CN115918641A - 猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用，涉及猪精液冷冻保护技术领域。所述冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO和异丙醇；所述非渗透性冷冻保护剂包括PVP、吐温20、Triton‑100和SDS，且渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂的体积比为1:1。本发明利用渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂联合使用，可以充分保护精子的顶体、线粒体完整性，提高精子配种率，解冻后精液活力优于其它猪冻精。采用本发明的稀释剂用于猪冷冻精液的生产，解冻后精子活力达85％以上，顶体完整率达85％以上，质膜完整率80以上，线粒体活性达80％以上，畸形率10％以下。
Description
技术领域
本申请涉及猪精液冷冻保护技术领域，具体涉及一种猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用。
背景技术
当前养猪业碰到很大的困难，需要在活体保种之外探索一些技术方法来遗传资源。2019年悉尼大学使用了50多年前冷冻的美利奴公羊的精液给56只母羊进行体外受精，其中34只母羊成功受孕，受孕率达到61％，并且没有发现使用冷冻精子的受孕率随着冷冻时间的延长而下降的现象。该方法的成功为养猪业的精子保种提供了思路。但猪一次射精量很大(约300ml)，在进行精液冷冻的时候，会遇到慢速冷冻损伤和快速冷冻损伤的问题。
常见的猪冷冻精液稀释液都是基于甘油-卵黄保护剂进行开发的，开发的思路是在两种损伤之间寻找平衡点，使损伤的总和达到最小，得到最大的冷冻生存率。然而，此种冷冻保护方式精液的损伤仍然相对较大，且冷冻方法复杂。
因此，业内亟需研发一种猪精液冷冻保护剂及其制备方法和冷冻、解冻方法，克服冷冻精子过程中慢速冷冻损伤和快速冷冻损伤的问题。
发明内容
本发明提供的一种猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用，旨在解决上述背景技术中，在进行猪精液冷冻的时候，会遇到慢速冷冻损伤和快速冷冻损伤的问题。
为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
第一方面，本发明公开了一种猪精液冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO和异丙醇；所述非渗透性冷冻保护剂包括PVP、吐温20、Triton-100和SDS，且渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂的体积比为1:1。
在一些实施例中，所述冷冻保护剂还包括TRIS稀释液，各成份在冷冻保护剂中所占的百分比为：甘油5％-7％v/v、DMSO 3％-5％v/v、异丙醇1％-2％v/v、PVP 3％-5％g/v、吐温20 0.3-0.6％v/v、Triton-100 0.1％v/v、SDS 5％-8％v/v，余量为TRIS稀释液；所述TRIS稀释液中各成分及含量为：
| 成分 | 质量 |
| TRIS | 2.44g |
| 柠檬酸一水合物 | 1.36g |
| 葡萄糖 | 0.82g |
| 蛋黄 | 20.0ml |
| Polymixin B硫酸盐 | 100,000IU |
| 超纯水 | 100.0ml |
| 渗透压(mOsm kg21) | 301.0 |
| pH值 | 6.55 |
第二方面，本发明公开了一种猪精液冷冻保护剂的制备方法，将渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂混合均匀后，添加到TRIS稀释液中稀释，即得。
第三方面，本发明公开了一种利用第一方面所述的冷冻保护剂冷冻猪精液的方法，包括如下步骤：
步骤1：将猪精液稀释预处理后离心，弃去上清液，然后加入TRIS稀释液，使得0.5ml精液中含精子为5亿；
步骤2：向步骤1得到的精液中加入冷冻保护剂，使得1ml精液中含精子为5亿；
步骤3：将步骤2得到的精液灌装到细管中，并用液氮熏蒸法(－150℃)进行冷冻，然后迅速投入液氮保存。
在一些实施例中，所述猪精液稀释预处理步骤如下：调节猪精液稀释剂温度，使猪精液稀释剂与猪精液之间的温度差异在±1℃内，然后向猪精液中加入等体积的猪精液稀释剂，于16℃～18℃冷藏。
进一步的，所述液氮熏蒸法包括如下步骤：
将装有猪精液的细管放入载有浮漂的冷冻装置内，所述浮漂上固定安装有支架，所述细管放入所述支架内，所述冷冻装置内装有液氮；
向浮漂施加外力，使支架浸入液氮液面之下，利用液氮冷冻支架上细管内猪精液，冷冻5分钟到7分钟。
第四方面，本发明公开了一种解冻猪精液的方法，包括如下步骤：取出液氮中的冷冻精液，并置于30℃～36℃恒温水浴锅中解冻，解冻后将精液加入到BTS稀释液中，使精液最终配种所需浓度为30mL～50mL BTS液稀释液中含精子10亿～90亿。
在一些实施例中，所述BTS稀释液中各成分及含量为：
第五方面，本发明公开了一种如第一方面所述的猪精液冷冻保护剂或由第二方面制备得到的猪精液冷冻保护剂或由第三方面所述的冷冻猪精液的方法在冷冻猪精液过程中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明利用渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂联合使用，可以充分保护精子的顶体、线粒体完整性，提高精子配种率，解冻后精液活力优于其它猪冻精。非渗透性冷冻保护与卵黄中油脂一起防止精子细胞在冷冻过程中过渡暴露在高浓度溶质环境或过度收缩，引起损伤。TRIS-柠檬酸调节溶液pH值。渗透性冷冻保护剂减少了精子在冷冻过程中水分子形成的冰晶，使精子不会被超低温破坏结构，降低了精子的死亡。
2、将本发明的稀释剂用于猪冷冻精液的生产，解冻后精子活力达85％以上，顶体完整率达85％以上，质膜完整率80以上，线粒体活性达80％以上，畸形率10％以下。
附图说明
图1为本申请中公开的液氮熏蒸法使用的装置图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1、溶液的配置及筛选：
TRIS稀释液按下列表1中配方1-4的组分含量进行配制筛选。
表1TRIS稀释液
Beltsville解冻溶液(BTS)按下列表2中配方5-9的组分含量进行配制筛选。
表2Beltsville解冻溶液(BTS)
2、猪冷冻精液保护剂的制备：
将渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂混合均匀后，添加到TRIS稀释液中稀释，即得。
其中，渗透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO和异丙醇；非渗透性冷冻保护剂包括PVP、吐温20、Triton-100和SDS。经过TRIS稀释液稀释后的保护剂中，各成份在冷冻保护剂中所占的百分比为：甘油5％-7％v/v、DMSO 3％-5％v/v、异丙醇1％-2％v/v、PVP 3％-5％g/v、吐温20 0.3-0.6％v/v、Triton-100 0.1％v/v、SDS 5％-8％v/v，余量为TRIS稀释液。
3、冷冻猪精液的方法：
(1)调节猪精液稀释剂温度，使猪精液稀释剂与猪精液之间的温度差异在±1℃内，然后向猪精液中加入等体积的猪精液稀释剂，于16℃～18℃冷藏。
(2)按照如下方法对猪精液进行冷冻：
步骤1：取出16℃～18℃的稀释后的猪精液，离心，弃去上清液，加入TRIS的稀释液，使得最终0.5mL精液中含精子为5亿，混匀后将精液降温至4℃(置于4度冰箱)；
步骤2：向前一步骤得到精液中加入冷冻保护剂，使最终1ml精液中含精子为5亿；
步骤3：将前一步骤得到精液灌装到细管中，并用液氮熏蒸法(－150℃)进行冷冻，冷冻5分钟到7分钟，然后迅速投入液氮保存；
其中，液氮熏蒸法采用如图1所示的装置进行，包括如下步骤：
将装有猪精液的细管放入载有浮漂2的冷冻装置1内，所述浮漂2上固定安装有支架3，所述细管放入所述支架3内，所述冷冻装置1内装有液氮；
向浮漂2施加外力，使支架3浸入液氮液面之下，利用液氮冷冻支架3上细管内猪精液，冷冻5分钟到7分钟。
步骤4：取出液氮中的冷冻精液，并置于30℃～36℃恒温水浴锅解冻，解冻后将精液加入到恒温好的BTS稀释液中；精液根据最终配种所需浓度为30mL～50mL BTS中含精子10亿～90亿进行添加。
4、考察不同配方的TRIS稀释液对冷冻效果的影响：
选择表1中配方1-4制成的TRIS稀释液，采用3中的冷冻方法对猪精液进行冷冻(保护剂使用3ml)，然后采用表2中配方6制成的BTS稀释液对冷冻后的精液进行解冻，对解冻后的精子活力进行检查，结果如下表3所示。
表3不同TRIS稀释液对精子活力的影响
由表3结果可知，采用配方1制成的同TRIS稀释液能最大程度保持精子活力，且与配方2-4之间存在显著差异，P＜0.05。
5、考察不同配方的TRIS稀释液对冷冻效果的影响：
选择表1中配方1制成的BTS稀释液，采用3中的冷冻方法对猪精液进行冷冻(保护剂使用3ml)，然后采用表2中配方5-9制成的BTS稀释液对冷冻后的精液进行解冻，对解冻后的精子活力进行检查，结果如下表4所示。
表4不同BTS稀释液对精子活力的影响
由表4结果可知，采用配方5制成的BTS稀释液与配方6制成的BTS稀释液对精子活力的影响无显著差异，P＜0.05，能最大程度保持精子活力，但与配方7-9之间存在显著差异，考虑到成本问题，选择配方5配置BTS稀释液。
6、考察添加不同保护剂量，对冷冻效果的影响：
选择表1中配方1制成的BTS稀释液，采用3中的冷冻方法对猪精液进行冷冻(保护剂分别使用0ml、3ml、6ml)，然后采用表2中配方5制成的BTS稀释液对冷冻后的精液进行解冻，对解冻后的精子活力进行检查，结果如下表5所示。
表5不同计量保护剂对精子活力的影响
通过表5对比可知，为添加冷冻保护剂的情况下，精子活力明显较加有保护剂的精子活力低，且添加保护剂含量越多，对精子的保护效果更强。
将本发明的稀释剂用于猪冷冻精液的生产，当使用保护剂含量达到6ml时，解冻后精子活力可达85％以上，顶体完整率达85％以上，质膜完整率80以上，线粒体活性达80％以上，畸形率10％以下。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (9)
1.一种猪精液冷冻保护剂，其特征在于：所述冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO和异丙醇；所述非渗透性冷冻保护剂包括PVP、吐温20、Triton-100和SDS，且渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂的体积比为1:1。
2.根据权利要求1所述的猪精液冷冻保护剂，其特征在于：所述冷冻保护剂还包括TRIS稀释液，各成份在冷冻保护剂中所占的百分比为：甘油5％-7％v/v、DMSO 3％-5％v/v、异丙醇1％-2％v/v、PVP 3％-5％g/v、吐温20 0.3-0.6％v/v、Triton-100 0.1％v/v、SDS 5％-8％v/v，余量为TRIS稀释液；所述TRIS稀释液中各成分及含量为：
3.一种猪精液冷冻保护剂的制备方法，其特征在于：将渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂混合均匀后，添加到TRIS稀释液中稀释，即得。
4.一种利用权利要求1-2任一项所述的冷冻保护剂冷冻猪精液的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：将猪精液稀释预处理后离心，弃去上清液，然后加入TRIS稀释液，使得0.5ml精液中含精子为5亿；
步骤2：向步骤1得到的精液中加入冷冻保护剂，使得1ml精液中含精子为5亿；
步骤3：将步骤2得到的精液灌装到细管中，并用液氮熏蒸法(－150℃)进行冷冻，然后迅速投入液氮保存。
5.根据权利要求4所述的利用冷冻保护剂冷冻猪精液的方法，其特征在于：所述猪精液稀释预处理步骤如下：调节猪精液稀释剂温度，使猪精液稀释剂与猪精液之间的温度差异在±1℃内，然后向猪精液中加入等体积的猪精液稀释剂，于16℃～18℃冷藏。
6.根据权利要求4所述的利用冷冻保护剂冷冻猪精液的方法，其特征在于：所述液氮熏蒸法包括如下步骤：
将装有猪精液的细管放入载有浮漂的冷冻装置内，所述浮漂上固定安装有支架，所述细管放入所述支架内，所述冷冻装置内装有液氮；
向浮漂施加外力，使支架浸入液氮液面之下，利用液氮冷冻支架上细管内猪精液，冷冻5分钟到7分钟。
7.一种解冻猪精液的方法，其特征在于，包括如下步骤：取出液氮中的冷冻精液，并置于30℃～36℃恒温水浴锅中解冻，解冻后将精液加入到BTS稀释液中，使精液最终配种所需浓度为30mL～50mL BTS稀释液中含精子10亿～90亿。
8.根据权利要求7所述的解冻猪精液的方法，其特征在于：所述BTS稀释液中各成分及含量为：
9.如权利要求1-2任一项所述的猪精液冷冻保护剂或由权利要求3制备得到的猪精液冷冻保护剂或由权利要求4所述的冷冻猪精液的方法在冷冻猪精液过程中的应用。
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