ES2961158T3 - Métodos y kits para detectar la fragmentación de ADN espermático - Google Patents

Métodos y kits para detectar la fragmentación de ADN espermático Download PDF

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Abstract

En el presente documento se describen métodos para la detección de la presencia de fragmentación del ADN del esperma en una muestra de semen. Los métodos incluyen la inclusión de espermatozoides de la muestra de semen en un gel, la desnaturalización del ADN de los espermatozoides y la lisis de las proteínas nucleares de los espermatozoides. El presente método incluye un tensioactivo iónico dodicilsulfato de sodio (SDS) y un agente caotrópico urea en la solución de lisis para liberar ADN de la protamina del cromosoma, lo que reduce significativamente el tiempo requerido para la lisis. También se divulga un kit para detectar la fragmentación del ADN del esperma en una muestra de semen. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y kits para detectar la fragmentación de ADN espermático
Campo
La presente descripción se refiere a un método para la detección de la presencia de fragmentación de ADN espermático en una muestra de semen. La presente descripción también se refiere a un kit para detectar fragmentación de ADN espermático en una muestra de semen.
Antecedentes
La integridad del ADN espermático es crucial para la calidad del embrión, la implantación del embrión y el desarrollo del embrión. La fragmentación del ADN espermático (SDF) puede provocarse por factores extrínsecos (tales como radiación, contaminantes ambientales y agentes quimioterapéuticos), así como por factores intrínsecos (tales como una espermatogénesis defectuosa, apoptosis de esperma y estrés oxidativo). La SDF puede causar infertilidad masculina, fracaso de la fertilizaciónin vitro(IVF) y aborto espontáneo. Por lo tanto, la detección de SDF es importante para las pruebas de fertilidad y las técnicas de reproducción asistida (ART).
Los métodos convencionales para detectar SDF incluyen un ensayo de la estructura de cromatina de esperma (SCSA), ensayo de marcaje del extremo de corte de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL), ensayo de detección de rotura de ADN-hibridación fluorescentein situ(DBD-FISH), ensayo Comet (CA) y prueba de dispersión de cromatina de espermatozoides (SCD).
La prueba SCD es un ensayo halo modificado que utiliza métodos bioquímicos para detectar SDF. Los procedimientos de prueba SCD implican embeber espermatozoides en un gel de agarosa, seguido de la desnaturalización del ADN y desproteinización. Durante la desproteinización se lisa la proteína nuclear (incluida la protamina) de cada espermatozoide. Las etapas de desnaturalización del ADN requieren aproximadamente 7 minutos y el procedimiento de lisis tarda aproximadamente 20 minutos. (véanse las especificaciones del producto del Kit Haloespery G2, Helotech)
Fernandez y col. 2003 (J Andrology 24(1): 59-66) describen un método para detectar la fragmentación del ADN espermático embebiendo la muestra de semen en un gel de agarosa, y mediante la desnaturalización del ADN utilizando HCl, lisis de las proteínas nucleares durante 15 minutos utilizando soluciones de lisis que comprenden DTT 0,8 M, SDS al 1 % y NaCl 2 M, realización de la tinción de ADN con, por ejemplo, DAPI y la observación de la formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides.
El documento EP2637019 describe un método que comprende una etapa de detección de fragmentación de ADN espermático mediante la observación de la formación de halos alrededor de la cabeza del esperma, en donde las células están en un gel, p. ej., agarosa, y los halos se detectan después del tratamiento con una solución ácida y una solución de lisis antes de la tinción, en donde la solución de lisis puede contener un detergente y un agente caotrópico, el detergente es preferiblemente SDS, preferiblemente al 1 %, y los agentes caotrópicos incluyen urea, normalmente a una concentración 6-8 M.
A pesar de lo mencionado anteriormente, sigue existiendo la necesidad de desarrollar un método para la detección rápida y precisa de SDF, porque cuanto más tiempo lleven las pruebas SCD, mayor incertidumbre sobre la muestra generará la prueba de SCD.
Resumen
La invención se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
En un primer aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que puede aliviar al menos uno de los inconvenientes de la técnica anterior. El método incluye:
(a) embeber la muestra de semen que contiene espermatozoides en un gel que contiene un componente seleccionado del grupo que consiste en agarosa, acrilamida, alginato y cloruro de vinilo, para obtener un gel que embebe los espermatozoides;
(b) someter el gel que embebe los espermatozoides a un tratamiento de desnaturalización de ADN con una solución de desnaturalización de ADN, de modo que se desnaturalice el ADN de los espermatozoides embebidos en el gel;
(c) someter el gel desnaturalizado obtenido en la etapa (b) a un tratamiento de lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml), de modo que se lisan las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel;
(d) someter el gel lisado obtenido en la etapa (c) a la tinción de ADN; y
(e) observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático.
En un segundo aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que puede aliviar al menos uno de los inconvenientes de la técnica anterior. El método incluye:
(a) someter una solución de agarosa a un tratamiento térmico, seguido de la adición de una solución de desnaturalización de ADN y la muestra de semen que contiene espermatozoides, para formar una mezcla;
(b) someter la mezcla a una reacción de polimerización en gel, para obtener un gel de agarosa con los espermatozoides que contienen el ADN desnaturalizado embebidos en su interior;
(c) someter el gel de agarosa a un tratamiento de lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml), de modo que se lisan las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel; (d) someter el gel de agarosa lisado obtenido en la etapa (c) a la tinción de ADN; y
(e) observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático.
En un tercer aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que puede aliviar al menos uno de los inconvenientes de la técnica anterior. El método incluye:
(a) mezclar la muestra de semen que contiene espermatozoides con una solución de desnaturalización de ADN y un componente de formación de gel, seguido del sometimiento de la mezcla así obtenida a una reacción de polimerización en gel, para obtener un gel con los espermatozoides que contienen ADN desnaturalizado embebidos en su interior, seleccionándose el componente de formación de gel del grupo que consiste en acrilamida, alginato y cloruro de vinilo;
(b) someter el gel a un tratamiento de lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml), de modo que se lisan las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel;
(c) someter el gel lisado obtenido en la etapa (b) a la tinción de ADN; y
(d) observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático.
En un cuarto aspecto, la presente descripción proporciona un kit para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que puede aliviar al menos uno de los inconvenientes de la técnica anterior. Este incluye: una formulación de formación de gel que incluye un componente seleccionado del grupo que consiste en agarosa, acrilamida, alginato y cloruro de vinilo;
una solución de desnaturalización de ADN;
una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml); y
un reactivo de tinción de ADN.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la imagen de una muestra de semen que contiene espermatozoides con halo y espermatozoides sin halo.
La figura 2 muestra el índice de fragmentación de ADN (DFI) determinado en cada muestra de prueba y muestra de control del ejemplo 1.
La figura 3 muestra un gráfico de correlación de 22 muestras de semen entre el DFI determinado según el presente método y el DFI determinado según la prueba de dispersión de cromatina de espermatozoides (SCD).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un método mejorado para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen. Los inventores han descubierto que al incluir dodecil sulfato de sodio (SDS) como tensioactivo iónico y urea como agente caotrópico en una solución de lisis para liberar ADN de la protamina del cromosoma, se reduce significativamente el tiempo requerido para la lisis.
La presente divulgación proporciona un método para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que incluye:
(a) embeber la muestra de semen que contiene espermatozoides en un gel que comprende agarosa, acrilamida, alginato o cloruro de vinilo;
(b) someter el gel que embebe los espermatozoides a un tratamiento de desnaturalización de ADN con una solución de desnaturalización de ADN, para desnaturalizar el ADN de los espermatozoides;
(c) someter el gel desnaturalizado obtenido en la etapa (b) a un tratamiento de lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml) para lisar las proteínas nucleares de los espermatozoides;
(d) someter el gel lisado obtenido en la etapa (c) a la tinción de ADN; y
(e) observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza del espermatozoide correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático. Según la presente descripción, en la etapa (a), el gel opcionalmente contiene además un indicador ácido-básico seleccionado del grupo que consiste en rojo de fenol, violeta de metilo, naranja de metilo, rojo de metilo, rojo Congo y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, el indicador ácido-básico es rojo de fenol.
En ciertas realizaciones, en la etapa (a), el gel puede ser un gel de agarosa.
Según la presente descripción, el gel de agarosa puede tener una concentración de agarosa que varía del 1 % (p/v, g/ml) al 3 % (p/v, g/ml). En una realización ilustrativa, el gel de agarosa tiene una concentración de agarosa del 1,25 % (p/v, g/ml). Según la presente descripción, antes de su uso para embeber la muestra de semen, el gel de agarosa puede fundirse a una temperatura que varía de 95 °C a 100 °C mediante el uso de un horno de microondas o un baño de agua a temperatura constante. En una realización ilustrativa, el gel de agarosa se funde a una temperatura de 95 °C.
Según la presente descripción, la muestra de semen se puede recoger de un sujeto de sexo masculino en cualquier momento. En una realización ilustrativa, la muestra de semen se recoge de un sujeto de sexo masculino que ha experimentado abstinencia sexual durante al menos 2 a 3 días pero no más de 10 días.
Según la presente descripción, la muestra de semen puede ser fresca o congelada (p. ej., puede estar en forma congelada almacenada en nitrógeno líquido (-196 °C).
Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a cualquier animal de interés, tal como primates (por ejemplo, seres humanos, simios y monos), mamíferos no primates (por ejemplo, cerdos, vacas, ovejas, caballos, cabras, perros, gatos, ratones y ratas), peces y anfibios. En ciertas realizaciones, el sujeto es un mamífero o un ser humano. Según la presente descripción, la muestra de semen puede diluirse con un diluyente para tener una concentración de esperma que varía de 4 x 106 células/ml a 1,5 x 107 células/ml.
Los ejemplos del diluyente pueden incluir, pero no se limitan a, medio de Earle, medio de fluido tubárico humano (HTF), solución salina tamponada con Tris (TBS), solución salina tamponada con fosfato (PBS) y solución salina. En ciertas realizaciones, la muestra de semen se diluye con medio HTF para tener una concentración de esperma de 1 x 107 células/ml.
Según la presente descripción, la solución de desnaturalización del ADN puede ser una solución acuosa ácida o una solución acuosa alcalina, y puede tener una concentración equivalente que varía de 0,05 N a 0,08 N. En ciertas realizaciones, la solución de desnaturalización del ADN puede tener una concentración equivalente que varía de 0,06 N a 0,07 N.
Según la presente descripción, la solución de desnaturalización de ADN puede ser una solución acuosa ácida que contiene un ácido seleccionado del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido nítrico, ácido sulfúrico y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, la solución de desnaturalización del ADN es una solución acuosa ácida que contiene ácido clorhídrico.
Según la presente descripción, la solución de desnaturalización del ADN puede ser una solución acuosa alcalina que contiene una base seleccionada del grupo que consiste en hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, la solución de desnaturalización de ADN es una solución acuosa alcalina que contiene hidróxido de sodio.
Como se usa en la presente descripción, el término “ solución de lisis” puede usarse indistintamente con los términos “ solución de lisis celular” y “ solución de lisis de proteínas” .
Según la presente descripción, en la solución de lisis, se usa lauril sulfato de sodio, también denominado dodecilsulfato de sodio (SDS) como tensioactivo iónico y se usa urea como desnaturalizante de proteínas. Estos dos componentes mejoran la lisis de la protamina y, por lo tanto, los bucles de ADN pueden liberarse fácilmente de la protamina a la periferia de la cabeza del espermatozoide y después monitorizarse como un halo mediante tinción del ADN. Los inventores han descubierto que el uso de SDS y urea en la solución de lisis reduce eficazmente el tiempo de tratamiento de la lisis (por ejemplo, a menos de 5 minutos) y, por lo tanto, reduce la incertidumbre sobre la muestra.
Según la presente descripción, la solución de lisis puede incluir además un tensioactivo iónico o no iónico adicional.
En ciertas realizaciones, el tensioactivo iónico adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en desoxicolato de sodio, colato de sodio, lauroil sarcosinato de sodio y combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones, el tensioactivo no iónico adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en Triton X-100, Nonoxynol-40 (NP-40), Pluronic F-127 (F-127), Tween-20 y combinaciones de los mismos. En una realización ilustrativa, el tensioactivo no iónico adicional es Triton X-100.
Según la presente descripción, la solución de lisis puede incluir además un desnaturalizante de proteínas adicional. Los ejemplos del desnaturalizante de proteínas adicional pueden incluir, pero no se limitan a, hidrato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato, cloruro de guanidinio y una combinación de los mismos.
Según la presente descripción, la solución de lisis puede incluir además un agente reductor. Los ejemplos del agente reductor pueden incluir, pero no se limitan a, ditiotreitol (DTT), clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ditioeritritol (DTE), p-mercaptoetanol (p-ME), glutatión (GSH), dimercaprol, heparina y combinaciones de los mismos. En una realización ilustrativa, el agente reductor es DTT o TCEP.
Según la presente descripción, la solución de lisis puede incluir además sales. Los ejemplos de las sales pueden incluir, pero no se limitan a, cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl) y una combinación de los mismos.
Según la presente descripción, la solución de lisis puede incluir además un agente de valoración del pH. Los ejemplos del agente de valoración pueden incluir, pero no se limitan a, hidróxido de sodio (NaOH), ácido clorhídrico (HCl) y una combinación de los mismos.
En ciertas realizaciones, la solución de lisis puede incluir además de 0,15 M a 3 M de NaCl, de 0,05 M a 0,2 M de DTT o TCEP, del 0,1 % (v/v) al 50 (v/v) de Triton X-100 y de 0,01 M a 0,02 M de NaOH.
En una realización ilustrativa, la solución de lisis incluye urea 1 M, un 0,05 % (p/v, g/ml) de SDS, NaCl 2,5 M, DTT 0,1 M o TCEP 0,05 M, 1 % (v/v) de Triton X-100 y NaOH 0,02 M. En otra realización ilustrativa, la solución de lisis incluye urea 4 M, un 0,05 % (p/v, g/ml) de SDS, NaCl 0,15 M, DTT 0,2 M o TCEP 0,05 M, 0,5 % (v/v) de Triton X-100 y NaOH 0,01 M. En otra realización ilustrativa adicional, la solución de lisis incluye urea 0,5 M, un 0,5 % (p/v, g/ml) de SDS, NaCl 3 M, TCEP o DTT 0,05 M, un 5 % (v/v) de Triton X-100 y NaOH 0,015 M.
Según la presente descripción, la solución de lisis puede ajustarse para tener un valor de pH deseado mediante el uso del agente de valoración. En ciertas realizaciones, cuando la solución de desnaturalización del ADN es una solución acuosa ácida, la solución de lisis puede tener un valor de pH que varía de 7,5 a 9,0. En ciertas realizaciones, cuando la solución de desnaturalización del ADN es una solución acuosa alcalina, la solución de lisis puede tener un valor de pH que varía de 5,5 a 7,0. En una realización ilustrativa, la solución de lisis tiene un valor de pH que varía de 8,2 a 8,5.
Según la presente descripción, la tinción de ADN se lleva a cabo usando un método de tinción seleccionado del grupo que consiste en tinción de Diff-Quik, tinción de Wright-Giemsa, tinción con yoduro de propidio (PI), tinción con SYBR Green, tinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y tinción con naranja de acridina.
La presente descripción también proporciona otro método para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que incluye:
(a) someter una solución de agarosa a calor, seguido de la adición de una solución de desnaturalización de ADN y la muestra de semen que contiene espermatozoides, para formar una mezcla;
(b) someter la mezcla a una reacción de polimerización en gel, para obtener un gel de agarosa con los espermatozoides que contienen el ADN desnaturalizado embebidos en su interior;
(c) someter el gel de agarosa a lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml), de modo que se lisan las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel de agarosa;
(d) someter el gel de agarosa lisado obtenido en la etapa (c) a la tinción de ADN; y
(e) observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático.
Según la presente descripción, en la etapa (a), la solución de agarosa puede mezclarse adicionalmente con un indicador ácido-básico como se ha descrito anteriormente antes del tratamiento térmico.
Según la presente descripción, el tratamiento térmico puede realizarse a una temperatura que varía de 95 °C a 100 °C. En una realización ilustrativa, el tratamiento térmico se realiza a una temperatura de 95 °C.
Los detalles de las condiciones de funcionamiento y reactivos (es decir, la preparación de la muestra de semen, la solución de desnaturalización de ADN, la solución de lisis, el método de tinción de ADN, etc.) de otro método son generalmente los mismos que se han descrito anteriormente.
Además, la presente descripción proporciona además otro método más para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que incluye:
(a) mezclar la muestra de semen que contiene espermatozoides con una solución de desnaturalización de ADN y un componente de formación de gel, seguido del sometimiento de la mezcla así obtenida a una reacción de polimerización en gel, para obtener un gel con los espermatozoides que contienen ADN desnaturalizado embebidos en su interior, seleccionándose el componente de formación de gel del grupo que consiste en acrilamida, alginato y cloruro de vinilo; (b) someter el gel a lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml), de modo que se lisan las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel;
(c) someter el gel lisado obtenido en la etapa (b) a la tinción de ADN; y
(d) observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático.
Según la presente descripción, en la etapa (a), la mezcla puede mezclarse adicionalmente con un indicador ácidobásico como se ha descrito anteriormente antes de la reacción de polimerización.
Los detalles de las condiciones de funcionamiento y reactivos (es decir, la preparación de la muestra de semen, la solución de desnaturalización de ADN, la solución de lisis, el método de tinción de ADN, etc.) del otro método adicional son generalmente los mismos que se han descrito anteriormente.
En los presentes métodos, las imágenes de la formación de halo se pueden estudiar mediante análisis visual directo con un microscopio o aplicando software de análisis de imágenes digitalizadas, obtenido usando cámaras analógicas o digitales, acopladas a las plataformas de microscopio.
En todos los métodos descritos anteriormente, después de la etapa de observación de la presencia o la ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, opcionalmente los métodos comprenden además una etapa para calcular el índice de fragmentación del ADN (DFI) (%), que es el % del número de espermatozoides con fragmentación del ADN con respecto al número total de espermatozoides. En general, las muestras de semen normales tienen DFI < 15 %; las muestras de semen anómalas tienen DFI > 30 %. Los valores del intervalo 15 % < DFI < 30 % se consideran muestras límite o muestra umbral.
La figura 1 muestra una imagen de espermatozoides con una formación de halo y espermatozoides sin formación de halo, alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en una muestra de semen umbral.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un kit para detectar fragmentación de ADN espermático en una muestra de semen, que incluye:
una formulación de formación de gel que incluye un componente seleccionado del grupo que consiste en agarosa, acrilamida, alginato y cloruro de vinilo;
una solución de desnaturalización de ADN;
una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml); y
un reactivo de tinción de ADN.
En determinadas realizaciones, el componente es agarosa.
En determinadas realizaciones, el componente es acrilamida.
En determinadas realizaciones, la formulación de formación de gel incluye una solución de acrilamida/bis-acrilamida. Según la presente descripción, la formulación de formación de gel puede incluir además un iniciador.
En determinadas realizaciones, la solución de acrilamida/bis-acrilamida y el iniciador se colocan en recipientes separados (tales como tubos de microcentrífuga, frascos de vidrio o frascos de plástico).
Según la presente descripción, el iniciador puede seleccionarse del grupo que consiste en persulfato de amonio (APS), tetrametiletilendiamina (TEMED), riboflavina-5'-fosfato de sodio, 3-(dimetilamino)propionitrilo y combinaciones de los mismos.
Según la presente descripción, la formulación de formación de gel puede incluir además un indicador ácido-básico como se ha descrito anteriormente.
Los detalles de los reactivos (es decir, la solución de desnaturalización de ADN y la solución de lisis) aplicados en este kit son generalmente los mismos que se han descrito anteriormente.
En ciertas realizaciones, la solución de desnaturalización del ADN y la formulación de formación de gel se colocan en recipientes separados (tales como tubos de microcentrífuga, frascos de vidrio o frascos de plástico).
Según la presente descripción, el kit puede incluir además un soporte para transportar la muestra de semen. El soporte incluye una base de soporte y una capa de agarosa dispuesta en una superficie de la base de soporte, y la capa de agarosa tiene una concentración de agarosa que varía del 0,25 % (p/v, g/l) al 1,5 % (p/v, g/l).
Los ejemplos de la base de soporte pueden incluir, pero no se limitan a, un portaobjetos de microscopio y una placa de pocillos.
En una realización ilustrativa, la base de soporte es un portaobjetos de microscopio, y sobre una superficie del portaobjetos de microscopio se ha aplicado una capa de 1 % (p/v, g/l) de agarosa.
Según la presente descripción, el reactivo de tinción de ADN puede seleccionarse del grupo que consiste en solución de Diff-Quik, solución de Wright-Giemsa, PI, SYBR Green, dAp I y naranja de acridina.
La descripción se describirá adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que los siguientes ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y no deben considerarse limitantes de la descripción en la práctica.
Ejemplos
Solución de lisis de prueba
La solución de lisis de prueba usada en los siguientes experimentos para muestras de prueba contenía cloruro de sodio 2,5 M (NaCl), ditiotreitol (DTT) 0,2 M, urea 4 M, Triton X-100 al 1 %, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,05 % e hidróxido de sodio (NaOH) 0,01 M, y tenía un valor de pH que varía de 8,2 a 8,5.
Solución de lisis convencional
La solución de lisis convencional usada en los siguientes experimentos para muestras de control contenía NaCI 2,5 M, DTT 0,2 M, Tris 0,2 M y Triton X-100 al 1 %. Esta solución de lisis convencional se usa en la prueba de dispersión de cromatina de espermatozoides (SCD).
Ejemplo 1. Evaluación de diversas soluciones de lisis con respecto a la fragmentación del ADN espermático (SDF)
Procedimientos experimentales:
Se recogió una muestra de semen de un sujeto de sexo masculino 1 (edad entre 22-40 años), seguido de licuefacción a temperatura ambiente. Se sometieron l0o pl de la muestra de semen licuada a la determinación del número de espermatozoides usando un analizador de calidad de semen (X1 PRO, LensHooke) según las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se añadió una cantidad adecuada de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para diluir la muestra de semen para alcanzar una concentración de espermatozoides de 0,1 x 105 células/pl. Se usaron cinco alícuotas (de 25 pl cada una) de la suspensión de semen diluida del sujeto 1 para los siguientes experimentos.
Una alícuota sirvió como muestra de control, y las otras cuatro alícuotas sirvieron respectivamente como cuatro muestras de prueba (es decir, muestra de prueba 1 a 4). A cada alícuota se le añadieron 100 pl de una solución de agarosa precalentada (1,250 (p/v, g/l), en H2O; Uniregion Bio Tech Inc.) que contenía 0,02 mg/ml de rojo de fenol. Se pusieron 25 pl de la mezcla resultante respectiva en una capa de agarosa (que contenía un 1 % (p/v, g/l) de agarosa) dispuesta en una superficie de un portaobjetos de microscopio, seguido de reposo a 4 °C durante 5 minutos, de manera que los espermatozoides se embebieron en un gel de agarosa y se inmovilizaron en el portaobjetos de microscopio. El gel de agarosa (AG) con los espermatozoides embebidos se sometió al siguiente tratamiento de hidrólisis de ADN y en lo sucesivo se denomina “AG con espermatozoides” .
Los AG con espermatozoides de cada muestra de control y muestras de prueba se trataron con 200-300 pl de una solución de desnaturalización de ADN que contenía HCl 0,1 N, seguido reposo para que la reacción continuara a temperatura ambiente durante 7 minutos.
Los AG con espermatozoides desnaturalizados de las muestras de prueba 1-4 se trataron con 200-300 pl de una solución de lisis de prueba como se ha descrito anteriormente a temperatura ambiente durante 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos y 20 minutos, respectivamente. Por separado, el AG con espermatozoides desnaturalizados de la muestra de control se trató con 200-300 pl de una solución de lisis convencional, a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Después de lavar con agua dos veces, el AG con espermatozoides lisados de la muestra respectiva se sometió a deshidratación usando etanol al 70 %, seguido de tinción de Wright-Giemsa utilizando un protocolo de tinción bien conocido por los expertos en la materia. A continuación, se observaron los AG con espermatozoides teñidos resultantes y se fotografiaron bajo un microscopio óptico (BX-53, Olympus) a 100 y 200 aumentos.
Se calculó el número de espermatozoides sin halo o con un halo que tenía una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza del espermatozoide (es decir, el número de espermatozoides con fragmentación de ADN) y también se calculó el índice de fragmentación de ADN (DFI) (%) de cada muestra usando una técnica bien conocida por los expertos en la materia.
Resultados:
Con referencia a la figura 2, no se observó ninguna diferencia significativa en el DFI entre las muestras de prueba 1 a 4 y la muestra de control. Los resultados demuestran que el uso de una solución de lisis que contiene urea y SDS para lisar los espermatozoides acelera eficazmente la lisis de proteínas nucleares del espermatozoide y, por lo tanto, puede acortar el tiempo de detección y presentar un efecto de detección similar al del método convencional (por ejemplo, la prueba SCD).
Ejemplo 2. Efecto del pretratamiento de la suspensión de semen con solución de desnaturalización de ADN sobre la detección de SDF
Procedimientos experimentales:
Se recogió una muestra de semen de un sujeto de sexo masculino 2 (edad entre 22-40 años). Se prepararon tres alícuotas según el ejemplo 1. Una alícuota sirvió como muestra de control, y las otras dos alícuotas sirvieron respectivamente como las muestras de prueba 1 a 2.
La muestra de control se sometió a detección de SDF según el método descrito en el ejemplo 1, y el DFI se calculó usando una técnica bien conocida por los expertos en la materia.
La muestra de prueba 1 se sometió a detección de SDF según un método similar al realizado para la muestra de prueba 2 como se describe en el ejemplo 1, y el DFI se calculó utilizando una técnica bien conocida por los expertos en la materia.
La muestra de prueba 2 se sometió a detección de SDF según los siguientes procedimientos operativos. En primer lugar, se mezclaron 50 pl de una solución de agarosa precalentada (1,250 (p/v, g/l), en H2O; Uniregion Bio Tech Inc.) que contenía 0,02 mg/ml de rojo de fenol con 25 pl de una solución de desnaturalización de ADN que contenía HCl 0,28 N, seguido de mezcla con la muestra de prueba 2. La mezcla resultante se puso en una capa de agarosa (que contenía un 1 % (p/v, g/l) de agarosa) dispuesta en una superficie de un portaobjetos de microscopio, seguido de reposo a 4 °C durante 6 minutos, de manera que los espermatozoides se embebieron en un gel de agarosa y se inmovilizaron en el portaobjetos de microscopio. El gel de agarosa (AG) con espermatozoides desnaturalizados embebidos resultante se denomina en lo sucesivo “AG con espermatozoides desnaturalizados” .
Posteriormente, el AG con espermatozoides desnaturalizados de la muestra de prueba 2 se trató con 200-300 pl de una solución de lisis de prueba como se describe en el ejemplo 1 a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de lavar con agua dos veces, el AG con espermatozoides lisados se sometió a deshidratación usando etanol al 70 %, seguido de una tinción de Wright-Giemsa usando un protocolo de tinción bien conocido por los expertos en la materia. A continuación, se observaron los AG con espermatozoides teñidos resultantes y se fotografiaron bajo un microscopio óptico (BX-53, Olympus) a 100 y 200 aumentos. El número de espermatozoides con fragmentación de ADN se calculó según el método descrito en el Ejemplo 1, y el DFI se calculó adicionalmente usando una técnica bien conocida por los expertos en la materia.
Resultados:
Como se muestra en la tabla 1 mostrada a continuación, no se observó ninguna diferencia significativa en el DFI entre la muestra de prueba 1 a 2 y la muestra de control. El resultado indica que la solución de lisis de prueba que contiene urea y SDS puede acortar el tiempo de detección, con o sin pretratamiento de la suspensión de semen con una solución de desnaturalización de ADN, y puede presentar un efecto de detección similar al del método convencional (por ejemplo, la prueba SCD).
Tabla 1.
Ejemplo 3. Efecto del tiempo de lisis de la suspensión de semen en la detección de SDF
Procedimientos experimentales:
Se recogió una muestra de semen de un sujeto de sexo masculino 3 (edad entre 22-40 años). Se prepararon ocho alícuotas según el ejemplo 1. Cuatro alícuotas sirvieron como muestras de prueba 1-4, y las otras cuatro alícuotas sirvieron como muestras de control 1-4.
Las cuatro muestras de prueba se sometieron a detección de SDF según un método similar al realizado para la muestra de prueba 1 como se describe en el ejemplo 2 (con solución de lisis de prueba que contiene urea y SDS), con la excepción de que el tiempo de lisis de cada muestra de prueba es diferente (véase la Tabla 2).
Las cuatro muestras de control se sometieron a detección de SDF según un método como se describe en el ejemplo 2 (con solución de lisis convencional sin urea y SDS), con la excepción de que el tiempo de lisis de cada muestra de prueba es diferente (véase la Tabla 2).
Los resultados del DFI (%) se muestran en la Tabla 2. Los resultados muestran que cuando se incluyen urea y SDS en una solución de lisis, el tiempo de lisis podría acortarse de 20 minutos a 2 minutos para lograr los mismos resultados de DFI. Por el contrario, la solución de lisis convencional requería 20 minutos para lisar completamente las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel y para lograr resultados correctos de DFI. El tiempo de lisis más corto de 2, 5 o 10 minutos con la solución de lisis convencional sin urea y SDS no lisó completamente las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel y no consiguió resultados correctos de DFI.
Tabla 2.
Ejemplo 4. Evaluación de la precisión del método de la presente descripción
Procedimientos experimentales:
Se recogieron 22 muestras de semen de sujetos de sexo masculino (edad entre 22-40 años) y se prepararon suspensiones de semen diluidas según el ejemplo 1. Las suspensiones de semen diluidas se sometieron a detección de SDF según un método similar al realizado para la muestra de prueba 2 como se describe en el ejemplo 2, y el DFI de la suspensión de semen de prueba respectiva se calculó usando una técnica bien conocida por los expertos en la materia.
Además, las 22 suspensiones de semen de prueba también se sometieron a la prueba SCD, y los procedimientos operativos de la prueba SCD fueron similares a los realizados para la muestra de control como se describe en el ejemplo 1.
Los DFI determinados respectivamente basándose en el método de la presente descripción y la prueba SCD se analizaron mediante regresión lineal y análisis de correlación de Pearson para determinar la correlación entre los mismos, y use calculó un coeficiente de determinación (valor R2).
Resultados:
Con referencia a la Figura 3, el DFI determinado según el método de la presente descripción y el DFI determinado según la prueba SCD tuvieron una excelente correlación, con un valor calculado de R2 de 0,9523. El resultado indica que la precisión del método de la presente descripción es la misma que la prueba SCD.
Resumiendo los resultados de la prueba anteriores, el presente método puede detectar eficazmente la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen y, por lo tanto, es útil para evaluar la infertilidad masculina.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que comprende:
(a)embeber la muestra de semen que contiene espermatozoides en un gel que comprende agarosa, acrilamida, alginato o cloruro de vinilo;
(b) someter el gel que embebe los espermatozoides a un tratamiento de desnaturalización de ADN con una solución de desnaturalización de ADN, para desnaturalizar el ADN de los espermatozoides; (c) someter el gel desnaturalizado obtenido en la etapa (b) a un tratamiento de lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % (p/v, g/ml) al 0,5 % (p/v, g/ml) para lisar las proteínas nucleares de los espermatozoides;
(d) someter el gel lisado obtenido en la etapa (c) a la tinción de ADN; y
(e) observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza del espermatozoide correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático.
2. El método de la reivindicación 1, en donde en la etapa (a), el gel contiene además un indicador ácido-básico seleccionado del grupo que consiste en rojo de fenol, violeta de metilo, naranja de metilo, rojo de metilo, rojo Congo y combinaciones de los mismos.
3. Un método para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que comprende:
(a)calentar una solución de agarosa, seguido de la adición de una solución de desnaturalización de ADN y la muestra de semen que contiene espermatozoides a la solución de agarosa calentada para formar una mezcla;
(b)someter la mezcla a una reacción de polimerización en gel, para obtener un gel de agarosa con los espermatozoides que contienen el<a>D<n>desnaturalizado embebidos en su interior; (c)someter el gel de agarosa polimerizado a un tratamiento de lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % al 0,5 % (p/v) para lisar las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel de agarosa;
(d)someter el gel de agarosa lisado obtenido en la etapa (c) a la tinción de ADN; y (e)observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza del espermatozoide correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático.
4. El método de la reivindicación 3, en donde en la etapa (a), la solución de agarosa se mezcla además con un indicador ácido-básico antes del tratamiento térmico, seleccionándose el indicador ácido-básico del grupo que consiste en rojo de fenol, violeta de metilo, naranja de metilo, rojo de metilo, rojo Congo y combinaciones de los mismos.
5. Un método para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que comprende:
(a) mezclar una muestra de semen que contiene espermatozoides con una solución de desnaturalización de ADN y un componente de formación de gel, seguido del sometimiento de la mezcla así obtenida a una reacción de polimerización en gel, para obtener un gel con los espermatozoides que contienen ADN desnaturalizado embebidos en su interior, seleccionándose el componente de formación de gel del grupo que consiste en acrilamida, alginato y cloruro de vinilo; (b) someter el gel a un tratamiento de lisis con una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % al 0,5 % (p/v) para lisar las proteínas nucleares de los espermatozoides embebidos en el gel;
(c) someter el gel lisado obtenido en la etapa (b) a la tinción de ADN; y
(d) observar la presencia o ausencia de formación de halo alrededor de las cabezas de los espermatozoides, en donde la no formación de halo o la presencia de un halo que tiene una anchura de halo menor que un tercio del diámetro de la cabeza del espermatozoide correspondiente indica la presencia de fragmentación del ADN espermático.
6. El método de la reivindicación 5, en donde en la etapa (a), la mezcla se mezcla adicionalmente con un indicador ácido-básico antes de la reacción de polimerización del gen, seleccionándose el indicador ácidobásico del grupo que consiste en rojo de fenol, violeta de metilo, naranja de metilo, rojo de metilo, rojo Congo y combinaciones de los mismos.
7. El método de la reivindicación 1, 3 o 5, en donde la solución de desnaturalización de ADN es una solución acuosa ácida que contiene un ácido seleccionado del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido nítrico, ácido sulfúrico y combinaciones de los mismos.
8. El método de la reivindicación 1, 3 o 5, en donde la solución de desnaturalización del ADN puede ser una solución acuosa alcalina que contiene una base seleccionada del grupo que consiste en hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio y combinaciones de los mismos.
9. El método de la reivindicación 1, 3 o 5, en donde la solución de lisis incluye además un desnaturalizante de proteínas de hidrato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propansulfonato, cloruro de guanidinio o una combinación de los mismos.
10. El método de la reivindicación 1, 3 o 5, en donde la solución de lisis incluye además un tensioactivo iónico seleccionado del grupo que consiste en desoxicolato de sodio, colato de sodio, lauroil sarcosinato de sodio y combinaciones de los mismos.
11. Un kit para detectar la fragmentación del ADN espermático en una muestra de semen, que comprende:
una formulación de formación de gel que comprende agarosa, acrilamida, alginato o cloruro de vinilo; una solución de desnaturalización de ADN;
una solución de lisis que incluye urea a una concentración que varía de 0,5 M a 4 M y dodecilsulfato de sodio a una concentración que varía del 0,05 % al 0,5 % (p/v); y
un reactivo de tinción de ADN.
El kit de la reivindicación 11, en donde la formulación de formación de gel incluye además un indicador ácidobásico seleccionado del grupo que consiste en rojo de fenol, violeta de metilo, naranja de metilo, rojo de metilo, rojo Congo y combinaciones de los mismos.
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