KR20090058221A - 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로파쇄하는 방법 - Google Patents

시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로파쇄하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포를 포함하는 시료를 비이온 계면활성제와 2가 양이온 염을 포함하는 파쇄 버퍼와 혼합하여 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 단계를 포함하는, 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 방법을 제공한다.
죽은 세포, 살아 있는 세포, 비이온 계면활성제

Description

시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 방법{Method of selectively lysing a dead cell in a cell populations in a sample}
본 발명은 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 방법 및 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포 또는 살아 있는 세포를 선택적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
시료 중의 살아 있는 세포 (viable cell)만을 분석하여야 하는 경우가 있다. 이러한 분석의 예에는 식품 및 수질 안전을 모니터링하는 경우, 약품의 무균 상태를 확인하는 경우, 임상 진단 및 바이오테러 물질의 분석 등이 있다. 이러한 분석에서 죽은 세포가 존재하는 경우, 분석결과에 위양성 (false positive) 결과를 야기시킬 수 있다.
또한, Campylobacter jejuni와 같은 Campylobacter 속의 종들은 살아 있지만 배양이 되지 않거나 배양에 특별한 조건을 요구하는 경우에는, 배양을 통하여 살아 있는 세포를 분석하기가 어려운 경우가 있다.
종래 죽은 세포와 살아 있는 세포를 구분하는 방법에는, 죽은 세포 또는 살아 있는 세포에만 특이적으로 투과되는 염료, 예를 들면, 프로피듐 아이오다이드 (PI) 및 SYTO9을 사용하거나, 유세포 흐름 (flow cytometry)을 이용하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 미국특허 제7,262,009호에는, 시료 내의 세포 집단의 분석으로부터 죽은 세포를 배제하는 방법으로서, (a) 시료를 시료 내의 죽은 세포의 핵산을 변형시키는 생존 프로브 (viability probe)와 접촉시키는 단계로서, 상기 생존 프로브는 죽은 세포로부터의 핵산에 선택적으로 반응하여, 살아 있는 세포 내의 핵산은 상기 생존 프로브에 의하여 변형되지 않고 남아 있는 것인 단계; (b) (a) 단계 후에 상기 세포를 파쇄하고 세포 파쇄 후 살아 있는 세포 및 죽은 세포로부터의 상기 핵산을 (c) 단계 전에 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 시료 중의 상기 살아 있는 세포로부터의 핵산을 검출하는 것으로서, 상기 검출은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 상기 핵산 내의 표적 서열에 결합시키는 것인 방법이 개시되어 있다.
이러한 종래 기술에 의하더라도, 살아 있는 세포 및 죽은 세포를 포함하는 시료로부터 살아 있는 세포를 선택적으로 분석할 수 있는 방법은 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 살아 있는 세포 및 죽은 세포를 포함하는 시료로부터 죽은 세포를 선택적으로 파쇄할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 살아 있는 세포 및 죽은 세포를 포함하는 시료로부터 죽은 세포 또는 살아 있는 세포를 선택적으로 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 세포를 포함하는 시료를 비이온 계면활성제와 2가 양이온 염을 포함하는 파쇄 버퍼와 혼합하여 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 단계를 포함하는, 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 방법을 제공한다.
상기 비이온 계면활성제는 폴리에틸렌 에테르 (polyethylene ethers) (TritonX 100, TritonX 102), Tween 20, 옥틸페놀에틸렌 옥사이드 (octylphenol-ethylene oxide) (NP40), 및 Brij 58 (폴리옥시에틸렌 아실 에테르) (polyoxyethylene acyl ether)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, TritonX 100이다.
상기 비이온 계면활성제의 농도는 0.1 부피% 내지 3 부피%인 것일 수 있다.
상기 2가 양이온 염은 Ca2 + 또는 Mg2 +의 염인 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 2가 양이온 염은 CaCl2, MgCl2 또는 MgSO4인 것일 수 있다.
상기 2가 양이온 염의 농도는 1mM 내지 25mM인 것 일수 있다.
본 발명의 일 구체예는, 상기 비이온 계면활성제는 0.1 부피% 내지 3 부피% 의 TritonX 100이고, 상기 2가 양이온 염은 1mM 내지 25mM의 MgCl2인 것이다.
상기 혼합은 실온, 예를 들면 25℃ 내지 27℃에서 5 내지 10분 동안 수행되는 것이나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 실온에서, 10분 동안 혼합하는 것이다. 혼합은 교반 또는 교반 없이 수행될 수 있다. 또한, 상기 혼합은 pH 7 내지 8의 범위로 유지하여 주는 버퍼의 존재 하에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 10mM 내지 60mM 농도의 Tris-HCl 버퍼이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 세포에는 그람 음성 박테리아, 그람 양성 박테리아 및 동물세포가 포함된다. 바람직하게는, 상기 세포는 그람 음성 박테리아 세포이며, 더욱 바람직하게는 대장균이다.
본 발명은 또한, 세포를 포함하는 시료를 비이온 계면활성제와 2가 양이온 염을 포함하는 파쇄 버퍼와 혼합하여 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 단계; 및 상기 파쇄된 죽은 세포와 살아 있는 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포 또는 살아 있는 세포를 선택적으로 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 세포를 포함하는 시료를 비이온 계면활성제와 2가 양이온 염을 포함하는 파쇄 버퍼와 혼합하여 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 단계를 포함한다.
상기 비이온 계면활성제는 폴리에틸렌 에테르 (polyethylene ethers) (TritonX 100, TritonX 102), Tween 20, 옥틸페놀에틸렌 옥사이드 (octylphenol- ethylene oxide) (NP40), 및 Brij 58 (폴리옥시에틸렌 아실 에테르) (polyoxyethylene acyl ether)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, TritonX 100이다.
상기 비이온 계면활성제의 농도는 0.1 부피% 내지 3 부피%인 것일 수 있다.
상기 2가 양이온 염은 Ca2 + 또는 Mg2 +의 염인 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 2가 양이온 염은 CaCl2, MgCl2 또는 MgSO4인 것일 수 있다.
상기 2가 양이온 염의 농도는 1mM 내지 25mM인 것 일수 있다.
본 발명의 일 구체예는, 상기 비이온 계면활성제는 0.1 부피% 내지 3 부피% TritonX 100이고, 상기 2가 양이온 염은 1mM 내지 25mM의 MgCl2인 것이다.
상기 혼합은 실온, 예를 들면 25℃ 내지 27℃에서 5 내지 10 분 동안 수행되는 것이나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 실온에서, 10분 동안 혼합하는 것이다. 혼합은 교반 또는 교반 없이 수행될 수 있다. 또한, 상기 혼합은 pH 7 내지 8의 범위로 유지하여 주는 버퍼의 존재하에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 10mM 내지 60mM 농도의 Tris-HCl 버퍼이다.
본 발명의 방법은 또한, 상기 파쇄된 죽은 세포와 살아 있는 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 분리는 원심분리, 여과 등과 물리적 분리 방법에 의하여 수행되거나, 효소 예를 들면, DNase, RNase와 같은 분석하고자 하는 표적물질을 분해하는 효소를 이용하여, 파쇄된 죽은 세포로부터 나온 물질을 선택적으로 분해함으로써, 이루 어질 수 있다. 그러나, 상기 분리 방법은 상기 예들에 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 원심분리에 의하여 죽은 세포의 파쇄물이 포함되는 상층 (supernatant)과 살아 있는 세포를 포함하는 펠렛 (pellet)으로 분리하는 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 세포에는 그람 음성 박테리아, 그람 양성 박테리아 및 동물세포가 포함된다. 바람직하게는, 상기 세포는 그람 음성 박테리아 세포이며, 더욱 바람직하게는 대장균이다.
이렇게 분리된 파쇄된 죽은 세포 또는 살아 있는 세포는 생물학적 분석에 사용될 수 있다. 예를 들면, 죽은 세포 또는 살아 있는 세포로부터 얻어지는 핵산에 대하여, PCR, RT-PCR 등과 같은 핵산 증폭과정을 수행하거나, 혼성화 반응을 수행할 수 있다. 또한, 죽은 세포 또는 살아 있는 세포로부터 얻어진 시료를 ELISA, EIA와 같은 검출 방법에 이용될 수 있다. 또한, 살아 있는 세포 자체를 배양하여 분석에 이용할 수 있다.
본 발명의 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 방법에 따르면, 시료 중의 죽은 세포만을 선택적으로 파쇄할 수 있다.
본 발명의 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포 또는 살아 있는 세포를 선택적으로 분석하는 방법에 따르면, 시료 중의 죽은 세포 또는 살아 있는 세포를 선택적으로 분석할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실 시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 파쇄 용액의 영향
본 실시예에서는 파쇄 용액의 종류에 따른 죽은 세포와 살아 있는 세포의 선별적 파쇄 효과를 확인하였다. 파쇄 버퍼 1은 0.8M 수크로즈, 2.5 부피% TritonX 100, 5mM MgCl2 및 30mM Tris HCl (pH 7.4)로 구성되는 파쇄 용액이고, 파쇄 버퍼 2는 10mM KHCO3, 155mM NH4Cl, 0.1mM EDTA (0.2㎛ 필터를 사용하여 필터 멸균함) (Vogelstein, B. and Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615 (1979))로 구성되는 용액이다.
구체적으로, 대장균 BL21을 10ml의 LB 배지에 접종하고 밤새 배양한 후, 1ml를 10ml의 새로운 배지에 2 시간 배양하여, 대수기의 대장균을 PBS 중에 첨가시켜 108 cells/ml의 농도로 하였으며, 이를 살아 있는 세포로 사용하였다. 죽은 세포는, 동일한 부피의 상기 살아 있는 세포를 72℃에서 15분 동안 열처리한 것을 사용하였다 (Journal of Microbiological Methods 67 (2006) 310-320.). 이렇게 얻어진 죽은 세포 및 살아 있는 세포 0.1-0.3ml에 각각 상기 파쇄 버퍼 1 및 2의 용액 1ml에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 파쇄시켰다. 다음으로, 상기 배양물을 13,000rpm에서 30초 동안 원심분리하여 상층 (supernatant)을 취하였다. 취하여진 상층 20㎕를 0.6% 아가로즈 겔 상에서 전기영동하였다. 1X TBE buffer에서 100V 20분 정도 전기영동을 실시하였다.
도 1은 파쇄 버퍼에 따른 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄 정도를 나타내는 도면이다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 파쇄 버퍼 1을 사용하는 경우, 죽은 세포에서는 DNA가 관찰되나, 살아 있는 세포에는 DNA가 관찰되지 않아, 살아 있는 세포는 파쇄되지 않고, 죽은 세포만 선택적으로 파쇄되었다는 것을 알 수 있다. 도 1a에서, 레인 1은 마커 (lambda HindIII marker, 첫번째 크기 25kb)이며, 레인 2-6은 죽은 세포에 대한 결과이고, 레인 7-11은 살아 있는 세포에 대한 결과이다. 실험은 5 반복으로 하였다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 파쇄 버퍼 2를 사용하는 경우, 죽은 세포 및 살아 있는 세포 모두에서 DNA가 관찰되지 않아, 세포가 파쇄되지 않았다는 것을 나타낸다. 도 1b에서, 레인 1은 마커 (lambda HindIII marker, 첫 번째 크기 25kb)이며, 레인 2-6은 죽은 세포에 대한 결과이고, 레인 7-11은 살아 있는 세포에 대한 결과이다. 실험은 5 반복으로 하였다.
실시예 2: 파쇄버퍼 1의 각 성분의 영향
본 실시예에서는 파쇄 버퍼 1의 성분에 대하여 죽은 세포를 선택적으로 파쇄시키는 효과를 확인하였다. 파쇄 버퍼 1은 0.8M 수크로즈, 2.5 부피% TritonX 100, 5mM MgCl2 및 30mM Tris HCl (pH 7.4)로 구성되는 파쇄 용액이다.
구체적으로, 대장균 BL21을 10ml의 LB 배지에 접종하고 밤새 배양한 후, 1ml를 10ml의 새로운 배지에 2시간 배양하여, 대수기의 대장균을 PBS 중에 첨가시켜 108 cells/ml의 농도로 하였으며, 이를 살아 있는 세포로 사용하였다. 죽은 세포는, 동일한 부피의 상기 살아 있는 세포를 72℃에서 15분 동안 열처리한 것을 사용하였다 (Journal of Microbiological Methods 67 (2006) 310-320). 이렇게 얻어진 죽은 세포 및 살아 있는 세포 0.1-0.3ml에 상기 파쇄 버퍼 1과 상기 파쇄 버퍼 1에서, 수크로즈, TritonX 100, MgCl2, Tris-HCl (pH 7.4)를 각각 제거한 파쇄 용액(1x 버퍼) 1ml에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 파쇄시켰다. 다음으로, 상기 배양물을 13000rpm에서 30초 동안 원심분리하여 상층 (supernatant)을 취하였다. 취하여진 상층 10㎕를 주형으로 하고, 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 (70bp PCR 산물 포워드 프라이머: 5＇-TGTATGAAGAAGGC TTCG-3＇, 리버스 프라이머 5＇-AAAGGTATTAACTTTACTC-3＇)를 프라이머로 하여, PCR을 수행하였다. 프로브로는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 (5＇-FAM-GTACTTTCAGCGGGGAGGAA-TMARA-3＇)를 사용하였다. 2X PCR mastermix (1X PCR buffer, 5mM MgCl2, 250nM dNTP, 0.1U/㎕ Taq DNA polymerase (Solgent), 200nM primers, 200nM probe)를 제조하여 상층액 DNA와 1:1로 혼합하여 용액을 준비하였다. PCR은 초기 변성 94℃에서 80초, 변성 94℃에서 10초 및, 어닐링 50℃에서 30초 및 중합 72℃에서 30초를 30회 반복하였다. PCR은 Lightcycler 2 (Roche)기기를 사용하여 리얼 타임 PCR을 수행하였으며, 그 증폭 정도는 Cp (crossing point = Ct (threshold cycles) 값을 측정하여 확인하였다. PCR의 증폭효율이 2n으로 기하급수적으로 증폭하는 단계의 사이클을 측정하게 된다. 각 성분이 세포 파쇄에 미치는 영향은 죽은 세포와 살아 있는 세포 사 이의 Cp 값의 차이 즉, △Cp (파쇄되지 않은 세포-파쇄된 세포) 값으로 확인하였다.
도 2는 파쇄 버퍼 1의 각 성분이 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄에 미치는 정도를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, TritonX 100과 MgCl2가 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는데 가장 큰 영향을 미치는 것으로 보인다. 다음으로, Tris-HCl (pH 7.4)가 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는데 영향을 미친다.
아래 표 1 내지 3은 각각 TritonX 100, MgCl2 및 Tris-HCl (pH 7.4)가 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는데 영향을 Cp 값 및 △Cp 값으로 나타낸 것이다.
표 1. TritonX 100의 영향 (파쇄 효과)
살아 있는 세포 죽은 세포
Cp 30 28.385
△Cp 1.615
표 2. MgCl2의 영향 (세포 보호 효과)
살아 있는 세포 죽은 세포
Cp 26.08 24.405
△Cp 1.675
표 3. Tris-HCl (pH 7.4)의 영향 (세포 보호 효과)
살아 있는 세포 죽은 세포
Cp 27.36 24.865
△Cp 2.495
표 1에 따르면, 살아 있는 세포의 Cp 값은 감소하지 않았으므로, TritonX 100은 세포를 파쇄하는 효과가 있는 것으로 여겨진다. 또한, 표 2와 3에 따르면, 살아 있는 세포의 Cp 값은 감소하였으므로, MgCl2와 Tris-HCl (pH 7.4)은 세포 보호 효과가 있는 것으로 여겨진다. 특히 Mg의 경우 살아 있는 세포의 값에도 영향을 미치는 것으로 보아 음전하를 띠는 세포막의 안정성에 관련하여 이 성분이 없을 경우 살사 있는 세포도 파쇄시키므로 적정한 농도의 조절이 중요할 것으로 보인다.
실시예 3: 파쇄 버퍼가 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는지 여부의 확인
본 실시예에서는 파쇄 버퍼1이 죽은 세포를 선택적으로 파쇄한다는 것을 형광 현미경을 통하여 확인하였다. 파쇄 버퍼 1은 2.5 부피% TritonX 100, 5mM MgCl2 및 30mM Tris HCl (pH 7.4)로 구성되는 파쇄 용액이다.
구체적으로, 대장균 BL21을 10ml의 LB 배지에 접종하고 밤새 배양한 후, 1ml를 10ml의 새로운 배지에 2 시간 배양하여, 대수기의 대장균을 PBS 중에 첨가시켜 108 cells/ml의 농도로 하였으며, 이를 살아 있는 세포로 사용하였다. 죽은 세포는, 동일한 부피의 상기 살아 있는 세포를 72℃에서 15분 동안 열처리한 것을 사용하였다 (Journal of Microbiological Methods 2006,67, 310-320). 이렇게 얻어진 죽은 세포 및 살아 있는 세포을 동일한 부피로 혼합한 혼합용액, 죽은 세포 용액 및 살아 있는 세포 용액 1ml에 프로피듐 아이오다이드 (PI) 염료 및 SYTO9 염료를 각각4.5㎕의 양으로 첨가하였다 (Invitrogen L7012, LIVE/DEADTM BacLightTM Bacterial Viability Kits). 이를 암 상태로 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 여기서, PI는 살아 있는 세포에 투과성이 없는 염료로 죽은 세포만을 빨간 색으로 염색시키고, SYTO9는 살아 있는 세포에 투과성이어서 살아 있는 세포만을 염색하는 염료이다.
혼합용액, 죽은 세포 용액 및 살아 있는 세포 용액 0.1ml에 상기 파쇄 버퍼를 1ml에 첨가하고, 10분 동안 배양하여 세포를 파쇄시켰다. 다음으로, 상기 배양 물을 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 3은 죽은 세포와 살아 있는 세포의 혼합용액, 죽은 세포 용액 및 살아 있는 세포 용액을 파쇄 버퍼 1로 처리한 결과를 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에서 A 및 B의 빨간 색이 D와 E에서는 모두 사라진 것을 알 수 있다. 이는 파쇄 버퍼 1로 처리한 결과, 죽은 세포는 모두 파쇄되었다는 것을 나타낸다. 반면, C의 녹색은 F에서도 여전히 나타나므로, 살아 있는 세포는 파쇄 버퍼 1로 처리하더라도 파쇄되지 않는다는 것을 나타낸다. 도 3에서, A, B, 및 C는 각각 세포의 혼합용액, 죽은 세포 용액 및 살아 있는 세포 용액으로 파쇄 버퍼 1로 처리하기 전의 형광 사진이고, D, E 및 F는 각각 세포의 혼합용액, 죽은 세포 용액 및 살아 있는 세포 용액으로 파쇄 버퍼 1로 처리한 후의 형광 사진이다.
실시예 4: 파쇄버퍼 1의 각 성분의 최적 농도의 확인
본 실시예에서는 파쇄 버퍼1 중의 TritonX 100과 MgCl2의 농도를 달리하거나 대체하여 이들이 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는데 미치는 영향을 확인하였다. 파쇄 버퍼 1은 0.8M 수크로즈, 2.5% TritonX 100, 12.5mM MgCl2 및 30mM Tris HCl (pH 7.4)로 구성되는 파쇄 용액이다.
구체적으로, 대장균 BL21을 10ml의 LB 배지에 접종하고 밤새 배양한 후, 1ml를 10ml의 새로운 배지에 2시간 배양하여, 대수기의 대장균을 PBS 중에 첨가시켜 108 cells/ml의 농도로 하였으며, 이를 살아 있는 세포로 사용하였다. 죽은 세포는, 동일한 부피의 상기 살아 있는 세포를 72℃에서 15분 동안 열처리한 것을 사용하였 다 (Journal of Microbiological Methods 67 (2006) 310-320).
이렇게 얻어진 죽은 세포 및 살아 있는 세포 0.1ml에 상기 파쇄 버퍼 1에서, TritonX 100의 농도를 0 내지 5 부피%의 범위로 변형하여 얻어진 버퍼, 상기 파쇄 버퍼 1에서 TritonX 100를 0 내지 5부피%의 Tween 20으로 대체하여 얻어지는 버퍼, 상기 파쇄 버퍼 1에서 MgCl2를 0 내지 5mM로 달리하여 얻어지는 버퍼 1ml에 첨가하고, 10분 동안 배양하여 세포를 파쇄시켰다. 다음으로, 상기 배양물을 13000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 상층 (supernatant)을 취하였다. 취하여진 상층 10㎕를 주형으로 하고, 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 (70bp PCR 산물 포워드 프라이머: 5＇-TGTATGAAGAAGGC TTCG-3＇, 리버스 프라이머 5＇-AAAGGTATTAACTTTACTC-3＇)를 프라이머로 하여, PCR을 수행하였다. 프로브로는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 (5＇-FAM-GTACTTTCAGCGGGGAGGAA-TMARA-3＇)의 TaqmanTM 프로브를 사용하였다. 2X PCR mastermix (1X PCR buffer, 5mM MgCl2, 250nM dNTP, 0.1U/㎕ Taq DNA polymerase (Solgent), 200nM primers, 200nM probe)를 제조하여 상층액 DNA와 1:1로 혼합하여 용액을 준비하였다. PCR은 초기 변성 94℃에서 180초, 변성 94℃에서 10초 및, 어닐링 50℃에서 30초 및 중합 72℃에서 30초를 30회 반복하였다. PCR은 Lightcycler 2 (Roche) 기기를 사용하여 리얼 타임 PCR을 수행하였으며, 그 증폭 정도는 Cp (crossing point = Ct (threshold cycles) 값을 측정하여 확인하였다 PCR의 증폭 효율이 2n으로 기하급수적으로 증폭하는 단계의 사이클을 측정하게 된다. 각 성분이 세포 파쇄에 미치는 영향은 죽은 세포와 살아 있는 세포 사이의 Cp 값의 차이 즉, △Cp (파쇄되지 않은 세포-파쇄된 세포) 값으로 확인하였다. 죽은 세포의 양성 대조군은 살아 있는 세포를 95℃에서 15분 동안 열처리한 것을 사용하였다 (완전히 파쇄된 세포).
도 4는 파쇄 버퍼 1의 TritonX 100 성분이 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄에 미치는 정도를 나타내는 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, TritonX 100은 0.1 부피% 내지 3 부피%에서 효과가 좋은 것으로 여겨진다.
도 5는 파쇄 버퍼 1의 TritonX 100 성분을 Tween 20으로 대체하였을 경우 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄에 미치는 정도를 나타내는 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, Tween 20은 0.1 부피% 내지 3 부피%에서 효과가 좋은 것으로 여겨진다. 처리하지 않은 세포의 경우 처리하는 동안 자연적으로 죽어 다른 대조군과는 달리 Cp 값이 상대적으로 차이가 미비하다. 동일 실험의 대조군을 고려할 경우 Tween 20는 효과가 있는 것이다.
도 6은 파쇄 버퍼 1의 MgCl2 성분이 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄에 미치는 정도를 나타내는 도면이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, MgCl2 성분은 1mM 내지 25mM에서 효과가 좋은 것으로 여겨진다.
그에 SDS에 대하여도 실험을 하였으나, 살아 있는 세포를 파쇄하므로, 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 효과가 없었다 (데이터 미제시).
실시예 4의 결과로부터, 최종 선정된 파쇄버퍼는 2.5 부피%(v/v) TritonX100/5mM MgCl2/30mM Tris-HCl (pH7.4) 이다.
도 1은 파쇄 버퍼에 따른 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄 정도를 나타내는 도면이다.
도 2는 파쇄 버퍼 1의 각 성분이 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄에 미치는 정도를 나타내는 도면이다.
도 3은 죽은 세포와 살아 있는 세포의 혼합용액, 죽은 세포 용액 및 살아 있는 세포 용액을 파쇄 버퍼 1로 처리한 결과를 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 파쇄 버퍼 1의 TritonX 100 성분이 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄에 미치는 정도를 나타내는 도면이다.
도 5는 파쇄 버퍼 1의 TritonX 100 성분을 Tween 20으로 대체하였을 경우 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄에 미치는 정도를 나타내는 도면이다.
도 6은 파쇄 버퍼 1의 MgCl2 성분이 죽은 세포와 살아 있는 세포의 파쇄에 미치는 정도를 나타내는 도면이다.
<110> Samsumg Electronics Co., Ltd. <120> Method of selectively lysing a dead cell in a cell populations in a sample <130> PN076192 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 tgtatgaaga aggcttcg 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 aaaggtatta actttactc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5' terminus is modified with FAM <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> 3' terminus is modified with TMARA <400> 3 gtactttcag cggggaggaa 20

Claims (14)

  1. 세포를 포함하는 시료를 비이온 계면활성제와 2가 양이온 염을 포함하는 파쇄 버퍼와 혼합하여 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 단계를 포함하는, 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비이온 계면활성제는 TritonX 100, Tween 20, NP40, 및 Brij 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비이온 계면활성제의 농도는 0.1 부피% 내지 3 부피%인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 2가 양이온 염은 Ca2 + 또는 Mg2 +의 염인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 2가 양이온 염은 CaCl2, MgCl2 또는 MgSO4인 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 2가 양이온 염의 농도는 1mM 내지 25mM인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 비이온 계면활성제는 0.1 부피% 내지 3 부피%의 TritonX 100이고, 상기 2가 양이온 염은 1mM 내지 25mM의 MgCl2인 것인 방법.
  8. 세포를 포함하는 시료를 비이온 계면활성제와 2가 양이온 염을 포함하는 파쇄 버퍼와 혼합하여 죽은 세포를 선택적으로 파쇄하는 단계; 및
    상기 파쇄된 죽은 세포와 살아 있는 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 시료 중의 세포 집단으로부터 죽은 세포 또는 살아 있는 세포를 선택적으로 분석하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 비이온 계면활성제는 TritonX 100, Tween 20, NP40, 및 Brij 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 비이온 계면활성제의 농도는 0.1 부피% 내지 3 부피%인 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 2가 양이온 염은 Ca2 + 또는 Mg2 +의 염인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 2가 양이온 염은 CaCl2, MgCl2 또는 MgSO4인 것인 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 2가 양이온 염의 농도는 1mM 내지 25mM인 것인 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 비이온 계면활성제는 0.1 부피% 내지 3 부피%의 TritonX 100이고, 상기 2가 양이온 염은 1mM 내지 25mM의 MgCl2인 것인 방법.
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