鉴定作用于细胞壁的化合物的方法的第一个步骤包括在候选化合物的存在下接触含有对作用于细菌细胞壁的抗生素敏感的细菌的培养物。对作用于细胞壁的抗生素敏感的细菌的实例包括,但不限于,大肠杆菌的阿莫西林敏感菌株、粪肠球菌的氨苄青霉素敏感菌株、鲍曼不动杆菌的iminepen敏感菌株、大肠杆菌的头孢他啶敏感菌株等。更多关于细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性的信息可在现有技术(2010年6月CLSIGuidelines)中找到。
本发明的裂解溶液
本发明是基于这样的事实,即作用于细胞壁的抗生素具有的对细菌的活性的一个结果是将胞外DNA片段释放到培养基中。此外,当细菌培养物是混合的或受污染的培养物,即,存在敏感性或耐受细胞的混合物时,胞外DNA片段的观察不会非常适合作为严格的判别准则,因为尽管释放了胞外DNA片段,但细菌的形态未被抗生素的作用改变,即,细菌对抗生素的敏感性和耐受均显示了显然完整的细胞壁。为了解决这个问题,本发明人设计了只影响其细胞壁已被作用于细胞壁的抗生素的作用预先破坏细菌的裂解溶液。
因此,本发明的另一方面涉及裂解溶液,其特征在于其仅影响具有被抗生素的作用破坏的细菌壁的细菌,在下文中本发明的裂解溶液包含缓冲液和在3和11.5之间的pH。
如在前面的本发明的方面所描述,特异性地影响具有被作用于细菌细胞壁的抗生素破坏的细胞壁的细菌的裂解溶液主要包含具有3至11.5之间的pH的缓冲液,但其还可以不同比例包含其他组分,包括,但不限于,离子型去污剂、非离子型去污剂、盐等。
因此,在一个具体实施方式中,本发明的裂解溶液进一步包含上达至3%的离子型去污剂或非离子型去污剂。在一个具体实施例中,所述离子型去污剂是选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠、烷基苯磺酸酯、月桂酰肌氨酸、甘氨胆酸盐水合物及它们的混合物。在另一具体实施方式中,所述非离子型去污剂选自由以下组成的组:叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇、N,N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺、Brij(r)35P、N-癸酰基-N-甲基谷氨酰胺、洋地黄皂苷、十二酰基-N-甲基葡糖酰胺、庚酰基-N甲基谷氨酰胺、支链的辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、Nonidet P40、N-辛酰基-N-甲基谷氨酰胺、Span20溶液和聚山梨醇酯20。在另一具体实施方式中,该裂解溶液进一步包含上达至3M浓度的盐,例如,碳酸盐、氯化物、磷酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐(乙酸盐、甲酸盐、水杨酸盐等);在一个具体实施方式中,该裂解溶液包含氯化钠(NaCl)。
在一个具体实施方式中,在3至11.5之间的pH下,本发明提供的裂解溶液包含0.001M至2M的Tris、上达至3%的SDS和上达至3M浓度的NaCl。然而,本领域技术人员应理解,可以用其他等效的化合物代替这些化合物;例如,可以用上达至10%的Triton X-100代替SDS。
在另一具体实施方式中,本发明提供的裂解溶液包含约0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇(Tris)、约0.025%的SDS、约0.5M或0.05M的氯化钠,且pH为10;在这种情况中,可以用约5%的Triton X-100代替SDS。
在另一具体实施方式中,本发明提供的裂解溶液包含约0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇、约5%的Triton X-100、约1M的氯化钠,且pH为10。
在另一具体实施方式中,本发明提供的裂解溶液包含约0.3M的磷酸氢二钠、约2%的SDS、约0.05M的乙二胺四乙酸(EDTA),且pH为11.45。
可在本发明的第二种方法的描述中找到关于本发明裂解溶液的不同具体实施例的更多细节和说明。
在另一方面,本发明涉及使用本发明的裂解溶液用于评价细菌细胞壁。可在本发明的第一和第二种方法的描述中找到关于本发明的裂解溶液可如何被用于评价细菌细胞壁的信息。
本发明的试剂盒
将本发明的方法付诸实践需要一系列可以试剂包(pack)或试剂盒的形式一起提供的组分,下文中为本发明的试剂盒。用于将本发明的方法付诸实践的有用成分包括,但不限于,缓冲溶液、裂解溶液、染料、用于样品采集的无菌材料(棉签、拭子、镊子等)、盖玻片和载玻片、蒸馏水、醇(乙醇)等。另外,本发明的试剂盒可包括指导本领域技术人员将本发明的方法付诸实践的说明书或标签(indication)。
因此,在另一方面,本发明涉及包括本发明的裂解溶液的试剂盒。
下列实施例仅说明本发明,而并不意味着限制本发明。
实施例
材料和方法
所需的材料和装置
荧光显微镜(推荐油镜(immersion objective))
4℃的冰箱
37℃的烘箱
80℃的烘箱或培养皿(可选)
37℃的恒温槽(incubation bath)
塑胶手套
玻璃盖玻片(18×18mm,22×22mm或24×60mm)
微量移液器
用于水平孵育的4个容器
蒸馏水
70%、90%、100%乙醇
制备每张载玻片的样品
1)将盖上的水平孵育容器中的裂解溶液置于37℃烘箱中。
2)以每毫升5百万到1千万的浓度稀释培养基或PBS中的微生物样品。
制备琼脂糖微凝胶
1)将具有胶凝琼脂糖的Eppendorf管放入浮板,让它处于盖子的水平面上,并让它在90-100℃水中漂浮5分钟,直到琼脂糖熔化。可替代地,也可在微波炉中熔化琼脂糖。
2)与浮板一起转移Eppendorf管到37℃恒温槽中,并使其维持5分钟,直到温度平衡。
3)将60μL的微生物样品添加到Eppendorf管的内容物中,并用微量移液器重悬。
4)将预处理的载玻片置于4℃的冷表面上(例如,金属或玻璃板)。
5)一旦载玻片变冷,用琼脂糖将微生物悬浮液沉积并放置玻璃盖玻片,以防止形成气泡。建议对于18×18毫米、22×22毫米或24×60毫米的盖玻片分别沉积12、20或50微升的滴。
6)将冷片与载玻片一起放入冰箱并使样品凝胶5分钟。
处理样品
1)使用手套通过轻轻滑动盖玻片来除去它,并立即将载玻片水平地放入具有裂解溶液的容器中,加盖并使其在37℃烘箱或浴槽(bath)中孵育5分钟。
2)使用手套借助于柳叶刀提起载玻片。水平地拿着载玻片并使其水平地沉积在含充裕的蒸馏水或缓冲溶液的容器中以清洗裂解溶液。使其孵育5分钟。
3)在-20℃下,将载玻片水平地放入具有70%乙醇的容器中(3分钟),然后放入另一个具有90%乙醇的容器中(3分钟),最后放入100%乙醇中(3分钟)。
4)使其空气干燥,并在500-1000W微波炉中孵育1-10分钟,或缺乏微波炉时,在80℃烘箱中孵育至少一小时或过夜。一旦干燥,经处理的载玻片可在室温下于黑暗中被存储在存档柜中数月。
用于在荧光显微镜下观察的样品的染色
取决于荧光滤光片的可用性,可用EvaGreen(绿色)或GelRed(红色)类型的DNA特异性荧光染料染色样品。SYBR系列的荧光染料,具体地SYBR Gold,允许良好的分辨率和可靠的光稳定性。
储藏及稳定性
在室温下储藏。
保质期:对于至少6个月的时期,试剂和材料是稳定的。建议以垂直位置和良好的密闭保存裂解溶液。
确定细胞壁完整性
在穆勒-欣顿(Mueller-Hinton)液体培养基中将每个样品的等分试样稀释到5百万到1千万的微生物/mL浓度,在穆勒-欣顿液体培养基中用抗生素孵育它们。另一方面,将含有低熔点琼脂糖的凝胶化等分试样的0.5mL微量离心管置于90℃-100℃水浴中约5分钟,以完全熔化琼脂糖,然后置于37℃水浴中。接着,将25μL的稀释样品加至所述管中并与熔化的琼脂糖混合。将20μL的样品-琼脂糖混合物的等分试样用移液器吸取到已预先被涂覆(例如,用琼脂糖膜涂覆)的载玻片上,并用22×22mm盖玻片覆盖样品。将载玻片置于冰箱(4℃)中的冷培养皿上5分钟,以使琼脂糖形成具有完整细胞捕获在其中的微凝胶。对于革兰氏+(革兰氏阳性)细菌在37℃下而对于革兰氏-(革兰氏阴性)细菌在22℃下小心地除去盖玻片并将盖玻片以水平位置立即浸没在裂解溶液中5分钟。在培养皿上用充裕的蒸馏水水平地洗涤载玻片3分钟,通过在渐增浓度(70%、90%和100%)的冷乙醇(-20℃)中水平地孵育其来使其脱水,每个浓度持续3分钟,并加热炉中空气干燥。将干燥的载玻片在750W的微波炉中孵育4分钟,并用25μL的以TBE缓冲液(0.09M Tris-硼酸盐,0.002MEDTA,pH7.5)1:400稀释的SYBR Gold(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)将DNA与玻璃盖玻片一起在黑暗中染色2分钟。在pH6.88的磷酸盐缓冲液(Merck,Darmstadt,Germany)中简短洗涤后,加上24×60mm的盖玻片,并通过荧光显微镜观察载玻片。
荧光显微镜和数字图像分析
使用100×的物镜和适用于FITC-SYBR Gold(在465nm下激发,在515-555nm下发射)、PI-Cy3(在540/25nm下激发,在605/55nm下发射)和DAPI(在340-380nm下激发,在435-485nm下发射)的荧光滤光片在落射荧光显微镜(epifluorescence microscope)(Nikon E800)下观察图像。在对氨苄青霉素的剂量响应实验中,用高灵敏度的CCD照相机(KX32ME,Apogee Instruments,Roseville,CA,USA)拍摄图像。获得16位数字图像并将其存档为.GIFf文件。图像分析使用Visilog5.1程序(Noesis,Gif sur Yvette,France)中的宏。这允许确定阈值,减去背景并以μm测量类核光晕的平均宽度的大小,在类核的外周端和细胞体的外部界限之间划定界限。在未认出细胞体的情况下,类核的质心被认为是测量分散类核的光晕宽度的内部参照点。
实施例1
确认该技术起作用:在对作用于细菌壁的抗生素敏感的细菌中的细菌类核
的释放和扩散的壁残留物和/或细菌产物的释放
将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的三种不同菌株暴露于β-内酰胺类抗生素阿莫西林和β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸,并通过本发明的用于评价细胞壁完整性的技术处理。将在穆勒-欣顿液体培养基中生长的在对数生长期的细菌用抗生素在37℃下于穆勒-欣顿液体培养基中伴随着搅拌孵育40分钟。根据临床和实验室标准化研究所(CLSI)指出的截取点选择抗生素的剂量。根据其建议,当菌株的最低抑制浓度(MIC)为≤8/4(阿莫西林:8μg/mL和克拉维酸:4μg/mL)时认为其是敏感的而当其MIC为≥32/16(阿莫西林:32μg/mL和克拉维酸:16μg/mL)时认为其是耐受的。根据培养皿扩散数据,这些菌株中的一株是敏感菌株,另一株是具有中间敏感性的菌株,而剩下的菌株是耐受菌株。
结果示于图1。8/4的剂量后,仅敏感菌株的细菌被裂解,示出类核(a')。32/16的剂量后,敏感菌株和具有中间敏感性的菌株被裂解(a″和b″),而耐受菌株未被裂解(c″)。然而,在一些分离的细胞中可见一些细胞壁破坏。当抗生素有效时,除了类核的释放和扩散,观察到由细胞释出的胞外DNA片段的扩散均匀的微粒状-纤维状背景。
实施例2
评估从医院分离的几个大肠杆菌菌株的β-内酰胺类抗生素的敏感性或耐
受
接着前面实验(实施例1)的结果,研究了在Microbiology Service中分离的11个不同大肠杆菌菌株。用穆勒-欣顿培养基在培养皿上生长24小时后,在穆勒-欣顿液体培养基中将它们暴露于阿莫西林连同克拉维酸中1小时,此后通过根据本发明的用于评价细胞壁完整性的技术处理它们。如在实施例1中的,剂量为0、8/4和32/16(阿莫西林/克拉维酸)。
根据本发明的方案:
-三个菌株表现出甚至在低剂量(8/4)下的完全的壁裂解和胞外DNA片段的强烈背景,这些菌株被归类为敏感菌株。
-5个菌株仅表现出在高剂量(32/16)下完全的壁裂解和胞外DNA片段的强烈背景,这些菌株被视为具有中间敏感性的菌株。
-两个菌株表现出在高剂量下非裂解的细胞连同其他适度裂解的细胞,具有非常微弱的背景或无胞外DNA片段的背景。这些菌株被归类为耐受菌株。
该技术的结果与由Microbiology Laboratory(微生物实验室)提供的结果一致。
该实验的实际结论是,使用单一剂量,特别是低剂量(8/4),可以清楚地将敏感菌株与其余菌株区分开来。这可极大地简化多个菌株的大量研究,因为从临床的观点来看,对做出治疗决策重要的是从“不敏感”中区分“敏感”。在菌株具有对特定抗生素的中间敏感性的情况下,所述抗生素不会被施用,而将使用菌株对其完全敏感的其他替代抗生素。
实施例3
确定用β-内酰胺类抗生素的最小孵育时间,这允许检测对大肠杆菌的敏感
菌株和具有中间敏感性的菌株中的壁的影响。评估源自培养皿培养物或液
体培养物的细菌
在穆勒-欣顿液体培养基中将大肠杆菌的敏感菌株、具有中间敏感性的菌株和另一种耐受菌株暴露于阿莫西林连同克拉维酸,并通过本发明的用于评价细胞壁完整性的技术进行处理。剂量(阿莫西林/克拉维酸)为:8/4(低)和32/16(高)。用抗生素的孵育时间为5、10、20、30、40、60和75分钟。
A)当细菌源自24小时的培养皿培养物时,观察到下列情形:
-在敏感菌株中,20分钟后开始看到高剂量(32/16)下伴随胞外DNA片段的一些背景的非常微弱的影响和微弱的细胞裂解。此微弱的影响在低剂量(8/4)40分钟后被观察到,而它在某种程度上随着高剂量变强。伴随着在低剂量60分钟后胞外DNA片段的微弱背景和几乎所有细胞的裂解,以及高剂量后的大量背景和裂解,影响变得最大。
-60分钟且仅在高剂量(32/16)后,具有中间敏感性的菌株开始表现出明显影响,非常迟于敏感菌株。此影响75分钟后更为明显。
-耐受菌株完全未表现出任何影响,虽然高剂量(32/16)后75分钟,一些分离的细胞适度裂解,如图1c″。
B)当源自液体培养物的细菌在对数生长期时,观察到下列情形:
-在敏感菌株中,10分钟后开始观察到影响。在低剂量(8/4)下这是非常微弱的,而用高剂量(32/16)更显著。影响的强度逐渐增加,30分钟后影响与源自培养皿培养物的细菌中在60分钟后观察到的影响非常相似。
-30-40分钟且仅在高剂量(32/16)后,具有中间敏感性的菌株开始表现出明显影响,非常迟于敏感菌株。此影响60分钟后更为明显。
-耐受菌株完全未表现出任何影响,虽然高剂量(32/16)后60分钟,一些分离的细胞适度裂解,如图1c″。
结论:
1)细菌的生长状态影响对抗生素的敏感性。众所周知的是在静止期的非生长细胞大大降低了其对β-内酰胺类抗生素的敏感性。
2)从实用性的角度来看,为了安全地从其他菌株中区分大肠杆菌敏感菌株,如果它们是在对数生长期(新鲜液体培养物),那么用抗生素孵育它们30分钟就足够了,或,如果它们源于24小时的培养皿培养物,那么孵育40-60分钟是足够的。如果培养皿时间较长或液体培养物已达到对数生长期,细菌样品在液体培养基中用抗菌素的孵育时间可延长数小时。当评估临床样品时,同时处理敏感菌株、具有中间敏感性的菌株和耐受菌株作为抗生素活性和该技术有效性的对照是可取的。
实施例4
确定不同革兰氏+和革兰氏-细菌对不同β-内酰胺类抗生素(青霉素、头孢
菌素和碳青霉烯)的敏感性或耐受
随后在37℃、搅拌下,在穆勒-欣顿液体培养基中,将在具有穆勒-欣顿培养基的培养皿上生长24小时的不同细菌菌株暴露于β-内酰胺类抗生素60分钟,并最终通过根据本发明所述的用于评价细胞壁完整性的技术处理。
所使用的菌株和抗生素为:
革兰氏+
粪肠球菌氨苄青霉素敏感(MIC=4)和苄青霉素耐受(MIC>32)菌株。
屎肠球菌氨苄青霉素耐受(MIC>32)和苄青霉素耐受(MIC>32)菌株。
革兰氏-
鲍曼不动杆菌亚胺培南耐受(MIC>32)和头孢他啶耐受(MIC>32)菌株。
鲍曼不动杆菌亚胺培南敏感菌株(MIC=0.38)和对头孢他啶具有中间敏感性的菌株(MIC=12)。
大肠杆菌头孢他啶敏感菌株(MIC=1)和对氨苄青霉素具有中间敏感性的菌株(MIC=16)。
大肠杆菌氨苄青霉素耐受(MIC>256)和头孢他啶耐受(MIC=32)菌株。
抗生素的应用剂量为0,通过微量稀释(microdilution)和/或E-测试技术,以及由临床实验室标准化研究所(CLSI)指出的每个菌株敏感性和耐受的截取点技术来在Microbiology Laboratory中确定MIC。也使用比MIC高10倍的剂量。
每个菌株的抗生素截取点不同:
结果
革兰氏+
粪肠球菌氨苄青霉素敏感(MIC=4)和苄青霉素耐受(MIC>32)菌株。
-用氨苄青霉素孵育:0、4μg/mL(MIC)、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL、40μg/mL。用4μg/mL(MIC)的剂量孵育后,在大多数细胞中观察到了对壁的影响,细胞以异源方式被裂解,具有包含DNA片段的微弱背景。重度裂解:35%;中度裂解:25%;具有片段化DNA的裂解:12%;未裂解:28%。用8μg/mL、12μg/mL和16μg/mL的剂量孵育后观察到类似的结果。在40μg/mL的剂量后,背景变得非常微弱,具有很少的细胞,63%未裂解、15%具有指示对壁的影响的小光晕、20%具有大的裂解光晕、而2%是具有片段化DNA类核的裂解(图2)。
-用苄青霉素的孵育:0、0.06μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、320μg/mL。用16μg/mL的剂量孵育后,观察到一些背景,其在用32μg/mL和320μg/mL的剂量孵育后稍微增加。用16μg/mL的剂量孵育后,有4.5%的裂解细胞具有大的光晕。81%的细胞未裂解。用32μg/mL的剂量孵育后:4%具有大的光晕而4%伴随具有片段化DNA的类核裂解。65%的细胞未裂解。用320μg/mL的剂量孵育后:72.3%未裂解而25%具有小的光晕。用16μg/mL、32μg/mL和320μg/mL的剂量孵育后,观察到许多空的暗淡囊:0.5-1.5%。
屎肠球菌氨苄青霉素耐受(MIC>32)和苄青霉素耐受(MIC>32)菌株。
-用氨苄青霉素孵育:0、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL、32μg/mL(MIC)、320μg/mL。用320μg/mL的剂量孵育后,观察到一些影响,具有7.5%重度裂解细胞、1%具有带片段化DNA的类核的裂解细胞、2%具有小光晕的细胞和89%未裂解的细胞的微弱背景(图3)。
-用苄青霉素孵育:0、0.06μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、320μg/mL。用320μg/mL的剂量孵育后,没有背景,但观察到5%重度裂解的细胞。剩余的细胞未裂解。
革兰氏-
鲍曼不动杆菌亚胺培南耐受(MIC>32)和头孢他啶耐受(MIC>32)菌株。该菌株表现出非常微弱的基线背景。
-用亚胺培南孵育:0、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、320μg/mL。用16μg/mL的剂量孵育后,观察到没有胞外DNA片段的背景,且1%的细胞具有大的光晕,1%的细胞具有小的光晕并且0.5%的裂解细胞具有带片段化DNA的类核。用32μg/mL的剂量孵育后,观察到类似于用16μg/mL的剂量孵育的结果。用320μg/mL的剂量孵育,观察到胞外DNA片段的微弱背景,但92%的细胞未被裂解、2.5%裂解的细胞具有小的光晕、3.5%重度裂解的细胞和2%裂解的细胞具有带片段化DNA的类核。未裂解的细胞较大且较圆。
-用头孢他啶孵育:0、8μg/mL、20μg/mL、32μg/mL、256μg/mL、2,560μg/mL。用8μg/mL的剂量孵育后,22%的细胞是非常延长的且为丝状。在随后的剂量下,90%的细胞是丝状的。用20μg/mL和32μg/mL的剂量孵育后:84.5%的细胞显示小的光晕、1.5%的细胞在显示大的光晕、没有胞外DNA片段的背景。用256μg/mL的剂量孵育后:32.3%的细胞被重度裂解、63%的细胞显示小的光晕、4.7%未被裂解、具有微弱的背景。用2,560μg/mL的剂量孵育后,继续存在相同的背景,5%的细胞未被裂解、6.5%的细胞显示小的光晕、63.5%的细胞显示大的光晕、而25%是具有带片段化DNA的类核的裂解细胞。
鲍曼不动杆菌亚胺培南敏感菌株(MIC=0.38)和对头孢他啶具有中敏感性的菌株(MIC=12)。该菌株不具有基线背景。
-用亚胺培南孵育:0、0.038μg/mL、0.38μg/mL(MIC)、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL。用0.038μg/mL的剂量孵育后,有少许背景。75.7%的细胞未被裂解,并且仅有1.4%的细胞具有大的光晕并且22.9%的细胞具有小的光晕。0.38μg/mL后,有清晰的背景。75.7%的细胞被重度裂解具有大的光晕,5.9%的细胞具有小的光晕并且7.4%的裂解细胞具有带片段化DNA的类核。用4μg/mL、8μg/mL和16μg/mL的剂量孵育后,观察到背景和许多暗淡的空囊(在4μg/mL的剂量下为12%;在8μg/mL的剂量下为19.5%;在16μg/mL的剂量下为15%)。有许多具有带片段化DNA的类核的裂解的细胞(在4μg/mL的剂量下为66%;在8μg/mL的剂量下为69.5%;在16μg/mL的剂量下为73.5%)。有很少具有大的光晕的细胞(在4μg/mL的剂量下为13.5%;在8μg/mL的剂量下为6%;在16μg/mL的剂量下为5%)并有一些未裂解的细胞(在4μg/mL的剂量下为8.5%;在8μg/mL的剂量下为5%;在16μg/mL的剂量下为6.5%)。
-用头孢他啶孵育:0、8μg/mL、12μg/mL(MIC)、20μg/mL、32μg/mL、120μg/mL。用8μg/mL的剂量孵育后,存在82%的丝状细胞,具有共40%的具有小光晕的裂解细胞和1%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞,没有背景。在用12μg/mL(MIC)和20μg/mL的剂量孵育后,存在95%的丝状细胞,分别具有94.5%和91.5%的带小光晕的裂解细胞,和分别的1.5%和3%的带大光晕的裂解细胞,以及分别的4%和5.5%的未裂解细胞;用12μg/mL的剂量,存在微弱背景,该微弱背景在20μg/mL的剂量后增加。用32μg/mL的剂量孵育后,有更多的背景,90%的伸长细胞和88%的具有小光晕的裂解细胞,6%的具有大光晕的裂解细胞和6%的未裂解细胞。以120μg/mL的剂量孵育后,观察到大量背景,并且存在91%的丝状细胞和23%的具有大光晕的裂解细胞、67%的具有小光晕的裂解细胞、36%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞和7%的未裂解细胞。
大肠杆菌头孢他啶敏感菌株(MIC=1)与对氨苄青霉素具有中间敏感性的菌株(MIC=16)。
-用氨苄青霉素孵育:0、8μg/mL、16μg/mL(MIC)、20μg/mL、32μg/mL、160μg/mL。用8μg/mL的剂量孵育后,已经观察到大量背景,并且除了9%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞外,55%的细胞被重度裂解。用16μg/mL(MIC)的剂量孵育后:60.4%的具有大光晕的裂解细胞、5.7%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞、22.6%的空囊、11.3%的未裂解细胞。用20μg/mL的剂量孵育后:存在非常少的细胞。47.3%的细胞显示大光晕、8.6%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞、31.2%的空囊、和12.9%的未裂解细胞。用32μg/mL和160μg/mL的剂量孵育后,存在非常少的细胞,存在54%的空囊。
-用头孢他啶孵育:0、1μg/mL(MIC)、8μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、32μg/mL。用1μg/mL的剂量孵育后,存在99%的丝状细胞,97%的具有一些背景的重度裂解细胞(图4)。用8μg/mL的剂量孵育后,结果与用1μg/mL的剂量孵育时获得的结果类似,但具有更多的背景。用10μg/mL的剂量孵育后,与大量的背景一起获得76.5%的彻底裂解的细胞、11%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞和10.5%的空囊。用20μg/mL和32μg/mL的剂量孵育后,破坏是过度的,具有25.3%的空囊和20%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞、52.7%彻底裂解的细胞和2%未裂解细胞。
大肠杆菌氨苄青霉素耐受(MIC>256)和头孢他啶耐受(MIC=32)菌株。
-用氨苄青霉素孵育:0、8μg/mL、20μg/mL、32μg/mL、256μg/mL、2,560μg/mL。用256μg/mL的剂量孵育后,观察到仅0.5%的裂解细胞和1%具有带片段化DNA的类核的裂解细胞,没有背景,与基线和前述的剂量类似。用2,560μg/mL的剂量孵育后,虽然不是丝状,但细胞更细长;13%的重度裂解细胞、5%的中度裂解细胞、1.5%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞和4%的空囊,具有微弱的背景。
-用头孢他啶孵育:0、8μg/mL、20μg/mL、32μg/mL(MIC)、320μg/mL。用8μg/mL的剂量孵育后,存在13%的丝状细胞,仅1%的彻底裂解的细胞。用20μg/mL的剂量孵育后,存在99%的丝状细胞、94%的未裂解细胞;5%彻底裂解的细胞且没有背景。用32μg/mL的剂量孵育后,存在98%的丝状细胞、92%未裂解细胞、4%彻底裂解的细胞、3%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞、1%空囊,具有微弱的背景。用320μg/mL的剂量孵育后,观察到微弱的背景,具有99%的丝状细胞和95%中度裂解的细胞、3.5%的重度裂解细胞、0.5%的具有带片段化DNA的类核的裂解细胞和1%未裂解细胞。
实施例5
原位检测细菌群体内的持留菌以及它们的频数量化(frequency
quantification)
抗生素治疗后的持久性现象具有重大的临床利益。在细菌菌株群体中,尽管是对抗生素敏感的,可能存在一些不具有任何已知耐受机制而耐受抗生素的细胞,所述细胞是休眠的或生长缓慢。去除抗生素后,这些细胞的一些可以再次生长并且是当接受不连续的抗生素治疗时形成复发性感染的原因。当细菌成对数地生长时,可以以低比例发现这些持留菌,但是当它们进入静止期并且在生物膜形成期间时其频数增加(Lewis K.Persister cells,dormancy and infectious disease.Nat Rev Microbiol2007;5:48-56)。
就β-内酰胺类抗生素而言,持留菌被视为缺乏或具有失效的壁自溶系统,壁自溶系统在抗生素治疗后被触发。本发明的方法可以显示这些细胞从而提供巨大的价值。它们可在含有对抗生素敏感的细胞的培养物中以比现存的其他方法(例如通过时差显微镜(time-lapse microscopy)或流式细胞仪技术监测细胞生长)简单得多的方式被检测到。这些现存方法是复杂的、费力的、昂贵的,并且不能在临床水平下使用(Roostalu J,Joers A,Luidalepp H,Kaldalu N,Tenson T.Cell division in Escherichia coli culturesmonitored at single cell resolution.BMC Microbiol2008;8:68)。
图5示出源自液体培养基中的培养物、在对数期生长、对阿莫西林/克拉维酸敏感、并暴露于高剂量(32/16)下90分钟的大肠杆菌敏感菌株的细胞。除具有受影响壁的细胞和胞外DNA片段的背景外,清楚地观察到其很可能(must)在理论上(logically)对应于持留菌的完全不受抗生素的影响而具有完整形态的细胞。
因为持久菌细胞不生长,当用抗生素的孵育时间增加时,它们在载玻片上的相对比例应逐逐渐增加,而敏感细胞从培养物逐渐消失。当菌株用逐渐增加剂量的抗生素孵育特定时间时,这种现象也可发生。实际上,如果该结果被调整到用抗生素孵育后细胞存在的量,没有光晕的细胞(持留菌)将保持恒定而用抗生素的剂量或用抗生素的孵育时间无关,因为它们不生长;而剩余的具有光晕的敏感细胞将逐渐减少,因为它们从培养物中消失。其中,可用以下两种类型的实验确定未裂解的细胞是否对应于持留菌。
A)用渐增剂量的抗生素孵育。用渐增剂量的抗生素孵育氨苄青霉素敏感的大肠杆菌菌株60分钟。表1示出未裂解细胞的百分比随着抗生素的剂量而增加,而裂解细胞的百分比相应地减少。当它们是依照相对OD600,即,根据每次给药后培养物中细胞的相对数量时,可以看出,未裂解细胞的相对比例趋于在5-8.5之间,而裂解细胞的相对比例随着剂量的增加而显著地减少。
表1
用渐增剂量的氨苄青霉素孵育大肠杆菌敏感菌株60分钟的结果。由OD600归一化细胞的%。
B)用抗生素孵育持续渐增的时间段。用32/16的抗生素剂量孵育阿莫西林/克拉维酸敏感的大肠杆菌菌株24小时。将待研究的等分试样从培养物中提取图6中指定的时间。图6的上半部分示出,当受抗生素影响的细胞逐渐减少时,培养物中未裂解细胞的比例随着时间的推移逐渐增加。事实上,通过Neubauer室(Neubauer chamber)测量的具有光晕的细胞的百分比的下降曲线与培养物中细胞百分比的下降类似。如果将每种类型细胞的百分比相对于残留在培养物中细胞的百分比进行归一化,无光晕细胞的水平随着时间的推移趋于保持恒定,而具有受损壁的细胞的水平以与培养物中细胞类似的方式逐渐降低(图6,下半部分)。
结论,这两种类型的实验表明,无光晕的细胞随着时间的推移残留在具有抗生素以及具有不同渐增剂量的抗生素的培养物中。这支持了它们的持留状态,因为它们既不生长也不受抗生素影响,其频数很可能(must)独立于抗生素的剂量和用抗生素的孵育时间。
实施例6
确定具有受抗生素影响的细胞壁的细胞中具有片段化DNA的类核
在穆勒-欣顿液体培养基中将在对数生长中的大肠杆菌的敏感菌株和另一个具有中间敏感性的菌株暴露于阿莫西林和克拉维酸。剂量为32/16(阿莫西林/克拉维酸)。用抗生素的孵育时间为15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时。同时,同时也处理该菌株的无抗生素对照。
根据Tamayo等人描述的方案确定具有片段化DNA的类核的频数(Tamayo M,Santiso R,Gosálvez J,Bou G,Fernández JL.Rapid assessmentof the effect of ciprofloxacin on chromosomal DNA from Escherichia coliusing an in situ DNA fragmentation assay.BMC Microbiology2009;9:69)。该方案裂解所有细胞,不论它们壁的状态。这是用于评价一个群体中所有细胞的类核DNA状态的适合技术。另一方面,也在根据本发明的方案的识别对细胞壁影响而处理的制备物中确定这样的类核。这种方法是不适合的,因为其不允许估算其细胞壁不受抗生素影响的未裂解细胞中DNA的状态。然而,在该实验中大多数细胞都受抗生素影响的情况下,这允许专门地估算具有受损壁的细胞中的DNA断裂。这很重要,因为其允许评价以下原理:该原理表明具有受抗生素影响的细胞壁的细胞会产生延迟反应,该延迟反应可能通过生产游离氧自由基而将最终也影响类核DNA,该类核DNA稍后在细胞死亡过程中会被破碎(Kohanski,MA,Dwyer DJ,Hayete B,Lawrence CA,Collins JJ.A common mechanism of cellular deathinduced by bactericidal antibiotics.Cell2007;130:797–810)。
图7示出使用用于确定对细胞壁影响的方法处理的几个细胞。其中一个类核具有破碎的DNA。与完整的类核不同,后者的染色更淡,并且由于DNA片段的光晕从中央细菌区域或残留物扩散而占据了较大的表面。
实施例7
确定对β-内酰胺类抗生素的敏感性或耐受而不使用裂解,评估制备物中胞
外DNA片段的背景
当在没有于裂解溶液中孵育的步骤的情况下处理细菌时,这些细菌不论它们是否受抗生素影响都几乎是完整的。然而,如果用敏感菌株的截取剂量的抗生素适当孵育后,在制备物中可看到或不可看到含有由细胞释出的DNA片段的均匀扩散的微粒状-纤维状背景,从而可清楚地知道该菌株是否是敏感的。可通过用荧光染料使包含在微凝胶中的材料或未包含在微凝胶中的材料(材料是固定的或新鲜的)染色来进行该无需使用裂解来观察对细胞壁的影响的背景评估。
在纯培养物的情况下,含有存在于未使用裂解而制备的制备物中的DNA片段的背景的评估可足以确定在用细菌壁特异性抗生素孵育合适的时间后菌株是否是敏感的或耐受的。当由于临床紧迫性而时间紧迫时,这可能可以加快用于获得结果的时间。
A)包含在微凝胶中的材料
将具有细胞的液体包含于在醇中脱水的和/或空气干燥的或在烘箱中干燥的琼脂糖微凝胶中并用荧光染料染色。这是上文详细描述的相同过程,但没有用裂解溶液孵育。在完成该技术所需要的15-20分钟后可迅速地评价背景。该配制物是永久性的。其结果示于图8中,示出了存在于图1中的相同菌株,在培养皿上生长24小时,然后用0、8/4(低)和32/16(高)剂量的阿莫西林/克拉维酸孵育40分钟。在混合培养物或受污染培养物的情况下,该缩短的系统不允许检测细菌菌株本身的持留菌,或从耐受细胞中区分敏感细胞。此外,胞外DNA片段的背景强度取决于敏感细菌的浓度。如果浓度小,背景可是非常微弱的或几乎无法观察到的。因此,从0.07的OD600开始,用高浓度(32/16)孵育的阿莫西林/克拉维酸敏感大肠杆菌菌株在孵育15分钟后示出了非常清晰的背景(OD600:0.071;通过Neubauer室测量,每mL4.25千万个细胞;5.62%活细胞)且孵育上达至2小时时该背景保持强烈(OD600:0.033;每mL1.45千万个细胞;3.77%活细胞)。3和4小时后背景变弱(OD600:分别为0.037和0.033;在3和4小时下均为每mL1.4千万个细胞;在3和4小时下均为0.38%活细胞)且6小时后不再观察到背景(OD600:0.035;每mL1.35千万个细胞;0.13%活细胞)。从60分钟到6小时,即使细胞总数相对于初始细胞被维持在40-30%之间,但含有DNA片段的背景强度在该时间期间逐渐减小,直到其不再可检测到,这可能是由于它们的降解。
B)固定材料
可将无抗生素培养物的等分试样和具有多个剂量抗生素的其他等分试样与固定剂混合。可使用醇类固定剂、醛类固定剂或酮类固定剂如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛,以及乙酸、苦味酸、氯化汞、重铬酸根离子、四氧化锇等,以及它们的混合物如以例如3:1比例的甲醇:乙酸、及Carnoy液。就甲醛而言,溶液可是0.1%至50%、优选10%的水溶液。就其他固定剂而言,它们可以从0.1%至100%的不同比例使用。推荐采用含有微生物的5-10%的比例的水溶液和95-90%的固定剂。在湿涂片上固定的优势是,材料可贮存较长时间并在合适时观察。在载玻片上展开一滴(几微升)制备物并晾干。然后加入荧光染料SYBR Gold(1:400),铺放盖玻片并检查载玻片。甲醛仅保存背景很短的时期,因此是不推荐的。其他固定剂是更持久的且给出背景的清晰图像。
甲醇:乙酸是优选的。用甲醇:乙酸,材料更容易在载玻片上展开,背景材料和细菌更好地附着在玻璃上,而用其他固定剂,因为不预先用干热孵育,它们将很可能在染色过程中变得分离。观察到胞外DNA片段的背景为分散的聚集体(aggregate)(图9)。固定在载玻片上的材料的展开需要8-10分钟来干燥,虽然当载玻片被置于37℃下的培养皿上或烘箱中时其在5分钟内干燥。如果甲醇:乙酸(3:1)为95%,展开液滴后的干燥是快速的,在少于1分钟内。虽然材料简单,但相对于也是永久性的微凝胶制备物来说,固定在制备时间和和观察时间方面不提供极大的优势。因此,鉴于第一个快速临时敏感性或耐受确定,固定或使用微凝胶的操作性实际上是相似的。
C)新鲜材料
将荧光染料加入到培养物的等分试样中,放置盖玻片并在荧光显微镜下直接检查载玻片。例如,将2μL的荧光染料SYBR Gold(1:400)加入到约10μL的具有细菌的液体培养物中。这在具有作用于细胞壁的抗生素的培养物(包括一个无抗生素的对照培养物)中进行。对应于由敏感细菌发出的背景,除漂浮菌(floating bacteria)外,在具有抗生素的培养物中观察到在连续布朗运动(Brownian motion)中的扩散的细胞间微丝(microfilamentous)或粒状材料(图9)。对作用于细胞壁的抗生素的敏感性或耐受的1分钟确定是最快和最简单的。在任何情况下,其取决于细胞浓度、敏感细胞释放细胞物质的能力、菌株的纯度、用抗生素的孵育时间、抗生素的剂量等。有时可观察到释放DNA类核的裂解细菌,但大多数细菌不如此表现。在混合培养物或受污染培养物的情况下,该技术不允许检测细菌菌株本身的持留菌,或从耐受细胞中区分敏感细胞。最后,图像质量不与在包含于微凝胶中的情况下的图像质量一样清晰和明显,且该制备物不是永久性的,因此其不能被储藏和在将来检查,除非其不被冻结。
当在具有细菌对其敏感的壁特异性抗生素的液体培养基中生长的细菌被离心时,细菌积聚形成团块,而胞外DNA片段保留在上清液部分中。以湿涂片观察或在微凝胶中固定或处理,此上清液部分的等分试样可用荧光染料染色来评估。因此,也获得了关于对抗生素的敏感性或耐受的快捷信息。此胞外DNA片段的背景的评定不仅可通过显微镜进行,而且可通过用于检测DNA的任何其他替代的物理或化学方法进行(电泳、抗体、分光光度法、聚合酶链式反应、杂交技术、微阵列、微流体、纳米颗粒、量子点等)。
实施例8
评价在含有对细胞壁特异性抗生素敏感的细菌的培养物的制备物中观察
到的微粒状-纤维状背景的性质
为研究在含有对细胞壁特异性抗生素敏感的细菌的培养物的制备物中观察到的微粒状-纤维状背景的性质,进行了稀释培养物的用酶(蛋白酶K和DNA酶I)原位消化、荧光原位杂交(FISH)和微凝胶染色。
A)用蛋白酶K(一种降解蛋白质的酶)和DNA酶I(一种消化DNA的 酶)原位孵育
用氨苄青霉素敏感的大肠杆菌的菌株和亚胺培南敏感的鲍曼不动杆菌的菌株进行该实验。在37℃、在搅拌下、在穆勒-欣顿液体培养基中,用32μg/mL氨苄青霉素孵育第一个菌株并用0.76μg/mL亚胺培南孵育第二个菌株60分钟。孵育后,在载玻片上将每个具有细胞的培养物包含于微凝胶中。将含有无抗生素对照培养物的微凝胶和含有用抗生素处理的培养物的2个微凝胶置于各自的载玻片上。每个微凝胶的大小对应于18×18mm的载玻片盖。在蛋白酶K缓冲液(1%SDS,2mM EDTA)中洗涤一些载玻片上的微凝胶,而在DNA酶I缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.3,2mM MgCl2)中洗涤其他载玻片上的微凝胶。前者中,仅用蛋白酶K缓冲液孵育含有用氨苄青霉素处理的培养物的微凝胶中的一个,而用5μl的2mg/mL蛋白酶K在其缓冲液中孵育含有用氨苄青霉素处理的培养物的其他微凝胶。在用DNA酶I缓冲液洗涤的载玻片中,仅用DNA酶I缓冲液孵育含有用氨苄青霉素处理的培养物的微凝胶中的一个,而用5μl的2.5UDNA酶I在其缓冲液中孵育含有用氨苄青霉素处理的培养物的其他微凝胶。在湿度室(humidity chamber)中于37℃下进行孵育30分钟。然后在蒸馏水中洗涤载玻片、在渐增的醇中脱水、干燥并用SYBR Gold(1:400)染色。
结果:
未用氨苄青霉素或亚胺培南处理的培养物在制备物中没有显示出微粒状-纤维状背景(图10a)。用氨苄青霉素或亚胺培南处理的培养物显示出在仅仅用酶的缓冲液孵育的微凝胶中维持的背景(图10b、图10c和图10e)。当其用蛋白酶K孵育时,背景保持不变(图10f),而当其用DNA酶I孵育时,背景消失(图10d)。无论在微凝胶中或在于Carnoy中的展开中,在相同的缓冲液中或在水中将蛋白酶K浓度增加到10mg/mL均未引起对背景的影响。这表明所观察到的背景主要包括源自受抗生素影响的细胞的胞外DNA片段。当使用其他类型的抗生素如喹诺酮类时,未观察到此背景。
B)用大肠杆菌的全基因组DNA探针的荧光原位杂交(FISH)
在37℃、在搅拌下、在穆勒-欣顿液体培养基中用32μg/mL的所述抗生素孵育氨苄青霉素敏感的大肠杆菌培养物60分钟。将50μL的培养物与950μL甲醇:乙酸(3:1)混合,并在载玻片上展开。空气干燥后,将载玻片在甲醇:乙酸(3:1)(Carnoy液)中浸没5分钟,并晾干。然后在-20℃下于70%、90%和100%醇中孵育它们,每种5分钟,并晾干。通过在75%甲酰胺/2×SSC(pH7)中在67℃下孵育90秒来变性存在于载玻片上的DNA。然后使它们在-20℃下再次通过70%、90%和100%的醇,每种5分钟,并晾干。在它们的每个中,在展开区的水平下,移取几微升的用生物素标记的大肠杆菌全基因组DNA探针(4.3ng/μl在50%甲酰胺、2×SSC、10%硫酸葡聚糖、100mM磷酸钠、pH7中),放置一个18×18mm的盖玻片。在湿度室中孵育该探针过夜。在50%甲酰胺/2×SSC,pH7中洗涤未杂交的探针,两次5分钟的洗涤,然后在37℃下在2×SSC,pH7中洗涤两次,每次3分钟。为了显示杂交的探针,在37℃下在抗体封闭液(5%BSA,4×SSC,0.1%Triton X-100)中孵育载玻片5分钟,然后在链霉亲和素-Cy3(streptavidin-Cy3)(1:200,在1%BSA、4×SSC、0.1%Triton X-100中)中孵育30分钟。用DAPI染色(1μg/mL在Vectashield中)并在荧光显微镜下检查载玻片。
结果:
用DAPI的复染显示,在背景中可看到固定于Carnoy的制备物中的可以围绕细菌细胞的聚集体,该细菌细胞的类核用DAPI染色。DNA的染料容易渗透是由于所述细胞中壁的缺失。DAPI也染色聚集的背景但更淡(图11a)。通过检查探针的杂交信号,观察到由于抗生素处理而缺乏壁的细胞的类核与全基因组DNA探针杂交。该聚集的背景显示强烈的杂交信号(图11b),证明其以确定的方式对应于细菌DNA。
C)使含有亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌的稀释培养物的微凝胶染色
在37℃、搅拌下,在穆勒-欣顿液体培养基中用0.76μg/mL的所述抗生素孵育亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌培养物60分钟。将所述培养物的等分试样稀释10倍并包含在微凝胶中而不使用裂解,在渐增的醇中使其脱水,干燥并用SYBR Gold染色。稀释液允许更详细地观察微粒状-纤维状背景的外观,其对应于从分离瞬间的外观到拉长的纤维状外观的处于不同延长水平的DNA片段(图12)。
结果:
在其中细胞壁特异性抗生素已经发挥效力的微生物培养基中观察到的微粒状-纤维状背景对应于微生物释放的胞外DNA片段。
结论
作为一个整体,在实施例1至实施例8中获得的结果清楚地显示本发明提供的方法用于快速原位测定细菌对作用于细胞壁(例如,通过抑制肽聚糖生物合成)的抗生素的敏感性或耐受的有效性。已在使用源自临床分离株的不同微生物(例如,鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、克雷伯菌(Klebsiella spp.)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、沙门氏菌属(Salmonellaspp.)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、肠球菌(Enterococcus spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))进行的测试中已验证所述结果,这些临床分离株是在(西班牙)的医院中从不同患者和抑制肽聚糖合成的抗生素(例如,氨苄青霉素、头孢他啶、亚胺培南、青霉素和万古霉素)采集的,如Santiso等人所提到的(Santiso等人,BMC Microbiology2011,11:191),将其内容通过引用并入。
本发明提供的用于评价细胞壁完整性的技术是一种快速和简便的方法,其允许区分对作用于细胞壁(例如,通过干预肽聚糖的生物合成)的抗生素耐受和敏感的菌株。这种方法不仅在临床水平上而且在对于进行作用于细胞壁的抗生素的作用机理的基础研究上是有用的。
Claims (33)
1.一种用于在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价纯培养物中细菌的细胞壁的完整性的方法,其包括:
ⅰ)将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述细菌的所述纯培养物中,和
ⅱ)确定培养基中胞外DNA片段的存在,
其中,所述培养基中胞外DNA片段的存在指示所述细菌的细胞壁的完整性已被破坏。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法包括在步骤(i)和(ii)之间将来自于步骤(i)的所述培养物的样品固定在载玻片上。
3.一种用于在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价存在于培养物中的细菌的细胞壁的完整性的方法,其包括:
ⅰ)将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述培养物中,
ⅱ)将裂解溶液加入到产生自步骤i)的所述培养物中,其中,所述裂解溶液是对细胞壁已被所述作用于细菌细胞壁的抗生素破坏的细菌特异的裂解溶液,并包含具有在3至11.5之间的pH的缓冲液,和
ⅲ)确定细菌类核的存在,
其中,所述培养基中细菌类核的存在指示所述细菌的细胞壁的完整性已被破坏。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,存在于所述培养物中的细菌属于相同物种或不同物种。
5.根据权利要求3或4所述的方法,其中,所述裂解溶液进一步包含上达至3%的离子型去污剂或非离子型去污剂。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述离子型去污剂是选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠、烷基苯磺酸酯、月桂酰肌氨酸、甘氨胆酸盐水合物及它们的混合物。
7.根据权利要求5所述的方法,其中,所述非离子型去污剂选自由以下组成的组:叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇、N,N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺、二十三乙二醇十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基谷氨酰胺、洋地黄皂苷、十二酰基-N-甲基葡糖酰胺、庚酰基-N-甲基谷氨酰胺、支链的辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、N-辛酰基-N-甲基谷氨酰胺、司盘20溶液和聚山梨醇酯20。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法,其中,所述裂解溶液进一步包含上达至3M浓度的盐。
9.根据权利要求3或4所述的方法,其中,所述裂解溶液包含0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇、0.025%的十二烷基硫酸钠、0.5M或0.05M的氯化钠,且pH为10。
10.根据权利要求3或4所述的方法,其中所述裂解溶液包含0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇、5%的Triton X-100、1M的氯化钠、且pH为10。
11.根据权利要求3或4所述的方法,其中,所述裂解溶液包含0.3M的磷酸氢二钠、2%的十二烷基硫酸钠、0.05M的乙二胺四乙酸,且pH为11.45。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法,其中,所述方法进一步包括在步骤(ii)之前或之后将来自所述培养物的样品固定在载体上。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中,通过染色来进行培养基中胞外DNA片段的存在或细菌类核的存在的观察。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,通过使用一种或多种荧光染料来进行所述染色。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,所述荧光染料选自由以下组成的组:赫斯特33342、赫斯特33258、DAPI、色霉素A3、光神霉素、溴化乙啶、吖啶橙、噻唑橙、7-AAD、青色素衍生物和荧光染料TOTO、YOYO、BOBO、POPO、JOJO、LOLO、SYTOX、PO-PRO、BO-PRO、YO-PRO、TO-PRO、JO-PRO、PO-PRO和LO-PRO的变异体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中,所述作用于细菌细胞壁的抗生素选自由以下组成的组:β-内酰胺类抗生素、异烟肼、乙硫异烟胺、乙胺丁醇、环丝氨酸和糖肽类抗生素。
17.根据权利要求16所述的方法,其中,所述β-内酰胺类抗生素选自由以下组成的组:青霉素、头孢菌素、头霉素、碳头孢烯、碳青霉烯、单酰胺菌素和β-内酰胺酶抑制剂。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述β-内酰胺酶抑制剂选自由克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦组成的组。
19.根据权利要求16所述的方法,其中,所述糖肽类抗生素为万古霉素或替考拉宁。
20.一种用于确定细菌对作用于细菌细胞壁的抗生素的敏感性的方法,其包括通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法评价所述细菌的细胞壁的完整性,其中,如果所述细菌的细胞壁的完整性已被破坏,那么所述细菌是对所述抗生素是敏感的。
21.一种用于设计为患细菌性疾病的个体定制的抗生素疗法的方法,其包括
ⅰ)从源自所述个体的样品中分离引起所述细菌性疾病的细菌,和
ⅱ)通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法来评价所述细菌的细胞壁的完整性,
其中,如果所述细菌的细胞壁的完整性已被破坏,那么所述个体可接受基于作用于细胞壁的抗生素的疗法。
22.一种用于识别作用于细菌细胞壁的化合物的方法,其包括:
ⅰ)在候选化合物的存在下接触含有对作用于细菌细胞壁的抗生素敏感的细菌的培养物,和
ⅱ)通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法来评价所述细菌的细胞壁的完整性,
其中,如果所述细菌的细胞壁的完整性已被破坏,那么所述候选化合物是作用于细菌细胞壁的化合物。
23.一种用于识别含有敏感性细菌的培养物中的持留菌或对作用于细菌细胞壁的抗生素耐受的细菌的方法,其包括通过根据权利要求3至19中任一项所述的方法评价存在于所述培养物中的所述细菌的细胞壁的完整性,其中,细胞壁完整性未被损坏的细菌被识别为持留菌或耐受菌。
24.一种裂解溶液,其特征在于,其仅影响具有被抗生素的作用破坏的细菌壁的细菌,包含缓冲液且pH在3和11.5之间。
25.根据权利要求24所述的裂解溶液,其中,所述裂解溶液进一步包含上达至3%的离子型去污剂或非离子型去污剂。
26.根据权利要求25所述的裂解溶液,其中,所述离子型去污剂是选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠、烷基苯磺酸酯、月桂酰肌氨酸、甘氨胆酸盐水合物及它们的混合物。
27.根据权利要求25中任一项所述的裂解溶液,其中,所述非离子型去污剂选自由以下组成的组:叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇、N,N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺、Brij(r)35P、N-癸酰基-N-甲基谷氨酰胺、洋地黄皂苷、十二酰基-N-甲基葡糖酰胺、庚酰基-N-甲基谷氨酰胺、支链的辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、Nonidet P40、N-辛酰基-N-甲基谷氨酰胺、司盘20溶液和聚山梨醇酯20。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的裂解溶液,其中,所述裂解溶液进一步包含上达至3M浓度的盐。
29.根据权利要求24所述的裂解溶液,其中,所述裂解溶液包含0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇、0.025%的十二烷基硫酸钠、0.5M或0.05M的氯化钠,且pH为10。
30.根据权利要求24所述的裂解溶液,其中,所述裂解溶液包含0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇、5%的Triton X-100、1M的氯化钠,且pH为10。
31.根据权利要求24所述的裂解溶液,其中,所述裂解溶液包含0.3M的磷酸氢二钠、2%的十二烷基硫酸钠、0.05M的乙二胺四乙酸,且pH为11.45。
32.根据权利要求24到31中任一项所述的裂解溶液用于评价细菌细胞壁完整性的应用。
33.一种试剂盒,包括根据权利要求24到31中任一项所述的裂解溶液。
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