BRPI0506549B1 - método para avaliação da integridade da cromatina/dna de células de esperma de um animal e kit para sua realização - Google Patents

Abstract

"método para avaliação da integridade da cromatina/dna e de esperma animal e kit para a avaliação da qualidade do esperma animal". a presente invenção descreve um método para a determinação da fragmentação do dna no esperma animal. ela se refere particularmente a um procedimento para avaliar a integridade da cromatina/dna do esperma por meio de um tratamento da amostra com uma solução desnaturante seguido, opcionalmente, por um tingimento; um tratamento subseqüente com uma solução de lise que não contém um detergente desnaturante de proteínas, seguido, opcionalmente, por um tingimento; e uma avaliação da integridade da cromatina/dna. a presente invenção também se refere a um kit para a avaliação da qualidade do esperma animal que inclui uma solução desnaturante de dna e uma solução de lise que não contém um detergente desnaturante de proteína.

Description

"MÉTODO PARA AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DA CROMATINA/DNA DE CÉLULAS DE ESPERMA DE UM ANIMAL E KIT PARA SUA REALIZAÇÃO" DESCRIÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção tem seu campo de aplicação no setor da saúde, principalmente no setor relacionado à reprodução biológica, e refere-se particularmente a procedimentos e métodos para a determinação da qualidade do sêmen em animais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Atualmente, 6% dos machos, em idade fértil, em países ocidentais, têm algum tipo de doença que impede a reprodução normal. Como consequência disso, a Organização Mundial de Saúde (OMS) uniu uma série de procedimentos de laboratório em um único protocolo que padroniza a análise da qualidade do sêmen em âmbito internacional. Estes estudos estão centrados na determinação da concentração, da morfologia e da motilidade do esperma, complementados com a avaliação de determinados testes funcionais, bem como de parâmetros bioquímicos e enzimáticos determinados do sêmen (OMS, 1999). Este grupo de testes pode estimar o volume total do mesmo e a concentração de espermatozóides por mililitro e pode ser diagnosticado se a infertilidade do macho se deve a uma ausência (azoospermia) ou a uma diminuição clara (oligospermia) pela quantidade de esperma na ejaculação. Além disso, determina a possível existência de problemas de motilidade (astenozoospermia) que torna impossível que estas células cruzem a cavidade uterina e alcancem com sucesso o terço externo dos tubos de Falópio. Também é analisado se existem sérios problemas morfológicos de seus componentes (cabeça, pescoço, cauda) (teratozoospermia), ume vez que estas variações têm repercussões na capacidade de uma fertilização eficiente do óvulo da fêmea. Adicionalmente, explora do mesmo modo a participação de glândulas tais como a próstata e as vesículas seminais (infecções, agênese). Por último, testes funcionais tais como o teste de HOS (permeabilidade iônica da membrana celular) ou a capacidade de progressão do espermatozóide in vitro dão uma ideia da capacidade de fertilidade do sêmen. Finalmente, estes estudos de laboratório têm que ser ocasionalmente complementados com perfis hormonais, biópsia de testículos e/ou a determinação de testes genéticos cariotipicos e/ou moleculares (cujo estudo cromossômico define a condição fertilização eficiente do óvulo da fêmea. Adicionalmente, explora do mesmo modo a participação de glândulas tais como a próstata e as vesículas seminais (infecções, agênese). Por último, testes funcionais tais como o teste de HOS (permeabilidade iônica da membrana celular) ou a capacidade de progressão do espermatozóide in vitro dão uma idéia da capacidade de fertilidade do sêmen. Finalmente, estes estudos de laboratório têm que ser ocasionalmente complementados com perfis hormonais, biópsia de testículos e/ou a determinação de testes genéticos cariotípicos e/ou moleculares (cujo estudo cromossômico define a condição hereditária do sexo masculino ou feminino de um indivíduo).

Independentemente dos estudos clínicos e de laboratório, a causa da infertilidade não pode ser determinada em aproximadamente 30% a 50% dos machos inférteis, sendo chamada de infertilidade idiopática. Recentemente, foi reconhecido que os danos ao DNA do esperma poderíam explicar uma elevada porcentagem destes casos (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000), de uma maneira tal que o estudo da fragmentação do DNA do esperma é um assunto de pesquisa ativa com publicações contínuas em jornais especializados (Evenson et al., 2002). As anomalias da cromatina ou mesmo os danos ao DNA nuclear do esperma poderíam ocorrer ou mesmo ser o resultado das anomalias no invólucro do DNA que ocorrem durante a espermatogênese (Sailer et al., 1995). Também ainda existe a possibilidade de que elas podem ser o resultado de danos produzidos pelos radicais livres que causam o estresse oxidativo (Aitken et al., 1998), uma consequência de um processo possível de apoptose (Gorczyca et al., 1993). Há diferentes métodos para avaliar a integridade da cromatina/DNA do esperma humano. Entre eles merece destaque a ruptura do DNA in si tu mediante a introdução de nucleotídeos rotulados no mesmo ao utilizar enzimas tais como a transferase terminal (TUNEL) ou a polimerase de DNA (translação de divagem hidrolitica in si tu - ISNT) {Gorczyca et al-, 1993). Estes métodos são baseados no uso de enzimas no esperma fixado em lâminas. Por essa razão, a sua eficiência não é muito elevada, e apenas aquelas rupturas rotuladas que são acessíveis à enzima, o que conduz a uma reprodutibilidade relativamente baixa dos resultados. Os reagentes também são caros, portanto, as técnicas são utilizadas somente em pesquisa, não sendo possível a sua utilização para a avaliação clínica do sêmen. Uma outra técnica é o ensaio de cometa (Hughes et al., 1996). 0 esperma é incluído em um microgel de agarose em uma lâmina e é submetido a soluções de lise para extrair as membranas e as proteínas. Desse modo, são obtidos os nucleóides, isto é, os núcleos desproteinizados, nos quais os laços de DNA foram se desenrolando devido ao estiramento. Os nucleóides são submetidos à eletroforese em um tanque cheio com agente tampão, de uma maneira tal que os cordões de DNA migram ao ânodo, criando a imagem de um cometa, com uma cabeça e uma cauda na direção da migração eletroforética. Estes cometas são tingidos com uma tinta fluorescente, para serem observados sob um microscópio de fluorescência. Se o núcleo tiver uma fragmentação de DNA, uma grande quantidade deles terá migrado e terá se concentrado na cauda do cometa. Este é um teste bem sensível, mas também relativamente dispendioso e complicado para um laboratório clínico convencional. De fato, ele requer um equipamento particularmente incomum: fonte e tanque de energia de eletroforese, microscópio de fluorescência e um sistema de captura de imagens e de análise do mesmo. Por todas estas razões, também não é aplicável ao estudo clínico do sêmen e é utilizado somente para finalidades de pesquisa. A presente técnica de referência para o estudo da fragmentação do DNA do esperma é o ensaio da estrutura da cromatina da autoria de Evenson (SCSA: Sperm Chroniatin Structure Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994). Nesta técnica, o esperma em suspensão é adicionado a uma solução desnaturante ácida. O esperma sem rupturas em seu DNA é resistente a este desnaturante ácido, permanecendo como um DNA de cordão duplo. No entanto, o próprio esperma com DNA fragmentado desnatura o seu DNA, sendo transformado em DNA de cadeia única. Ele é então tingido com alaranjado de acridina. Esta tinta emite uma fluorescência verde quando se liga com o DNA de cordão duplo. No entanto, no esperma com DNA desnaturad©, em um único cordão, este fluorocroma emite uma fluorescência vermelha. O esperma com DNA desnaturado é quantificado ao utilizar a citometria de fluxo, para discriminar entre ambos os tipos de fluorescência. O SCSA é uma técnica com amplo âmbito clínico, tendo sido avaliado em um grande número de pacientes. Ao utilizar este sistema, foi estabelecido que, quando um indivíduo tem 30% ou mais de esperma com DNA fragmentado, a probabilidade de uma gestação ir a termo é menor do que 1% e isto se aplica tanto à fertilização natural quanto à reprodução assistida (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000). A porcentagem de espermatozóides com DNA fragmentado pode ser mais ou menos constante nos diferentes ciclos da espermatogênese de um indivíduo, mas também pode variar devido a fatores exógenos, ou, por exemplo, depois de um episódio febril intenso, tal como a gripe (Evenson et al., 2000). Desta maneira, estudos em série podem ser realizados, mediante a seleção das amostras com um nível mais baixo de fragmentação, para serem subsequentemente utilizadas em técnicas de reprodução assistida. É importante levar em consideração que o congelamento das amostras de sêmen em nitrogênio liquido não altera os níveis de fragmentação do DNA, portanto, este teste pode ser feito em amostras congeladas, as quais podem ser posteriormente utilizadas em inseminação, FIV {fertilização in vitro) ou ICSI (injeção de esperma intracitoplasmática). Isto tem uma grande vantagem operacional para o paciente e para o laboratório. A técnica de SCSA, embora seja vigorosa e altamente reprodutivel, é um sistema caro, dificil de ser implementado e não muito acessível ao laboratório de rotina (De Jonge, 2002) . Por esta razão, a qualidade de DNA do esperma ainda não pode ser avaliada rotineiramente, apesar de seu valor clínico verificado no estudo da infertilidade.

Recentemente, nosso grupo de pesquisa descreveu preliminarmente uma técnica que permitiu que a cromatina do esperma humano fosse dispersa in situ, demonstrando que esse esperma não tinha capacidade de dispersar o DNA fragmentado contido na cromatina (Fernandez, J.L. et al., Journal of Andrology, 2003, volume 24, N°. 1, páginas 59 a 66; "The Sperm Chromatin Dispersion Test; a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation") . Ao utilizar este método, as amostras de sêmen são tratadas seqüencialmente em microgel de agarose com uma solução desnaturante ácida, com as duas soluções de lise e com uma lavagem de modo que possam ser secadas e posteriormente tingidas. Esta técnica, que é chamada de teste de Dispersão de Cromatina no Esperma (SCD), faz uso de reagentes e condições excessivamente agressivos. O método descrito não fornece resultados consistentes, o que torna a repetição das avaliações difícil. Por outro lado, a qualidade e o contraste das imagens obtidas e a reprodutibilidade dos resultados não são suficientemente bons para que possam ser aplicados comercialmente. Além disso, a estrutura do espermatozóide é afetada e a cauda não é visível nas amostras. Este problema é grave, uma vez que o espermatozóide não pode ser facilmente distinguido de outras células na amostra, com erro subseqüente na quantificação do número de espermatozóides com cromatina/DNA danificado.

Portanto, ainda se faz necessário um processo confiável que possa ser utilizado rotineira e facilmente para o estudo da qualidade do sêmen em animais e, em particular, para avaliar a integridade da cromatina/DNA. 0 processo tem que ser vigoroso, fácil de ser implementado, barato e acessível ao laboratório básico. Ele tem que resolver os problemas previamente mencionados. Além disso, ele tem que fornecer resultados homogêneos entre os laboratórios e tem que ser apropriado para a automatização.

OBJETIVO DA INVENÇÃO 0 objetivo da invenção consiste em um método que seja rápido e preciso para a avaliação da integridade da cromatina/DNA das células de esperma em animais e que possa ser incorporado na atividade rotineira analítica, veterinária ou específica para o laboratório de reprodução humana.

Portanto, um objetivo da invenção consiste em um método para avaliar a integridade da cromatina/DNA do esperma de um animal, o qual compreende: a) uma etapa de tratamento da amostra que contém o esperma, com uma solução desnaturante de DNA, b) uma etapa de tratamento única com uma solução de lise para extrair as proteínas nucleares, c) uma etapa de avaliação da integridade da cromatina/DNA do esperma, caracterizado pelo fato que a solução de lise não contém um detergente desnaturante de proteínas e a cauda do espermatozóide não é essencialmente destruída.

De maneira geral, é preferível que a etapa a) preceda a etapa b).

Conforme é indicado, a seleção da solução de lise é crítica para atingir os objetivos da invenção. Entre os detergentes desnaturantes de proteínas que não devem ser utilizados, são incluídos os detergentes aniônicos e catiônicos, por exemplo, SDS, dodecil sulfato de sódio, benzeno sulfonato de alquila, ácido glicólico, sal hidratado, etc. Eles são detergentes que rompem extremamente as membranas, com um efeito de lise, e são ao mesmo tempo ativos na desnaturação das proteínas. Eles são utilizados na eletroforese de desnaturação onde as proteínas são submetidas à migração que assegura a desnaturação completa (perda da estrutura tridimensional). Eles são especialmente ativos em um pH ácido, de preferência em bactérias gram-positivas. A sua atividade dentro dos detergentes é elevada.

No método da invenção, é preferivelmente utilizado um detergente desnaturante que não de proteína não iônico, ou seja, um detergente que solubiliza as proteínas, mas não desnatura as mesmas. Dentre estes, o toctilfenoxipolietoxietanol é o preferido (Triton X-100), N, N-bis (3-D-Gluconamidopropil) colamida (bigCHAP), Brij (r) 35 P, N-decanoil-N-metilglucamina, digitonina, dodecanoil-N-metilglucamida, heptanoil-N- metilglucamida, octilfenóxi poli(etilenóxi) etanol ramificado (Igepal CA-630), N-Nonanoil-N-metilglucamina, Nonidet P 40, N-Octanoil-N-metilglucamina, solução Span 20, Polissorbato 20 (Tween 20). O Triton X-100 é particularmente preferido devido aos bons resultados que confere e à sua fácil disponibilidade. É preferível que a solução de lise tenha uma resistência iônica suficiente para facilitar o processo de lise na desnaturação. Foi verificado que uma solução eficaz é aquela que contém entre 1M e 3M de cloreto de sódio, entre 0,001 M e 2 M de ditiotreitol (DTT), entre 0,001 M e 2 M de 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) e entre 0,1% e 3% de Triton X-100. É particularmente apropriada uma solução que contém aproximadamente 2,5 M de NaCl, aproximadamente 0,2 M de DTT, aproximadamente 0,2 M de Tris, aproximadamente 1% de Triton X-100 e um pH de aproximadamente 7,5. A solução desnaturante de DNA é de preferência ácida, por exemplo, de um ácido selecionado do grupo que compreende ácido clorídrico, ácido acético, ácido nítrico, ou as misturas destes. De preferência, é uma solução de ácido clorídrico. O método de acordo com a invenção tem uma avaliação da integridade da cromatina/DNA da etapa de esperma após as etapas a) e b) . Embora haja diversas alternativas para esta avaliação, é preferível que ela seja visual. Com este objetivo, o procedimento inclui de preferência uma etapa de tingimento da amostra após as etapas a) e b) . Uma tinta que propicia resultados excelentes e permite que a cauda do espermatozóide seja visualizada assim como o halo característico formado é uma solução similar àquela de Wright.

Em uma variação preferida, o esperma é incluído em um meio similar a uma suspensão, de preferência em um microgel, especialmente em um microgel de agarose. A invenção também se refere a um kit de avaliação da qualidade do esperma animal, o qual compreende: a) uma solução desnaturante de DNA, b) uma solução de lise para extrair as proteínas nucleares, caracterizado pelo fato que a solução de lise não contém um detergente desnaturante de proteínas e essencialmente não destrói as caudas dos espermatozóides. 0 kit permite a execução do procedimento de acordo com a invenção que foi descrita acima.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Parâmetros utilizados para a definição do tamanho dos halos no esperma humano, de acordo com a metodologia da invenção. Ia: 0 nucleóide, que corresponde ao núcleo extensivamente desproteinizado do esperma, que consiste em duas porções: a silhueta do núcleo do esperma, chamada de núcleo, em uma posição central, e o halo periférico de dispersão de cromatina/DNA. A cauda do esperma é visível. lb: Um filtro de relevo para uma melhor visualização e estabelecimento dos limites entre o halo e o núcleo, lc: Diâmetro menor do núcleo (a) e espessura do halo (b) , como uma amostra das medições utilizadas para estabelecer os diferentes tamanhos de halos, conforme é explicado na metodologia da invenção.

Figura 2. Tipo diferente de esperma definido de acordo com o tamanho do halo que é produzido após a aplicação da metodologia da invenção. 2a: Espermatozóides com um halo de tamanho grande. 2b: Espermatozóides com um halo de tamanho médio. 2c: Espermatozóides com um halo pequeno feito sob medida. 2d: Espermatozóides sem nenhum halo. 2e: Espermatozóides sem um halo e degradado. 2f: Campo geral no qual os diferentes tipos de esperma previamente descritos são observados.

Figura 3. Correlação entre os diferentes tamanhos de halo visualizados após o tingimento com DAPI (a-e, azul de fluoresceína) e o sinal de hibridização in si tu ao utilizar uma sonda de DNA genômico humano total, de acordo com a metodologia DBD-FISH (a'-e', vermelho de fluoresceína) para visualizar o nível de fragmentação do DNA. 3a: Espermatozóides com halo e baixo sinal de hibridização (3a'). 3b: Espermatozóides com halo médio e baixo sinal de hibridização, embora ligeiramente mais alto do que no caso precedente (3b'). 3c: Espermatozóides com um halo pequeno e um aumento notável no nível de hibridização (3c'). 3d: Espermatozóides sem um halo e nível elevado de hibridização (3d')- 3e: Espermatozóides degradados e apresentando uma distribuição de hibridização irregular (3e')· Figura 4. Aplicação do método da invenção às amostras de esperma da seguinte espécie: camundongo (Mus musculus), touro (Sos taurus), rodovalho {Scophthalmus maximus) e minhoca (Lombricus terrestris) . 4a, corresponde a um touro; 4b, c, d correspondem a um camundongo; 4e corresponde à minhoca; 4f corresponde ao rodovalho.

Figura 5. Amostra de um paciente com a presença de níveis elevados de leucocitospermia. A ausência de uma cauda nos leucócitos é observada, o que permite que eles sejam diferenciados do restante dos tipos de células.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme será detalhado, o procedimento e o kit da invenção constituem um sistema simples e confiável para a determinação da freqüência do esperma com DNA fragmentado. A metodologia é aplicável em laboratórios de andrologia e em clínicas de reprodução assistida e laboratórios de procriação de animais. Também se trata de um sistema muito versátil, uma vez que é possível congelar as amostras e analisar as mesmas quando necessário, sem causar alterações nos resultados da análise. 0 procedimento da invenção, que permite a avaliação da integridade da cromatina/DNA e do esperma de um animal, compreende: a) uma etapa de tratamento da amostra que contém o esperma, com uma solução desnaturante de DNA; b) uma etapa de tratamento única com uma solução de lise para extrair as proteínas nucleares, que não contém um detergente desnaturante de proteínas e essencialmente não destrói as caudas dos espermatozóides; c) uma etapa de avaliação da integridade da cromatina/DNA do esperma.

As principais diferenças do procedimento da invenção, dentre outras, conforme mencionado no estado da técnica e especificamente conforme mencionado em Fernandez, de J.L. et al. Journal of Andrology, 2003, volume 24, n°. 1, páginas 59 a 66, estão basicamente no campo da lise e do tingimento. Desse modo, uma única solução de lise é utilizada, em vez de duas soluções seqüenciais. A composição é diferente porque não contém SDS (detergente desnaturante de proteínas aniônico) ou EDTA (agente quelante) . Ela pode incorporar um detergente relativamente suave, neutro, não desnaturante, tal como o Triton X-100.

Tecnicamente, estas diferenças conduzem à preservação das caudas dos espermatozóides. Trata-se de um aprimoramento crucial, porque a sua detecção é uma parte indispensável dos dados para discriminar se as imagens dos nucleóides realmente provêm do esperma ou correspondem a outros tipos de células que poderíam estar presentes, por exemplo, células descarnadas do trato genito-urinário, células inflamatórias, do sangue, etc. Esta persistência é atingida ao utilizar uma lise bem menos agressiva, bem como a administração do uso do SDS.

Além disso, a lise mais suave resulta no desdobramento dos cordões de cromatina, preservando melhor a morfologia da cabeça ou do núcleo e obtendo halos de dispersão com uma densidade mais elevada do material da cromatina, resultando no fato de serem mais intensamente tingidos. Em conseqüência disto, o contraste e a visualização de tamanhos diferentes de halo são bastante aprimorados, especialmente quando o tingimento de Wright é utilizado.

Uma outra vantagem significativa é que a ausência de um detergente desnaturante de proteína, tal como o SDS, permite o uso seqüencial da técnica aqui descrita com uma outra que permite que outros componentes da célula sejam visualizados. Desse modo, nos nucleóides obtidos, de acordo com a metodologia descrita, os métodos para a imunodetecção de proteínas, os tipos de proteína de laminina e outras proteínas nucleares podem ser aplicados, bem como a detecção do RNA associada com a matriz nuclear, uma vez que o DNA é estendido, a quantidade de estrutura nuclear é mantida tanto quanto possível. Isto é importante em determinados tópicos de pesquisa na estrutura nuclear do esperma.

Uma outra vantagem adicional é o uso de uma quantidade menor de reagentes e, conseqüentemente, a um custo econômico menor. Por exemplo, o DTT é particularmente caro e a redução da concentração descrita nos exemplos (um quarto do que foi descrito no artigo) é significativa para o custo. 0 que pode ser inferido por tudo o que foi expresso é que o procedimento para patentear resulta em imagens mais aprimoradas e mais reprodutíveis dos nucleóides dos espermatozóides, conforme mencionado no estado da técnica. É possível discriminar se os nucleóides provêm do esperma maduro ou de outros tipos de células e a classificação do tamanho do halo é muito mais precisa e confiável. Conseqüentemente, com o procedimento para patentear, a determinação dos níveis de fragmentação do DNA da amostra é muito mais confiável, o que significa que ele pode ser utilizado rotineira e simplesmente a um custo baixo. A sua aplicação é relevante em diferentes laboratórios, na aplicação clínica e em amostras humanas, bem como em laboratórios veterinários para o estudo de amostras animais. Isto é muito importante, uma vez que é um teste com uma aplicação clínica possível aos pacientes. A seqüência das etapas de tratamento da amostra pode ser feita em qualquer ordem, primeiramente com uma solução desnaturante de DNA, seguida pela etapa de tratamento com uma solução de lise, ou vice versa. Mas é preferível tratar primeiramente a amostra com a solução desnaturante de DNA e posteriormente com a solução de lise, uma vez que isto fornece melhores resultados. Em uma outra variação (lise seguida pela desnaturação do DNA), o esperma com o DNA fragmentado se comporta de uma maneira diferente. Neste caso, o esperma dispersa fragmentos de cromatina/DNA, causando halos maiores. Até mesmo um único tratamento com uma solução de lise pode ser suficiente para observar este comportamento, embora a discriminação dos tamanhos do halo não seja muito precisa. 0 procedimento da invenção é definido em detalhes abaixo, conjuntamente com algumas variações e etapas opcionais. 0 elemento versado na técnica deve compreender que há outras maneiras de realização e outras possibilidades contanto que os aspectos fundamentais que são descritos sejam mantidos. A primeira etapa é a preparação da amostra. A mesma é obtida ao utilizar os procedimentos comuns para este campo, e a concentração de esperma na amostra é determinada. A concentração apropriada para esta análise varia entre 0,1 e 20 milhões de células por mililitro. Se a amostra for altamente concentrada, ela é ajustada a uma concentração apropriada ao diluir a mesma com o meio de cultura ou com uma solução de fosfato/solução salina tamponada (PBS) ou similar. A amostra de sêmen tem que ser colocada eim um suporte para seu processamento de acordo com o procedimento da invenção e para tornar a sua avaliação mais fácil. Este é de preferência uma lâmina de vidro que pode ser coberta com uma película de agarose padrão. Para isso, uma solução padrão de agarose entre 0,2% e 1% é preparada em água destilada em um frasco de Coplin ou similar. Ela é coberta com uma gaze de plástico e é colocada em um forno de microondas. O forno de microondas é ajustado a uma potência entre 300 W e 1.000 W, por exemplo, 500 W, agitando o recipiente para aprimorar a dissolução da agarose, até que ele entre em ebulição. Este procedimento pode ser realizado ao utilizar um banho termostático. Quando a solução de agarose fica completamente transparente, ela será então preparada ao ser colocada em recipientes verticais de 10 ml a 250 ml. Estes recipientes devem ser previamente aquecidos entre 60°C e 100°C, por exemplo 70°C, em um banho, para manter a solução de agarose no estado liquido.

Antes de introduzir as lâminas na solução de agarose, estas são limpas ao serem friccionadas com um pano para eliminar possíveis impurezas. As lâminas são submersas verticalmente, mantidas com pinças na área fosca, entre 1 a 60 segundos, retirando e retornando as mesmas para serem submersas entre uma e dez vezes, até ser formada uma película homogênea na lâmina. Estas são depositadas horizontalmente sobre uma superfície lisa, por exemplo de vidro ou de metal e são resfriadas até entre 1°C e 15°C, de preferência a 4°C. Esta placa, com as lâminas, é colocada no refrigerador a 4°C por 30 minutos, até que seja verificado que a agarose se transformou em gel na superfície das lâminas. As bandejas são removidas do refrigerador e a superfície da lâmina que estava em contato com a placa é limpa com papel de borrão. Em seguida, as lâminas são colocadas horizontalmente em uma câmara de secagem em uma faixa de temperatura entre 37°C e 100°C, até que a agarose esteja completamente seca e forme uma película fina aderida ao vidro. As lâminas tratadas desse modo podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser armazenadas em uma caixa bem vedada à temperatura ambiente por diversos meses.

Para tornar o processamento da amostra que contém o esperma mais fácil, este pode ser incluído em um meio com características similares àquelas de uma suspensão tal como, por exemplo, um microgel de agarose. Neste caso, uma solução de agarose com baixa fusão/transformação em gel a uma concentração entre 0,5% e 2% em água destilada é preparada. A transformação deste ágar em gel é realizada em um forno de microondas ou em um banho termostático e é mantida então entre 30°C e 37 °C em um tubo colocado em um banho termostático ou em uma câmara de secagem. O sêmen e a solução de agarose são misturados com cuidado em um tubo de Eppendorf ou similar, de uma maneira tal que esta última esteja em uma concentração entre 0,3% e 1%. Por exemplo, 70 microlitros da solução de agarose + 30 microlitros da amostra. É importante que a solução de agarose não esteja a uma temperatura mais elevada do que 37°C, de modo a não danificar as células.

Finalmente, para colocar a amostra sobre o suporte, as lâminas cobertas são colocadas em uma superfície lisa e fresca de vidro ou de metal, com uma temperatura que varia entre 1°C e 15°C, para evitar a formação de bolhas de ar. É recomendável depositar uma gota de 5 a 200 microlitros da mistura com uma micropipeta, colocando uma lamínula sobre a gota. Como precaução, é recomendável processar cada amostra em duplicata e utilizar uma amostra de controle cada vez que a técnica é aplicada. A placa com as lâminas é colocada em um refrigerador a 4°C por dois a trinta minutos até que a agarose seja apropriadamente transformada em gel. Uma vez que a transformação em gel tenha ocorrido, as lâminas são então retiradas cuidadosamente do mesmo refrigerador, para se certificar que o microgel não seja danificado.

Uma vez que as amostras estejam preparadas apropriadamente para a sua manipulação fácil e repetida, elas são então tratadas de acordo com o procedimento da invenção com uma etapa de tratamento com a solução desnaturante de DNA e uma etapa de lise para extrair as proteínas nucleares.

Em uma variação preferida/· as lâminas com a amostra são colocadas primeiramente em uma posição horizontal em um recipiente que contém a solução desnaturante. A solução desnaturante de DNA pode ser ácida, por exemplo, uma solução de ácido acético, de ácido nitrico, de ácido sulfúrico, ou então alcalina tal como, por exemplo, uma solução de hidróxido de sódio, hidróxido de bário, hidróxido de potássio, a concentrações fracas. Em uma variação preferida, uma solução de ácido clorídrico é utilizada a uma concentração que varia entre 0,01N e 0,5N, de preferência entre 0,1N e 0,3N, e uma concentração de aproximadamente 0,2N é particularmente preferida. É recomendável que esta solução seja preparada no mesmo dia da realização do teste e ao manter as lâminas incubando na solução desnaturante de DNA entre 1 e 15 minutos a uma temperatura entre 1°C e 37°C, de preferência entre 18°C e 25°C, de preferência entre 20 e 22°C.

Uma vez que esta parte do processo esteja terminada, a lise da amostra é então realizada com uma única solução de lise que seja suficientemente suave de modo a não destruir as caudas dos espermatozóides. Por isso, cada lâmina é submersa, em uma posição horizontal, em um outro recipiente que contém a mesma.

Conforme mencionado anteriormente, a solução de lise é selecionada de uma maneira tal que atinja o desdobramento dos cordões de cromatina, preservando melhor a morfologia da seção principal e, portanto, a formação dos halos característicos com uma densidade mais elevada do material da cromatina. Ela também deve ser suficientemente suave para a preservação das caudas dos espermatozóides. Isto é obtido ao assegurar que detergentes e desnaturantes de proteínas agressivos sejam evitados. Adicionalmente, o controle da concentração iônica também pode permitir que este efeito seja modulado.

Em uma variação preferida, esta solução é composta de: entre 1M e 3M de cloreto de sódio, de preferência entre 2 M e 3M; entre 0,001 M e 2 M de ditiotreitol (DTT), de preferência entre 0,01M e 0,8M; entre 0,001 M e 2 M de 2 amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris), de preferência entre 0,01M e 0,4M; e entre 0,1% e 3% de Triton X-100, de preferência entre 0,5% e 1,5%. Esta solução é ajustada a um pH entre 6,5 e 8,5, de preferência entre 7 e 7,5. Há outras soluções de lise alternativas, ou as concentrações, os períodos e as temperaturas de incubação da solução podem ser variados contanto que as suas características funcionais sejam mantidas. Além disso, como alternativas ao DTT, há compostos tais como o beta-mercaptoetanol e outros agentes de redução. Como alternativas ao Tris, outras soluções de tampão podem ser utilizadas, tais como Hepes, Mops e Pipes. Como uma alternativa ao Triton X-100, outros detergentes neutros podem ser utilizados conforme mencionado acima.

Dependendo da solução empregada e do tipo de amostra, os preparados são incubados na solução de lise entre 1 e 60 minutos, de preferência entre 15 e 35 minutos; um período de aproximadamente 25 minutos é particularmente preferido; e a uma temperatura entre 1°C e 37°C, de preferência entre 18°C e 25°C, sendo que uma temperatura entre 20°C e 22°C é particularmente preferida.

Como uma alternativa total aos processos descritos previamente, a ordem de incubação na desnaturação e nas soluções de lise pode ser invertida. Os efeitos na cromatina do esperma também permitem que o esperma com cromatina/DNA danificado seja discriminado do restante do esperma. Os detalhes das diferenças obtidas serão descritos no Exemplo Número 6.

Depois do tratamento com a solução desnaturante de DNA e com a solução de lise, as preparações podem ser lavadas para eliminar vestígios destas soluções. Por isso, é utilizada uma solução de lavagem o mais suave possível, evitando agentes quelantes ou detergentes. Por exemplo, elas são submersas na posição horizontal em um recipiente que contém água destilada abundante ou em solução de tampão ou solução salina fisiológica por um período entre 1 e 60 minutos. A amostra é então desidratada. Para isso, concentrações crescentes de álcool podem ser utilizadas. Por exemplo, as lâminas são içadas e submersas em uma posição horizontal, em recipientes com uma série de concentrações crescentes de etanol, entre 5% e 100%, por 30 segundos a 60 minutos cada uma e os preparados são então colocados para secar no ar. Como uma alternativa ás incubações em uma série de etanol, os preparados podem ser desidratados mediante a incubação em álcoois diferentes, tal como o metanol, ou podem ainda ser colocadas para secar no ar ou em uma câmara de secagem.

Uma vez secas, as lâminas já processadas que contêm a amostra de. sêmen podem ser mantidas em caixas de armazenagem à temperatura ambiente por meses. Isto ajuda a separar o processo de tratamento de acordo com a invenção e a etapa seguinte de avaliação da integridade da cromatina/DNA do esperma. A armazenagem permite avaliações repetidas em intervalos diferentes de tempo de diversas amostras do mesmo indivíduo.

Uma vez que as amostras são tratadas de acordo com a invenção, elas passam pela etapa de avaliação. Há diversos processos possíveis para avaliar a integridade da cromatina/DNA do esperma conforme foi indicado anteriormente. A vantagem é que as amostras tratadas de acordo com a invenção têm um halo muito mais fácil de ser visualizado e a estrutura do espermatozóide é mantida, particularmente a integridade das caudas, o que permite que as mesmas sejam claramente distinguidas de outros tipos de células.

Em uma variação preferida, um tingimento é aplicado à amostra para facilitar a avaliação visual. Uma escolha apropriada das condições de tingimento pode obter imagens de alta qualidade e uma consistência elevada nos resultados da avaliação. Há diversas estratégias para o tingimento, dependendo se um microscópio convencional, de campo claro ou um microscópio de fluorescência é utilizado.

Tingimento para observação sob um microscópio de campo claro: Neste caso, os tingimentos que podem ser utilizados são: reagente de Wright, de Giemsa, de Orcein, de Schiff, Carmina Acética, tipos de tiazina e misturas de tipos de Romanowsky ou derivados do que foi mencionado acima (consultar Chromossome banding de AT Sumner, páginas 90 e 91) .

Os tingimentos tais como os de Wright são preferidos devido a ura tingimento mais intenso da amostra e particularmente dos halos. Com estes tingimentos, o contraste e a discriminação visual dos halos de tamanhos diferentes são significativamente aprimorados. Eles também têm a vantagem do baixo custo e da fácil disponibilidade para qualquer tipo de laboratório. O seu uso permite que as caudas sejam visualizadas, uma vez que estas não são normalmente visíveis em tingimentos de DNA com fluorocromas utilizados nos microscópios de fluorescência. É importante enfatizar que este tingimento é facilmente manipulado para conseguir o nível de tingimento apropriado, um fato não possível com Diff-Quik ou similares.

Outros tingimentos, tal como Diff-Quik, descrito por Fernandez, J.L. et al. no Journal of Andrology, 2003, volume 24, N°. 1, páginas 59 a 66, são consideravelmente mais fracos e não atingem um contraste adequado do halo em relação ao fundo. Consequentemente, quando o halo é bastante disperso, é normalmente difícil visualizar o seu esboço periférico, às vezes sendo confundido com um halo pequeno, desse modo atribuindo a categoria de fragmentação a um espermatozóide que contém o DNA intacto. Ou seja, o procedimento da publicação tem uma tendência de superestimar os níveis de fragmentação, particularmente no tingimento de campo claro. Isto é relativamente incômodo para um teste com possível aplicação em indivíduos. Portanto, é óbvio que este aprimoramento tem uma relevância enorme na confiabilidade da técnica.

Em uma variação de tingimento da amostra, a solução de Wright (Merck 1.01383.0500) é misturada com uma solução de tampão de fosfato, por exemplo, a um pH 6,88 (Merck 1.07924.1000) a uma razão de 1:30 e 30:1 (volume/volume). Uma camada de tinta é depositada, horizontalmente, a qual deve cobrir o microgel seco. O tempo de tingimento para atingir um contraste melhor varia entre 30 segundos e 60 minutos. É recomendável soprar ocasionalmente a camada de tinta. A tinta em excesso é decantada, as lâminas são lavadas delicadamente com água corrente e colocadas para secar. Se a tinta for excessiva, ela pode ser lavada em água na mesma intensidade. Uma outra possibilidade é retirar a tintura em etanol, a secagem e o tingimento uma outra vez. Se a tinta for fraca, particularmente na região dos halos de dispersão de cromatina, ela pode ser tingida outra vez diretamente com a solução de Wright.

Alternativamente, outras tintas podem ser utilizadas, tais como Hemacolor 2 (Merck 1.11956) e Hemacolor 3 (Merck 1.11957), Giemsa, bem como outras soluções de tingimento da mesma família.

Tinqimento para observação sob um microscópio de fluorescência: Dependendo da disponibilidade dos filtros de fluorescência, as amostras podem ser tingidas com fluorocromas específicos para o DNA do tipo DAPI, Hoechst 33258, brometo de etídio, iodeto de propídio, etc., em um meio anti-enfraquecimento (por exemplo; Vetor H-1000).

Se preparados permanentes forem desejados, as lâminas processadas e tingidas podem ser incluídas em meios de montagem (por exemplo, Entellan; Merck 1,07961).

Finalmente, a integridade da cromatina/DNA do esperma é avaliada ao prosseguir com a distinção dos tipos de células. Conforme já foi mencionado, o procedimento da invenção torna esta avaliação muito mais fácil, conforme mencionado no estado da técnica.

As imagens obtidas podem ser estudadas pela análise visual direta ou pela aplicação do software de análise de imagens digitalizadas, obtido ao utilizar câmeras analógicas ou digitais, acopladas às plataformas do microscópio.

Inicialmente, o estudo de um mínimo de 500 espermatozóides por amostra é recomendado, mediante a adoção dos seguintes critérios básicos (consultar a Figura 1 e a Figura 2): 1. Espermatozóides sem halo de dispersão de cromatina (Figura 1). 2. Espermatozóides sem halo de dispersão de cromatina e degradados: aqueles que não apresentam um halo, têm uma cabeça fragmentada em grânulos ou apresentam um tingimento muito fraco. (Figura 1). 3. Espermatozóides com um halo de dispersão de tamanho pequeno: a espessura do halo é menor do que ou igual a 1/3 do diâmetro inferior do núcleo (Figura 1). 4. Espermatozóides com um halo de dispersão de tamanho médio: a espessura do halo fica compreendida entre mais do que 1/3 do diâmetro inferior do núcleo e menor do que o diâmetro do núcleo (Figura 1) . 5. Espermatozóides com um halo de dispersão de tamanho grande: espermatozóides onde o halo é maior do que ou igual ao diâmetro inferior do núcleo. (Figura 1). 6. Outros: núcleos de células que não pertencem ao espermatozóide. Uma das características morfológicas que os distinguem é a ausência de uma cauda.

Os espermatozóides com DNA fragmentado podem ser considerados como aqueles sem um halo de dispersão de cromatina 1, aqueles que estão presentes sem um halo de dispersão de cromatina e degradados 2 e aqueles com um halo de dispersão de tamanho pequeno 3. Os espermatozóides com um halo de dispersão de cromatina de tamanho médio ou de tamanho grande e a fragmentação do DNA derivam dos resultados obtidos ao utilizar a técnica de DBD-FISH (DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization; Fernandez et al., 1998; 2000; 2002; Fernandez and Gonsálvez, 2002). Este procedimento permite a detecção e quantificação dos núcleos das células com rupturas de DNA, desproteinizados e submetidos à desnaturação controlada do DNA. Esta desnaturação gera seções de DNA de cadeia única a partir das extremidades das rupturas, as quais são detectadas pela hibridização in situ ao utilizar uma sonda de DNA genômico total rotulada com um fluorocroma, visíveis ao utilizar um microscópio de fluorescência. Quanto maior o nível de rupturas no DNA da célula, maior é a quantidade da sonda hibridizada e maior é a fluorescência observada. As amostras processadas de acordo com o método descrito na presente invenção contêm um DNA de cadeia única, criado pela solução desnaturante, a partir das extremidades possíveis da ruptura que existem no DNA. Portanto, a intensidade da hibridização ao utilizar a sonda de DNA genômico total será com relação à quantidade de rupturas presentes no núcleo do esperma. Dessa maneira, é confirmado que os nucleóides sem um halo ou com um halo muito reduzido no tamanho apresentam uma rotulação intensa com DBD-FISH, o que demonstra a intensa fragmentação de seu DNA (Figura 2). 0 restante dos nucleóides apresenta níveis muito baixos de marcador com esta sonda, que correspondem à profundidade de hibridização pelo próprio tratamento da cromatina. A invenção também contempla um kit para a avaliação da integridade da cromatina/DNA do esperma animal. Este kit contém uma solução desnaturante de DNA, uma solução de lise para extrair as proteínas nucleares, o qual é caracterizado pelo fato que a solução de lise não contém um detergente desnaturante de proteínas e essencialmente não destrói as caudas dos espermatozóides. As soluções desnaturantes de DNA preferidas e as soluções de lise preferidas são descritas acima.

Opcionalmente, o kit também pode conter um suporte previamente tratado, por exemplo, com agarose, bem como uma solução para a preparação de um meio com características similares a uma suspensão que contém a amostra. Por exemplo, uma solução de agarose com baixo ponto de transformação em gel que permita que um microgel seja preparado. 0 conteúdo e as instruções para o uso de um kit de acordo com uma variação da invenção são detalhados abaixo: Descrição do conteúdo do kit Lâminas previamente tratadas* Tubos de Eppendorf contendo um tubo de agarose com baixo ponto de transformação em gel (A) Tubo com 37% de HC1, tubo (B) Tubos com solução de lise, Tubo C*. Composição: 2,5M de NaCl, 0,2 M de DTT, 0,2 M de Tris, 1% de Triton X-100, pH 7,5 Recipientes de processamento para a solução desnaturante e para a solução de lise.

Lanceta Flutuadores para os tubcs de Eppendorf * Preparação conforme referido anteriormente na descrição. Material e equipamento requeridos Microscópio de campo claro ou de fluorescência (objetivo de imersão recomendado) Refrigerador a 4°C Banho de incubação a 37°C Luvas de plástico Lamínulas de vidro (18 x 18 mm, 22 x 22 mm ou 24 x 60 mm) Micropipetas Quatro recipientes horizontais para incubação Água destilada Etanola a 70%, 90%, 100% Instruções para o uso Preparação de uma amostra para as lâminas 1) Utilizar um frasco C para colocar a solução de lise à temperatura ambiente (22°C) 2) Diluir a amostra de sêmen em um meio de cultura ou em PBS, a uma concentração de 5 a 10 milhões por mililitro. Amostras frescas ou diretamente congeladas em nitrogênio liquido podem ser utilizadas.

Preparação do microgel de agarose 3) Colocar delicadamente um tubo de Eppendorf contendo a agarose com baixo ponto de transformação em gel (Tubo A) na posição vertical, para a deposição da agarose no fundo do tubo. 4) Adicionar 140 microlitros de água destilada, evitando a formação de bolhas, e suspender novamente. 5) Introduzir o Tubo A no flutuador, deixando o mesmo ao nível da tampa e deixar o mesmo flutuar por cinco minutos em água de 90 a 100°C, até que a agarose esteja dissolvida. O derretimento da agarose pode ser alternativamente realizado em um forno de microondas. 6) Transferir o Tubo A com o flutuador a um banho termostático a 37°C e deixar por cinco minutos até atingir a temperatura. 7) Adicionar 60 microlitros da amostra de sêmen ao conteúdo do Tubo A, e suspender novamente. 8) Colocar uma lâmina pré-tratada em uma superfície fria, a 4°C (por exemplo, uma folha de metal ou de vidro). 9) Uma vez que as lâminas tenham resfriado, depositar a suspensão de células do Tubo A e colocar uma lamínula, evitando a formação de bolhas de ar. É recomendável a deposição de uma gota de 11, 17 e 50 microlitros, para uma lamínula de 18 x 18 mm, 22 x 22 mm ou 24 x 60 mm, respectivamente. 10) Colocar a folha fria com as lâminas no refrigerador e deixar a amostra no gel por cinco minutos.

Processamento das amostras 11) Preparar a solução desnaturante. Para isso, adicionar 80 microlitros do conteúdo do Tubo B em 10 microlitros de água destilada, misturar e colocar na caixa verde. 12) Remover as lamínulas, deslizando as mesmas delicadamente e, imediatamente, colocar a lâmina horizontalmente, na solução desnaturante e colocar para incubar por sete minutos, à temperatura ambiente (22°C). 13) Içar as lâminas com a ajuda de uma lanceta, ao utilizar luvas. Prender as mesmas horizontalmente, e colocar horizontalmente no recipiente branco contendo 10 ml da solução de lise (Tubo C trazido à temperatura). Incubar por 25 minutos. 14) Içar as lâminas e colocar as mesmas horizontalmente em um recipiente contendo água destilada abundante para a lavagem da solução de lise. Deixar em repouso por cinco minutos. 15) Colocar as lâminas horizontalmente em um recipiente com etanol a 70% (dois minutos), a seguir com etanola 90% (dois minutos) e finalmente com etanola 100% (dois minutos) . 16) Colocar para secar no ar. Uma vez que as lâminas processadas estejam secas, elas podem ser armazenadas em gabinetes de arquivamento, à temperatura ambiente por meses. Tingimento das amostras Tingimento para observação sob um microscópio de campo claro: - Misturar a solução de Wright com o tampão de fosfato (1:1) e depositar uma camada de tinta, horizontalmente, que cubra o microgel seco. Colocar para tingir por cinco a dez minutos, soprando sobre a mesma ocasionalmente. Decantar, lavar delicadamente com água corrente e colocar para secar. Se a tinta for excessiva, a tinta pode ser retirada em etanol, secada e tingida outra vez. Se a tinta for fraca, particularmente nos halos, ela pode ser tingida outra vez com mais solução de Wright. - Uma outra possibilidade é a incubação por cinco minutos, verticalmente, em uma jarra de Coplin com solução de Hemacolor 2 (Merck 1.11956), colocar para drenar verticalmente por dez segundos e então incubar em uma outra jarra de Coplin, verticalmente, com solução de Hemacolor 3 (Merck 1.11957), por cinco minutos. Finalmente, lavar delicadamente em água destilada e colocar para secar. Se um preparado permanente for desejado, este pode ser montado em Entallan.

Tingimento para observação sob um microscópio de fluorescência: Dependendo da variabilidade dos filtros de fluorescência, as amostras podem ser tingidas com fluorocromas específicos para o DNA do tipo DAPI, Hoechst 33258, brometo de etídio, iodeto de propídio, etc., em um meio antienfraquecimento (por exemplo, Vectashield, Vector, referência: H-1000).

Segurança e o ambiente Evitar a inalação e o contato com as soluções fornecidas.

As soluções B e C contêm ácido clorídrico, ditiotreitol e Triton X-100.

Consultar as especificações fornecidas pelos fabricantes. Não descartar os produtos utilizados no meio ambiente. Seguir as diretrizes do Centro para a armazenagem e o descarte de produtos tóxicos.

As amostras biológicas devem ser manipuladas como sendo potencialmente infecciosas.

Armazenagem e estabilidade Armazenar à temperatura ambiente, exceto a solução C, a qual deve ser armazenada a 4°C. Validade: os reagentes e materiais são estáveis por um período mínimo de seis meses. É recomendável que as soluções B e C sejam mantidas na posição vertical e sejam bem vedadas. A presente invenção tem diferentes campos onde a sua aplicação é relevante. 0 seu uso em aplicações, humanas é óbvio. Por exemplo, em amostras de indivíduos inférteis cujos parâmetros de seminograma são normais, em casais com abortos repetidos, em amostras utilizadas para a reprodução assistida, em amostras que serão congeladas (criopreservação) para seu uso futuro em técnicas de reprodução assistida devido à extirpação dos testículos. Também em pacientes submetidos à quimioterapia e/ou à radioterapia devido a doenças oncológicas, e antes da realização de uma vasectomia. 0 estudo realizado com o procedimento e o kit da invenção pode aprimorar os critérios de seleção dos candidatos doadores de esperma, bem como complementar a avaliação periódica das amostras dos doadores, em bancos de esperma. Também é possível analisar o efeito da idade avançada na qualidade do sêmen e na fertilidade. A sua aplicação é interessante para a avaliação de pacientes com doenças que podem afetar a integridade do esperma: febre, infecções, varicocele, estresse, exposição a agentes genotóxicos ou acidentais no trabalho (pesticidas, radiação, oestrogenes ambientais, etc.), tratamentos com hormônios ou a exposição repetida ao calor aumentado (profissões associadas com fornos quentes, cerâmica, vidro ou motoristas de veículos). Estes indivíduos também podem ser periodicamente avaliados. Por último, a invenção é útil na pesquisa básica e clínica.

Analogamente, a invenção também encontra uso em laboratórios veterinários. É possível estudar o nível de fragmentação do DNA em diferentes espécies animais, por exemplo, a criação de machos, em amostras armazenadas, em processos de doenças, nos machos de espécies em risco de extinção e na avaliação de danos causados por agentes tóxicos.

EXEMPLOS A invenção será descrita com base em alguns exemplos que ilustrarão mais detalhadamente algumas das características previamente descritas.

Exemplo 1: Em uma amostra de sêmen fresco, a metodologia descrita é aplicada para produzir halos de dispersão de cromatina. Para isso, a amostra diluída a uma concentração de 10 milhões por mililitro, em PBS, foi misturada com 1% de agarose líquida com baixo ponto de transformação em gel, para obter uma concentração final de 0,7% desta última. Depois que o microgel foi transformado em gel sobre a lâmina, a amostra foi incubada a 22°C por oito minutos na solução desnaturante composta de 0,08M de HC1 e então na solução de lise que consiste em 2,5M de NaCl, 0,2 M de DTT, 0,2 M de Tris, 1% de Triton X-100, pH 7,5, por 25 minutos, a 22°C. As lâminas foram lavadas em água destilada por cinco minutos, foram desidratadas em banhos de etanol e foram secadas ao ar. Então, seqüencialmente e nas mesmas células, DBD-FISH (DNA Breakage Detection - Fluorescence In Situ Hybridization; Fernandez et al., 1998; 2000; 2002; Fernandez and Gonsálvez, 2002), foi então realizada ao utilizar uma sonda de DNA genômico total. Este procedimento permite a detecção e a quantificação das rupturas do DNA nos núcleos das células imersas em microgel de agarose, desproteinizadas e submetidas à desnaturação controlada do DNA. Esta desnaturação produz seções de DNA de cadeia única a partir das extremidades da ruptura, as quais são detectadas por meio da hibridização in situ ao utilizar uma sonda de DNA genômico total rotulada com um fluorocroma que emite fluorescência vermelha (Cy3). Quanto maior é o número de rupturas no DNA da célula, maior é a qualidade do DNA de cadeia única produzido pela solução desnaturante, maior é a quantidade da sonda hibridizada e maior é a fluorescência vermelha obtida. As amostras processadas de acordo com o procedimento da presente invenção contêm o DNA de cadeia única, produzido pela solução desnaturante, a partir das extremidades possíveis das rupturas que o DNA tem. Portanto, a intensidade da hibridização ao utilizar a sonda de DNA genômico total será com relação à quantidade de rupturas presentes no núcleo do espermatozóide.

Foram contadas duzentas e cinqüenta células obtidas aleatoriamente. As imagens tingidas de DAPI dos halos de dispersão de cromatina foram capturadas ao utilizar uma câmera de CCD refrigerada ao utilizar dois filtros para visualizar os halos de dispersão, visíveis em azul, e o sinal de hibridização, visível em vermelho, simultaneamente. O objetivo final consistia em estabelecer uma correlação entre o tamanho dos halos de dispersão de cromatina e o nível do marcador das rupturas de DNA. Os resultados demonstraram uma correlação inversa entre a área relativa dos halos de dispersão de cromatina e a intensidade do marcador de DNA ao utilizar DBD-FISH (Tabela 1).

Tabela 1 Deve ser observado que, quando a área relativa do halo diminui, é produzido um aumento na densidade média total (MD) da hibridização.

Em conseqüência disto, a simples determinação do tamanho dos halos de dispersão de cromatina, obtida ao utilizar nosso procedimento, oferece uma estimativa simples e direta da integridade da cromatina/DNA do esperma humano.

Exemplo 2: Método complementar para a avaliação dos doadores de esperma utilizado em técnicas de reprodução assistida.

Em uma clinica de reprodução assistida, foram utilizadas dez amostras de doadores de sêmen. Como um complemento do espermograma rotineiro, o nível de fragmentação do DNA foi determinado nestas amostras. Quinhentas células por indivíduo foram contadas. Neste caso, os resultados foram obtidos ao aplicar o teste dos halos de dispersão de cromatina da invenção. As amostras foram incluídas em um microgel de agarose, incubadas em ácido e as soluções de lise foram lavadas, desidratadas e levadas para secar, conforme descrito no Exemplo 1. 0 tingimento, neste caso, não foi feito com DAPI, mas com o tingimento de Wright, para a microscopia de campo claro. Para isso, a solução de Wright foi misturada com o tampão de fosfato (1:1) e uma camada de tinta foi colocada, horizontalmente, cobrindo o microgel seco. Ela foi tingida por cinco a dez minutos, soprando sobre a mesma ocasionalmente. Depois de uma lavagem em água corrente, ela foi colocada para secar e os nucleóides foram visualizados. Os resultados são mostrados na Tabela 2. 0 nível médio de fragmentação neste grupo foi menor do que 20% em todos os casos (15,4 ± 3,1).

Tabela 2 Distribuição das porcentagens das categorias do tamanho dos halos obtidos em ldez doadores de sêmen. A porcentagem de espermatozóides com DNA fragmentado consistiu na soma das categorias de espermatozóides com um halo pequeno, sem halo e sem halos degradados.

Exemplo 3: Avaliação clínica de pacientes inférteis.

Em uma clínica de reprodução assistida, foram empregadas dezessete amostras de doadores de esperma. Como um complemento do espermograma rotineiro, o nível de fragmentação do DNA foi determinado nestas amostras. Quinhentas células por indivíduo foram contadas. Tal como no exemplo precedente, os resultados foram obtidos ao aplicar o teste dos halos de dispersão de cromatina da invenção. Os resultados são mostrados na Tabela 3. 0 nivel médio de fragmentação neste grupo foi superior a 20% em todos os casos (49,9 ± 20,7) . f Tabela 3 Distribuição das porcentagens das categorias do tamanho dos halos obtidos em dezessete pacientes. A porcentagem de espermatozóides com DNA fragmentado consistiu na soma das categorias de espermatozóides com um halo pequeno, sem halo e sem halos degradados.

Exemplo 4: A invenção foi utilizada para avaliar os danos toxicológicos que afetam o esperma humano.

Danos por agentes exógenos e endógenos.

Como um exemplo ilustrativo, um estudo é apresentado, o qual analisou os danos ao DNA induzidos por um agente químico doador de óxido nítrico (NO). Para isso, .alíquotas de 50 microlitros de uma amostra de sêmen totalmente fresca de um indivíduo normal foram incubadas por uma hora, à temperatura ambiente, com doses diferentes de nitroprussato de sódio (SNP). As amostras tratadas foram então centrifugadas delicadamente, descartando o sobrenadante, para lavar o SNP. Depois de suspensas novamente em PBS, as amostras foram processadas de acordo com o método descrito na presente invenção.

Os resultados são apresentados na Tabela 4. deve ser observado que, quando a concentração do doador de NO foi aumentada, a porcentagem de esperma com cromatina/DNA danificado aumentou.

Tabela 4 Distribuição das porcentagens das categorias do tamanho dos halos obtidos em uma amostra de sêmen tratada com concentrações diferentes de um agente doador de óxido nitrico (NO), com capacidade para produzir danos ao DNA. A porcentagem de espermatozóides com DNA fragmentado consistiu na soma das categorias de espermatozóides com um halo pequeno, sem halo e sem halos degradados.

Exemplo 5: Reprodutibilidade do ensaio ao utilizar amostras de sêmen congeladas.

Dois fatores que poderíam afetar a qualidade das i, , amostras foram estudados, tais como o congelamento e a diluição, ao utilizar a metodologia pela análise do grau de dispersão do halo de cromatina. Para isso, quatro amostras frescas de doadores diferentes e alíquotas congeladas em nitrogênio líquido foram analisadas. A análise das amostras foi realizada pela contagem visual direta dos diferentes tipos de nucleóides (500 células), em duas lâminas diferentes e em um mínimo de duas vezes, por amostra e por ponto experimental.

Reprodutibilidade das contagens. O coeficiente de correlação intraclasse (R) foi calculado para as diferentes medições que foram realizadas em cada lâmina. Os resultados dos índices para cada tipo de célula e os cálculos com a média de duas contagens variaram entre os valores de 0,78 e 0,92 e, uma vez que os valores de R variaram entre 0 e 1, isso mostra que uma reprodutibilidade elevada foi obtida (Tabela 5).

Tabela 5 Congelamento. Os resultados obtidos são comparados ao utilizar uma análise de variância de dois fatores (método e amostra de preservação). Foi demonstrado que não havia nenhuma diferença significativa (P > 0,05) no nivel de fragmentação das amostras processadas frescas e congeladas em nitrogênio liquido. Nem o tempo de congelamento pareceu afetar a proporção do esperma com DNA fragmentado (Tabela 6).

Tabela 6 Em conclusão, a reprodutibilidade dos resultados obtidos após a análise visual direta é demonstrada.

Exemplo 6: Análise da integridade da cromatina/DNA do esperma humano ao utilizar a variação da ordem de incubação das soluções desnaturantes e de lise: Nesta variação, após a colocação do esperma nos raicrogéis de agarose, o mesmo foi incubado, em uma primeira etapa, na solução de lise descrita no kit, por 25 minutos, a 22°C. As lâminas são então submersas na solução desnaturante composta de 0,88 de HC1, por oito minutos, a 22°C. Finalmente, depois da lavagem em água destilada, as lâminas são desidratadas e tingidas com a solução de Wright e são observadas ao utilizar um microscópio de campo claro.

Utilizando esta variação técnica, os espermatozóides com DNA fragmentado comportam-se de uma maneira diferente. Neste caso, os mesmos dispersam fragmentos de cromatina/DNA, formando halos de tamanhos maiores.

Exemplo 7: Resultados da aplicação da metodologia em amostras de esperma de diferentes animais.

Com o objetivo de avaliar o caráter universal da metodologia que é proposta, indivíduos do sexo masculino de espécies diferentes foram selecionados para a realização de um estudo dos níveis de fragmentação do DNA no esperma e a visualização paralela de sua cauda como um elemento celular distintivo. Foram empregadas amostras de esperma das seguintes espécies: camundongo (Mus musculus), touro (Bos taurus), rodovalho (Scophthalmus maximus) e minhoca (Lombricus terrestris). Em todas as espécies, a aplicação da técnica produziu halos de dispersão de cromatina e suas caudas puderam ser reconhecidas, incluindo aquelas que tinham o DNA normal bem como aquelas que tinham o DNA fragmentado (Figura 4). A forma do espermatozóide e o tipo de halo produzido são característicos de cada espécie (4a corresponde ao touro; 4b, c, d correspondem ao camundongo; 4e corresponde à minhoca; 4f corresponde ao rodovalho). A morfologia do esperma, contendo o DNA fragmentado ou não, é diferente entre as espécies e, por sua vez, diferente daquela verificada em seres humanos. Em todos os casos, a dispersão de cromatina é paralela e comparável àquela encontrada no caso das amostras de esperma humano. Ou seja, halos de dispersão de cromatina de um tamanho diferente são produzidos e a cauda do espermatozóide pode ser visualizada. A morfologia e o tamanho dos halos de diferentes espécies e os resultados obtidos foram os seguintes: No exemplo do touro, amostras independentes foram analisadas ao utilizar cinco observadores diferentes. Neste caso, as diferenças foram verificadas na porcentagem de núcleos de espermatozóides com DNA fragmentado por cada indivíduo, mas nenhuma diferença foi observada entre as porcentagens obtidas entre cada observador (Tabela 7).

Tabela 7 No caso do camundongo, duas cepas diferentes foram utilizadas, uma normal (M1-32NNC) e uma outra consangüínea (M2-32BC). As porcentagens obtidas para os diferentes tipos de halos mostram diferenças claras entre uma cepa normal (7,1) e uma cepa consangüínea (25,1) (Tabela 8).

Tabela 8 No caso específico do rodovalho, os espermatozóides que tinham um halo de dispersão de cromatina grande e um núcleo pequeno poderíam ser distinguidos versus aqueles que tinham um halo de dispersão pequeno e um núcleo grande e, finalmente, outros sem um halo de dispersão. Os resultados são indicados na Tabela 9.

Tabela 9 No caso da minhoca, uma geração dinâmica de halos similares que foram descritos nos casos precedentes é produzida e, neste caso, a cabeça do espermatozóide e sua cauda também podem ser perfeitamente distinguidas. A porcentagem estimada de esperma que contêm o DNA fragmentado em dois indivíduos estudados (um jovem e um adulto) foi de 15% e 22%/ respectivamente. Neste caso, as cabeças dos espermatozóides aparecem com uma formação parcial de halo, cujo significado se encontra atualmente em fase de investigação (consultar a Figura 4e).

Exemplo 8: Visualização da mesma preparação citológica de halos de dispersão de cromatina, de caudas de espermatozóides e de leucócitos. Avaliação do efeito da leucocitospermia na integridade do DNA nas amostras de esperma. A leucocitospermia é um processo invasivo indesejado que conduz ao aumento anormal dos leucócitos em amostras de fluido seminal (> 5 x 106/ml) . A leucocitospermia foi detectada entre 10% e 20% dos machos inférteis. Parece que os neutrófilos bem como os macrófagos presentes no sêmen podem gerar ROS (Espécies Reativas ao Oxigênio) que causam um estresse oxidativo, e resultam em danos ao DNA no esperma (Omu et al., 1999; Erenpreiss et al., 2002; Henkes et al., 2003). De fato, a leucocitospermia foi associada com diferentes anomalias dos parâmetros clássicos utilizados na análise da qualidade do esperma. Por exemplo, quando a incidência de espermatozóides anormais ocorre em apenas 47% das amostras de indivíduos sem leucocitospermia, a porcentagem aumenta para 88% quando esta leucocitospermia está presente (www.clevelandclinic.org).

Em uma amostra de cinco pacientes, com níveis elevados de leucocitospermia de etiologia diferente {prostatite e infecções devido a clamidomonas e agentes bacterianos) , a resposta à técnica foi estudada para diferenciar, inequivocamente, a porcentagem de leucócitos presentes nas amostras de sêmen e os níveis de fragmentação do DNA no esperma das mesmas amostras. A diferença, entre ambos os tipos de células, quando as amostras são submetidas ao mesmo tratamento, é clara, uma vez que os espermatozóides com DNA fragmentado bem como aqueles que não o tem, apresentam uma cauda que caracteriza os mesmos. A ausência de uma cauda nos leucócitos permite a diferenciação destes do restante dos tipos de células (Figura 5).

Dessa maneira, uma correlação direta pode ser estabelecida entre o número de leucócitos por amostra e os níveis de fragmentação no esperma. A Tabela 10 mostra o nível de leucócitos em amostras de sêmen de cinco pacientes afetados pela leucocitospermia de etiologia diferente e a porcentagem de espermatozóides com DNA normal (grande e médio; L/M) e fragmentado (halo pequeno e sem halo (S/WH).

Tabela 10 REFERÊNCIAS

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Claims (16)

1. Método para avaliação da integridade da cromativa/DNA de células de esperma de um animal, caracterizado pelo fato compreender: a) Uma etapa de tratamento da amostra que contém o esperma, com uma solução desnaturante de DNA, em que a referida solução de desnaturação de DNA compreende um reagente a uma escala de concentração de 0,01 a 0,5 N, selecionado a partir do grupo de: ácido clorídrico, ácido acético, ácido nítrico, ácido sulfúrico, hidróxido de sódio, hidróxido de bário, hidróxido de potássio e suas misturas; b) Uma etapa de tratamento única com uma única solução de lise para extrair as proteínas nucleares, em que a referida solução de lise compreende; 1. cloreto de sódio na escala de concentração de 1 a 3 M, ii. um agente de redução na escala de concentração de 0,001 até 2 M, selecionado a partir do grupo: ditiotreitol (DTT) e beta-mercaptoetanol; iii. um tampão susceptível de ajustar o pH entre 6,5 e 8,5 na faixa de concentração de 0,001 até 2 M selecionado a partir do grupo de: 2-amino-2 (hidroximetil) 1,3-propanodiol (Tris), HEPES, MOPS e Pipes; e uma proteína não desnaturante detergente não iônico na gama de concentrações de 0,1% a 3%, selecionado a partir do grupo toctylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), N, N-bis (3-D-gluconamidopropil) cholamide (bigCHAP), Brij (r ) 35 P, N-decanoil-N-metilglucamina, digitonina, dodecanoil-N-metilglucamida, heptanoil-N- metilglucamida, ramificado octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol (Igepal CA-630), N-nonanoil-N-metilglucamina, Nonidet P 40, N-Octanoil-N-metil-glucamina, 20 solução Span, Polisorbato 20 (Tween 20) e suas misturas, e c) Um estágio de avaliação da integridade da cromatina/DNA do esperma baseado na medida do tamanho do halo das células de esperma.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a concentração de cloreto de sódio é entre 2 M e 3M.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a concentração da redução do agente é entre 0,01 M e 0,8 M.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a concentração do tampão é entre 0,01 M e 0,4 M.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o pH do tampão é entre 7 e 7,5.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a concentração do detergente não iônico é entre 0,5% e 1,5%.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o detergente não iônico é selecionado do grupo: Triton X-100, Igepal, Nonidet P40, Tween 20 e misturas destes.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato que a solição de lise compreende 2,5 M de cloreto de sódio, 0,2 M de DTT, 0,2 M de Tris, 1% de Triton X-100 e um pH de 7,5.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato que a solução desnaturante de DNA é selecionada a partir do grupo de ácido hidroclorídrico, ácido acético, ácido nítrico e ácido sulfúrico.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato que a solição desnaturante de DNA compreende o ácido clorídrico.

11. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato que, depois das etapas a) e b), há uma etapa de tingimento da amostra.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato que o tingimento é feito com uma solução do tipo Wright.

13. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato que a amostra que contém o esperma é incluída em um meio similar a uma suspensão, de preferência em um microgel.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato que a amostra que contém o espera é incluída em um microgel de agarose.

15. Kit para realização do método tal como descrito na reivindicação 1 caracterizado pelo fato que compreende: a) Uma solução desnaturante de DNA; b) Uma única solução de lise para extrair as proteínas nucleares, em que a solução de lise contém um detergente não desnaturante de proteínas;

16. Kit, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato que a solução de lise compreende entre 1 M e 3 M de cloreto de sódio, entre 0,001 M e 2M de ditiotreitol (DTI), entre 0,001 M e 2 M de 2-amino-2(hidroximetil)-1,3propanodiol (tris) e entre 0,1% e 3% de Triton X-100.