KR101315007B1 - 세포내 효소의 방출 전 세포외 효소를 불활성화함으로써시료 내 세포를 구별하는 방법 - Google Patents

세포내 효소의 방출 전 세포외 효소를 불활성화함으로써시료 내 세포를 구별하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101315007B1
KR101315007B1 KR1020077028198A KR20077028198A KR101315007B1 KR 101315007 B1 KR101315007 B1 KR 101315007B1 KR 1020077028198 A KR1020077028198 A KR 1020077028198A KR 20077028198 A KR20077028198 A KR 20077028198A KR 101315007 B1 KR101315007 B1 KR 101315007B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
activity
cells
sample
interest
blood
Prior art date
Application number
KR1020077028198A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080056112A (ko
Inventor
마크 그린
로버트 에이젠탈
Original Assignee
쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 filed Critical 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
Publication of KR20080056112A publication Critical patent/KR20080056112A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101315007B1 publication Critical patent/KR101315007B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 액체 시료 내 관심 세포의 존재 또는 부존재를 검출하는 방법에 관한 것으로 (a) 상기 시료는 (i) 가측 활성을 갖는 효소를 포함하는 세포외 배지를 포함하고, 그리고 (ii) 상기 가측 활성을 갖는 세포내 효소를 함유하는 관심 세포를 함유할 것으로 추정되고, (b) 상기 방법은 (i) 상기 관심 세포내 가측 활성을 불활성화하지 않지만, 세포외 배지에서 상기 가측 활성을 불활성화하는 시약으로 액체 시료를 처리하는 단계, (ii) 상기 관심 세포를 용해하여 세포내 효소를 방출하는 단계, 및 (iii) 상기 가측 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 따라서 세포내 효소는 세포외 효소로부터의 간섭 없이 측정될 수 있다. 본 발명은 아데닐레이트 키나아제 활성을 기초로 하는 검출 분석을 이용하여 세균으로 감염된 혈액의 치료에 특히 유용하다.
세포내 효소, 세포외 효소, 아데닐레이트 키나아제, 혈액

Description

세포내 효소의 방출 전 세포외 효소를 불활성화함으로써 시료 내 세포를 구별하는 방법{DISTINGUISHING CELLS IN A SAMPLE BY INACTIVATING EXTRACELLULAR ENZYME BEFORE RELEASING INTRACELLULAR ENZYME}
본 명세서에서 인용된 모든 문서들은 전체적으로 참조에 의해 편입된다.
본 발명은 세포 분석 분야, 특히 임상 진단 미생물학 분야에 속한다.
임상 미생물학은 흔히 체액 내 세균의 검출을 포함한다. 체액은 세균을 함유할 뿐만 아니라, 환자 자신으로부터의 세포를 함유할 수 있다. 숙주 및 병원균 세포의 상대적인 비율은 광범위하게 다양할 수 있고, 예컨대, 소변 시료는 숙주 세포가 거의 없고 다수의 세균(㎖ 당 > 100,000)을 함유할 수 있지만, 혈액 시료는 큰 초과량의 숙주 세포(107 이상)를 함유할 수 있다.
몇몇의 진단 테스트(예컨대, 그램 염색법, PCR)는 숙주 세포와 세균 세포를 쉽게 구별할 수 있지만, 다른 것들은 그렇지 못하다. 예컨대, 몇몇의 진단 테스트는 숙주 세포에서도 존재하는 마커(marker)에 의존하고, 따라서 두 유형의 세포에서의 존재는 테스트를 간섭할 수 있다. 이러한 종류의 간섭은 치은열구액(GCF) 테스트에서 발견된다. 알칼리성 포스파타아제, 산성 포스파타아제 및 젖산 탈수효소 와 같은 단백질이 질병 상태의 GCF 시료 내에서 상승하는 것으로 밝혀졌으나, 모든 이 효소는 숙주 또는 세균으로부터 유래할 수 있다, [1].
여러 백그라운드를 갖는 숙주 세포들 내에서 세균 세포를 식별하여야 하지만, 비특이적 세포내 마커를 이용하여야 하는 경우, 숙주 백그라운드로부터 세균 마커를 구별하는 방법이 요구된다. 더 특히, 임상 혈액 시료 내 관심 마커가 혈액 세포, 세균 세포 또는 심지어 혈청으로부터 유래할 수 있는 경우, 이 다양한 근원들을 서로 구별할 필요가 있다.
발명의 개시
발명자는 시료 내 세포내 미생물 마커를 특이적으로 검출하는 방법, 심지어 시료가 숙주 세포내 그리고/또는 유리 용액에서 또한 이 마커를 함유하는 경우에서도 특이적으로 검출하는 방법을 발견하였다. 세포 감별 용해(differential lysis)를 이용하여 미생물은 손상되지 않게 하고 숙주 세포를 용해함으로써, 숙주 세포 마커를 방출하고, 다음으로 벌크 용액 내 마커를 불활성화한다. 숙주 세포 및 용액으로부터 유래한 마커의 불활성화로 이어지는 미생물의 용해는 간섭 없이 분석될 수 있는 마커를 방출한다. 이 기술은 숙주 세포 백그라운드 내 미생물뿐만 아니라 세포가 감별 용해 처리될 수 있는 세포 유형의 임의의 혼합물에도 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 액체 시료 내 관심 세포의 부존재 또는 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 여기서
(a) 상기 시료는 (i) 가측 활성을 갖는 효소를 함유하는 세포외 배지를 포함하고, 그리고 (ii) 상기 가측 활성을 갖는 세포내 효소를 함유하는 관심 세포를 함유할 것으로 추정되고,
(b) 상기 방법은 (i) 상기 관심 세포내 가측 활성을 불활성화하지 않지만, 세포외 배지에서 상기 가측 활성을 불활성화하는 시약으로 액체 시료를 처리하는 단계, (ii) 상기 관심 세포를 용해하여 세포내 효소를 방출하는 단계, 및 (iii) 상기 가측 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
단계 (iii)에서 가측 활성의 검출은 관심 세포가 시료 내에 존재하였음을 나타내고, 역으로, 가측 활성의 부존재는 세포가 존재하지 않았음을 나타낸다.
세포외 활성의 불활성화 후, 그러나 (b)의 단계 (ii)의 용해 이전, 관심 세포를 배양하여 이를 성장시킬 수 있다.
전형적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 가측 효소를 소화하는 프로테아제로의 선택 용해에서 기인한 조성물(예컨대, 혈액 세포는 용해되었지만, 미생물은 손상되지 않은 혈액 시료)을 처리하는 단계를 포함할 것이다. 예를 들어, 인간 아데닐레이트 키나아제(AK) 효소가 트립신 처리의 영향을 받기 쉽다는 점이 밝혀졌으며, 그 결과 혈액 내 백그라운드 AK 활성이 미생물 용해 이전에 제거될 수 있고, 따라서 미생물 자체의 AK 활성이 혈액 AK로부터 간섭 없이 분석 목적에 이용될 수 있다. 시료가 처음에 혈액 내 큰 초과량의 동일 활성을 함유할지라도 본 발명으로 미생물 효소 활성을 검출할 수 있음을 본 발명자가 밝혔다는 점에서 본 발명은 특히 유리하다.
따라서 본 발명은 (i) 혈액 시료 내 혈액 세포를 용해하지만, 혈액 시료 내 임의의 미생물은 용해하지 않는 시약으로 혈액 시료를 처리함으로써, 상기 혈액 세포로부터 아데닐레이트 키나아제를 방출하는 단계; (ii) 미생물 내 아데닐레이트 키나아제를 불활성화하지 않고, 혈액 시료 내 아데닐레이트 키나아제를 불활성화하기 위해 프로테아제로 이 용해물을 처리하는 단계; (iii) 미생물을 용해하여 아데닐레이트 키나아제를 방출하는 단계; 및 (iv) 미생물에 의해 방출된 아데닐레이트 키나아제를 측정하는 단계를 포함하는 혈액 시료 내 미생물의 부존재 또는 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 단계 (ii)와 (iii) 사이에, 일부 또는 모든 미생물을 배양하여 성장시킬 수 있고, 가능한 항균 처리(들)를 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 ADP, 2가 금속 양이온의 가용성 염, 루시페라아제, 루시페린, 사포닌, 소포제 및/또는 항응고제 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개) 및 프로테아제를 포함하는 키트를 제공한다. 2가 금속 양이온은 Zn++ 또는 Mg++가 바람직하다. 소포제는 폴리프로필렌 글리콜이 바람직하다. 항응고제는 폴리아네톨설포네이트가 바람직하다. 사포닌이 바람직한 성분이다. 키트는 각각 ADP, 2가 금속 양이온의 가용성 염, 루시페라아제 및 루시페린을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 용해 시약 및 프로테아제를 포함하는 반응 용기를 제공한다. 용기는 전형적으로 일회용 관이고, 일단계(one step)로 혈액 용해 및 아데닐레이트 키나아제 불활성화 과정을 수행하기 위해 혈액 시료를 수용하는 데 적합하다. 본 발명은 또한, 혈액 세포(전형적으로 용해될 것임)를 더 포함하는 반응 용기를 제공한다.
가측 효소 활성
본 발명은 관심 세포 내 가측 효소 활성의 존재에 의존한다. 그러나 효소 활성은 관심 세포에 대해 특이적이지 않으므로, 다른 근원의 이 활성으로부터 간섭받지 않을 수 있다. 그러므로, 본 발명은 세포외 배지 내 이 활성을 불활성화하고, 활성을 갖는 세포내 효소를 방출하여 비활성화 세포외 효소로부터의 간섭 없이 방출된 효소의 활성을 측정할 수 있게 한다.
불활성화 효소 및 방출된 효소는 동일한 가측 활성을 가지지만, 동일한 효소일 필요는 없다. 예컨대, 효소는 동질효소(동종효소)여서 상이한 효소 파라미터(예컨대, KM 및 kcat)를 가지더라도 동일 반응을 촉진할 수 있다. 그러나, 모든 경우에서, 효소는 분석에서 측정되어야 하는 활성을 공유하여 효소 모두의 존재는 분석의 결과를 간섭할 수 있다.
세균 세포를 검출하기 위해, 다양한 효소 활성을 이용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 세균에 대해 유일한 활성을 이용하지 않고, 동물 세포(그리고 특히 혈액 세포) 또는 식물 세포와 같은 다른 생물에서도 발견되는 활성을 이용한다. 적합한 효소 활성은 당분해 경로, 전사 등의 활성과 같이 보편적인 것을 포함한다.
젖산 탈수효소(LDH)는 다수의 신체 조직, 특히 심장, 간, 신장, 골격근, 뇌, 혈액 세포(적혈구, 백혈구 및 혈소판 포함) 및 폐에서 발견되고, 기초 세포 대사에 관여한다. 여러 LDH 동질효소가 존재하고, 이 모두는 혈청에 존재한다. LDH는 미생물 내에서도 발견된다. 따라서 혈액 시료는 혈청, 인간 세포내 및 미생물 세포내 LDH(3개의 근원)를 함유할 수 있다. 본 발명은 미생물 LDH 활성을 혈청 및 인간 세포내 LDH 활성과 구별되도록 한다. LDH는 효소와 함께 이용하기에 적당한 활성인데, 이는 혈액 내 LDH 활성에 대한 분석이 이미 표준 혈액 병리학 테스트의 일부로서 쉽게 입수 가능하기 때문이다.
참고문헌 2 내지 7은 세포 용해 후 세포내 아데닐레이트 키나아제(AK)의 방출에 기초하여 세포를 검출하는 방법을 개시한다. AK는 혈액 세포 및 미생물 뿐만아니라 혈청 내에서도 발견되지만, 그 발명은 미생물 AK 활성이 혈청 및 인간 세포내 AK 활성으로부터 유리하게 구별되도록 한다. 가열, 과도한 pH, 과도한 염 농도 또는 초음파에 의한 변성을 이용하여 불필요한 백그라운드 AK 활성을 제거하는 것에 대해서는 참고 문헌 8에 보고된 바 있다. 그러나 이들 방법은 관심 세포를 파괴하거나, 또는 상태가 정상으로 복귀하는 경우, 가역성일 수 있어, 이 경우 간섭 활성이 다시 나타나기 때문에 본 발명과 이용하기에 부적합하다.
본 발명에 이용되는 가장 바람직한 효소 활성은 AK 활성이다. AK는 EC 번호 E.C.2.7.4.3을 가지고, 또한 미오키나아제, 아데닐릭 키나아제(anenylic kinase) 및 아데닐로키나아제(anenylokinase)로서 공지되어 있다. 이는 하나의 ADP로부터의 포스페이트를 다른 하나에 이동시켜 2개의 ADP 분자로부터 ATP 및 AMP의 생성을 촉진할 수 있고, 그리고 또한 ADP 및 Pi로부터 ATP의 생성을 촉진할 수 있다. 효소는 2가 금속 양이온, 전형적으로 마그네슘 이온 또는 아연 이온을 이용한다. 그러므로 ADP의 공급원 및 Mg++/Zn++와 함께, AK는 외인성 ADP로부터 ATP를 생성할 수 있다. 이 반응은 매우 효율적이고, 단일 AK 효소는 10분 동안 ADP로부터 400,000 분자의 ATP 생성을 촉진할 수 있다. 그러므로 본 발명의 방법은 ADP 및 적합한 2가 양이온의 공급원을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 양이온의 몰 농도는 모든 ADP 분자가 하나 이상의 양이온과 결합될 수 있도록 ADP의 몰 농도와 같거나 그보다 큰 것이 바람직하다.
ATP는 루시페라아제 반응을 이용하여 편리하게 검출될 수 있다. 외부에서 첨가한 ADP로부터 ATP를 생성하는 데 AK를 이용하는 것은 루시페라아제 반응을 유도하는 데 내인성 ATP를 이용하는 것보다 100배 넘게 민감하며, 또한 세포 수와의 더 좋은 상호관련성을 보여준다. 따라서 AK와 루시페라아제의 조합은 세포 수의 정량 측정으로서 이용될 수 있다. 그러므로 본 발명의 방법은 ATP의 생성 동안 또는, 바람직하게는 ATP의 생성 이후, 루시페린 및 루시페라아제를 첨가하는 단계, 및 이후 선택적으로 시료로부터의 루시페라아제-생성 발광량을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서 AK 활성은 루시페라아제 반응을 통해 간접적으로 측정된다.
관심 세포
본 발명의 방법은 세포 유형 모두에 통상적인 효소 마커를 이용하는 경우에도 다른 세포의 백그라운드에 대하여 관심세포를 검출하도록 해준다. 본 발명은 간섭 세포를 용해하고, 용해 단계에서 방출되는 마커를 불활성화하고, 다음으로 관심 세포를 용해함으로써 이러한 감별 검출을 달성한다.
바람직한 관심 세포는 세균이고, 스타필로코시(Staphylococci), 예컨대, 스타필로코시 아우레우스(S. aureus)(그리고 더 특히 메티실린 내성 스타필로코시 아우레우스 또는 'MRSA'); 엔테로코시(Enterococci), 예컨대 엔테로코시 패슘(E. faecium) 및 엔테로코시 패칼리스(E. faecalis)(그리고 더 특히 반코마이신 내성 엔테로코시 패칼리스); 스트렙토코시(Streptococci), 예컨대, 스트렙토코시 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코시 유모니에(S. pneumoniae)(그리고 더 특히 페니실린 내성 스트렙토코시 유모니에) 및 스트렙토코시 아갈락티에(S. agalactiae); 대장균군(Coliform), 예컨대 이.콜라이(E. coli), 클렙시엘라(Klebsiella) 종(예컨대, 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca)), 프로테우스(Proteus) 종(예컨대, 프로테우스 불가리스(P. vulgaris)) 및 엔테로박터(Enterobacter) 종(예컨대, 엔테로박터 클로아케(E. cloacae)); 장관계 생물, 예컨대 살모넬라 종(예컨대, 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis)), 시겔라(Shigella) 종 및 캄필로박터(Campylobacter) 종; 나이세리아(Neisseria) 종, 예컨대, 나이세리아 메닌기티스(N. meningitidis), 나이세리아 고노로에(N. gonorrhoeae); 아시네토박터(Acinetobacter) 종, 예컨대, 아시네토박터 바우마니(A. baumanii); 세라티아(Serratia), 예컨대, 세라티아 마르세센스(S. marcescens); 슈도노마스(Pseudomonas), 예컨대, 슈도노마스 에루지노사(P. aeruginosa); 및 특이성 병원균, 예컨대, 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 클로스트리듐 보투리늄(Clostridium botulinum), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 및 보르데텔라 페르투스시스(Bordetella pertussis)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 또한 칸디다 알비칸스(C.albicans)와 같은 효모와 이용될 수 있다. 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum), 리슈마니아(Leishmania)와 같은 기생충; 나선균(spirochaetes); 주혈흡충(schistosoma) 등에도 이용될 수 있다. 이러한 열거는 모든 것을 망라한 것이 아니고, 본 발명을 이용하여 검출될 수 있는 질환 유발 미생물의 광범위한 범위를 설명하기 위해 제공되는 것이다.
액체 시료
본 발명은 관심의 표지를 공유하는 관심 세포를 함유할 수 있는 다양한 액체 시료, 예컨대, 혈액 시료, 정액 시료, 소변 시료, 배설물, 식품 시료 등에 이용될 수 있다. 본 발명은 혈액 내 세균 세포를 검출하는 데 가장 유용하다. 따라서 본 발명의 방법에서 이용되는 액체 시료는 전형적으로 혈액 시료일 수 있다. 혈액 시료는 환자로부터 직접 채취된 상태이거나, 또는 예컨대, 헤파린화, 원심분리, 용해 등으로 처리되었을 수 있다. 혈액 시료는 수혈을 목적할 수 있다.
혈액은 혈청과 세포를 포함한다. 혈청과 세포 모두는 관심 효소 활성을 함유할 수 있다(예컨대, LDH는 혈액 세포와 혈청 모두에 존재함). 이 근원 모두는 미생물 내 이 활성의 분석을 간섭할 수 있고, 본 발명은 혈액 세포를 용해하여 혈액-결합 마커를 방출함으로써 동시에 두 근원을 제거할 수 있다. 따라서 임의의 미생물은 손상되지 않게 하고, 혈액 세포를 용해하는 본 발명의 방법에 의한 분석을 위한 전형적인 액체 시료는 혈액 시료일 것이다. 따라서 이 시료는 (i) 혈청 및 혈액 세포 용해물을 포함하는 세포외 배지, 및 (ii) 원 시료에 존재하였던 임의의 미생물을 포함한다.
시료 내 미생물 세포는 손상되지 않게 하고, 혈액 세포(적혈구, 백혈구 및 혈소판 포함)를 우선적으로 용해하는 방법은 본 기술 분야, 특히 임상 미생물학적 분석 시스템 및 기생체 혈액 감염 진단 분야에는 널리 공지되어 있고, 사포닌 용해, RB 완충물의 이용 및 계면활성제 및 삼투압 충격의 이용과 같은 방법을 포함한다. OxoidTM 유래의 IsolatorTM 시스템은 세균을 손상함 없이 혈액 내 백혈구와 적혈구를 용해하는 시약을 이용하고, 정제된 사포닌의 이용을 기초로 한다. 또한 사포닌의 발포 경향을 차단하기 위해 폴리프로필렌 글리콜이 이용되고, 나트륨 폴리아네톨설포네이트는 (i) 항응고제로서 (ii) 혈액의 살균 성질을 중화시키기 위해, 그리고 (iii) 식세포작용을 억제하도록 작용한다. RB 완충물은 본 기술 분야에 널리 공지되어 있고(예컨대, 40 mM MOPS, 10 mM 나트륨 아세테이트, 1 mM EDTA, pH 7.0; 또는 0.5mM MgCl2, 1 mM EGTA 및 0.1 M MES-KOH, pH 6.8), Cambio(영국, 캠브리지) 및 Microzone(영국, 헤이워즈 히스)에 의해 시판되는 '감염된 혈액용 마이크로라이시스(microLYSISTM)'에서 이용된다. 백혈구가 용해될 필요가 없다면, RB 완충물은 TE 완충물로 대체될 수 있다. 혈액 세포는 사포닌을 이용하여 용해하는 것이 바람직하다. 혈소판은 예를 들어, TritonTM X-1OO 및/또는 M-Per와 같은 비이온성 계면활성제를 이용하여 용해하는 것이 바람직하다.
감별 용해 방법의 추가 예는 참고 문헌 9에서 개시된 방법을 이용하는 적혈구 및 백혈구의 감별 용해; 활성화된 사멸(LAK) 세포 클론의 감별적인 종양 세포의 용해[10]; 법의학 분석에서, 기타 세포, 특히 상피 세포로부터 정자를 구별하기 위한 감별 용해의 이용을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
효소의 불활성화
본 발명의 방법은 효소 활성을 불활성화하는 시약으로 액체 시료를 처리하는 단계를 포함한다. 그러나, 불활성화 방법은 액체 시료 내에도 존재하는 관심 세포 내 가측 활성을 불활성화하지는 않는다. 따라서 관심 세포 내 활성은 방법의 후 단계에서 측정할 수 있다.
열 변성과 같은 방법[8]은 관심 세포내 활성도 파괴할 것이기 때문에 세포내 활성의 불활성화 없이 세포외 활성의 선택적 불활성화를 위해 일반적으로 이용되지 않을 것이다. 차라리 화학적 또는 물리적 방법을 이용할 것이고, 전형적인 불활성화 방법은 세포외 물질에 작용할 수 있으나 손상되지 않은 세포로 들어갈 수 없는 시약을 이용할 것이다. 따라서 선택성은 시약이 관심 세포 막에 불투과성을 갖는지에 따라 결정된다.
불활성화는 바람직하게는 비가역성이다. 따라서 억제제, 경미한 화학 변성제 등으로의 처리는 바람직하게 않다.
효소 활성을 불활성화하는 시약은 관심 세포를 사멸시키거나 또는 사멸시키지 않을 수 있다. 혈액으로부터 추출된 미생물이 후속적으로 성장될 경우의 테스트를 위해(예컨대, 항균제 감수성 검사용), 비살상 불활성화 시약이 이용되어야 한다.
시약의 한 종류는 산과 염기이다. 산의 첨가는 세포외 AK를 불활성화하는 것으로 발견되었다. 그러나, pH는 관심 세포내 가측 효소도 변성될 정도로(또는, 불활성화 후 관심 세포의 생존을 요구하는 경우, 세포가 죽을 정도로) 너무 심하게 감소되거나 또는 증가하지 않아야 한다. 불활성화 후, 그리고 관심 세포의 용해 이전 또는 이 동안, pH는 방출된 효소의 불활성화를 피하기 위해 조절되어야 한다.
바람직한 비가역성 처리는 단백질 가수분해 효소의 이용을 포함한다. 적합한 프로테아제는 트립신, 키모트립신, 브로멜라인, 엘라스타제, 파파인, 펩신, 레닌, 플라스미노겐, 서브틸리신, 트롬빈, 판크레아틴, 카텝신, 피신, 프로테나아제 K 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 광범위하고 싸게 입수 가능하기 때문에, 트립신, 파파인, 키모트립신, 프로테나아제 K, 펩신 및 레닌과 같은 프로테아제가 바람직하다. 정선한 마커 효소를 불활성화하기 위한 특정한 프로테아제의 능력은 통상적인 생화학 분석법에 의해 결정될 수 있고, 그리고/또는, 서열 정보가 입수 가능한 경우는 표적의 아미노산 서열 및 프로테아제의 인식 서열에 기초하여 예상될 수 있다. 특정한 프로테아제가 특정한 환경에서 효과적이지 않는 경우(예컨대, 참고 문헌 11 & 12 참조), 대안적인 프로테아제를 쉽게 발견할 수 있다. 특이적 성질을 갖는 프로테아제를 또한 특이적 환경에 대해 선택할 수 있고, 예컨대, 내열성인 프로테아제, 매우 낮거나 높은 pH 최적 조건을 갖는 프로테아제, 특정 화합물의 존재를 허용할 수 있는 등의 프로테아제 등을 선택할 수 있다.
발명자는 혈청 AK 및 혈액 세포로부터 방출된 AK의 불활성화가 트립신을 이용함으로써 미생물의 사멸 또는 이의 AK의 불활성화 없이 편리하게 달성될 수 있음을 발견하였다. 종래에 생화학 연구를 위해 AK를 소화(따라서 불활성화)시키는 데 트립신을 이용하여 왔지만(예컨대, 참고 문헌 13), 세포외 AK의 선택적 불활성화를 위한 이의 용도는 보고되어 있지 않았다. 예상과 다르게, 트립신이 혈인성 세균을 손상시키지 않는 것(이는 심지어 처리 후에도 성장 능력을 유지함)을 발견하였고, 이 회복력은 최소 성장 배지에서 세균을 유지하지 못한다는 점에 기인한 것으로 여겨진다. 또한, 트립신이 세균 내에 위치하는 AK를 불활성화하지 않는 것을 발견하였다. 더 나아가, 트립신은 다운스트림 AK 분석을 현저히 간섭하지 않고, 따라서 미생물 용해 후 AK/루시페라아제 분석을 곧 진행하지 않는 한, 제거될 필요가 없다. AK/루시페라아제 분석은 5-10분 이내에 완벽한 결과를 제공할 정도로 신속하고, 이 시간 척도에 따른 미생물 AK에 대한 트립신의 효과는 무시해도 좋다. 비록 그렇다 하더라도, 미생물 AK에 대한 트립신의 효과는 유리하게는 (a) 트립신 억제제의 첨가 및/또는 (b) 트립신의 최적 조건에는 벗어나지만 AK/루시페라아제 최적 조건에 맞춰지는 pH 및/또는 온도의 변화 및/또는 (c) 용해 시약 내에 트립신을 불활성화하는 화학 물질을 포함함으로써 더 최소화시킬 수 있다.
프로테아제의 pH 최적 조건은 용해 후 측정되는 효소의 pH 최적 조건과 동일하거나, 유사하거나(예컨대, 효소의 pH 최적 조건과 pH 2 단위 이내) 또는 상이(예컨대, 효소의 pH 최적 조건과 pH 2 단위 이상이 벗어남)할 수 있다. 상이한 pH 최적 조건을 갖는 프로테아제(예컨대, AK/루시페라아제 반응을 이용하는 경우, 5.5 미만 또는 10 초과의 pH 최적 조건을 갖는 효소)를 선택함으로써, 그리고 pH를 가측 효소의 최적 조건에 맞게 조절함으로써(예컨대, 관심 세포의 용해 이전 또는 이동안), 프로테아제가 세포로부터 방출된 효소를 불활성화할 수 있는 위험을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서 펩신(2-4 범위의 pH 최적 조건)과 같은 효소의 이용은 AK와 같은 효소를 불활성화하는 데 이용될 수 있고, 다음으로 pH는 AK 분석에 적합하도록 조절될 수 있고(예컨대, 약 7.5), 세포는 용해되어 펩신(펩신은 활성을 가지는 않음)의 존재 하에서 이의 AK를 방출할 수 있다.
프로테아제로의 불활성화는 프로테아제와 시료의 단순 혼합 후 단백질 소화를 진행하도록 하는 배양을 일반적으로 포함할 것이다. 배양 조건은 프로테아제의 선호성(예컨대, pH, 온도, 이온, 완충물 등)을 만족시키기 위해 선택될 것이지만, 이들 조건은 세포내 효소가 비가역적으로 불활성화되거나 또는 다운스트림 단계가 달리 요구되지 않는다면 관심 세포가 사멸될 정도로 너무 과하게 변경되지 않아야 하고, 예를 들어, 특정 프로테아제는 55℃의 온도 최적 조건을 가질 수 있지만, 관심 세포는 이 온도를 견디지 못할 수 있고, 따라서 타협점으로서 더 낮은 온도를 이용하여야 한다. 그러므로 프로테아제 소화의 이전 또는 동안, 본 발명의 방법은 온도 조절 및/또는 pH 조절을 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 온도 및/또는 pH는 또한 프로테아제 소화의 종료 시에 조절될 수 있고, 그리고/또는 추가적인 단백질 소화를 예방하기 위해 프로테아제 억제제가 첨가될 수 있다. 프로테아제의 억제제는 널리 공지되어 있고, 예컨대, BPTI 등으로부터 즉시 입수 가능하다.
불활성화를 위해 이용되는 프로테아제의 농도는 다양한 변수들(소화되는 효소의 농도, 불활성화를 위해 이용 가능한 시간, 다운스트림 분석법에 요구되는 시간(프로테아제가 여전히 존재할 수 있는 동안) 등을 포함)에 좌우될 것이다. 이러한 변수들은 어려움 없이 선택되고 최적화할 수 있다. 최대 12시간 동안의 소화가 전형적이고, 예컨대, 최대 6시간, 최대 4시간 등일 수 있다.
항균제 감수성 검사
본 발명의 방법은 환자 시료로부터 추출된 미생물에 대한 항균제 감수성 검사(AST)[14 내지 16]에 매우 적합하다.
한 구체예에서, 관심 세포를 추출하고, 이 추출한 세포를 AST 테스트에 이용한다. 다른 구체예에서, 환자 시료를 세포의 복합 추출물과 배양한다. 이들 두 구체예 모두에서, 시간에 따른 가측 활성의 증가는 감염의 존재를 나타내는, 미생물 성장이 증가함을 의미한다. 첫 번째 구체예가 바람직하다.
첫 번째 구체예에서, 본 발명은 액체 시료 내 관심 세포의 부존재 또는 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 여기서
(a) 상기 시료는 (i) 가측 활성을 갖는 효소를 함유하는 세포외 배지를 포함하고, 그리고 (ii) 상기 가측 활성을 갖는 세포내 효소를 함유하는 관심 세포를 함유할 것으로 추정되고,
(b) 상기 방법은 (i) 상기 관심 세포에서 가측 활성을 불활성화하지 않지만, 세포외 배지에서 상기 가측 활성을 불활성화하는 시약으로 액체 시료를 처리하는 단계, (ii) 단계 (i) 후 남아 있는 관심 세포의 배양물을 확인하는 단계, 및 (iii) 상기 배양물로부터 1 이상의 시료를 취하는 단계를 포함한다.
(b)의 단계 (iii)에서 취한 각 시료에 대해 본 명세서에서 기술한 바와 같이 관심 세포(예컨대, 세균)를 용해하여 세포내 효소(예컨대, AK)를 방출하고, 다음으로 상기 가측 활성을 측정할 수 있다. 단계 (iii)에서 취한 시료를 AST 분석을 위해 항균제로 처리할 수 있다. 시료를 상이한 시간에서 테스트하는 경우, 시간에 따른 활성의 증가는 세포의 성장을 나타낸다. 또한(또는 대안적으로) 단계 (iii)에서 취한 시료를 존재하는 미생물(임의의 미생물이 존재한다면)을 식별하기 위한 과정으로 처리할 수 있다.
두 번째 구체예에서, 미생물을 성장하게 하는 조건 하에서 환자 시료를 배양하고, 부시료(sub-sample)를 n개의 상이한 시간에서 제거할 수 있다(n은 2 이상의 정수, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임). 각각의 부시료를 불활성화, 용해 및 측정 처리할 수 있다. 따라서 본 발명은 액체 시료 내 관심 세포의 부존재 또는 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 여기서
(a) 상기 시료는 (i) 가측 활성을 갖는 효소를 함유하는 세포외 배지를 포함하고, 그리고 (ii) 상기 가측 활성을 갖는 효소를 함유하는 관심 세포를 함유할 것으로 추정되고,
(b) 상기 방법은 (i) 미생물이 성장되도록 하는 조건 하에서 시료를 배양하는 단계, (ii) 제1 시점에서 시료로부터 제1 부시료를 취하는 단계, (iii) 상기 관심 세포 내 가측 활성을 불활성화하지 않지만, 이의 세포외 배지 내 상기 가측 활성을 불활성화하는 시약으로 제1 부시료를 처리하는 단계; (iv) 상기 관심 세포를 용해하여 세포내 효소를 방출하는 단계; (v) 상기 가측 활성을 측정하는 단계; (vi) 제2 시점에서 제2 부시료를 취하는 단계; (vii) 상기 관심 세포 내 가측 활성을 불활성화하지 않지만, 이의 세포외 배지 내 상기 가측 활성을 불활성화하는 시약으로 제2 부시료를 처리하는 단계; (viii) 상기 관심 세포를 용해하여 세포내 효소를 방출하는 단계; 및 (ix) 상기 가측 활성을 측정하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 제1 시점과 상기 제2 시점 사이에서의 가측 활성의 증가는 상기 시점들 사이에서 상기 관심 세포의 성장을 나타낸다.
이들 방법은 동종의 시료(이중 하나는 항균제로 처리함)에 대해 본 방법을 수행함으로써 항균제 감수성 검사에 이용될 수 있다. 시료에서 정상 성장을 나타내는 비처리 시료가 대조군으로서 제공되고, 항균제로 처리한 시료에서의 미생물 성장을 대조군 성장과 비교할 수 있고, 더 낮은 성장률(비성장 또는 심지어 성장 감소 포함)은 미생물이 항균제에 감수성이 있다는 것을 나타내고, 이에 따라 환자에 대한 치료 결정을 할 수 있다. 이 과정은 도 1에 설명되어 있고, 한 패널의 항균제들에 대해 동시에 수행될 수 있다.
시간에 따라 미생물 수가 상승, 하락 또는 일정하게 유지되는지 여부를 결정하기 위해, 정량 기술을 이용하는 것이 바람직하다. AK/루시페라아제 분석이 이 요건을 만족시킨다.
본 발명을 유사하게는 사멸 곡선(주어진 농도에 대한 시간에 따른 항균제의 효과)을 생성하는 데 이용할 수 있다.
항균제가 다양한 농도에서 테스트된다면, 본 발명을 이용하여 항균제에 대한 최소 억제 농도(MIC) 값(즉, 주어진 미생물의 성장을 억제할 수 있는 특정한 항균제의 최소 농도) 또는 최소 세균 농도(MBC) 값(즉, 주어진 미생물을 사멸시킬 수 있는 최소 농도)을 식별할 수 있다
본 발명에 따라서, 복수(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상)의 항균제를 테스트할 수 있다. 더 나아가, 바람직하게는 각 항균제에 대해 복수(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상)의 농도, 더 바람직하게는 4 내지 8개의 농도(예컨대, 6개)를 테스트할 수 있다. 0.05 내지 150 mg/㎖의 범위, 더 바람직하게는 0.125 내지 16 mg/l의 범위, 또는 심지어 최대 128 mg/㎖의 농도를 테스트하는 것이 바람직하다. 범위는 항균제에 대한 공지된 중지점까지 연결되는 것이 바람직하다.
일반적으로, 단일 AST, MIC 또는 MBC 테스트를 위해, 본 발명의 방법은 항균제를 기결정된 농도로 시료에 첨가하는 단계, 항균제의 존재 하에서 기결정된 기간(예컨대, 항균제의 부존재 하에서 ≥2 로그의 성장을 허용하는 기간) 동안 시료를 배양하는 단계, 및 상기 기간의 종료 시에 시료 내 미생물 수를 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
완전한 AST 테스트의 경우, 본 발명의 방법은 복수의 상이한 항균제를 기결정된 농도로 복수의 상이한 부시료에 첨가하는 단계, 항균제의 존재 하에서 기결정된 기간 동안 부시료를 배양하는 단계, 및 상기 기간의 종료 시에 부시료 내 미생물 수를 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
완전한 MIC 또는 MBC 테스트의 경우, 본 발명의 방법은 항균제를 복수의 기결정된 농도로 복수의 상이한 부시료에 첨가하는 단계, 항균제의 존재 하에서 기결정된 기간 동안 부시료를 배양하는 단계, 및 상기 기간의 종료 시에 부시료 내 미생물 수를 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
사멸 곡선 테스트의 경우, 본 발명의 방법은 항균제를 기결정된 농도로 부시료에 첨가하는 단계, 항균제의 존재 하에서 기결정된 기간 동안 부시료를 배양하는 단계, 및 상기 기간 이내의 복수의 시점에서 부시료 내 미생물 수를 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
테스트는 시간 0에서 부시료 내 미생물 수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 첫 번째 구체예에서, 이는 배양물의 확인 이전, 동안 또는 후에 일어날 수 있다.
본 발명의 방법은 항생제 테스트 단계의 결과를 이용하여 환자 시료 내 주어진 미생물에 대한 MIC 및/또는 MBC 값을 계산하는 단계를 더 포함할 수 있다. MIC 값은 실제(true) MIC, 단축(abridged) MIC, 또는 계산 MIC으로서 존재할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, 항균제 테스트는 전형적으로 항균제의 부존재 하에서 미생물을 배양하는 대조군 분석을 동반할 것이다. 또한, 본 발명의 과정은 대조군 테스트를 포함할 것이다. 전형적인 음성 대조군이 기초 배양 배지 등에 대한 방법 등을 수행하기 위해 존재할 수 있다.
일반적으로, 특정 시간에 취해진 시료 내 미생물 수의 평가는 즉시 수행되지 않을 것이다. 따라서 전형적인 과정은 평가가 이루어지는 한 부시료 내에서 추가 성장의 억제를 요구할 것이다. 추가 성장은 아자이드와 같은 "정지액"의 첨가, 냉각 또는 급속 동결, 용해 등에 의해 억제될 수 있다.
배양 단계는 바람직하게는 기결정된 온도, 예컨대, 37±2℃에서 이루어질 수 있다. 필요하다면, 더 높은 온도를 이용할 수 있고, 예컨대, 이.콜라이의 배가 시간은 37℃에서 20분인 것과 비교하여 41℃에서는 7분이고, 따라서 더 높은 온도는 분석을 가속화할 수 있다. 또한 더 높은 온도는 몇몇의 느린 성장 미생물을 위해 유용하다. 상이한 미생물들의 온도 선호도는 미생물학 분야에 널리 공지되어 있고,이에 따라 본 발명에서 이용되는 온도는 변경될 수 있다.
용어 "항균제"는 미생물을 사멸시키거나 또는 성장을 억제할 수 있는 임의의 물질(전형적으로 유기 화합물)을 지칭한다. 이 용어는 천연 및 합성 화합물을 포함한다. 이는 항생제, 항진균제 및 항바이러스제를 이의 범위 내 포함하고, 항생제가 항균제의 바람직한 서브셋(subset)이다. 테스트될 수 있는 항균제의 종류는 베타-락탐, 아미노글리코사이드, 플루오로퀴놀론, 설폰아마이드, 글리코펩타이드, 카바페넴, 아졸, 옥사졸리디논, 마크롤라이드, 퀴놀론, 테트라시클린 등을 포함한다. 본 발명과 이용되기 위한 전형적인 항균제는 페니실린, 아목시실린, 시프로플록사신, 세팔로틴, 암피실린, 오그멘틴, 리네졸리드, 젠타마이신, 플루클루사실린, 반코마이신, 클로람페니콜, 테트라시클린, 미노시클린, 설포아마이드, 옥사졸리디논, 플루코나졸, 나이트로퓨란토인, 트라이메토프림, 날리딕스산, 암포테리신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 비다라빈, 아시클로비어, 간시클로비어, AZT(지도부딘), 3TC(라미부딘) 등이다.
또한 본 발명을 이용하여 2 이상의 항균제의 혼합물의 효과를 테스트할 수 있다. 테스트 조합물은 특정한 추출된 미생물에 관하여 항균제들 사이의 양성 또는 음성 시너지를 확인할 수 있다.
상이한 항균제는 전형적으로 상이한 활성 프로파일을 가지고, 예컨대, 이들은 느린 또는 빠른 작용성일 수 있다. 그러므로 각각의 항균제 테스트는 상이할 수 있다. 그러나, 본 발명이 공지된 항균제의 이용을 포함하기 때문에, 본 발명은 임의의 특정한 항균제의 프로파일에 따라 적합화될 수 있다.
특정한 유형의 미생물에 대해 특이적인 항균제(예컨대, 그램 음성 세균에 특이적이거나, 특정한 생물, 예컨대 리소스타핀에 특이적인 리신 또는 파지)를 이용한다면, 후-불활성화 용해가 단계적으로, 예컨대, 제1 서브셋의 관심 세포가 용해 및 분석되는 제1 단계, 및 제2 서브셋의 관심 세포가 용해 및 분석되는 제2 단계 등으로 이루어질 수 있다. 따라서 초기 용해 및 불활성화 후 남아있는 상이한 세포 유형을 특이적 용해에 의존하여 다시 구별할 수 있다.
추가 방법 단계
본 발명의 방법은 액체 시료를 처리하여 가측 활성을 불활성화하는 단계, 관심 세포를 용해하여 세포내 효소를 방출하는 단계 및 방출된 활성을 측정하는 단계를 포함할 뿐만 아니라 추가 단계를 포함할 수 있다.
전술한 바로서, 관심 세포를 용해하기 전에 이들을 배양하여 세포 수를 증가시킬 수 있다. 상이한 미생물은 전형적으로 상이한 최적 성장 조건(배지, 호기성/혐기성, 온도 등)을 가진다. 예를 들어, 스트렙토코시는 Todd-Hewitt 배지에서 잘 성장하지만, 스트렙토코시 아우레우스는 펩톤을 선호한다. 따라서 본 발명은 다수의 상이한 조건을 이용할 수 있고, 그러나 간단하게는, '일반' 배지, 예컨대, BHI(뇌 심장 주입액)을 이용함으로써 타협하는 것이 바람직하다. 성장 배지의 선택은 분석되는 미생물의 선택에 최종적으로 좌우될 것이고, 이러한 선택은 당업자에게 친숙하다. 성장 배지의 선택은 지리적 위치에 좌우될 것이고, 예컨대, 유럽 및 미국은 상이한 표준 방법론을 가진다.
본 발명의 방법은 AST 이전에 예컨대, 시료 내 미생물의 유형을 결정하기 위한 미생물 식별 단계를 포함할 수 있다. 이 식별은 표현형(예컨대, 형태, 성장 특성 등)을 기초로 할 수 있지만, 현재 미생물을 핵산 서열을 기초로 식별하도록 하는 유전자형 기초 기술(예컨대, PCR의 이용이 광범위하게 기술되어 있음(예컨대, 참고 문헌 18 내지 23))도 이용 가능하고[17], 그리고 이 기술들은 신속하고, 고감도이며, 특이적이다.
관심 세포를 용해하는 단계 이전에, 본 발명의 방법은 가측 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서 예컨대, 시료 내 혈액 세포의 수 또한 결정될 수 있다.
용해 후, 분석을 위해 핵산을 고체 지지체 상에 캡쳐할 수 있다. 고체 지지체는 초기 분리를 위해 이용되는 입자일 수 있거나, 또는 개별 지지체일 수 있다. 핵산은 DNA, RNA 또는 이의 임의의 자연 발생 또는 합성 변형체 및 이의 조합물일 수 있다. 그러나, 바람직하게는 핵산은 단일 또는 이중 가닥 또는 임의의 다른 형태, 예컨대, 선형 또는 원형일 수 있는 DNA일 것이다. DNA로부터 RNA를 제거하고자 한다면, RNA분해효소 또는 NaOH와 같은 알칼리를 첨가함으로써 이를 달성할 수 있다.
본 발명은 또한 시료에 대해 본 발명의 방법을 수행하는 단계를 포함하는, 병원균의 존재에 대해 혈액 시료(예컨대, 수혈을 목적으로 하는 것)를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명이 음성 결과를 제공한다면(즉, 관심 세포가 존재하지 않음), 혈액 시료가 수혈을 위해 정화될 것이고, 본 발명이 양성 결과를 제공한다면(즉, 관심 세포가 존재함), 혈액 시료는 수혈을 거부당할 수 있다. 임의의 병원균의 존재는 시료가 거부되어야 한다는 것을 의미하기 때문에, 스크리닝에서 존재하는 특이적인 병원균을 식별하는 것은 중요하지 않을 수 있다.
부분 방법
본 발명의 방법이 불활성화, 용해 및 측정의 3개의 기본 단계를 포함하는 경우, 이들은 상이한 시간 및 장소에서 이루어질 수 있다. 예컨대, 혈액 시료는 현장 또는 병원에서 의사에 의해 취해지고 불활성화될 수 있다. 다음으로 미생물의 성장 및 측정은 임의의 실험실에서 수행될 수 있다.
따라서 본 발명은 액체 시료 내 관심 세포의 부존재 또는 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 여기서
(a) 상기 시료는 (i) 상기 관심 세포 내 가측 활성은 불활성화하지 않지만, 세포외 배지 내 가측 활성을 불활성화하는 시약으로 처리한 액체 시료를 포함하고, 그리고 (ii) 상기 가측 활성을 갖는 세포내 효소를 함유하는 관심 세포를 함유할 것으로 추정되고,
(b) 상기 방법은 (i) 상기 관심 세포를 용해하여 세포내 효소를 방출하는 단계, 및 (ii) 상기 가측 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
유사하게, 본 발명은 액체 시료를 처리하는 방법을 제공하고, 여기서
(a) 상기 시료는 (i) 가측 활성을 갖는 효소를 함유하는 세포외 배지를 포함하고, 그리고 (ii) 상기 가측 활성을 갖는 세포내 효소를 함유하는 관심 세포를 함유할 것으로 추정되고,
(b) 상기 방법은 (i) 상기 관심 세포 내 가측 활성은 불활성화하지 않지만, 세포외 배지 내 상기 가측 활성을 불활성화하는 시약으로 액체 시료를 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 유사 부분 방법은 명백할 것이다.
일반론
용어 "포함하는"은 "비롯한" 뿐만 아니라 "이루어지는"을 내포하고, 예컨대, X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수 있거나, 또는 임의의 것이 첨가된, 예컨대, X + Y일 수 있다.
단어 "실질적으로"는 "완전하게"를 제외하는 것이 아니고, 예컨대, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전하게 없을 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 값 x와 관련하여 용어 "약"은 예를 들어, x±10%을 의미한다.
특별하게 기술하지 않았다면, 2 이상이 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 과정은 혼합의 임의의 특정한 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 성분은 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 3개의 성분이 존재하는 경우, 2개의 성분이 서로 조합될 수 있고, 다음으로 조합물이 3번째 성분과 조합될 수 있다.
"세포내"로서 기술되는 효소의 경우, 이 용어는 일반적으로 세포외에 위치하는 불활성화 시약에 의한 불활성화 동안 효소가 영향받지 않는 점에서, "세포외"가 아님을 의미하는 데 이용된다. 세포내 효소는 세포의 외막의 내부 면 위, 외막의 외부 표면 위(예컨대, 생물의 캡슐에 의해 불활성화 동안 보호됨), 내부 막 내, 주변 세포질(periplasm) 내, 세포소기관 내 등을 비롯하여, 세포 내에서 다양하게 위치할 수 있다.
본 발명을 수행하기 위한 양식
실험 연구는 아데닐레이트 키나아제 생성 ATP를 이용하여 루시페린/루시페라아제 활성을 유도하였고, 이는 초기 ATP 수준의 정량 측정으로서 RLU의 결과를 제공한다. 모든 AK 분석법은 pH 7.5 및 37℃에서 수행하였다. 분석의 결과를 상온에서 읽었다.
예비 실험에서, pH를 감소시킴으로써 아데닐레이트 키나아제 불활성화를 수행하였다. 이후 실험에서, 불활성화는 pH 7.5에서 돼지의 트립신을 이용하였다. pH 감소는 세포 내 세균 AK에 영향을 미침 없이 영구적으로 혈액 AK를 불활성화하지만, 트립신이 이용이 더 효과적이고, 취급이 덜 힘들다.
따라서, 본 분석법에서 이용되는 현재 프로토콜은 다음과 같다:
사포닌/sps/ppg 1 ㎖를 전혈 10 ㎖에 첨가하는 단계- 충분히 용해되도록 함(10-15분).
45분 동안 5,000rpm로 원심분리하는 단계.
상청액을 제거하는 단계.
10 x 농도의 트립신(10,000 U/㎖) 스톡을 적절한 배지(예컨대, MH 배양액이 일반적으로 이용됨)에서 제조하는 단계.
30-40 ㎖ MH에서 펠렛을 재현탁하는 단계(필요하다면, 높은 백그라운드 시료의 경우 두 번째 원심분리/재현탁("세척" 단계)이 여기에 포함될 수 있음).
트립신 스톡을 최종 재현탁 시료에 1/10 희석 비율로 첨가하는 단계(1,000 U/㎖의 최종 농도를 제공).
필요한 배양 단계의 지속 기간 동안 37℃에서 배양하는 단계 - 전형적으로 4-5시간이지만, 세균 성장 속도에 좌우됨.
AK 활성에 대한 분석(이하 참조).
AK 를 불활성화를 위한 pH 감소
AK 활성에 대한 pH의 영향을 평가하기 위해, 정제된 효소를 다양한 pH에서 1시간 동안 배양하였고, 대조군은 pH 7.5(정상 분석 조건)로 하여 배양하였다. AK 활성은 생물 발광제 루시페린/루시페라아제를 이용함으로써 측정하여 AK 생성 ATP를 검출하였다. 결과는 다음과 같았다(도 16):
배양 pH 3 4 5 6 7.5 9 10 11 12
RLU (10 3 ) 15.7 11.1 299.0 333.5 288.2 262.4 214.5 201.2 88.6
추가 실험에서, 3개의 처리 조건을 테스트하였다: (i) 대조군, pH 변화 없이 pH 7.5로 실시; (ii) 분석 이전, 일시적 pH 하락(pH를 pH 4로 감소시켰다가 다시 pH 7.5로 되돌렸음); 및 (iii) 산성 배양(pH를 15분 동안 pH 4로 감소시켰음). 그리고 나서 AK 활성을 평가하였다. 병행 테스트에서, 이.콜라이 및 엔테로코시 패칼리스의 생존 능력에 대한 이들 pH 조건의 영향을 평가하였다. 결과는 다음과 같았다(%):
대조군 일시적 pH 하락 산성 배양
AK 단독 100 91 13
이.콜라이 100 89 83
AK 단독 100 89 8
엔테로코시 패칼리스 100 86 67
따라서 pH 4에서의 배양을 이용하여 동일한 시료 내 세균의 생존 능력을 실질적으로 손상을 초래함 없이, 그리고 이들 세포내 AK를 불활성화함 없이, 실질적으로 AK를 불활성화(예컨대, 약 10배 감소된 활성)할 수 있다. 따라서 산성 조건을 이용하여 세포내 AK의 다운스트림 분석을 훼손함 없이 세포외 AK를 불활성화할 수 있다.
트립신 대조군
예비 실험에서, 생물 발광 시스템에 대한 트립신의 영향을 평가하였다. Mueller-Hinton(MH) 배양액에서 상이한 농도로 희석한 트립신 시료를 ATP와 혼합하였다. 결과는 다음과 같았다:
시료 트립신 농도 RLU
평균

ATP 없음

 대조군(0 U/㎖) 392
5000 U/㎖ 414
1000 U/㎖ 538
200 U/㎖ 646

+ ATP

 대조군(0 U/㎖) 65,538
5000 U/㎖ 81,276
1000 U/㎖ 64,005
200 U/㎖ 68,036
따라서 5000 유닛/㎖(U/㎖)에서 신호가 상승되는 것으로 보이지만, 트립신과 관련된 백그라운드 ATP-생성 활성은 거의 없거나 존재하지 않는다. ≤ 1000 U/㎖의 트립신 수준에서, 생물 발광 반응에 대한 영향은 최소로 존재하거나 존재하지 않는다.
세포내 세균 AK 의 트립신 소화
104 및 105 cfu/㎖ 농도의 이.콜라이 및 엔테로코시 패칼리스를 1000, 200 및 0(대조군) U/㎖의 트립신을 함유하는 MH 배양액과 혼합하였다. 이를 즉시 분석하였다. 결과는 다음과 같았다:

생물

cfu


트립신 농도
200 100
평균 RLU


이.콜라이
 104
+ 트립신 7,197 12,694
대조군 8,857 14,260
105
+ 트립신 65,452 106,552
대조군 77,690 127,808


엔테로코시 패칼리스
 104
+트립신 13,310 17,369
대조군 14,675 18,107
105
+트립신 87,059 103,959
대조군 93,758 111,965
따라서, 용해된 세균으로부터 생성된 AK 신호의 대략 10-20% 만이 트립신 소화에 의한 AK 반응 동안 손실되었다.
시간에 따른 트립신에 의한 AK 감소
정제된 AK(바실러스 스테아로스모필러스(B. stearothermophilus)) 또는 사포닌-용해 혈액의 10-3 희석액을 5000, 1000, 200 및 0 (대조군) U/㎖의 MH 배양액에서 희석된 트립신(트립신/MH) 내에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 분취액을 0, 15분, 30분 및 1시간에서 분석하였다.
세균 AK의 경우, 시간에 따른 활성의 감소를 도 2에 도시한다. 용해된 혈액 세포의 경우, 시간에 따른 AK 활성의 감소를 도 3에 도시한다.
따라서, 용해된 혈액 내 AK는 트립신에 의해 급격하게 소화된다. 심지어 0 시간에서도(즉, 시료를 분취하고 분석하는 데 걸리는 시간의 길이), 트립신 농도가 높은 경우에는 신호의 큰 감소가 나타날 수 있다. 트립신이 용해된 혈액에 첨가될 때, 시간에 따라 더 낮은 편평역(plateau)에 도달하는 것으로 보이고, 이는 정제된 세균 AK에는 명백히 나타나지 않는데, 이러한 점은 혈액 내 소량의 AK는 트립신에 접근할 수 없음을 제시해 준다(예컨대, 비용해된 세포 내부에 존재함). 이 편평역은 또한 프로테아제에 의해 영향받지 않는 세포 ATP의 존재에 의한 것이다.
용해된 혈액 내 AK의 분해는 정제된 세균 AK보다 상당히 더 빠르게 발생한다. 또한, 그램 음성 세균으로부터의 AK가 그램 양성 세균으로부터의 AK보다 더 빠르게 분해됨을 발견하였다. 세균 AK가 분해되더라도, 이는 용해된 혈액으로부터의 AK 만큼 극적으로 또는 급격하게 발생하지는 않는다. 상기 주어진 결과를 결부시켜 생각할 때, 세균 AK가 용해된 세균으로부터 방출 후 10-20%만이 감소하는 경우, 이 데이터는 세균 AK가 포유류 혈액 AK보다 트립신 분해에 대해 덜 영향을 받을 수 있음을 제시하고, 이는 트립신을 이용하는 경우 세포내 세균 AK와의 간섭 없이 혈액 유래 AK를 불활성화하는 추가 장점을 제공한다. 이 효과는 정제된 AK에 대한 근원 생물의 호열성 성질과 관련될 수 있다.
상이한 미생물에 대해 시간에 따른 상이한 프로테아제에 의한 AK 감소
실험은 상기 기술한 것과 유사한 방식으로 수행되었고, 이하 기술된다.
세균 아데닐레이트 키나아제의 회수 및 테스트
1. 세균을 플레이트로부터 긁었고, 대략 20 ㎖의 배양액 만에 접종하였다. 이를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
2. 1Ox 스톡의 효소를 배양액 만에서 제조하였다:
a. 1O mg의 16,000 U/mg 트립신을 16 ㎖의 배양액에 첨가하여 10,000 U/㎖(1Ox) 스톡을 제공하였다.
b. 25 mg의 4 U/mg 파파인을 1㎖의 배양액에 첨가하여 1OO U/㎖(1Ox) 스톡을 제공하였다.
c. lO mg의 7.5 U/mg 프로테나아제 K를 3㎖의 배양액에 첨가하여 25 U/㎖(1Ox) 스톡을 제공하였다.
d. 10.5 ul의 239 U/㎖ 키모트립신을 239.5 ul의 배양액에 첨가하여 1O U/㎖ 스톡을 제공하였다.
3. 접종물을 1시간 동안 대략 14030 RCF에서 원심분리하였다.
4. 상청액을 취하여 아데닐레이트 키나아제 활성을 테스트하였고(이하 기술), 오직 배양액과 희석하였다(약 105 cpm/㎖을 제공할 것이 요구된다면).
5. 상청액에 대해 시점 0에서 아데닐레이트 키나아제 활성을 3번씩 분석하였고 평균화하였다.
6. 1.5 ㎖ 용액의 상청액을 정확한 농도의 효소를 가지도록 제조하고, 또는 대조군용으로 배양액을 준비하였다. 이를 37℃에서 배양하였다.
7. 시료를 취하여 10, 30, 60 및 120분에서 아데닐레이트 키나아제 활성을 3번씩 분석하였다.
8. 3회의 결과를 평균화하였고, 시점 0 평균으로 나눔으로써 표준화하였다.
아데닐레이트 키나아제 분석(오직 AK , 세포 없음)
1. 시료 1OO ㎕를 큐벳에 첨가하였다.
2. 시약 1(오직 AD; 용해제 없음) 50 ㎕을 첨가하고 잠깐 보르텍스하였다.
3. 5분 후, 큐벳을 루미노미터에 위치시켰다.
4. 시약 2(희석 및 루시페린/루시페라아제) 50 ㎕를 확실히 시료에 직접적으로 첨가하였다.
5. 즉시 RLU를 읽었다.
AK는 상이한 생물로부터 추출하였고, 파파인, 트립신, 키모트립신 또는 프로테나아제 K로 처리하였다. 결과를 도 19(스타필로코커스 에피더미디스(S.epidermidis), 20(스타필로코시 아우레우스), 21(이.콜라이), 22(엔테로코시 패칼리스), 23(슈도노마스 에루지노사) 및 24(MRSA)에 도시한다. 그램 양성 및 그램 음성 세균 모두와의 일관성 때문에 트립신은 여전히 선택된 프로테아제이다.
생물에 대한 트립신의 효과
트립신이 세균 성장에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, 103 cfu/㎖ 생물을 트립신/MH 시료 1000, 200 및 0(대조군) U/㎖와 혼합하였다. 이 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 배양하였고, 분취액을 0, 1, 2 및 3시간의 시점에서 분석하였다. 결과는 도 4 내지 14에 도시한다.
따라서 1000 및 200 U/㎖의 트립신은 테스트된 11 종의 경우 생물에 대해 (만약 있다면) 최소 효과를 갖는다. 스타필로코시 아우레우스에 대한 결과는 성장이 트립신에 의해 억제되는 것을 최초로 제안하지만, 이는 추가 정밀조사에서 샘플링 오차에 의해 유발된 명백한 성장 억제였음이 나타났다. 그러므로 모든 11가지 세균의 경우, 성장에 영향을 미치지 않고 세균 배양 전 과정에 걸쳐 트립신이 존재할 수 있다.
다양한 농도의 용해된 혈액 내 AK 의 트립신 소화
사포닌-용해된 혈액을 트립신/MH 1000 또는 200 U/㎖와 연속적으로 희석 및 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 배양하였고, 분취액을 0, 1, 2, 3 및 4시간의 시점에서 분석하였다.
AK 분석의 결과를 도 15에 도시한다.
혈액 및 트립신 1000 U/㎖의 10-1 희석액을 이용하여, 백그라운드를 4시간 내에 대략 1억에서 4,000 RLU로 25,000배 감소시켰다. 1000 U/㎖의 경우 광범위한 주 AK 소화는 최초 2시간 이내에 발생하는 것으로 보인다. 백그라운드의 감소는 느려져서 특정 수준의 편평역에 도달하고, 이 편평역은 출발 백그라운드 수준에 좌우되는 것으로 보인다. 이는 포유동물 일정량의 AK가 트립신에 접근하기 어렵거나 또는 트립신에 의해 영향을 받지 않거나, 또는 신호가 AK-상관성이 아님을 제시한다.
트립신을 이용하여 용해된 혈액 백그라운드에 대항하는 생물 성장의 연구
대략 102 cfu/㎖의 생물을 트립신 1000 U/㎖을 함유하는 MH에서 용해된 혈액의 10-1 희석액과 혼합하였다. 이를 4시간 동안 37℃에서 배양하였고, 분취액을 0, 1, 2, 3 및 4시간에서 분석하였다. 결과는 다음과 같았다:
미생물 배양 기간 평균 RLU


음성

 0 시간 과부하
1 시간 7,684
2 시간 3,148
3 시간 2,001
4 시간 1,572


이.콜라이

 0 시간 과부하
1 시간 9,605
2 시간 7,460
3 시간 41,121
4 시간 353,541


슈도노마스 에루지노사

 0 시간 과부하
1 시간 8,852
2 시간 3,582
3 시간 3,332
4 시간 8,123


엔테로코시 패칼리스

 0 시간 과부하
1 시간 10,099
2 시간 4,939
3 시간 15,587
4 시간 106,762
트립신 1000 U/㎖를 이용하는 농도 102 cfu/㎖의 출발 생물에 대한 이들 결과에 기초하면, 이.콜라이 및 엔테로코시 패칼리스는 초기 백그라운드 약 1억 RLU에 대항하여 2시간 이내에 가시적일 것이고, 그리고 슈도노마스 에루지노사는 4시간 이내에 가시적일 수 있다. 따라서, 높은 AK 백그라운드에도 불구하고, 고 백그라운드에 대항하여 ≤ 4시간에서 소수의 미생물이 혈액 내에서 검출될 수 있다.
혈소판의 트립신 처리의 연구
오염된 혈소판의 테스트 시료 0.5 ㎖에 5% Triton X-100 용액 40 ㎕ 및 P-Per 150 ㎕을 첨가하였고, 상온에서 온화한 진동으로 10분 동안 배양하였다. 다음으로 혼합물을 3.5분 동안 13000 rpm로 원심분리하였다.
다음으로 상청액을 제거하였고, 펠렛을 멸균수 1.5 ㎖에서 피펫팅을 반복함으로써 재현탁하였다. 다음으로 혼합물을 3.5분 동안 13000 rpm에서 원심분리하였다.
다음으로 상청액을 제거하였고, 펠렛을 1000 U/㎖ 트립신을 함유하는 LB 배양액 0.5 ㎖에서 재현탁하였고, 37℃에서 20분 동안 배양하였다.
다음으로 AK 활성을 최대 4시간 간격으로 상기 기술한 바와 같이 분석하였다.
결과(도 17 및 18)는 102-103 미생물/㎖만큼 낮은 수준에서 혈소판의 오염을 검출하는 데 이 분석을 이용할 수 있음을 보여준다.
항균제에서 전체 세균성 미생물에 대한 프로테아제의 효과
프로테아제의 존재가 항균제의 활성에 미치는 영향이 무엇인지를 알기 위해 분석(이하 기술되는 것)을 수행하였다.
세균 아데닐레이트 키나아제의 회수 및 테스트
1. 플레이트로부터 긁어낸 세균을 1 ㎖의 배양액 만에 접종하였고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
2. 항균제 배양액을 3 항균제 탭(콜리스틴, 시프로플록사신 및 옥사실린)을 200㎖의 배양액 만에 첨가함으로써 제조하였다.
3. 표적(예컨대, MRSA) 또는 내성(예컨대, 스타필로코커스 에피더미디스) 세균 균주는 대략 105 cpm/㎖까지 희석하였지만, 비표적 또는 과민한 세균 균주는 대략 106 cpm/㎖까지 희석하였다.
4. 효소 스톡을 항균제 배양액에 (상기 기술한 바와 같이) 제공하였다.
5. 1.98 ㎖의 용액을 이하와 같이 제공하였고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
효소 없음
대조군 		10 U/ ㎖
파파인 		2.5 U/ ㎖
프로테나아제 		1.0 U/ ㎖
키모트립신 		1000 U/ ㎖
트립신
항생제와 배양액( ㎖ ) 1.98 1.78 1.78 1.78 1.78
10x 효소 스톡( ㎖ ) 0 0.2 0.2 0.2 0.2
6. 세균 희석액(단계 3에서 제공)을 100배 희석하였고, 아데닐레이트 키나아제 활성에 대해 3번씩 분석하였고, 평균화하였다. 이를 시점 0 평균으로서 이용하였다.
7. 적절한 세균 희석액(단계 3에서 제공) 20 ㎕을 용액(단계 5에서 제공)에 첨가하였고, 37℃에서 배양하였다.
8. 시료를 설정된 시점에서 아데닐레이트 키나아제에 대해 3번씩 분석하였다.
9. 3회를 평균하였고, 시점 0 평균에 대해 나눔으로써 표준화하였다.
결과(도 25-30 참조)는 항균제가 프로테아제에 의해 영향을 받지 않고, 항균제 및 표적 세균, 불필요한 비표적 세균에 부분적으로 또는 전적으로 의존하여 여전히 사멸 및 용해가 가능함을 보여준다. 특히, 효소를 갖는 시료는 대조군과 비교할 때 방출되는 AK가 분해됨에 따라 일반적으로 더 낮은 RLU를 제공한다.
이의 AK의 파괴에 고도로 영향을 받는 프로테아제로 인해, 그램 음성 세균(이.콜라이 및 슈도노마스 애르지노사)에서 이는 더 두드러진다. 스타필로코커스 에피더미디스 또한 효소에 의해 상당히 영향받는 것으로 보인다. 엔테로코시 패칼리스 성장은 느리지만 효소에 의해 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 이는 내성이고, 따라서 성장하고, AK에 도달하여 RLU를 낮출 정도로 효소를 충분히 용해하지 않는다. 더 중요하게는, MRSA 성장은 효소 및 항균제에의 의해 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 따라서, 이러한 결과는 프로테아제가 항균제를 간섭하지 않는 것을 보여준다. 본 발명을 오직 예로서 기술하였지만, 본 발명의 범위 및 사상 이내에 존재하는 변경이 이루어질 수 있음을 이해하여야 할 것이다.
참고 문헌(이의 내용은 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)
[1] http://www.altcorp.com/AffinityLaboratory/introgcf.htm
[2] 국제공개출원 제94/17202호
[3] 국제공개출원 제96/02665호
[4] 문헌 [Squirrell et al. (1994) Adenylate kinase as a cell marker in bioluminescent assays. In: Campbell AK, Kricka LJ, Stanley PE (editors). Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamentals and Applied Aspects. Chichester: John Wiley and Sons, pages 486-9]
[5] 문헌 [Sanders (1994) A rapid bioluminescent technique for the detection and identification of Listeria monocytogenes in the presence of Listeria innocua. 참고 문헌 4와 동일한 권의 Pages 454-7]
[6] 국제공개출원 제00/70082호
[7] 문헌 [Blasco et al. (1998) Journal of Applied Microbiology 84:661ff]
[8] 국제공개출원 제00/46357호
[9] 국제공개출원 제99/23489호
[10] 문헌 [Bean et al. (1992) InternationalJournal of Cell Cloning 10:190-5]
[11] 문헌 [Konstantinova (1972) Dokl Akad Nauk SSSR 203:1204-6]
[12] 문헌 [Perrier et al. (1998) J Biol Chem 273:19097-101]
[13] 문헌 [Fraser et al. (1997) Biochem J 323:711-8]
[14] 문헌 [Balows (1974) Current techniques for antibiotic susceptibility testing. ISBN: 0398028869]
[15] 문헌 [Smaill (2000) Can J Gastroenterol 14:871-875]
[16] 문헌 [Baquero (1990) Eur J Clin Microbiol Infect Dis 9:492-495]
[17] 문헌 [Baselski (1996) Clin Lab Med. 16:49-60]
[18] 문헌 [Kassimi et al. (2002) J Virol Methods 101:197-206]
[19] 문헌 [Zhang & Weintraub (1998) J Clin Microbiol 36:3545-3548]
[20] 문헌 [Dowd et al. (1998) Appl Environ Microbiol 64:333-336]
[21] 문헌 [Li et al. (1996) J Clin Microbiol 34:1903-1907]
[22] 문헌 [Shetab et al. (1998) J Clin Microbiol 36:1729-1732]
[23] 문헌 [Hornes et al. (1991) J Clin Microbiol 29:2375-2379]
도 1은 항균제 감수성 검사에 대한 본 발명의 응용을 예시한다.
도 2 및 3은 트립신과의 배양 시 AK 활성의 감소를 도시한다. 도 2는 세균 AK 활성을 도시하고, 도 3은 용해된 혈액의 AK 활성을 도시한다. 도 3B는 도 3A의 하부의 확대도이다.
도 4 내지 14는 AK의 존재 하에서 세균의 성장을 도시한다. 세균은 다음과 같았다: (4) 이.콜라이(E. Coli); (5) 엔테로코시 패칼리스(E. faecalis); (6) 슈도노마스 에루지노사(P. aeruginosa); (7) 스타필로코시 아우레우스(S. aureus); (8) 클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae); (9) 엔테로박터 클로아케(E. cloacae); (10) 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca); (11) 프로테우스 불가리스(P. vulgaris); (12) 아시네토박터 바우마니(A. baumanii); (13) 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis); 및 (14) 세라티아 마르세센스(S. marcescens).
도 15는 트립신 소화에 의해 유발된 혈액 AK 활성의 감소를 도시한다.
도 2 내지 15의 Y 축은 'RLU'(상대 광 유닛) 값을 나타낸다. X 축은 분(도 2 & 3) 또는 시(도 4∼15)의 시간을 나타낸다.
도 16은 AK 활성에 대한 pH의 효과를 도시한다.
도 17은 트립신 소화에 의해 유발된 혈소판 AK 활성의 감소 및 시간에 따른 AK 활성의 변화를 도시한다. 약간 어두운 부분이 혈소판이고, 진한 어두운 부분이 혈소판 + 트립신이다.
도 18은 시간에 따른 트립신 소화 및 원심분리의 상이한 지속 시간에 의해 유발된 혈소판 AK 활성의 감소를 도시한다. 1 = 1분 원심분리와 용해, 트립신 없음; 2 = 3분 원심분리와 용해, 트립신 없음; 3 = 용해 1분, 트립신; 및 4 = 용해 3 분, 트립신.
도 19 내지 24는 상이한 프로테아제로 배양된 상이한 세균으로부터 추출된 아데닐레이트 키나아제를 도시한다. 세균은 다음과 같았다: (19) 스타필로코커스 에피더미디스(AC086), (20) 스타필로코시 아우레우스(AC082), (21) 이.콜라이(AC024), (22) 엔테로코시 패칼리스(AC012), (23) 슈도노마스 에루지노사(AC044) 및 (24) MRSA(AC145).
도 25 내지 30은 콜리스틴, 시프로플록사신 및 옥사실린의 존재 하에서 배양된 세균에 대한 상이한 프로테아제의 효과를 도시한다. 세균은 다음과 같았다: (25) 스타필로코시 아우레우스(AC082), (26) 스타필로코커스 에피더미디스(AC086), (27) MRSA(AC 145), (28) 이.콜라이(AC024), (29) 슈도노마스 에루지노사(AC044) 및 (30) 엔테로코시 패칼리스(AC012).
도 19 내지 30의 Y 축은 t=0에 대해 표준화된 'RLU'(상대 광 유닛) 값을 도시한다. 표준화는 각 시점에 대한 평균값을 t=0에서 평균값으로 나눔으로써 수행된다. X 축은 시간(분)을 나타낸다.

Claims (11)

  1. 액체 시료 내 관심 세포의 존재 또는 부존재를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 시료는 (i) 가측 아데닐레이트 키나아제 활성을 포함하는 세포외 배지를 포함하고, 그리고 (ii) 세포내 가측 아데닐레이트 키나아제 활성을 함유하는 관심 세포를 함유할 것으로 추정되고,
    (b) 상기 방법은 (i) 트립신으로 액체 시료를 처리하는 단계, (ii) 상기 관심 세포를 용해하여 세포내 아데닐레이트 키나아제를 방출하는 단계, 및 (iii) 상기 아데닐레이트 키나아제 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것인 검출 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
KR1020077028198A 2005-05-03 2006-05-03 세포내 효소의 방출 전 세포외 효소를 불활성화함으로써시료 내 세포를 구별하는 방법 KR101315007B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0508981.8A GB0508981D0 (en) 2005-05-03 2005-05-03 Distinguishing cells in a sample
GB0508981.8 2005-05-03
PCT/GB2006/001618 WO2006117557A2 (en) 2005-05-03 2006-05-03 Distinguishing cells in a sample by inactivating extracellular enzyme before releasing intracellular enzyme

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080056112A KR20080056112A (ko) 2008-06-20
KR101315007B1 true KR101315007B1 (ko) 2013-10-04

Family

ID=34674235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077028198A KR101315007B1 (ko) 2005-05-03 2006-05-03 세포내 효소의 방출 전 세포외 효소를 불활성화함으로써시료 내 세포를 구별하는 방법

Country Status (12)

Country Link
US (2) US8349583B2 (ko)
EP (1) EP1877571B1 (ko)
JP (2) JP5475278B2 (ko)
KR (1) KR101315007B1 (ko)
CN (1) CN101198705B (ko)
AU (1) AU2006242988A1 (ko)
BR (1) BRPI0611655A2 (ko)
CA (1) CA2607058A1 (ko)
GB (1) GB0508981D0 (ko)
MX (1) MX2007013662A (ko)
WO (1) WO2006117557A2 (ko)
ZA (1) ZA200709442B (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0508981D0 (en) * 2005-05-03 2005-06-08 Acolyte Biomedica Ltd Distinguishing cells in a sample
GB0606822D0 (en) * 2006-04-05 2006-05-17 Alaska Food Diagnostics Assay System
US20120003662A1 (en) 2007-10-18 2012-01-05 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods and Kits for Detecting Mastitis
EP2333105A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-15 Koninklijke Philips Electronics N.V. Selective lysis of cells
CN103328652B (zh) * 2010-04-16 2016-12-28 宙斯科学有限公司 测量用于测定未纯化的样品中细胞生活力的酶活性的方法
CA2839794A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Advandx, Inc. Selective ultrasonic lysis of blood and other biological fluids and tissues
JP2015513921A (ja) * 2012-04-12 2015-05-18 ゼウス サイエンティフィック、インク． 任意のポリメラーゼ伸長活性の高感度定量的測定と生細胞存在の決定とに有用なポリメラーゼ活性測定方法
US8975060B2 (en) * 2012-11-30 2015-03-10 Qvella Corporation Method for pretreatment of microbial samples
US10662420B2 (en) 2012-11-30 2020-05-26 Qvella Corporation Apparatus and method for extracting microbial cells
CA2961510A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Helixbind, Inc. Methods and devices for detecting and identifying microorganisms
CN109414695B (zh) 2016-03-14 2022-03-18 海利克斯拜恩德股份有限公司 集成流体装置及相关方法
AU2019378011A1 (en) * 2018-11-16 2021-06-03 SeLux Diagnostics, Inc. System, method and interface for parallel processing of antimicrobial susceptibility tests using different samples
WO2020202113A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-08 Thermo Fisher Scientific Oy Mass spectrometric methods and compositions for identifying microbes from blood by reducing confounding proteins

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002092843A1 (fr) 2001-05-16 2002-11-21 Kikkoman Corporation Technique de comptage de cellules microbiennes

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL81822A0 (en) * 1987-03-08 1987-10-20 Yissum Res Dev Co Method and kit for testing for the presence of catalase in milk
JP3200134B2 (ja) * 1992-02-24 2001-08-20 湧永製薬株式会社 マラリア原虫の検出
GB9301118D0 (en) 1993-01-21 1993-03-10 Secr Defence Enzyme linked assays
DE69430327T2 (de) 1994-07-13 2002-10-31 Secr Defence Brit Mikrobiologisches testverfahren und reagenzien
US5843608A (en) 1995-06-08 1998-12-01 Coulter International Corp. Reagent and method for differential determination of leukocytes in blood
GB9902659D0 (en) * 1999-02-05 1999-03-31 Microbiological Res Authority Assay with reduced background
GB9911095D0 (en) * 1999-05-13 1999-07-14 Secr Defence Microbiological test method and reagents
GB0308199D0 (en) * 2003-04-09 2003-05-14 Acolyte Biomedica Ltd Combined microbiology system
GB0508981D0 (en) * 2005-05-03 2005-06-08 Acolyte Biomedica Ltd Distinguishing cells in a sample

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002092843A1 (fr) 2001-05-16 2002-11-21 Kikkoman Corporation Technique de comptage de cellules microbiennes

Also Published As

Publication number Publication date
EP1877571A2 (en) 2008-01-16
EP1877571B1 (en) 2015-01-14
KR20080056112A (ko) 2008-06-20
MX2007013662A (es) 2008-04-08
JP5475278B2 (ja) 2014-04-16
US20090275063A1 (en) 2009-11-05
JP2008539712A (ja) 2008-11-20
US20130130290A1 (en) 2013-05-23
CA2607058A1 (en) 2006-11-09
WO2006117557A2 (en) 2006-11-09
WO2006117557A3 (en) 2007-01-11
US8349583B2 (en) 2013-01-08
ZA200709442B (en) 2009-04-29
AU2006242988A1 (en) 2006-11-09
JP2014042526A (ja) 2014-03-13
CN101198705B (zh) 2013-03-27
GB0508981D0 (en) 2005-06-08
CN101198705A (zh) 2008-06-11
BRPI0611655A2 (pt) 2011-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101315007B1 (ko) 세포내 효소의 방출 전 세포외 효소를 불활성화함으로써시료 내 세포를 구별하는 방법
US20220243248A1 (en) Method for the rapid determination of susceptibility or resistance of bacteria to antibiotics
JP5808269B2 (ja) 耐性微生物の特異的検出用の培地
ES2652367T3 (es) Método de detección de los microorganismos resistentes a un agente terapéutico
RU2384624C2 (ru) Способ получения образца для детектирования микроорганизма, способ детектирования микроорганизма и набор для детектирования микроорганизма
JP2021104043A (ja) ベータ−ラクタマーゼの検出のためのキット
US7166442B2 (en) Device and method for detecting antibiotic inactivating enzymes
US7807403B2 (en) Device and direct method for detection of antibiotic-inactivating enzymes
ES2396820B1 (es) Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.
US9562899B2 (en) Method of detecting OXA-048 carbapenemase producing bacteria
EP3052642A2 (en) Antimicrobial compound susceptibility test
JP2023537325A (ja) 化合物を殺細菌活性についてスクリーニングし、細菌サンプルの感受性を決定するための方法
Cubas-Atienzar Cubas-Atienzar, AI, Williams, CT, Karkey, A, Dongol, S, Sulochana, M, Rajendra, S, Hobbs, G, Evans, K, Musicha, P, Feasey, N, Cuevas, LE, Adams, ER and Edwards, T A Novel Air-Dried Multiplex High Resolution Melt Assay for the Detection of Extended Spectrum Beta-Lactamase and Carbapenemase Genes.

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160831

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180903

Year of fee payment: 6