ES2396820A1 - Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana. - Google Patents

Abstract

Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana. La presente invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, que desde un punto vista práctico, permite determinar de forma rápida si una bacteria es sensible o resistente a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana. Asimismo, la presente invención también se relaciona con una solución de lisis de aplicación en el método anterior, que afecta de forma específica a las bacterias que presentan la pared celular dañada por la acción de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, permitiendo distinguir las bacterias sensibles de las resistentes a dicho antibiótico.

Description

Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria biotecnológica, y principalmente aquel relacionado con la microbiología, cuyo ámbito de aplicación se encuentra dentro del sector sanitario (humano, veterinario, medioambiental y básico). La presente invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, que desde un punto vista práctico, permite determinar de forma rápida si una bacteria es sensible o resistente a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su realización se desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos.

Algunos de los métodos más usados en la práctica clínica diaria incluyen (i) métodos de difusión, como el antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores (Bauer A W, et.al. Am. J. Clin. Pathol. 1966, 45:493-496) o el método épsilon test o E-test (AB Biodisk, Suecia), o (ii) métodos de dilución, como el método de dilución en agar o el método de microdilución con caldo. Comparando los métodos de difusión con los métodos de dilución, éstos son técnicamente más complejos y casi siempre más caros, en particular cuando se utilizan paneles comerciales de microdilución. En la práctica rutinaria del laboratorio de microbiología clínica, los métodos de microdilución en medio líquido son los más utilizados.

En muchos laboratorios el empleo de paneles comerciales se basa en la utilización de sistemas semiautomáticos de incubación-lectura-interpretación; esto facilita su uso, pero tiene el inconveniente del incremento del gasto. Algunas compañías han introducido en el mercado paneles en los que el medio de cultivo incluye un indicador fluorescente que permite la obtención rápida (menos de 8 horas) de los resultados. En relación con determinación rápida de resistencia a antibióticos que actúan a nivel de la pared bacteriana, como los �-lactámicos, se añade un compuesto metabolizable fluorogénico al medio de cultivo (solicitud de patente WO/1992/019763). Si el organismo crece con el antibiótico, el metabolismo de la bacteria da lugar a la suelta del fluoróforo. Si el organismo no crece, se incrementa la fluorescencia de la muestra.

Otra posibilidad es usar un compuesto indicador de color, como el tetrazolium, que en caso de sensibilidad al antibiótico produce un cambio de color tras añadir un transportador electrónico como la phenazine methosulfate. Sin embargo, no existen aún datos suficientes que permitan aconsejar el uso rutinario de este tipo de paneles.

Varias compañías comerciales están evaluando, también, sistemas expertos (programas informáticos) que facilitan la interpretación clínica de los resultados obtenidos; es presumible que su uso se generalizará en un futuro. Varios sistemas se encuentran a fecha de hoy en el mercado, MicroScan WalkAway, Vitek, Wider entre los más destacados. A falta de más experiencia clínica con el empleo de indicadores fluorescentes el tiempo medio de respuesta para obtener la susceptibilidad a antimicrobianos de un microorganismo específico oscila, como en los métodos de difusión previamente mencionados, entre 18 a 24 horas.

Recientemente se ha apuntado la posibilidad de emplear un sistema de dielectroforesis que detecta cambios en la electrofisiología de la célula tras administrar el antibiótico (Hoettges KF, Dale JW, Hughes MP. Rapid determination of antibiotic resistance in E. coli using dielectrophoresis. Phys Med Biol 2007;52:6001-6009).

Otro desarrollo para antibióticos que actúan a nivel de la pared bacteriana, como los �-lactámicos, consiste en la detección, mediante un sustrato específico, de la actividad de enzimas citoplásmicas que son liberadas por la célula al medio, si el antibiótico ha sido efectivo (European Patent EP0135023).

El BACcelr8r™ es una plataforma en desarrollo por Accelr8, para la identificación automática de microorganismos y estudiar su resistencia a antibióticos. No emplea cultivo ni hace necesario el aislamiento de las bacterias. Funciona mediante cassettes, en donde cada una corresponde a una muestra. Usa un sistema automatizado, con un microscopio controlado mediante un computador, una cámara digital y un software de análisis. Una bomba mantiene un flujo de medio con bacterias, en diferentes condiciones, a través de la cassette. El análisis de la resistencia a antibióticos podría completarse en 8 horas.

La solicitud de patente US2004/0014066 describe un método para detectar en una muestra la actividad de un antibiótico que afecta la integridad celular que comprende (a) proporcionar un microorganismo transformado que comprende una ácido nucleico que codifica un promotor operativametne unido a un gen reportero heterólogo capaz de emitir una señal detectable, y (b) contactar la muestra con el microorganismo trasformado, (c) observar dicho microorganismo para dicha señal detectable, en el que el promotor está regulado por un sistema de transducción de señales de dos componentes, en donde los componentes son (i) un receptor sensible a cambios en la envuelta o membrana celular del microorganismo y (ii) un factor que actúa en trans que es activado en repuesta a una estimulación por el receptor y que regula el promotor.

Antibióticos que actúan a nivel de la pared bacteriana El esqueleto de la pared celular bacteriana está constituido por un heteropolímero, el peptidoglicano mureína. Esta macromolécula está formada por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina (NAG) y el ácido Nacetilmurámico (NAM) unidos mediante enlaces ß-1,4. La cadena es recta y no ramificada, constituyendo la estructura básica de la pared celular. El ácido N-acetilmurámico posee un grupo de ácido láctico que enlaza con una pequeña cadena peptídica (tetrapéptido). Entre los aminoácidos típicos de esta cadena se encuentran la L-alanina, ácido D-glutámico, ácido m-diaminopimélico o la L-lisina o D-alanina.

Los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared bacteriana son distintas familias de fármacos que actúan sobre distintos pasos de la síntesis de la pared bacteriana:

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La cicloserina es un análogo de la D-alanina e inhibe competitivamente la unión de este aminoácido a las enzimas D-alanino-D-alanina sintetasa y la alanino racemasa, impidiendo su unión a los precursores del peptidoglicano.

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La fosfomicina bloquea la síntesis de los precursores del péptidoglicano. -La bacitracina inhibe el reciclado del undecaprenil, el transportador lipídico del peptidoglucano hacia el exterior de la célula.

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Los antibióticos glucopéptidos o glicopéptidos son una clase de péptidos que contienen azúcares ligados, como en la pared celular bacteriana, poseyendo una gran afinidad a los precursores de esta estructura. Los más conocidos son la vancomicina y la teicoplanina. La vancomicina ejerce su acción bactericida inhibiendo la síntesis de la pared celular bacteriana, uniéndose al fragmento D alanina-D alanina (D-Ala-D-Ala) del pentapéptido de la pared de las bacterias Gram+, bloqueando la incorporación de péptidos a la pared celular. Secundariamente, la vancomicina actuaría por otros mecanismos como es la afectación de la permeabilidad de la membrana citoplasmática e inhibición de la síntesis de ARN, que se ejerce después que el fármaco se unió al peptidoglicano.

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Los antibióticos �-lactámicos ejercen función bactericida al interferir la unión transversal o puente interpeptídico, necesario para la reticulación. Inhiben la actividad de las PBPs, serina proteasas o transpeptidasas, con las que se unen de forma irreversible.

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Otros antibióticos que interfieren con la síntesis de pared son isoniacida, etionamida y el etambutol. Se usan en el tratamiento de infecciones por micobacterias, al igual que la cicloserina, citada anteriormente. La isoniacida tiene actividad bactericida en fase de replicación activa. Afecta síntesis de ácido micólico, interrumpiendo la elongación de ácidos grasos. La etionamida también inhibe síntesis de ácido micólico. El etambutol interfiere la síntesis de arabinogalactano de la pared celular. La resistencia a estos antibióticos es por la falta de penetración en la bacteria y/o modificación de sus dianas celulares.

La resistencia a los antibióticos ocasiona decenas de miles de muertes cada año. Muchas de estas muertes podrían evitarse con un tratamiento antibiótico bien seleccionado por su efectividad. Dados los niveles de resistencia, es necesario realizar el cultivo bacteriano, seguido de antibiograma. Para completar todo ello, las bacterias deben crecer 2-3 días, habitualmente. El antibiograma en sí, suele requerir un día de incubación, al menos, en las bacterias habituales de crecimiento rápido.

En pacientes críticos de la UCI, es importante un tratamiento antibiótico rápido. Dada la demora del antibiograma, éste se realiza de modo empírico. Este tipo de tratamiento es inefectivo en el 20-40% de los casos, y el cambio de tratamiento tras los resultados del antibiograma puede ya no ser efectivo. En esta situación, es importante disponer de un sistema de antibiograma rápido. Los antibióticos que actúan a nivel de la pared bacteriana, concretamente los

�-lactámicos, son un grupo muy numeroso y de los más utilizados en la terapia anti-infecciosa. Es de gran interés disponer de sistemas de antibiograma rápido para este tipo de antibióticos.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han descubierto que una consecuencia de la actividad de los antibióticos que actúan a nivel de la pared celular bacteriana sobre las bacterias es la liberación de fragmentos extracelulares de ADN al medio de cultivo. Para observar este efecto, los inventores incubaron una cepa de E.coli sensible a ampicilina (un antibiótico �-lactámico) en presencia de dicho antibiótico, tras lo cual el cultivo se incluyó en diferentes microgeles sobre unos portaobjetos, a los que se les administró proteinasa K o DNAasa I (Ejemplos 7 y 8). Los cultivos sin tratar con la ampicilina no mostraron fondo micro granular-fibrilar en la preparación (Figura 10 a), mientras que en los cultivos tratados con ampicilina apareció un fondo microgranular. Cuando los cultivos tratados

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con ampicilina se incubaron con proteinasa K, el fondo permaneció inalterado (Figura 10 f), mientras que cuando se incubaron con DNAasa I, el fondo desapareció (Figura 10 d), indicando que el fondo observado incluye principalmente fragmentos extracelulares de ADN procedentes de las células afectadas por el antibiótico. Dicho fondo no se apreció cuando se usaron otros tipos de antibióticos, como las quinolonas, que no actúan a nivel de la pared celular.

No obstante, los inventores también observaron que, cuando el cultivo bacteriano es mixto o contaminado, es decir, hay mezcla de células sensibles o resistentes, dicho método no sería muy adecuado como criterio estricto de discriminación puesto que a pesar de liberar fragmentos extracelulares de ADN, la morfología de las bacterias no se ve alterada por la acción del antibiótico, es decir, tanto las bacterias sensibles como resistentes al antibiótico muestran aparentemente la pared celular intacta. Para solucionar este problema, los inventores han diseñado una solución de lisis que afecta únicamente a las bacterias cuya pared celular ha sido previamente dañada por la acción del antibiótico que actúa a nivel de la pared celular, y que cuando es añadida al cultivo bacteriano, que anteriormente ha sido expuesto a la acción de dicho antibiótico, se produce la liberación del nucleotide bacteriano observándose entonces una bacteria con la pared celular dañada (Ejemplos 1 a 5). Así, la presencia del nucleoide bacteriano tras aplicar la solución de lisis, es indicativo de la presencia de bacterias sensibles al antibiótico.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria en un cultivo puro en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende:

i) añadir a dicho cultivo puro de dicha bacteria un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular

bacteriana, y

ii) determinar la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo, en el que la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo es indicativo de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende:

i) añadir a dicho cultivo un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, ii) añadir solución de lisis al cultivo resultante de la etapa i), en donde dicha solución de lisis es una solución de lisis específica para aquellas bacterias cuya pared celular ha sido dañada por el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, y comprende un tampón con un pH comprendido entre 3 y 11,5, y iii) determinar la presencia del nucleoide bacteriano, en el que la presencia del nucleoide bacteriano en el medio es indicativa de que la integridad de la pared celular de las bacterias ha sido dañada.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, que comprende medir la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según la presente invención, en el que si la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada, entonces la bacteria es sensible al antibiótico.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diseñar una terapia antibiótica personalizada a un individuo que padece una enfermedad bacteriana que comprende i) aislar la bacteria causante de la enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según la presente invención, en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces dicho individuo es susceptible de recibir una terapia basada en un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para identificar un compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende: i) poner en contacto un cultivo de una bacteria sensible a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana en presencia del compuesto candidato, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según la presente invención, en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces el compuesto candidato es un compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para identificar una bacteria persister o tolerante a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana en un cultivo de bacterias sensibles, que comprende evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en dicho cultivo mediante un método según la presente invención, en el que la bacteria cuya integridad de la pared celular no haya sido dañada es identificada como persister o tolerante.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una solución de lisis caracterizada porque afecta solo a las bacterias que presentan la pared bacteriana dañada por acción de un antibiótico, que comprende un tampón y un pH de entre 3 y 11,5.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la solución de lisis de la presente invención para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende la solución de lisis de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Tres cepas diferentes de Escherichia coli, bacteria Gram-, expuestas al antibiótico �-lactámico amoxicilina, junto con el inhibidor de las â-lactamasas ácido clavulánico, procesadas mediante la técnica para evaluación de la integridad de la pared celular. La incubación fue en medio líquido Mueller-Hinton, durante la fase de crecimiento exponencial, a 37ºC, con agitación, durante 40 minutos. Las dosis de antibiótico fueron elegidas según los puntos de corte indicados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Así, la cepa se considera sensible cuando su concentración mínima inhibitoria (CMI) es < 8/4 (amoxicilina 8 μg/mL y ácido clavulánico 4 μg/mL) y resistente cuando su CMI es > 32/16 (amoxicilina 32 μg/mL y ácido clavulánico 16 μg/mL). Según las técnicas estándar de microbiología, la primera cepa (fila de arriba: a, a’, a’’) es sensible, la segunda es intermedia (fila del medio: b, b’, b’’) y la tercera es resistente (fila de abajo: c, c’, c’’). a, b, c: control, sin antibiótico. a’, b’, c’: 8/4; amoxicilina 8 μg/mL y ácido clavulánico 4 μg/mL; a’’, b’’, c’’: 32/16; amoxicilina 32 μg/mL y ácido clavulánico 16 μg/mL. Los controles sin antibiótico (a, b, c) muestran las bacterias sin lisar. Tras la dosis 8/4, solo las bacterias de la primera cepa, sensible, aparecen lisadas, mostrando los nucleoides (a’). Tras la dosis 32/16, la primera y segunda cepa, sensible e intermedia, aparecen lisadas (a’’ y b’’), mientras que la tercera, resistente, permanece sin lisar (c’’). Sin embargo, algún daño en pared celular es visible en algunas células aisladas. Cuando el antibiótico es efectivo, además de la liberación y expansión de los nucleoides, se aprecia un fondo homogéneo micro difuso, granular, de fragmentos de ADN desprendidos por las células.

Figura 2. Enterococcus faecalis, bacteria Gram +, sensible al antibiótico �-lactámico ampicilina (CMI = 4 μg/mL), tratada con diferentes dosis de ampicilina durante 60 min. a: control, sin antibiótico; b: 4 μg/mL (CMI); c: 8 μg/mL; d: 16 μg/mL; e: 32 μg/mL. La dosis CMI ya es suficiente para observar la afectación de la pared por el antibiótico y el fondo de fragmentos extracelulares de ADN.

Figura 3. Enterococcus faecium, bacteria Gram +, resistente al antibiótico �-lactámico ampicilina (CMI >32), incubada con diferentes dosis de este antibiótico durante 60 min. a: control, sin antibiótico; b: 32 μg/mL; c: 320 μg/mL. Tras 320 μg/mL se ve afectación de la pared en algunas células aisladas, con un fondo discreto de fragmentos extracelulares de ADN.

Figura 4. E. coli sensible al antibiótico �-lactámico ceftazidima, del tipo de las cefalosporinas. La cepa fue expuesta a diferentes dosis durante 60 minutos. a: control, sin antibiótico; b: 1 μg/mL (CMI); c: 8 μg/mL. La CMI da lugar a apariencia filamentosa de las células, con afectación de la pared. Tras 8 μg/mL se aprecia una gran afectación de la pared, visualizándose claramente el fondo de fragmentos extracelulares de ADN.

Figura 5. Células de E. coli, procedentes de un cultivo en medio líquido, creciendo en fase exponencial, sensible a la amoxicilina/ácido clavulánico, y expuesto a la dosis alta de 32/16 durante 90 minutos. Tras el procesado por la técnica de la invención, además de las células afectadas en la pared, que liberan el nucleoide, y del fondo de fragmentos extracelulares de ADN, se observa claramente una célula que mantiene su morfología intacta (asterisco), que no ha sido afectada por el antibiótico. Esta célula se comporta como un “persister”.

Figura 6. Gráficas que representan los porcentajes de células en cultivo, de células sin halo y de células con daño en la pared, de E. coli, procedentes de un cultivo en medio líquido, creciendo en fase exponencial, sensible a la amoxicilina/ácido clavulánico, y expuesto a la dosis alta de 32/16 durante diferentes tiempos. Arriba se observa que la proporción de células sin lisar va aumentando en el cultivo a lo largo del tiempo, a medida que van despareciendo las células afectadas por el antibiótico (HG: halo grande + HP: halo pequeño + F: lisadas con ADN fragmentado). Abajo, la misma figura pero cuyos datos han sido normalizados según el porcentaje de células que van quedando en el cultivo. Se observa que el porcentaje de células sin halo tiende a mantenerse constante en el tiempo, mientras que el porcentaje de células con pared dañada va disminuyendo del mismo modo que el de las células del cultivo. Esto apoya que las células sin halo se comportan como “persisters”.

Figura 7. Células de E. coli, procedentes de un cultivo en medio líquido, creciendo en fase exponencial, sensible a la amoxicilina/ácido clavulánico, y expuesto a la dosis alta de 32/16 durante 60 minutos. Tras el procesado por la técnica de la invención, se observan tres células que liberan el nucleoide, además del fondo típico. Uno de los nucleoides no mantiene la morfología intacta, sino que se muestra fragmentado, mucho menos teñido y más difuso (asterisco), mostrando un halo amplio de pequeños fragmentos de ADN que difunden del residuo bacteriano central.

Figura 8. Las mismas cepas de E. coli, presentadas en la Figura 1, fueron cultivadas durante 24 horas en placa y luego durante 40 min en medio líquido con las dosis 0 (a, b, c), 8/4 (dosis baja; a’, b’, c’) y 32/16 (dosis alta; a’’, b’’, c’’) de amoxicilina/ácido clavulánico. Las cepas fueron procesadas sin el paso de lisis de exposición a la solución de lisis. La cepa sensible se presenta en la fila de arriba (a, a’, a’’); la intermedia en la fila central (b, b’, b’’) y la resistente en la fila de abajo (c, c’, c’’). En esas condiciones de crecimiento y tras este período de incubación con el antibiótico, sólo la cepa sensible muestra el fondo homogéneo micro difuso, granular-fibrilar, de fragmentos extracelulares de ADN, desprendidos por las células. Este fondo es evidente tras la dosis baja (8/4) y se incrementa notablemente tras la dosis alta (32/16). De este modo, se puede diferenciar claramente la cepa sensible de las demás.

Figura 9. Una cepa de E. coli sensible a la ampicilina fue incubada con una dosis de 8 μg/mL de dicho antibiótico, durante 60 minutos. a y b: Observación en fresco. a: cultivo control, sin antibiótico; b: cultivo tratado con ampicilina. En este último se aprecia, entre las bacterias, un fondo difuso microgranular o fibrilar, de fragmentos extracelulares de ADN bacteriano. c y d: cultivo fijado en metanol:ácido acético. c: cultivo control, sin antibiótico; d: cultivo tratado con ampicilina, en el que se visualiza el material de fondo de ADN entre las bacterias, constituyendo agregados de diversa forma y tamaño.

Figura 10. Una cepa de E. coli sensible a la ampicilina fue incubada con una dosis de 32 μg/mL de dicho antibiótico, durante 60 minutos. Alícuotas de un cultivo control sin antibiótico y alícuotas del cultivo con el tratamiento de ampicilina, se incluyeron en microgeles y se tiñeron con SYBR Gold. El cultivo control sin antibiótico no muestra fondo micro granular-fibrilar en la preparación (a), mientras que el tratado con ampicilina sí evidencia dicho fondo (b). La incubación de los microgeles con los tampones de las enzimas DNAasa I (c) o proteinasa K (e) no afecta a dicho fondo. Cuando el microgel de los cultivos tratados con ampicilina se incuba con DNAasa I, 2.5 U, 30 minutos, el fondo desaparece de la preparación (d), mientras que cuando se incuba con proteinasa K, 2 mg/mL, durante 30 minutos, el fondo permanece inalterado (f). El tampón de la proteinasa K posee SDS y EDTA, que lisa las células. Subir la concentración de proteinasa K a 10 mg/mL en el mismo tampón o en agua, tampoco resulta en afectación del fondo. Este experimento demuestra que el fondo corresponde a fragmentos extracelulares de ADN.

Figura 11. Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) con sonda de ADN genómico total de E. coli, sobre extensiones de cultivo, fijados en Carnoy, de dicha bacteria tratada con ampicilina durante 60 minutos. El Carnoy provoca que material micro granular-fibrilar del fondo se agregue, englobando bacterias. Así, la contratinción con DAPI evidencia agregados del material de fondo, con bacterias cuyos nucleoides se tiñen intensamente con el DAPI. El material de fondo agregado también se tiñe con dicho colorante, aunque de modo más tenue (a). La sonda de ADN genómico total hibrida tanto en los nucleoides celulares como en el material de fondo, demostrando que este último corresponde a ADN bacteriano fragmentado.

Figura 12. Una cepa de Acinetobacter baumannii, sensible al imipenem, fue incubada con este antibiótico 0,76 μg/mL, 1 hora. Una alícuota del cultivo se diluyó y se incluyó en microgel de agrosa, se deshidrató en alcoholes crecientes, se secó y se tiñó con SYBR Gold. Se aprecia un fondo microgranular-fibrilar que corresponde a fragmentos de ADN en diferentes grados de estiramiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han descubierto que una consecuencia de la actividad de los antibióticos que actúan a nivel de la pared celular bacteriana sobre las bacterias es la liberación de fragmentos extracelulares de ADN al medio de cultivo. Para observar este efecto, los inventores incubaron una cepa de E.coli sensible a ampicilina (un antibiótico �-lactámico) en presencia de dicho antibiótico, tras lo cual el cultivo se incluyó en diferentes microgeles sobre unos portaobjetos, a los que se les administró proteinasa K o DNAasa I (Ejemplos 7 y 8). Los cultivos sin tratar con la ampicilina no mostraron fondo micro granular-fibrilar en la preparación (Figura 10 a), mientras que en los cultivos tratados con ampicilina apareció un fondo microgranular. Cuando los cultivos tratados con ampicilina se incubaron con proteinasa K, el fondo permaneció inalterado (Figura 10 f), mientras que cuando se incubaron con DNAasa I, el fondo desapareció (Figura 10 d), indicando que el fondo observado incluye principalmente fragmentos extracelulares de ADN procedentes de las células afectadas por el antibiótico. Dicho fondo no se apreció cuando se usaron otros tipos de antibióticos, como las quinolonas, que no actúan a nivel de la pared celular.

No obstante, los inventores también observaron que, cuando el cultivo bacteriano es mixto o contaminado, es decir, hay mezcla de células sensibles o resistentes, dicho método no sería muy adecuado como criterio estricto de discriminación puesto que a pesar de liberar fragmentos extracelulares de ADN, la morfología de las bacterias no se ve alterada por la acción del antibiótico, es decir, tanto las bacterias sensibles como resistentes al antibiótico muestran aparentemente la pared celular intacta. Para solucionar este problema, los inventores han diseñado una solución de lisis que afecta únicamente a las bacterias cuya pared celular ha sido previamente dañada por la acción de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular, y que cuando es añadida al cultivo bacteriano que anteriormente ha sido expuesto a la acción de dicho antibiótico, se produce la liberación del nucleoide bacteriano observándose entonces una bacteria con la pared celular dañada (Ejemplos 1 a 5). Así, la observación del nucleoide bacteriano tras aplicar la solución de lisis sobre las bacterias es indicativa de la presencia de bacterias sensibles al antibiótico.

En base a este descubrimiento, los inventores han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicados en detalle a continuación.

MÉTODOS PARA EVALUAR LA INTEGRIDAD DE PARED CELULAR BACTERIANA DE LA INVENCIÓN

Por lo tanto, en un aspecto la invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria en un cultivo puro en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana (de aquí en adelante primer método de la invención), que comprende:

i) añadir a dicho cultivo puro de dicha bacteria un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana,

y

ii) determinar la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo, en el que la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo es indicativo de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

En el contexto de la presente invención, el término “pared celular” se refiere a la pared celular que envuelve a una célula bacteriana y que está constituida por el peptidoglicano mureína, el cual está formado por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM) unidos mediante enlaces ß-1,4. Los términos “pared celular” y “pared celular bacteriana” son equivalentes y pueden ser empleados indistintamente a lo largo de la presente descripción.

En la presente invención, se entiende por “evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria” a la acción de averiguar si los componentes o estructura originales de la pared celular bacteriana han sido dañados, o si por el contrario conservan sus componentes y estructura intactas tras la exposición a un agente externo. En el contexto de la presente invención, el agente externo es un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, esto es, un antibiótico que bloquea la síntesis del peptidoglicano de manera que la pared celular de la bacteria resulta dañada.

En la presente invención se entiende por “cultivo puro” a aquel cultivo que contiene un solo tipo de microorganismo. Los diferentes medios de cultivo, técnicas y procedimientos para obtener cultivos puros son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y son práctica de rutina para el experto en la materia (Rotger, R. (editor), 1997, Microbiología Sanitaria y clínica, Editorial Síntesis, Madrid).

Una primera etapa del primer método de la invención comprende añadir a dicho cultivo puro de dicha bacteria un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana.

Un antibiótico es cualquier compuesto químico producido por un ser vivo, o derivado sintético del mismo, que a bajas concentraciones elimina o inhibe el crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad común a todos los antibióticos es la toxicidad selectiva: la toxicidad es superior para los organismos invasores que para los animales o los seres humanos que los hospedan. Los antibióticos se pueden clasificar en función de su estructura, del microorganismo al que atacan, por su mecanismo de acción, por su diana terapéutica, etc. En la presente invención, se entiende por “antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana” al antibiótico que interfiere en cualquiera de las etapas de la síntesis de la pared bacteriana. Un ensayo para determinar si un antibiótico actúa a nivel de la pared celular es, por ejemplo, cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos de la presente solicitud de patente.

En una realización particular, el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico �-lactámico, una isoniacida, una etionamida, un etambutol, una cicloserina y un antibiótico glucopéptido.

En otra realización particular, el antibiótico �-lactámico se selecciona del grupo que consiste en penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbacefem, carbapenémicos, monobactámicos e inhibidores de las �-lactamasas.

En otra realización particular, los inhibidores de las �-lactamasas se seleccionan del grupo que consiste en ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam.

En otra realización particular, el antibiótico glucopéptido es vancomicina o teicoplanina.

Como sabe el experto en la materia, el tiempo de incubación del cultivo junto con el antibiótico puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de si el cultivo está fase de crecimiento estacionario o exponencial, de si el cultivo se lleva a cabo en placa o en medio líquido, de la dosis de antibiótico que se añade al cultivo, etc. En general, el tiempo de incubación con el antibiótico puede ir desde los 5 minutos a los 90 minutos, preferiblemente, desde los 20 a los 60 minutos. En una realización particular, el tiempo de incubación es de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 minutos. Por otro lado, la cantidad de antibiótico a añadir al medio de cultivo también puede variar dentro de un amplio intervalo, desde 5 a 2570 Ig/mL, aunque preferentemente, la cantidad de antibiótico a añadir será la concentración mínima inhibitoria (CMI) para una determinada bacteria. Como sabe el experto en la materia, en el estado de la técnica existen tablas ampliamente aceptadas y estandarizadas en las que se recogen la CMI necesaria para inhibir un microorganismo determinado. En una realización particular, la cantidad de antibiótico que se puede añadir al medio de cultivo es 0,06, 0,038, 0,38, 4, 8, 16, 20, 32, 160, 256, o 2560 Ig/mL. Finalmente, la temperatura de incubación del cultivo con el antibiótico puede oscilar entre 36 y 38ºC, preferiblemente 37ºC.

Una segunda etapa del primer método de la invención [etapa ii)] comprende observar la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo.

Como entiende el experto en la materia, la determinación de la presencia de fragmentos de ADN en el medio puede ser efectuada por microscopía o por cualquier otro procedimiento alternativo para detectar ADN liberado por los microorganismos al medio de cultivo, ya sea físico o químico, entre los que se incluyen, sin limitar a electroforesis, anticuerpos, espectrofotometría, reacción en cadena de la polimerasa, técnicas de hibridación, micromatrices (microarrays), microfluídica, nanopartículas, quantum dots, etc. Estos procedimientos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y la puesta en práctica de los mismos es práctica de rutina para el experto en la materia.

No obstante, debido al tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de ADN, la microscopía es de elección para la determinación de la presencia de los fragmentos de ADN dada su mayor sensibilidad. Para ello, es conveniente inmovilizar una muestra del cultivo resultante de la primera etapa sobre un portaobjetos. Por lo tanto, en una realización particular, el primer método de la invención comprende entre las etapas (i) e (ii), inmovilizar una muestra del cultivo de la etapa (i) sobre un soporte, en particular, un portaobjetos.

El soporte preferentemente es un portabjetos de cristal que se recubre con una película de agarosa estándar. Para ello, se prepara una solución de agarosa estándar entre 0,2 y 2% en agua destilada en una jarra de Coplin o similar. Se cubre con una lámina de plástico agujereada y se deposita en un horno microondas. Se regula el horno microondas a una potencia de entre 300-1000W, preferentemente a 500W, agitando el envase ocasionalmente para una mejor disolución de la agarosa, dejándola hasta que hierva. Este procedimiento también se puede realizar utilizando un baño termostático. Cuando la solución de agarosa se vuelva totalmente transparente, ya estará preparada para depositarla en recipientes verticales de un contenido entre 10 y 250 mL. Estos recipientes deberán estar previamente atemperados en un baño entre 60-100°C, preferentemente a 70ºC, para mantener la solución de agarosa en estado líquido. A continuación, los portaobjetos limpios se sumergen verticalmente, sujetándolos con unas pinzas por la zona esmerilada, entre 1-60 segundos, retirándolos y volviéndolos a sumergir entre una y diez veces, hasta formar una película homogénea sobre el portaobjetos. Alternativamente, en lugar de sumergir el portaobjetos en la solución de agarosa, es posible usar un pulverizador, dispersando la agarosa sobre los portaobjetos. Se pueden recubrir así gran cantidad de portaobjetos en corto espacio de tiempo. Independientemente del método empleado, los portaobjetos cubiertos una película de agarosa se depositan horizontalmente sobre una superficie lisa y fría entre 1 y 15ºC, preferentemente a 4ºC, por ejemplo, de cristal o de metal. Esta placa, con los portaobjetos, se introduce en la nevera a 4°C durante un mínimo de 30 minutos, hasta que se comprueba que la solución de agarosa ha gelificado sobre la superficie del portaobjetos. Se retiran las bandejas de la nevera y se limpia la superficie de los portaobjetos que estaba en contacto con la placa con un papel secante. Seguidamente, los portaobjetos se introducen horizontalmente en una estufa en un rango de temperaturas de 37-100ºC, hasta que la agarosa seque por completo y forme una película fina adherida al cristal. Los portaobjetos así tratados se pueden utilizar inmediatamente o almacenar en una caja bien cerrada a temperatura ambiente durante varios meses.

La inmovilización de una muestra del cultivo de la etapa i) sobre un portaobjetos preparado de la manera antes explicada, requiere, previamente, la preparación de dicha muestra. Mediante los procedimientos habituales en éste campo se obtiene y se comprueba la concentración de microorganismos en una muestra líquida. La concentración adecuada para el análisis oscila entre 0,1 y 20 millones de microorganismos por mililitro. Si la muestra estuviese excesivamente concentrada se ajusta a la concentración adecuada diluyéndola con medio de cultivo o con solución salina/fosfato tamponada (PBS) o similar, adecuado según el microorganismo y según la estabilidad del antibiótico a ensayar.

Para facilitar el procesamiento de la muestra que contiene los microorganismos, ésta se incluye en un medio con características similares a las de una suspensión, como por ejemplo un microgel de agarosa. En este caso se prepara una solución de agarosa de bajo punto de fusión (low melting/low gelling) a una concentración comprendida entre el 0,5 y 3% en agua destilada o tampón fosfato salino (PBS). La fusión de esta agarosa se realiza utilizando un horno microondas o un baño termostatizado, y se mantiene posteriormente entre 30 y 37°C en un tubo introducido en un baño termostatizado o estufa. En un tubo Eppendorf o similar, se mezcla cuidadosamente la muestra del cultivo y la solución de agarosa, de manera que esta última quede a una concentración entre 0,3 y 2%. Por ejemplo, 70 IL de la solución de agarosa + 30 IL de la muestra. Es importante que la temperatura de la agarosa no sea superior a 37°C, para no dañar a los microorganismos.

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Finalmente, para obtener la muestra sobre soporte, se colocan los portaobjetos recubiertos con agarosa sobre una superficie lisa y fría de cristal o de metal, con una temperatura que oscile entre 1 y 15ºC, evitando formar burbujas de aire. Se recomienda depositar con una micropipeta una gota entre 2-200 microlitros de la mezcla (muestra del cultivo preparada + agarosa), colocando un cubreobjetos encima de la gota. Pueden pipetarse múltiples gotas, i.e. muestras de cultivo bacteriano del a etapa i), en cada portaobjetos. Como precaución, se recomienda procesar cada muestra por duplicado, y utilizar una muestra control cada vez que se aplique la técnica. La placa con los portaobjetos, se introduce en una nevera a 4°C, entre 2 a 30 minutos hasta que se produzca una gelificación adecuada de la agarosa. Una vez que ha ocurrido la gelificación, se procede a retirar los cubreobjetos con mucha suavidad, dentro de la misma nevera y evitando que se dañe el microgel.

A continuación, para la visualización de los fragmentos de ADN por microoscopia, es conveniente estabilizar y adherir firmemente los fragmentos de ADN al portaobjetos ya que pueden desprenderse. Para ello, los portaobjetos secos se incuban en un horno microondas a una potencia entre 300-1000W, preferentemente a 500W, durante 1-10 minutos. Una alternativa, aunque menos recomendable por su duración, es incubar los portaobjetos en un horno o estufa alta temperatura durante una a varias horas. Una vez bien secos, los portaobjetos ya procesados conteniendo la muestra, se pueden guardar en cajas archivadoras a temperatura ambiente, en oscuridad, durante meses. Esto facilita la separación del proceso de tratamiento de la muestra y la posterior etapa de evaluación de la integridad de la pared celular de los microorganismos. El archivado permite una evaluación repetida a diferentes intervalos de varias muestras de un mismo microorganismo.

Una vez tratadas las muestras, y de estabilizar y adherir firmemente los fragmentos de ADN al portaobjetos, se puede proceder a la tinción de las mismas y la evaluación de la integridad de la pared celular de los microorganismos. Así, en una realización particular del método de la invención, la observación de la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo se lleva a cabo mediante tinción. Eligiendo convenientemente las condiciones de tinción se puede obtener una alta calidad de las imágenes y una alta consistencia de los resultados de evaluación.

La tinción o coloración es una técnica auxiliar en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico para la molécula que se quiere teñir, en el contexto de la presente invención ADN, a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Las tinciones pueden ser usadas, entre otras cosas, para definir y examinar orgánulos dentro de células individuales, o para marcar los ácidos nucleicos en electroforesis en gel.

La mayoría de los colorantes o tintes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos incluyen, pero no se limitan a, el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares, lo que es especialmente útil. En ocasiones, algunos colorantes tiñen mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, denominada mordiente, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico, que se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Como sabe el experto en la materia, en el estado de la técnica existen técnicas específicas para teñir el ADN, como es, por ejemplo, la tinción de Feulgen, que consiste en someter el material a una hidrólisis con ácido clorhídrico 1N a 60º C ó 5N a temperatura ambiente y añadir después reactivo de Schiff. Mediante esta técnica es posible teñir los núcleos de las células bacterianas.

Como se ha indicado previamente, debido al tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de ADN, la microscopía de fluorescencia es de elección para la visualización de los fragmentos de ADN dada su mayor sensibilidad, para lo cual es necesario realizar la tinción de las bacterias con unos determinados compuestosquímicos denominados fluoróforos o fluorocromos. Éstos son capaces de emitir fluorescencia cuando son excitados con luz a una longitud de onda adecuada. En la actualidad existe toda una gama de fluorocromos que proporcionan no sólo información sobre la viabilidad, sino que ponen de manifiesto ciertas características fisiológicas y en algunos casos estructurales de bacterias. A modo de ejemplo, hay fluoróforos que detectan (i) actividad respiratoria (derivados de tetrazolio), (ii) actividad esterasa (calceína-AM, carboxifluoresceína), (iii) potencial de membrana (rodamina 123, oxonol VI, carbocianinas) e (iv) integridad de la membrana (SYTO-9, SYTO-13, verde Sitox, yoduro de propidio).

Por lo tanto, en una realización particular, la tinción se lleva a cabo mediante fluorocromos. Así, dependiendo de la disponibilidad de filtros de fluorescencia, las muestras se pueden teñir con fluorocromos específicos para ADN del tipo DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342, bromuro de Etidio, Ioduro de Propidio, etc., Sin embargo, son de preferencia aquellos fluorocromos de mayor sensibilidad, tales como el GelRed, EvaGreen, y otros derivados de la cianinas como las familias SYBR, las de PicoGreen® (Invitrogen - Molecular Sondas ™), las variantes de los TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO, LO-PRO,

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etc. Otros tipos de fluorocromos incluyen, pero no se limitan a, SYTOX Azul, cromomicina A3, mitramicina, naranja de acridina, SYTOX Verde, naranja de tiazoilo, LDS 751, 7-AAD, SYTOX naranja, DRAQ5.

En una realización particular, los fluorocromos se seleccionan del grupo que consiste en Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI,cromomicina A3, mitramicina, bromuro de etidio, naranja de acridina, naranja de tiazoilo, , 7-AAD, , derivados de la cianinas, y las variantes de los fluorocromos TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO y LO-PRO

La cantidad y calidad de fluorocromos se está incrementando actualmente. Para evitar la pérdida de fluorescencia, se puede incluir un medio “antifading” (por ejemplo Vectashield-Vector H-1000, DABCO; etc.). Sin embargo, estos medios suelen producir fluorescencia difusa y un fondo claro que dificulta el contraste de la imagen. Es preferible usar un fluorocromo de alta sensibilidad y relativa fotoestabilidad, montado en una solución acuosa tamponada, y evaluar la muestra con relativa rapidez, antes de su secado. Si fuese necesario, el portaobjetos se puede lavar y volver a teñir.

Las imágenes obtenidas se pueden estudiar mediante análisis visual directo o bien, preferiblemente, aplicando software de análisis de imágenes digitalizadas, obtenidas mediante cámaras analógicas o bien digitales, acopladas a las plataformas de microscopía.

Finalmente se procede a la evaluación de la integridad de la pared de los microorganismos mediante la determinación de la presencia de los fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo, en donde la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo es indicativa de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

No obstante, tal como se ha mencionado al principio de la presente descripción, cuando el cultivo bacteriano es mixto o contaminado, es decir, hay mezcla de células sensibles o resistentes a los antibióticos que actúan a nivel de la pared celular bacteriana, el primer método de la invención no sería muy adecuado como criterio estricto de discriminación puesto que tanto las bacterias sensibles como resistentes al antibiótico muestran aparentemente la pared celular intacta. Para solucionar este problema, los inventores han diseñado una solución de lisis que afecta únicamente a las bacterias cuya pared celular ha sido previamente dañada por la acción del antibiótico que actúa a nivel de la pared celular. Esta solución de lisis puede añadirse al cultivo bacteriano que anteriormente ha sido expuesto a la acción de dicho antibiótico, produciéndose la liberación del nucleoide bacteriano y observándose entonces una bacteria con la pared celular dañada (Ejemplos 1 a 5). Así, la presencia del nucleoide bacteriano tras aplicar la solución de lisis es indicativa de la presencia de bacterias sensibles al antibiótico.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, de aquí en adelante, segundo método de la invención, que comprende:

i) añadir a dicho cultivo un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, ii) añadir solución de lisis al cultivo resultante de la etapa i), en donde dicha solución de lisis es una solución de lisis específica para aquellas bacterias cuya pared celular ha sido dañada por el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, y comprende un tampón con un pH comprendido entre 3 y 11,5, y iii) determinar la presencia del nucleoide bacteriano, en el que la presencia del nucleoide bacteriano en el medio es indicativa de que la integridad de la pared celular de las bacterias ha sido dañada.

Los términos y expresiones “evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias”, “pared celular” y “antibiótico que actúa a nivel de la pared celular” ya han sido definidos previamente para el primer método de la invención, y son aplicables al presente aspecto inventivo.

Por otro lado, aunque el segundo método de la invención ha sido diseñado para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias en un cultivo mixto o contaminado, el experto en la materia entiende que el presente método también puede aplicarse a cultivos puros.

El término “cultivo puro” ha sido previamente definido en la presente descripción. En la presente invención, se entiende por “cultivo mixto” al cultivo bacteriano que contiene dos o más especies distintas de bacterias. En la mayoría de las ocasiones, la presencia de dos o más especies distintas de bacterias en un cultivo se debe a la contaminación del cultivo debido a una manipulación incorrecta de la muestra, por lo que en el contexto de la presente invención, los términos “cultivo mixto” y “cultivo contaminado” son equivalentes y pueden ser empleados indistintamente a lo largo de la descripción. Así, en una realización particular del segundo método de la invención, las bacterias presentes en el cultivo pertenecen a la misma especie o a especies distintas.

Como puede apreciar el experto en la materia, las etapas i) y iii) del segundo método de la invención son comunes al primer método de la invención. En consecuencia, todas las explicaciones y realizaciones particulares anteriormente mencionadas también son aplicables al presente aspecto inventivo. Adicionalmente, el segundo método de la invención comprende las etapas i) y iii) una segunda etapa ii) no presente en el primer método de la invención que comprende añadir una solución de lisis al cultivo resultante de la etapa i), en donde dicha solución de lisis es una solución de lisis específica para aquellas bacterias cuya pared celular ha sido dañada por el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, y comprende un tampón con un pH comprendido entre 3 y 11,5.

La solución de lisis que afecta de forma específica a las bacterias que tienen la pared celular afectada por el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana comprende, básicamente, una solución tampón que presenta un pH de entre 3 y 11,5 pero que, adicionalmente, puede comprender otros componentes, entre los que se incluyen, pero no se limitan a, detergentes iónicos, detergentes no iónicos, sales, etc. en distintas proporciones.

Así, en una realización particular, el tampón que forma parte de la solución de lisis es tris(hidroximetil)aminometano (Tris) de fórmula (HOCH2)3CNH2, que además puede ser empleada para preparar otras disoluciones tampón, entre las que se incluyen, pero no se limitan a, tampones Tris-HCl, Tris-Gly, TAE y TBE. El Tris tiene un pKa de 8,06, lo que le aporta capacidad tamponante efectiva en un intervalo de pH entre 7,0 y 9,2. La forma de uso más frecuente se llama Tris base (es la forma básica, no ionizada, de la amina); en ocasiones se utiliza también la forma ácida o hidrocloruro (Tris-HCl).Otras soluciones tampón incluyen, pero no se limitan a, Hepes, Mops, Pipes. Para obtener un pH estable próximo a 11,5 se usa el sodio fosfato bibásico, también denominado disodio hidrogenofosfato (Na2HPO4), el ácido bórico-borato, la triethylamine y el 4-[cyclohexylamino]-1-butansulphonic acid (CABS).

En otra realización particular, la solución de lisis comprende, además de la solución tampón, hasta un 3% de un detergente iónico o un detergente no iónico.

Por el término “detergente iónico” se entiende aquel compuesto que presenta una parte hidrofoba y una parte hidrofílica, que en solución forma iones cargados positiva (detergente catiónico) o negativamente (detergente aniónico) y que permite conseguir una emulsión. Como entiende el experto en la materia, los términos “detergente”, “surfactante” y “tensioactivo” son sinónimos, por lo que pueden ser usados indistintamente a lo largo de la presente descripción.

Ejemplos de detergentes catiónicos incluyen, pero no se limitan a, sales de amonio primario, secundario, terciario y cuaternario, ya sean de estructura lineal o cíclica, mezclas de las mismas, como por ejemplo sales de piridina, piperizina, y derivados de dichas sales de amonio. Como derivados de sales de amonio se entiende aquellas sales que incorporan en la misma estructura al menos dos grupos amino ya sean primario, secundario, terciario y/o cuaternario, tales como por ejemplo las sales de guanidina, piperazina e imidazol. En esta definición, estarían también comprendidas las sales de aminoácidos, tales como por ejemplo las sales de lisina, arginina, ornitina o triptófano. Asimismo, se encontrarían englobadas en esta definición aquellas sales de amonio en las cuales la carga positiva se encuentra sobre un átomo de fósforo, como por ejemplo ioduro de ditetradecil (trimetiletilfosfonio) metilfosfonato, ioduro de ditetradecil (butildimetilfosfonio) metilfosfonato, ioduro de ditetradecil (ioduro de dimetilisopropilfosfonio) metilfosfonato o arsénico (ioduro de ditetradecil (trimetilarsonio) metilfosfonato, ioduro de dioleil (trimetilfosfonio) metilfosfonato, en lugar de sobre el átomo de nitrógeno. Ejemplos de sales de amonio incluyen, pero no se limitan a sales de tetraalquilamonio, sales de alquilbencil dimetil amonio o sales de amonio heterocíclicas, tales como el bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB).

Ejemplos de detergentes iónicos incluyen, sin limitar a, acil-aminoácidos, tales como acil-glutámicos, acil-péptidos, sarcosinatos, tauratos, etc., ácidos carboxílicos, tales como ácidos de cadena saturada, ésteres de ácidos carboxílicos, éteres de ácidos carboxílicos, ésteres del ácido fosfórico, ácidos sulfónicos, tales como acil-isotianatos, alquil aril sulfonatos, alquil sulfonatos, sulfosuccinatos, etc., y ésteres del ácido sulfúrico, tales como alquil éter sulfatos y alquil sulfatos. En una realización particular, el detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio (SDS), sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina, sal hidratada del ácido glicocólico, y sus sales.

Ejemplos de detergentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, polisorbatos, copolímeros de polietilenglicol y copolímeros de polipropilenglicol, como por ejemplo Tween, Span, Poloxamer.

En otra realización particular, el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en el toctilfenoxipolietoxietanol, N,N-Bis(3-D-gluconamidopropil) colamida, Brij(r) 35 P, N-decanoil-N-metilglutamina, digitonina, dodecanoil-N-metilglucamida, heptanoil-N-metilglutamida, octilfenoxi poli(etileneoxi)etanol ramificado, NNonanoil-N-metilglucamina, Nonidet P 40, N-octanoil-N-metilglutamina, solución Span 20 y polisorbato 20.

En otra realización particular, la solución de lisis comprende, además, hasta una concentración 3M de una sal. Ejemplos de sales que pueden formar parte de la solución de lisis de la invención incluyen, pero no se limitan a, carbonatos, cloruros, fosfatos, nitratos, nitritos, sulfatos, citratos, carboxilatos (acetatos, formiatos, salicilatos, etc.). En una realización particular, la solución de lisis comprende cloruro sódico (NaCl).

No obstante en la materia entenderá que estos compuestos pueden sustituirse por otros compuestos equivalentes. Por ejemplo, el SDS puede ser substituido por Tritón X-100 hasta el 10%.

En una realización particular, la solución de lisis comprende Tris entre 0,001 y 2M, SDS hasta el 3%, y NaCl hasta una concentración de 3M, a un pH entre 3 y 11,5. El SDS puede ser substituido por Tritón X-100 hasta el 10%.

En otra realización todavía más particular, la solución de lisis comprende (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) aproximadamente 0,2M, dodecilsulfato de sodio (SDS) aproximadamente al 0,025%, cloruro sódico aproximadamente al 0,5M ó 0,05M, un pH de 10 y una temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC. En vez de SDS, la solución de lisis puede comprender Tritón X-100 aproximadamente al 5%.

En otra realización todavía más particular, la solución de lisis comprende (hidroximetil)-1,3-propanediol aproximadamente 0,2M, Triton X-100 aproximadamente al 5%, cloruro sódico aproximadamente 1M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

En otra realización todavía más particular, la solución de lisis comprende sodio fosfato bibásico aproximadamente 0,3M, dodecilsulfato de sodio aproximadamente al 2%, ácido etilendiamino tetraacético aproximadamente 0,05M, un pH de 11,45 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

Según la solución empleada y el tipo de muestra, las preparaciones se incuban en la solución de lisis entre 1 y 120 minutos, preferentemente entre 1 y 35 minutos, especialmente preferido es un tiempo alrededor de 5 minutos; y a una temperatura entre 1 y 45ºC, preferentemente 15ºC-40ºC, especialmente preferida es una temperatura de 22 ó de 37ºC.

Una vez añadida la solución de lisis al cultivo bacteriano previamente incubado en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular, se procede a detectar la presencia del nucleoide bacteriano en el medio de cultivo [etapa iii)]. Como se ha explicado para el primer método de la invención, la evaluación de la presencia del nucleoide bacteriano en el medio puede ser efectuada por microscopía o por cualquier otro procedimiento alternativo para detectar ADN liberado por los microorganismos al medio de cultivo, ya sea físico o químico, entre los que se incluyen, sin limitar a electroforesis, anticuerpos, espectrofotometría, reacción en cadena de la polimerasa, técnicas de hibridación, micromatrices (microarrays), microfluídica, nanopartículas, quantum dots, etc. Estos procedimientos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y la puesta en práctica de los mismos es práctica de rutina para el experto en la materia.

No obstante, en una realización particular, la detección del nucleoide bacteriano se lleva a cabo mediante microscopia, para lo cual, es necesario inmovilizar una muestra del cultivo resultante de la etapa i) [es decir, tras la exposición del cultivo bacteriano a la acción del antibiótico] en un soporte, en particular, en un portaobjetos. En este caso, la etapa ii) del segundo método de la invención, es decir, la adición de la solución de lisis que afecta únicamente a las bacterias cuya pared celular ha sido afectada por el antibiótico, puede llevarse a cabo antes o después de inmovilizar las bacterias sobre un soporte, en particular, sobre un portaobjetos. Así, en una realización particular, el segundo método de la invención comprende, además, antes o después de la etapa (ii), inmovilizar una muestra del cultivo sobre un portaobjetos. Los procedimientos y técnicas que existen en el estado de la técnica para inmovilizar muestras sobre soportes, así como la preparación de los mismos, ya han sido explicados previamente para el primer método de la invención, y son igualmente aplicables al segundo método de la invención.

En caso de que el tratamiento con la solución de lisis se haga después de inmovilizar una muestra del cultivo resultante de la etapa i) sobre un soporte, en particular, un portaobjetos, éste se sumerge en posición horizontal en un recipiente que contiene la solución de lisis. Después del tratamiento con solución de lisis (el cuál ha sido explicado previamente), las preparaciones se pueden lavar para eliminar los restos de esta solución. Para ello se introducen los portaobjetos horizontalmente, en una solución de lavado lo más suave posible, evitando agentes quelantes o detergentes. Por ejemplo, se sumergen en posición horizontal en un recipiente que contiene abundante agua destilada o una solución tampón o suero fisiológico durante un tiempo entre 1 y 60 minutos.

A continuación se procede a la deshidratación de la muestra. Para ello se puede utilizar soluciones de concentración creciente de alcohol. Por ejemplo, se levantan los portaobjetos y se sumergen en posición horizontal, en recipientes con series de concentración creciente de etanol, entre 5 y 100%, durante 30 segundos a 60 minutos cada una y después las preparaciones se dejan secar al aire. La temperatura de los alcoholes puede oscilar desde –20ºC a temperatura ambiente. Puede ser preferible usar alcoholes a –20ºC para mejorar la precipitación del ADN, durante 5 minutos cada uno. Como alternativas a las incubaciones en series de etanol, las preparaciones se pueden deshidratar incubando en soluciones de diferentes alcoholes como el metanol, o bien dejando secar al aire o en estufa.

Finalmente, en la etapa iii) del segundo método de la invención se procede a determinar la presencia del nucleoide bacteriano o bien en el medio de cultivo o bien en el soporte si se ha procedido a inmovilizar la muestra.

En la presente invención se entiende por “nucleoide bacteriano” a la región que contiene el ADN en el citoplasma de las células bacteriana. La evidencia experimental sugiere que el nucleoide está compuesto fundamentalmente por ADN (60%), con pequeñas proporciones de ARN y proteínas. Estos dos últimos componentes actúan como ARN mensajero y como proteínas reguladoras del genoma. En el estado de la técnica, el nucleoide bacteriano también es conocido con el nombre de “región nuclear” o “cuerpo nuclear”. Las técnicas explicadas previamente para observar la presencia de los fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo también pueden emplearse para observar el nucleoide bacteriano tal como requiere el segundo método de la invención.

Si la técnica de elección para determinar la presencia del nucleoide bacteriano es la microscopía, entonces, tal como se ha explicado previamente para el primer método de la invención, es conveniente estabilizar y adherir firmemente los fragmentos de ADN al portaobjetos ya que pueden desprenderse.

Una vez tratadas las muestras, y de estabilizar y adherir firmemente los fragmentos de ADN al portaobjetos, se puede proceder a la tinción de las mismas y la evaluación de la integridad de la pared celular de los microorganismos. Así, en una realización particular del método de la invención, la observación de la presencia del nucleoide bacteriano en el medio de cultivo se lleva a cabo mediante tinción. Eligiendo convenientemente las condiciones de tinción se puede obtener una alta calidad de las imágenes y una alta consistencia de los resultados de evaluación. Las distintas técnicas de tinción así como los tintes que se pueden emplear para visualizar ADN mediante microscopía han sido explicados previamente en la presente descripción.

Así, en una realización particular, la observación de la presencia del nucleoide bacteriano en el medio de cultivo se lleva a cabo mediante tinción, que una realización más particular, se lleva a cabo mediante fluorocromos que, en otra realización todavía más particular, se seleccionan del grupo que consiste en fluorocromos se seleccionan del grupo que consiste en Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI, cromomicina A3, mitramicina, bromuro de etidio, naranja de acridina, naranja de tiazoilo, , 7-AAD, , derivados de la cianinas, y las variantes de los fluorocromos TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO y LO-PRO.

La puesta en práctica del segundo método de la invención requiere en una primera etapa añadir a un cultivo bacteriano un antibiótico que actúe a nivel de la pared celular bacteriana. Cualquiera de los antibióticos descritos anteriormente para el primer método de la invención puede emplearse en el segundo método de la invención. Por lo tanto, en una realización particular el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico �-lactámico (entre los que incluyen, pero no se limita a penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbacefem, carbapenémicos, monobactámicos e inhibidores de las �-lactamasas tales como ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam, etc.), una isoniacida, una etionamida, un etambutol, una cicloserina y un antibiótico glucopéptido (entre los que se incluyen, sin limitar a, vancomicina o teicoplanina).

APLICACIONES DE LOS MÉTODOS DE LA INVENCIÓN

Como se ha explicado previamente, la aplicación práctica del primer y segundo método de la invención es averiguar de una manera rápida y fiable si una bacteria es sensible o resistente a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana. Para ello, basta con evaluar la integridad de la pared bacteriana mediante cualquiera de los métodos de la invención descritos anteriormente en la presente descripción.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante cualquiera de los métodos de la invención, en el que si la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada, entonces la bacteria es sensible al antibiótico. Por el contrario, como entiende el experto en la materia, si la integridad de la pared celular aparece no ha sido dañada y esta aparece intacta (no hay liberación de fragmentos extracelulares de ADN o del nucleoide al medio de cultivo), entonces la bacteria es no es sensible al antibiótico, pudiendo ser una bacteria resistente o una bacteria denominada “persister”

o tolerante. Ambos tipos de bacterias no son afectadas por el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, pero se diferencian en que las bacterias resistentes tienen mutaciones en el ADN de forma que la resistencia al antibiótico es permanente, mientras que las bacterias “persister” no tienen mutaciones de resistencia en el ADN, siendo un estado funcional reversible. Por lo tanto, otras de las aplicaciones de los métodos de la invención es la detección en una muestra de bacterias resistentes o de bacterias “persister”.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para identificar una bacteria persister o tolerante a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana en un cultivo de bacterias sensibles, que comprende evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en dicho cultivo mediante el segundo método de la invención, en el que la bacteria cuya integridad de la pared celular no haya sido dañada es identificada como persister o tolerante.

Otra de las aplicaciones prácticas que presentan los métodos de la invención se relaciona con el diseño de una terapia antibiótica personalizada para una persona que padece una enfermedad bacteriana, ya que mediante los métodos de la invención se puede averiguar si la bacteria causante de la enfermedad bacteriana es sensible o

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resistente a un determinado antibiótico. Si tras aplicar alguno de los métodos de la invención resulta que la bacteria causante de la enfermedad bacteriana es sensible al antibiótico testado, entonces el médico podrá decidir administrar al individuo que padece dicha enfermedad bacteriana una terapia basada en dicho antibiótico. Si por el contrario la bacteria causante de la enfermedad bacteriana es resistente al antibiótico testado, entonces el médico elegirá como un tratamiento que no esté basado en dicho antibiótico.

Así, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para diseñar una terapia antibiótica personalizada a un individuo que padece una enfermedad bacteriana que comprende i) aislar la bacteria causante de la enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo, y ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante uno cualquiera de los métodos de la

invención, en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces dicho individuo es susceptible de recibir una terapia basada en antibióticos que actúan a nivel de la pared celular.

En la presente invención se entiende por “individuo” a un miembro de cualquier especie animal, entre los que se incluyen, pero no se limita a, mamíferos, en particular, ganado vacuno (vacas, toros, bueyes, yaks, etc,), ganado ovino (ovejas, etc.), ganado porcino (cerdos, jabalíes, etc.), ganado caprino (cabras, etc.), ganado equino o caballar (caballos, yeguas, cebras, etc.), camélidos (camellos, llamas, alpacas, etc.), conejos, liebres, bisontes, búfalos, ciervos, renos, venados, caribús, perros, gatos, ratones, primates no humanos (chimpancés, gorilas, orangutanes, macacos, gibones, etc.). En particular, el mamífero es preferiblemente un ser humano de cualquier sexo, edad o raza. Los términos “individuo” o “sujeto” son sinónimos y pueden emplearse indistintamente a lo largo de la presente descripción.

En la presente invención se entiende por “enfermedad bacteriana” a aquella enfermedad que resulta de la infección de un individuo por una bacteria. Ejemplos de enfermedades bacterianas incluyen, sin limitar a, enfermedades provocadas por la infección de bacterias del género Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Heamophilus y Bordetella.

La primera etapa del método para diseñar una terapia antibiótica personalizada a un individuo que padece una enfermedad bacteriana comprende aislar la bacteria causante de dicha enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo.

Como sabe el experto en la materia, para garantizar unos buenos resultados es fundamental realizar una buena selección, recolección y trasporte de las muestras, así como el buen procesado de éstas para el correcto aislamiento del microorganismo. Por ejemplo, la muestra tiene que ser representativa del proceso infeccioso y ha de tomarse del lugar anatómico correcto, debe ser recogida en cantidad suficiente para asegurar un examen adecuado, se han de emplear en la recogida dispositivos estériles, etc. Más información sobre los procedimientos y materiales empleados en la recogida de muestras se pueden encontrar en Rotger, R. (editor), 1997 (citado ad supra).

Por otro lado, antibióticos que actúan a nivel de la pared celular y que pueden administrarse al individuo en función de la conclusión alcanzada han sido descritos previamente en la presente descripción.

El experto en la materia entenderá que los métodos de la invención también pueden emplearse para identificar nuevos compuestos antibióticos que actúen a nivel de la pared celular. Por lo tanto, en otro aspecto la invención se relaciona con un método para identificar un compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende:

i) poner en contacto un cultivo de una bacteria sensible a los antibióticos que actúan a nivel de la pared

celular en presencia del compuesto candidato, y

ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante cualquiera de los métodos de la

invención, en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces el compuesto candidato es un compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana.

En la presente invención, se entiende por “compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana” al compuesto que interfiere en cualquiera de las etapas de síntesis de la pared celular bacteriana o afecta su estructura.

La primera etapa del método para identificar compuestos que actúen a nivel de la pared celular comprende poner en contacto un cultivo de una bacteria sensible a los antibióticos que actúan a nivel de la pared celular en presencia del compuesto candidato. Ejemplos de bacterias sensibles a los antibióticos que actúan a nivel de la pared celular incluyen, pero no se limitan a, cepas de E. coli sensibles a amoxicilina, cepa de Enterococcus faecaelis sensible a amplicilina, cepa de Acinetobacter baumannii sensible a iminepen, cepa de E.coli sensible a ceftazidima, etc. Más información sobre la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos �-lactámicos puede encontrarse en el estado de la técnica (June 2010 CLSI Guidelines).

SOLUCIÓN DE LISIS DE LA INVENCIÓN

La presente invención está basada en el hecho de que una consecuencia de la actividad de los antibióticos que actúan a nivel de la pared celular sobre las bacterias es la liberación de fragmentos extracelulares de ADN al medio de cultivo. Adicionalmente, cuando el cultivo bacteriano es mixto o contaminado, es decir, hay mezcla de células sensibles o resistentes, la observación de los fragmentos extracelulares de ADN no sería muy adecuado como criterio estricto de discriminación puesto que a pesar de liberar fragmentos extracelulares de ADN, la morfología de las bacterias no se ve alterada por la acción del antibiótico, es decir, tanto las bacterias sensibles como resistentes al antibiótico muestran aparentemente la pared celular intacta. Para solucionar este problema, los inventores diseñaron una solución de lisis que afecta únicamente a las bacterias cuya pared celular ha sido previamente dañada por la acción del antibiótico que actúa a nivel de la pared celular.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se relaciona con una solución de lisis, de aquí en adelante solución de lisis de la invención, caracterizada porque afecta solo a las bacterias que presentan la pared bacteriana dañada por acción de un antibiótico, que comprende un tampón y un pH de entre 3 y 11,5.

La solución de lisis que afecta de forma específica a las bacterias que tienen la pared celular dañada por el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana comprende, básicamente una solución tampón que presenta un pH de entre 3 y 11,5 pero que adicionalmente, tal como se ha explicado en aspectos inventivos anteriores, puede comprender otros componentes, entre los que se incluyen, pero no se limitan a, detergentes iónicos, detergentes no iónicos, sales, etc. en distintas proporciones.

Así, realizaciones particulares de la solución de lisis de la invención son:

-

La solución de lisis comprende, además, hasta un 3% de un detergente iónico o un detergente no iónico.

-

El detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio,

sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina, sal hidratada del ácido glicocólico, y sus mezclas.

-

El detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en el toctilfenoxipolietoxietanol, N,N-Bis(3-D

gluconamidopropil) colamida, Brij(r) 35 P, N-decanoil-N-metilglutamina, digitonina, dodecanoil-N

metilglutamida, heptanoil-N-metilglutamida, octilfenoxi poli(etileneoxi)etanol ramificado, N-Nonanoil-N

metilglutamina, Nonidet P 40, N-octanoil-N-metilglutamina, solución Span 20 y polisorbato 20.

-

la solución de lisis comprende, además, hasta una concentración 3M de una sal.

En otra realización todavía más particular, la solución de lisis comprende (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) aproximadamente 0,2M, dodecilsulfato de sodio (SDS) aproximadamente al 0,025%, cloruro sódico aproximadamente al 0,5M ó 0,05M, un pH de 10 y una temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC. En vez de SDS, la solución de lisis puede comprender Tritón X-100 aproximadamente al 5%.

En otra realización todavía más particular, la solución de lisis comprende (hidroximetil)-1,3-propanediol aproximadamente 0,2M, Triton X-100 aproximadamente al 5%, cloruro sódico aproximadamente 1M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

En otra realización todavía más particular, la solución de lisis comprende sodio fosfato bibásico aproximadamente 0,3M, dodecilsulfato de sodio aproximadamente al 2%, ácido etilendiamino tetraacético aproximadamente 0,05M, un pH de 11,45 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

Más detalles y explicaciones sobre las distintas realizaciones particulares de la solución de lisis de la invención pueden encontrarse en la descripción del segundo método de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la solución de lisis de la invención para evaluar la pared celular bacteriana. Información sobre cómo puede usarse la solución de lisis de la invención para evaluar la pared celular bacteriana puede encontrarse en la descripción del primer y segundo métodos de la invención.

KIT DE LA INVENCIÓN

La puesta en práctica de los métodos de la invención requiere una serie de componentes que pueden disponerse juntos en forma de pack o kit, de aquí en adelante, kit de la invención. Componentes útiles para la puesta en práctica de los métodos de la invención incluyen, pero no se limita a, solución tampón, solución de lisis, tintes, material estéril para hacer la recogida de muestras (hisopos, torundas, pinzas, etc.), cubres y portaobjetos, agua destiladas alcoholes (etanol), etc. Adicionalmente, el kit de la invención puede contener instrucciones o indicaciones que guíen al experto en la materia en la puesta en práctica los métodos de la invención.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende la solución de lisis de la invención.

Los siguientes ejemplos tan solo ilustran la invención y no pretenden ser limitativos de la misma.

EJEMPLOS

MATERIAL Y MÉTODOS

Material y equipo requerido Microscopio de fluorescencia (recomendable objetivo de inmersión) Nevera a 4ºC Estufa a 37ºC Estufa o placa a 80ºC (opcional) Baño de incubación a 37ºC Guantes de plástico Cubreobjetos de cristal (18x18 mm, 22x22 mm o 24x60 mm) Micropipetas 4 cajas para incubaciones en horizontal Agua destilada Etanol 70%, 90%, 100%

Preparación de una muestra por portaobjetos 1) Poner solución de lisis en recipiente de incubación horizontal, en estufa a 37ºC, tapado. 2) Diluir la muestra de microorganismos en medio de cultivo o PBS, a una concentración de 5-10 millones por mililitro.

Preparación del microgel de agarosa 1) Introducir el tubo Eppendorf con agarosa gelificada, en el flotador, dejándolo al nivel de la tapa, y dejar flotando 5 minutos en agua a 90-100ºC, hasta que la agarosa se funda. La fusión de la agarosa se puede realizar alternativamente en un horno microondas. 2) Transferir el tubo Eppendorf con el flotador, a un baño termostático a 37ºC, y dejar 5 minutos hasta equilibrar la temperatura. 3) Añadir 60 IL de la muestra de microorganismos al contenido del tubo Eppendorf y resuspender, con la micropipeta. 4) Colocar un portaobjetos pretratado en una superficie fría, a 4ºC (por ejemplo, una lámina metálica o de vidrio). 5) Una vez enfriado el portaobjetos, depositar la suspensión de microorganismos con agarosa y poner un cubreobjetos de cristal, evitando formar burbujas de aire. Se recomienda depositar una gota de 12, 20 ó 50 microlitros, para un cubreobjetos de 18x18 milímetros, 22x22 milímetros ó 24x60 milímetros, respectivamente. 10) Introducir la lámina fría con el portaobjetos, en la nevera y dejar gelificar la muestra durante 5 minutos.

Procesado de las muestras 1) Usando guantes, retirar el cubreobjetos, deslizándolo con suavidad, e inmediatamente introducir el portaobjetos, en horizontal, en el recipiente con la solución de lisis, tapando y dejando incubar durante 5 minutos, en la estufa o baño a 37ºC. 2) Levantar el portaobjetos con ayuda de la lanceta, usando guantes. Sujetarlo en horizontal, y depositarlo en horizontal, en una caja conteniendo abundante agua destilada o solución tampón, para lavar la solución de lisis. Dejar incubando durante 5 minutos. 3) Introducir el portaobjetos, en horizontal, en una caja con etanol 70% (3 minutos), luego en otra caja con etanol 90% (3 minutos), y finalmente en etanol 100% (3 minutos), a –20ºC. 4) Dejar secar al aire, e incubar en horno microondas a 500-1000W durante 1-10 minutos, o en su defecto, en estufa a 80ºC durante una hora como mínimo, o toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos procesados se pueden guardar en cajas archivadoras, a temperatura ambiente, en oscuridad, durante meses.

Tinción de las muestras para observación en microscopio de fluorescencia Dependiendo de la disponibilidad de filtros de fluorescencia, las muestras se pueden teñir con fluorocromos específicos para ADN del tipo EvaGreen o (verde) o GelRed (rojo). Los fluorocromos de la familia SYBR, concretamente el SYBR Gold, permiten una buena resolución, con cierta fotoestabilidad.

Almacenamiento y estabilidad Almacenar a temperatura ambiente. Caducidad: los reactivos y materiales son estables por un periodo mínimo de 6 meses. Se recomienda que la solución de lisis se mantenga en posición vertical y bien cerrada.

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Ejemplo 1 Confirmación del funcionamiento de la técnica: liberación del nucleoide bacteriano y de restos difusos de pared y/o productos bacterianos, en bacterias sensibles a un antibiótico que actúa a nivel de la pared bacteriana

Tres cepas diferentes de Escherichia coli fueron expuestas al antibiótico �-lactámico amoxicilina, junto con el inhibidor de las �-lactamasas ácido clavulánico, y procesadas mediante la técnica para evaluación de la integridad de la pared celular. Las bacterias que estaban creciendo en medio líquido Mueller-Hinton fueron incubadas con el antibiótico en medio líquido Mueller-Hinton durante la fase de crecimiento exponencial, a 37ºC, con agitación, durante 40 minutos. Las dosis de antibiótico fueron elegidas según los puntos de corte indicados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Según sus recomendaciones, la cepa se considera sensible cuando su concentración mínima inhibitoria (CMI) es < 8/4 (amoxicilina 8 μg/mL y ácido clavulánico 4 μg/mL) y resistente cuando su CMI es > 32/16 (amoxicilina 32 μg/mL y ácido clavulánico 16 μg/mL). Según los datos de difusión en disco, una de las cepas es sensible, otra es intermedia y otra resistente.

Los resultados se visualizan en la Figura 1. Tras la dosis 8/4, solo las bacterias de la cepa sensible aparecen lisadas, mostrando los nucleoides (a’). Tras la dosis 32/16, las cepas sensible e intermedia aparecen lisadas (a’’ y b’’), mientras que la resistente permanece sin lisar (c’’). Sin embargo, algún daño en pared celular es visible en algunas células aisladas. Cuando el antibiótico es efectivo, además de la liberación y expansión de los nucleoides, se aprecia un fondo homogéneo micro difuso, granular-fibrilar, de fragmentos extracelulares de ADN, desprendidos por las células.

Ejemplo 2 Valoración de sensibilidad o resistencia a antibiótico j-lactámico en varias cepas de E. coli aisladas del hospital.

Tras los resultados del experimento anterior (ejemplo 1), se estudiaron 11 cepas diferentes de E. coli, aisladas en el servicio de microbiología. Tras crecer en placa con medio Mueller-Hinton, durante 24 horas, fueron expuestas al antibiótico �-lactámico amoxicilina, junto con el inhibidor de las �-lactamasas ácido clavulánico, en medio líquido Mueller-Hinton durante una hora, tras lo cual fueron procesadas mediante la técnica para evaluación de la integridad de la pared celular. Al igual que en el experimento anterior las dosis fueron 0, 8/4 y 32/16.

Según el protocolo de la invención: -3 cepas mostraron lisis total de pared y fondo intenso de fragmentos extracelulares de ADN ya en la dosis baja, siendo categorizadas como sensibles. -En 5 cepas sólo se observó lisis total de pared y fondo intenso de fragmentos extracelulares de ADN en la dosis alta, siendo conceptuadas como de sensibilidad intermedia. -2 cepas mostraron en la dosis alta, células sin lisar, conjuntamente con otras discretamente lisadas, con un fondo de fragmentos extracelulares de ADN muy tenue o nulo. Fueron categorizadas como resistentes.

Los resultados de la técnica encajaron con los aportados por el laboratorio de microbiología.

La conclusión práctica del experimento es que las cepas sensibles son claramente diferenciables del resto empleando una única dosis, la dosis baja de 8/4. Esto puede simplificar enormemente el estudio masivo de múltiples cepas, pues desde el punto de vista clínico, lo importante para la decisión terapéutica es diferenciar sensible de no sensible. En caso de una capa intermedia a un determinado antibiótico, éste no se administraría, y se utilizaría otro alternativo al que fuese totalmente sensible.

Ejemplo 3 Determinación del tiempo mínimo de incubación con un antibiótico j-lactámico, que permite detectar la afectación de la pared en la cepa sensible y la cepa intermedia de E. coli. Valoración de bacterias procedentes de cultivo de placa o de cultivo líquido

Una cepa sensible, otra intermedia y otra resistente de E. coli, fueron expuestas al antibiótico �-lactámico amoxicilina, junto con el inhibidor de las �-lactamasas ácido clavulánico, en medio líquido Mueller-Hinton, y procesadas mediante la técnica para evaluación de la integridad de la pared celular. Las dosis fueron 8/4 (baja) y 32/16 (alta). Los tiempos de incubación con el antibiótico fueron 5, 10, 20, 30, 40, 60 y 75 minutos.

A) Cuando las bacterias procedían de cultivo de 24 horas, en placa, se observó lo siguiente:

-

En la cepa sensible, a los 20 minutos se empezó a apreciar un efecto muy discreto en la dosis alta de

32/16, con algo de fondo de fragmentos extracelulares de ADN y una lisis discreta de las células. Este

efecto discreto pasó a observarse a los 40 minutos tras la dosis baja 8/4, mientras que fue algo mayor

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con la dosis alta. A los 60 minutos el efecto ya era máximo, con discreto fondo de fragmentos extracelulares de ADN y lisis de prácticamente todas las células tras la dosis baja, y mucho fondo y lisis tras la dosis alta.

-

La cepa intermedia comenzó a mostrar un efecto claro mucho más tarde que la sensible, a los 60 minutos y sólo tras la dosis alta 32/16. Este efecto fue más evidente a los 75 minutos

-

La cepa resistente nunca mostró efecto, aunque a los 75 minutos, tras la dosis alta 32/16, algunas células aisladas aparecían discretamente lisadas, como en la Fig.1 c’’.

B) Cuando las bacterias procedían de cultivo líquido, en fase de crecimiento exponencial, se observó lo siguiente:

-

En la cepa sensible ya se empezó a observar un efecto a los 10 minutos. Este era muy discreto en la dosis baja 8/4, y más acusado con la dosis alta 32/16. La intensidad del efecto fue incrementándose progresivamente, siendo a los 30 minutos, muy similar al observado tras 60 minutos en el caso de las que procedían de cultivo en placa.

-

La cepa intermedia comenzó a mostrar un efecto claro mucho más tarde que la sensible, a los 30-40 minutos y sólo tras la dosis alta 32/16. Este efecto fue más evidente a los 60 minutos.

-

La cepa resistente nunca mostró efecto, aunque a los 60 minutos, tras la dosis alta 32/16, algunas células aisladas aparecían discretamente lisadas, como en la Fig.1 c’’. En conclusión:

1) El estado de crecimiento de las bacterias influye en la sensibilidad al antibiótico. Es bien conocido que las células que no crecen, en fase estacionaria, disminuyen extraordinariamente su sensibilidad a los lactámicos.

2) Desde el punto de vista práctico, para diferenciar con seguridad las cepas de E. coli sensibles de las demás, es suficiente con incubarlas con el antibiótico durante 30 minutos en caso de estar en fase de crecimiento exponencial (cultivo líquido reciente), o de 40-60 minutos, en caso de proceder de cultivo en placa de 24 horas. Si la placa está más envejecida o el cultivo líquido ha llegado a la fase exponencial, el tiempo de incubación de la muestra de bacterias con el antibiótico en medio líquido, puede alargarse varias horas. En el caso de valoración de muestras clínicas, es recomendable procesar simultáneamente una cepa sensible, otra intermedia y otra resistente, como control de la actividad del antibiótico y de la efectividad de la técnica.

Ejemplo 4 Determinación de sensibilidad o resistencia de diferentes gérmenes Gram+ y Gram- a diferentes antibióticos beta-lactámicos (penicilinas, cefalosporina y carbapenem)

Diferentes cepas bacterianas crecieron en placa con medio Mueller-Hinton, durante 24 horas, luego fueron expuestas al antibiótico �-lactámico durante 60 minutos en medio líquido Mueller-Hinton, a 37ºC, en agitación, y finalmente se procesaron mediante la técnica para evaluación de la integridad de la pared celular.

Las cepas y los antibióticos empleados fueron:

Gram+

Enterococcus faecalis. Cepa sensible a ampicilina (CMI= 4) y resistente a becilpenicilina (CMI >32). Enterococcus faecium. Cepa resistente a ampicilina (CMI >32) y a bencilpenicilina (CMI >32).

Gram-

Acinetobacter baumannii. Cepa resistente a imipenem (CMI >32) y a ceftazidima (CMI >32). Acinetobacter baumannii. Cepa sensible a imipenem (CMI =0,38) e intermedia a ceftazidima (CMI =12). Escherichia coli. Cepa intermedia a ampicilina (CMI= 16) y sensible a ceftazidima (CMI =1). Escherichia coli. Cepa resistente a ampicilina (CMI> 256) y a ceftazidima (CMI =32).

Las dosis de antibiótico aplicadas fueron 0, la CMI, determinada en el laboratorio de microbiología mediante técnica de microdilución y/o e-test, y las de los puntos de corte de sensibilidad y de resistencia indicados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para cada cepa. También se empleó una dosis 10 veces mayor que la CMI.

Los puntos de corte de los antibióticos varían para cada cepa: Enterococcus. Ampicilina < 8 (Sensible) > 16 (Resistente) Acinetobacter. Ceftazidima < 8 (Sensible) > 32 (Resistente)

Imipenem < 4 (Sensible) > 16 (Resistente)

E. coli. Ampicilina < 8 (Sensible) > 32 (Resistente) Ceftazidima < 8 (Sensible) > 32 (Resistente)

Resultados:

Gram+

• Enterococcus faecalis. Cepa sensible a ampicilina (CMI= 4) y resistente a bencilpenicilina (CMI >32). -Incubación con ampicilina: 0, 4 (CMI), 8, 12, 16, 40 μg/mL. Tras incubar con dosis de 4 μg/mL (CMI), ya se observa el efecto sobre la pared en la mayoría de las células, apareciendo lisadas de modo heterogéneo, con discreto fondo de fragmentos de ADN. Muy lisadas: 35%; discretamante lisadas: 25%; lisadas con ADN fragmentado: 12%; sin lisar: 28%. Tras 8, 12 y 16 μg/mL dan un resultado similar. En 40 μg/mL el fondo se hace muy tenue, con pocas células, el 63% sin lisar, un 15% tienen un pequeño halo de

afectación de la pared, un 20% tiene un halo grande de lisis, un 2% lisadas con nucleoide de ADN fragmentado (Figura 2). -Incubación con bencilpenicilina.: 0, 0,06, 16, 32, 320 μg/mL. Tras 16 μg/mL se aprecia algo de

fondo, que se incrementa algo en 32 y 320 μg/mL. Tras 16 μg/mL, 4.5% lisadas con halo grande. El 81% siguen sin lisar. Tras 32 μg/mL: 4% con halo grande y 4% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado. El 65% siguen sin lisar. Tras 320 μg/mL: 72.3% sin lisar y 25% con halo pequeño. Tras 16, 32 y 320 μg/mL se aprecian muchas cápsulas vacías tenues: 0,5-1,5%.

• Enterococcus faecium. Cepa resistente a ampicilina (CMI >32) y a bencilpenicilina (CMI >32). -Incubación con ampicilina: 0, 8, 12, 16, 32 (CMI), 320 μg/mL. A 320 μg/mL se ve algo de efecto,

con un fondo discreto con 7.5% células muy lisadas, 1% células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, 2% células con halo pequeño y 89% sin lisar (Figura 3). -Incubación con bencilpenicilina: 0, 0,06, 16, 32, 320 μg/mL. Tras 320 μg/mL no hay fondo pero se

observa un 5% de células muy lisadas. El resto están sin lisar.

Gram-

•

Acinetobacter baumannii. Cepa resistente a imipenem (CMI >32) y a ceftazidima (CMI >32). Esta cepa

muestra un fondo muy discreto de base. -Incubación con imipenem: 0, 4, 8, 16, 32, 320 μg/mL . Tras 16 μg/mL no hay fondo de fragmentos extracelulares de ADN y se observa un 1% con halo grande, 1% con halo pequeño. 0,5% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado. Tras 32 μg/mL se observa un resultado similar al de 16 μg/mL. Tras 320 μg/mL se aprecia un discreto fondo de fragmentos extracelulares de ADN, pero el 92% de las células están sin lisar, el 2,5% lisadas con halo pequeño, un 3,5% muy lisadas y un 2% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado. Las no lisadas se muestran de mayor tamaño y más redondeadas. -Incubación con ceftazidima: 0, 8, 20, 32, 256, 2560 μg/mL. Tras 8 μg/mL, el 22% de células están muy alargadas, filamentosas. En las siguientes dosis, el 90% se muestran filamentosas. Tras 20 y 32 μg/mL: el 84,5% muestran halo pequeño, 1.5% con halo grande, sin fondo de fragmentos extracelulares de ADN. Tras 256 μg/mL: 32,3% están muy lisadas, el 63% con halo pequeño, 4.7 % sin lisar, con fondo discreto. Tras 2560 μg/mL continua el mismo fondo, 5% células sin lisar, 6,5% con halo pequeño y 63,5% con halo grande, 25% lisadas y con nucleoides con ADN fragmentado.

•

Acinetobacter baumannii. Cepa sensible a imipenem (CMI =0,38) e intermedia a ceftazidima (CMI =12).

Esta cepa no presenta fondo basal. -Incubación con imipenem: 0, 0,038, 0,38 (CMI), 4, 8, 16 μg/mL. Tras 0,038 μg/mL hay un poco de fondo. El 75,7% permanecen sin lisar y sólo hay un 1,4% con halo grande y un 22,9% con halo pequeño. Tras 0,38 μg/mL hay un fondo claro. El 75,7% están muy lisadas, con halo grande, el 5,9% poseen un halo pequeño y el 7,4% están lisadas y con nucleoide con ADN fragmentado. Tras 4, 8 y 16 μg/mL se aprecia el fondo y muchas cápsulas vacías tenues (12% en 4 μg/mL; 19,5% en 8 μg/mL; 15% en 16 μg/mL). Hay muchas células lisadas con nucleoide con ADN fragmentado (66% en 4 μg/mL; 69,5% en 8 μg/mL; 73,5% en 16 μg/mL). Hay pocas células con halo grande (13,5% en 4 μg/mL; 6% en 8 μg/mL; 5% en 16 μg/mL) y otras pocas sin lisar (8,5% en 4 μg/mL; 5% en 8 μg/mL; 6,5% en 16 μg/mL).

-

Incubación con ceftazidima: 0, 8, 12 (CMI), 20, 32, 120 μg/mL. Tras 8 μg/mL aparecen un 82% de células filamentosas, con un total de 40% lisadas con halo pequeño y un 1% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, sin fondo. Tras 12 μg/mL (CMI) y 20 μg/mL, aparecen 95% de células filamentosas, con 94,5% y 91,5% lisadas con halo pequeño respectivamente y 1,5% y 3% con halo grande, respectivamente y un 4% y 5,5% no lisadas, respectivamente; con 12 μg/mL aparece un fondo discreto, que aumenta tras 20 μg/mL. Tras 32 μg/mL hay más fondo fondo, 90% células alargadas y 88% lisadas con halo pequeño, 6% lisadas con halo grande y 6% sin lisar. Tras 120 μg/mL se observa mucho fondo y aparecen 91% filamentosas y 23% bien lisadas, con halo grande, 67% con halo pequeño, 36% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado y 7% sin lisar.

• Escherichia coli. Cepa intermedia a ampicilina (CMI= 16) y sensible a ceftazidima (CMI =1). -Incubación con ampicilina: 0, 8, 16 (CMI), 20, 32, 160 μg/mL. Tras 8 μg/mL ya se observa mucho fondo y el 55% de las células están muy lisadas, además del 9% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado. Tras 16 μg/mL (CMI): 60,4% lisadas con halo grande, 5,7% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, 22,6 cápsulas vacías, 11,3% sin lisar. Tras 20 μg/mL: hay muy pocas células. El 47,3%

muestran halo grande, 8,6% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, 31,2% cápsulas vacías, 12,9%

sin lisar. Tras 32 y 160 μg/mL hay muy escasas células, siendo un 54% cápsulas vacías.

-

Incubación con ceftazidima: 0, 1 (CMI), 8, 10, 20, 32 μg/mL. Tras 1 μg/mL aparecen un 99% de

células filamentosas, 97% muy lisadas, con algo de fondo (Figura 4). Tras 8 μg/mL, el resultado es similar al de 1 μg/mL, pero con más fondo. Tras 10 μg/mL, 76,5% bien lisadas, 11% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado y 10,5% cápsulas vacías, con mucho fondo. Tras 20 y 32 μg/mL el daño es excesivo, con 25,3% cápsulas vacías y 20% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado; 52,7% bien lisadas y 2% sin lisar.

• Escherichia coli. Cepa resistente a ampicilina (CMI> 256) y a ceftazidima (CMI =32). -Incubación con ampicilina: 0, 8, 20, 32, 256, 2560 μg/mL. Tras 256 μg/mL se aprecian solo 0,5% lisadas y un 1% de lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, sin fondo, similar al basal y dosis

anteriores. Tras 2560 μg/mL las células son más largadas, aunque no filamentosas; un 13% de ellas aparecen muy lisadas, 5% discretamente lisadas, 1,5% lisadas con nucleoide conADN fragmentado y 4% cápsulas vacías, con fondo discreto.

-

Incubación con ceftazidima: 0, 8, 20, 32 (CMI), 320 μg/mL. Tras 8 μg/mL aparecen un 13% células filamentosas, sólo 1% bien lisadas. Tras 20 μg/mL aparecen 99% filamentosas, 94% sin lisar; 5% bien lisadas y sin fondo. Tras 32 μg/mL, 98% filamentosas, 92% sin lisar, 4% bien lisadas, 3% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, 1% cápsulas vacías, con fondo discreto. Tras 320 μg/mL se observa un fondo discreto, con 99% células filamentosas y 95% discretamente lisadas, 3,5% muy lisadas, 0,5% lisadas con nucleoide con ADN fragmentado, 1% sin lisar.

Ejemplo 5 Detección de “persisters”, in situ, dentro de la población bacteriana, y cuantificación de su frecuencia

El fenómeno de la persistencia tras los tratamientos antibióticos tiene gran interés clínico. En una población de una cepa bacteriana, a pesar de ser sensible al antibiótico, puede haber algunas pocas células que, sin tener ningún mecanismo de conocido de resistencia, toleran el antibiótico, permaneciendo sin crecer o creciendo lentamente. Tras quitar el antibiótico, algunas de estas células podrían volver a crecer, y podrían ser responsables de la recidiva de la infección cuando se hace un tratamiento antibiótico discontinuo. Estos “persisters” se pueden encontrar en baja proporción cuando las bacterias crecen exponencialmente, pero su frecuencia se incrementa cuando entran en fase estacionaria y en la formación de los biofilms (Lewis K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol 2007;5:48-56).

En el caso de los �-lactámicos, los “persisters” se cree que carecen de, o tienen inhabilitado, el sistema de autolisis de la pared, el cual se dispara tras el tratamiento antibiótico. La metodología de la invención podría revelar estas células, lo cual aporta un gran valor a la misma. Se podrían detectar en cultivos de células sensibles a un antibiótico, de modo mucho más simple que los métodos que existen actualmente, la monitorización del crecimiento celular mediante microscopía continuada en el tiempo o técnicas de citometría de flujo. Estas metodologías son complejas, laboriosas, caras, y no pueden emplearse a nivel clínico (Roostalu J, Joers A, Luidalepp H, Kaldalu N, Tenson T. Cell división in Escherichia coli cultures monitored at single cell resolution. BMC Microbiol 2008;8:68).

La Figura 5 muestra células de una cepa sensible de E. coli, procedentes de un cultivo en medio líquido, creciendo en fase exponencial, sensible a la amoxicilina/ácido clavulánico, y expuesto a la dosis alta de 32/16 durante 90 minutos. Además de las células afectadas en la pared y del fondo de fragmentos extracelulares de ADN, se observa claramente una que mantiene su morfología intacta, luego no afectada por el antibiótico, que lógicamente debe de corresponder a un “persister”.

Las células “persisters”, al no crecer, deberían incrementar progresivamente su proporción relativa en el portaobjetos, a medida que se aumenta el tiempo de incubación con el antibiótico y las células sensibles van despareciendo del cultivo. Este fenómeno también podría tener lugar cuando la cepa se incuba con dosis progresivamente crecientes del antibiótico, durante un tiempo fijo. En realidad, si se ajustasen los resultados por la cantidad de células presentes tras la incubación con el antibiótico, se obtendría que las células sin halo (“persisters”) se mantendrían constantes independientemente de la dosis de antibiótico o el tiempo de incubación con el mismo, pues no crecen, mientras que el resto de las células sensibles, con halo, disminuirían progresivamente, al desparecer del cultivo. Con estos dos tipos de experimentos, entre otros, se puede determinar si las células sin lisar corresponden a los “persisters”.

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A) Incubación con dosis creciente de antibiótico. Una cepa de E. coli sensible al ampicilina, se incuba con dosis crecientes del antibiótico durante 60 minutos. En la Tabla 1 se observa que el porcentaje de células sin lisar aumenta con la dosis del antibiótico, mientras que el porcentaje de células lisadas disminuye concomitantemente. Cuando se normalizan según la OD600 relativa, es decir, por el número relativo de células que hay en el cultivo tras cada dosis, se aprecia que la proporción relativa de células sin lisar tiende a permanecer entre un 5-8.5, mientras que la proporción relativa de células lisadas disminuye espectacularmente a medida que aumenta la dosis.

DOSIS ug/mL

OD600= 0,1) (ODinicial OD600 % RELATIVA Células Sin Lisar Células Lisadas

%

Relativas % Relativas

0 2 8 16 32 160

0,416 0,323 0,120 0,050 0,027 0,024 100,0 77,6 28,8 12,0 6,5 5,8 -9,7 29,3 62,5 77,5 85,0 -7,5 8,5 7,5 5,0 4,9 2.3 90,3 70,6 37,5 22,5 15,0 2.3 70,1 20,4 4,5 1,5 0,9

10 Tabla 1. Resultados de la incubación de una cepa sensible de E. coli, con dosis crecientes de ampicilina, durante 60 minutos. El % de células se normalizó mediante la OD 600.

B) Incubación durante tiempos crecientes de antibiótico. Una cepa de E. coli sensible a la amoxicina/ácido clavulánico, se incubó con una dosis 32/16 del antibiótico durante 24 horas. Se extrajeron alícuotas del cultivo 15 para ser estudiadas, durante los tiempos especificados en la Figura 6. En la Figura 6, arriba, se observa que la proporción de células sin lisar va aumentando en el cultivo a lo largo del tiempo, a medida que van despareciendo las células afectadas por el antibiótico. De hecho, la curva de caída del porcentaje de células con halo es similar a la caída del porcentaje de células del cultivo, medidas mediante cámara Neubauer. Si se normaliza el porcentaje de células de cada tipo con respecto al porcentaje de células que va quedando en el

20 cultivo, el nivel de células sin halo tiende a mantenerse constante en el tiempo, mientras que el nivel de células con la pared dañada va disminuyendo progresivamente, del mismo modo que el de células del cultivo (Figura 6, abajo).

En conclusión, ambos tipos de experimentos indican que las células sin halo permanecen en el cultivo con

25 antibiótico, a lo largo del tiempo y con diferentes dosis crecientes del antibiótico. Esto apoya su status de “persisters”, pues al no ser afectadas por el antibiótico y no crecer, su frecuencia debería ser independiente de la dosis del antibiótico y del tiempo de incubación con el mismo.

Ejemplo 6

30 Determinación de nucleoides con ADN fragmentado, exclusivamente en las células afectadas en la pared celular por el antibiótico

Una cepa sensible y otra intermedia de E. coli, en crecimiento exponencial, fueron expuestas al antibiótico lactámico amoxicilina, junto con el inhibidor de las �-lactamasas ácido clavulánico, en medio líquido Mueller-Hinton.

35 La dosis fue 32/16. Los tiempos de incubación con el antibiótico fueron 15 minutos, 30 minutos, 1h, 2h, 4 h y 6h. Simultáneamente, en esos mismos tiempos, también se procesó un control de la cepa, sin antibiótico.

La frecuencia de nucleoides con ADN fragmentado se determinó según el protocolo descrito en Tamayo et al. (Tamayo M, Santiso R, Gosálvez J, Bou G, Fernández JL. Rapid assessment of the effect of ciprofloxacin on 40 chromosomal DNA from Escherichia coli using an in situ DNA fragmentation assay. BMC Microbiology 2009; 9: 69). Este protocolo, basado en nuestra patente previa, lisa todas las células independientemente de su estado de la pared. Esta es la técnica adecuada para evaluar el estado del ADN del nucleoide en todas las células de una población. Por otra parte, este tipo de nucleoide también se determinó en las preparaciones procesadas para reconocer la afectación de la pared celular, según el protocolo de la presente invención. Este procedimiento no es 45 adecuado porque no permite estimar el estado del ADN en las células sin lisar, no afectadas en su pared celular por el antibiótico. Sin embargo, dado que en este experimento la gran mayoría de las células son afectadas por el antibiótico, esto permite una estimación de la fragmentación del ADN exclusivamente en las células con la pared dañada. Esto es importante, pues permite evaluar la teoría que indica que la células afectadas por el antibiótico a nivel de la pared celular, generarían una respuesta tardía que acabaría afectando también el ADN del nucleoide, el

50 cual se fragmentaría tardíamente durante el proceso de muerte celular, posiblemente por producción de radicales libres de oxígeno (Kohanski, MA, Dwyer DJ, Hayete B, Lawrence CA, Collins JJ. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell 2007;130:797–810).

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La Figura 7 muestra varias células procesadas por el procedimiento para la determinación de la afectación de la pared celular. Uno de los nucleoides posee el ADN fragmentado. A diferencia de los nucleoides intactos, éste aparece teñido más tenuemente, ocupando una mayor superficie debido al halo de difusión de los fragmentos de ADN a partir de la zona o residuo bacteriano central.

Ejemplo 7 Determinación de sensibilidad o resistencia a un antibiótico j-lactámico, sin emplear la lisis, valorando el fondo de fragmentos extracelulares de ADN, en la preparación

Cuando las bacterias se procesan obviando el paso de incubación en la solución de lisis, éstas aparecen intactas en su práctica totalidad, estén afectadas o no por el antibiótico. Sin embargo, si tras incubación pertinente con la dosis de antibiótico de corte para sensible, en la preparación se aprecia o no el fondo homogéneo micro difuso, granularfibrilar, de fragmentos de ADN desprendidos por las células, se puede claramente decidir si la cepa es sensible o no, respectivamente. Esta valoración del fondo, sin usar la lisis para ver el efecto sobre la pared celular, puede hacerse tiñendo con el fluorocromo el material incluido en microgel, o el material sin incluir en microgel, ya sea fijado o fresco.

En caso de cultivo puro, la valoración del fondo de fragmentos de ADN presentes en la preparación hecha sin emplear la lisis puede ser suficiente para reconocer si una cepa es sensible o resistente, tras el tiempo de incubación adecuado con el antibiótico contra la pared bacteriana. Esto quizás puede agilizar aun más el tiempo de obtención del resultado, cuando éste se hace muy imperioso por urgencia clínica.

A) Material incluido en microgel El líquido con las células se incluye en microgel de agarosa, que se deshidrata en alcoholes y/o se seca al aire o en estufa y se tiñe con el fluorocromo. Es el mismo proceso descrito con detalle anteriormente, pero sin incubación con la solución de lisis. La evaluación del fondo se puede realizar rápidamente, tras los 15-20 minutos que ocupa realizar la técnica. Las preparaciones son permanentes. El resultado se aprecia en la Figura 8, que muestra las mismas cepas presentadas en la Figura 1, crecidas durante 24 horas en placa y luego incubadas 40 minutos con las dosis 0, 8/4 (baja) y 32/16 (alta) de amoxicilina/ácido clavulánico.Este sistema más abreviado no permite detectar los “persisters” de la propia cepa bacteriana, ni discriminar células sensibles de resistentes, en caso de cultivo mixto o contaminado. Además, la intensidad del fondo de fragmentos extracelulares de ADN depende de la concentración de bacterias sensibles. Si esta es reducida, el fondo puede ser muy tenue o casi inobservable. Así, una cepa de E. coli sensible a amoxicilina/ácido clavulánico, incubada con una concentración alta (32/16), a partir de una OD600 de 0,07, muestra fondo muy evidente a los 15 minutos de incubación (OD600: 0,071; 42,5 millones de células por mL, medidas mediante cámara Neubauer; 5.62 % de células viables) y se mantiene intenso hasta las 2 horas de incubación (OD600: 0,033; 14,5 millones de células por mL; 3,77 % de células viables). El fondo pasa a ser escaso a las 3 y 4 horas (OD600: 0,037 y 0,033 respectivamente; 14 millones de células por mL en ambos tiempos; 0,38 % de células viables en ambos tiempos) y ya no se aprecia a las 6 horas (OD600: 0,035; 13,5 millones de células por mL; 0,13 % de células viables). Si bien las células totales se mantienen entre un 40-30% de las iniciales desde los 60 minutos hasta las 6 horas, la intensidad del fondo de fragmentos de ADN se va reduciendo en ese tiempo hasta no ser detectable, posiblemente por degradación del mismo.

B) Material fijado Una alícuota del cultivo sin antibiótico y otras con las dosis de antibiótico, se pueden mezclar con un fijador. Por ejemplo, se pueden usar fijadores alcohólicos, aldehídicos o cetónicos como metanol, etanol, acetona, formaldehído, glutaraldehído, también ácido acético, ácido pícrico, cloruro de mercurio, ión dicromato, tetróxido de osmio, etc, y mezclas como el metanol:ácido acético, por ejemplo en proporción 3:1, como el líquido de Carnoy. En el caso del formaldehído, la solución puede quedar acuosa del 0,1 al 50%, preferentemente al 10%. En el caso de los demás fijadores, se pueden usar en diferentes proporciones, del 0,1 al 100%. Es recomendable una proporción de 5-10% de solución acuosa de microorganismos y 95-90% de fijador. La ventaja de la fijación sobre la observación en fresco es que el material se puede almacenar durante mucho tiempo y observarse cuando sea conveniente. Se extiende una gota (unos pocos microlitros) sobre el portaobjetos y se deja secar. Luego se añade el fluorocromo SYBR Gold (1:400), se monta con un cubreobjetos y se examina. El formaldehído conserva el fondo solo brevemente, por lo que no es recomendable. Los otros fijadores son más duraderos y dan una imagen clara del fondo.

Es preferible es el metanol:ácido acético. Con el metanol:ácido acético, el material se extiende más fácilmente sobre el portaobjetos y el material de fondo y las bacterias quedan mejor adheridos al vidrio, mientras que con los otros fijadores es más probable que se desprendan al teñir, a no ser que se incube previamente con calor seco. El fondo de fragmentos extracelulares de ADN se aprecia como un agregado disperso (Figura 9). La extensión del material fijado sobre el portaobjetos tarda en secar unos 8-10 minutos, aunque cuando el portaobjetos se coloca sobre una placa o estufa a 37ºC se seca en 5 minutos. Si el metanol: ácido:acético (3:1) está al 95%, el secado tras la extensión de la gota es rápido, en menos de 1 minuto. Aunque más sencilla en materiales, las fijaciones no aportan gran ventaja en cuanto al tiempo de preparación y observación, con respecto a la preparación del microgel, el cual

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también es permanente. Así pues, de cara a una primera determinación provisional rápida de sensibilidad o resistencia, la operatividad de la fijación o del uso del microgel es prácticamente similar.

C) Material fresco Se añade el fluorocromo ana alícuota del cultivo, se coloca un cubreobjetos y se examina directamente con el microscopio de fluorescencia. Por ejemplo, a unos 10 microlitros del cultivo líquido con bacterias, se añaden 2 microlitros de fluorocromo SYBR Gold (1:400). Esto se hace en cultivos con antibiótico que actúa sobre la pared celular, incluyendo un cultivo control, sin antibiótico. En el cultivo con el antibiótico, además de las bacterias flotando, se aprecia material difuso intercelular micro filamentoso o granular, en continuo movimiento browniano, que corresponde al fondo emitido por las bacterias sensibles (Figura 9).Esta determinación de la sensibilidad o resistencia al antibiótico que actúa sobre la pared celular, es la más rápida y sencilla, en 1 minuto. De todos modos depende de la concentración de células, la capacidad de la célula sensible para soltar material celular, la pureza de la cepa, tiempo de incubación con el antibiótico, dosis del antibiótico, etc. Ocasionalmente puede observarse alguna bacteria lisada, que suelta el nucleoide de ADN, pero la mayoría no se comportan así. La técnica no permite detectar los “persisters” de la propia cepa bacteriana, ni discriminar células sensibles de resistentes, en caso de cultivo mixto

o contaminado. Finalmente, la calidad de la imagen no es tan clara y nítida como en el caso de inclusión en microgel, y la preparación no es permanente, por lo que no se puede almacenar y examinar en el futuro, a no ser que se congele.

Cuando se centrifugan las bacterias que crecen en un medio líquido con un antibiótico contra la pared, al que son sensibles, las bacterias se acumulan en el pellet, mientras que los fragmentos de extracelulares ADN permanecen en la fracción sobrenadante. Un alícuota de esta fracción sobrenadante se puede teñir con el fluorocromo, para ser valorada, ya en fresco o fijada o procesada en microgel. De este modo también se obtiene información rápida de la sensibilidad o resistencia al antibiótico. La valoración de este fondo de fragmentos extracelulares de ADN pude ser realizada no solo mediante la microscopía, sino por cualquier otro procedimiento alternativo para detectar ADN, ya sea físico o químico (electroforesis, anticuerpos, espectrofotometría, reacción en cadena de la polimerasa, técnicas de hibridación, microarrays, microfluídica, nanopartículas, quantum dots, etc).

Ejemplo 8 Evaluación de la naturaleza del fondo microgranular-fibrilar observado en las preparaciones de cultivos de bacterias sensibles a antibióticos contra la pared celular.

A) Incubación in situ con proteinasa K, enzima que degrada las proteínas, y con DNAasa I, enzima que digiere el ADN El experimento se realizó con una cepa de E. coli sensible a ampicilina y un cepa de A. baumanii sensible a imipenem. La primera se incubó con ampicilina 32 μg/mL y la segunda con imipenem 0,76 μg/mL, durante 60 minutos, en medio líquido Mueller-Hinton, a 37ºC, en agitación. Tras la incubación, cada cultivo con las células se incluyó en microgeles sobre el portaobjetos. En cada portaobjetos se colocó un microgel del cultivo control sin antibiótico, y dos microgeles del cultivo tratado con antibiótico. El tamaño de cada microgel es el que corresponde a un cubreojetos de 18x18mm. Estos microgeles, en unos portaobjetos fueron lavados en tampón de proteinasa K (SDS 1%, EDTA 2 mM) y en otros portaobjetos, en tampón de DNAasa I (Tris-HCl 20 mM, pH 8,3, MgCl2 2 mM). En los primeros, uno de los microgeles del cultivo tratado con ampicilina se incubó solamente con tampón de proteinasa K y el otro microgel del cultivo tratado con ampicilina se incubó con 5 μl de la propia proteinasa K, 2 mg/mL, en su tampón. En los portaobjetos lavados con tampón de DNAasa I, uno de los microgeles del cultivo tratado con ampicilina se incubó solamente con tampón de DNAasa I y el otro microgel del cultivo tratado con ampicilina se incuba con 5 μl de la propia DNAasa I, 2,5 U, en su tampón. Las incubaciones se realizaron durante 30 minutos, a 37ºC, en cámara húmeda. Posteriormente los portaobjetos se lavan en agua destilada, se deshidratan en alcoholes crecientes, se secan y se tiñen con SYBR Gold (1:400).

Resultado: Los cultivos sin tratar con la ampicilina o el imipenem no mostraron fondo micro granular-fibrilar en la preparación (Figura 10 a). En los cultivos tratados con ampicilina o imipenem, apareció el fondo, el cual se mantuvo en los microgeles incubados exclusivamente con los tampones de las enzimas (Figura 10 b, c y e). Cuando se incubó con proteinasa K, el fondo permaneció inalterado (Figura 10 f), mientras que cuando se incuba con DNAasa I, el fondo desapareció (Figura 10 d). Incrementar la concentración de proteinasa K a 10 mg/mL en el mismo tampón

o en agua, tampoco resultó en afectación del fondo, sea en microgel o en extensión en Carnoy. Esto indica que el fondo observado incluye principalmente fragmentos extracelulares de ADN procedentes de las células afectadas por el antibiótico. Este fondo no se aprecia cuando se usan otros tipos de antibióticos, como las quinolonas.

B) Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) con sonda de ADN genómico total de E. coli.

Un cultivo de E. coli sensible a ampicilina se incubó con dicho antibiótico, 32 μg/mL, durante 60 minutos, en medio líquido Mueller-Hinton, a 37ºC, en agitación. ML de cultivo se mezclaron con metanol: ácido acético (3:1) y se extendieron sobre portaobjetos. Tras secar al aire, los portaobjetos se sumergieron 5 minutos en metanol: ácido acético (3:1) (líquido de Carnoy) y se dejaron secar. Posteriormente se incubaron en alcoholes de 70%, 90% y 100%, a -20ºC, 5 minutos cada uno y se dejaron secar. El ADN presente en los portaobjetos se desnaturalizó, incubándolos en 75% formamida/2XSSC, pH7, a 67ºC, 90 segundos. Posteriormente se volvieron a pasar por alcoholes de 70%, 90% y 100%, a -20ºC, 5 minutos cada uno y se dejaron secar. En cada uno de ellos, a nivel del área de la extensión, se pipetearon microlitros de sonda de ADN genómico total de E. coli, marcada con biotina (4.3 ng/μl en 50% formamida, 2XSSC, 10% sulfato de dextrano, 100mM fosfato sódico, pH7), poniendo un cubreobjetos de 18x18mm. La sonda se incubó toda la noche en cámara húmeda: la sonda no hibridada se lavó en 50% formamida/2XSSC, pH7, dos lavados de 5 minutos y luego en 2XSSC, pH7, dos lavados de 3 minutos cada uno, a 37ºC. Para revelar la sonda hibridada, los portaobjetos se incubaron en solución bloqueante de anticuerpos (5% BSA,4XSSC, 0,1% Triton X-100) durante 5 minutos a 37ºC y luego en streptavidin-Cy3 (1:200, en 1% BSA, 4XSSC, 0,1% Triton X-100), 30 minutos. Los portaobjetos se contratiñeron con DAPI (1 μg/mL en Vectashield) y se examinaron con microscopio de fluorescencia.

Resultado: La contratinción con DAPI evidencia que en las preparaciones fijadas en Carnoy, el fondo se muestran en agregados, que pueden englobar células bacterianas cuyos nucleoides se tiñen con el DAPI. El colorante del ADN penetra fácilmente debido a la ausencia de pared en dichas células. El DAPI también tiñe, más tenuemente, el fondo agregado (Figura 11 a). Al examinar la señal de hibridación de la sonda, se observa que los nucleoides de las células, desprovistas de pared debido al tratamiento antibiótico, hibridan la sonda de ADN genómico total. El fondo agregado muestra señal intensa de hibridación (Figura 11 b), demostrando, de modo concluyente, que corresponde a ADN bacteriano.

C) Tinción de microgel de cultivo diluido de Acinetobacter baumannii, sensible a imipenem Un cultivo de A. baumannii sensible a imipenem se incubó con dicho antibiótico, 0,76 μg/mL, durante 60 minutos, en medio líquido Mueller-Hinton, a 37ºC, en agitación. Un alícuota de dicho cultivo se diluyó 10 veces y se incluyó en microgel sin usar lisis, se deshidrató en alcoholes crecientes, se secó y se tiñó con SYBR Gold. La dilución permitió observar con mayor detalle el aspecto del fondo microgranular-fibrilar, el cual corresponde a fragmentos de ADN en diferentes niveles de estiramiento, desde el aspecto puntual retraído hasta la apariencia fibrilar extendida (Figura 12).

Conclusión: El fondo microgranular-fibrilar observado en el medio de los cultivos de microorganismos donde el antibiótico contra la pared celular ha sido efectivo corresponde a fragmentos de ADN extracelular, liberado por el microorganismo.

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Claims (42)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método para evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria en un cultivo puro en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende: i) añadir a dicho cultivo puro de dicha bacteria un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, y

   ii) determinar la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo, en el que la presencia de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo es indicativo de que la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende entre las etapas (i) e (ii), inmovilizar una muestra del cultivo de la etapa (i) sobre un portaobjetos.

3. 3.

   Método para evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en un cultivo en presencia de un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende:

   i) añadir a dicho cultivo un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, ii) añadir solución de lisis al cultivo resultante de la etapa i), en donde dicha solución de lisis es una solución de lisis específica para aquellas bacterias cuya pared celular ha sido dañada por el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana, y comprende un tampón con un pH comprendido entre 3 y 11,5, y

   iii) determinar la presencia del nucleoide bacteriano, en el que la presencia del nucleoide bacteriano en el medio es indicativa de que la integridad de la pared celular de las bacterias ha sido dañada.

4. 4.

   Método según la reivindicación 3, en el que las bacterias presentes en el cultivo pertenecen a la misma especie o a especies distintas.

5. 5.

   Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que la solución de lisis comprende, además, hasta un 3% de un detergente iónico o un detergente no iónico.

6. 6.

   Método según la reivindicación 5, en el que el detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina, sal hidratada del ácido glicocólico, y sus mezclas.

7. 7.

   Método según la reivindicación 5, en el que el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en el toctilfenoxipolietoxietanol, N,N-Bis(3-D-gluconamidopropil) colamida, tricosaetilen gliol dodecileter, N-decanoil-Nmetilglutamina, digitonina, dodecanoil-N-metilglucamida, heptanoil-N-metilglutamida, octilfenoxi poli(etileneoxi)etanol ramificado, N-Nonanoil-N-metilglucamina, octilfenoxipolietoxietanol, N-octanoil-N-metilglutamina, solución Span 20 y polisorbato 20.

8. 8.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que la solución de lisis comprende, además, hasta una concentración 3M de una sal.

9. 9.

   Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que la solución de lisis comprende (hidroximetil)-1,3-propanediol 0,2M, dodecilsulfato de sodio 0,025%, cloruro sódico 0,5M ó 0,05M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

10. 10.

    Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que la solución de lisis comprende (hidroximetil)-1,3-propanediol 0,2M, Triton X-100 5%, cloruro sódico 1M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

11. 11.

    Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que la solución de lisis comprende sodio fosfato bibásico 0,3M, dodecilsulfato de sodio 2%, ácido etilendiamino tetraacético 0,05M, un pH de 11,45 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

12. 12.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que el método comprende, además, antes o después de la etapa (ii), inmovilizar una muestra del cultivo sobre un portaobjetos.

13. 13.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la observación de la presencia de fragmentos extracelulares de ADN o del nucleoide bacteriano en el medio de cultivo se lleva a cabo mediante tinción.

14. 14.

    Método según la reivindicación 13, en el que la tinción se lleva a cabo mediante fluorocromos.

15. 15.

    Método según la reivindicación 14, en el que los fluorocromos se seleccionan del grupo que consiste en Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI, cromomicina A3, mitramicina, bromuro de etidio, naranja de acridina, naranja de

    25

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    tiazoilo, , 7-AAD, , derivados de la cianinas, y las variantes de los fluorocromos TOTO, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO y LO-PRO.

16. 16.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico �-lactámico, una isoniacida, una etionamida, un etambutol, una cicloserina y un antibiótico glucopéptido.

17. 17.

    Método según la reivindicación 16, en el que el antibiótico �-lactámico se selecciona del grupo que consiste en penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbacefem, carbapenémicos, monobactámicos e inhibidores de las lactamasas.

18. 18.

    Método según la reivindicación 17, en el que los inhibidores de las �-lactamasas se seleccionan del grupo que consiste en ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam.

19. 19.

    Método según la reivindicación 16, en el que el antibiótico glucopéptido es vancomicina o teicoplanina.

20. 20.

    Método para determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que si la integridad de la pared celular de la bacteria ha sido dañada, entonces la bacteria es sensible al antibiótico.

21. 21.

    Método para diseñar una terapia antibiótica personalizada a un individuo que padece una enfermedad bacteriana que comprende i) aislar la bacteria causante de la enfermedad bacteriana a partir de una muestra procedente de dicho individuo, y ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 19, en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces dicho individuo es susceptible de recibir una terapia basada en un antibiótico que actúan a nivel de la pared celular.

22. 22.

    Método para identificar un compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana que comprende: i) poner en contacto un cultivo de una bacteria sensible a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana en presencia del compuesto candidato, y ii) evaluar la integridad de la pared celular de dicha bacteria mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19,

    en el que si la integridad de la pared celular de dicha bacteria ha sido dañada, entonces el compuesto candidato es un compuesto que actúa a nivel de la pared celular bacteriana.

23. 23.

    Método para identificar una bacteria persister o tolerante a un antibiótico que actúa a nivel de la pared celular bacteriana en un cultivo de bacterias sensibles, que comprende evaluar la integridad de la pared celular de las bacterias presentes en dicho cultivo mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 19, en el que la bacteria cuya integridad de la pared celular no haya sido dañada es identificada como persister o tolerante.

24. 24.

    Una solución de lisis caracterizada porque afecta solo a las bacterias que presentan la pared bacteriana dañada por acción de un antibiótico, que comprende un tampón y un pH de entre 3 y 11,5.

25. 25.

    Solución de lisis según la reivindicación 24, en el que dicha solución de lisis comprende, además, hasta un 3% de un detergente iónico o un detergente no iónico

26. 26.

    Solución de lisis según la reivindicación 25, en el que el detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina, sal hidratada del ácido glicocólico, y sus mezclas.

27. 27.

    Solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones 25, en el que el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en el toctilfenoxipolietoxietanol, N,N-Bis(3-D-gluconamidopropil) colamida, Brij(r) 35 P, Ndecanoil-N-metilglutamina, digitonina, dodecanoil-N-metilglutamida, heptanoil-N-metilglutamida, octilfenoxi poli(etileneoxi)etanol ramificado, N-Nonanoil-N-metilglutamina, Nonidet P 40, N-octanoil-N-metilglutamina, solución Span 20 y polisorbato 20.

28. 28.

    Solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que la solución de lisis comprende, además, hasta una concentración 3M de una sal.

29. 29.

    Solución de lisis según la reivindicación 24, en el que la solución de lisis comprende (hidroximetil)-1,3propanediol 0,2M, dodecilsulfato de sodio 0,025%, cloruro sódico 0,5M ó 0,05M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.

    26

    5 30. Solución de lisis según la reivindicación 24, en el que la solución de lisis comprende (hidroximetil)-1,3propanediol 0,2M, Triton X-100 5%, cloruro sódico 1M, un pH de 10 y temperatura ambiente de 22ºC ó 37ºC.
30. 31. Solución de lisis según la reivindicación 24, en el que la solución de lisis comprende sodio fosfato bibásico 0,3M,

    dodecilsulfato de sodio 2%, ácido etilendiamino tetraacético 0,05M, un pH de 11,45 y temperatura ambiente de 22ºC 10 ó 37ºC.
31. 32. Uso de una solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31, para evaluar la integridad de pared celular bacteriana.

    15 33. Kit que comprende una solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31.

    27

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    FIG.1

    FIG 2

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    FIG. 3

    FIG.4

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    FIG. 5

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    FIG. 6

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    FIG. 7

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    FIG. 8

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    FIG. 9

    34

    FIG. 10

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    ES 2 396 820 Al

    FIG. 11

    FIG. 12

    36

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.º solicitud: 201131276

    ESPAÑA

    Fecha de presentación de la solicitud: 26.07.2011

    Fecha de prioridad:

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categoria

    @ Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    X Y X Y A A A A A A A FERNÁNDEZ, J.L. et al., ‘DNA fragmentation in microorganisms assessed in situ’, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2008 Oct, Vol. 74, No. 19, páginas 5925-5933, ISSN: 0099-2240, Resultados y Discusión, páginas 5931-2 ('Ampicillin incubation'), Figura 6. Resultados y Discusión, Figura 6. US 2009142798 A1 (SAMSUNG ELECTRONICS CO. LTD.) 04.06.2009, párrafos [0025]-[0031]; reivindicaciones. Párrafos [0025]-[0031]; ejemplos. US 2011151455 A1 (UNIV. SOUTH FLORIDA) 23.06.2011, todo el documento. WO 02055015 A2 (ESSENTIAL THERAPEUTICS INC.) 18.07.2002, todo el documento. WO 03048380 A1 (ASTRAZENECA AB.) 12.06.2003, todo el documento. GB 2128737 A (BEECHAM GROUP PLC.) 02.05.1984, todo el documento. WO 2008089280 A2 (APPLERA CORP.) 24.07.2008, todo el documento. EP 2333105 (KONINKL PHILIPS ELECTRONICS) 15.06.2011, todo el documento. SINGH, N.P., ‘A simple method for accurate estimation of apoptotic cells’, EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, 2000, Vol. 256, No.1, páginas 328-337, ISSN: 0014-4827, todo el documento. 1,2 3-5,7,8,12-23 24-28,32, 33 3-5,7,8,12-23 1-23 1-23 1-23 1-23 1-23 1-23 1-23

    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado � para todas las reivindicaciones � para las reivindicaciones nº:

    Fecha de realizaci6n del informe 28.01.2013 Examinador J. L. Vizán Arroyo Pagina 1/5

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    Nº de solicitud: 201131276

    CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD C12Q1/18 (2006.01)

    C12N1/06 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

    C12N, C12Q

    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE

    Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

    OPINION ESCRITA

    Nº de solicitud: 201131276

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 28.01.2013

    Declaraci6n

    Novedad (Art. .1 LP 11/198 )

    Reivindicaciones 3-33 SI

    Reivindicaciones

    1, 2 NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/198 )

    Reivindicaciones 6, 9-11, 29-31 SI

    Reivindicaciones

    3-5, 7,8, 12-28, 32, 33 NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opini6n.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

    OPINION ESCRITA

    Nº de solicitud: 201131276

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Numero Publicaci6n o Identificaci6n Fecha Publicaci6n

    D01

    FERNÁNDEZ, J.L. et al., Appl. Environ. Microbiol., (2008),74(19): 5925-33. 2008

    D02

    US 2009142798 A1 (SAMSUNG ELECTRONICS CO. LTD.) 04.06.2009

    D03

    US 2011151455 A1 (UNIV. SOUTH FLORIDA) 23.06.2011

    D04

    WO 02055015 A2 (ESSENTIAL THERAPEUTICS INC.) 18.07.2002

    D05

    WO 03048380 A1 (ASTRAZENECA AB.) 12.06.2003

    D06

    GB 2128737 A (BEECHAM GROUP PLC.) 02.05.1984

    D07

    WO 2008089280 A2 (APPLERA CORP.) 24.07.2008

    D08

    EP 2333105 (KONINKL PHILIPS ELECTRONICS) 15.06.2011

    D09

    SINGH, N.P., Exp. Cell. Res., (2000), 256(1): 328-37. 2000

    En D1 se describe un procedimiento de valoración in situ de la fragmentación del ADN cromosómico en microorganismos. En D2 se describe un método y un tampón para lisar células de manera selectiva.
32. 2. Declaraci6n motivada segun los articulos 29. y 29.7 del Reglamento de ejecuci6n de la Ley 11/198 , de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraci6n

    1. NOVEDAD (Art. 4.1. y Art. 6.1. de la Ley de Patentes).

    1.1. Reivindicación independiente 1.

    1.1.1. El objeto de la reivindicación 1 consiste en un método para evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria en un cultivo puro en presencia de un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana caracterizado básicamente por la detección de fragmentos extracelulares de ADN en el medio de cultivo.

    En el documento D1 se ha estudiado la efecto del tratamiento con ampicilina sobre el ADN cromosómico de bacterias sensibles al antibiótico y se ha detectado, tras un periodo de incubación del cultivo bacteriano con el antibiótico, la liberación de fragmentos de ADN al medio de cultivo como consecuencia de un proceso espontaneo de lisis celular (cf. D1: Resultados y Discusión, ‘Ampicillin incubation’ en páginas 5931-2, Figura 6). Por consiguiente, se considera que el objeto de protección de la reivindicación independiente 1 y el de la dependiente 2 no es nuevo sobre la base del documento D1.

    1.2.

    La presente solicitud no satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes, pues el objeto de las reivindicaciones 1 y 2 no es nuevo de acuerdo con el Art. 6.1. de la Ley de Patentes.

33. 2.

    ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 4.1. y Art. 8.1. de la Ley de Patentes).

34. 2.1. Reivindicación independiente 3.
35. 2.1.1. Los documentos D1-D2 constituyen el estado de la técnica más próximo. En D1 se analiza del efecto de los antibióticos que actúan en la pared celular sobre el ADN de bacterias sensibles al antibiótico y se describe la liberación de fragmentos de ADN al medio de cultivo como consecuencia de un proceso de autolisis (cf. D1: Resultados y Discusión, ‘Ampicillin incubation’ en páginas 5931-2, Figura 6). En D2 se describe un método para lisar selectivamente células no viables en una muestra de una población celular (cf. D2: Párrafos [0025]-[0031], Reivindicaciones).
36. 2.1.2. El problema técnico a resolver por el objeto de la reivindicación independiente 1 puede ser considerado, por consiguiente, como la provisión de un nuevo método para evaluar la integridad de la pared celular de una bacteria en un cultivo puro en presencia de un antibiótico que actúa sobre la pared celular bacteriana.
37. 2.1.3. La solución propuesta en la reivindicación 3 consiste básicamente en un método caracterizado por la inducción de la lisis específica de las baterías dañadas en la pared celular por la acción del antibiótico y la detección subsiguiente de fragmentos de ADN en el medio de cultivo. La lisis bacteriana se lleva a cabo mediante un tampón caracterizado porque el pH está comprendido entre 3 y 11,5 (Reivindicación 3).

    La diferencia técnica entre el método de la invención y el descrito en D1 consiste en la etapa de inducción de la lisis de las bacterias dañadas en la pared celular. En el estado de la técnica se han divulgado métodos de lisis selectiva de determinadas células en una muestra de una población celular (cf: D2, D4-D6). En particular, en D2 se describe un método para lisar selectivamente microorganismos no viables en una muestra mediante un tampón de lisis que incluye un surfactante no iónico y una sal divalente, y cuyo valor de pH está comprendido entre 7 y 8. Por consiguiente, se considera que ante el problema técnico planteado, el experto en la materia combinaría las enseñanzas divulgadas en D1 con las de D2 llegando a la solución propuesta en la reivindicación 3 o a una equivalente. Por todo ello, se considera que la reivindicación 3 y las reivindicaciones dependiente 4, 5, 7, 8, 12-23 no son inventivas.

    Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

    OPINION ESCRITA

    Nº de solicitud: 201131276
38. 2.2. Reivindicación independiente 24 y reivindicaciones dependientes 25-28, 32, 33.
39. 2.2.1. En D2 se describe una solución para la lisis selectiva de células no viables que comprende un surfactante no iónico y una sal divalente, y cuyo valor de pH está comprendido entre 7 y 8.
40. 2.2.2. El problema técnico a resolver por el objeto de las reivindicaciones 24-28 puede ser considerado como la provisión de una nueva solución para la lisis selectiva de ciertas bacterias con características determinadas. La solución propuesta en la reivindicación 24 consiste en una solución de lisis caracterizada porque afecta a bacterias que presentan la pared bacteriana dañada por la acción de un antibiótico y porque comprende un tampón cuyo valor de pH está comprendido entre 3 y 11,5. Además, según las reivindicaciones 25 a 28, la solución de lisis puede comprender un detergente no iónico y una sal. Se considera que el experto en la materia llegaría a la solución propuesta en la reivindicación 24 o a una equivalente a partir del documento D2. Por consiguiente, se estima que la reivindicación 24 y las reivindicaciones dependiente 25-28, 32, 33 no son inventivas.
41. 2.3. La presente solicitud no satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes porque el objeto de la invención, definido en las reivindicaciones 3-5, 7,8, 12-28, 32, 33, no implica actividad inventiva de acuerdo con el Art.
42. 8.1. de la Ley de Patentes.

    Informe del Estado de la Técnica Página 5/5