MXPA02005134A - Metodo para crioconservar celulas de esperma seleccionadas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para crioconservar esperma que se ha seleccionado por una caracteristica especifica. En una modalidad preferida, el metodo se emplea para congelar esperma de sexo seleccionado. Aunque el metodo de crioconservacion de la invencion puede usarse para congelar esperma seleccionada por cualquier numero de metodos de seleccion, se prefiere que la seleccion use citometria de flujo. La presente invencion tambien proporciona una muestra de esperma congelada que se ha seleccionado por una caracteristica particular . tal como el tipo de sexo. En las modalidades preferidas, la muestra de esperma congelada incluye una esperma de mamifero, tal como, por ejemplo, esperma humana, de bovino, equino, porcino, ovino, alce, o bisonte. La muestra de esperma seleccionada, congelada puede usarse en una variedad de aplicaciones. En particular, la muestra puede descongelarse y usarse para fertilizacion. Por consiguiente, la invencion tambien incluye un metodo para usar la muestra de esperma seleccionada, congelada para inseminacion artificial o fertilizacion in vitro.

Description

MÉTODO PARA CRIOCONSERVAR CÉLULAS DE ESPERMA SELECCIONADAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las solicitudes reclaman el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana Mo . 60/167,423, presentada el 24 de noviembre de 1999. La invención se refiere a un método para congelar esperma seleccionada para una característica particular, así como para una muestra de esperma seleccionada congelada y métodos para usar tal muestra. La invención es particularmente útil para conservar esperma seleccionada por sexo . Alrededor de hace medio siglo, se introdujo la inseminación artificial en los Estados Unidos como una herramienta de cría comercial para una diversidad de especies de mamífero. Aunque la inseminación artificial se limitó inicialmente a regiones relativamente cerca del sirio de recolección de esperma, los avances en la crioconservación y almacenamiento de esperma han facilitado la amplia distribución y comercialización de la esperma pretendida para inseminación artificial o fertilización in vitro. Las mejoras adicionales en la recolección de esperma de mamíferos, selección, crioconservación, almacenamiento, y técnicas de manej?( han mejorado la capacidad del criador para producir animales que tengan rasgos deseados. Por ejemplo, los avances en la selección de esperma de mamíferos con base en ligeras diferencias en las características físicas ha hecho posible separar la esperma con base en el tipo de sexo, esto es, para seleccionar células que contienen el cromosoma X o Y. Esta técnica permite al criador manipular el porcentaje relativo de esperma tipo X o Y en una muestra y determinar con eso el sexo de la descendencia. La capacidad para seleccionar la esperma con base en el tipo de sexo o cualquier otra característica deseable proporciona una herramienta importante para acelerar el progreso genético, aumentar la eficiencia de la producción y lograr mayor flexibilidad en el manejo de ganado. La explotación completa de esta herramienta, sin embargo depende de la capacidad para congelar y almacenar la esperma seleccionada. Una diversidad de métodos está disponible para seleccionar las células; sin embargo, la selección y el procesamiento subsecuente de la esperma presenta retos únicos debido a que la esperma es incapaz de reparación de ADN y debido a la morfología de la esperma. Cada esperma tiene un acrosoma sobrepuesto a la cabeza y una cola, que son importantes para la fertilidad y que son relativamente susceptibles al daño físico. Además, la fertilidad de la esperma disminuye con el aumento de tiempo entre la recolección y el uso. Como la mayoría de los métodos de selección disponibles involucran tensiones físicas y toman tiempo, la esperma seleccionada está típicamente algo comprometida en comparación con las células no seleccionadas. La fertilidad puede reducirse adicionalmente si la técnica de selección involucra la dilución significativa. Se ha sugerido que este "efecto de dilución" puede deberse a la pérdida de los componentes protectores en el plasma seminal . La citometría de flujo es un método de selección particularmente eficiente que se ha empleado para distribuir esperma por tipo de sexo. Sin embargo, la esperma distribuida está sujeta a tensiones más allá de aquellas normalmente encontradas en los protocolos de inseminación artificial estándar o fertilización in vitro. En particular, la citometría de flujo consume tiempo, y, debido a las restricciones físicas de los citómetros de flujo, la esperma debe diluirse para distribuirse en niveles que no son óptimos para almacenamiento (normalmente del orden de 105-106/ml) . Además, la esperma distribuida pretendida para inseminación artificial debe concentrarse de manera que pueda usarse el equipo de suministro y empaque convencional. La necesidad de un paso de concentración expone así la esperma un tanto ya comprometida además de las tensiones físicas. La congelación de la esperma también reduce invariablemente la fertilidad, movilidad, y/o viabilidad, y, aunque las técnicas para congelar esperma no seleccionada son bien conocidas, ninguna técnica para la crioconservación de esperma seleccionada se ha descritu. La presente invención proporciona un método para crioconservar esperma que se ha seleccionado por una característica» específica. El método es particularmente útil para crioconservar esperma seleccionada por un método que resulta en la dilución del esperma, puesto que el método proporciona el aislamiento de la esperma a partir de una muestra de esperma seleccionada, seguido por la adición de un diluyente final a la esperma aislada para producir una suspensión que tiene una concentración deseada de esperma. En una modalidad preferida, el método se emplea para congelar esperma seleccionada por sexo. Aunque el método de crioconservación de la invención puede usarse para congelar esperma seleccionada por cualquier - número de métodos de selección, se prefiere la selección que usa citometría de flujo . La presente invención también proporciona una muestra de esperma congelada que se ha seleccionado por una característica- particular tal como tipo de sexo. En modalidades preferidas, la muestra de esperma congelada incluye esperma de mamíferos, tal como, por ejemplo esperma humana, de bovino, equino, porcino, ovino, alce, o bisonte. También dentro del alcance de la invención está un recipiente que incluye una muestra de esperma congelada de acuerdo con la invención.

La muestra de esperma seleccionada congelada puede usarse en una diversidad de aplicacoLones . En particular, la muestra puede descongelarse y usarse para f rtilización. En consecuencia, la invención también incluye un método para usar la muestra de esperma seleccionada congelada para inseminación artificial o fertilización in vitro. La presente invención permite la crioconservación de esperma que se ha seleccionado por una característica particular, facilitando el almacenamiento y/o embarque de las muestras de esperma seleccionada a sitios distantes del sitio de recolección. La descongelación produce esperma viable que puede usarse en procedimientos tales como inseminación artificial ("AI") y fertilización in vitro ( "IVF") . Este resultado fue sorprendente debido a la bien documentada fragilidad del" esperma. Se ha demostrado que las tensiones asociadas con los diversos métodos _de selección o con la crioconservación resultan en pérdida significativa en fertilidad y/o viabilidad. Se ha demostrado, por la primera vez, que pueden lograr preñarse con esperma que se ha seleccionado y después congelado. La invención representa un avance importante en el manejo de ganado, en donde la selección de la esperma para uso en rales procedimientos puede usarse para aumentar la_ producción de descendencia que tiene los rasgos deseables. Por ejemplo, la selección para obtener la esperma que lieva el cromosoma X o el Y permite el control sobre el sexo de la descendencia, que es ventajoso para los productores de animales tales como ganado lechero o de carne. La selección del sexo también encuentra aplicación para _criar animales valiosos, (por ejemplo, caballos de espectáculos o de carreras) o en peligro. La capacidad para congelar esperma seleccionada, lo cual proporciona la. invención, permitirá el uso amplio de tales métodos de selección para, por ejemplo, aumentar la eficiencia de producción de ganado así como la calidad. Definiciones El término "acrosoma" o "tapa acroso al" se refiere a la tapa que cubre la mitad anterior de la cabeza de la esperma y que contiene las enzimas necesarias para la penetración del huevo. El término "tipo de sexo" se refiere al tipo de cromosoma sexual presente en el esperma (es decir, el cromosoma X o Y) . El término "capacitación" se refiere a los cambios específicos que sufre un esperma para desarrollar la capacidad de fertilizar los huevos, tales como cambios enzimáticos sobre la superficie de la acrosoma que conducen a la liberación de enzimas acromosámales que facilitan la penetración ole la esperma dentro del huevo. Como se usa en referencia a la esperma, el término "crioprotector" se refiere a una molécula que protege la esperma durante un ciclo de congelación-descongelación, que promueve la supervivencia y retención de la capacidad de fe tilización . El término "efecto de dilución" se refiere a la declinación rápida en la movilidad y/o viabilidad del esperma cuando se diluye fuertemente. Como se usa en la presente, el término "selección" se refiere a un método por el cual una muestra se subdivide con base en la presencia" o ausencias" de una característica específica (a menos que el contexto lo dicte de otra forma) .

Así, una "muestra de esperma seleccionada" es una muestra obtenida al someter una fuente de muestra a selección por la característica específica. Una muestra de esperma seleccionada está por lo tanto enriquecida, con relación a la muestra de la fuente, en esperma que tiene una característica específica. El término "distribución" s usa en la presente para describir un método de selecciono llevado _a cabo usando un distribuidor de células activado por fluorescencia (FACS) . El término "diluyente" se refiere a cualquier medio que tiende a conservar la viabilidad de la_ esperma. El término "dilución" se refiere a la dilución dei esperma con el diluyente. El término "diluyente inicial" se refiere a un medio usado para diluir la esperma antes del paso de aislamiento del método de esta invención. El término "diluyente final" se refiere a un medio usado para diluir la esperma antes del paso de congelación del método de esta invención. Una "sustancia orgánica" en un diluyente descrito en la presente es cualquier sustancia orgánica que tiende a reducir el choque por frío y conservar la fertilidad de la esperma . Ona "fuente de energía" en un diluyente descrito en la presente es cualquier sustancia o substrato que puede utilizar la esperma para el mantenimiento y/o movilidad de las células. El término "osmolalidad", como se usa en la presente, es una medida de la presión osmótica de las partículas de soluto disueltas en una solución acuosa (por ejemplo, un diluyente) . Las partículas de soluto incluyen iones y moléculas no ionizadas. La osmolalidad se expresa como la concentración de partículas osmóticamente activas (es decir, osmoles) disueltas en 1 kg de agua. Método de Crioconservación La invención proporciona un método para crioconservar esperma seleccionada que incluye los pasos siguientes : (1) obtener una muestra de esperma seleccionada; (2) enfriar la muestra de esperma seleccionada; (3) aislar la esperma a partir de la muestra de esperma seleccionada; (4) agregar diluyente finai a la esperma aislada para producir una suspensión de esperma; y (5) congelar la suspensión de esperma. Obtener una Muestra de Esperma Seleccionada El primer paso en el método de crioconservación de la invención abarca obtener una muestra de esperma seleccionada previamente, así como someter una muestra de la fuente a cualquier método de selección adecuado. La esperma de cualquier especie puede seleccionarse y congelarse de acuerdo al método de la invención. El método puede llevarse a cabo con esperma de animales domesticados, especialmente ganado, así como con esperma de animales salvajes (por ejemplo, especies en peligro) . Preferiblemente, la muestra de esperma seleccionada contiene esperma de mamífero. Se prefiere particularmente esperma humana, de bovino, equino, porcino, ovino, alce, y esperma de bisonte. Generalmente, la muestra de esperma seleccionada contiene esperma viable normal. Para este fin, el eyaculado del cual se obtiene la esperma tiene típicamente al menos aproximadamente 50%, y preferiblemente al menos aproximadamente 75% de esperma morfológicamente normal. En estas modaiidades, generalmente al menos aproximadamente 40%, y preferiblemente al menos aproximadamente bO" de la esperma en el eyaculado presenta movilidad progresiva. Una amplia diversidad de métodos para seleccionar células a partir de poblaciones mezcladas están disponibles, incluyendo, por ejemplo, la selección basada en el enlace de células o componentes celulares "con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, u otros asociados por simbiosis de enlace y tinción diferencial. La invención se ejemplifica en la presente con la selección basada en el tipo de sexo, y la esperma seleccionada por sexo para uso en la invención puede obtenerse usando cualquier estrategia de selección que tome ventaja de las ligeras diferencias en las características entre el esperma de tipo X e Y. Ejemplos de métodos de selección por sexo incluyen técnicas magnéticas (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,276,139), técnicas columnares (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,514,537) técnicas gravimétricas (véase, Patente Norteamericana No. 3,894,529, Patente reexpedida No. 32350, Patentes Norteamericanas Nos. 4,092,229, 4,067,965, y 4,155,831) . La selección del sexo con base en las diferencias en las propiedades eléctricas se describe en la Patente Norteamericana No. 4,083,957, y las técnicas que seleccionan con base en las diferencias en las propiedades eléctricas y gravimétricas .se discuten en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,225,405, 4,698,142, y 4,749,458. Las Patentes Norteamericanas Nos. 4,009,260 y 4,339,434 describen la selección con base en las diferencias en movilidad. Las técnicas bioquímicas que se apoyan en anticuerpos se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,511,661, 4,999,253, 3,687,803; 4,191,749, 4,44^8,767, mientras que las Patentes Norteamericanas Nos. 5,021,244, 5,346,990, 5,439,362, y 5,660,997 describen la selección con base en las diferencias en las proteínas de la membrana. La citometría de flujo es un método preferido para separar las células de poblaciones mezcladas con base en la tinción diferencial con tintes fluorescentes o enlace a moléculas marcadas fluorescentemente, tales como anticuerpos o ácidos nucleicos. En la distribución de células activadas por fluorescencia ("FACS") , las células se "distribuyen" en poblaciones diferentes con base en la intensidad de la fluorescencia durante la irradiación. Puede usarse FACS para la selección del sexo del esperma debido a que el cromosoma X contiene ligeramente más ADN que el cromosoma Y. Cuando la esperma se tiñe con un tinte de enlace ADN fluorescente, el esperma que lleva el cromosoma X absorbe más tinte que el esperma que lleva el cromosoma Y y las dos poblaciones pueden separarse por lo tanto por FACS. Esta estrategia se discutió en la Patente Norteamericana No. 4,362,246 y se expandió significativamente en la Patente Norteamericana No. 5,135,759 (expedida para Johnson) . La separación se ha mejorado a través del uso de citómetros de flujo de alta velocidad, tales como el citómetro de fiu]o _ MoFlo_ produciao por Cyto ation, Inc., (Ft. Collins, CO) y descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,150,313, 5,602,039, 5,602,349, 5,643,796, así como en la Publicación PCT No. WO 96/12171. El método de selección usado para obtener la muestra de esperma seleccionada es preferiblemente uno que conserva la viabilidad de la esperma. Debido a la fragilidad relativa de la esperma, las técnicas de citometría de flujo normales deberían modificarse generalmente para distribuir esperaras . Más específicamente, la citometría de flujo vincula la tinción, dilución e interrogación de las células con luz. Todos estos pasos representan tensiones que pueden reducir la viabilidad del esperma. La sensibilidad del esperma a estas tensiones puede variar entre las especies y aún entre los individuos dentro de las especies. Dichas sensibilidaaes se han documentado o pueden determinarse fácilmente por estudios empíricos, tales como aquellos descritos en los Ejemplos 1-5. Las modificaciones que mejoran la viabilidad se describen en las publicaciones de patente discutidas anteriormente. Por ejemplo, los procedimientos que proporcionan sistemas de envoltura y recolectores me~ orados para distribuir esperma se: desoncen en la publicación PCT No. WO 99/33956 (Solicitud No. PCT/US98/27909 ) . Adicionalmente, los Ejemplos 1-7 posteriores describen ejemplos de procedimientos para t-=ñ?r y distribuir esperma. El Ejemplo 3 describe un estudio de los efectos de la intensidad del láser y la concentración de tinte de la movilidad pos-descongelación de la esperma congelada distribuida. Este estudio indica que el uso de intensidades de láser menores durante la distribución puede aumentar la movilidad pos-descongelación. La muestra de esperma seleccionada puede contener una diversidad de componentes además de la esperma y frecuentemente contendrán componentes agregados para proteger a la esperma durante el proceso de selección. En el caso de FACS, la muestra de esperma seleccionada puede contener el o los componentes de las soluciones usadas para teñir y distribuir (por ejemplo el fluido de envoltura y el regulador de recepción) . Además, la muestra de esperma seleccionada contiene típicamente un diluyente o fracción de diluyente. Por ejemplo, son bien conocidos los diluyentes de "dos pasos" que incluyen una "fracción A" que carece de glicerol y una "fracción B" que contiene glicerol. La fracción A se agrega a la esperma primero, seguido por la adición de un volumen igual de la fracción B. Para este paso, la fracción B se divide frecuentemente en al menos dos alícuotas y se agrega secuencialmente. Por ejemplo, la segunda alícuota de fracción B se agrega 15 minutos después de la primera. Si no están presentes componentes diluyentes, se agrega típicamente un diluyente o fracción de diluyente a la muestra de esperma seleccionada antes de que la esperma se aisle de .la muestra. Si solamente están presentes algunos componentes diluyentes, pueden agregarse opcionalmente componentes adicionales de manera que la muestra de esperma seleccionada incluya un diluyente completo o una fracción de diluyente antes del paso de aislamiento. En ejemplos de modalidades, la esperma de bovino se distribuye por flujo para producir una muestra de esperma seleccionada que incluye la fracción A de un diluyente (véanse Ejemplos 2, 3, y 4) . Si se desea, la fracción B puede agregarse después a la muestra de esperma seleccionada antes del paso de aislamiento (véase Ejemplo 5) . El diluyente del paso de pre-aislamiento (o fracción de diluyente) se denomina "el diluyente inicial" para distinguirlo del "diluyente final" empleado para la dilución de la esperma aislada antes de la congelación. Si la muestra de esperma seleccionada se seleccionó usando FACS, el diluyente inicial puede igualarse con el fluido de cobertura empleado para la distribución. Los ejemplos de fluidos de cobertura igualados y diluyente se describen en detalle en el Ej emplo 4. Un diluyente adecuado para uso en la muestra de esperma seleccionada incluye un portador fisiológicamente aceptable. El portador fisiológicamente aceptable es típicamente acuoso, y, en modalidades preferidas, incluye agua desionizada. Los diluyentes adecuados comprenden comúnmente uno o más ' de los siguientes componentes adicionales: un crioprotector, un componente que mantiene la osmolalidad y regula el pH, una sustancia orgánica que previene el choque por frío y conserva la fertilidad de la esperma, un detergente que actúa sinergísticamente con algunas sustancias orgánicas para mejorar la conservación de la esperma, una fuente de energía que puede utilizarse fácilmente por la esperma, un antioxidante, que protege la esperma del choque por frío, una sustancia que facilita la capacitación de la esperma, y uno o más antibióticos. " Aunque los crioprotectores útiles en la invención no se limitan a aquellos que actúan por un mecanismo particular, la mayoría de los crioprotectores convencionales actúan, al menos en parte, reduciendo la deshidratación intracelular. Específicamente, la congelación se acompaña por un aumento en la concentración de soluto en el medio que rodea la esperma. Este aumento en concentración de soluto saca agua de las células, lo cual aumenta la concentración de electrolitos intracelular. Ejemplos de crioprotectores incluyen glicerol, sulfóxido de metilo, etilenglicol, propilenglicol, y similares. El crioprotector adecuado para uso en up diluyente dado puede variar, dependiendo de la especie de la cual se deriva la esperma. Por ejemplo, el glicerol es adecuado para uso en la crioconservación de esperma humana y de bovinos, pero no se usa generalmente para la crioconservación de esperma de porcino o conejo. Tales preferencias son bien conocidas para muchas espermas comercialmente valiosas y pueden determinarse fácilmente empíricamente para otros tipos de esperma. Los diluyentes útiles en la invención incluyen opcionalmente uno o más componentes que ayudan a mantener la osmolalidad y proporcionan capacidad de regulación. En las modalidades preferidas de la invención, la osmolalidad del diluyente se aproxima a la de los fluidos fisiológicos. De mayor preferencia, la osmolalidad del diluyente está en el rango de aproximadamente 280 mOsm hasta aproximadamente 320 mOsm. El pH está también preferiblemente dentro de un rango fisiológicamente aceptable, de mayor preferencia en el rango de aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 7.5. Las substancias que ayudan a mantener la omolalidad y pH dentro de estos rangos son bien conocidas en la técnica y pueden agregarse a los diluyentes _como un sólido o ya en solución. Un regulador que contiene una sal, un carbohidrato, o una combinación de los mismos puede emplearse para este propósito. Los ejemplos específicos incluyen reguladores de citrato de sodio, tris (hidroximetil ) aminometano, y TES (ácido N-Tris [Hidroximetil] metil-2-aminoetansulfónico) , y glutamato monosódico; leche; medio regulado con HEFE3; y cualquier combinación de los mismos. El compcnente empleado para ayudar a mantener la osmolalidad y proporcionar capacidad de regulación en una aplicación particular puede variar dependiendo de los otros componentes del diluyente y, en algunos casos, de las especies de las cuales se deriva la esperma. La selección de dicho componente para uso en la presente invención, está, sin embargo dentro del nivel de experiencia en la técnica. También pueden incluirse en _el diluyente una o más sustancias orgánicas que protegen la esperma en contra del choque por frío y ayudan a conservar la capacidad de fertilización. Dichas sustancias son bien conocidas y se describen algunas veces como "crioprotectores no penetrantes". Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una sustancia orgánica adecuada para una aplicación particular del método de crioconservación descrito en la presente. Por ejemplo, las sustancias orgánicas que contienen constituyentes protectores (por ejemplo, lipoproteinas , fosfolípidos, lecitina) que se cree reducen el impacto del choque por frío y el efecto de dilución pueden incluirse en - el diluyente. Las substancias orgánicas adecuadas incluyen disacáridos, trisacáridos y cualquier combinación de los mismos.

Ejemplos de substancias orgánicas incluyen yema de huevo, un extracto de yema de huevo, leche, un extracto de leche, caseína, albúmina, lecitina, colesterol, y cualquier combinación de los mismos. El diluyente también puede incluir un detergente.

Los detergentes iónicos de alquilo tales como dodecil sulfato sódico (SDS) , se han reportado que actúan sinergísticamente con la yema de huevo para mejorar la protección en contra el choque por frío. Otros detergentes útiles en la crioconservación de células puede también emplearse en el diluyente, y la selección de un detergente particular para una aplicación específica está dentro del nivel de experiencia en la técnica a la luz de la guía proporcionada en la presente. Véase, por ejemplo, Ejemplo 5. Preferiblemente, el diluyente incluye una fuente de energía que se utiliza fácilmente por la esperma. En ausencia de una fuente de energía, la esperma puede oxidar fosfolípidos intracelulares y otros componentes celulares. Así, la inclusión de una fuente de energía en el diluyente protege las reservas intracelulares y los componentes celulares. Como es bien conocido en la técnica, los azúcares, particularmente monosacáridos, proporcionan una fuente de energía conveniente, aunque cualquier fuente de energía convencional puede emplearse en el diluyente. Ejemplos de monosacáridos útiles en el diluyente incluyen glucosa, fructosa, y/o mañosa. Uno o más antioxidantes pueden incluirse opcionalmente en el diluyente para -proporcionar protección adicional en contra del choque por frío. Ejemplos de antioxidantes incluyen hidroxitolueno butilado (BHT) , sus derivados, y similares. Sin embargo, otros antioxidantes útiles en la crioconservación de células también pueden emplearse en el diluyente, y la selección de un antioxidante particular para una aplicación específica está dentro del nivel - de experiencia en la técnica a la luz de la guía proporcionada en la presente. El diluyente también puede contener una substancia que facilita la capacitación de esperma. Una diversidad de facilitadores de capacitación se conoce en la técnica y cualquiera puede emplearse en el diluyente. Ejemplos incluyen enzimas tales como alfa amilasa, beta amilasa, beta glucuronidasa, que pueden usarse en combinación, si se desea. Finalmente, el diluyente incluye preferiblemente un antibiótico, puesto que el crecimiento bacteriano sustancial puede amenazar la viabilidad de la esperma y aumentar el riesgo de infección del huésped en los procedimientos de inseminación artificial o fertilización in vitro. Cualquiera de una diversidad de antibióticos útiles en la crioconservación de células también puede emplearse en el diluyente. La selección de un antibiótico adecuado depende de la especie de la cual se _ obtuvo la _esperma, los procedimientos involucrados para obtener y manejar la muestra de esperma, y el o los microorganismos específicos a ser seleccionados. Ejemplos de antibióticos incluyen tilosina, gentamicina, lincomicina, espectinomicina, linco-espectina (una combinación de lincomicina- y espectinomicina), penicilina, estreptomicina, y ticarcilina, que pueden usarse solos o en combinación. Sin embargo, un experto en la técnica puede determinar fácilmente otros antibióticos adecuados para uso en el diluyente. y Ejemplos de diluyentes se discuten en mayor detalle posteriormente y en los ejemplos. La concentración de esperma es típicamente inferior en la muestra de esperma seleccionada que en la muestra de fuente, y, como se indicó anteriormente, cuando se emplea FACS, la dilución es significativa. Una distribución típica basada en el tipo de sexo puede producir una muestra que contiene esperma en' 6 x 105 células/ml de regulador de recepción. Como tal una baja concentración no "es óptima para almacenamiento (al menos para la mayoría de las especies probadas), el método de crioconservación de_ la invención concentra generalmente la muestra de esperma seleccionada. Enfriar la Mues tra de Esperma Seleccionada El segundo paso en el método de crioconservación vincula enfriar la muestra de ., esperma seleccionada, típicamente, reduciendo la temperatura a una velocidad controlada. Enfriar demasiado rápidamente puede oausar choque por frío, que puede resultar en una pérdida ele integridad de la membrana y la función celular. La severidad de los efectos del choque por frío varia de especie a especie y depende de factores tales como la velocidad de enfriamiento y el rango de temperatura. Bajo condiciones de enfriamiento controladas adecuadas, la esperma es capaz de adaptarse a los efectos térmicos. El Ejemplo 2 entre otros describe las condiciones para enfriar esperma de bovino, y determinar las condiciones adecuadas para enfriar la esperma de otras especies está dentro del nivel de experiencia en la técnica. En una modalidad preferida de la invención, "la muestra de esperma seleccionada se enfría típicamente de aproximadamente 22° Celsius, hasta aproximadamente 5° Celsius, y el enfriamiento se lleva a cabo generalmente durante un periodo de aproximadamente 60 minutos hasta aproximadamente 24 horas, preferiblemente durante un periodo de aproximadamente 90 minutos hasta aproximadamente 240 minutos, y de mayor preferencia durante un periodo de aproximadamente 90 minutos hasta aproximadamente 120 minutos. El enfriamiento puede lograrse ~~ or cualquier método conveniente, que incluye simplemente colocar _ la muestra_ de esperma seleccionada en un ambiente de 5° Celsius. Aislamien to de las C lulas de Esperma a Parzir Je la Jluestra de Esperma Seleccionada Después de la dilución inicial d3 -la muestra de esperma seleccionada, la esperma se aisla a oartir de la muestra usando cualquiera método de aislamiento suficientemente suave que proporciona al menos aproximadamente 50% de recuperación" de esperma, de mayor preferencia aproximadamente 75% hasta aproximadamente 90o. de recuperación de esperma, y de mayor preferencia aproximadamente 80% hasta aproximadamente 90A de recuperación de esperma. Durante el paso de aislamiento, la esperma enfriada debe mantenerse generalmente fría, es decir, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8° Celsius, y de preferencia cerca de 4 ó 5° Celsius. Cualquiera de una diversidad de métodos adecuados para recuperar las células a partir de una suspensión puede usarse para aislar la esperma, incluyendo por ejemplo, filtración, sedimentación y centrifugación. En un ejemplo, de la modalidad preferida, se pone una alícuota de muestra de esperma seleccionada dentro de tubos de 5Q ml a volúmenes que no exceden aproximadamente 27 ml, y de preferencia entre aproximadamente 20 hasta aproximadamente 27 ml . La centrifugación se lleva a cabo a aproximadamente 4o Celsius, hasta aproximadamente 853 x g, durante aproximadamente 20 minutos. Preferiblemente, el paso de centrif gación proporciona al menos aproximadamente 50- hasta aproximadamente 90% de recuperación de esperma, de mayor preferencia aproximadamente 60" hasta aproximadamente 2-0- de recuperación de esperma, y de mayor preferencia aproximadamente 70% hasta aproximadamente 90" de recuperación de esperma. Después del aislamiento, se elimina el sobrenadante y el granulo se suspende agitando con vortex suavemente o aspiración repetida a 4o Celsius. La concentración de esperma se determina después típicamente (por ejemplo, usando un hemacitómetro) . Dilución Final de las Cél ulas de Esperma Aisladas Después del aislamiento, la esperma se reúne, si se desea, y se diluye con diluyente final hasta una concentración apropiada para congelación. La concentración de esperma después de la dilución final y antes del congelamiento está preferiblemente" en el rango de aproximadamente 1 x 10°/ml hasta aproximadamente 300 x IQVml, de mayor preferencia aproximadamente 10 x 106/ml hasta aproximadamente 50 x 10 /ml , y de mayor preferencia aproximadamente 10 x 10e/ml hasta aproximadamente 20 x lOVml. La descripción del diluyente inicial anterior también aplica al diluyente final, que puede ser el mismo como o diferente del diluyente inicial. En modalidades particulares, la composición de la muestra de esperma diluida con el diluyente final es sustancialmente similar a (si no la misma co o) la composición de la muestra de esperma después de la adición del diluyente inicial. En una modalidad preferida de la invención, se usa un diluyente de yema de huevo-Tris. Después de la adición del diluyente, la suspensión de esperma comprende glicerol (crioprotector) ; ácido cítrico y Tris [hidroximetil] aminometano (regulador) ; yema de huevo (substancia orgánica); fructosa (fuente de energía); tilosina, gentamicina, y linco-espectina (antibióticos) . Las concentraciones aproximadas típicas de estos componentes después de la adición del diluyente final a la esperma aislada son: Componentes del Diluyente de Yema de Huevo-Tris Glicerol : 4-8% vol/vol Ácido cítrico: 55-75 mM Tris [hidroximetil] aminometano : 190-210 mM Yema de huevo : 5-25% vol/vol Fructosa : 45-65 mM Tilosina : 25-100 µg/ml Gentamicina : 200-300 µg/ml Linco-espectina : 100-400 µg/ml* '100-400 µg/ml de lincomicina y 100-400 µg/ml de espectinomicina En una variación de esta modalidad particularmente adecuada para congelar esperma de bovino, las concentraciones de estos componentes después de la - adición del diluyente final a la esperma aislada son aproximadamente 6% (vol/vol) de glicerol, aproximadamente 65 mm de ácido cítrico, aproximadamente 200 mM de Tris [hidroximetil ] aminometano, aproximadamente 20% (vol/vol) de yema de huevo, aproximadamente 56 mm de fructosa, aproximadamente 50 µg/ml de tilosina, aproximadamente 250 µg/ml de gentamicina, y aproximadamente 150/300 µg/ml de linco-espectina (es decir, 150 µg/ml de lincomicina y 300 µg/ml "de espectinomicina) , en agua desionizada. En una modalidad alternativa, se emplea un diluyente de yema de huevo-citrato. Después de la adición del diluyente, la suspensión de esperma comprende glicerol (crioprotector); citrato de sodio (regulador); yema de huevo (sustancia orgánica); tilosina, gentamicina, y linco-espectina (antibióticos). Las concentraciones aproximadas típicas de estos componentes después de la adición del diluyente final a la esperma aislada son: Componentes del Diluyente de Yema de Huevo-Citrato Glicerol: 4-8% vol/vol Citrato de Sodio: 60-80 mM Yema de huevo: 5-25% vol/vol Tilosina: 25-100 µg/ml Gentamicina: 200-300 µg/ml Lincs-espectina : 100-400 µg/mL' "100-400 µg/ml de lincomicina y 100-400 µg/ml de espectinomicina Ejemplos, de las concentraciones preferidas para congelar esperma de bovino son aproximadamente 7% (vol/vol) de glicerol, aproximadamente 72 mM de citrato de sodio, aproximadamente 20% (vol/vol) de yema de huevo, aproximadamente 50 µg/ml de tilosina, aproximadamente 250 µg/ml de gentarnicina, y aproximadamente 250/300 µg/ml de linco-espectina. En otra modalidad alternativa, se emplea un diluyente de yema de huevo-TES-Tps ("EY TEST") . Después de la adición del diluyente, la suspensión de esperma comprende glicerol (crioprotector) ; yema de huevo y leche calentada, por ejemplo, leche homogeneizada que contiene 1.25% de fructosa con 10% de glicerol (substancias orgánicas); tilosina, gentamicina, y linco-espectina (antibióticos) . Las concentraciones aproximadas típicas de estos componentes después de la adición del diluyente final a la esperma aislada son: Componentes del Diluyente de Yema de Huevo TES-Tris Glicerol: _ 3-7^ vol/vol Acido Tris [hidroximeti-metil] -2- aminoetansulfónico 140-170 mM Tris [hidroximetil] aminometano : 60-80 mM Yema de Huevo: 5-25- vol/vol Fructosa: 5-12 M Tilosina : 50-150 µg/ml Gentamicina : 400-600 µg/ml Linco-espectina 200-700 µg/mL '200-700 µg/ml de lincomicina y 200-700 µg/ml de espectinomicina Ejemplos, de las concentraciones preferidas para congelar esperma de bovino son aproximadamente 5% (vol/vol) de glicerol, aproximadamente 158 mM de ácido Tris [hidroximeti-metil] -2-aminoetansulfónico, aproximadamente 72 mM de Tris [hidroximetil] aminometano, aproximadamente 20% (vol/vol) de yema de huevo, aproximadamente 8 mM de fructosa, aproximadamente 100 µg/ml de tilosina, aproximadamente 500 µg/ml de gentamicina, y aproximadamente 300/600 µg/ml de linco-espectina . En aún otra modalidad alternativa de la invención, se emplea un diluyente de Leche. Después de la adición del diluyente, la suspensión de esperma comprende glicerol (crioprotector); leche homogeneizada calentada (substancia orgánica); fructosa (fuente de energía); y tilosina, gentamicina, y linco-espectina (antibióticos). Las concentraciones aproximadas típicas de éstos componentes después de la adición del diluyente final a la esperma aislada son: Componentes de Diluyente de Leche Leche homogeneizada 901 (vol/vol1 Glicerol : 3-7 (vol/vol; Fructosa : 1.25. (peso/vol; Tilosina : 50 µg/mi Gentamicina : 250 µg/ml Linco-espectina: 250/300 µg/ml' *250-300 µg/ml de lincomicina y 225500--330000 µµgq//mmll de espectinomicina Ejemplos de las concentraciones preferidas para congelar esperma de bovino son aproximadamente 90% de leche, aproximadamente 10% (vol/vol) de giicerol, aproximadamente 1.25% de fructosa (peso/vol), aproximadamente 50 µg/ml de tilosina, aproximadamente 250 µg/ml de gentamicina, y aproximadamente 250/300 µg/ml de linco-espectina. También pueden emplearse otros diluyentes estandarizadamente usados para congelar esperma como el diluyente final para congelar esperma seleccionado. Se ha descrito una diversidad de diluyentes optimizados para uso para congelar esperma a partir de diversas especies, y muchos están comercialmente disponibles . Los diluyentes para congelar esperma de equino consisten típicamente de leche, yema de huevo, diversos azúcares:, electrolitos y un crioprotector. Ejemplos de diluyentes para congelación se describen por Squires, E.L., et al., Cooled and Frozen Stallion Semen Animal Reprod. and Biotechnology Laboratory Bulletin No. 59, Chapter 8, "Seminal Extendere" pp . 49-51 (julio, 1999) . Equil ibra ción y Congelación de Esperma La dilución de la muestra de esperma produce una suspensión de esperma, que se transfiere después dentro de recipientes para congelación. Si la esperma se desea usar en fertilización, se hacen alícuotas de células convenientemente en dosis individuales suficientes para lograr la fertilización. La dosis requerida puede variar sustancialmente de una especie a la siguiente y es bien conocida (por ejemplo, para ganado y caballos) o puede determinarse fácilmente. En el caso de la e=perma de bovino seleccionada por sexo, las dosis convenientes varían de aproximadamente 1.0 x 106 de esperma hasta aproximadamente 3.0 x 106 de esperma. Cualquier recipiente adecuado puede emplearse para congelar, incluyendo, por ejemplo, una ámpula, una ampolleta, y un popote. La esperma deseada^ para AI se congela típicamente en popote (por ejemplo popote de 0.25 ml o 0.50 ml) diseñados para uso con una pistola de inseminación. Preferiblemente, se saca un bolo de diluyente dentro del popote, seguido, en secuencia, por aire, esperma, aire y diluyente, de manera que la esperma está flanqueada a cada lado por un espacio de aire, que separa la esperma de un bolo de diluyente en cada extremo del popote. Antes de congelar, la esperma se deja generalmente equilibrar a aproximadamente 5°C. Preferiblemente, la esperma se deja equilibrar durante un periodo en el rango de aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 18 horas, de mayor preferencia entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 18 horas, y de mayor preferencia entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 6 horas (véase Ej emplo 2 ) . Después de la equilibración, puede emplearse cualquier método de congelación estándar, con la condición de que la velocidad de congelación no sea demasiado rápida (es decir, no en exceso de aproximadamente 0.5°C/minuto) . Preferiblemente, la velocidad de congelación es aproximadamente 0.5°C/minuto. En un ejemplo, la modalidad preferida, la esperma se coloca en vapor de nitrógeno líquido estático, y se lleva a cabo la congelación en tres etapas distintas durante un periodo de aproximadamente 10 minutos. En la primera etapa de congelación, la esperma se enfría de aproximadamente 5°C hasta aproximadamente -15 °C a una velocidad de aproximadamente 40°C/minuto hasta aproximadamente 65°C/minuto. En la segunda etapa de congelación, la esperma se enfría de aproximadamente -15°C hasta aproximadamente -60°C a una velocidad de aproximadamente 25°C/minuto hasta aproximadamente 35°C/minuto. En la tercera etapa, la esperma se sumerge dentro de nitrógeno líquido a aproximadamente -100°C.

Muestras de Esperma Seleccionada Además de un método de congelación, la invención proporciona una muestra de esperma congelada que incluye esperma seleccionada a partir de una muestra de fuente para una característica particular. La esperma puede ser de cualquier especie, incluyendo cualquiera de aquellas discutidas anteriormente con referencia al método de congelación. La invención abarca esperma congelada seleccionada para cualquier característica por cualquier método adecuado, tal como aquellos descritos anteriormente.

Las modalidades preferidas incluyen esperma seleccionada de humano, bovino, equino, porcino, ovino, alce, o bisonte por sexo congelada. La selección del sexo se lleva a cabo preferiblemente usando citometría de flujo como se describió en forma general anteriormente. También dentro del alcance de la invención está un recipiente que contiene una muestra de esperma congelada de acuerdo a la invención. El recipiente puede formarse a partir de cualquier material que no reaccione con la muestra de esperma congelada y puede tener cualquier forma u otra característica que facilite el uso _de la muestra para la aplicación deseada. Para muestras deseadas para uso en AI, por ejemplo, el recipiente es convenientemente _un popote (por ejemplo, popote de 0.25 ml o 0.5 ml)" diseñado para uso con una"" pistola de inseminación. El recipiente se sella en cualquier forma adecuada para conservar la muestra a la temperatura de almacenamiento deseada, que está típicamente debajo de -80°Celsius. Pueden sellarse popotes de 0.25 ml, por ejemplo, con polvo de PVC, ultrasónicamente, o con un tapón de algodón-polivinilo y/o una bola de acero inoxidable (BB) . Como la muestra de esperma congelada de la invención se descongela típicamente antes de usarse, la invención también proporciona una muestra de esperma seleccionada previamente congelada, descongelada y un recipiente que incluye dicha muestra descongelada. Métodos para Usar la Muestra de Esperma Seleccionada La muestra de esperma seleccionada congelada de la invención es adecuada para usarse en cualquier método en que se use esperma. La muestra puede descongelarse y usarse en cualquier método de fertilización .convencional, tal como inseminación artificial o fertilización in vitro. La descongelación se lleva a cabo en la misma forma que para la esperma no seleccionada congelada. Brevemente, "el popote que contiene la esperma congelada se sumerge en un baño de agua mantenido a una temperatura de aproximadamente 35°C hasta aproximadamente 37 °C durante un período de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 segundos. Después de descongelar, la deposición de semen (por ejemplo, inseminación) se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos estándar, teniendo cuidado de proteger la esperma de fluctuaciones ambientales. EJEMPLOS Ejemplo 1 Efecto de la Dil ución de la Esperma Objetivo: determinar el efecto de la concentración de esperma en la movilidad de la esperma para esperma no congelada, no distribuida, pero de esperma fuertemente diluida. A. Efecto de la Dil ución de la Esperma No Lavada . 1. Recolección de la mues tra fuen te . Se recolectó esperma a partir de toros en un programa de recolección de rutina usando una vagina artificial como se describe en Schenk J., Proc 17th NAAB, p.48-58 (1998), and Saacke RG, Proc NAAB Tech Conf AI Reprod. 41:22-27 (1972). Todos los eyaculados usados contienen más del 50% de movilidad progresiva y más de 75% de esperma morfológicamente normal.

Se agregaron antibióticos al eyaculado puro como se describe por Shin S., Proc NAAB Tech Conf AI Reprod. 11:33-38 (1986) dentro de 15 minutos de recolección, y la concentración de esperma se determinó usando un espectrofotoómetro . 2. Métodos : Se diluyó la esperma de 4 toros a 1.25, 2.5, 5, 10, 15, y 20 x 105/ml usando un diluyente de yema de huevo-citrato (EYC) preparado con 20% de yema de huevo (vol/vol) en 72 mM de citrato de sodio, 50 Tg/ml de tilosina, 250 Tg/ml de gentamicina, y 250/300 Tg/ml de lico-espectina . Cada muestra se preparó por duplicada_ (2 tubos/dilución/toro) y comprendió 8 ml de volumen total por tubo. Todas las muestras se incubaron durante 60 minutos a 22°C después de lo cual se centrifugaron usando una centrífuga de cubeta oscilante (Eppendorf, Model # 5810R) a 600 x g durante 10 minutos para concentrar la esperma. Después de la centrifugación, no se eliminó el sobrenadante de un conjunto de los tubos por duplicado; la esperma se resuspendió en el mismo medio y a la concentración original por aspiración suave repetida usando una pipeta serológica ~ de 5 ml . (El segundo conjunto de los tubos por duplicado se usaron en el Ejemplo IB) . Las muestras de esperma se enfriaron después a 5°C a 0.2°C/min durante 90 minutos. La esperma se denominó "esperma no lavada". Todas las muestras se incubaron a 5°C durante 24 ó 48 h pos-recolección. 3. Eval uación de Movilidad. Después de la incubación, las muestras se calentaron a 37°C usando un incubador de bloque seco durante 10 minutos antes de la determinación de la movilidad. Para este experimento, se determinó un estimado ciego, sencillo del por ciento de esperma progresivamente móvil para cada muestra. La movilidad progresiva de la esperma se determinó subjetivamente para cada subclase por un observador sencillo _(x2Q0, microscopía de contraste de fase); otra persona preparó los portaobjetos del microscopio en una forma aleatoria para que el observador no se diera cuenta de los tratamientos. 4. Análisis estadístico . Los datos se analizaron por análisis de varianza (SAS Institute, Cary, North Carolina) con factores de toros y concentración de dilución inicial. Los análisis separados se hicieron para cada tiempo de incubación. Las tendencias de dilución se probaron usando contrastes lineales (log) . 5. Resul tados . Los datos para esperma no lavada (Tabla 1) revelaron relaciones lineales (log) (P<0.01) para ambos tiempos de incubación. Los porcentajes de esperma móvil aumentaron conforme aumentó la concentración de esperma de 1.25 x 106/ml a 10 x 106/ml, pero hubo poca diferencia posteriormente. El término cúbico fue significativamente (P<0.05) para incubaciones de 24 h y marginalmente significativo (P<0.1) para 48 h. Hubo un efecto de especulación (P<0.01) en ambos tiempos. Tabla 1. Efectos del enfriamiento en la movilidad de la esperma no lavada (%) después de enfriar a 5°C. Incubación a 5°C Dilución 24 hc 4 8 hr (ísVml ) 1 . 25 18 O" 2 . 5 38 c, d 6C d 5 . 0 56p 3 1d, e 10 . 0 61d 42e 15 . 0 55 -j 44e 20.0 58d 41e- S:E.f 5.6 6.4 a(log) lineal (P<0.01) y efectos cúbicos (P<0.05). b(log) lineal (P<0.01) y efectos cúbicos (P<0.1). c,d,e Medios dentro de las columnas sin superíndices comunes difieren (P<0.05) .

(SAS Institute, Cary, ?C, USA) B. Efectos de Dil ución en la Esperma Lavada 1. Recolección de la Mues tra de Origen . El segundo conjunto de los tubos por duplicado que contienen muestras preparadas en el Ejemplo 1 A se usaron en este .experimento. 2. Métodos . La esperma se diluyó, incubó y concentró por centrifugación como en el Ejemplo ÍA. Después de la centrifugación, se aspiró 7.1 ml del sobrenadante de cada tubo, eliminando la mayoría del plasma seminal y dejando la esperma en un granulo de 900-µl. La esperma se diluyó con EYC (véase Ejemplo ÍA) para hacer suspensiones de esperma de 10 x 106/ml o 20 x 10d/ml. Las muestras se enfriaron después a 5°C durante 90 minutos como en el Ejemplo ÍA. 3. Eval ua ción de Movil idad. Las muestras se calentaron y evaluaron por movilidad progresiva como en el Ejemplo ÍA. 4. Análisis Es tadís tico . Los datos se analizaron como" en el Ejemplo 1A. Además, los datos en el Ejemplo IB se_ analizaron por concentración de incubación a 5°C. 5. Resul tados . Los datos para esperma lavada (Tabla 2) no revelaron efectos de tratamiento significativo cuando la esperma se evaluó después de 24 h. Sin embargo, después del almacenamiento durante 48 h a 5°C, hubo especulación, dilución inicial, concentración de incubación y especulación por efectos de incubación (P<0.05) . Más esperma permaneció móvil cuando se mantuvo a 20 x 106/ml que a 10 x 106/ml (31% vs . 20%; P<0.05) . Las diluciones iniciales de 1.25, 2.5, y 5 x 106 esperma/ml resultaron en movilidad progresiva inferior que 10 x 106 esperma/ml (P<0.05), con medios de efecto principal respectivos de 19, 20, 27, y 37% de esperma móvil.

Tabla 2. Efectos acumulativos dé lavado, dilución, concentración y enfriamiento en la movilidad progresiva de la esperma (%) Almacenamiento a 5°C - Concentración y Duración de la Esperma 24 h 48 ha Concentración de esperma 20xl06/ml 10xl06/ml 20xlOVml 10xlOs/mlb- (loVml) durante pre-incubación de 1 h a 37°C 1.25 45 49 24 15 2.5 51 40- 29 11 5.0 54 54 32 21 10. Q 51 _ 50 40 34 15.0 60 41 20.0 55 10 aLa concentración a 20 x 10 esperma/ml fue superior (P 0.05) a 10 x 10 esperma/ml después de 48 h de almacenamiento. También, la dilución inicial a 10 x 10d fue superior a las diluciones inferiores (P<0.05) . Los errores estándar reunidos Verror cuadrado medio de ANOVA e- fueron 4.0 para la incubación de 24 h, y 2.8 para 48 h. bTendencia (log) lineal significativa (P<0.06) . C. Conclusión La alta dilución de la_ esperma y el enfriamiento resultaron en una reducción sustancial en el por ciento de esperma móvil, independientemente de la presencia o eliminación del plasma seminal. Sin embargo, este efecto de dilusión se atenuó grandemente al concentrar la esperma diluida a 10 x 106/ml y aún más, a 20 x 106/ml antes del almacenamiento a 5°C. La esperma de algunos"" toros toleró mejor la dilución que la esperma de otros toros; sin embargo, las diferencias de los toros encontradas son típicas. La esperma extremadamente diluida pudiera estar comprometida durante la clasificación, en parte, por la eliminación de los compuestos protectores en el plasma seminal. Ejemplo 2 Efectos del Tiempo de Equilibrio Antes de Congelar la Esperma Clasificada _ _ Objetivo: evaluar el efecto de los tiempos de equilibrio (3, 6 y 18 h, 5°C) antes de congelar la_esperma clasificada por flujo. El siguiente experimento se duplicó en su totalidad usando los mismos toros: 1. Recolección de la Muestra de Origen. Se recolectó y preparó la esperma de 4 toros como se describió en el Ejemplo 1A. 2. Métodos . a) Tinción y Preparación para Clasificar. i) Preparación de la Solución Patrón de Tinción: una solución patrón de 8.89 mM Hoechst 33342 (bis-Benzimida H-33342; #190305, ICN Biomedicals _Inc, Aurora, OH) se preparó en agua desionizada. ii) Procedimiento de Tinción de Esperma: la esperma se diluyó en un regulador TALP modificado (Tabla 3) a 400 x 106 esperma/ml. Después de la dilución, se" agregó tinte Hoechst 33342 a las suspensiones de esperma a una concentración de 224 µM. Después que se agregó la tinción a las suspensiones de esperma, las muestras se incubaron durante 60 minutos a 34°C. Después de la incubación, la esperma se diluyó a 100 x 106/ml con TALP que contiene 2.67% de yema de huevo clarificada y 0.002> de tinte colorante de alimento (FD&C #40) que extingue la fluorescencia de Hoechst 33342 en las espermas con membranas celulares comprometidas, permitiéndoles ser encerradas durante el proceso de clasificación. Justo antes de la clasificación ele flujo, las muestras se filtraron en la unidad de gravedad a través de un filtro de malla de nylon de 40-µm para eliminar cualquier resto y/o esperma aglomerada. b) Clasificación . Se usó un láser de argón de dos líneas que opera a 351 y 364 nm y 150 mW para excitar el tinte Hoechst 33342. El citómetro de flujo/clasificador de células usado fue un SX MoFlo"* (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) operando a 50 psí. Se usó un fluido de envoltura basado en Tris que consiste de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris; 197.0 mM; #T-1503, Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO, USA), ácido cítrico monohidratado (55.4 mM; #C-7129, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) y fructosa (47.5 mM; #F-0127, Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO, USA). También se agregaron antibióticos de línea base al fluido de envoltura basado en Tris que consiste de 0.58 g/L 'de penicilina y 0.05 g/L de sulfato de estreptomicina . La esperma se clasificó por un proceso referido como "clasificación en masa" que permite la acumulación rápida de grandes números de esperrrras para que los ejemplos a gran escala puedan hacerse dentro de un tiemper razonable. La esperma pasa a través del citómetro de flujo bajo las condiciones de operación estándar con la excepción de que todas las gotitas que contienen esperma viable se recolectaron dentro de un tubo sencillo más que clasificarse dentro de dos tubos basados en características específicas (por ejemplo, clasificación por tipo de sexo) . La esperma se clasificó sobre la base de viabilidad; en consecuencia, las espermas que tenían membranas plasmáticas comprometidas se excluyeron durante la clasificación err masa . La esperma teñida se mantuvo a 22 ±_1°C durante la clasificación. La esperma clasificada en masa se recolectó en tubos de plástico de 50 ml que contienen 2 ml de diluyente de yema de huevo al 20%-Tris preparado con yema de huevo al 20% (vol/vol) en 200 mM de Tris, 65 mM de ácido cítrico, 56 mM de fructosa, 50 Tg/ml de tilosina 250 Tg/ml de gentamicina, y 150/300 " Tg/ml de linco-espectina en agua desionizada. El diluyente de yema de huevo-Tris se denominó "fracción Tris-A" para denotar la carencia del glicerol en este punto del procedimiento. La esperma se recolectó en tubos para contener 12 ml y aproximadamente 6 x 106 esperma. La esperma se incubó subsecuentemente a 22°C durante 1__ a 3 h para simular condiciones de una clasificación basada en tipo de sexo. c) Preparación para Congelación . Después de la incubación, la esperma clasificada se enfrió a 5°C durante el periodo de 70 minutos. Después de enfriar, el contenido de los dos tubos se reunió y se transfirió a una centrífuga de cubeta oscilante refrigerada calibrada a 5°C y se centrifugó a 850 x g durante 20 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, el proceso continúa a 5°C agregando aproximadamente 150 µl de diluyente fracción Tris-A a aproximadamente 150-µl de granulo de'esperma para llevar la concentración de esperma a aproximadamente 40 x 106/ml. Se reunió la esperma de toros individuales -y se diluyó inmediatamente con un volumen igual de diluyente de yema de huevo-Tris que contiene 12% (v/v) de glicerol ("fracción Tris-B") . La -fracción Tris-B se agregó a la suspensión de esperma como 2 volúmenes iguales a Intervalos- de 15 minutos para ajustar la concentración de esperma final en 20 x 106/ml. La concentración de glicerol final del diluyente de yema de huevo-Tris completo que contiene la esperma fue 6% (v/v) . d) Equilibrio y Congelación . La esperma diluida se empacó después en 0.25 ml de cloruro de polivinilo de popotes para congelarse por procedimientos de rutina en bastidores en vapor de nitrógeno líquido estático. Se congelaron dos popotes de cada uno de los 4 toros después de 3, 6 y 18 h de tiempo de equilibrio total a 5°C. 3. Evaluación de la movilidad pos-descongelación. Los popotes se descongelaron en un baño de agua a 37°C durante 30 segundos. Se hicieron estimaciones ciegas de la movilidad progresiva después de incubar las muestras a 37 °C durante 0, 1 y 2 h pos-descongelación. Cada uno de los dos observadores estimó la movilidad de la esperma progresiva a partir de cada uno de los dos popotes de semen. Estos cuatro estimados ciegos para cada unidad experimental representan submuestreo. 4. Análisis estadístico . Estadísticamente, las submuestras se analizaron como una subgráfica de la gráfica principal de mínimos cuadrados de las ANOVA para analizar los efectos de cualquier observador e interacción de observador x tratamiento. N se refiere al número de unidades experimentales, sin submuestras; los errores estándar se calcularon sobre la base de las medias de las cuatro submuestras a partir de los cuadrados del error medio de las ANOVA y el número de unidades experimentales; se presentan los cuadrados mínimos medios . Los efectos del tratamiento se evaluaron por medio de las ANOVA separadas para cada tiempo de incubación. El modelo incluyó los toros como un efecto aleatorio y el tiempo de equilibrio y el observador como efectos fijos; la subgráfica consistió del término del observador y las interacciones relacionadas. 5. Resul tados . Los tiempos de equilibrio de 3 ó 6 h fueron superiores a 18 h (Tabla 4), con base en el porcentaje de esperma progresivamente móvil, para 0 y 1 h (P<0.01) pero no 2 h de incubación pos-descongelación. Los efectos de especulación fueron evidentes en los tiempos de incubación de 1 y 2 h (P<0.05), pero no a 0 h . No hubo interacción del tiempo de equilibrio de la especulación significativa (P>0.1) no hubo un efecto del observador significativo para cualquier respuesta . Tabla 3. Regulador TALP modificado Ingrediente Concentración NaCl 95.0 mM KCl 3.0 mM NaHP04 0.3 mM NaHC03 10.0 mM MgCl2 • 6H20 0.4 mM Piruvato de Na 2.0 mM Glucosa 5.0 mM lactato de Na 25.0 mM HEPES3 40.0 mM Albuminab de suero de bovino 3.0 mg/ml Sulfato de Gentamicina 30. J µg/ml a #H3375, Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO, USA b #US70195, fraction V; Amersham/Life_ Science, Cleveland, OH, USA Tabla 4. Efecto del tiempo de equilibrio precongelación en la movilidad progresiva pos-descongelación (%) Equilibrio Incubación pos-descongelacion a 37°C a 5°C Oh lh 2h 3 h 41c 36a,b 16 6 h 41 a 37a 18 18 h 35b 31b 12 S.E.C 1.5 0.8 2.0 a, Dentro de las columnas, las medias sin superíndices comunes difieren (P<0.05), Tukey' s HSD. Errores estándar reunidos, 6. Concl usión . Los resultados no indicaron diferencias en la movilidad de la esperma pos-descongelación entre 3 y 6 h de tiempo de equilibrio total a 5°C, pero hubo una declinación significante en la movilidad de la esperma después de 18 h de equilibrio a 5°C antes de congelar. El rango de 3 a 6 h permite reunir 2 lotes de clasificación de 3 h consecutivos para congelar esperma sin disminuir la movilidad pos-descongelación. Puesto que la interacción del tiempo de equilibrio por toro no fue significativa, fueron adecuadas 3 a 6 h de equilibrio, con la advertencia de que solamente se usaron 4 toros. El tiempo de equilibrio óptimo para una minoría de toros espera ser >6 h. Ejemplo 3 Efectos de la Concentración de Tinción y la Potencia de Láser en la Esperma Clasificada Objetivo: evaluar los efectos de la concentración de tinte Hoechst 33342 en combinación con la intensidad de láser en la esperma clasificada por flujo. 1. Recolección de la Muestra de Origen . Se recolectó y se preparó la esperma de 6 toros como se describe en el Ejemplo 1A. 2. Métodos a) Diseño Experimental . Se usó un eyaculado (2 toros) y 2 eyaculados en días diferentes (4 toros) en un diseño de 2 por 2 más el control. b) Tinción y Clasificación . La tinción, preparación para la clasificación y al esperma de clasificación se logró como se describió en el Ejemplo 2 excepto que el tinte Hoechst 33342 se agregó a las suspensiones de esperma a una concentración final de 149 TM o 224 TM; y la esperma se clasificó en masa operando el láser a 100 mW o 150 mW de potencia incidente. La esperma clasificada en masa se recolectó en tubos de plástico de 50 ml como se describió en el Ejemplo 2. Se recolectaron cuatro tubos que contienen aproximadamente 15 x 106 de esperma total/tubo durante 1 h para cada toro. La esperma clasificada se incubó durante 1 h a 22°C para simular un tiempo de clasificación más largo. c) Prepara ción para congela ción . Después de la incubación, la esperma se enfrió como en el Ejemplo 2. La esperma se concentró después por centrifugación a 5°C a 850 x g durante 20 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, se agregó 150 µl de diluyente dedrracción Tris-A a cada granulo de esperma de 150-µl a 5°C. Todos los granulos de esperma se suspendieron por aspiración suave repetida y la esperma de los toros individuales se reunió. Este diluyente de fracción Tris B se agregó en pasos como se describió en el Ejemplo 2. Se preparó un control no teñido, no clasificado para cada toro a 20 x 106 espermas/ml en diluyente Tris que contiene 6% de glicerol y se enfrió a 5°C mientras era preparada la esperma clasificada en masa. d) Equilibrio y congelación . El control y la esperma clasificada se empacaron en popotes de 0.25 ml de cloruro de polivinilo como se describió en el Ejemplo 2, se equilibró a 5°C durante 3 h y después se congeló convencionalmente . 3. Eval uación de la Movilidad Pos -descongela ción . Los popotes se descongelaron y se evaluaron como se describió en el Ejemplo 2. 4. Anál isis estadístico . Se proporciona una descripción general de los análisis estadísticos en el Ejemplo 2. Específicamente, los efectos del tratamiento se evaluaron por medio de ANOVA. El modelo incluyó concentración de tinte, intensidad de láser y toros en la gráfica principal, y el observador e interacciones relacionadas en las subgráficas. Los toros se consideraron un efecto aleatorio y los otros factores como fijos. 5. Resul tados . Los efectos del . toro fueron significativos para los porcentajes de esperma progresivamente móvil inmediatamente después de descongelación (P<0.1) y después de 1 h y 2 h de incubación a 37°C (P<0.05) . No hubo efecto de las concentraciones de tinte o concentración de tinte por toro en la movilidad de la esperma en cualquier tiempo de incubación. Con los toros considerados como un efecto aleatorio, 150 mW de potencia de láser resultaron en menor movilidad pos-descongelación de la esperma que 100 mW a 0 h de incubación (P<0.1) , pero no a otros tiempos de incubación (Tabla 5) . Si los toros se consideran como efectos fijos, 150 mW de potencia resultaron en menor movilidad de la esperma que ?00 mW (P<0.05) en todos los 3 tiempos de incubación. Hubo un efecto de potencia de láser por toro (P<0.05) en la movilidad de la esperma a 1 h, pero no a 0 h o 2 h de tiempo de incubación. También, la potencia más alta de láser resultó en la movilidad de esperma más baja que el control (P<0.05) a tiempos de incubación de 0 y 1 h (Tabla 5) . No hubo efecto_de observador significativo a 1 h, pero no a tiempos de incubación de 0=h o 2 h . No hubo interacción de tratamiento por observador (P>0.1) . Tabla 5. Efectos de la intensidad del láser y concentración de tinte en la movilidad pos-descongelación ( ) Media del Incubación a 37°C efecto principal Qh lh 2h Control 49 44 Concentración de Tinte 149 µM 41 39 30 224 µM 42 39 20 Intensidad de láser 100 mW 46 42 33 150 mW 38a 35b 27 S.E.C 2.2 1.2 1.3 a Efecto principal significativo (P<0.1) y difiere del control (P<0.05) . b Difiere del control (P<0.05). c Errores estándar reunidos 6. Conclusión . Los porcentajes de esperma progresivamente móvil pos-descongelación se disminuyeron por el proceso de tinción y clasificación. La más alta intensidad de láser fue la más perjudicial que_la menor intensidad de láser. No hubo efecto de la concentración del tinte en la movilidad de la esperma pos-descongelación. Así, la excitación de la esperma unida a tinte Hoechst 33342 a menores intensidades de láser es menos perjudicial y la esperma teñida a la concentración de tinte más alta no tuvo efecto perjudicial en la movilidad pos-descongelación. El daño observado se debió probablemente a la movilidad de la esperma en el aparato. Ejemplo 4 Evalua ción de los Procedimien tos de Tinción , Preclasi f i ca ción y Sel ección de Dil uyen tes para la Crioconserva ción de la Esperma . Objetivo: (1) evaluar tres tratamientos pre-clasificación para la esperma; y, (2) y evaluar combinaciones de fluido de envoltura y diluyente para la crioconservación de esperma clasificada por flujo. El siguiente experimento se duplicó en su totalidad: 1. Recolección de la Mues tra de Origen . Se recolectó y preparó la esperma de 4 toros como se describió en el Ejemplo ÍA. 2. Mé todos . a) Diseño Experimen tal . Se_ diseño un experimento factorial de 3 (tratamientos pre-clasificación) por 3 (diluyentes) por 2 (fluidos de envoltura) por 4 (toros) por 2 (observadores) para determinar el mejor procedimiento para mantener la esperma antes de la clasificación, y evaluar tres diluyentes para crioconservar la esperma clasificada. b) Prepara ción y Tinción de la Mues tra . La esperma recientemente recolectada de cada uno de los 4 toros se trató como sigue: (1) se diluyó a 400 x 106/ml en TALP modificado (véase Ejemplo 2, Tabla 3) y se tiñó durante 1 h a 34°C antes de clasificar en masa ("Diluir—0 h") ; (2) se incubó bien a 22°C durante 3 n antes de la dilución, se tiñó y se clasificó ("Bien cuidado-3 h"); o, (3) se diluyó y tiñó como "Diluir-0 h" y se incubó después a 22°C durante 3 h antes de clasificar en masa ("Diluir- 3 h") . c) Diluyen tes . Se compararon los siguientes diluyentes de congelación: EYC (véase Ejemplo 1) que contiene 7% de glicerol, yema de huevo-Tris (véase Ejemplo 2) que contiene 6% de glicerol, y yema de huevo-TES-Tris (TEST) que contiene 5% de glicerol. La "Fracción A" de EYC se refiere al diluyente EYC que no contiene glicersl, y la "fracción B" de EYC se refiere al diluyente EYC que contiene dos veces la concentración de glicerol deseada final (es decir, 14%) . Así, cuando se combinan las fracciones EYC A y B en volúmenes iguales, el diluyente EYC final contiene 7% de glicerol. Las fracciones A y B de Tris se nombran igualmente, y se describen en el Ejemplo 2. El diluyente TEST se preparó como un diluyente completo que contiene 5% de glicerol; en consecuencia, no hubo fracciones "A" y "B" para el TEST. d) Fl uido de Envol tura . El fluido de envoltura fue citrato de sodio dihidratado 98.6 mM (#S279-3, Fisher Scientific, Fair La n, NJ) o Tris como se describió en el Ejemplo 2. Ambos tipos de fluido de envoltura se ajustaron a pH 6.8; la osmolalidad fue aproximadamente 270 a 280 mOsm/kg. El fluido de envoltura Tris se usó para recolectar esperma que se diluyó en diluyentes de congelación de yema de huevo Tris y TEST. El fluido de envoltura _que contiene 98.6 mM d citrato de sodio dihidratado se usó para recolectar esperma ser diluida después en diluyente de congelación EYC. e) Clasificación . Aproximadamente 58_x 106 esperma para cada combinación de tratamiento preclasificación, fluid de envoltura y diluyente se clasificaron en masa como s describió en el Ejemplo 2 usando 150 mW de potencia de láse incidente. Para cada clasificación, la esperma se recolect durante aproximadamente 1 h. Después de clasificar, la muestras se incubaron a 22°C durante 2 h para simular un clasificación de 3 h . f) Preparación para Congelación . -Después de l incubación, la esperma se enfrió como se describió en e Ejemplo 2. Después de enfriar, las muestras se centrifugaro a 5°C a 850 x g durante 20 minutos. Cada muestra comprendi aproximadamente 28 ml de volumen total y estuvo contenida e un tubo de plástico de 50-ml. Después de que se eliminó el sobrenadante, l esperma se regresó a un cuarto frío a 5°C para dilución. La muestras se diluyeron a 40 x 10°/ml depositando 131 µl de l suspensión de esperma dentro de 69 µl de un diiuyente de EY fracción A, yema de huevo-Tris fracción A o TEST Inmediatamente, las suspensiones se ajustaron a 20 x 10 espermas/ml con la adición del glicerol ajustado que contien diluyente (es decir, EYC fracción B, Tris fracción B) o TEST. Los diluyentes de la fracción B se agregaron a sus muestras respectivas en pasos (2X) a intervalos de 15 minutos como se describió en el Ejemplo 2. El TEST se agregó a la esperma en pasos en la misma forma que los diluyentes EYC fracción B Tris. g) Equilibrio y Congelación . La_ esperma se empac en popotes de cloruro de polivinilo de 0.25 ml, se equilibr durante 3 h a 5°C y se congeló después en vapor de nitrógen líquido estático. 3. Evaluación de la Movilidad Pos -descongelación . Se hicieron las evaluaciones de descongelación y posdescongelación de esperma como se describió para el Ejempl 2. 4. Análisis Estadístico . Se proporciona una descripción general de análisis estadístico en el Ejemplo 2. Específicamente, se evaluaron los efectos del tratamiento por medio de análisis separados de varianza para cada tiempo de incubación pos-descongelación. La gráfica principal incluyó tratamiento pre-clasificación, diluyentes y toros; la subgráfica consistió de observadores e interacciones asociadas. Los toros se consideraron un efecto aleatorio, los otros factores fijos. El experimento completo se duplic dos veces. La prueba HSD de Tukey se usó para separar medias. 5. Resul tados . La movilidad progresiva pos descongelación de la esperma clasificada en masa se afectó (P<0.05) por el diluyente y los toros en cada tiempo de incubación pos-descongelación y por el procedimiento pre-clasificación a 0 h de incubación (Tabla 6) . No hubo diferencias debido a fluidos de envoltura (P>0.05) . A 0 h de incubación pos-descongelación, el uso del tratamiento de 3 bien cuidado resultó en más esperma móvil después de congela y descongelar que los otros dos tratamientos de tinción pre-clasificación (P<0.05; Tabla 6) . Sin embargo, los procedimientos de preclasificación no fueron estadísticamente significativos después de la incubación pos-descongelación d la esperma durante 1 o 2 h con los toros considerados como u efecto aleatorio. Apreciablemente, en estos 2 tiempos de incubación, no hubo tratamiento pre-clasificació significa"tivo por interacciones de toro (P<0.05) . Además, el tratamiento pre-clasificación habría tenido un efect significativo en todos los tiempos de incubación pos descongelación si los toros se hubieran considerado com efectos fijos. Inmediatamente después de descongelación (0 h) , TEST fue el mejor diluyente, pero después de 1 ó 2 h d incubación a 37°C, Tris fue el mejor diluyente. Apreciablemente, no hubo tratamiento pre-clasificación po interacción del diluyente para cualquier respuesta. Hub efectos de observador (PíO.01) en_ todos los tiempos d incubación, pero sin observador mediante interacciones po tratamiento. Hubo un toro por interacción de diluyent (P<0.05) en las 3 veces de incubación. Tabla 6. Efectos principales del tratamiento pre clasificación y diluyentes de congelación en la movilida progresiva pos-descongelación (%) Procedimiento Incubación a 37°C pre-clasificación Diluyente 0 h 1 h 2 h Diluir-0 h Media 39a 32 22 Bien cuidada--3 h Media 43b 36 25 Dilución--3 h Media 38a 31 19 Media EYC 36a 29a 17a Media Tris 40b 39 29b Media TEST 44c 33c 20a S.E.' 0.8 0.8 0.7 ,b,c Las medias dentro de columnas, dentro de efecto principales, sin superíndices comunes difieren (P<0.05) . d Errores estándar reunidos = J error cuadrado medio de ANOVA -r- __ 6. Conclusión . Este estudio mostró que mantener l esperma bien cuidada durante 3 h antes de la dilución tinció y clasificación fue mejor que la dilución y tinción inmediat 0 h o 3 h después. Así, cerca de 3 h dentro de la clasificación, e mejor continuar con una nueva alícuota del eyaculado origina que se mantuvo Bien cuidada 3 h y después teñir, más que continuar con la muestra original de esperma teñida y mantener a 400 X 106 espermas/ml. Aún cuando el diluyente TEST proporcionó mayor movilidad pos-descongelación a 0 h, Tris fue el diluyente superior cuando la esperma fue sometida a esfuerzos por incubación a 37°C. Cualquier fluido, de envoltura funcionó igualmente bien para cada diluyente. Con base en estos resultados, se ha incorporado el uso _de fluido de envoltura Tris en combinación con el diluyente de congelación Tris dentro del procedimiento de operación estándar. Ejemplo 5 Efectos., de los Adi tivos del Diluyen te en la Esperma Clasificada Objetivo: evaluar el efecto de agregar dodeciisulfato sódico ("SDS") al diluyente de congelación en la esperma clasificada por flujo A. Evaluación del Efecto de la Concentración de SDS en el Diluyente de Congelación 1. Recolección de la Muestra de Origen . Se recolectó y se preparó la esperma de 6 toros como se describió en el Ejemplo ÍA. 2. Métodos . La esperma de cada uno de los ó toros se diluyó a 20 x 106/ml en diluyente Tris de huevo completo al 20% ("WET") que contiene 0, 0.03," 0.06, 0.0G, o 0.12 por ciento de SDS, se empacó en popotes y se congeló. El diluyente WET se preparó usando 3.028 g de Tri [hidroximetil] aminometano, l.~8 g de ácido cítrico monohidratado, y 1.25 g de fructosa por 100 ml de agua doblemente destilada, a la cual se agregó 20% de huevo completo (vol/vol) . El diluyente WET se preparó a un pH de aproximadamente 7.0 y tuvo una concentración de glicerol final de aproximadamente 6% (vol/vol) . El diluyente WET también tuvo 1000 IU de penicilina "G" sódica y 100 Tg de sulfato de estreptomicina/ml . 3. Resul tados . Las medias respectivas (muestra n=l de cada uno de los 6 toros) fueron 51, 51, 50, 51, y 48% de esperma progresiva móvil aproximadamente 10 minutos posdescongelación. Con base en estos resultados, se usó 0.06 por ciento de SDS en el Ejemplo 5B. B. Eval uación de los Efectos de 0 . 06. por cien to de SDS en Diversos Dil uyentes de Congela ción en la Movilidad Pos -Descongela ción de la Esperma Clasificada por Fl uj o . 1. Recolección de la Muestra de Ori gen . Se recolectó- y se preparó la esperma de 8 toros como se describió en el Ejemplo ÍA. 2. Métodos . Se estudió la movilidad posdescongelación para la esperma congelada en los diluyentes yema de huevo-Tris (véase Ejemplo 2) y WET (véase Ejemplo 5A) con y sin 0.06% de SDS. El contenido_ de glicerol final para ambos diluyentes fue 6%. a) Tinción , JPrepara ción para la Clasifi ca ción , Clasificación . Las muestras de esperma teñidas se prepararon a partir de un eyaculado de cada uno de los 8 toros como se describió en el Ejemplo 2. La esperma teñida se clasificó en masa usando fluido de envoltura Tris como se describió en el Ejemplo 2 excepto que la clasificación se logró usando 135 mW de potencia láser incidente. La esperma clasificada se recolectó en un tubo de plástico de 50 ml conteniendo 2 ml de regulador de congelación fracción A para cada diluyente, se recolectó 15 x 106 de esperma clasificada total (25 ml) para cada tratamiento y se incubó durante 1 h a 22°C para simular la clasificación más larga. b) Prepara ción para Congela ción . La esperma diluida se enfrió después a 5°C durante 90 minutos. Se agregó un volumen igual del diluyente de fracción B apropiado en pasos (2x) a intervalos de 15 minutos a cada tubo de plástico de 50 ml conteniendo esperma clasificada. Se concentraron alícuotas del tratamiento de 25 ml/diluyente por centrifugación durante 20" minutos a 850 x g en una centrífuga refrigerada. El sobrenadante se eliminó dejando un granulo de esperma 600 Tl que se suspendió agitando suavemente con remolino durante 15 segundos. No se agregó diluyente adicional al granulo de esperma puesto que la suspensión que contiene el granulo ya contenía glicerol. La concentración de la suspensión de esperma fue aproximadamente 20 x 106/ml. Se preparó un control no teñido, no clasificado para cada toro a 20 x 106 espermas/ml en diluyente de yema de huevo Tris que contiene 6% de glicerol. El control se colocó en un cuarto frío a 5°C mientras tuvo lugar la clasificación en masa. c) Equilibrio y Congelación . Toda la esperma control y clasificada en masa se empacó y se congeló al mismo tiempo. La esperma se empacó dentro de popotes de cloruro de polivinilo de 0.25 ml, se equilibró durante aproximadamente 3 h hasta aproximadamente 6 h a 5°C y después se congeló en vapor de nitrógeno líquido estático. 3. Evaluación de la Movilidad Pos-descongelación . Se hicieron las evaluaciones de descongelación y posdescongelación de la esperma como se describió para el Ejemplo 2 con la excepción de que se evaluó la movilidad progresiva 0.5 y 2.0 h después de la incubación. 4. Análisis Estadístico : Se proporciona una descripción general de los análisis estadísticos en el Ejemplo 2. Específicamente, los efectos del tratamiento se evaluaron por medio de análisis separados de varianza para cada tiempo de incubación; el modelo incluyó toro y diluyente en la gráfica principal y observador e interacciones relacionadas en la subgráfica. Las diferencias en las medias se determinó por la prueba de diferencia menos significativa. 5. Resul tados . El diluyente afectó (P<0.05) la movilidad progresiva de la esperma después de 0.5 o 2 h de incubación pos-descongelación (Tabla 7) . A 0.5 h, WET más SDS resultó en menor movilidad que Tris con SDS. A 2 h, todos los tratamientos con esperma clasificada en masa fueron peores que la esperma control no clasificada. Hubo efectos de toro y observador significativos (P<0.01) en ambos tiempos de incubación, pero sin observador mediante interacciones por tratamiento . Tabla 7. Efecto del diluyente en la movilidad progresiva posdescongelación (%) incubación a las 37°C Diluyente 0.5 h 2 h Tris (sin clasificar] 42a 41a Tris w/o SDS 40 'b 35b Tris w/SDS 42a 37b WET w/o SDS 40a'b 35b WET w/SDS 38b 35b ?.E.C 1.0 1.2 a'b Medias dentro de las columnas sin superíndices comunes difieren (P<0.05) . error cuadrado medio de ANOVA -?- ¡ N Concl usión . La inclusión de VSDS en los diluyentes Tris o WET no benefició la calidad de la esperma como se determinó por los estimados visuales de movilidad después de descongelación. También, los resultados usando diluyentes WET y Tris fueron similares; en consecuencia, WET pareció ser tan eficaz como Tris para crioconservar la esperma de bovino seleccionada. Ejemplo 6 Calidad de la Esperma Sexuada por Clasifica ción de Fl uj o para Pruebas de Campo Objetivo: evaluar la calidad pos-descongelación de la esperma clasificada con base en la integridad del acrosoma. 1. Recolección de la Mues tra de Origen . Se recolectó y se preparó la esperma de 3 toros como se describió en el Ejemplo ÍA. 2 . Métodos . La esperma control clasificada y sin clasificar del mismo eyaculado, se tiñó, se procesó y se clasificó como se describió en el Ejemplo 2 excepto que la esperma se clasificó por tipo de sexo a un nivel de pureza de 90%. La esperma clasificada se recolectó en un volumen de aproximadamente 20 ml y se enfrió a 5°C durante 90 minutos (0.2°C/min) . Después de enfriar, se agregó un volumen igual de diluyente de yema de huevo-Tris B (véase Ejemplo 2) a la esperma clasificada en 2 volúmenes iguales a intervalos de 15 minutos . La centrifugación y aspiración del sobrenadante se logró como se describió en el Ejemplo 5. Después de la centrifugación y aspiración, se agregó diluyente de yema de huevo-Tris que contiene 6% de glicerol (v/v) al granulo de esperma para llevar la concentración de la esperma hasta aproximadamente 20 x 10 /ml . La congelación y descongelación se hizo como se describió en el Ejemplo 2, excepto que el tiempo de equilibrio fue aproximadamente 3 h. 3. Eval uación de la Movilidad Pos -Descongelación . Se hicieron estimados visuales del porcentaje de esperma progresivamente móvil a 37 °C aproximadamente 10 minutos después de la descongelación. La integridad del acrosoma de la esperma se valoró usando microscopía de contraste de interferencia diferencial (xlOOO) después de 2 h de incubación a 37 °C. La esperma se trató con 40 mM de fluoruro de sodio, se hizo un frotis en húmedo, y se examinaron 100 espermas por tratamiento. Los acroso as se clasificaron como: (a) acrosoma intacto, (b) acrosoma hinchado o dañado, o (c) acrosoma perdido (no intacto) . A * Análisis Estadístico . Se analizaron datos de 19 diferentes fechas de congelación equilibrados a través de 3 toros usados en las pruebas de campo. Los efectos del tratamiento (clasificado vs . control) se evaluaron por medio de análisis de varianza con los toros como un efecto fijo. 5. Resul tados . El porcentaje de esperma progresivamente móvil pos-descongelación fue significativamente mayor (P<0.05) para la esperma no clasificada (50%) que para la esperma clasificada (46%; Tabla 8), a pesar de la eliminación de la esperma muerta durante la clasificación. Sin embargo, el porcentaje de esperma con un acrosoma intacto no fue diferente. La clasificación aumentó el porcentaje de esperma que pierde un acrosoma, pero también redujo el porcentaje de esperma con un acrosoma dañado, con relación a la esperma control (P<0.05) . Existieron diferencias significativas entre los toros del porcentaje de acrosomas intactos (P<0.05), por ciento de acrosomas no intactos (P<0.01), y movilidad progresiva pos-descongelación (P<0.01) . Hubo un efecto de clasificación por toro para la movilidad pos-descongelación (p<0.01) pero no para las otras respuestas. De los toros A y B, las diferencias en la movilidad pos-descongelación entre la esperma clasificada y no clasificada fue casi cero; para el toro C, la esperma clasificada fue ÍQ puntos porcentuales (19%) menor en movilidad que la esperma control. Tabla 8. Efecto de la clasificación en la movilidad posdescongelación (%) y el estatus del acrosoma (%) . Estatus del acrosoma No Movilidad Intacto Dañado Intacto pos-descongelación Control 64a 20a 15a 50a Clasificado 65a 14b 21b 46b a,b Las medias de columna con diferentes superíndices difieren (P<0.05) . 6. Conclusión . Los estimados ^visuales para la movilidad progresiva para la esperma congelada clasificada en promedio fueron ligeramente menores (4 puntos porcentuales; 8%) que para la esperma control, aunque esta diferencia fue más grande para un toro. Estas evaluaciones se hicieron aproximadamente 10 minutos después de_ descongelar . La pequeña diferencia promedio es consistente con la de los acrosomas no intactos después de 2 h de incubación. La esperma con un acrosoma dañado o perdido es probable que sea inmóvil . El porcentaje aumentado de esperma con un acrosoma no intacto, para las muestras clasificadas, indica daño asociado con la clasificación o con la crioconservación antes o después de la clasificación actual. Probablemente, la clasificación convirtió los acrosomas dañados en acrosomas perdidos. Con base en los procedimientos estándar para la evaluación de la calidad de la esperma, no existe base para suponer que el potencial fertilizante de esta esperma de clasificación por flujo deba estar severamente comprometido para la mayoría de los toros. Ejemplo 7 Selección del Sexo y Crioconserva ción de la esperma de toro usando dil uyen te de yema de huevo- Tris al 20 % Objetivo: proporcionar un protocolo para la crioconservación de la esperma de toro clasificada por flujo. 1. Recolección y val oración del eya culado . Recolectar y preparar eyaculados como se describió en el Ejemplo 1A. Seleccionar eyaculados a partir de aquellos toros con >75~- de esperma morfológicamente normal. Estimar visualmente el porcentaje de esperma progresivamente móvil (los eyaculados que tienen movilidad progresiva >60°> son mejores para distribución). Agregar antibióticos al semen puro como sigue: tilosina a una concentración final de 100 µg/ml, gentamicina a una concentración final de 500 µg/ml, y linco-espectina a una concentración final de 300/600 µg/ml. 2. Tinción y Preparación para Dis tribución . Después de la adición de los antibióticos a la muestra de semen puro, dejar 15-20 minutos antes de teñir. Teñir las muestras como se describió en el Ejemplo 2. 3. Distribución . Distribuir esperma de tipo X- e Y-, colocando las compuertas de distribución para 90% de pureza. Distribuir la esperma dentro de tubos Falcon de 50 ml que contienen 2 ml de 20% de diluyente de yema de huevo-fracción Tris A (véase Ejemplo 2) hasta que cada tubo contenga un máximo de 20 ml de volumen total (o un máximo de 2 h por distribución) y la concentración de esperma distribuida final es 6 x 105/ml. Indicar que debe agregarse 20% adicional de regulador de recepción de yema de huevo-fracción de Tris-A después de la distribución y antes de enfriar de manera que el porcentaje final de yema de huevo sea al menos 3%. 4. Preparación para Congelación . Después de la distribución, enfriar las muestras distribuidas a 5°C durante un período de 90 minutos. Después de enfriar, agregar 20% de diluyente de yema de huevo-fracción Tris B (véase Ejemplo 2) en pasos (2X) a intervalos de 15, minutos. El volumen final del diluyente fracción Tris B agregado a la muestra de esperma debe ser igual al volumen del diluyente de fracción Tris A. El volumen total de la muestra de esperma después de que se agrega al diluyente de fracción Tris B no debe exceder 27 ml del volumen total. Después que se agrega el diluyente fracción Tris B a la muestra de esperma, concentrar la - muestra por centrifugación durante 20 minutos a 850 x g. Aspirar el sobrenadante dejando aproximadamente 150 µil de granulo de esperma. Resuspender la esperma y reunir la esperma de cada toro individual. 5. Congela ción . Agregar diluyente completo de yema de huevo-Tris (6% de glicerol) para lograr una concentración de esperma final de 20 x 106/ml. Empacar la esperma diluida en popotes de cloruro de polivinilo de 0.25 ml para congelar como se describió en el Ejemplo 2. Ejemplo 8 Evaluación de la Fertilidad de la Esperma de Toro Congelada Dis tribuida por Fluj o en Estudios de Campo MATERIALES Y MÉTODOS Recolección y Procesamiento de Semen ~ Se recolectó semen de toros jóvenes de fertilidad desconocida por medio de la vagina artificial (véase Ejemplo 1A) . Después de determinar la concentración de esperma con un espectrofotómetro y la evaluación subjetiva de la movilidad progresiva de la esperma, se procesó el semen y se distribuyó como se describió en el Ejemplo 2 excepto que la esperma se distribuyó por tipo de sexo a 90% de pureza usando una potencia incidente de láser de aproximadamente 135 hasta aproximadamente 150 mW. Se logró el procesamiento y congelamiento como en el Ejemplo 2 excepto que el tiempo de equilibrio fue aproximadamente 3 h. Se usó Diluyente Cornell Universal (Seidel GE Jr . , Theriogenology 1997; 48:1255-1264) para el semen líquido en las pruebas de campo 1, 2, y 3. Para el semen congelado en las pruebas de campo 2 y 3, el diluyente usado fue 2.9% de citrato de Na + 20% de yema de huevo con una concentración de glicerol final de 7% (véase Ejemplo 1) . Para las pruebas de campo 4 hasta 11, la esperma se congeló en un diluyente basado en Tris compuesto de 200 mM de Tris, 65 mM de ácido cítrico, 56 mM de fructosa, 20% de yema de huevo, y una concentración de glicerol final de 6% (véase Ejemplo 2) . El fluido de envoltura usado en el citómetro de flujo fue 2.9% de citrato de Na (véase Ejemplo 4) para las pruebas 1, 2, y 3, y un regulador Tris para las pruebas restantes (véase Ejemplo 2) . La esperma se empacó en popotes franceses de 0.25ml en columnas tan pequeñas como 50 ul en el centro del popote. Para minimizar los efectos de dilución, se usaron bajos volúmenes de manera que estaban en al menos 107 espermas/ml. En la mayoría de las pruebas, se aspiró una columna de diluyentes sin esperma dentro del popote primero para humedecer el tapón de algodón, seguido por una pequeña columna de aire, y después la esperma sexada. Cuando la esperma se congeló, un popote de cada lote se descongeló en agua a 35°C durante 30 segundos para control de calidad, y los lotes con menos de 25% de movilidad progresiva después de la congelación se desecharon. Una muestra de esperma sexada de cada lote se sónico y se analizó por citometría de flujo para determinar la precisión del sexado. Manej o e Inseminación Artificial de Ternera Las terneras usadas estaban en 6 unidades de producción ampliamente esparcidas con diferentes prácticas de manejo. Las diferencias de estación y cría contribuyeron adicionalmente a la heterogeneidad de los experimentos (Tabla 9) . Hasta donde fue posible, los tratamientos y controles se alternaron sistemáticamente entre los toros dentro de inseminadores a medida que las terneras entraron a las instalaciones de inseminación. El estro se sincronizó en una de 4 formas (Tabla 9) : (1) 500 mg de acetato de melengesterol (MGA) alimentado diariamente en 2.3 kg de grano durante 14 días seguido por una inyección i.m. de 25 mg de prostaglandina F2 (Lutalyse, Upjohn, Kalamazoo, MI, USA) 17, 18 ó 19 días después del último día de alimentación MGA (MGA/PG) ; (2) una inyección sencilla de 25 mg de prostaglandina F2a (PG) ; (3) 20 ó 25 mg de prostaglandina F2a inyectada i.m. a intervalos de 12 días (PG/PG) o (4) 50 o 100 Tg de GnRH inyectado i.m., seguido por 25 mg de prostaglandina F2a 7 días después de (GnREVPG) . Las terneras se inspeccionaron visualmente las mañanas y las tardes por estro constante, pero se inseminaron solamente en las tardes después de las 16:00, aproximadamente 1/2 o 1 día después del principio del estro. La inseminación !- 9 -• ' - *i - Z* fue dentro del cuerpo uterino convencionalmente, o la mitad K " " u* rstíi %- u * dentro de cada cuerno uterino ^ ausando envolturas de transferencia de embrión a traumática**ss-(IMV,' Minneap '-olis, MN, * TÍ -USA) . En el último caso, el semen se ""depositó después de la S?* Í curvatura mayor del cuerno uterino_ tan anterior como pudo lograrse sin trauma, idénticamente a la transferencia de embrión no quirúrgica. En la mayoría de los casos, el semen se depositó entre el tercio anterior y la mitad de los cuernos. La mayoría de los experimentos incluyeron un control de esperma congelada inseminada dentro del cuerpo uterino con 20 ó 40 x 106 espermas/dosis de los mismos toros usados para la esperma distribuida por tipo de sexo (sexada) . Ese control sirvió como un estimado compuesto de la fertilidad intrínseca normal de las terneras bajo las condiciones de prueba de campo específicas así como la fertilidad de los toros usados y las habilidades de los inseminadores . Algunas pruebas también incluyeron un grupo 5 control no sexado de dosis baja. Se planearon algunos números de inseminaciones control para hacer la 1/2 o 2/3 de número usado para cada tratamiento para obtener más información .-? sobre la esperma sexada. La esperma congelada sexada y de control se descongelaron durante 20 a 30 segundos en un baño 10 de agua de 35 a 37°C. Otros detalles diversos se resumen en la Tabla 9. La preñez se diagnosticó por ultrasonido 28 a 37 días después de la inseminación y/o 56 a 92 días después de ^^ la inseminación, tiempo en el cual se_ determinó el sexo del 15 feto en la mayoría de las pruebas, como se describió en Curran, S., Theriogenology 1991; 36:809-814, sin saber el operador los tratamientos de inseminación o control. El sexo de los becerros nacido fue casi idéntico al diagnóstico de sexo fetal. Los datos se analizaron por Chi cuadrada de grado 20 de libertad sencillo corregido por continuidad; 2 pruebas de flk cola se usaron a menos que se especifique una cola. Se deshecho menos del 5% de las inseminaciones debido a errores del tratamiento de inseminación, infección franca del tracto reproductivo, falla en atravesar la cerviz, etc. Las 25 decisiones para desechar animales de los experimentos se hicieron poco después de la inseminación y nunca se basaron en el diagnóstico de preñez. Tabla 9. Detalles de procedimiento de las pruebas de campo. Prueba Fecha de Razas de Sincropi- ¡nseminación terneras Toros usados Inseminadores zación de Comentarios estros 5/20-23, Apgus N1.N2, A,B MGA/PG Incluidos los controles de dosis 1997 AN4 baja 218-5/22, Angus N3.N4.N5, C.D PGPG Dosis baja pero sin controles de 1998 crossbred N6 dosis normal; algunas novillas embarazadas y abortaron cuando se sincronizaron 6/2-6/5, Angas AN4.AN5, B,D MGA/PG 1998 N7.N8 2/10-13, Holstein J2, J4 C, D PG Lodo, nieve, viento y frío muy 1999 severo, lluvia torrencial 224-26, Holstein J2,J4,J5 C,B,D PGPG 1999 4/14-16, Holstein J2.J3.J4.J5 C,D G Algunas terneras eran 1999 deshechos reproductivos 4/27-5/1, Hereford& AN1.AN4 C MGA/PG Semen de un toro 1999 Angus empacado 6 h antes de la distribución; tiempo severo crossbred 4/21-23, Angus H1.H2 MGA/PG Terneras de corral reservado: 1999 crossbred 5/5-8,1999 Red Angus AR1.AR2 C.F MGA/PG 10 5/31-6/2, Angus AN4.AN7, B,D GnRH/PG 1999 ANS 11 7/28-30, Holstein H2.H3 C.D PG/PG Primera réplica disponible en una 1999 prueba mucho más grande RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los datos presentados son de 11 pruebas de campo consecutivas, heterogéneas, restringidas por aspectos logístícos de los estudios, tales como tener que ajustar los 5 toros a las necesidades genéticas de los rebaños, inaccesibilidad a la información de fertilidad de los toros, números limitados de terneras, inaccesibilidad de los mismos má inseminadores a través de las pruebas, tiempos severos en algunas pruebas, cantidades limitadas de semen sexado en las 10 pruebas anteriores, dos conjuntos de terneras en las cuales algunas resultaron estar preñadas hasta aproximadamente 55 días en el momento de sincronización del estro, etc. Hasta 4 toros y 3 inseminadores están involucrados en cada prueba; ^^ esto nos permitió muestrear las poblaciones para asegurar que 15 los resultados se aplican a más de un toro o técnico; sin embargo, se produjeron datos insuficientes para evaluar las diferencias de toro a toro en la fertilidad rigurosamente. Más conjuntos de terneras eran de rebaños de cría ubicados de 140 a 250 km del laboratorio. No hubo diferencias 20 significativas en las proporciones de preñez entre los inseminadores en ninguna prueba, pero los números de crías por inseminador fueron bajas, y probablemente se detectarían diferencias con números más grandes de inseminaciones. Los métodos de sincronización del estro no se 25 compararon dentro de las pruebas, de manera que no fue posible comparar las proporciones de preñez entre estos métodos. Las proporciones de preñez parecieron ser satisfactorias para los cuatro procedimientos de sincronización usados. Puesto que las inseminaciones se hicieron una vez al día, las terneras en tardes de estro se inseminaron aproximadamente 24 h después de que se detectó el estro. La proporción de preñez para estas terneras con la esperma sexada reunida durante todas las pruebas fue 203/414 (49.0%) que no fue significativamente diferente (P>0.1) de la de las terneras en las mañanas de estro e inseminadas así medio día después de la detección del estro 266/586 (45.4%) . Esta tendencia para mayor fertilidad con inseminación posterior está de acuerdo con los descubrimientos de otra investigación que es preferible inseminar posteriormente de lo recomendado normalmente con toros de fertilidad inferior, cuando se usan números de espermas bajos, o cuando las condiciones son de otra forma subóptimas . Las proporciones de preñez por los tratamientos y, cuando está disponible, el sexo del feto o becerro se presentan en las tablas 10 a 20. El objetivo fue obtener descendencia de hembras, excepto en la prueba 8; la precisión fue 95%, 83%, 90%, 83%, 82%, y 94% en~las Pruebas 1, 3, 8, 9, 10, y 11, respectivamente. En el resto de las pruebas, los sexos del feto o iniciación no estuvieron disponibles debido al ritmo de diagnóstico de preñez, inaccesibilidad de personas expertas para sexar fetos, y/o debido a que los becerros no habían nacido aún. Ésta no fue una preocupación principal debido a que el objetivo principal de esta investigación era determinar la fertilidad de la esperma distribuida por tiempo inseminada a dosis bajas. La precisión del sexado puede ajustarse a virtualmente cualquier nivel deseado entre 50 y 95+% al ajustar los parámetros de distribución. Sin embargo, resultados de precisión superior en números inferiores de esperma distribuida por unidad de tiempo, particularmente para la esperma del cromosoma Y. 90% de precisión suficiente para el trabajo de rutina. Los descubrimientos principales de cada prueba de campo serán resumidos a su vez. Notar que los números de espermas totales se dan en los encabezados de la Tabla; los números de espermas progresivamente móviles normalmente fueron 30 a 50% de estos valores. La prueba de campo 1 (Tabla 10) confirmó que las proporciones de preñez con la inseminación del cuerno uterino usando bajos números de esperma no sexada fueron similares a los controles con números de espéralas normales. La proporción de preñez del día 64 a 67 con esperma sexada no congelada (42%) fue 12 puntos porcentuales por abajo del control líquido no sexado con esperma diluida, teñida, y centrifugada idénticamente a la esperma distribuida. La precisión del sexado fue 95%; el sexo de los terneros nacidos de esperma sexada coincidió con el diagnóstico de sexo de los fetos exactamente; hubo un error al sexar los fetos de los controles». No hubo abortos entre los dos meses de gestación y el término, y los 19 becerros del tratamiento de esperma sexada fueron normales y sobrevivieron. Para el tratamiento de semen sexado, las proporciones de preñez de 2 meses para los toros NI, N2, y N3 fueron 41, 44, y 40%, respectivamente, el 39% '(13/33) de las terneras en estro en la mañana y 50 ^ (6/12) en estro en la tarde se preñaron. Tabla 10. Resultados de la prueba de campo 1—terneras Angus en Wyoming, 1997 Tratamiento/sitio No. de No. de No. de No. de No. de $ esperma terneras preñadas preñadas que parió día 31 a 33 día 64 a 67 la vaca Sexado, 5°C/cuernos 3 x 105 45 20 (Aá.%) 19 (42%) 18 (95%)a Control, 5°C/cuernos 3 x 105 28 15 (54%) 15 (54%) 5 (53%)b Congelado, 40 x 106 29 16 (55%) 15 (52%) 11 (73%)a'b control/cuerpo a,a Proporciones de sexo sin superíndices comunes difieren (P<0.02) . La prueba de campo 2 , Tabla 11) proporcionó la primera evidencia de que los resultados con esperma sexada, congelada son similares a la esperma no congelada sexada, si se hacen ajustes para los números_ de esperma destruida durante la crioconservación. Tampoco hubo diferencia en las proporciones de preñez entre la esperma sexada almacenada a 5 versus 18°C. Las proporciones de preñez a 2 + meses después de la inseminación para el semen sexado de toros individuales varió de 22 a 42% de preñez (P>0.05) . La pérdida embriónica entre 1 y 2 meses de gestación fue muy similar para la preñez sexada y de control. Estuvieron disponibles datos de los becerros a partir de 39 terneras a partir de esta prueba; cada una de estas terneras (30 preñeces sexadas, 9 controles) preñadas a los dos meses paridas después de una gestación de periodo normal. Tabla 11. Resultados de la prueba de campo 2--Terneras de res cruzadas en Colorado, 1998 Tratamiento/sitio No. de No. de No. de No. de esperma terneras preñadas preñadas día 30 a 35a día 59 a 92a Control, 5°C/cuernos 5 x 105 58 27 ( 7a) 24 (41%) Sexado, 5°C/cuernos 5 x 105 51 17 (33%) 16 (31%) Sexado, 18°C/cuernos 5 x 105 46 16 (35%) 12 (26%) Sexado, congelado/cuernos 1 x 106 87 29 (33%) 28 (32%) a Sin diferencias significativas ?" . La prueba de campo 3 'Tabla 12) confirmó que la esperma congelada sexada resulta en proporciones de preñez razonables. La precisión del esperma sexado se confirmó de nuevo; sin embargo, existieron 4 errores al sexar fetos en relación con los becerros nacidos; los sexos actuales de los becerros nacidos se presentan. De nuevo, no hubo abortos entre los dos meses de gestación y el término. Las proporciones de preñez promediadas sobre la esperma congelada, descongelada y sexada, sexada para los toros N8, N9, AN5, y AN4 fue 24, 31, 50, y 60%, respectivamente (P<0.1) . Tabla 12. Resultados de la prueba de campo 3--Terneras Angus en Wyoming, 1998 Tratamiento/sitio No. de No. de No. de No. de $ esperma terneras preñadas que parió día 62 a 65 la vaca Sexado, 18°C/cuernos 5 x 10' 37 11 (30%)' 10 (91%) Sexado, congelado/cuernos 1 x 10b 35 18 (51%)a'B 14 (7 Congelado, control/cuerpo 40 x 10b 37 27 (73%) D 16 (59 - \d a,b Las medias sin superíndices comunes difieren (P<0.05) . c' El porcentaje de _p! que parió la vaca de los tratamientos sexados (83%) difirió del grupo control, P<0.05, 1-cola, ?2. Las pruebas de campo 4, 5, y 6 (Tablas 13, 14, 15) se hiciero _en la misma ubicación con 3 grupos diferentes de terneras. Desafortunadamente, no fue posible replicar cada prueba igualmente debido a caprichos de las pruebas de campo, tales como programación de personal, disponibilidad de semen sexado de cada toro, etc. Las proporciones de preñez ampliamente diferentes entre las pruebas 5 y 6 ilustran que las condiciones fueron diferentes entre las pruebas. Algunas de las terneras en la prueba 6 estuvieron disponibles debido a que fallaron en preñarse después de 1 mes de apareamiento natural. Bajo las condiciones de estas pruebas, las proporciones de preñez fueron muy similares entre 1.5 y 3.0 x 10° espermas congeladas/dosis sexadas. -Además, no hubo ventaja en la inseminación uterina-cuerno . No hubo diferencia significativa (P>0.05) en las proporciones de preñez entre los toros excepto en la Prueba 5 en la cual la proporción de preñez de J2, 20/28 (71%), fue superior que la de J4 , 15/39 (38%) (P<0.05) . Esta diferencia no fué consistente de prueba a prueba, a medida que J4 tuvo numéricamente pero no significativamente (P>0.1) proporciones de preñez superiores que J2 en las Pruebas 4 y 6. Tabla 13. Resultados de la prueba de campo 4—terneras Holstein en Colorado, 1999 Tratamiento/sitio No. de No. de No. de No. de esperma terneras preñadas preñadas día 30 a 33 día 64 a 67* Sexado, congelado/cuerpo 1.5 x 106 55 36 (65% a,b 36 (65%)a'b Sexado, congelado/cuerpo 3 x 10ff 52 27 (52%) a 26 (50^)a Control, congelado/cuerpo 20 x 106 55 ^5 (82%) 43 (78%)b Las medias sin superíndices comunes difieren 'P<0.01 * Se vendieron seis terneras preñadas en el día 30 a 33 antes del segundo diagnóstico de preñez ; se supuso que estas habrían permanecido preñadas . Tabla 14 , Resultados de la prueba de campo 5--terneras Holstein en Colorado, 1999 Tratamiento/sitio No. de No. de No. de No. de esperma terneras preñadas preñadas día 33 a 35a día 60 a 62a Sexado, congelado/cuerpo 1.5 x 106 23 12 (52%) 12 (52%) Sexado, congelado/cuerpo 3.0 x 105 25 15 (60%) 14 (56%) Sexado, congelado/cuernos 1.5 x 106 25 15 (60%) 12 (48%) Sexado, congelado/cuerno 3.0 x 106 25 17 (68%) 15 (60%) Control, congelado/cuerpo 20 x 106 30 20 (67%) 19 (63%) a Sin diferencias significativas. Tabla 15. Resultados de la prueba de campo 6—terneras Holstein en Colorado, 1999 Tratamiento/sitio No. de No. de No. de No. de esperma terneras preñadas preñadas día 31 a 34 día 60 a 63 Sexado, congelado/cuerpo 1.5 X 10 27 11 (41%)a 9 (33%)a Sexado, congelado/cuerpo 3.0 X 106 25 10 (40%)a 9 (36%)a Sexado, congelado/cuernos 1.5 x 106 24 8 (33%)a 7 (29%)a Sexado, congelado/cuernos 3.Q x 106 24 10 (42%) a 8 (33%)a Control, congelado/cuerpo 20- x 106 24 18 (75%)b 17 (71%)' a'b Las medias sin superíndices comunes difieren (P<0.05' Para la prueba 7 (Tabla 16) , solamente un inseminador estuvo disponible debido a reprogramación. Esta es la única prueba que mostró una ventaja convincente de la inseminación de cuerno-uterino sobre el cuerpo-uterino. Para 5 este inseminador bajo las condiciones de la prueba, 55% más terneras (22 puntos porcentuales) se preñaron con semen congelado sexado inseminado dentro de los cuernos uterinos # que dentro del cuerpo uterino. La verdadera diferencia podría ser más pequeña debido a que existen intervalos de confianza 10 amplia en estas medias. En todas las otras pruebas (5, 6, 9, y 11) en las cuales se comparó la inseminación de cuerpo y cuerno, las proporciones de preñez fueron muy similares para ambos métodos para este técnico así como para otros técnicos. El semen de uno de los toros usados en la prueba 7 15 se embarcó sin dilución de Montana por aire en una caja aislada a ~20°C antes de distribuir; el tiempo de embarque fue de 6 h. Las proporciones de preñez para el esperma sexado de los dos toros fue virtualmente idéntico, 49% para el semen no embarcado y 52% para el semen embarcado. El semen no se 20 diluyó con diluyente y no enfrió para embarque debido a que las propiedades de tinción de la esperma con Hoechst 33342 se • alteran por la dilución con diluyentes. Además, en otros estudios (véase Ejemplo 4), almacenar semen bien cuidado a temperatura ambiente entre la recolección y la distribución 25 de flujo se encontró que es superior al diluido.

Tabla 16. Resultados de la prueba de campo 7— terneras de res cruzadas en Colorado, 1999 Tratamiento/sitio No. de Mo. de No. de esperma terneras preñadas día 33 a 37 Sexado, congelado/cuerpo 1.5 X 10 34 (4o:ya Sexado, congelado/cuernos 1.5 X 106 86 53 (62%)b Control, congelado/cuerpo 20 x 106 35 18 (51%)a'b a,b Las medias sin superíndices comunes .difieren (P<0.01) . La prueba de campo 8 (Tabla 17) se refiere a terneras de corral reservado no implantadas con promotores del crecimiento; en el momento que se diagnosticó la preñez abortaron, de manera que los datos de parida no están disponibles. Este experimento ilustra que el sexado eficaz también puede hacerse en la dirección del macho. Las direcciones de preñez para los 2 toros fueron 50 y 61% . Tabla 17. Resultados de la prueba de campo 8--terneras Angus en Nebraska, 1999 Tratamiento/sitio No. de No. de . No. de No. de esperma terneras preñadas3 fetos o* día 74 a 76 Sexado, congelado, 1 X 106 18 7 (39%) 6 (í láser de 72 mW/cuerpo Sexado, congelado, 1 X 106 18 13 £78^ 12 (92%) láser de 135 mW/cuerpo d Sin diferencias significantes. La prueba de campo 9 (Tabla 18) fue la única prueba que muestra una ventaja convincente de 3.0 versus 1.5 x 106 espermas sexadas, congeladas/dosis de inseminación. Esta ventaja fue verdadera para ambos inseminadores. Las proporciones de preñez para las espermas sexadas de los 2 toros fueron 62 y 75%. Tabla 18. Resultados de la prueba de campo 9--terneras Red Angus en Nebraska, 1999 Tratamiento/sitio No. de No. de No. de No. de esperma terneras preñadas fetos O dia 60 a 63a Sexado, congelado/cuerpo 1.5 X 10 15 _ 8 (53%) 7 (88%) Sexado, congelado/cuerpo 3.0 X 106 14 12 ( 86% ) 9 (75% ) Sexado, congelado/cuernos 1.5 x 106 16 9 (56% ) 7 (78% ) Sexado, congelado/cuerno 3.0 x 106 16 12 (75% ) 11 ( 92% ) Control, congelado/cuerpo 20 x 106 30 21 (70% ) 13 ( 62%) a 3.0 x 106 espermas sexadas tuvieron una proporción de preñez superior (80%) que 1.5 x 106 espermas sexadas (55%), P<0.05, 1- cola, x" . Las proporciones de preñez en la prueba de campo 10 (Tabla 19) con semen congelado sexado, fueron similares a los controles; la precisión de sexar esperma en esta prueba fue solamente 82%, lo cual, sin embargo, no es significativamente diferente de la precisión de 90% seleccionada. Las proporciones de preñez para el semen sexado fueron 54, 66, y 50% para los toros AN4, AN7 , y AN8, respectivamente (P>0.1). Dieciocho de las terneras inseminadas en esta prueba fueron las vacas que parieron que resultan del esperma sexado en la prueba de campo 1. Tabla 19. Resultados de la prueba de campo 10—terneras Angus en Wyoming, 1999 • Tratamiento/sitio No. de No. de No. de No. de esperma terneras preñadas fetos $ 10 día 61 a 63a Sexado, congelado/cuerpo 1 x 10 44 26 (59% ) 23 (85%) Sexado, congelado/cuerpo 3 x 10 43 23 (53%) 17 (74% ) Control, congelado/cuerpo 20 x 106 35 20 (57%) 12 (57%) a Sin diferencia significante . 15 Tabla 20 . Resultados de la prueba de campo 11— terneras Holstein en Colorado, 1999 Tratamiento/sitio No. de No. de No . de No . de esperma terneras preñadas preñadas 20 Sexado, congelado/cuerpo 1 X 106 12 8 ( 67% ) 7 ( 58% ) • Sexado, congelado/cuerpo 3 X 106 12 6 (50% ) 4 (33%) Sexado, congelado/cuernos 1 x 10 7 4 (57% ) 4 (57% ) Sexado, congelado/cuernos 3 x 106 4 (57%) 4 (57%) Control, congelado/cuerpo 20 x 10 4 (44% ) 3 (33% ) 25 Sin diferencias significativas ¿ 16 de 17 (94%) fetos de los tratamientos de semen sexado fueron hembras; dos estaban demasiado hondo en la cavidad corporal para diagnosticar el sexo con ultrasonido. Se combinaron los datos de estas pruebas en las cuales los tratamientos fueron idénticos excepto que se reunieron dosis de espermas de 1 x 10 y 1.5 x 106 (Tabla 21) . Tabla 21. Meta-resumen de combinar las pruebas con semen congelado sexado y controles congelados . Pruebas No. de espermas/ No. de No. de combinadas sitio terneras preñadas 5,6,9,11 1.0 - 1.5 x 106/cuerpo 77 36 (47%) 3.0 x 106/cuerpo 76 38 (50%) 1.0 - 1.5 x 106/cuernos 72 32 (44%) 3.0 x 106/cuernos 72 39 (54%) 2Qx 106/cuerpo, control 93 61 (66%) 4,5,6,9,10,11 1.0 - 1.5 x 106/cuerpo 176 98 (56%) 3.0 x 106/cuerpo 171 88 (51%) 20 x 106/cuerpo, control 183 124 (68%) 5,6,7,9,11 1.5 x 106/cuerpo 163 70 (43%) 1.5 x 106/cuerno 158 85 (54%) 20 x 106/cuerpo, control 128 79 (62%) Las proporciones de preñez con la esperma sexada fueron generalmente 70-90% de los controles sin sexar dentro de los experimentos con 7 a 20 veces más esperma. Esta diferencia fue menor en las pruebas más recientes, reflejando posiblemente procedimientos mejorados de procesamiento de esperma y sexado. En algunas pruebas, las terneras se examinaron por preñez por ultrasonido en los meses _1 y 2 después de la inseminación. Las pérdidas de preñez en este intervalo fueron similares (P>0.1) para los tratamientos de esperma sexada (23/261; 8.8%) versus control (9/145; 6.2%) lo cual es una medida de que el daño genético debido a que el sexado es mínimo. Se obtuvo información del parto de solamente unas cuantas de las terneras preñadas debido a que se vendió la mayoría del ganado de las pruebas anteriores, y aquellas de las pruebas posteriores aún no habían parido. La población de vacas paridas producidas a la fecha de semen sexado parece no ser diferente de la población de los controles . CONCLUSIÓN Las proporciones de sexo en el ganado pueden distorsionarse en aproximadamente 90% de cualquier sexo al distribuir la esperma sobre la base del contenido de ADN con un citómetro de flujo/distribuidor de células seguido por crioconservación e inseminación artificial de rutina relativamente. Las vacas paridas que resultan del esperma sexado parecen ser normales. Para la mayoría de los toros en estos estudios, las proporciones de preñez con 1.0 a 1.5 x 106 espermas congeladas sexadas fue 70 a 90% de. los controles no sexados con 20 o 40 x 106 espermas congeladas inseminadas convencionalmente. Estos resultados se aplican a terneras bien manejadas cruzadas por inseminadores bien entrenados usando el semen procesado apropiadamente. Puede haber una pequeña ventaja en inseminar esperma sexado bilateralmente dentro de los cuernos uterinos en comparación a la inseminación estándar del cuerpo uterino. La presente invención tiene por necesidad ser discutida en la presente en referencia a algunos métodos y materiales específicos. Debe entenderse que la discusión de estos métodos y materiales específicos de ninguna manera constituyen ninguna limitación al alcance de la presente invención, que se extiende a cualquier y todos los materiales alternativos y métodos adecuados para lograr los fines de la presente invención. Todas las patentes y publicaciones descritas se incorporan en la presente para referencia en su totalidad.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para la crioconservación de esperma, caracterizado porque comprende: (a) obtener una muestra de esperma seleccionada; (b) enfriar la muestra de esperma seleccionado; (c) aislar la esperma de la muestra de esperma seleccionada para producir esperma aislada; (d) agregar diluyente final a la esperma aislada para producir una suspensión de esperma; y (e) congelar la suspensión de esperma. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de esperma seleccionada comprende una porción de la esperma presente en una muestra de origen, seleccionada a la porción de esperma por una característica, y en donde la concentración de esperma en la muestra de esperma seleccionada es menor que la muestra de origen. 3. El método de conformidad-, con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de esperma seleccionada comprende esperma seleccionada por sexo. 4. El método de conformidad, con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de esperma seleccionada comprende esperma de mamífero. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la muestra de esperma seleccionada comprende esperma de bovino. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la muestra de esperma seleccionada comprende esperma de equino. 5 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la muestra de esperma seleccionada comprende esperma de porcino. • 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de esperma seleccionada 10 comprende esperma seleccionada por un método del grupo que consiste de citometría de flujo, una técnica magnética, una técnica de columna, una técnica gravimétrica, una técnica bioquímica, una técnica basada en la movilidad de la esperma, una técnica basada en una propiedad eléctrica de la esperma, 15 y cualquier combinación de los mismos. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la esperma se ha seleccionado por citometría de flujo. 10. El método de conformidad con la reivindicación 20 1, caracterizado porque el enfriamiento se lleva a cabo > reduciendo la temperatura de la muestra de esperma seleccionada hasta aproximadamente 5°Celsius. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el enfriamiento se lleva a cabo 25 durante un periodo de aproximadamente 60 minutos hasta aproximadamente 240 minutos. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el diluyente final agregado a la muestra de esperma seleccionada comprende, cada uno, además de un crioprotector, uno o más de los siguientes componentes: un componente que mantiene la osmolalidad y regula el pH, una sustancia orgánica que reduce el choque de frío y conserva la fertilidad de la esperma, una fuente de energía, una sustancia que facilita la capacitación de esperma, y un antibiótico. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el crioprotector se selecciona a partir del grupo que consiste de disacáridos, trisacáridos y cualquier combinación de los mismos. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el crioprotector se ~ selecciona a partir del grupo que consiste de glicerol, sulfóxido dimetilo etilenglicol, propilenglicol, y cualquier combinación de los mismos . 15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el componente que mantiene la osmolalidad y regula el pH se selecciona a partir del grupo que consiste de un regulador que comprende una sal, un regulador que contienen un carbohidrato y cualquier combinación de los mismos. 16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el componente que mantiene la osmolalidad y regula el pH se selecciona del grupo que consiste de citrato de sodio, Tris [hidroximetil] aminometano, 5 ácido N-Tris [hidroximetil] metil-2-aminoetansulfónico, glutamato monosódico, leche, medio regulado con HEPES, y cualquier combinación de los mismos. 17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la sustancia orgánica se selecciona 10 a partir del grupo que consiste de yema de huevo, un extracto de yema de huevo, leche, un extracto de leche, caseína, albúmina, lecitina, y cualquier combinación de los mismos. 18. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la fuente de energía es un 15 monosacárido seleccionado a partir del grupo que consiste de glucosa, fructosa, mañosa, y cualquier combinación de los mismos . 19. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el antibiótico se selecciona a 20 partir del grupo que consiste de tilosina, gentamicina, lincomicina, linco-espectina, espectinomicina, penicilina, ^ estreptomicina, y cualquier combinación de los mismos. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque después de la adición del diluyente 25 final, la muestra de esperma y la suspensión de esperma, respectivamente, comprenden glicerol, citrato de sodio, Tris [hidroximetil] aminometano, yema de huevo, fructosa, y uno o más antibióticos. 21. El método de conformidad con la reivindicación 5 1, caracterizado porque, después de la adición del diluyente final, la muestra de esperma y la suspensión de esperma, comprenden cada uno glicerol, citrato de sodio, yema de huevo, y uno o más antibióticos. # 22. El método de conformidad con la reivindicación 10 1, caracterizado porque después de la adición del diluyente final, la muestra de esperma y la suspensión de esperma, comprenden cada uno glicerol, yema de huevo, leche, fructosa, y uno o más antibióticos. 23. El método de conformidad con la reivindicación 15 8, caracterizado porque el diluyente tiene un pH en el rango de aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 7.5. 24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la esperma se aisla a partir de la muestra de esperma seleccionada por centrifugación. 20 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la centrifugación permite al menos • aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90% de recuperación de esperma. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25 1, caracterizado porque la concentración de esperma en la suspensión antes de congelar es aproximadamente 1 x 106/ml hasta aproximadamente 300 x 106/ml. 27. Una muestra de esperma seleccionada congelada caracterizada porque comprende una porción de la esperma presente en una muestra de origen, seleccionada la porción de esperma por una característica. 28. La muestra de esperma seleccionada congelada de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la muestra de esperma seleccionada congelada comprende esperma seleccionada por sexo. 29. La muestra de esperma seleccionada congelada de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la muestra de esperma seleccionada congelada comprende esperma de mamífero. 30. La muestra de esperma seleccionada congelada de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la muestra de esperma seleccionada congelada, comprende esperma de bovino . 31. La muestra de esperma seleccionada congelada de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la esperma seleccionada congelada comprende esperma de equino. 32. La muestra de esperma seleccionada congelada de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la muestra de esperma seleccionada congelada comprende esperma de porcino. 33. La muestra de esperma seleccionada congelada de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el método usado para seleccionar la muestra de esperma seleccionada comprende una técnica del grupo que consiste de 5 citometría de flujo, una técnica magnética, una técnica de columna, una técnica gravimétrica, una técnica bioquímica, una técnica basada en la movilidad de la esperma, una técnica • basada en una propiedad eléctrica de la esperma y cualquier combinación de las mismas, 10 34. La muestra de esperma seleccionada congelada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la muestra de esperma seleccionada congelada comprende esperma que se selecciona por citometría de flujo. * 35. La muestra de esperma seleccionada congelada de 15 conformidad con la reivindicación 27, en donde la muestra de esperma seleccionada congelada se produce por un método caracterizado porque comprende: (a) obtener una muestra de esperma seleccionada; (b) enfriar la muestra de esperma seleccionado; 20 (c) aislar la esperma de la muestra de esperma seleccionada para producir esperma aislada; (d) agregar diluyente final a la esperma aislada para producir una suspensión de esperma; y (e) congelar la suspensión de esperma. 25 36. Él método caracterizado porque comprende usar la muestra de esperma seleccionada congelada de conformidad con la reivindicación 27, para la inseminación artificial o fertilización in vitro. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36 caracterizado porque comprende usar la muestra de esperma seleccionada congelada para inseminación artificial de dosis baja .