JP2023537325A - 化合物を殺細菌活性についてスクリーニングし、細菌サンプルの感受性を決定するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、耐熱性ルシフェラーゼを用い、リアルタイムのバイオルミネセンス測定に基づいて化合物を殺細菌活性についてスクリーニングするための方法に関するものである。本発明はさらに、細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルの、既知の抗生物質の群に対する感受性を決定するための方法、及び殺細菌性化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を評価する方法に関する。

Description

本発明は、化合物を殺細菌活性についてスクリーニングするための、容易で、簡単で、信頼性が高く、非常に迅速な方法に関する。本発明はまた、細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルの、既知の抗生物質の群に対する感受性を決定するための、同様に容易で、簡単で、信頼性が高く、非常に迅速な方法に関する。最後に、本発明は、殺細菌性化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を評価するための迅速な方法に関する。

抗菌薬の創薬及び感受性試験においては、製薬業者からの化合物や溶液の膨大なライブラリーをリアルタイムで解析する能力が不可欠である。また、細菌感染症に罹患している患者の治療においては、入手可能で感染症に感受性のある殺細菌性化合物とその適切な最小発育阻止濃度を迅速に決定することが、感染症を食い止めるために極めて重要である。未曾有の細菌感染症のパンデミックなどの状況においては、有効な薬剤を迅速にスクリーニングすることが極めて重要である。
しかしながら、新規の有力な殺細菌性化合物をスクリーニングしたり、既知の抗生物質に対する細菌サンプルの感受性を試験したりするための現行の試験は、満足のいくものではない。特に、そのほとんどは煩雑で、結果が出るまでに何時間も要する。また、既知のアッセイのほとんどは、増殖中の細菌を使用してのみ実施可能であり、定常期又はバイオフィルムの細菌を使用することはできない。多数の患者を検査する場合、抗生物質への感受性試験は簡便で、迅速で、かつ信頼性の高い結果を得られるものでなければならない。
例えば、Ｌｉｎｇら（Nature. 2015 Jan 22;517(7535):455-9）は、２０時間のインキュベーションを必要とするステップを含む方法によって、１０，０００の細菌単離株からの抽出物を用い、それらの細菌の増殖を阻害する能力について試験している。この増殖阻害アッセイはまた、寒天プレート上で細菌を成長させ菌叢とすることを含む。そのため、このアッセイは非常に時間がかかり、増殖の定常期にある細胞やバイオフィルム内の細胞では、実施することができない。また、抗生物質の感受性試験も、ほとんどが時間のかかる細菌の増殖阻害アッセイに依存するものである。

アデノシン－５’－三リン酸（ＡＴＰ）は、重要な生体分子であり、その定量的な検出は、特に抗菌薬の発見や感受性試験の分野で重要であり、重要な開発の対象になっている。実際、細胞溶解に伴う細胞膜の破壊は、細胞内のＡＴＰストックの放出によって特徴づけられる。そのため、細胞培養培地中に放出されるＡＴＰ量を測定することで、殺細菌性化合物による細菌細胞の溶解を測定することが可能なはずであることを提案する研究者も存在した。
これは２つのグループによって試みられてきた。９０年代には、ｄｅ Ｒａｕｔｌｉｎ ｄｅ ｌａ Ｒｏｙら（J. Biolumin. Chemilumin. 6, 193-201 (1991)）が、ルシフェリン－ルシフェラーゼアッセイを用いて抗生物質の殺細菌活性の動態を測定することを試みている。この試験において、抗生物質の殺細菌効果は徐々にしか検出されず、時には細菌サンプルへの添加後１０時間経過しなければ検出されない。そのため、この試験は、新規の有力な殺細菌性化合物の迅速かつ効率的なスクリーニングには適していない。さらに、蒸留水に希釈する際に細菌を浸透圧ショックにかけるが、これは細菌膜を変化させ、抗生物質以外によるＡＴＰ放出にもつながると予想されるため、結果が不明確となり、この試験は信頼できないものとなる。

最近では、Ｈｅｌｌｅｒら（2019. PLoS ONE 14(1): 1-13 (2019)）が、細胞溶解により放出されるＡＴＰをバイオルミネセンス ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応により測定することを含むＡＴＰ／ＯＤ６００比法という方法に基づく細菌感受性試験を開示している。この方法で、著者らは、増殖期がほぼ終了し、細菌が定常期に達したときにのみ抗生物質を添加することを推奨している。定常期の細胞を用いるのは、この方法の感度が低いためである。定常期を待つまでに時間がかかるため、この提案される方法では時間がかかり過ぎる。さらに、国際的な抗生物質感受性試験ガイドラインでは、アミノグリコシドのような一部の抗生物質が、定常期の細胞に対して有効性が低いため、定常期の細胞の使用は推奨されていない。著者らはまた、細胞外ＡＴＰ濃度の測定値を培養菌の光学濃度（ＯＤ）により調整することを推奨しているが、これは試験の信頼性を損なう可能性がある。さらに、この試験では、バイオルミネセンスを測定する前に、試験サンプルを氷上でしばらく静置するが、このステップは、試験サンプルに存在するＡＴＰの分解を誘発する可能性があり、これも試験の信頼性及び感度に影響する。実際、この方法ではシグナルが非常に弱く、アミノグリコシドであるゲンタマイシンに対する感受性菌の感受性の検出でさえも失敗している。さらに、試験サンプル中に存在するＡＴＰを測定する前に、サンプルから細菌を除去するために遠心分離のステップが採用されるが、これは細菌の細胞壁を変化させ、ＡＴＰをさらに放出させ、スクリーニング化合物に対するいくつかの細菌の測定感度を人為的に増加させる可能性がある。このため、提案された方法は時間がかかり過ぎるのに加え、感度及び信頼性が十分でない。

ＷＯ２０１９／１６２３０１は、第１及び第２のペプチドを含む医薬組成物に関する発明を開示している。第１のペプチドは、バクテリオシンＰＬＮＣ８αβのペプチドである。また、ＰＬＮＣ８αβによって誘導される細胞溶解を実証するための、古典的なＡＴＰ流出測定に基づく方法が開示されている。この方法は、２８℃を超える温度では不安定な古典的なホタルルシフェラーゼを使用するものである。この不安定性は、ＭＩＣ又は２×ＭＩＣのペプチド濃度に対してＡＴＰ放出がないことによって示されるように、測定試験の信頼性及び感度に影響を与える。

ＡＴＰ流出測定における古典的なルシフェラーゼＦＬＥ－５０の使用は、Ｌｅｎｎａｒｔ ＮＩＬＳＳＯＮによっても開示されている（"New Rapid Bioassay of Gentamicin Based on Luciferase Assay of Extracellular ATP in Bacterial Cultures", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 14, no. 6, 1 January 1978）。以上のように、この不安定性により、高感度なＡＴＰ測定は得られない。また、Ｎｉｌｓｓｏｎによって開示された方法では、ＡＴＰの流出をリアルタイムで測定することが不可能である。すなわち、低い感度及びシグナルの振幅により、バイオルミネセンス測定を行うまでに最低でも１時間３０分の遅延を余儀なくするため、この方法は最適ではない。

以上のことから、現在利用可能な殺細菌剤のスクリーニング方法や、既知の薬剤に対する細菌の感受性を試験する方法は、時間がかかり、感度や信頼性が低いものであるため、迅速性、感受性、信頼性が改善された方法に対するニーズが明らかに存在する。

本発明の文脈において、本発明者らは、ルシフェリン－ルシフェラーゼアッセイを用いて、新規な候補殺細菌性化合物又は既知の抗生物質に曝露した後の生細菌からのＡＴＰ又はそのアナログの流出をリアルタイムで検出する方法を開発した。なお、本発明の方法によって検出されるＡＴＰ又はそのアナログの流出は、必ずしも細菌全体の細胞溶解や細菌細胞壁の破壊を伴う細胞溶解（βラクタム系などの一部の抗生物質で知られている現象）の結果ではないことに留意すべきである。以上説明したように、ＡＴＰは迅速に加水分解される脆弱な生体分子である。この不安定性は、ＡＴＰ加水分解酵素が存在する可能性のある培養培地中では重要な意味を持つ。ルシフェラーゼとＡＴＰの反応を、菌体から離れた時点でリアルタイムにモニタリングすることは、ＡＴＰの分解を回避し、検出感受性を最大限に高め、測定の信頼性を保証するものである。また、リアルタイム測定の採用のため、細菌に物理的（高速遠心分離など）、化学的（浸透圧ショックなど）なストレスを与える必要がない。細菌は、単に６００ｎｍの最小光学密度（ＯＤ６００）まで増殖し、ルシフェリン－ルシフェラーゼ試薬と、候補殺細菌性化合物又は既知の抗生物質と、を添加され、リアルタイムでバイオルミネセンスが測定されるため（図１参照）、細菌の細胞壁の変化や培地交換による細胞生理の変化（図４参照、このようにＡＴＰの人工的放出がもたらされる）により結果が歪められることはない。このように、リアルタイム測定の採用は、先行技術の方法と比較して、本発明による方法の感度及び信頼性を顕著に向上させるものである。

さらに、本発明者らは、ルシフェラーゼと、同じくルシフェラーゼによって光に変換されるＡＴＰ又はそのアナログとの反応を、リアルタイムでモニタリングすることにより、抗生物質のファミリーごとに特徴的な時間的特徴及びＡＴＰ漏出の振幅を初めて発見した（図８参照）。驚くべきことに、本発明者らは、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）付近の濃度では、一般に抗生物質との接触後数分でＡＴＰの漏出が始まることを明らかにし（表２参照）、細菌が生きている間であっても、ＡＴＰの漏出は必ずしも細胞溶解の結果ではないことが見出された（図８参照）。この発見は、先行技術の方法よりもはるかに迅速で、一般にわずか数分後に結果が得られる方法の基礎となるものである。
さらに、本発明者らは、本方法が、精製形態（特に図８、１０、１１参照）としての、又は細菌上清などの複合混合物としての、広範囲の抗生物質に使用でき（図１２参照）、また広範囲の細菌株（例えば多剤耐性細菌、図２０参照）及び形態（浮遊細胞又はバイオフィルムなど、図８、２０参照）に使用できることを明らかにした。

全体として、本発明者らによって設計された方法は、このように非常に迅速で（一般に数分で十分であろう）、感度（ＭＩＣ以下の感度）及び信頼性が高く、（試験する化合物／組成物及び細菌の種類について）広く適用できる。本方法はさらに、マイクロプレートで実施することができ、容易に自動化することができ、したがって産業的にも有用である。また、本方法は、超ハイスループットスクリーニング用のマイクロ流体ツールで実施することも可能である。したがって、本発明の方法は、創薬のための新規な候補殺細菌性化合物の大規模ライブラリーの試験や、細菌の耐性に関連する迅速な抗生物質感受性試験に適している。

最後に、本発明者らはまた、ルシフェラーゼとＡＴＰ又はそのアナログとの反応をリアルタイムでモニタリングすることにより、抗生物質濃度を変化させても、抗生物質の添加からＡＴＰ漏出の検出までのタイムラグを測定し、所定の細菌サンプルに対する化合物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を迅速かつ確実に評価することができることを明らかにした（図２２及び２３を参照）。

第１の態様によれば、本発明はすなわち、化合物を殺細菌活性についてスクリーニングするための方法であって、
ａ）培養培地中に生細菌を含む１つ又は複数の試験細菌サンプルを用意することと、
ｂ）前記試験細菌サンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加することと、
ｃ）前記試験細菌サンプルに候補組成物を添加することと、
ｄ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物及び候補組成物が添加された試験細菌サンプルを２０～６０℃、好ましくは３５～３７℃でインキュベートし、バイオルミネセンスをリアルタイムで測定することと
を含み、
ステップａ）、ｂ）及びｃ）が実行された後の試験細菌サンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２であり、
ステップｄ）において試験細菌サンプル中で測定されたバイオルミネセンスの増加は、ステップｃ）において試験細菌サンプルに添加された候補組成物が、殺細菌活性を有する少なくとも１つの化合物を含むことを示す、方法に関する。

第２の態様によれば、本発明はまた、細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルの、既知の抗生物質の群に対する感受性を決定するための方法であって、
ａ）細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルを培養培地に接種し、任意に、サンプル中の細菌を増幅させることと、
ｂ）ステップａ）の細菌サンプルを、試験される既知の抗生物質の数と少なくとも同数のサンプルとなるよう、いくつかのサブサンプルに分割することと、
ｃ）各サブサンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加することと、
ｄ）１つ又は複数のサブサンプルに既知の抗生物質の群又は抗生物質の組み合わせのそれぞれを添加することと、
ｅ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物及び既知の抗生物質が添加されたサブサンプルを２０～６０℃、好ましくは３５～３７℃の温度でインキュベートし、バイオルミネセンスをリアルタイムで測定することと
を含み、
ステップａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）が実施された後のサブサンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２であり、
ステップｅ）においてサブサンプル中で測定されたバイオルミネセンスの増加は、対象に由来する細菌サンプルが、ステップｄ）においてサブサンプルに添加された既知の抗生物質の添加濃度に対して感受性であることを示す、方法に関する。

第３の態様によれば、本発明はまた、殺細菌性化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を評価するための方法であって、
ａ）培養培地中に生細菌を含む少なくとも１つの試験細菌サンプルを用意することと、
ｂ）ステップａ）の細菌サンプルをいくつかのサブサンプルに分割することと、
ｃ）前記サブサンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加することと、
ｄ）前記サブサンプルに様々な濃度の殺細菌性化合物を添加することと、
ｅ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼと殺細菌性化合物の混合物が添加されたサブサンプルを２０～６０℃、好ましくは３５～３７℃でインキュベートし、バイオルミネセンスをリアルタイムで測定することであって、ステップａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）が行われた後のサブサンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２である、測定することと、
ｆ）試験した殺細菌性化合物の各濃度について、殺細菌性化合物が添加された時点と、バイオルミネセンスシグナルの増加が検出された時点との間のラグタイムを測定することと、
ｇ）殺細菌性化合物濃度の関数としてラグタイムを表すことと、
ｈ）殺細菌性化合物濃度の関数として、ラグタイムの測定点にフィットする指数関数的減衰曲線を作成することと、
ｉ）指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトーにおける最低の殺細菌性化合物濃度を決定することと、
ｊ）指数関数的減衰フィッティング曲線のラグタイム振幅を決定することと、
ｋ）ＭＩＣを評価することであって、ＭＩＣが、
・指数関数的減衰フィッティング曲線上で、又は（プラトーでのラグタイム＋０．３×ラグタイム振幅）に等しいラグタイムに対応する抗生物質濃度と、
・指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトーにおける最低の殺細菌性化合物濃度と
の間に含まれるとして評価されることと
を含む、方法。

ＡＴＰ放出をリアルタイムでモニタリングするためのバイオルミネセンスアッセイを示す図である。 ＡＴＰ流出をリアルタイムでモニタリングするための耐熱性ルシフェラーゼアッセイを示す図である。Ａ：従来のルシフェラーゼアッセイの安定性試験。２８℃の富栄養培地（ＬＢ）又は最少（ＭＯＰＳグルコース０．４％）培地で試薬をプレインキュベーションした後、ＡＴＰを添加した後に得られたバイオルミネセンスのシグナル。Ｂ：膜損傷を引き起こすことが知られている抗生物質（ネオマイシン）に対する古典的バイオルミネセンスアッセイの２８℃における反応。ネオマイシンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５の対数増殖期の培養培地に、そのＭＩＣ、すなわちＬＢ中では２２．８μｇ／ｍＬ、ＭＯＰＳグルコース０．４％中では０．８μｇ／ｍＬで添加した。ＬＢ中又はＭＯＰＳグルコース０．４％中の抗生物質無添加の対照も含む。Ｃ：３７℃で耐熱性ルシフェラーゼを用いて行った実験。Ｄ：最少培地でのＡＴＰアッセイには、耐熱性ルシフェラーゼがより適している。最少培地又はＬＢ中、３７℃で、耐熱性ルシフェラーゼを用いて、様々なＡＴＰ濃度のバイオルミネセンスシグナルを得た。 アッセイにおける生細菌（レポーター細胞）の量が重要であることを示す図である。Ａ：ミュラーヒントン培地で培養した大腸菌レポーター細胞の量を増やしながら、３７℃でアッセイを実施した。使用した細胞培養培地の最終的なＯＤ₆₀₀値を各パネルに示す。Ｂ：最大濃度のネオマイシン（１００μｇ／ｍＬ）に対して記録された最大値をグラフで報告した。０．１５の最終ＯＤ₆₀₀は、このアッセイによく適合している。 Ａ：アミノグリコシド曝露前の新鮮な培地への交換を伴う遠心分離は、薬物の殺細菌効果を促進することを示す図である。０．２５％グルコースを含むＴＳＢ培地中の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＵＳＡ３００を３７℃で定常期に達するまでインキュベートした。細胞を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離するか（＋）、遠心分離せずに３７℃に置いた（≠）。遠心分離後、ペレットを新鮮なブロスで洗浄し、３７℃に置いた。試験に応じて、異なる濃度のネオマイシンを添加した。遠心分離し、新鮮なブロスで洗浄した黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００サンプルは、ネオマイシンに対してより感受性である。例えば、細菌ＣＦＵは、８ｍＭ及び２ｍＭの濃度では２時間で検出限界（１０²ＣＦＵ／ｍＬ）以下になるが、０．５ｍＭの濃度ではさらに２時間必要である。棒グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．４．１で算出した平均値からの標準誤差（ＳＥＭ）を表す。Ｂ：０．２５％グルコースを含むＴＳＢ培地中の黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００を３７℃で定常期に達するまで培養した。細胞を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離するか、遠心分離せずに３７℃に置いた。遠心分離後、ペレットを新鮮なブロスで洗浄し、３７℃に置いた。ネオマイシン４ｍＭを含む１００μＬの新鮮な培地をすべてのチューブに、遠心分離の有無で、遠心分離後５、１５、３０、６０及び１２０分に添加（最終濃度は２ｍＭ）した。サンプルをネオマイシンと共に合計２時間インキュベートした後、ＰＢＳ １×で３回洗浄し、希釈し、トリプティックソイ寒天培地上で培養した。翌日、コロニー形成単位／ｍＬを計数した。棒グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．４．３で算出した標準偏差（ＳＤ）を表す。 試験した抗生物質のみでは、一般にバイオルミネセンスアッセイ（耐熱性ルシフェラーゼ）に影響を与えないことを示す図である。ルシフェラーゼ－ルシフェリン試薬を、３０ｎＭのＡＴＰを添加する前に、ＬＢ中の様々な抗生物質の存在下で３７℃で４０分間プレインキュベートした（細菌非存在下）。Ａ：本試験で使用した一組の抗生物質の最大濃度でのＲＬＵ（最大値）である。Ｂ：バイオルミネセンスアッセイにおけるピューロマイシンの効果の評価である。ＭＩＣ（３７７μｇ／ｍＬ）以上の濃度では、バイオルミネセンスの阻害は強く、５０％を超えていた。 バイオルミネセンス試薬が、細胞生存率を維持したことを示す図である。バイオルミネセンス測定試薬（耐熱性ルシフェラーゼ）は、ＬＢ中のＭＧ１６５５大腸菌細胞の増殖速度をわずかに遅延させるだけであった。細胞を、バイオルミネセンスアッセイ試薬の存在下又は非存在下で３７℃のマイクロプレートリーダー上でインキュベートし、細胞の増殖を光学密度の測定によってモニターした。測定は二重に行い、同一であることを確認した。このアッセイは非滅菌状態で行った。 アミノグリコシド耐性株大腸菌ＭＧ１６５５によるＡＴＰ漏出の不存在を示す図である。耐性株（ＭＧ ＫａｎＲ）は、アミノグリコシドＯ－ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３’）－ＩＩａの発現遺伝子を含む。耐性株（ＫａｎＲ）又は非耐性株（ＷＴ）ＭＧ１６５５大腸菌をＭＯＰＳ最少培地（グルコース０．４％）中、３７℃で漸増濃度のネオマイシンに曝露したときのＡＴＰ放出量である。耐性株（ＫａｎＲ）ではＡＴＰの漏出は見られなかった。 殺細菌性抗生物質は、ＡＴＰ放出の単相性又は多相性のトレースを誘発したことを示す図である。ＬＢ増殖培地中の大腸菌レポーター細胞を用いて、様々な抗生物質を添加した後に３７℃で得られたバイオルミネセンス測定の代表的なトレースである。バイオルミネセンスシグナルは８０秒ごとに１秒間取得した。ＭＩＣ値を示す。右上パネル：ネオマイシンの場合、異なる薬剤濃度について得られた殺傷曲線は、最初の９０分間、細胞が生存したままであったことを示した。したがって、ネオマイシンでは、二相性のＡＴＰ流出が生細胞に由来することがわかった。他のアミノグリコシド系薬剤（カナマイシン、ストレプトマイシン、アミカシン、アプラマイシン、ゲンタマイシン）についても、二相性のＡＴＰ流出が認められた。ネオマイシンに関しては、ＭＩＣ又はＭＩＣに近い濃度でのシグナルが、それよりわずかに低い濃度でのシグナルよりも低いことが認められた。 殺細菌性抗生物質は、殺細菌性のない濃度で使用した場合、ＡＴＰ放出を誘発しなかったことを示す図である。ＬＢ増殖培地中の大腸菌レポーター細胞を用いて、抗生物質を添加した後に３７℃で得られたバイオルミネセンス測定の代表的なトレースである。ＭＩＣ値を示す。一部の静菌性の薬剤は、高用量で使用した場合にのみ強いシグナルを示し、その後致死量となった。 Ａ：図８及び図９に示す結果の合成を示す図である。殺細菌性抗生物質による攻撃の鍵となるシグネチャーとしてのＡＴＰの漏出である。殺細菌性抗生物質が感受性のＭＧ１６５５大腸菌と反応したとき、普遍的なシグナル（濃い灰色）が検出された。このシグナルは、静菌性抗生物質では、存在しないか又は非常に弱かった（薄い灰色）。Ｂ：殺細菌性抗生物質と静菌性抗生物質の解析結果を合成したヒートマップを示す。バイオルミネセンスシグナルの最大振幅を、ＬＢ及びＭＯＰＳ－Ｇ中の（ＭＩＣ）、又はＬＢ中のＭＩＣ超（＞ＭＩＣ）の薬剤を用いた最初の４時間の間に収集した。シグナルの強度は、強い（濃い灰色）～ないか又は非常に弱い（薄い灰色）までのスケールで色強度で示す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１上で実施した。 ３７℃の最少増殖培地におけるバイオルミネセンスアッセイを示す図である。Ａ：ＭＯＰＳ最少培地（グルコース０．４％）で、殺細菌性（左）、静菌性（右）のセットにおけるそれぞれのＭＩＣの抗生物質の存在下で増殖させた大腸菌のＡＴＰ放出である。Ｂ：ゲンタマイシン、ネオマイシン、アプラマイシン（殺細菌性）、及びリファンピシン、アジスロマイシン（静菌性）のトレースの完全セットである。アジスロマイシンは、その最高濃度（４００μｇ／ｍＬ）でＡＴＰ漏出を刺激し、富栄養培地で観察されるものと一致した（図９）。 ストレプトマイセス・フラディエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）の上清中のネオマイシンの存在が、グラム陽性レポーター株ルテウス菌（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）で検出可能であることを示す図である。４日間培養したＳ．フラディエの上清の存在下、ＬＢ培地で培養したルテウス菌の３７℃におけるＡＴＰ放出量である。レポーター細胞であるルテウス菌が存在しない対照実験では、ＡＴＰの漏出が見られなかった。 富栄養培地で発生する偽陽性シグナルを示す図である。黒：ルシフェリン－ルシフェラーゼ試薬溶液とストレプトマイセス・フラディエ培養由来の上清と共に３７℃でインキュベートしたレポーター細菌である大腸菌（７日）を示す。灰色：新鮮な培地（一定量を保つため）及びルシフェリン－ルシフェラーゼ試薬溶液のみでインキュベートした上清（細菌なし）。明るい灰色：レポーター細菌である大腸菌を新鮮な培地（一定量を保つため）及びルシフェリン－ルシフェラーゼ試薬溶液のみでインキュベートしたもの（上清なし）。バイオルミネセンスは２１０分間モニターした。 ストレプトマイセス・フラディエ培養上清及びルシフェラーゼ－ルシフェリン試薬と接触させたときの新鮮なＬＢ培地が、バイオルミネセンスを誘発したことを示す図である。ストレプトマイセス・フラディエ培養（７日）由来の上清にＬＢ培地を添加すると、３７℃で偽陽性シグナルが発生した。ＬＢ培地は３０分後に注入した（黒矢印）。薄い灰色：ＡＴＣＣ株。黒：ＤＳＭ株（ネオマイシンを産生できない多重変異株ＤＳＭ４１５５０）。 最少培地を使用することで、富栄養培地で発生する偽陽性シグナルの問題が解決されたことを示す図である。ネオマイシン産生株ストレプトマイセス・フラディエ（ＷＴ、図の左側）の上清を添加し、３７℃のＭＯＰＳ－Ｇ培地で発生するＡＴＰ漏出をリアルタイムでモニタリングした。この条件では、レポーター細胞（大腸菌）又はＷＴストレプトマイセス・フラディエ細胞の上清を単独で使用してもバイオルミネセンスシグナルは生じなかった。レポーター細胞を薬剤産生株の上清と接触させた場合のみ、シグナルが検出された。ネオマイシンを産生できない多遺伝子変異株であるストレプトマイセス・フラディエ変異株ＤＳＭ（変異株ＤＳＭ４１５５０、図中右）の場合、非常に弱いシグナルが観察され、ネオマイシン以外の何らかの殺細菌性化合物が存在することが示唆された。 アッセイの最適化に関し、Ａ：上清をＰＭＳＦ（濃度０．１ｍＭ）と共にインキュベートした場合の影響を示す図である。無水エタノールに溶解した０．２μＬのＰＭＳＦを１９．８μＬのストレプトマイセス・フラディエ上清に添加した。この混合物を室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを氷上に置き、マイクロタイタープレートが充填されるまで置いた。バイオルミネセンスは、３７℃で８時間モニターした。Ｂ：膜（カットオフ５０００Ｄａ）を用いた限外濾過の効果を示す。上清を限外濾過装置（ＶｉｖａＳｐｉｎＴＭ ５００ ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）により濾過した。濾過の前に、膜を緩衝液（ＭＯＰＳ－グルコース０．４％）でリンスした。上清を濃縮チャンバーに入れた。濃縮チャンバーとコレクターチューブを１５，０００ｇで２０分間遠心分離した。濾液を回収し、－２０℃で保存した。 ＭＯＰＳ最少培地（グルコース０．４％）中で増殖した大腸菌細胞による、漸増濃度のネオマイシンの存在下でのＡＴＰ放出についての、３７℃での最少培地中のバイオルミネセンスアッセイを示す図である。ＡＴＰの漏出は、図８で得られたネオマイシンのトレースと比較して、わずかに遅れていた。ＭＯＰＳ－グルコース最少培地では見られなかった特徴的な二相性キネティックがここで観察されたのは、上清と共に使用した条件と一致するようにＴＳＢ培地で行った抗生物質の連続希釈のためである。 ３８４ウェルマイクロタイタープレートでのバイオルミネセンスアッセイを示す図である。ＭＯＰＳ最少培地（グルコース０．４％）で増殖させた大腸菌の、漸増濃度のネオマイシンの存在下でのＡＴＰ放出である。このアッセイは、白色の３８４ウェルマイクロタイタープレート中の体積を減らして、３７℃で行った。 薬剤産生株の培養上清中の殺細菌性化合物の存在を検出するためのバイオルミネセンスアッセイを示す図である。Ａ：薬剤産生株の上清に適用した方法の原理である。Ｂ：図１６ｂに示す上清の濾過を伴うアッセイの最適化である。バイオルミネセンスは、３７℃で４時間モニターした。Ｃ：ストレプトマイセス・フラディエの培養上清を二重に用い、最適化されたプロトコルを用いた試験である。バイオルミネセンスシグナルは、ストレプトマイセス・フラディエのネオマイシン産生野生型株ＡＴＣＣについては検出されたが、非産生多変異株（ＤＳＭ４１５５０）又は単一変異株（Δｎｅｏ６）については検出されなかった。 多剤耐性黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００株のバイオフィルムからの薬物依存的なＡＴＰ放出を示す図である。Ａ：抗生物質非存在下、３７℃での対照実験である。バイオフィルムを、バイオルミネセンスアッセイでネオマイシンに曝露する前に、ＭＯＰＳ培地で洗浄した。バイオフィルムは、実施例のセクションに記載されるように入手し、ＭＯＰＳ－Ｇ培地で２回洗浄した。洗浄液を、バイオルミネセンスアッセイでＡＴＰの存在について試験した。これらの溶液はＡＴＰを含まなかった。洗浄したバイオフィルムを、次にＡＴＰ放出について試験した。シグナルは最初の４０分間で存在した。このＡＴＰ放出は、おそらく、プレートリーダーでバイオフィルムを物理的に撹乱しながら振とうしたことに由来する。Ｂ：薬物曝露に対する３７℃でのバイオフィルムの反応である。 抗菌剤の発見のためのバイオルミネッセンスアッセイを示す図である。 薬剤濃度及びＭＩＣ値のポジショニングの関数としてのラグタイムの変動の分析を示す図である。抗生物質濃度（ｃ）の関数としてのラグの値は、指数関数的減衰Ｙ＝（ＹＯ－プラトー）^*ｅｘｐ（－Ｋ^*ｃ）＋プラトーとして分析される。ＭＩＣの測定実験値を、白丸によって曲線上に表示する。各抗生物質について、値Ｘを算出し、これらの値を表２に表示する。 抗生物質の濃度増加の関数としてのラグタイムの代表的な分析を示す図である。実験は、富栄養ＬＢ培地、又は指示される場合にはカチオン調整ミュラーヒントン（ＭＨ）培地で増殖させた大腸菌株を使用して行った。アミカシン（図８）のバイオルミネセンスシグナルの出現領域を例として示す（左）。各薬物濃度について、シグナルが増加する時間を矢印で示す。データの対応するフィットを右図に示す。データは、図２２の式を用いて分析した。各抗生物質について、実験的に測定されたＭＩＣ値を白丸で表示する。 従来の（耐熱性でない）ホタルルシフェラーゼとキッコーマン社製の耐熱性ルシフェラーゼとの比較アッセイを示す図である。これらの酵素はいずれも、富栄養培地（ＬＢ）又は最少培地（ＭＯＰＳ－グルコース）中で３７℃にてインキュベートし、ルシフェラーゼの活性を様々な時間にて測定した。エラーバーは、３つの独立したアッセイの平均の標準誤差である。 臨床用のミュラー増殖培地中の大腸菌により得られたバイオルミネセンスシグナルを示す図である。Ａ：ネオマイシン添加後のヒントン培地である。ＥＵＣＡＳＴの勧告に従い、１ｍＬ当たりの細菌コロニー形成単位を、Ｄ６００での０．０００２７５（約５．５×１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ）の接種量とした。Ｂ：移動平均法を用いて曲線を平滑化した。ＭＩＣの推定。実験によるＭＩＣ（３．１２μｇ／ｍＬ）を白丸で示し、ＭＩＣにおけるＸ値を、４つの独立した実験についてその平均の標準誤差と共に示す。バーは４つの独立した実験について算出された標準偏差（ＳＤ）を表す。

本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「ｃｏｎｔａｉｎｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」などｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は、オープンエンドであり、追加の記載されない要素又は方法ステップを除外しないことを意味する。「から本質的になる」という表現は、本質的な意味を持つ他の成分又はステップを除外することを意味する。したがって、記載された成分から本質的になる組成物は、微量成分、汚染物質及び薬学的に許容される担体を除外しないであろう。「からなる」とは、他の成分又はステップの微量要素以上のものを除外することを意味するものとする。本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのその派生語のいずれか）が用いられるときは、本発明はまた、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのその派生語のいずれか）が、「から本質的になる」又は「からなる」で置き換えられる同じ実施形態にも関する。

化合物を殺細菌活性についてスクリーニングするための方法（スクリーニング方法）
上述のように、本発明者らは、ルシフェリン－ルシフェラーゼアッセイを用いて、新規な候補殺細菌性化合物又は既知の抗生物質に曝露した後の生細菌からのＡＴＰ又はそのアナログの流出をリアルタイムで検出する方法を開発した。本発明の方法は、非常に迅速（一般に数分で十分であろう）であり、（リアルタイム測定のおかげで、脆弱なＡＴＰ分解による歪みが防止され、細菌細胞の物理的及び化学的ストレスがないため）感度及び信頼性が高く、また（組成物の種類及び試験される細菌に関して）広く適用できる。さらに、マイクロプレートに実装することにより、容易に自動化することができ、したがって工業的に有用であるか、又は超ハイスループットスクリーニングのためのマイクロ流体ツールに実装することができる。したがって、本発明の方法は、新規な候補殺細菌性化合物の大規模なライブラリーをスクリーニングすることを可能にする。

第１の態様によれば、本発明はすなわち、化合物を殺細菌活性についてスクリーニングするための方法であって、
ａ）培養培地中に生細菌を含む１つ又は複数の試験細菌サンプルを用意することと、
ｂ） 試験細菌サンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加することと、
ｃ）試験細菌サンプルに候補組成物を添加することと、
ｄ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物及び候補組成物が添加された試験細菌サンプルを２０～６０℃、好ましくは３５～３７℃でインキュベートし、バイオルミネセンスをリアルタイムで測定することと
を含み、
ステップａ）、ｂ）及びｃ）が実行された後の試験細菌サンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２であり、
ステップｄ）において試験細菌サンプル中で測定されたバイオルミネセンスの増加は、ステップｃ）において試験細菌サンプルに添加された候補組成物が、殺細菌活性を有する少なくとも１つの化合物を含むことを示す、方法に関する。

ステップａ）：培養培地中の生細菌を含む少なくとも１つの試験細菌サンプルの提供
試験細菌サンプルの光学密度
本発明者らは、ＡＴＰ漏出シグナルの振幅が、最終サンプル（ステップａ）、ｂ）及びｃ）が行われた後の試験細菌サンプル）中の培養培地中の生細菌（本明細書では「レポーター細胞」とも称する）の量に相関することを明らかにした。ＡＴＰ漏出の検出のためには、細菌は、最終サンプル中の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が少なくとも０．０００２、好ましくは少なくとも０．０００３、少なくとも０．０００５、少なくとも０．００１、少なくとも０．００５、少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．０１５、さらに好ましくは少なくとも０．１であるものを用いなければならない。最初に、本発明者らは、黒色のマイクロプレートを用いて、最終ＯＤ６００が０．３又は０．１５ではＡＴＰ漏出シグナルは許容できるが、最終ＯＤ６００が０．０１５ではＡＴＰ漏出シグナルは弱く、このようなマイクロプレートでは結果の信頼性が低く、最終ＯＤ６００が０．００１５ではＡＴＰ漏出のシグナルは非常に弱く使用できないことを見出した。白色マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、６５５０７５）を用いてスクリーニング法の感受性を向上させるための補助的なアッセイを行ったところ、本発明者らは、最終サンプル中の細菌濃度が非常に低くても、ＡＴＰ漏出シグナルが許容できる場合があることを見出した。本発明者らはゆえに、少なくとも０．０００２、好ましくは少なくとも０．０００３のＯＤ６００で、ＡＴＰ漏出シグナルが検出可能であることを見出した（図２５）。したがって、ステップａ）、ｂ）及びｃ）が行われた後の試験細菌サンプル中の生細菌のＯＤ６００は、少なくとも０．０００２、好ましくは少なくとも０．０００３、少なくとも０．０００５、少なくとも０．００１、少なくとも０．００５、少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．０１５、好ましくは０．０００２～０．５、０．０００３～０．５、０．０００５～０．５、０．００１～０．５、０．００５～０．５、０．０１～０．５、また０．０１５～０．５、０．０３～０．５、０．０５～０．５、又は０．１～０．５である。さらに、最終ＯＤ６００が０．３又は０．１５で得られる結果は特に満足できるものであるため、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様に従うと、最終サンプル中の生細菌のＯＤ６００は、０．１～０．３、又は０．１～０．２で構成される。好ましくは、最終サンプル中の生細菌のＯＤ６００は、０．１５である。

したがって、ステップａ）の試験細菌サンプル中の生細菌の初期ＯＤ６００（ステップｂ）及びｃ）を実行する前）は、０．０３より高く、好ましくは０．０５より高く、０．１より高く、より好ましくは０．３より高い。好ましくは、ステップｂ）で添加されるルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物及びステップｃ）で添加される候補組成物の体積は、（ステップｂ）及びｃ）の後の）最終体積が、試験細菌サンプルの初期体積の１．５～３倍、例えば２倍になる。この場合、ステップａ）の試験細菌サンプル中の生細菌の初期ＯＤ６００は、したがって、０．０００２より１．５～３倍（例えば、２倍）高く、好ましくは０．０００３より高く、０．０００５より高く、０．００１より高く、０．００５より高く、０．０１より高く、０．０１５より高く、より好ましくは０．０５より１．５～３倍（２倍など）高く、０．１より１．５～３倍（２倍など）高く、さらにより好ましくは０．１５より１．５～３倍高くする。ステップｂ）及びｃ）で添加される必要量と、ステップｄ）で培養される最終サンプル中の生細菌の目標最終ＯＤ６００に応じて、ステップａ）の最初の試験細菌サンプルの初期ＯＤ６００をどのようにするかは、当業者であれば容易に選択できるであろう。ステップｂ）及びｃ）における添加が、ステップａ）の試験細菌サンプルの初期体積の２倍である最終体積をもたらすとき、ステップａ）の試験細菌サンプル中の生細菌の初期ＯＤ６００は、好ましくは少なくとも０.０００４、少なくとも０．０００６、少なくとも０．００１、少なくとも０．００２、少なくとも０．０１、少なくとも０．０２、少なくとも０．０３、少なくとも０．１、より好ましくは０．２～０．６、又は０．２～０．４、最も好ましくは約０．３である。

本発明の文脈では、「６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）」という用語は、６００ｎｍの光学密度による細菌増殖の測定に関するものである。この測定は、吸光検出モードに基づき、基本的に、細菌のサンプルを通過する光の一部を測定する。溶液中の粒子は光を散乱させ、溶液中に粒子（細菌）が多く存在するほど、より多くの光が粒子によって散乱される。したがって、細菌の集団が複製されると、光の散乱が増大し、吸光度の測定値が増加する。同時にこれは、吸光モードが、吸収分子による光エネルギーの物理的な吸収を測定する代わりに、光散乱の程度を測定するためにのみ利用されることを意味する。ＯＤ₆₀₀は、このように光散乱を測定するものであり、ＯＤ₆₀₀値は、微生物の数に直接相関させることができる。

機械的及び化学的ストレスがないことが望ましい
さらに、本発明のスクリーニング方法は、好ましくは、生細菌の操作を避けることを強調することが重要である。特に、該方法は、好ましくは、生細菌の生理を撹乱する又は損傷を与える可能性のある化学的又は機械的な操作、すなわち、サンプル中の生細菌に化学的又は機械的ストレスを誘発する可能性のある操作を除外するものである。機械的・化学的ストレスは、殺細菌性化合物と同様に、細菌の構造、特に細菌膜とその機能にダメージを与える。そのため、以前に化学的及び／又は機械的ストレスが与えられた細菌の細胞を分析すると、測定された抗生物質化合物に対する細菌の感受性が人為的に高くなり、結果が歪んでしまう（図４参照）。

機械的ストレスは、例えば、細菌サンプルの移送や保存（例えば、氷上保存）、又は遠心分離に供する際に、サンプル中の生細菌を物理的に操作することによって生じるストレスと定義され得る。緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のようないくつかの株は、遠心分離に敏感であることが明らかに示されている（Gilbert et al., 1991, Centrifugation injury of Gram-negative Bacteria）。したがって、殺細菌性化合物のスクリーニング方法に使用する細菌に機械的ストレスを与えるステップを含めることは、信頼性の低い結果をもたらす原因となり得る。

化学的ストレスとは、細菌の培養培地中に、生細菌とその環境との生理的バランスを変化させる濃度の試薬を添加することによって、細菌の周囲の溶質濃度を急激に変化させ、細胞膜を通過する水の動きを急激に変化させる（すなわち、浸透圧ショックを与える）ことなどを指す。例えば、培養培地中に含まれる細菌を蒸留水中で強く希釈することは、Ｒａｕｌｉｎ ｄｅ ｌａ Ｒｏｙら（J. Biolumin. Chemilumin. 6, 193-201 (1991)）の知見のように、結果として浸透圧ショックが生じ、細菌の構造、特に細菌膜とその機能を変化させ、抗生物質化合物に対する細菌の測定感度を人為的に増加させる可能性が生じる。

したがって、本発明のスクリーニング方法の一実施形態によれば、ステップａ）において提供される試験サンプル中の生細菌は、ステップａ）の前に、特に２時間未満、好ましくは４時間未満、より好ましくは６時間未満、機械的又は化学的ストレスを受けていない。具体的には、ステップａ）において用意された試験サンプル中の生細菌は、好ましくは、遠心分離又は浸透圧ショックに供されていない。より具体的には、ステップａ）において提供される試験サンプル中の生細菌は、ステップａ）の前に、２時間未満、好ましくは４時間未満、より好ましくは６時間未満、遠心分離又は浸透圧ショックに供されていない。
より好ましい実施形態によれば、細菌サンプルは、本発明のスクリーニング方法の間、機械的又は化学的なストレスに供されない。

細菌の試験サンプルに含まれる細菌の種類
上記で示したように、本発明のスクリーニング方法の利点は、広範囲な細菌株及び増殖状態に対して殺細菌性化合物をスクリーニングできることである。一実施形態によれば、該試験サンプル中の生細菌は、多剤耐性細菌を含む抗生物質耐性細菌、病原性細菌、浮遊性細胞及びバイオフィルム中の細菌の細胞からなる群から選択される。
本発明の文脈において、「抗生物質耐性細菌」という表現は、抗生物質の殺細菌効果及び／又は静菌効果に打ち勝つ能力を発達させた細菌株を指す。その結果、細菌は、殺細菌性及び／又は静菌性化合物の存在下でも死滅せず、増殖し続ける。
抗生物質耐性細菌は、１種類以上の抗生物質に耐性を示し得る。複数の抗生物質に耐性を有する細菌は、「多剤耐性細菌」と呼ばれる。
本発明の文脈において、用語「病原性細菌」とは、生体、特に動物、より詳細には哺乳類、さらに詳細にはヒトの対象に、損傷及び／又は病理を引き起こし得るすべての細菌株を指す。
さらに、本明細書で使用する場合、「浮遊性細胞」という用語は、懸濁液中で自由に流動する細菌に関するものである。浮遊性細胞は、自己産生されたポリマーマトリックスに包まれ、不活性表面又は生活表面に付着した細菌細胞の構造化されたコミュニティとして定義され得る「バイオフィルムの細胞」とは対照的である。

いくつかの細菌属及び特にいくつかの細菌株は、特に医学的に興味深いものであり、したがって、本発明によるスクリーニング方法において好適に使用され得る。これらには、例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）によって定義される抗生物質耐性「優先病原体」のＥＳＫＡＰＥグループが含まれる。ＥＳＫＡＰＥは、以下のグラム陽性種及びグラム陰性種を設計するための頭字語である：エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、緑膿菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の各菌種。ＷＨＯはまた、ヒトの健康にとって最大の脅威となる１２科の細菌のカタログを公表している。これらは以下の通りである：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（クラリスロマイシン耐性）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）（フルオロキノロン耐性）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ）（フルオロキノロン耐性）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（セファロスポリン耐性、フルオロキノロン耐性）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ペニシリン非感受性）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（アンピシリン耐性）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）（フルオロキノロン耐性）。また、例えば、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、多くのレンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）など）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（緑膿菌など）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、大腸菌、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）などが興味深いものである。

他の細菌属／株は、（例えば、病原性がなく、高い安全性のバイオコンテインメントを必要としないため）特に操作が容易であり、また、本発明によるスクリーニング方法において好ましく用い得る（一旦このような細菌を用いて新しい殺細菌性化合物が確認されると、病原性の有無を問わず、他の細菌に対する殺細菌効果が確認され得る）。これらには、大腸菌の非病原性株、レンサ球菌属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、弱毒化サルモネラ属株が挙げられる。
いくつかの細菌は、多くの抗生物質に特に感受性が高く、例えばグラム陽性株のルテウス菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）のように、抗菌性スクリーニングに特に有用であり得る。

培養培地
上記のように、試験サンプルでは、生細菌が培養培地中に存在する。
該培養培地は、測定期間にわたって細菌細胞の生存能力を維持できるべきであるが、多くの異なる培養培地を使用することができ、当業者であれば、スクリーニング方法に用いる細菌レポーター細胞の種類に応じて、いずれの培地を選択できるかを理解するであろう。
特に、精製された化学物質（後述）をスクリーニングする場合には、富栄養培地（ルリアブロス（ＬＢ）、カチオン調整ミュラーヒントン（ＭＨ）など）、及びグルコースなどの炭素源が補充された最少培地（ＭＯＰＳ－グルコースなど）のいずれも用いることが可能である。

しかしながら、細菌上清のような複雑な混合物をスクリーニングする場合、グルコースなどの炭素源が補充された最少培地（ＭＯＰＳ－グルコースなど）が好ましくは使用されるであろう。このことは、本発明者らが驚くべきことに、富栄養培地（例えばルリアブロス（ＬＢ））と細菌上清との組み合わせが、細菌レポーター細胞（図１３及び１４を参照）がない場合であっても、ルシフェリンからのルシフェラーゼによるバイオルミネセンスの発生を誘発したが、この効果が、グルコースが補充された最少培地（ＭＯＰＳ－グルコースなど、図１５参照）を使用した場合には観察されないことを発見したことによるものである。

本発明の文脈において、「最少培地」とは、対象となる細菌の増殖に最低限必要なものを含む培地を指す。一般に、無機塩、炭素源、及び水のみを含む。グルコースなどの炭素源が補充される場合、本発明で使用され得る最少培地の例には、ＭＯＰＳ及びＭ９が含まれる。ＭＯＰＳ培地は、モルホリノプロパン酸スルホン酸カリウム、ハイドロリン酸カリウム、水及びチアミンの混合物を含み、好ましくは約ｐＨ７に調整され、これに他の成分（硫酸第一鉄、塩化アンモニウム、硫酸カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム）が添加される。培地の調製方法は、当業者であれば理解するであろう。本明細書に記載の最少培地（ＭＯＰＳ）は、Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ ２２９０ Ｂｅｒｔ Ｄｒｉｖｅ Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ ９５０２３ ＵＳＡから市販品を購入できる。Ｔｅｋｎｏｖａはまた、ＬＢなどの富栄養培地で得られるものと同様の高い増殖速度を再現するために濃縮された同じ最少培地を提供している。
最少培地を使用する場合、グルコースなどの炭素源が補充されることが好ましく、グルコースが０．４～２％含む濃度で使用される。

本発明において、「富栄養培地」とは、細菌が最大限の速度で増殖することができる培地を指す。一般に、最少培地の成分に加えて、さらなる成分、具体的には塩化ナトリウム、複合栄養素（ペプチドの混合物（トリプトン）及び酵母エキスなど）を含む。本発明で使用し得る富栄養培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）（溶原ブロス（ＬＢ）とも呼ばれる）、カチオン調整ミュラーヒントン（ＭＨ）などが挙げられる。ＬＢ培地は、主に細菌の増殖に使用される栄養豊富な培地である。その組成は、提供者によって若干異なる場合があるが、常に以下を含む：ペプチド及びカゼインペプトン、ビタミン（ビタミンＢを含む）、微量元素（窒素、硫黄、マグネシウムなど）及びミネラル。好ましい実施形態によれば、高い再現性のため、カチオン調整ミュラーヒントン（ＭＨ）培地が使用される。これは、細菌膜の重要な構成要素であるマグネシウム及びカルシウムの調整されたレベルを含む。これは、Ｍｅｒｃｋ社から市販されており、牛肉エキス、カゼイン及びデンプンの酸加水分解物を含む。

ステップｂ）：ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物の上記サンプルへの添加
「ルシフェラーゼ」とは、バイオルミネセンスを行う酸化酵素の総称である。ルシフェラーゼは、外部からの光源を必要としないが、基質となるルシフェリンの添加が必要である。ルシフェラーゼは、酸素分子とルシフェリンを結合させてオキシルシフェリンを形成する化学反応を促進させ、同時に光子を放出する。この反応は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）又はその特定のアナログ（ルシフェラーゼ及びデヒドロルシフェリンと弱く反応するジアデノシン四リン酸（Ａｐ４Ａ）など）によって提供されるエネルギーを必要とし（Garrido et al., J. Biochem. Biophys. Methods 30 (1995) 191-198）、光（バイオルミネセンス）を放出する。バイオルミネセンスは、ルシフェラーゼによって加水分解可能なＡＴＰ及びＡＴＰアナログの濃度に比例し、したがって、この濃度を測定することができる。したがって、ルシフェラーゼは、細胞生存率アッセイ又はキナーゼ活性アッセイにおいて、細胞のＡＴＰ及び特定のＡＴＰアナログのレベルを検出するために使用され得る。古典的に使用されるホタルルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として使用し、それは分子状酸素とＡＴＰ（又は上記のような特定のＡＴＰアナログ）を利用する反応でオキシルシフェリンに酸化され、５６０ｎｍの光を放出する。この反応の発生には、場合によってはマグネシウムイオンも必要となる（使用するルシフェラーゼ／ルシフェリンの特異的対に依存する）。酸素及びマグネシウムイオンは、ステップａ）で添加された細菌サンプル中に既に存在しているので、殺細菌性化合物によるＡＴＰとＡＴＰアナログの漏出を測定するためには、ステップｂ）で添加するのはルシフェラーゼ及びルシフェリンだけでよい。

本発明の文脈において、本発明者らは、まず、古典的に使用されているホタルルシフェラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ２２０６６として参照）を用いて、富栄養培地及び最少培地でＡＴＰ又はそのアナログを検出する能力を評価した。ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を含む富栄養培地（ルリアブロス（ＬＢ））又は最少培地（グルコースが補充されたＭＯＰＳ）にＡＴＰ又はそのアナログを添加すると、発光が誘発された。最初に、本発明者らは、富栄養ＬＢ培地では試薬の安定性が比較的高いと判断し、ホタルルシフェラーゼをＡＴＰシグナルの検出に使用できる可能性があると結論付けた。このアッセイは、２８℃で行った。しかしながら、同じ温度で、グルコースが補充された最少ＭＯＰＳ培地では、試薬は急速に失活し、得られたＡＴＰシグナルは不安定で、検出が困難であった。本発明者らは、通常細菌の増殖に使用される温度で、古典的に使用されるホタルルシフェラーゼがＡＴＰの高感度で信頼性の高い測定を可能にするか否かを決定するために、３７℃の富栄養培地及び最少培地で補足的なアッセイを実施した。図２４に示す結果は、３７℃では、従来のホタルルシフェラーゼを用いた最少培地及び富栄養培地での信頼できる高感度のＡＴＰ検出を得るのは最適でないことを示す。本発明者らは、驚くべきことに、この問題は、耐熱性ルシフェラーゼでは発生しないことを見出した。したがって、本発明のスクリーニング方法は、本方法のステップａ）において用意されたサンプルに添加される耐熱性ルシフェラーゼを使用する。

本発明の文脈において、用語「耐熱性ルシフェラーゼ」は、３０℃を超える温度での安定性が改善されたルシフェラーゼ酵素、特にホタルルシフェラーゼに関連する。特に、耐熱性ルシフェラーゼは、好ましくは、従来のルシフェラーゼと比較して、特にアクセッション番号ＡＡＡ２９７９５．１でＧｅｎＢａｎｋリリース２４３に公表されているフォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）の野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、３０℃超の温度、特に３７℃での活性が改善されている。ルシフェラーゼの耐熱性の向上は、ルシフェラーゼのアミノ酸配列に種々の変異を挿入したり、種々のルシフェラーゼの配列を組み合わせてキメラ体を作製したりすることにより得ることができる。例えば、キッコーマン社の耐熱性ルシフェラーゼは、フォティヌス・ピラリスルシフェラーゼとゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）ルシフェラーゼの耐熱性変異体との遺伝子キメラ化と、触媒性能向上のための変異との組み合わせによって作製されている（Hirokawa et al., Biochimica et Biophysica Acta 1597 (2002) 271- 279）。安定性が改善された数種類の変異ルシフェラーゼが開示されており（例えば、ＥＰ０５２４４４８、ＵＳ５２２９２８５Ａ及びＵＳ６０７４８５９（すべてキッコーマン株式会社）、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（ＮＬｕｃ）（Hall et al., ACS Chem Biol. 2012 Nov 16;7(11):1848-57. doi: 10.1021/cb3002478、England et al., Bioconjug Chem. 2016 May 18; 27(5):1175-1187. doi:10.1021/acs.bioconjchem.6b00112)参照）、本発明のスクリーニング方法において用いることができる。

本発明のスクリーニング方法の一実施形態によれば、耐熱性ルシフェラーゼは、キッコーマン株式会社製の耐熱性ホタルルシフェラーゼ（例えば、ＥＰ０５２４４８Ａ１又はＵＳ５２２９２８５に開示されているもの、ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００キットの耐熱性ホタルルシフェラーゼを含む）、又はＰｒｏｍｅｇａ社製のルシフェラーゼＮａｎｏｌｕｃ（「ＮＬｕｃ」ともいう）（Hall MP, Unch J, Binkowski BF, et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 2012;7(11):1848-1857. doi:10.1021/cb3002478参照、Ｎａｎｏｌｕｃの配列は図Ｓ６に開示されており、ＧｅｎＢａｎｋリリース２４３ＡＦ１７９２９０にアクセッション番号を有する）、又はスクリーニングに使用する培地で耐熱性の他のルシフェラーゼからなる群から選択される。特に、スクリーニングに使用する培地中でのルシフェラーゼの活性を試験する。好ましくは、耐熱性ルシフェラーゼは、キッコーマン株式会社からの耐熱性ホタルルシフェラーゼ（例えば、ＥＰ０５２４４４８Ａ１、ＵＳ５２２９８５Ａ又はＵＳ６０７４８５９に開示されているもので、ＵＳ６０７４８５９の配列番号７に対応する、ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００キットの耐熱性ホタルルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋリリース２４３ ＡＡＥ４３２５１．１のアクセッション番号を有する）にＴ２１９Ｉ及びＶ２３９Ｉの置換を追加したもの）、又はＰｒｏｍｅｇａ社製の改変ルシフェラーゼＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）である。

本発明のスクリーニング方法において、ルシフェラーゼの耐熱性は、有利には、数種類の培地で試験を行うことを可能にし、長期間の反応をモニタリングする際にルシフェラーゼの分解を防ぎ、調製時の酵素の取り扱いを容易にする。
本明細書において、「ルシフェリン」とは、バイオルミネセンスを生じさせる生物に存在する化合物であって、ルシフェラーゼによる酸化後に発光するものの総称として使用される。ルシフェリンは、通常、酵素触媒による酸化を受け、得られた励起状態中間体が基底状態に崩壊することで発光する。このようにルシフェリンは、ルシフェラーゼ酵素の基質となる低分子化合物である。ルシフェリン（Ｄ－ルシフェリン及びその誘導体、ＣｙｃＬｕｃ１、ＡｋａＬｕｍｉｎｅ－ＨＣｌなど、セレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔａｒａｚｉｎ）及びその誘導体、ジフェニルテラジン及びセレノテラジンなど、フリマジン）及びその誘導体／アナログ（例えば、Ｄ－ルシフェリン誘導体／アナログ：ＣｙｃＬｕｃ１及びＡｋａＬｕｍｉｎｅ－ＨＣｌ、コエレンタラジン誘導体／アナログ：ジフェニルテラジン及びセレンオテラジン）には、様々な種類がある。また、ルシフェリン誘導体／アナログも使用することができる。特に、ルシフェラーゼ変異体と反応して５９９、６０７、６７５、７０６ｎｍなどの５６０ｎｍ以外の波長で発光するルシフェリンアナログが作製されている（Jathoul et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2014 Nov 24;53(48):13059-63. doi: 10.1002/anie.201405955）。アナログのＡｋａＬｕｍｉｎｅ－ＨＣｌは、近赤外波長域（６７７ｎｍ）でバイオルミネセンスを生じさせる（Kuchimaru et al., Nat Commun. 2016 Jun 14;7:11856. doi: 10.1038/ncomms11856）。また他の新規ルシフェリンを操作されたルシフェラーゼと組み合わせた場合も、４６０ｎｍ（Hall et al., ACS Chem Biol. 2012 Nov 16;7(11):1848-57. doi: 10.1021/cb3002478）又は６７７ｎｍ（Yeh et al., Nat Methods.2017 Oct;14(10):971-974. doi: 10.1038/nmeth.4400）で光を生成する。したがって、様々なタイプのルシフェリン／ルシフェラーゼ反応を使用することができるが、これらの反応は、常に分子酸素及びＡＴＰ又はそのアナログの存在を必要とする。本発明で使用できるルシフェリンの例としては、ルシフェラーゼが耐熱性であれば、任意のルシフェリン－ルシフェラーゼ対におけるルシフェリンアナログが含まれる。フリマジン－Ｎａｎｏｌｕｃのような対の例は、Yeh et al., Nat Methods. 2017 Oct;14(10):971-974. doi: 10.1038/nmeth.4400の表１に記載されている。

本発明のスクリーニング方法に用いられるルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの組み合わせは、選択されたルシフェリンが、選択された耐熱性ルシフェラーゼにとって適切な、或いは最適な基質であるよう選択される。適切な（ルシフェリン／耐熱性ルシフェラーゼ）の組み合わせの例としては、（ホタルルシフェリン／耐熱性ホタルルシフェラーゼ）、フリマジン－Ｎｌｕｃルシフェラーゼ、フリマジン－Ａｎｔａｒｅｓルシフェラーゼ、ジフェニルテラジン（ＤＴＺ）－ｔｅＬｕｃ、ジフェニルテラジン（ＤＴＺ）－Ａｎｔａｒｅｓ２、セレンテラジン（ＳＴＺ）－ｙｅＬｕｃが挙げられる。

ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼを適切な比率で混合してなる溶液を含むキットは、当技術分野で入手可能である。そのようなキットの例としては、キッコーマン社から入手可能なＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００キット、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＮａｎｏｌｕｃが挙げられる。

ステップｂ）において添加されるルシフェリン及びルシフェラーゼの濃度又はストックルシフェリン及びルシフェラーゼ溶液の対応する希釈倍率は、候補組成物がステップｃ）においてさらに添加された後の最終濃度が、選択した市販のルシフェリン／ルシフェラーゼキットに付属する説明書に記載された推奨最終ルシフェリン及びルシフェラーゼ濃度のいずれかに対応するか、又はこの目的で当技術分野において既知の従来の方法を使用して選択されたルシフェリン／ルシフェラーゼの最適濃度に予備的測定に基づいて適合するよう、当業者が調整するであろう。

耐熱性ルシフェラーゼキット「ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００」（キッコーマン社）又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（ＮＬｕｃ）を使用する本発明のスクリーニング方法の好ましい実施形態（実施例に記載）において、ステップａ）～ｃ）が（すべての試薬を含む最終サンプルにおいて）行われた後のルシフェリンとルシフェラーゼの混合物は、キッコーマン社のキットから当技術分野及びメーカーのガイドラインに従って調製される最初のストック溶液と比較して６～９倍に希釈することが望ましい。

ステップｃ）：上記少なくとも１つのサンプルへの候補組成物の添加
培養培地中の生細菌を含むサンプルにルシフェリン／耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加するステップｂ）の後、ステップｃ）において候補組成物（殺細菌効果についてスクリーニングした少なくとも１つの化合物を含む）を添加する。
本発明の方法により、構造及び起源が異なる複数種の候補組成物をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法の一実施形態によれば、候補組成物は、精製された化合物である。この精製化合物は、化学化合物であっても生物学的化合物であってもよい。
本発明の文脈において、「精製化合物」とは、目的とする化学物質を夾雑物や汚染物質から物理的に分離して得られる化合物に関するものである。本発明の方法によってスクリーニングされた精製化合物は、公知の精製方法のいずれか１つによって得られ得る。精製化合物は、候補組成物の少なくとも９０％ｗ／ｗ、好ましくは少なくとも９５％ｗ／ｗ、少なくとも９６％ｗ／ｗ、少なくとも９７％ｗ／ｗ、少なくとも９８％ｗ／ｗ、又は少なくとも９９％ｗ／ｗを表す。

本明細書において、「化合物」という用語は、２種類以上の異なる原子（化学元素）が一定の化学量論的割合で存在する物質を意味する。本発明の方法によってスクリーニングされる化学化合物は、天然物由来、すなわち自然界にそのまま存在するものであっても、化学合成によって得られた人工的なものであってもよい。
本明細書で使用する場合、「生物学的化合物」という用語は、有機化合物、すなわち炭素を含む化合物を意味する。生物学的化合物は、生物から得られても、化学合成によって合成されてもよい。本発明の方法の好ましい実施形態では、候補組成物に含まれる生物学的化合物は、ＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ヘアピンＤＮＡ、線形又は環状ＤＮＡなどを含む任意のタイプのＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡなどを含む任意のタイプのＲＮＡ）、タンパク質（酵素、抗体、毒素など）、ペプチド、ホルモン、代謝物、微生物（ウイルス、特にファージを含む）、から選択され得る。本発明の方法の好ましい実施形態では、候補組成物に含まれる生物学的化合物は、ファージである。ここで、「ファージ」又は「バクテリオファージ」という用語は、細菌に感染し、細菌内で複製するウイルスに関するものである。
別の実施形態によれば、本発明の方法のステップｃ）において添加される候補組成物は、複合混合物、好ましくは細菌上清又は抽出物である。

本発明の文脈において、用語「細菌上清」は、細菌培養物の沈降、沈殿又は遠心分離によって堆積した固体状の細菌物質の上にある液体に関する。したがって、細菌上清は、培養培地に加えて、培養された細菌によって分泌された生成物を含む。さらに、用語「細菌抽出物」は、細菌培養物から１つ又は複数の細菌成分（タンパク質、脂質、代謝物及び／又は糖を含む）を抽出することによって得られる生成物に関するものである。好ましくは、細菌抽出物を本発明のスクリーニング方法に使用する場合、スクリーニングを開始する前に、抽出物中に存在する可能性のあるＡＴＰを加水分解する。この不活性化は、当該技術分野で知られている異なる様式で行うことができる。例えば、ＡＴＰは、細菌サンプルを３７～５０℃の温度で加熱することにより不活性化してもよい。当業者であれば、次の測定で試験される細菌抽出物の他の化合物を変化させることなく、ＡＴＰを不活性化するよう、加熱温度を決定することができるであろう。スクリーニングされた化合物を添加する前にサンプル中に存在するＡＴＰを不活性化するための別の方法としては、ＡＴＰを消化することができる酵素の使用が挙げられる。例えば、ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰをＡＤＰ（アデノシン二リン酸）に変換し、それをＡＭＰ（アデノシン一リン酸）に変換する）やアデノシン一リン酸デアミナーゼ（アミノ基を除去する）などが挙げられる。一般に、酵素によるＡＴＰの消化後、スクリーニング対象化合物を添加した後に放出されるＡＴＰを消化しないように、これらの酵素を被検サンプルから除去すべきである。そのためには、上記で開示したキッコーマン株式会社のキットで使用されているような界面活性剤を使用することができる。また、これらの酵素は、濾過により除去してもよい。タンパク質の濾過では、従来から用いられている任意の方法を用い得る。特に、上清の濾過には、本発明で使用する限外濾過装置（ＶｉｖａＳｐｉｎＴＭ ５００ ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を使用し得る。

本発明の方法の実施形態において、候補組成物は、ステップｃ）におけるその添加の前に、好ましくは最大１５０００ダルトン、好ましくは２０００～１５０００ダルトン、３０００～１００００ダルトン、４０００～８０００ダルトン、例えば５０００ダルトンで構成されるカットオフを有する膜を使用して濾過される。このような濾過ステップは、候補組成物が、細菌上清又は細菌抽出物のような複合混合物である場合に、特に有用である。実際、本発明者らは、細菌上清中に存在する大きな分子が、ルシフェラーゼがＡＴＰ又はそのアナログをバイオルミネセンスに変換する反応を妨害し、５０００Ｄａのカットオフを有する膜による細菌上清の以前の濾過が、ルシフェラーゼによるＡＴＰ又はそのアナログのバイオルミネセンスへの最適な変換を回復することを示している（図１９ｂを参照）。したがって、候補組成物が細菌上清又は細菌抽出物のような複合組成物である場合、ステップｃ）におけるその添加の前に、好ましくは最大１５０００ダルトンの、好ましくは２０００～１５０００ダルトン、３０００～１００００ダルトン、４０００～８０００ダルトン、例えば５０００ダルトンで構成されるカットオフを有する膜で濾過する。
いずれにしても、候補組成物が少なくとも１つの殺細菌性化合物を含む場合、ＡＴＰの漏出をもたらすと予想される濃度で添加されることが好ましい。

殺細菌性化合物とみなされる化合物は、一般に、少なくとも０．００２μｇ／ｍＬ、最大でも１０２４μｇ／ｍＬのＭＩＣを有する。したがって、候補組成物（特に精製された化合物を含むとき）は、好ましくは、ステップｃ）において、ステップｄ）における最終濃度（ルシフェリン及び耐熱性ルシフェラーゼの混合物と候補組成物の両方の試験細菌サンプルへの添加後）が少なくとも０．００２μｇ／ｍＬ、好ましくはステップｄ）の開始時における候補組成物の濃度が０．００２μｇ／ｍＬ～１０２４μｇ／ｍＬとなる濃度で、添加されるであろう。

好ましくは、ステップａ）、ｂ）及びｃ）が行われた後、生細菌、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び候補組成物について上記に開示された好ましい濃度を考慮して、
・生細菌のＯＤ６００は、少なくとも０．１であり、好ましくは０．１～０．３の間、より好ましくは０．１～０．２の間に含まれ、特に０．１５である。
・ルシフェリンの溶液は、ルシフェリンメーカーの推奨する濃度又は予備実験に基づいて最適な濃度に希釈される（キッコーマン社の「ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００」キット又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（ＮＬｕｃ）を使用する場合は６倍～９倍である）。
・耐熱性ルシフェリンの溶液は、ルシフェリンメーカーの推奨する濃度又は予備実験に基づいて最適な濃度に希釈される（キッコーマン社の「ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００」キット又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（ＮＬｕｃ）を使用する場合は６倍～９倍である）。及び／又は
・候補組成物の濃度は、少なくとも０．００２μｇ／ｍＬ、好ましくは０．００２μｇ／ｍＬ～１０２４μｇ／ｍＬである。

ステップｄ）：サンプルを２０～６０℃、好ましくは３５～３７℃でインキュベートし、リアルタイムでバイオルミネセンスを測定する（測定ステップ）
ステップｂ）及びｃ）の後、サンプルは次にステップｄ）の間、２０～６０℃（ルシフェラーゼの熱安定性パラメータと一致して選択する温度）、好ましくは３０～４０℃、より好ましくは３５～３７℃の温度でインキュベートされる。このような条件は、殺細菌性化合物の非存在下でサンプルの細菌を生存させるために実に適切な条件である。このようにして、候補組成物中の殺細菌性化合物の存在に起因するＡＴＰの漏出のみが検出される。これらの温度条件は、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施形態に従って使用される耐熱性ルシフェラーゼに対して最適であると考えられるが、温度は、各ルシフェラーゼの耐熱性パラメータと一致するよう適合させることが可能である。

このステップの間、バイオルミネセンスはリアルタイムで測定される。測定されるバイオルミネセンスの増加が検出されることは、ステップｃ）においてサンプルに添加された候補組成物が、殺細菌活性を有する少なくとも１つの化合物を含むことを示す。

バイオルミネセンスは、そのような測定を行うために当業者に知られている任意の手段によってリアルタイムで測定され得る。特に、バイオルミネセンスは、以下のいくつかの例のようなルミノメーターと呼ばれる器具の群から選択される手段によって測定され得る：単一管ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ Ｏｃｔａ、ＡＴＴＯ、Ｌｕｍａｔ ３、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｒｉｕｓ Ｌ、ＴｉｔｅｒＴｅｋ Ｂｅｒｔｈｏｌｄなど）、多管ルミノメーター（ＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ ９５３、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、リアルタイム培養用ルミノメーター（Ｋｒｏｎｏｓ Ｄｉｏ、ＡＴＴＯ）、ハイスループット型スクリーニングシステム（ＦＤＳＳ７０００ＥＸ、浜松）、特にマイクロタイタープレートを用いたリーダー（例えば、ＩｎｆｉｎｉｔｅＰｒｏ２００、ＴＥＣＡＮ、ＦＤＳＳ／ＲａｙＣａｔｃｈｅｒ、浜松、Ｐｌａｔｅ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ Ｖ、Ｈｉｄｅｘ、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、ＢｉｏＴｅｃ）など。

本明細書で使用する「リアルタイムで測定する」とは、時間の関数としてのシグナルの変化の記録を十分な時間分解能で提供するために、同じサンプルの複数の測定を所定の期間（測定期間）中に実施することを意味する。この期間は、２０分～１８０分、好ましくは２０分～６０分、より好ましくは１５分～４０分とし得る。測定期間の持続時間に応じて、個々のサンプルは、２０～２００回、より好ましくは２０～７５回、さらに好ましくは１５～５０回測定し得る。上記に示したように、本発明のスクリーニング方法の主な利点は、測定がリアルタイムで行われることである（すなわち、サンプルの複数の測定が短時間の間に行われ得、これにより、最大の検出感度、十分な時間分解能での、時間の関数としてのシグナルの変化の記録が得られ、測定値の信頼性が保証される）。１回の測定は、０．５～５秒の間、特に１～３秒の間、より特に１～２秒の間に含まれ得る。同じ個別のサンプルの２つの測定間の時間間隔は、１秒～１００秒の間、具体的には１秒～９０秒の間、より具体的には１０秒～８０秒の間又は１０秒～６０秒の間に含まれ得る。複数の個別サンプルからなるマイクロプレートと、すべてのマイクロプレートウェルを（すべて同時にではなく）順次に測定する測定装置を使用する場合、同じ個別サンプルの２つの測定間の時間間隔は、測定されるサンプルの総数に依存することになる。しかしながら、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏプレートリーダーにおいて、１回の測定と次のサンプルへの移動の持続時間は０．２秒より短くできないことを考慮すると、同じ個々のサンプルの２回の測定間の時間間隔は、完全な９６ウェルのマイクロプレートでは２０秒、３８４ウェルのマイクロプレートでは３０秒より短くすべきではない。これらのデータに基づいて、当業者は、他の種類のプレートリーダーが使用される場合、同じ個々のサンプルの２つの測定の間の時間間隔を計算することができるであろう。
一実施形態によれば、すべてのサンプルの２回の測定の間に、測定されたサンプルは、その内容物を均質化するために穏やかな撹拌に付される。撹拌のパラメータは、当業者が、自らの一般的な知識に基づいて、及び／又は、いくつかの従来の試験を行った後に、決定することができる。特に、撹拌のパラメータのうち、振とうの様式、振幅及び振動数を決定することが必要である。

一実施形態によれば、サンプルがマイクロプレート内にある場合、振とうのモードは、軌道振とう又は直線振とう、横方向振とう又はＸ－Ｙ軸振とうから選択され得る。撹拌の振幅は、０．１ｍｍ～１０ｍｍ、好ましくは１ｍｍ～５ｍｍ、より好ましくは、約３ｍｍで構成され得る。振動数は、５０ｒｐｍ～５００ｒｐｍ、好ましくは１００ｒｐｍ～３００ｒｐｍ、より好ましくは２００ｒｐｍ～２５０ｒｐｍから選択し得る。
本発明のスクリーニング方法の好ましい実施形態では、サンプルがマイクロプレート内にある場合、撹拌は以下のパラメータで行われる：振とうモード：軌道、振幅：３ｍｍ、振動数：２１８．３ｒｐｍ。
本発明者らは、十分な濃度の殺細菌性化合物の存在下で、ＡＴＰ又はそのアナログの漏出が数分以内に始まる可能性があることを示したことから、ステップｄ）は、好ましくは、ステップｃ）が行われた直後に、すなわち、候補組成物（又はいくつかの陰性及び陽性対照のそれぞれとしての培養培地又は既知の殺細菌性化合物）が細菌サンプル、ルシフェリン及び耐熱ルシフェラーゼの混合物に添加されるとすぐに開始される。

上記から明らかなように、本発明によるスクリーニング方法は、細菌サンプルを用意し（ステップａ））、さらなる成分を添加し（ステップｂ）及びｃ））、ステップｄ）において最終サンプルのインキュベーション中にリアルタイムでバイオルミネセンスを測定するだけである。したがって、本方法は、細菌サンプルに化学的（水中での過酷な希釈を行わない）又は機械的（遠心分離を行わない）ストレスを誘発するような細菌サンプルの取り扱いや、ＡＴＰ又はそのアナログを分解するような待機ステップを一切必要としない。このため、本発明のスクリーニング方法は、より迅速で、より高感度かつより信頼性の高いものとなる。

ステップの順序
まず、ステップａ）が行われる。
ステップｂ）及びｃ）は、ステップａ）の後、ステップｄ）の前に実施される。ただし、ステップａ）とｄ）の間に行うことを条件として、ステップｂ）とｃ）は（ルシフェリンと耐熱ルシフェラーゼの混合物と候補組成物が予め混合されていれば）、ステップｃ）の前にステップｂ）を、ステップｂ）の前にステップｃ）を、又はステップｂ）とｃ）を同時に行うなど、いかなる順序で行っても良い。

本発明の方法の好ましい実施形態によれば、ステップｃ）は、ＡＴＰ流出のリアルタイム測定を改善するために、ステップｂ）の後又はそれと同時に行われる。実際、ステップｃ）がステップｂ）の前に行われる場合、ルシフェラーゼ／ルシフェリンが添加される前にＡＴＰ流出が始まり、その結果、ＡＴＰ流出の初期段階が見逃される可能性がある。より好ましくは、ステップｃ）は、ステップｂ）の後、好ましくはステップｂ）の２～１５分後、より好ましくはステップｂ）の３～１０分後、さらに好ましくはステップｂ）の４～６分後、特に約５分後に実施される。ステップｂ）とｃ）の間のこの遅延は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン混合物が、細菌の培養物中に存在し得、それにより、ステップｄ）の間のバイオルミネセンスシグナルの最初の読み取りに影響を与えるかも知れないＡＴＰの痕跡を消費することを可能にする。

それにもかかわらず、ステップｂ）の前にステップｃ）を行う場合、ステップｂ）は、ステップｃ）の後できるだけ早く、例えば、ステップｃ）の後１分未満、好ましくは３０秒未満に行うべきである。

陰性及び陽性対照
スクリーニング方法の信頼性を向上させるために、該スクリーニング方法は、好ましくは、陰性及び／又は陽性対照サンプルにおけるバイオルミネセンスもリアルタイムで測定する。好ましくは、該方法は、特にステップｃ）の最後に、試験細菌サンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼとの混合物、及び候補組成物からなる一組のスクリーニングサンプルについて、以下について、さらにリアルタイムでバイオルミネセンスを測定する：
・試験菌サンプル、ルシフェリン及び耐熱性ルシフェラーゼの混合物を含むが、候補組成物も既知の殺細菌性組成物も含まない少なくとも１つの陰性対照サンプル、及び／又は
・試験菌サンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物、及び既知の殺細菌性組成物を含む、少なくとも１つの陽性対照サンプル。

陰性対照サンプルは、殺細菌効果のある化合物を含まないはずであるため、陰性対照サンプルでのバイオルミネセンスの測定がないことが予想され、実験が信頼できるものであり、かつ、候補組成物を含む任意のスクリーニングサンプルで測定されたバイオルミネセンスの増加が、実際に候補組成物における少なくとも１つの殺細菌性化合物の存在を示し、偽陽性の結果でないことを確認することができる。
陽性対照サンプルは、既知の殺細菌効果を有する化合物又はＡＴＰを含むと想定され、該陽性対照サンプルにおけるバイオルミネセンスの増加が期待されるため、実験が信頼できるものであり、かつ、候補組成物を含むスクリーニングサンプルで測定されたバイオルミネセンスの増加がないことは、実際に候補組成物に少なくとも１つの殺細菌性化合物がないことを示し、偽陰性の結果ではないと確認することができる。さらに、バイオルミネセンスの増加が陽性対照サンプルとスクリーニングサンプルの両方で測定される場合、両方のサンプルで測定されたバイオルミネセンスの比較は、試験濃度における候補組成物の殺細菌力についての考察を与えることとなる。

マイクロプレートでのスクリーニング方法の実施
好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、マイクロプレートで行われる。マイクロプレートのウェルにさらなる成分を同時に添加できる装置や、マイクロプレートバイオルミネセンスリーダーが当技術分野では多く存在するため、マイクロプレートを用いることは特に実用的であり、本方法を容易に自動化することが可能となる。
本実施形態において、マイクロプレートは、スクリーニング方法において古典的に使用される任意のマイクロプレートであり得る。特に、マイクロプレートは、プラスチック又はポリスチレンで製造され得る。さらに、マイクロプレートは、発光検出性を向上させるために、二酸化チタンを添加することにより白色に着色し得る。好ましい実施形態によれば、マイクロプレートは黒色又は暗色ではなく、より好ましくは、マイクロプレートは明色（例えば、ライトグレー、アイボリー、ライトベージュなど）であり、さらに好ましくは、マイクロプレートは白色である。明色のマイクロプレート（好ましくは白色）を使用すると、光を反射させ、一方、暗い色（黒色など）は放出された光の一部を吸収するため、試験サンプル中の細菌の最終ＯＤ６００に基づく感受性の観察された差を説明することができる。

本発明のスクリーニング方法に用いられるマイクロプレートは、スクリーニングする候補組成物の数に応じて、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６ウェルなど、様々な数のウェルを有することができる。該ウェルは、平底、丸底又はＶ字底を有し得る。各ウェルの総量（ウェルの上端まで）及び推奨作業体積（こぼれ落ちたり、ウェル間の汚染を防ぐために製造者が推奨する最大体積）は、マイクロプレートのウェル数によって異なるであろう。特に、９６ウェルマイクロプレートは一般的に２５μＬ～２００μＬの間に含まれる推奨作業体積を有し、３８４ウェルマイクロプレートは一般的に５μＬ～８０μＬの間に含まれる推奨作業体積を有する。

ほとんどの場合、多くの候補組成物がスクリーニングされることになり、したがって、本発明のスクリーニング方法に使用するための好ましいマイクロプレートは、９６又は３８４ウェルのような多数のウェルを有し、それぞれ２５μＬ～２００μＬ及び５μＬ～８０μＬの推奨作業体積／ウェルを有している。
好ましくは、ステップｃ）の終了時に、マイクロプレートは、
ｉ）試験細菌サンプル、ルシフェリンと熱性ルシフェラーゼの混合物、並びに候補組成物を含む少なくとも１つのスクリーニングウェル、
ｉｉ）試験菌サンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を含むが、候補組成物も既知の殺細菌性組成物も含まない少なくとも１つの陰性対照ウェル、及び／又は
ｉｉｉ）試験細菌サンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物、及び既知の殺細菌性組成物又はＡＴＰを含む、少なくとも１つの陽性対照ウェル
を含む。

好ましくは、マイクロプレートは、ステップｃ）の終了時に、上記で定義した少なくとも１つのスクリーニングウェルｉ）、上記で定義した少なくとも１つの陰性対照ウェルｉｉ）、及び上記で定義した少なくとも１つの陽性対照ウェルｉｉｉ）、を含む。また、マイクロプレートは、同じ成分を有する複数のウェルを含み得る。特に、候補組成物の殺細菌効果を様々な濃度で試験するため、及び／又は結果の信頼性を向上させるために同じ濃度で測定を再現する（二重又は三重）ために、細菌サンプルとルシフェリン及び耐熱ルシフェラーゼの混合物を含むいくつかの異なるウェルに同じ候補組成物を添加し得る。
別の実施形態によれば、本発明のスクリーニング方法は、超ハイスループットスクリーニングのためのマイクロ流体ツールにおいても実施し得る。

細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルの、既知の抗生物質の群に対する感受性を決定するための方法（抗生物質感受性の決定方法）
また、本発明者らは、本発明のスクリーニング方法の原理に基づいて、細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルの、既知の抗生物質の群に対する感受性をリアルタイムで決定する方法を開発した。この方法の目的は、試験サンプル中の病原性細菌に対して効率的な殺細菌効果を示す抗生物質を臨床的に迅速に決定することである。

したがって、第２の態様によれば、本発明は、細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルの、既知の抗生物質の群に対する感受性を決定するための方法であって、
ａ）細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルを培養培地に接種し、任意に、サンプル中の細菌を増幅させることと、
ｂ）ステップａ）の細菌サンプルを、試験される既知の抗生物質の数と少なくとも同数のサンプルとなるよう、いくつかのサブサンプルに分割することと、
ｃ）各サブサンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加することと、
ｄ）１つ又は複数のサブサンプルに既知の抗生物質の群のそれぞれを添加することと、
ｅ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物及び既知の抗生物質が添加されたサブサンプルを２０～６０℃（ルシフェラーゼの耐熱性パラメータと一致するよう選択された温度）、好ましくは３５～３７℃の温度でインキュベートし、バイオルミネセンスをリアルタイムで測定することと
を含み、
ステップａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）が実施された後のサブサンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２であり、
ステップｅ）においてサブサンプル中で測定されたバイオルミネセンスの増加は、対象に由来する細菌サンプルが、ステップｄ）においてサブサンプルに添加された既知の抗生物質の添加濃度に対して感受性であることを示す、方法に関する。

ステップａ）：細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルを培養培地に接種し、任意に、サンプル中の細菌を増幅させること
本発明の抗生物質感受性の決定方法のステップａ）は、細菌感染症に罹患している対象に由来する、予め得られたサンプルを用いて行われる。前記サンプルは、具体的には、血液サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、糞便サンプル、便サンプル、喀痰サンプル、気管支肺胞洗浄液サンプル、気管内吸引サンプル、口腔咽頭又は鼻咽頭サンプル、皮膚サンプル、傷サンプル、体液（例えば、脳脊髄液、胆汁液、胸水）、膣又は腹腔膿瘍分泌物又は組織サンプルであり得る。

ステップａ）では、前記サンプルを培養培地に接種する。前記培養培地は、試験中、細菌細胞の生存能力を維持できるものであることが好ましい。かかる培地は、当該技術分野において周知であり、特に、本発明のスクリーニング方法に関して定義され、上記で開示されたように、富栄養培地（カチオン調整ミュラーヒントン（ＭＨ）及び溶原ブロス（ＬＢ）等）、及びグルコースなどの炭素源が補充された最少培地（ＭＯＰＳ－グルコース等）が挙げられる。抗生物質感受性試験のための国際的なガイドラインにおける参照培地は、非選好性生物の試験のための非補充カチオン調整ＭＨブロス、及び選好性生物の試験のためのＭＨ－Ｆ（５％の機械的に脱線維したウマの血液と２０ｍｇ／Ｌのβ－ＮＡＤが補充されたカチオン調整ＭＨブロス）である。ＥＵＣＡＳＴは、欧州臨床微生物学・感染症学会（ＥＳＣＭＩＤ）と欧州疾病予防管理センター（ＥＣＤＣ）の後援のもと、定期的に更新されるガイドラインを提供している。

必要に応じて、サンプルに含まれる細菌は、本発明に従う殺細菌性化合物のスクリーニング方法の文脈で本明細書で開示するように、ステップｄ）の終了時（ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物と既知の抗生物質の両方を添加した後）の最終ＯＤ６００が、少なくとも０．０００２、好ましくは少なくとも０．０００３、少なくとも０．０００５、少なくとも０．００１、少なくとも０．００５、少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．０１５、好ましくは０．０００２～０．５、０．０００３～０．５、０．０００５～０．５、０．００１～０．５、０．００５～０．５、０．０１～０．５０．０１５～０．５、０．１～０．５、０．１～０．３、さらに好ましくは０．１～０．２、特に０．１５と、十分な６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）に達するよう増幅される。好ましくは、ステップｃ）及びｄ）において添加された体積が約２の希釈倍率をもたらす（すなわち、両方の添加後の体積が、ステップｂ）におけるサブサンプルの初期体積の約２倍である）とき、病原細菌は、ＯＤ６００が、少なくとも０．０００４、少なくとも０．０００６、少なくとも０．００１、少なくとも０．００２、少なくとも０．０１、少なくとも０．０２、少なくとも０．０３、好ましくは０．０００４～０．６、０．０００６～０．６、０．００１～０．６、０．００２～０．６、０．０１～０．６、０．０３～０．６、０．１～０．６、０．２～０．６、より好ましくは０．２～０．４、最も好ましくは約０．３に達するように増幅される。培養培地中の細菌の増幅は、当該技術分野において公知の任意の方法に従って行うことができる。

本発明のスクリーニング方法としての、抗生物質感受性決定方法は、好ましくは、試験サンプル中の病原性細菌に対して、その生理機能を乱したり、損傷を与えたりするような、化学的又は機械的操作、すなわち、サンプル中の生細菌に化学的又は機械的ストレスを誘発するような操作の一切を除外するものである。したがって、本発明の抗生物質感受性決定方法の一実施形態によれば、ステップａ）における試験サンプルの細菌は、特に細菌の構造及び／又は細菌膜及びその機能を損傷する可能性のある機械的（特に遠心分離）又は化学的（特に浸透圧ショック）ストレスに曝されていない。機械的ストレス及び化学的ストレスは、本発明のスクリーニング方法について上記で定義した通りである。

本発明の抗生物質感受性決定方法のいくつかの実施形態において、細菌サンプル中に存在する細菌の種類が未知であっても、これは本発明の抗生物質感受性決定方法の実施を妨げない。次いで、いくつかの異なるクラスの抗生物質が、細菌サンプルの感受性について試験され得る。

他の実施形態では、細菌サンプル中に存在する細菌のタイプ（種又は少なくとも属）は、他の分析方法から既知である。これは、細菌サンプル中に存在するタイプの非耐性細菌に対して有効であることが当該技術分野で知られている、特定のクラスの抗生物質の試験に有利であり得る。具体的には、細菌のいくつかの種及び属は、動物、より詳細にはヒトを含む哺乳動物における細菌感染症に特に関連することが知られており、特に医学的に興味深いものである。したがって、かかる細菌は、好ましくは、本発明による抗生物質感受性決定方法において試験され得る。これらには、例えば、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、結核菌、多くのレンサ球菌属（肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌など）及びシュードモナス属（緑膿菌など）、エンテロコッカス・フェカリス、大腸菌、ミラビリス変形菌、セラチア菌、シトロバクター・フロインディイなどが含まれる。また、世界保健機関（ＷＨＯ）が定義する抗生物質耐性「優先病原体」であるＥＳＫＡＰＥグループも非常に興味深い。ＥＳＫＡＰＥは、以下のグラム陽性種及びグラム陰性種を意味するための頭字語である：エンテロコッカス・フェシウム、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、エンテロバクター属の各菌種。ＷＨＯは、ヒトの健康にとって最大の脅威となる１２科の細菌のカタログを公表している。これらは以下の通りである：ヘリコバクター・ピロリ（クラリスロマイシン耐性）、カンピロバクター属（フルオロキノロン耐性）、サルモネラ属（フルオロキノロン耐性）、淋菌（セファロスポリン耐性、フルオロキノロン耐性）、肺炎レンサ球菌（ペニシリン非感受性）、インフルエンザ菌（アンピシリン耐性）、赤痢菌属種（フルオロキノロン耐性）。

ステップｂ）：ステップａ）の細菌サンプルを、試験される既知の抗生物質の数と少なくとも同数のサンプルとなるよう、いくつかのサブサンプルに分割すること
本発明の抗生物質感受性決定方法のステップｂ）では、ステップａ）の細菌サンプルをいくつかのサブサンプルに分割し、その数は試験される既知の抗生物質の数に少なくとも相当する。すべてのサブサンプルは、好ましくは同量の培養培地を含み、少なくとも０．１、好ましくは０．１５～０．５、より好ましくは約０．３の同じＯＤ６００を有する。

ステップｃ）：各サブサンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加すること
本発明の抗生物質感受性決定方法は、本発明のスクリーニング方法と同じ原理、すなわち、殺細菌性化合物に曝された細菌が漏出したＡＴＰ又はそのアナログをルシフェラーゼによってバイオルミネセンスに変換することに基づいて行われるものである。したがって、本発明の第２の態様による抗生物質感受性決定方法においても、本発明のスクリーニング方法の文脈で上述したのと同じ耐熱性ルシフェラーゼ及びルシフェリンを、同じ条件で使用し得る。
本発明の感受性検出方法の一実施形態によれば、ステップｄ）の前に、短いプレインキュベーションステップ（３～１０分、例えば３、４、５、６、７、８分、特に４～６分、好ましくは５分）を、インキュベーション温度に徐々に達するように、かつ（抗生物質の添加前にルシフェラーゼによる変換によって）既に存在している可能性のある細胞外ＡＴＰを除去するために、実施する。

ステップｄ）：少なくとも１つのサブサンプルに既知の抗生物質の群のそれぞれを添加すること
ステップｃ）でルシフェリン／耐熱性ルシフェラーゼを添加した後、ステップｄ）において、細菌サンプルの感受性を決定するために、少なくとも１つのサブサンプルに試験された既知の抗生物質の群の各抗生物質を添加する。
少なくとも一部の細菌（すなわち、非耐性細菌）に対して殺細菌効果（すなわち、細菌を殺す感受性）を有することが知られている任意の抗生物質は、感受性について試験され、したがってステップｄ）において少なくとも１つのサブサンプルに添加され得る。好ましくは、感受性のために試験される抗生物質は、以下からなる群から選択される既知の殺細菌性抗生物質である：
・アミノグリコシド系（ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ネチルミシンなど）。
・ペナム系（ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリンなど）を含むβラクタム系、カルバペナム系、クラバム系（クラブラン酸など）、ペネム系、カルバペナム系、セフェム系（セファレキシン、セフポドキシムなど）、カルバセフェム系、オキサセフェム系、モノバクタム系。
・フルオロキノロン系を含むキノロン系（オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシンなど）。
・ポリペプチド（ポリミキシンＢなど）；糖ペプチド及びリポ糖ペプチド（バンコマイシン、テイコプラニン、オリタバンシン、ダルババンシン、テラバンシンなど）。
・トリメトプリム単独又はスルファメトキサゾールとの併用
トリメトプリムは、富栄養培地において殺細菌性を示す。２００μｇ／ｍＬ以上超の濃度では、この薬剤がルシフェラーゼ反応を阻害することを発明者らが見出したことから、この抗生物質による結果は注意して分析する必要がある。
・オキサゾリジノン系、リネゾリド（通常静菌剤に分類されるが、殺細菌作用を有することがある）、テディゾリド。
・マクロライド系では、エリスロマイシン、テリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシンが殺細菌・静菌作用を有すると報告されている。

公知の殺細菌性抗生物質のうち、本発明の抗生物質感受性判定方法によって細菌サンプルの感受性が決定される抗生物質が選択される好ましいリストとしては、以下のものが挙げられる：アモキシシリン、アモキシシリン－クラブラン酸、アンピシリン、チカルシリン、ピペラシリン－タゾバクタム、エルタペネム、セフォキシチン、セフィキシム、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフタジジム、ゲンタマイシン、アミカシン、ナリジクス酸、オフロキサシン、シプロフロキサシン、ホスホマイシン及びトリメトプリム－サルファメトキサゾール。

一実施形態によれば、本発明の感受性判定方法はまた、既知の抗生物質の組み合わせの感受性を判定するためにも実施し得る。例えば、かかる抗生物質の組み合わせは、１つ又は複数の細菌によって引き起こされる疾患を治療するために通常組み合わせて使用される（同時に又は順次投与される）抗生物質に対応するものである。

また、あまり好ましくはないが、本発明の抗生物質感受性検出方法は、少なくとも一部の細菌に対して静菌効果を有することが知られている抗生物質（すなわち、細菌を殺すことなく、細菌の成長及び増殖を阻止する抗生物質）の試験にも実施することができる。実際、本発明者らによって得られたデータは、静菌性化合物の存在下で細菌によってＡＴＰ又はアナログが漏出しないことを示しているが、一部の化合物は、低濃度で静菌性、高濃度で殺細菌性である可能性がある。少なくとも一部の細菌には静菌性を示すことが知られている抗生物質が、別の細菌株や高濃度では殺細菌性を示すことがある。本発明の抗生物質感受性決定方法において試験され得る、主に静菌剤として知られるそのような抗生物質は、具体的には、マクロライド系（アジスロマイシン、エリスロマイシン、テリスロマイシン、ロキシスロマイシンなど）、オキサゾリジノン系（リネゾリドなど）、スルホンアミド系、テトラサイクリン系（ドキシサイクリンなど）からなる群から選択され得る。

ステップｄ）の終了時（すなわち、反応の全成分が添加された後）、各サブサンプル中の試験済み抗生物質の最終濃度は、２倍連続希釈（２０の値）として、好ましくは０．００２μｇ／ｍＬ～１０２４μｇ／ｍＬの間に含まれる。簡略化のため、２倍連続希釈によって得られる濃度の範囲は、使用する培養培地中の既知の感受性細菌株に対する既知の抗生物質のＭＩＣの１／５００～１０００／１、好ましくは１／４～４／１で構成することができ、１０２４μｇ／ｍＬ未満とすることが好ましい。様々な培養培地における既知の抗生物質のＭＩＣは、当技術分野で周知であるか、又は当業者によるルーチン的な実験によって容易に決定することができる。

好ましくは、ステップｄ）の終わりに（すなわち、反応の全成分が添加された後に）：
・生細菌のＯＤ６００は、少なくとも０．１であり、好ましくは０．１～０．３、より好ましくは０．１～０．２、特に０．１５で構成する。
・ルシフェリンの溶液は、ルシフェリンメーカーの推奨する濃度又は予備実験に基づいて最適な濃度に希釈される（キッコーマン社の「ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００」キット又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（ＮＬｕｃ）を使用する場合は６倍～９倍である）；
・耐熱性ルシフェリンの溶液は、ルシフェリンメーカーの推奨する濃度又は予備実験に基づいて最適な濃度に希釈される（キッコーマン社の「ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００」キット又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（ＮＬｕｃ）を使用する場合は６倍～９倍である）；及び／又は
・既知の抗生物質の濃度は、０．００２μｇ／ｍＬ～１０２４μｇ／ｍＬ、好ましくは、使用する培養培地中の既知の感受性細菌株に対する既知の抗生物質のＭＩＣの１／４～４／１であり、好ましくは１０２４μｇ／ｍＬ未満に維持される。
上記のルシフェリン及びルシフェラーゼ溶液の希釈の値は、ルシフェリン／ルシフェラーゼキットに付属の説明書によって、調整することができる。

ステップｅ）：撹拌下、２０～６０℃、好ましくは３５～３７℃の温度でサブサンプルをインキュベートし、リアルタイムでバイオルミネセンスを測定すること（測定ステップ）
サブサンプルを２０～６０℃（ルシフェラーゼの耐熱性パラメータと一致して選択される温度）、好ましくは３０～４０℃、より好ましくは３５～３７℃で撹拌下でのインキュベートにより、リアルタイムでバイオルミネセンスを測定することを含む、本発明の抗生物質感受性決定方法の測定ステップｅ）は、本発明のスクリーニング方法の測定ステップｄ）に対応する。

したがって、スクリーニング方法の測定ステップｄ）について上記で提供されたすべての技術的特徴及び技術的定義は、本発明の抗生物質感受性決定方法の測定ステップｅ）に適用され得る。
特に、バイオルミネセンスは、前述したようにリアルタイムで測定される。サブサンプルで測定されるバイオルミネセンスの増加は、対象に由来する細菌サンプルが、ステップｃ）においてサブサンプルに添加された既知の抗生物質の添加濃度に対して感受性であることを示す。

ステップの順序
ステップａ）を第一に行い、ステップｂ）を第二に行う。
ステップｃ）とｄ）は、ステップａ）とｂ）の後、かつステップｅ）の前に実施される。ただし、ステップｂ）とｅ）の間に行うことを条件として、ステップｃ）とｄ）は、（ルシフェリンと耐熱ルシフェラーゼと既知の抗生物質の混合物が予め混合されていれば）ステップｄ）の前にステップｃ）を、ステップｃ）の前にステップｄ）を、又はステップｃ）とｄ）を両方同時に行うなど、いずれの順序で行っても良い。

本発明の方法の好ましい実施形態によれば、ステップｄ）は、ＡＴＰ流出のリアルタイム測定を改善するために、ステップｃ）の後又はそれと同時に行われる。実際、ステップｄ）がステップｃ）の前に行われる場合、ルシフェラーゼ／ルシフェリンが添加される前にＡＴＰ流出が始まり、その結果、ＡＴＰ流出の初期段階が見逃される可能性がある。好ましくは、ステップｄ）は、ステップｃ）と同時に、又はステップｃ）の後に実施される。より好ましくは、ステップｄ）は、ステップｃ）の後、好ましくはステップｃ）の２～１５分後、より好ましくはステップｃ）の３～１０分後、さらに好ましくはステップｃ）の４～６分後、特にステップｃ）の約５分後に実施される。ステップｃ）とｄ）の間のこの遅延は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン混合物が、細菌の培養物中に存在し得、それにより、ステップｄ）の間のバイオルミネセンスシグナルの最初の読み取りに影響を与えるかも知れないＡＴＰの痕跡を消費することを可能にする。
それにもかかわらず、ステップｃ）の前にステップｄ）を行う場合、ステップｃ）は、ステップｄ）の後できるだけ早く、例えば、ステップｄ）の後１分未満、好ましくは３０秒未満に行うべきである。

陰性及び陽性対照
抗生物質感受性決定方法の信頼性を向上させるために、上記抗生物質感受性決定方法はまた、陰性及び／又は陽性対照サンプルにおけるバイオルミネセンスをリアルタイムで測定することも好ましい。
陰性対照サンプルの第１のタイプは、ステップｄ）の終わり（すなわち、インキュベーション及びリアルタイムバイオルミネセンス測定の直前）に、細菌サブサンプルの代わりに培養培地、ルシフェリンと耐熱ルシフェラーゼの混合物、及び既知の抗生物質を含むサンプルである。実際、細菌のサンプルがない場合、バイオルミネセンスは期待できない。
陰性対照サンプルの第２のタイプは、ステップｄ）の終わり（すなわち、インキュベーション及びリアルタイムバイオルミネセンス測定の直前）に、細菌サブサンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物の代わりに培養培地、及び既知の抗生物質を含むサンプルである。実際、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物がない場合、バイオルミネセンスは期待できない。
陰性対照サンプルの第３のタイプは、ステップｄ）の最後（すなわち、インキュベーション及びリアルタイムのバイオルミネセンス測定の直前）に、細菌サブサンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物、及び既知の抗生物質の代わりに培養培地を含むサンプルである。実際、抗生物質がない場合、バイオルミネセンスは期待できない。
既知の抗生物質に対する細菌サンプルの感受性が不明であるので、従来の陽性対照（細菌に対して殺細菌的であることが知られている化合物を用いたもの）は不可能である。代わりに、例えば純粋なＡＴＰを用いた代替的な陽性対照を任意に使用し得る。この場合、ＡＴＰは抗生物質の代わりに添加され、バイオルミネセンスの測定はその直後に行われる。当業者であれば、製造業者のガイドライン（例えば５～５０ｎＭの範囲）から、使用すべきＡＴＰの濃度を知ることができるであろう。

マイクロプレートによる抗生物質感受性決定方法の実施
また、本発明の抗生物質感受性決定方法の場合、マイクロプレートを用いて行うことが好ましく、このマイクロプレートは、スクリーニング方法に関する上記の項で述べた任意の特徴又は特徴の組み合わせを有し得る。

この場合、本発明の抗生物質感受性決定方法のステップｂ）では、ステップａ）の細菌サンプルをいくつかのサブサンプルに分割し、その数は少なくとも試験すべき既知の抗生物質の数に対応し、マイクロプレートのいくつかの異なるウェルに分注される。ここでも、すべてのサブサンプルは好ましくは同じ体積の培養培地を含み、同じＯＤ６００を有する（反応のすべての成分が添加された後の最終ＯＤ６００が、少なくとも０．０００２、好ましくは少なくとも０．０００３、少なくとも０．０００５、少なくとも０．００１、少なくとも０．００５、少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．０１５、より好ましくは０．０００２～０．５、０．０００３～０．５、０．０００５～０．５、０．００１～０．５、０．００５～０．５、０．０１～０．５、０．０１５～０．５、０．１～０．５、０．１～０．３、さらに好ましくは０．１～０．２、特に約０．１５となるよう計算される）。第１のタイプの陰性対照を有するために、マイクロプレートの一部のウェルは、細菌を含まない培養培地で分注され得る。

ステップｃ）では、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を、細菌サブサンプルを含むマイクロプレートのウェルに、任意で、細菌を含まない培養培地を含むマイクロプレートのウェルに分注する。第２の陰性対照を有するために、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合液の代わりに、予め細菌のサブサンプルを分注したマイクロプレートのいくつかのウェルに培養培地を分注し得る。

ステップｄ）では、細菌サンプルの感受性を試験する抗生物質を、異なるマイクロプレートのウェルに添加する。同じ抗生物質を複数の異なるウェルに添加してよいのは、異なる濃度の抗生物質に対する細菌サンプルの感受性を試験し、及び／又は測定を再現し（二重又は三重）、結果の信頼性を向上させるためである。同様に、同じ陰性対照を有するいくつかのウェルを、マイクロプレート内に存在させてもよい（例えば、二重又は三重）。第３のタイプの陰性対照を有するために、細菌サブサンプルとルシフェリン及び耐熱性ルシフェラーゼの混合物を予め分注したマイクロプレートのいくつかのウェルに、既知の抗生物質の代わりに培養培地を分注し得る。
マイクロプレートは、上記に開示したように、陽性対照サンプルからなる１つ又は複数のウェルを含み得る。

殺細菌性化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の評価方法（ＭＩＣ評価方法）
本発明者らはまた、ルシフェラーゼとＡＴＰ又はそのアナログとの反応をリアルタイムにモニタリングすることにより、抗生物質濃度を変化させつつ、抗生物質の添加からＡＴＰの流出の検出までのタイムラグを測定することにより、与えられた細菌サンプルに対する化合物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を評価することが可能となることを明らかにした。
本発明の文脈において、用語「最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）」は、一晩インキュベートした後に微生物の目に見える増殖を抑制することができる抗菌化合物の最低濃度を意味する。
したがって、第３の態様によれば、本発明は、以下を含む殺細菌性化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を評価するための方法に関する：
ａ）６００ｎＭの光学密度（ＯＤ６００）が少なくとも０．０００２である、培養培地中の生細菌を含む少なくとも１つの試験細菌サンプルを提供することと、
ｂ）ステップａ）の細菌サンプルをいくつかのサブサンプルに分割することと、
ｃ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を該サブサンプルに添加することと、
ｄ）該サブサンプルに様々な濃度の殺細菌性化合物を添加することと、
ｅ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物及び殺細菌性化合物が添加されたサブサンプルを２０～６０℃（ルシフェラーゼの耐熱性パラメータと一致して選択される温度）、好ましくは３５～３７℃でインキュベートし、リアルタイムでバイオルミネセンスを測定することであって、ステップａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）が行われた後のサブサンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２、好ましくは０．１５である、測定することと、
ｆ）試験された殺細菌性化合物の各濃度について、殺細菌性化合物が添加された時点と、バイオルミネセンスシグナルの増加が検出された時点との間のラグタイムを決定することと、
ｇ）殺細菌性化合物濃度の関数としてラグタイムを表すことと、
ｈ）殺細菌性化合物濃度の関数として、ラグタイムの測定点にフィットする指数関数的減衰曲線を作成することと、
ｉ）指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトーにおける最低の殺細菌性化合物濃度を決定することと、
ｊ）指数関数的減衰フィッティング曲線のラグタイム振幅を決定することと、
ｋ）ＭＩＣを評価することであって、ＭＩＣが、
・ 指数関数的減衰フィッティング曲線上で、（プラトーでのラグタイム＋０．３×ラグタイム振幅）に等しいラグタイムに対応する抗生物質濃度と、
・ 指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトーにおける最低の殺細菌性化合物濃度と
の間に含まれるとして評価されること。

ステップａ）からｅ）
本発明のＭＩＣ評価方法のステップａ）～ｅ）は、本発明の抗生物質感受性決定方法のステップａ）～ｅ）に対応し、同様に実施される。特に、本発明のＭＩＣ評価方法においては、上記殺細菌性化合物が添加された時点と、バイオルミネセンスシグナルの増加が検出された時点との間のラグタイムを決定できるように、測定ステップｅ）は、好ましくは、ステップｄ）が行われた直後に、すなわち、細菌サブサンプル、ルシフェリン及び耐熱ルシフェラーゼの混合物に殺細菌性化合物が添加された直後に開始される。
ステップａ）を第一に行い、ステップｂ）を第二に行う。
ステップｃ）とｄ）は、ステップａ）とｂ）の後、かつステップｅ）の前に実施される。ただし、ステップｂ）とｅ）の間に行うことを条件として、ステップｃ）とｄ）は、（ルシフェリンと耐熱ルシフェラーゼと既知の抗生物質の混合物が予め混合されていれば）ステップｄ）の前にステップｃ）を、ステップｃ）の前にステップｄ）を、又はステップｃ）とｄ）を両方同時に、行うなど、いずれの順序で行っても良い。

本発明の方法の好ましい実施形態によれば、ステップｄ）は、ＡＴＰ流出のリアルタイム測定を改善するために、ステップｃ）の後又はそれと同時に行われる。実際、ステップｄ）がステップｃ）の前に行われる場合、ルシフェラーゼ／ルシフェリンが添加される前にＡＴＰ流出が始まり、その結果、ＡＴＰ流出の初期段階が見逃される可能性がある。好ましくは、ステップｄ）は、ステップｃ）と同時に、又はステップｃ）の後に実施される。より好ましくは、ステップｄ）は、ステップｃ）の後、好ましくはステップｃ）の２～１５分後、より好ましくはステップｃ）の３～１０分後、さらに好ましくはステップｃ）の４～６分後、特にステップｃ）の約５分後に行われる。ステップｃ）及びｄ）の間のこの遅延は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン混合物が、細菌の培養物に存在し得、それにより、ステップｄ）の間のバイオルミネセンスシグナルの最初の読み取りに影響を与え得るＡＴＰの痕跡を消費することを可能にする。

それにもかかわらず、ステップｃ）の前にステップｄ）を行う場合、ステップｃ）は、ステップｄ）の後できるだけ早く、例えば、ステップｄ）の後１分未満、好ましくは３０秒未満に行うべきである。

ステップｆ）：試験された殺細菌性化合物の各濃度について、殺細菌性化合物が添加された時点と、バイオルミネセンスシグナルの増加が検出された時点との間のラグタイムを決定すること
本発明の文脈では、用語「ラグタイム」は、２つの関連する事象間の期間、ここでは、殺細菌性化合物の添加時からバイオルミネセンスの増加が最初に検出されるまでの時間に関連する。
本発明者らは、殺細菌性化合物を添加してから、ＡＴＰ又はそのアナログの漏出のルシフェラーゼによる変換によるバイオルミネセンスの増加が最初に検出されるまでに遅延があり、この遅延が殺細菌性化合物の濃度が高くなると短くなることを観察した。
殺細菌性化合物の添加時間は既知である。ステップｅ）において、同じ殺細菌性化合物の様々な濃度についてバイオルミネセンスを測定した後、各濃度について得られたバイオルミネセンス曲線を解析し、各曲線において、バイオルミネセンスの増加が最初に検出される時間を決定する。バイオルミネセンス曲線において、この時間は、シグナルが前の時点と比較して増加し、この増加が継続する動力学の最初の時点に対応し、殺細菌性抗生物質の効果による急激な増加を示している。より正確には、場合によっては、ベースラインが動態の初期にわずかに増加することがあるため、最初の増加を主な特徴的なピークとみなすべきである。この時点は、目視又は数学的解析によって特定することができる。曲線の解析は、ノイズ除去（フーリエ変換、指数平滑化、移動平均など）により、遅延を正確に定義することができる。このような解析は、例えばＥｘｃｅｌ Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）を使用して行うことができる。
そして、殺細菌性化合物を添加した時刻を、最初にバイオルミネセンスの増加が検出された時刻から差し引くことで、試験した各濃度の殺細菌性化合物について得られたラグタイムを算出する。

ステップｇ）：殺細菌性化合物の濃度の関数としてラグタイムを表すこと
ステップｇ）において、殺細菌性化合物の試験濃度を変化させて得られたラグタイムを、試験された殺細菌性濃度の関数で模式的に表すことができる。ｘ軸に添加した殺細菌性化合物の濃度（μｇ／ｍＬ）、ｙ軸にステップｆ）で決定したラグタイム、をとってグラフを作成する。グラフには、試験した殺細菌性化合物の濃度の数と同数の実験点を表記する。

ステップｈ）：殺細菌性化合物濃度の関数として、ラグタイムの測定点にフィットする指数関数的減衰曲線を作成すること
すべての試験された殺細菌性化合物（実施例、特に図２２～２３参照）について、本発明者らは、試験された殺細菌剤の濃度の関数でラグタイムを表すグラフの様々な点が、指数減衰曲線によってフィットされ得ることを見出した。
具体的には、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍやＥｘｃｅｌ Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）などのソフトウェアに各実験点のｘ、ｙ座標を入力し、単一の指数関数的減衰フィット関数を選択してフィットを行えばよい。フィットの品質を示すパラメータを判定する必要がある。フィットの結果、シグナルのプラトーの値やラグタイムの振幅（スパン）にアクセスすることができる。これらのパラメータは、ＭＩＣの評価に必要である。

ステップｉ）：指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトーにおける最低の殺細菌性化合物濃度を決定すること
プラトーは、殺細菌性化合物の濃度がさらに上昇してもラグタイムがそれ以上減少しない限界を示す。指数関数的減衰曲線では、プラトーは曲線の水平な部分に相当する。プラトーは、フィットの結果パラメータに記載される。
実験点の１つ又は複数が、指数関数的減衰曲線のプラトー部に位置し得る。指数関数的減衰曲線のプラトー部に１つの実験点のみが位置する場合、この点の殺細菌性化合物濃度を、指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトー部における最低の殺細菌性化合物濃度とする。指数関数的減衰曲線のプラトー部に複数の実験点が位置する場合、殺細菌性化合物の濃度が最も低い点を選択し、この点の殺細菌性化合物の濃度を指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトー部における最低の殺細菌性化合物濃度として採用する。

ステップｊ）：指数関数的減衰フィッティング曲線のラグタイム振幅を決定すること
「ラグタイム振幅」は、指数関数的減衰のフィット曲線のｙ軸との切片におけるラグタイムの値と、指数関数的減衰のフィット曲線のプラトー部におけるラグタイムの値との差と定義される。ラグタイムの振幅（スパン）は、フィットの結果パラメータに記載される。

ステップｋ）：ＭＩＣ濃度の評価
この最終ステップでは、殺細菌性化合物のＭＩＣ濃度が、
・指数関数的減衰フィッティング曲線上で、（プラトーでのラグタイム＋０．３×ラグタイム振幅）に等しいラグタイムに対応する抗生物質濃度と、
・上記手順ｉ）で決定された、指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトーにおける最低の殺細菌性化合物濃度と
の間に含まれるとして評価される。

材料及び方法
細菌株及び増殖条件
大腸菌ＭＧ１６５５及びルテウス菌を、抗生物質感受性試験に使用した。培養は、富栄養ルリアブロス（ＬＢ）（１０ｇ ＮａＣｌ、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス／Ｌ）又は０．４％グルコース補充ＭＯＰＳ最少培地で３７℃にて実施した。黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００株は、トリプティックソイブロス（０．２５％グルコース添加）中で３７℃にて培養した。

抗生物質及び試薬
ネオマイシン（Ｎ６３８６）、アプラマイシン（Ａ２０２４）、アジスロマイシン（ＰＨＲ１０８８）、カナマイシン（Ｋ１３７７）、スペクチノマイシン（Ｓ４０１４）、アンピシリン（Ａ９５１８）、テトラサイクリン（Ｔ７６６０）、ストレプトマイシン（Ｓ９１３７）、セファレキシン（Ｃ４８９５）、ポリミキシンＢ（Ｐ４９３２）、エリスロマイシン（Ｅ６３７６）、プロマイシン（Ｐ７２５５）、オフロキサシン（Ｏ８７５７）、アモキシシリン（３１５８６）、アミカシン（ＰＨＲ１６５４）、セフィキシム（ＣＤＳ０２１５９０）、セフォキシチン（Ｃ４７８６）、セフタジジム（ＣＤＳ０２０６６７）、セフトリアキソン（Ｃ５７９３）、シプロフロキサシン（ＰＨＲ１１６７）、ホスホマイシン（Ｐ５３９６）、ニトロフラントイン（４６５０２）、ピペラシリン（９３１２９）、スルファメホキサゾール（３１７３７）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。クロラムフェニコール（０１８０４３）は、Ｅｕｒｏｂｉｏ社から購入した。３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ、Ｍ３１８３）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。グルコース（２４３７９．２９４）は、ＶＷＲ ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手した。Ｂａｃｔｏ（商標）トリプトン（２１１７０５）及びＢａｃｔｏ（商標）イーストエキスは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社から、塩化ナトリウム（０６４０４．１０００）は、Ｍｅｒｃｋ社から、それぞれ購入した。Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｉｃ（Ｔｒｙｐｉｃ） Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Ｒｅｆ０３７０－１７－３）は、Ｄｉｆｃｏ社から購入した。

リアルタイムバイオルミネッセンスアッセイ
古典的ルシフェラーゼは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製（ＡＴＰ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａ２２０６６））のものを使用した。耐熱性ルシフェラーゼは、「ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００」（キッコーマン社製）を使用した。ルシフェリン－ルシフェラーゼ試薬は、メーカーの説明書に従って調製した。黒色９６マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、６５５０７６）の各ウェル（６０μｌ／ウェル）に、指数関数的に増殖する培養培地からの細菌（ＯＤ₆₀₀＝０．３）を添加し、ルシフェリン－ルシフェラーゼ試薬溶液を２０μｌ添加した。マイクロタイタープレートを３７℃で５分間インキュベートしてルシフェラーゼと反応させ、細胞外のＡＴＰのトレースを消失させた。その後、培養培地で調製した抗生物質溶液（３倍濃縮）４０μｌを添加した。各ウェルのバイオルミネセンスを、振とう下（２１８ｒｐｍ）、実験に応じて２８℃又は３７℃で４時間モニターした（図の凡例参照）。抗生物質の存在下又は非存在下での試薬の安定性は、細菌を含まないが４ｐモルのＡＴＰを含む対照実験で確認した。試験は、３８４マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、７８４０７６）でも行った。

上清中における市販の殺細菌性化合物の検出
本発明者らが開発したＡＴＰ測定のプロトコルを調整・最適化し、試験感度を高めた。ホタルルシフェリンとルシフェラーゼを用いた同キット「ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ＡＴ１００」を使用した。
最少培地（ＭＯＰＳ－グルコース０．４％）で指数関数的に増殖させた培養培地（ＯＤ₆₀₀＝０．６）中の細菌を使用した。黒色マイクロタイタープレート（黒色壁・黒色底）の各ウェルに６０μＬの菌体懸濁液を加え、ルシフェリン・ルシフェラーゼ試薬溶液を各ウェルに１０μＬずつ添加した。細菌が放出した細胞外ＡＴＰのトレースの可能性を排除するため、プレートを振とう（２１８ｒｐｍ）しながら３７℃で５分間インキュベートした。その後、２０μＬのストレプトマイセス・フラディエ上清（待機中は氷上に保管）を各ウェルに添加した。各ウェルのバイオルミネセンスを、マイクロタイタープレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＰｒｏ２００、ＴＥＣＡＮ）により、振とう（２１８ｒｐｍ）下、３７℃で４時間観察した。

耐性細菌株及びバイオフィルム
バイオフィルムは、標準的なプロトコルに従って作製した。簡潔には、黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００をトリプティックソイブロス（０．２５％グルコース含有）中で３７℃、１８０ｒｐｍの条件で一晩インキュベートした。ＦＬＵＯＴＲＡＣ（商標）マイクロプレート（予め滅菌）のウェルに、予め平均濃度が１０⁵～１０⁶ＣＦＵ／ｍｌとなるよう希釈した接種済みブロスを１５０μｌ充填した。マイクロプレートに蓋をし、３７℃で１８時間インキュベートした。その後、バイオフィルムを１５０μｌのＭＯＰＳで２回洗浄した。洗浄液の８０μｌは廃棄せずに隣のウェルに入れ、含まれるＡＴＰの量を観察した。次に、バイオルミネセンスアッセイのために本発明者らによって開発された最適化されたプロトコルに従った。

抗生物質のＭＩＣ測定
抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、ＡＴＰアッセイキットを用いて試験と同じ培養条件で測定した。ＬＢ又はＭＯＰＳグルコース０．４％培地で試験抗生物質の２倍連続希釈液を調製した。試験濃度の抗生物質（４０μｌ／ウェル）を含む滅菌済みマイクロタイタープレートの各ウェル（６０μｌ／ウェル）に、指数関数的に増殖する培養物（ＯＤ₆₀₀＝０．３）を添加した。培地で１２０μｌまで体積を調整し、３７℃で１７時間、マイクロタイタープレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ、ＴＥＣＡＮ）を用いてＯＤ₆₀₀ｎｍ測定を実施した。

結果
ＡＴＰ漏出をリアルタイムで検出するバイオルミネッセンスアッセイ
このアッセイの原理を図１に示す。

本発明者らは、まず、古典的なホタルルシフェラーゼを用いて、富栄養及び最少培地におけるＡＴＰの検出の可能性を評価した。ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を含む富栄養培地であるルリアブロス（ＬＢ）又は最少培地（ＭＯＰＳ）にＡＴＰを添加すると、発光が誘発されることが確認された。試薬の安定性はＬＢ培地が優れていた（図２ａ）。ＭＯＰＳでは、試薬は培地とプレインキュベートすると急速に失活した（図２ａ）。次に、本発明者らは、小分子（アミノ酸、ヌクレオチド、カリウム）の漏出を引き起こすことが知られているアミノグリコシドであるネオマイシンによる抗生物質ショック後の生きたレポーター大腸菌細胞の反応を評価した。発光測定により、このアッセイが抗生物質依存的なＡＴＰの漏出をリアルタイムで報告することが実証された（図２ｂ）。本発明者らは、このアッセイの性能を、富栄養（ＬＢ）又は最少（ＭＯＰＳ）培地でも評価した。最少培地では、図２ａで観察されたように、１つ又はいくつかの試薬の不安定性のために、発光シグナルは検出されなかった（図２ｂ）。まず、本発明者らは、この結果について、富栄養増殖培地のいくつかの成分が、おそらくバイオルミネセンスアッセイにおいてルシフェラーゼの安定化剤として作用することを示すと結論付けた。しかしながら、このアッセイは２８℃（通常細菌の増殖に用いられる３７℃より低い温度）で行われたことから、本発明者らは、３７℃でのアッセイを再度行った。その結果、３７℃では、古典的なルシフェラーゼの富栄養培地及び最少培地における安定性が低く、その活性が急速に低下するため、得られた結果は満足のいくものではなかった。抗生物質を添加しない対照サンプルについては、ＡＴＰ放出が抗生物質に依存していることを示すシグナルを与えなかったようである（図２ｂ）。

ホタルルシフェラーゼの安定性を向上させることで、最少培地及び富栄養培地での測定が改善されるか否かを調べるために、本発明者らは、耐熱性ホタルルシフェラーゼを用いて同じアッセイを行った（図２ｃ）。抗生物質依存的な発光シグナルを、最少培地と富栄養培地の両方で記録することができ、生きた大腸菌のリアルタイムＡＴＰアッセイの条件が確立された（図２ｃ）。ＡＴＰ、ルシフェリン、ルシフェラーゼは、接触すると直ぐに発光するため、このアッセイではＡＴＰ（又はアナログ）の外膜への流出がリアルタイムで報告される。本発明者らは、富栄養培地（ＬＢ）と比較し、最少培地（ＭＯＰＳ）において耐熱性ルシフェラーゼの性能が優れていることに注目した（図２ｄ）。耐熱性ルシフェラーゼは、富栄養培地と最少培地で試験を行うことができるため、この酵素を用いた方法のさらなる開発を行った。
本発明者らは、従来のルシフェラーゼと耐熱性ルシフェラーゼで得られた結果を確認するために、比較アッセイを実施した。

このアッセイを行うために、古典的なルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＡＴＰ測定キット、Ａ２２０６６）と耐熱性ルシフェラーゼ（ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ ｋｉｔ、キッコーマン、ＡＡＥ４３２５１．１）をメーカーの説明書に従って使用した。両タイプのルシフェラーゼを３７℃に予熱した富栄養ＬＢ又は最少ＭＯＰＳ－グルコース培地に添加した。インキュベーション中の様々な時間に、溶液のアリコートを採取し、試薬を補充し、０．８ピコモルのＡＴＰと混合して、バイオルミネセンスを読み取った。混合の直後に、ＩｎｆｉｎｉｔｅＰｒｏ２００、ＴＥＣＡＮプレートリーダーを用いて、３８４ウェルのマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、７８４０７６）上の総体積１２μＬで３７℃にてバイオルミネセンス測定を行った。

図２４に示す結果から、古典的なホタルルシフェラーゼは、富栄養（ＬＢ）培地及び最少（ＭＯＰＳ－Ｇ）培地の両方で、３７℃において非常に不安定であることが確認された。ＬＢ培地では、酵素は、わずか１２分のインキュベーションでその活性の７０％を失った。最少ＭＯＰＳ－Ｇ培地では、酵素は３０分でその活性の８０％以上を失った。これらの結果は、従来の（非熱安定性）ルシフェラーゼは、細菌の増殖に最も適した温度である３７℃でＡＴＰの流出を検出するリアルタイムアッセイの実施に適していないことを示す。

一方、耐熱性ルシフェラーゼ（キッコーマン社）を用いて同様のアッセイを行ったところ、本酵素は、ＬＢ中３７℃で５時間インキュベーション後に５０％の活性を、ＭＯＰＳ－Ｇ中７時間インキュベーション後に９０％の活性を保持していた（図２４）。ＭＯＰＳ－Ｇでは、２０時間インキュベーション後でも８０％以上の活性を保持し、極めて安定な酵素であることがわかった。

これらの結果から、ほとんどの細菌種の増殖に最適な温度である３７℃において、耐熱性ルシフェラーゼは、感度と信頼性の高いリアルタイムＡＴＰ漏出アッセイを行うことができる唯一の酵素であると結論付けられた。
レポーター細胞（試験サンプル中の細菌）の量は、アッセイにとって重要である。バイオルミネセンスシグナルは、レポーター細胞の濃度に依存することがわかった。バクテリアの量を減らすと、バイオルミネセンスシグナルは減少した（図３）。また、シグナルの振幅は、細胞のＯＤの関数として変化した。本発明者らは、まず、細胞の量が少ない場合（ＯＤ₆₀₀＝０．００１５及び０．０１５）、低い濃度の薬剤でバイオルミネセンスシグナルが発生するが、これらのシグナルは薬剤濃度に応じて緩やかに増加するのみであることを見出した。ＯＤ₆₀₀が０．１５であれば、大きな振幅を持つシグナルが得られるため、アッセイに選択した。

そこで、本発明者らは、臨床ＡＳＴに多用されるカチオン調整ミュラーヒントン培地を用いた場合において、レポーター細胞の量を変化させて本発明のスクリーニング方法を試みた。白色マイクロタイタープレートを用いた方法の感度が向上し、ＥＵＣＡＳＴの接種量推奨値に到達した（図２５）。細胞を、ミュラーヒントン培地でＯＤ６００＝０．６まで増殖させた後、ミュラーヒントン培地でＯＤ６００＝０．０００５５まで希釈し、その後ルシフェリン－ルシフェラーゼを添加し、続いてｔＡＴＰバイオルミネセンス測定に用いる直前に抗生物質を添加した（ＯＤ６００＝０．０００５５の細菌６０μＬ＋試薬（ルシフェリン－ルシフェラーゼ）２０μＬ＋抗生物質４０μＬ）。細菌の最終的なＯＤ６００は０．０００２７５である。様々な薬剤濃度でアッセイを実施した。白色９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、６５５０７５）を使用した。ラグタイムの同定の精度を上げるため、特にシグナルが弱い条件では、ＡＴＰ漏出のトレースの短期間の変動を、５点移動平均法を用いて平滑化した。これにより、ＭＩＣの推定に必要なＡＴＰ漏出の発生前のラグタイムの同定が容易になった。ラグタイムの解析結果、この培地での標準的な増殖アッセイから得られたＭＩＣと同様のＭＩＣ推定値が得られた（図２５）。

細胞外の微量のＡＴＰは、薬剤添加前の５分間のプレインキュベーション中に細胞培養培地中に検出され、ルシフェラーゼによって消費された。本発明者らは、培養培地を新鮮な培地と交換するために、遠心分離によって細胞を洗浄する必要がないことを見出した。実際、本発明者らは、遠心分離とその後の細胞操作により、アミノグリコシド系抗生物質の取り込みが促進され得ることを示した（図４Ａ）。したがって、結果にバイアスが生じるのを防ぐために、レポーター細胞の操作は避けるべきである。
本発明者らはまた、遠心分離によるストレスから細菌を回復させるために、細菌の遠心分離の有無で、また遠心分離を行う場合はその後の様々な時点（数分、５分、１５分、３０分など、最大１２０分）後にのみ薬剤（ネオマイシン）を添加する、というアッセイを行った。その結果、本発明者らは、ネオマイシンの殺細菌効果が非遠心分離サンプルと同程度に戻るには、遠心分離後約２時間（１２０分）かかることを見出した（図４Ｂ）。

本発明者らは、試験した異なる抗生物質の存在が、バイオルミネセンスアッセイの活性に影響を及ぼさないことを確認した（図５）。したがって、３０ｎＭのＡＴＰを添加する前に、ＬＢ中で、この試験で使用される最大濃度の抗生物質とルシフェラーゼ－ルシフェリン試薬をプレインキュベーションした後に（細菌非存在下で）バイオルミネセンスを測定した。アミノアシル化ｔＲＮＡのアデノシン含有３’末端アナログであるピューロマイシン（図５）については、バイオルミネセンスの著しい阻害が観察されたが、それは大腸菌で測定された最小阻害濃度（ＭＩＣ）を超える濃度で認められただけであった（図５及び表１）。同様の観察を、アクチノマイシンＤ、ノボビオシン、トリメトプリムについても行った。

最適化の結果、バイオルミネセンスアッセイ用の試薬の量は、全体積の１７％未満となり、細胞の生存率に生じる可能性のある摂動を最小限に抑えた。実際、本発明者らは、これらの実験条件下で、細胞が生存可能であることを実証した（図６）。最後に、本発明者らは、アミノグリコシド耐性を有する大腸菌株を用いてＡＴＰ漏出アッセイを実施した。アミノグリコシドＯ－リン酸転移酵素ＡＰＨ（３’）－ＩＩａを発現させると、ネオマイシン添加時のＡＴＰ漏出を検出できなくなり、薬剤によるＡＴＰ漏出が薬剤の細菌に対する殺細菌活性によるものであることが示された（図７）。このことは、本方法が低濃度の抗生物質（ＭＩＣ又はそれ以下）を用いて、特定の細菌サンプルの感受性／耐性を検出できることをさらに実証している。生きている細菌のＡＴＰ漏出を報告する高感度バイオルミネセンスアッセイ（図１）を得た本発明者らは、様々な抗生物質へのショック後の反応を調べることに着手した。

殺細菌性抗生物質が引き金となるＡＴＰの漏出が重要なサインである
以下のすべての実験において、温度、ＯＤ₆₀₀及び装置などのパラメータは、バイオルミネセンスアッセイに使用したものと同じとし、各抗生物質のＭＩＣ値を測定した。

アミノグリコシドは殺細菌性抗生物質であり、翻訳ミスコーディングを引き起こし、細胞に致命的な影響を与える。アミノグリコシドショックに伴う小分子の漏出は、これまで放射標識を含む様々な方法で確認されている。そこで、本発明者らは、アミノグリコシドストレスに対する生細胞の反応を調べた。ＯＤ₆₀₀が０．３（最終０．１５）の高速で増殖する細胞を、プレートリーダーに短時間入れて熱平衡化し、ＬＢ培地中でＭＩＣ前後の異なる濃度で抗生物質を添加した。ネオマイシンの濃度を上げると、ＭＩＣを超える濃度では、最初のＡＴＰ放出が急速で強く、二相性のシグナルが明らかになった（図８）。この条件では、抗生物質の添加から数分以内に漏出が起こり、以前に報告されたアミノ酸／ヌクレオチド／Ｋ＋の漏出と一致する結果であった。ＭＩＣ値は細胞生存率を報告するものではないため、本発明者らはネオマイシン濃度を変えて生存率アッセイを行った（図８）。最初の９０分間のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は一定であり、細胞がこの期間中にネオマイシン処理において生存したことを実証した。したがって、本発明者らは、観察された二相性のＡＴＰ流出が、未だ生きている細胞からのものであると結論付けた。同様の二相性トレースが、他の５つのアミノグリコシド、すなわちストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、アプラマイシン及びアミカシンについても観察された（図８）。本発明者らは、６種類のアミノグリコシドのすべてについて、ＭＩＣ濃度又はその近辺でシグナル強度が低下することに注目し、これは、ＡＴＰ放出の動態の変化と相関があった。また、試験した６種類のアミノグリコシド系抗生物質において、抗生物質濃度の上昇に伴い、発光を検出するまでのタイムラグが短縮された（表２）。

最大濃度では、ネオマイシンでは約９．４分、カナマイシンでは４．７分、ストレプトマイシンでは１０分、アプラマイシンでは１０．９分というこれ以上不可能という値までラグが短縮された。ＭＩＣ未満では、結果を注意深く分析するべきである。長いラグと弱いシグナルは、薬剤を添加した瞬間にすべての細胞が抗生物質を蓄積したわけではないことを示唆している。さらに、ＭＩＣ以下の薬剤濃度では、試験中に細胞が増殖し続けたため、トレースは残りの増殖の影響をわずかに受けている可能性がある。ＭＩＣより高い濃度では反応は明瞭で、類似しており、ほとんどの細胞が薬剤接触後、非常に迅速に影響を受けたことが示された（図８）。これらのミスコーディング剤で観察された特徴、すなわち最初の急速で強いバースト及びそれに続く緩やかだが大きなフェーズは、ＭＩＣ濃度で明確に識別可能であった。

アンピシリンは、βラクタム系の殺細菌性抗生物質で、細胞壁の合成を速やかに阻害し、ゆっくりとした細胞溶解をもたらす。濃度を上げて添加すると、ＡＴＰ放出までのラグが９分と短くなった。同様に、ミスコーディング剤についても、ＭＩＣ（２５μｇ／ｍＬ）より高い濃度で、強く明確なシグネチャーが得られた（図８）。ここでは、ＡＴＰ放出は多相性で、非常に弱い強度の初期フェーズがあった後、はるかに大きな振幅を持つ約２時間の第２フェーズがあった。

ポリミキシンは、主に膜透過性を変化させることでグラム陰性菌に作用する殺細菌性抗生物質である。ポリミキシンＢは、ＭＩＣの２分の１の濃度（４μｇ／ｍＬ）でも明確で強い二相性反応を引き起こした。薬物添加後、強く速い初期フェーズとそれに続く大きな振幅の第２フェーズが生じた。４μｇ／ｍＬより高い濃度では、ポリミキシンＢ添加後すぐにＡＴＰ放出が始まった（ラグが２．４分より短く、測定不能）（図８）。興味深いことに、最初のバーストの振幅は４μｇ／ｍＬの用量で最大となり、高濃度では徐々に減少した（図８）。逆に、第２フェーズの振幅は、濃度と共に増加した（図８）。

セファロスポリン系のβラクタム系殺細菌性抗生物質であるセファレキシンを添加すると、多相性の反応が引き起こされた（図８）。８．８及び１７．５μｇ／ｍＬの抑制濃度以下の濃度では、５０～２５０分の間に３つの同期したフェーズが生じた。３５μｇ／ｍＬでは、アンピシリンやポリミキシンＢと同様にミスコーディング剤で検出された初期バーストを彷彿とさせる、高濃度ほど振幅の増大するバーストが検出された。ポリミキシンＢとは異なり、初期バーストの振幅はこれ以上短縮できないラグ３．６分後に（図８）、濃度依存的に増加した（図８）。５０～２５０分の間に続く３つの同期したフェーズの振幅は様々であった。

オフロキサシンは、フルオロキノロン系に属し、細菌のＤＮＡジャイレースを阻害し、増殖中の細菌のＤＮＡ複製を阻害する。それは殺細菌作用のある抗生物質である。ＡＴＰ放出に対する作用は、試験した最大濃度で７７分後に流出が観察されたため、かなり遅かった（図８及び表２）。ＡＴＰ放出は単相性のようであり、その振幅は使用した薬剤の濃度によって変化した。
試験した殺細菌性抗生物質に関するデータを、図１０Ａにまとめる。結論として、試験したすべての殺細菌性抗生物質について、本発明者らは、単相性又は多相性のＡＴＰ漏出を観察した。
これらのデータは、上記に開示されたものと同じ実験条件に従って新規のアッセイを行うことによって確認された。これらのアッセイの結果を図１０Ｂに要約するが、それらは殺細菌性化合物を迅速に同定する本発明による方法の性能を確認するものである。

静菌性抗生物質はＡＴＰの漏出を促進する作用が弱い
次に本発明者らは、タンパク質合成を阻害するいくつかの静菌性抗生物質を調べた。リボソームを標的とする抗生物質であるエリスロマイシン及びスペクチノマイシンは、非常に弱い振幅のＡＴＰ放出を引き起こした。これは、本発明者らが殺細菌性薬物について観察したものと比較にならない（図９及び図１０）。同じくリボソームを標的とするテトラサイクリンとアジスロマイシンについては、ＡＴＰ放出が観察されたのは、それぞれＭＩＣの４倍及び２．５倍という高用量のみでであった（図９）。リボソームを標的とするもう一つの静菌薬であるピューロマイシンでは、ＭＩＣ以下の濃度で非常に弱い漏出が観察された（図９）。これらの濃度ではピューロマイシンがバイオルミネセンスアッセイを阻害するため、ＭＩＣを超える濃度で測定されたシグナルは、過小評価しても良いであろう（図５ｂ）。ＭＩＣの２倍又は４倍の高濃度のクロラムフェニコールに曝露すると、時間経過と共に直線的と思われる顕著な漏出が生じた（図９）。これは、本発明者らがテトラサイクリンやアジスロマイシンで観察した結果を想起させるものである。リファンピシンは、転写開始阻害剤であり、大腸菌に静菌的な結果をもたらす急速なｍＲＮＡの崩壊を誘発する。本発明者らは、約３０分のタイムラグで弱いＡＴＰの漏出を観察した。シグナルはＭＩＣ（５０μｇ／ｍＬ）以上の濃度でより強くなった。ＭＩＣ以下では、トレースは単相性であった（図９）。
本発明者らは、静菌性抗生物質が静菌活性を持つ濃度で使用された場合、非常に弱いＡＴＰ流出が引き起こされると結論付けた。したがって、殺細菌性薬物で観察されるＡＴＰの漏出は、薬物の致死作用の重要なサインである（図１０）。

殺細菌性抗生物質が最少増殖培地でＡＴＰの放出を促進する
本発明者らは、最少培地でＡＴＰ放出アッセイを実施した。指数増殖期の細胞を使用した。

ＡＴＰ放出を、ＭＩＣ値、又は抗生物質の連続希釈でモニターした（図１１）。すべての抗生物質について、ＡＴＰ放出シグナルの強度は、富栄養培地と比較して、最少培地では弱かった。例えば、アンピシリンとポリミキシンでは、それぞれ１０分の１と３分の１に値が低下した。以上のように、本アッセイは、最少培地でより高感度にＡＴＰを検出することがわかった。この結果は、最少培地では、ＡＴＰの漏出がより顕著でないことを示した。また、本発明者らは、ポリミキシン及びセファレキシンについて、単相性のトレースが、富栄養培地においてこれらの薬剤についてそれぞれ観察された二相性又は多相性のトレースとは対照的であることを指摘した。この観察は、アミノグリコシド系、ネオマイシン、ゲンタマイシン、アプラマイシンにも当てはまる（図１１）。ＡＴＰ放出のラグタイムは、２分の１に減少したオフロキサシンを除いて、変化しないか、わずかに増加した（図１１）。本発明者らは、富栄養培地における殺細菌性抗生物質のＡＴＰ漏出の観察結果が、最少培地においても同様であると結論付けた。

殺細菌性化合物の同定に特化したＡＴＰ漏出アッセイ
ストレプトマイセス属が多くの二次代謝産物、特に抗生物質を産生できることは周知である。ストレプトマイセス属の細菌は、現代医学で使用される抗生物質の約６０％を供給している。本発明の目的は、病原体、多剤耐性細菌、又はバイオフィルムを形成する細菌など、医学的に関連性のある様々なレポーター株で実施可能なアッセイを開発することであった。本発明者らは、ストレプトマイセス属細菌が、本明細書で記載した試験で検出可能な抗生物質を産生できるかどうかを調べるために、ネオマイシン生産菌であるストレプトマイセス・フラディエとレポーター細菌である大腸菌を用いた（図１９）。
また、本発明者らは、レポーター株であるルテウス菌（グラム陽性）が使用可能であることを確認した（図１２）。産生株の培養は、３連で行った。その目的は、化学成分やバクテリア、シアノバクテリア、菌類の培養上清のみを用いて、かなりの量のライブラリーを試験するための堅牢なアッセイを作製することであった。ストレプトマイセス・フラディエの培養上清を添加すると、強い単相性のＡＴＰ漏出シグナルが測定された（図１３）。しかしながら、レポーター細菌を入れない場合にも、顕著なシグナルが観測された。また、ストレプトマイセス・フラディエの２種類の変異株である、非産生多変異株（ＤＳＭ４１５５０）又は単一変異株（Δｎｅｏ６）の上清でも、同様のことが観察された（データ示さず）。この結果は、上清の成分の一部が発光試薬と反応して発光するため、当初のプロトコルを最適化すべきであることを示した。

アッセイの最適化
さらに検討した結果、予備測定で使用した富栄養培地（ＬＢ又はＴＳＢ）が上清と反応し、レポーター細菌がない場合に偽陽性シグナルを発生させることがわかった（図１４）。富栄養培地ＬＢ（又はＴＳＢ）を最少培地ＭＯＰＳ－グルコース０．４％に置き換えると、この偽陽性シグナルはなくなった（図１５）。これは、富栄養ＬＢ培地中の成分が前駆体からのＡＴＰ産生を触媒するか、利用可能なＡＴＰ分子をルシフェラーゼ－ルシフェリン試薬と反応させたものと思われる。

次に、試験の感度を上げるための調整を行い、ＭＩＣ以下の濃度でも殺細菌成分の存在を検出できるようにした。調整したパラメータは以下の通りである：ＯＤ₆₀₀及びレポーター細胞の体積、バイオルミネセンス試薬の体積、アッセイの総体積。本発明者らは、総体積を減らすことにも成功した。ストレプトマイセス・フラディエは運動性のない細菌であるため、環境中で生存するために多くの細胞外プロテアーゼを産生する。さらに、これらのプロテアーゼは変動的に産生されることを踏まえ、本発明者らは、この変動源を排除し、感受性を向上させるために、プロテアーゼがルシフェラーゼを分解する可能性があるという理由から、上清中のプロテアーゼを排除することを選択した。まず、本発明者らは、セリンプロテアーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）でプロテアーゼの作用を阻害することを試みた。実際、ストレプトマイセス・フラディエはセリンプロテアーゼを産生できる。ＰＭＳＦを添加しても、結果に大きな改善は見られなかった（図１６）。本発明者らは、他のプロテアーゼ（セリンプロテアーゼに限らない）及び／又は上清中の他の分子がシグナル取得を阻害していると結論付けた。

ストレプトマイセス・フラディエが産生する二次代謝産物の測定におけるプロテアーゼによる悪影響に対処するため、本発明者らは、５,０００Ｄａのカットオフを有する膜を用いて上清を濾過することとした。上清を濾過する際、２つの主要な観察結果を強調する必要がある（図１６）。まず、本発明者らは、ネオマイシン産生株の上清を濾過したときに、シグナルが２倍増加することを確認した。さらに、上清を濾過したときに観察されたパターンは、純粋なネオマイシンで観察されたパターンをいくらか想起させるものであり、最初のＡＴＰ放出の強い二相性シグナルではあったが、動態は遅いものであった（図１６）。観察された遅れは、富栄養ＴＳＢ培地に由来する（図１７）。本発明者らは、濾過によって、アッセイの性能を妨害するタンパク質や大きな分子を除去することができると結論付けた。さらに、３８４ウェルマイクロタイタープレートのアッセイ量を９μＬまで減らしても、感度は落ちなかった（図１８）。培地の改良、体積減少、濾過の利用により、本発明者らは、ストレプトマイセス・フラディエ上清中の殺細菌成分ネオマイシンを検出・同定する高感度な技術を提供することに成功した。

ストレプトマイセス・フラディエの二次代謝産物の産生におけるばらつきを検出するアッセイ
本発明者らは、本明細書に記載される本試験がハイスループットなスクリーニングに十分耐えうることを確認するために、ネオマイシンを生産できないストレプトマイセス・フラディエの変異体の上清を試験した。本発明者らは、ネオマイシン産生に関わる遺伝子を含む複数の遺伝子を変異させたＤＳＭ４１５５０株と、ネオマイシン合成に関わる遺伝子を欠失させたΔＮｅｏ６株を用いた。野生型産生株と同様に、変異型ストレプトマイセス・フラディエの培養はすべて３重で実施し、２つの培養培地の上清を試験した。予想通り、野生型株と変異型株は同じ結果を示さなかった。野生型産生株の上清では、図１９ｃに示すように、強い二相性のシグナルが発生した。しかし、非生産株である多変異株（ＤＳＭ４１５５０）又は単一変異株（Δｎｅｏ６）の上清では、シグナルは観測されなかった（図１９ｃ）。この結果は、ネオマイシンの生合成経路が変異により不活性化されていることを示すものであった。本発明者らは、最適化されたアッセイを用いることにより、薬剤生産菌の培養上清中の殺細菌性化合物を検出することが可能であると結論付けた。

レポーター細胞としての抗生物質耐性株又はバイオフィルム
現在使用されている薬剤に耐性を獲得した病原株に対して有効な、新規な殺細菌剤のファミリーを特定することに強い関心が持たれている。また、多剤耐性株が形成するバイオフィルムに対して非常に有効な薬剤を発見することも、利点となるであろう。そこで、本発明者らは、本明細書に記載の試験が、バイオフィルム上での薬剤依存的なＡＴＰ漏出を報告するものか否かを試験した。薬剤に依存し、物理的操作に起因することが判明した多剤耐性黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００株による最初のＡＴＰ放出（図２０ａ）の後、薬剤ネオマイシンによってＡＴＰ放出が誘発された（図２０ｂ）。この反応は、ネオマイシン生産菌ストレプトマイセス・フラディエの濾過上清を使用した場合にも観察されたが、未濾過溶液では観察されず、本明細書で開示した最適化プロトコルをさらに検証した（図２０ｂ）。また、本発明者らの以前の知見と一致して、ストレプトマイセス・フラディエ変異体ＤＳＭで得られた上清は、陽性反応を生じなかった（図２０ｂ）。これらの結果は、バイオフィルムの形態で存在する場合であっても、多剤耐性株に対して活性を有するであろう新規殺細菌性化合物を薬剤産生菌の上清中で探索することが可能であることを示している（図２１）。

バイオルミネセンスデータからのＭＩＣ値（最小発育阻止濃度）の推定
本発明者らは、抗生物質を添加した瞬間と、ＡＴＰ（又はアナログ）の漏出を報告するバイオルミネセンスシグナルの検出との間に遅延があることに気付いた。この遅延は、抗生物質の濃度が高くなるにつれて短くなる。ほとんどの抗生物質において、濃度とラグタイムの相関は指数関数的減衰でフィットさせることができる。今回のデータでは、ＭＩＣの値は常にエントリーフェーズから遅延が短くなるプラトーまで見出された。このプラトーは、抗生物質濃度を上げてもラグタイムがあまり変化しない限界を表す。この観察結果を説明するために、本発明者らは、ある抗生物質のラグタイムの値のプラトー値を、この薬剤の既知のＭＩＣのラグタイムから差し引いた。この差を、次に、ラグタイムの変化の総振幅と比較し、図２２にＸで示されるパーセントとして表す。本発明者らは、試験した抗生物質のセットについて、Ｘの値が常に観察された全振幅の３０7％未満であることを見出した（図２２及び以下の表３）。

この観察について可能な一つの説明は、この濃度の抗生物質では、プラトーに達したとき、ほとんどすべての細菌が抗生物質の影響を受け、同時に反応するということである。抗生物質の投与量を増やしても、薬物がほとんどすべての細菌に既に作用しているため、遅延をそれ以上短縮することはできないのである。したがって、ある菌株の抗生物質に対する感受性を調べる場合、ＭＩＣはセグメントＸに対応する低濃度の範囲にあると推定することができる。

参照文献

Claims (15)

1. 化合物を殺細菌活性についてスクリーニングするための方法であって、
   ａ）培養培地中に生細菌を含む１つ又は複数の試験細菌サンプルを用意するステップと、
   ｂ）前記試験細菌サンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加するステップと、
   ｃ）前記試験細菌サンプルに候補組成物を添加するステップと、
   ｄ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの前記混合物及び前記候補組成物が添加された前記試験細菌サンプルを２０～６０℃（ルシフェラーゼ耐熱性パラメータと一致させて選択される温度）、好ましくは３５～３７℃でインキュベートし、バイオルミネセンスをリアルタイムで測定するステップと
   を含み、
   ステップａ）、ｂ）及びｃ）が実行された後の前記試験細菌サンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２であり、
   ステップｄ）において試験細菌サンプル中で測定されたバイオルミネセンスの増加は、ステップｃ）において試験細菌サンプルに添加された候補組成物が、殺細菌活性を有する少なくとも１つの化合物を含むことを示す、方法。
2. ステップａ）において用意された前記試験サンプルの前記生細菌が、機械的又は化学的ストレスを受けておらず、特に、ステップａ）において用意された前記試験サンプルの前記生細菌が、遠心分離又は浸透圧ショックを受けていない、請求項１に記載の方法。
3. 前記試験サンプル中の前記生細菌が、多剤耐性細菌を含む抗生物質耐性細菌、病原性細菌、浮遊性細胞及びバイオフィルム中の細菌細胞からなる群から選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記試験サンプル中の前記生細菌が、
   - ＥＳＫＡＰＥグループの抗生物質耐性「優先病原体」
   - ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レンサ球菌属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｕｌｅｎｚａｅ）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びシトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）
   からなる群において選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. ステップａ）で使用される前記培養培地が、好ましくは炭素源、より好ましくはグルコースが補充された最少培地である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. ステップａ）、ｂ）及びｃ）が行われた後の前記試験細菌サンプル中の生細菌のＯＤ６００が、０．１～０．３、好ましくは０．１～０．２の間に含まれる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. ステップｂ）において、前記耐熱性ルシフェラーゼが、ＧｅｎＢａｎｋリリース２４３アクセッション番号ＡＡＥ４３２５１．１を有する改変ルシフェラーゼ又はＧｅｎＢａｎｋリリース２４３アクセッション番号ＡＦ１７９２９０を有する改変ルシフェラーゼから選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記候補組成物が、精製された化合物、好ましくは化学的化合物又は生物学的化合物、例えばファージである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記候補組成物が、複合混合物、好ましくは細菌上清又は抽出物である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記複合混合物が、ステップｃ）において添加される前に濾過される、請求項９に記載の方法。
11. 前記方法が、マイクロプレートで行われ、ステップｃ）の終了時に、前記マイクロプレートが、好ましくは、
    ｉ）試験細菌サンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物、及び候補組成物、を含む少なくとも１つのスクリーニングウェルと、
    ｉｉ）少なくとも２つの陰性対照ウェルであって、一方のウェルが、試験細菌サンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を含むが、候補組成物も既知の殺細菌性組成物も含まず、他方のウェルが、培養培地を含むが、試験細菌サンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物、候補組成物及び既知の殺細菌性組成物のいずれも含まない、陰性対照ウェル、並びに／或いは
    ｉｉｉ）少なくとも１つの陽性対照ウェルであって、試験細菌サンプル、ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物、及び既知の殺細菌性組成物又はＡＴＰを含む、陽性対照ウェルと
    を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルの、既知の抗生物質の群に対する感受性を決定するための方法であって、
    ａ）細菌感染症に罹患している対象に由来する細菌サンプルを培養培地に接種し、任意に、前記サンプル中の前記細菌を増幅させるステップと、
    ｂ）ステップａ）の前記細菌サンプルを、試験される既知の抗生物質の数と少なくとも同数のサンプルとなるよう、いくつかのサブサンプルに分割するステップと、
    ｃ）各サブサンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加するステップと、
    ｄ）１つ又は複数のサブサンプルに既知の抗生物質の群のそれぞれを添加するステップと、
    ｅ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物及び前記既知の抗生物質が添加された前記サブサンプルを２０～６０℃、好ましくは３５～３７℃の温度でインキュベートし、バイオルミネセンスをリアルタイムで測定するステップと
    を含み、
    ステップａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）が実施された後の前記サブサンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２であり、
    ステップｅ）においてサブサンプル中で測定されたバイオルミネセンスの増加は、対象に由来する前記細菌サンプルが、ステップｄ）において前記サブサンプルに添加された前記既知の抗生物質の添加濃度に対して感受性であることを示す、方法。
13. ステップａ）において、
    ｉ）前記サンプルの前記生細菌が、機械的又は化学的ストレスを受けておらず、特に前記生細菌が、遠心分離又は浸透圧ショックを受けておらず、及び／又は、
    ｉｉ）前記培養培地が、グルコースが補充された最少培地である、請求項１２に記載の方法。
14. ステップｂ）において、前記耐熱性ルシフェラーゼが、ＧｅｎＢａｎｋリリース２４３アクセッション番号ＡＡＥ４３２５１．１を有する改変ルシフェラーゼ又はＧｅｎＢａｎｋリリース２４３アクセッション番号ＡＦＩ７９２９０を有する改変ルシフェラーゼから選択される、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
15. 殺細菌性化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を評価するための方法であって、
    ａ）培養培地中に生細菌を含む少なくとも１つの試験細菌サンプルを用意するステップと、
    ｂ）ステップａ）の細菌サンプルをいくつかのサブサンプルに分割するステップと、
    ｃ）前記サブサンプルにルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物を添加するステップと、
    ｄ）前記サブサンプルに様々な濃度の殺細菌性化合物を添加するステップと、
    ｅ）ルシフェリンと耐熱性ルシフェラーゼの混合物及び殺細菌性化合物が添加されたサブサンプルを２０～６０℃、好ましくは３５～３７℃の温度でインキュベートし、バイオルミネセンスをリアルタイムで測定するステップであって、ステップａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）が行われた後のサブサンプル中の生細菌の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が、少なくとも０．０００２である、ステップと、
    ｆ）試験された殺細菌性化合物の各濃度について、前記殺細菌性化合物が添加された時点と、バイオルミネセンスシグナルの増加が検出された時点との間のラグタイムを決定するステップと、
    ｇ）前記殺細菌性化合物濃度の関数としてラグタイムを表すステップと、
    ｈ）前記殺細菌性化合物濃度の関数として、ラグタイムの測定点にフィットする指数関数的減衰曲線を作成するステップと、
    ｉ）指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトーにおける最低の殺細菌性化合物濃度を決定するステップと、
    ｊ）指数関数的減衰フィッティング曲線のラグタイム振幅を決定するステップと、
    ｋ）ＭＩＣを評価するステップであって、ＭＩＣが、
    ・指数関数的減衰フィッティング曲線上で、（プラトーでのラグタイム＋０．３×ラグタイム振幅）に等しいラグタイムに対応する抗生物質濃度と、
    ・指数関数的減衰フィッティング曲線のプラトーにおける最低の殺細菌性化合物濃度
    と
    の間に含まれるとして評価されるステップと
    を含む、方法。

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