JP5753778B2 - 蠕虫卵、特に鞭虫卵の生物学的活性を測定する方法 - Google Patents
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Description
この分析は顕微鏡下で行う。形態学的基準を用いて、完全な形のままでかつ十分に成熟したL1幼虫が虫卵に含まれているかどうかを評価する。しかしながら、本出願で示される分子生物学的方法とは対照的に、形態学的評価のみでは幼虫が実際に十分に成熟しているのかどうかを確実に推定することはできない。さらに、成熟率には、幼虫を包蔵したL1−TSOの生存能力や生物学的活性に関する情報は含まれないという制限がある。さらに、この形態学的評価には観察者の経験が必要とされ、形態学的な判別が難しい事例においては主観的な分類がなされるため正確性および精度が制限される。
豚鞭虫に関しては、ブタを用いて分析を行う。ブタを感染させた後、特定の時点において腸粘膜に定着した幼虫数を測定し、TSOの投与量を基準にして感染率を計算する(Kringel et al., Vet. Parasitol., 2006, 139: 132-139;Summers et al., 2005, Gastroenterology, 128: 825-832;またはJohnson et al. Intl. J. Parasitol. 1998, 28, 627-633(豚回虫))。感染率を測定する際の問題点として、感染率が蠕虫卵の機能性により影響を受けるだけでなく、個々の宿主が有する要因、たとえば、実験動物の免疫システム、腸内細菌叢、腸の機能などによっても同様に影響を受けることが挙げられる。したがって、実験動物を用いた感染率の測定には大きなばらつきが本質的に伴い、試験系に生物を用いているため標準化することもできない。このため、実験動物を用いた感染率の測定は、生物学的活性試験としての適性が大幅に制限される。さらに、ブタを用いた豚鞭虫の感染率測定試験には、少なくとも3週間の長い潜伏期が伴う上、結果のばらつきが大きいため多数の動物が必要とされる。このような理由により、この試験を日常的に使用することは倫理的にも経済的にも難しい。
鞭虫の幼虫包蔵卵における遺伝子発現の誘導能の測定;
高温でのプレインキュベーションによる活性化後における、虫卵内に包蔵される鞭虫幼虫の運動性の長時間観察による顕微鏡測定;および/または、
内部標準を基準として、腸管内容物から回収した完全な形のままの幼虫包蔵卵を定量化する、実験動物における鞭虫幼虫の孵化率の測定。
幼虫の発育期における細胞分裂では、常に、染色体対が2倍になり、2個の娘細胞に分配される。したがって、虫卵中のゲノムDNAのコピー数は、発育途中の幼虫の体細胞数と相関すると見なすことができる。したがって、ゲノムDNAのコピー数を測定することによって、発育途中である幼虫の発育状態を表すことができる。このことは、上記の方法(成熟率の顕微鏡測定:上記参照)と比較して明らかに有利である。上記の成熟率の顕微鏡測定では、約13週間にわたる成熟の最終結果しか分析できず、幼虫が実際に完全に発育したのか(すなわち、細胞数が、完全に形成されたL1幼虫に相当するのか)に関していかなる情報も得られない。幼虫を成熟させることは蠕虫卵の医薬品製造工程の一部であり、ゲノムDNAのコピー数を測定することにより、該製造工程に伴う分析が初めて可能となる。この測定によって、蠕虫卵の医薬品製造工程の論理的な開発、および該製造工程の変更がもたらす効果の分析が可能となるだけでなく、幼虫の成熟期において製造を定期的に監視することも可能となる。
細胞の生存能力を測定する方法の多くが、代謝活性の分析に基づいている。細胞代謝において、アデノシン三リン酸はエネルギー伝達物質およびエネルギー貯蔵物質として中心的な役割を果たし、細胞内代謝活性を測定するためのマーカーとして使用できる。本発明では、豚鞭虫のL1幼虫のような、分化した生物の生存能力を測定するために、このヌクレオチドの検出も利用できることが示されている。
この方法の原理は、遺伝子発現の誘導である。遺伝子発現は生細胞でしか誘導することができないため、これにより生きている幼虫と死んでいる幼虫とを識別できる。さらに、遺伝子発現の誘導能は、休止状態のL1幼虫が種々の活性化状態を経ることを可能にするための必要条件であると考えられ、種々の活性化状態は生活環の次の段階(孵化、粘膜への定着など)を誘導するのに必要である。
この方法の原理は、虫卵内のL1幼虫の機能性に関するパラメータとしての虫体の運動の検出に基づく。幼虫の運動性は、幼虫が適切な環境条件下で孵化するための必要条件である。C.エレガンスのような自由生活性の幼虫および寄生虫においては、運動性の分析は生存能力および機能性を確認するための確実な方法として有効である。
この測定法の原理は、実験動物の腸管内あるいは実験動物からあらかじめ回収した腸管内容物内に含まれる蠕虫幼虫の孵化率の測定である。
豚鞭虫のITS2配列に基づき、TaqManシステムを用いた定量PCR法を開発した。標的配列、プライマー、およびTaqmanプローブを以下に示す。遺伝子配列が公知である他種の鞭虫と豚鞭虫とを識別できるように標的配列を選択した。このようにすると、ITS2コピー数に関する情報が得られるだけでなく、分析した生物が実際に豚鞭虫であったことも定性的に証明できる。
アデノシン三リン酸を検出するために、反応に必要なルシフェラーゼ酵素、基質であるルシフェリン、マグネシウム塩などを含む市販キットを使用することができる。幼虫包蔵卵をプレインキュベートしてアデノシン三リン酸の形成を刺激することは必須である。生存可能な幼虫包蔵卵が休止状態である場合、アデノシン三リン酸含量から、生存可能な幼虫包蔵卵と死んでいる虫卵とを十分に識別することはできない(図3)。図3の結果より、虫卵を37℃で19時間にわたりインキュベートする方法が適すると判明した。開発した分析法の重要な利点として、このインキュベーションに際して試料を調製する必要がないことが挙げられる。本発明の虫卵懸濁液は、培地の定性的および定量的組成とは無関係にそのまま使用することができる。pH価が2未満の強酸性培地でさえも試料を調製することなく使用することができ、虫卵中のアデノシン三リン酸の形成を刺激するのに何ら悪影響を与えることはない。インキュベートすることにより、生きているF1幼虫と死んでいるF1幼虫とを明確に識別することができる(図3)。
セノラブディティス・エレガンスに見出される熱ショック蛋白質hsp70の配列と、ネズミ鞭虫(Trichuris muris)の相同配列と、犬鞭虫(Trichuris vulpis)の相同配列とに由来するプライマーを用いて、豚鞭虫から単離したRNAの遺伝子配列を増幅することができた。豚鞭虫由来のこの新規の配列は、蛋白質配列に翻訳すると、C.エレガンスのhsp70蛋白質の蛋白質配列と65%一致する(図5)。
4.1 運動性指数の分析条件に対する依存性
活性な豚鞭虫卵と、48℃で72時間インキュベートして不活性化した豚鞭虫卵とを、39℃で11時間インキュベートした。1時間毎にそれぞれの虫卵を5分間観察し、運動性を測定した。運動性指数の経時変化を図7に示す。
以下に挙げる試験条件が有利であると判明した。リン酸緩衝液(pH7.4)300μl中に15,000個の蠕虫卵を含む試料を、96ウェルプレート(底面積:0.31cm2)へ移す。この播種密度においては、200倍の倍率で約80〜150個の虫卵が顕微鏡の視野内に入る。37℃で8時間インキュベーションした(活性化段階)後、温度を39.5℃まで上げて、連続した4つの観察野を選択し、それぞれ2時間観察する。この観察を行うため、フィルムに毎分3画像を記録する。次いで、虫卵数と動いている幼虫数とを測定し、運動性指数を計算する。4観察野の平均値から、試料の運動性指数を得る。
上記の条件下における運動性試験の再現性を調べるために、4回の実験をそれぞれ異なる日に実施し、1回の実験につき4種の豚鞭虫試料を分析した。測定結果を以下の表に示す。比較として、同一の豚鞭虫試料を用いて感染率測定試験を行った、4回の実験の結果を示す。
運動性と生物学的活性との相関を分析するために、活性なTSOと加温により不活性化したTSOとからなる混合物を作製し、4.2に記載した条件に従った運動性試験により分析した。加温による不活性化は、虫卵を48℃で72時間加温することにより行った。客観的な集計結果を得るために、盲検法にて試料を測定した。
本実施例により、運動性指数が相対生物学的活性と直線的に相関することが明らかに示された。運動性試験は、正確性と精度に関して感染率測定試験よりはるかに優れている。
一例として、幼虫包蔵卵と未成熟卵と不活性化した幼虫包蔵卵とからなる種々の混合物をウサギに経口投与した。8時間後、ウサギの腸管内容物を顕微鏡下で分析し、完全な形のままの虫卵数と空の幼虫被膜数とを集計した。本分析では虫卵を蛍光標識しなかったため、完全な形のままの幼虫包蔵卵と未成熟卵との比率により孵化率を計算した([IE]=幼虫包蔵卵数、[IS]=未成熟卵数として、上記の式を用いた)。分析結果と分析結果より計算した孵化率とを以下の表に示す。
in vitroにおける温度誘導性活性化能とin vivoにおける生物学的活性との相関
温度誘導性活性化能と生物学的活性との相関性を調べるために、種々の性質を有する12種のTSO試料を分析した。まず、これらの試料の幼虫が完全に発育しているのかをPCRを用いて評価した。次いで、加温により活性化を誘導した後、運動性指数とATP含量とを測定した。これらと並行として、12種の試料それぞれに対してブタを用いた感染率測定試験を行った。感染率測定試験は、Kringelらによって報告された方法に従い、それぞれの試料に対して5匹のブタを用いて行った。運動性とATP含量の2種のin vitroパラメータを、in vitro活性スコアとしてまとめた:
Claims (15)
- 鞭虫の幼虫包蔵卵の生物学的活性を測定する方法であって、
a)ゲノムDNAのコピー数を確認するのに適したマーカー配列を使用した定量PCR分
析による鞭虫卵の幼虫発育期の判定および/または確認、
b)生化学的方法および/または分子生物学的方法を用いた鞭虫の幼虫包蔵卵の代謝活性
の測定、
c)鞭虫の幼虫包蔵卵における遺伝子発現の誘導能の測定、
d)高温でのプレインキュベーション後における、虫卵内に包蔵される鞭虫幼虫の運動性
の、長時間観察による顕微鏡測定、および
e)内部標準を基準として、実験動物の糞から回収した完全な形のままの幼虫包蔵卵を定
量化する、実験動物における鞭虫の幼虫孵化率の測定
のうち少なくとも3種の測定を行うことを特徴とする方法。 - a)ゲノムDNAのコピー数を確認するのに適したマーカー配列を使用した定量PCR分析による鞭虫卵の幼虫発育期の判定および/または確認において、豚鞭虫に適した特異的配列を使用した定量PCR分析によりゲノムDNAのコピー数を測定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- b)生化学的方法および/または分子生物学的方法を用いた鞭虫の幼虫包蔵卵の代謝活性の測定において、豚鞭虫の幼虫包蔵卵の代謝活性を測定するためにATP含量を測定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ルミネセンス測定の前に、
aa)36〜42℃
bb)2〜30時間
cc)pH0.1〜3の懸濁培地中
の条件下で鞭虫卵をプレインキュベートすることを特徴とする、請求項3に記載の方法。 - b)生化学的方法および/または分子生物学的方法を用いた鞭虫の幼虫包蔵卵の代謝活性の測定において、鞭虫卵をまず、次亜塩素酸、キチナーゼ、および/またはプロテアーゼから選択される前処理剤で処理し、次いでテトラゾリウム塩で染色することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- c)鞭虫の幼虫包蔵卵における遺伝子発現の誘導能の測定において、熱ショック蛋白質の誘導能を測定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- c)鞭虫の幼虫包蔵卵における遺伝子発現の誘導能の測定において、前記発現を、蛍光標識されたヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- c)鞭虫の幼虫包蔵卵における遺伝子発現の誘導能の測定において、前記ハイブリダイゼーションをフローサイトメトリーにより検出することを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- d)高温でのプレインキュベーション後における、虫卵内に包蔵される鞭虫幼虫の運動性の、長時間観察による顕微鏡測定において、2分〜8時間にわたって経時的に記録することにより、虫卵内の鞭虫幼虫の運動性を顕微鏡下で測定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- e)内部標準を基準として、実験動物の糞から回収した完全な形のままの幼虫包蔵卵を定量化する、実験動物における鞭虫の幼虫孵化率の測定において、試験対象の鞭虫卵を蛍光プローブで標識し、内部標準を異なる色の蛍光プローブで標識することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- e)内部標準を基準として、実験動物の糞から回収した完全な形のままの幼虫包蔵卵を定量化する、実験動物における鞭虫の幼虫孵化率の測定において、ウサギおよび/またはブタの糞を試験系として使用することを特徴とする、請求項1に記載の鞭虫の幼虫包蔵卵の生物学的活性を測定する方法。
- e)内部標準を基準として、実験動物の糞から回収した完全な形のままの幼虫包蔵卵を定量化する、実験動物における鞭虫の幼虫孵化率の測定において、前記孵化率を確認するために、鞭虫の未成熟卵または不活性化卵を内部標準として使用することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記a)、前記b)、前記c)、前記d)、または前記e)から選択される少なくとも4種の測定を行うことを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 測定を行う前に、厳密に標準化された条件下で少なくとも30分〜24時間にわたって
鞭虫卵をプレインキュベートし、このプレインキュベーションにおいて、必須パラメータを変更できることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。 - 前記必須パラメータが温度であることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
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