CN104322484A - 一种猪精液的冷冻和解冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪精液的冷冻和解冻方法，包含以下步骤：①采集优秀的种公猪精液，经精液检测后，按比例的稀释，然后平衡0.5-1h；②将精液移入15℃条件下降温平衡3h；③在15℃条件下离心(800g，10min)，加入无甘油的I液，缓慢降到5℃，平衡2h，再加入含甘油的II液，然后分装；④进行冷冻程序后投入液氮保存；⑤与冷冻时原理相反进行解冻；⑥对解冻后的精液品质进行检测。本发明可以使精液得到长期保存，有效提高了公猪的利用率，降低活体保种的成本，防止优良基因的漂变和传染病的发生，利于深入开展猪的联合育种工作，获得更大的遗传进展，在保护地方优良品种与加快品种改良等方面具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

Description

一种猪精液的冷冻和解冻方法

技术领域

本发明属于猪精液的冷冻保存技术领域，具体地说，涉及一种猪精液的冷冻和解冻方法。

背景技术

猪的人工授精(artificial insemination，AI)技术，即利用人工方法采取公猪的精液，对其进行品质检查、稀释保存等处理，再用器械将精液输送到发情母猪生殖器官内，使其受孕。人工授精可提高公猪的配种效能，与本交相比，人工授精时一头优秀种公猪每年配种的母猪可提高10～20倍。由于良种公猪利用率的提高，加速了品种改良，可给养猪生产和猪的育种带来巨大的效益；减少公猪的饲养量，节省了饲养管理费用；可克服自然交配的难点，如公、母猪体格相差太大和某些生殖道异常等困难；可扩大优秀公猪在时间和地域上的利用率，为优秀种猪精液的交流提供了方便；此外，人工授精还可以有效防止公、母猪多种疫病接触传染的可能。正是由于人工授精在养猪生产中具有很多优越性，使得这一技术在许多养猪发达国家得到大力推广。然而，国内外在猪的人工授精中所用的精液多为常温(15～20℃)液态保存精液，配种时的精子活力较高(0.6～0.8)、配种母猪的受胎率较高(75％～85％)，但液态精液一是不能长期保存(保存期一般在3～5天)，二是不便于远距离运输，因此，无法充分发挥优秀种公猪尤其是顶级种公猪的种用价值。

近年来，猪人工授精的研究重点逐渐转移到冷冻精液上。猪冷冻精液技术是指利用干冰(-79℃)、液氮(-196℃)等作冷却源，将精液特殊处理后冷冻，保存在超低温(-79℃或-196℃)的状态下，达到长期保存的目的，并且解冻后输精达到较高受胎率的技术。中国是世界上第一养猪和猪肉生产大国，近几年来，每年生猪存栏4.5～4.7亿头，其中，能繁母猪存栏0.48～0.51亿头，生猪出栏6.5～7.1亿头，猪肉总产4800～5400万吨，约占世界养猪总产的一半；尤其是近年来，我国的养猪业正在从传统粗放散养方式向规模化集约化饲养方式的转型，长白、大白、杜洛克等快长瘦肉型引进猪种已经成为规模化猪场饲养的主流品种，以常温液态保存精液技术为主导的猪人工授精技术已经被大面积的推广和应用到养猪生产实践中。但在我国的养猪生产中，对于冷冻精液的研究与应用所开展的工作还很欠缺，因此，深入开展此项技术的研究与应用，不仅对于进一步发挥人工授精技术的优势具有重要意义，而且对于开展种猪的遗传改良以及针对一些濒危特有地方猪种资源的保存等方面也具有十分重要的战略意义。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术，提供一种可有效提高猪精液冷冻保存的质量和效果的猪精液的冷冻和解冻方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种猪精液的冷冻和解冻方法，包含以下步骤：

(一)、猪精液的冷冻过程：

①首先采集优秀的种公猪精液，用精子密度仪测出其内部精子密度，然后在37-40℃的温度下用稀释剂稀释该精液，使其最终活精子数与整体公猪精液的比例为0.51∶1，稀释后将该精液在17-20℃的室温环境下平衡0.5-1h。

②将上述①中的精液移入15℃的环境下降温，平衡3h。

③取上述②中的精液800g，使其在15℃的环境下离心10min，先加入无甘油的稀释液I，然后温度缓慢降至5℃，平衡2h后，再加入含甘油的稀释液II，然后用细管进行分装。

④取上述③中分装好的精液开始进行冷冻过程：

精液所处环境，初始温度为5℃，以3℃/min的速率从5℃降到-5℃，再于-5℃条件下保持1min结晶，然后以50℃/min的速率从-5℃降到-140℃，最后将精液放入广口液氮罐内与液氮面距离5cm处，熏蒸20min，再投入液氮保存。

(二)、猪精液的解冻过程：迅速取出于液氮中保存的冷冻的猪精液，与冷冻原理相反，温度以50℃/min的速率从-140℃升至-5℃，再以3℃/min的速率从-5℃升至5℃，解冻即可。

(三)、猪精液的检测：取解冻后的猪精液，通过电子生物显微镜和计数板对其精子活力、畸形率、有效精子数进行检测。

优选地，所述精液采用5mL大型细管Maxi-straw进行冷冻解冻。

优选地，所述猪精液冷冻过程①中所述的稀释剂配方为D-葡萄糖37.15g、柠檬酸三钠6.00g、EDTA钠盐1.25g、碳酸氢钠1.25g、氯化钾0.75g、青霉素钠0.60g、硫酸链霉素1.00g或D-葡萄糖60.00g、柠檬酸三钠3.70g、EDTA钠盐3.70g、碳酸氢钠1.20g、青霉素钠50万单位、硫酸链霉素0.50g。

优选地，所述猪精液冷冻过程③中所述的稀释液I和稀释液II的配方为：D-葡萄糖11.5g、柠檬酸三钠11.65g、EDTA钠盐2.35g、磷酸二氢钾1.75g、氰化钾0.75g、硫酸链霉素0.5g、聚乙烯醇(PVP.Type11)1.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris)5.5g、柠檬酸4.1g、半盘氨酸0.07g、OEP(氨基-钠十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS(十二烷基硫酸钠)0.3g、PGF2a 0.5g、维生素E 0.5g、GSH(谷胱甘肽)0.5g、透明质酸0.3g、N-乙酰基-D-氨基葡糖0.5g。

经实验数据显示，采用本发明所提供的方法冷冻解冻猪精子后，精子在冷冻、解冻后的活力达到0.5以上，畸形等异常精子率低于20％，发情母猪的配种受胎率达到65％以上，平均每头母猪正常产仔数为9头，达到了生产应用的技术水平。经生产实践显示，该猪精液的冷冻和解冻方法可以使精液得到长期保存，使精液的使用不受时间和地域的限制，不受该公猪死亡、损失、采精间隔或繁殖不育的限制，有效提高了公猪的利用率，充分发挥优良公猪的作用，降低活体保种的成本，防止优良基因的漂变和传染病的发生，利于深入开展猪的联合育种工作，获得更大的遗传进展，在保护地方优良品种与加快品种改良等方面具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步详细的阐述，但本发明的实施方法并不局限于实施例所表示的范围，该实施例仅限于说明本发明，而并非用于限制本发明的范围。

一种猪精液的冷冻和解冻方法，包含以下步骤：

(一)、猪精液的冷冻过程：

①首先采集优秀的种公猪精液，用精子密度仪测出其内部精子密度，然后在37-40℃的温度下用稀释剂稀释该精液，使其最终活精子数与整体公猪精液的比例为0.51∶1，稀释后将该精液在17-20℃的室温环境下平衡0.5-1h。

②将上述①中的精液移入15℃的环境下降温，平衡3h。

③取上述②中的精液800g，使其在15℃的环境下离心10min，先加入无甘油的稀释液I，然后温度缓慢降至5℃，平衡2h后，再加入含甘油的稀释液II，然后用细管进行分装。

④取上述③中分装好的精液开始进行冷冻过程：

精液所处环境，初始温度为5℃，以3℃/min的速率从5℃降到-5℃，再于-5℃条件下保持1min结晶，然后以50℃/min的速率从-5℃降到-140℃，最后将精液放入广口液氮罐内与液氮面距离5cm处，熏蒸20min，再投入液氮保存。

(二)、猪精液的解冻过程：迅速取出于液氮中保存的冷冻的猪精液，与冷冻原理相反，温度以50℃/min的速率从-140℃升至-5℃，再以3℃/min的速率从-5℃升至5℃，解冻即可。

(三)、猪精液的检测：取解冻后的猪精液，通过电子生物显微镜和计数板对其精子活力、畸形率、有效精子数进行检测。

进一步地，所述精液采用5mL大型细管Maxi-straw进行冷冻解冻。

进一步地，所述猪精液冷冻过程①中所述的稀释剂配方为D-葡萄糖37.15g、柠檬酸三钠6.00g、EDTA钠盐1.25g、碳酸氢钠1.25g、氯化钾0.75g、青霉素钠0.60g、硫酸链霉素1.00g或D-葡萄糖60.00g、柠檬酸三钠3.70g、EDTA钠盐3.70g、碳酸氢钠1.20g、青霉素钠50万单位、硫酸链霉素0.50g。

进一步地，所述猪精液冷冻过程③中所述的稀释液I和稀释液II的配方为：D-葡萄糖11.5g、柠檬酸三钠11.65g、EDTA钠盐2.35g、磷酸二氢钾1.75g、氰化钾0.75g、硫酸链霉素0.5g、聚乙烯醇(PVP.Type11)1.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris)5.5g、柠檬酸4.1g、半盘氨酸0.07g、OEP(氨基-钠十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS(十二烷基硫酸钠)0.3g、PGF2a 0.5g、维生素E 0.5g、GSH(谷胱甘肽)0.5g、透明质酸0.3g、N-乙酰基-D-氨基葡糖0.5g。

猪精液稀释后降温的过程是精子代谢减少的适应过程，需要数小时的冷冻平衡时间，但过慢的冷却速度会使溶液的电解逐渐增高，导致精细胞膜脂蛋白复合体破坏和膜分解，当细胞膜脱水收缩达到临界最小体积时，细胞膜的渗透性产生不可逆的损伤，原来不能透过膜的溶质变成可渗透性的，进而造成细胞损伤或死亡，本发明在实际操作中得出冷冻时间以2.5～4.0h为宜，配好的稀释液在4℃下停放过夜，可以达到更好的稀释冷冻效果。

冷冻过程中的精子细胞不但要对保存状态的低温有耐受能力，而且要能经受从射精时机体温度到保存时的超低温度的变化而不过度降低活力，后者比前者更显得重要。每种细胞都有它理想的冷冻与解冻速率要求，冷冻速率太慢时，要保存的细胞易受高浓度溶解液的影响而死亡或遭到破坏(称溶解液效应)；冷冻速率过快时，细胞内液体易导致结冰现象。本发明在猪精液冷冻过程中，从5℃降到-5℃时，降温速率为3℃/min，该速率不会对精子的浆膜导致很大的破坏，从-5℃降到-140℃，降温速率采用50℃/min，该条件下精子可以快速通过危险温区(0～-60℃)，提高了冻精解冻后的存活率。

本发明猪精液解冻时的原理恰好与冷冻相反，理论上讲，冷冻/冷却速率快的情况下，解冻速率也相应加快，其程度视不同类型细胞而略有差异。快速解冻相较慢速解冻对精子活力的恢复有利，精子与浓缩溶液及低温保护剂接触的时间较短，细胞内外能较快地达到平衡而使精子的活力得以恢复。

本发明造价低廉、易推广，且解冻方法简单易行，更易进行人工授精，适合规模化生产。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，对实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种猪精液的冷冻和解冻方法，包含以下步骤：

(一)、猪精液的冷冻过程：

①首先采集优秀的种公猪精液，用精子密度仪测出其内部精子密度，然后在37-40℃的温度下用稀释剂稀释该精液，使其最终活精子数与整体公猪精液的比例为0.51∶1，稀释后将该精液在17-20℃的室温环境下平衡0.5-1h。

②将上述①中的精液移入15℃的环境下降温，平衡3h。

③取上述②中的精液800g，使其在15℃的环境下离心10min，先加入无甘油的稀释液I，然后温度缓慢降至5℃，平衡2h后，再加入含甘油的稀释液II，然后用细管进行分装。

④取上述③中分装好的精液开始进行冷冻过程：

精液所处环境，初始温度为5℃，以3℃/min的速率从5℃降到-5℃，再于-5℃条件下保持1min结晶，然后以50℃/min的速率从-5℃降到-140℃，最后将精液放入广口液氮罐内与液氮面距离5cm处，熏蒸20min，再投入液氮保存。

(二)、猪精液的解冻过程：迅速取出于液氮中保存的冷冻的猪精液，与冷冻原理相反，温度以50℃/min的速率从-140℃升至-5℃，再以3℃/min的速率从-5℃升至5℃，解冻即可。

(三)、猪精液的检测：取解冻后的猪精液，通过电子生物显微镜和计数板对其精子活力、畸形率、有效精子数进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种猪精液的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述精液采用5mL大型细管Maxi-straw进行冷冻解冻。

3.根据权利要求1所述的一种猪精液的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述猪精液冷冻过程①中所述的稀释剂配方为D-葡萄糖37.15g、柠檬酸三钠6.00g、EDTA钠盐1.25g、碳酸氢钠1.25g、氯化钾0.75g、青霉素钠0.60g、硫酸链霉素1.00g或D-葡萄糖60.00g、柠檬酸三钠3.70g、EDTA钠盐3.70g、碳酸氢钠1.20g、青霉素钠50万单位、硫酸链霉素0.50g。

4.根据权利要求1所述的一种猪精液的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述猪精液冷冻过程③中所述的稀释液I和稀释液II的配方为：D-葡萄糖11.5g、柠檬酸三钠11.65g、EDTA钠盐2.35g、磷酸二氢钾1.75g、氰化钾0.75g、硫酸链霉素0.5g、聚乙烯醇(PVP.Typell)1.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris)5.5g、柠檬酸4.1g、半盘氨酸0.07g、OEP(氨基-钠十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS(十二烷基硫酸钠)0.3g、PGF2a 0.5g、维生素E 0.5g、GSH(谷胱甘肽)0.5g、透明质酸0.3g、N-乙酰基-D-氨基葡糖0.5g。