INSTRUMENTO PARA SELECCIONAR Y DEPOSITAR ORGANISMOS MULTICELULARES Y OTROS OBJETOS GRANDES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente solicitud tie e ver con los mecanismos de alta velocidad para identificar automáticamente y seleccionar físicamente organismos multicelulares u otros objetos grandes con características predeterminadas a partir de poblaciones mezcladas y depositarlas en ubicaciones discretas . Los organismos multicelulares intactos, tales como nemátodos, larvas de mosca de la fruta, o embriones de zebrafish son utilizados frecuentemente como sistemas de modelo para ayudar a entender la función de genes humanos que se han implicado para jugar un papel en la enfermedad. Los " homólogos de gen humano se han identificado en estos organismos modelo y mutaciones que se han inducido específicamente en esos homólogos de gen. Tales mutaciones frecuentemente resultan en un cambio fenotípico que se puede observar fácilmente en el organismo modelo, y se ha mostrado que ciertos mutantes responden a compuestos farmacológicos con un modo medible de acción. Los mutantes de organismos intactos ahora se utilizan como una nueva clase de selecciones de_ fármaco in vivo para bibliotecas de compuestos farmacológicos combinatorios. Al utilizar estos organismos, uno puede identificar los objetivos para la intervención del fármaco sin la necesidad de entender completamente las trayectorias bioquímicas complejas entre el genotipo y el fenotipo. Además, los enfoques químicos combinatorios en estado sólido ahora se están utilizando para producir estas bibliotecas de fármaco; el resultado final es que los químicos de muestra, que se prueban y están presentes en microesferas sólidas usualmente entre 100 y 500 µm de diámetro. Estas técnicas de estado sólido apresuran grandemente la preparación de la biblioteca de compuestos de muestra aunque necesitan un método para seleccionar adecuadamente y distribuir estas microesferas para propósitos de prueba. El enfoque histórico para modelar enfermedades en organismos multicelulares ha sido hacer mutantes morfológicos o conductivos con defectos fenotípicos sustanciales. El intento de tal investigación es producir un mutante que parezca o modele un estado de enfermedad de modo que los nuevos terapéuticos puedan seleccionarse sin utilizar "conejillos de india" humanos. De hecho, considerar la prevalencia actual de activistas de los derechos de los animales, el enfoque más seguro es evitar completamente el uso de mamíferos para propósitos de prueba. La meta, entonces, ha sido observar estos defectos de enfermedad modelo y su interacción con terapéuticos candidatos objetivamente y con alta sensibilidad. Desafortunadamente, esta meta con frecuencia no se ha cumplido. El enfoque más cercano para alcanzar la meta ha sido idear pruebas de "vida-muerte" que puedan llevarse ha cabo en matrices de micropozo utilizando sistemas de lectura de salida ópticos. El plan es distribuir organismos individuales dentro de micropozos, agregar el terapéutico -- candidato y detectar ópticamente la respuesta. Si el terapéutico candidato está presente en una microesfera, entonces la microesfera también debe seleccionarse y distribuirse exactamente. La exposición de los mutantes de organismo modelo para variar las bibliotecas de compuestos farmacéuticos, aún cuando la mutación no se ha unido a un homólogo de gen humano también ayuda a definir la función del gen. La adicción de tales técnicas genómicas funcionales al repertorio de los métodos biológicos y bioquímicos moleculares está llevando a un incremento significante en velocidad en los procesos de descubrimiento farmacéutico. Los investigadores agregan comentarios a las bibliotecas de fármaco farmacéuticas para la toxicidad, actividad no específica, o permeabilidad de la membrana celular, etc, observando su conducta en organismos intactos. De esta forma, el potencial de terapéuticos nuevos muestran toxicidad o resultados dañinos que pueden descartase tempranamente sin desperdiciar fuentes valuables. El nemátodo de tierra Caenorhabdbi tis el-egans, se ha vuelto un organismo multicelular particularmente importante para estos tipos de pruebas debido a su anatomía, desarrollo, conducta y genoma, se entiende más completamente que aquel de cualquier otro animal . C. elegans es un animal metazoario pequeño compuesto de solamente 959 células, cada una generada a partir de una célula zigoto individual a través de un linaje de célula completamente conocido. Este número pequeño de células sin embargo exhiben una diversidad de tipos celulares que tipifica más animales complejos, incluyendo piel, músculo, aparato digestivo y células nerviosas . Los genes de C. elegans tienen acceso fácilmente a través de herramientas de potencia clásica y genética molecular. La secuencia del genoma C. elegans también es más avanzado que aquella de cualquier otro animal y es un modelo para el Human Genome Project. Aunque la mayoría de los genes de enfermedad humanos que se han identificado y clonados basados en la posición cromssómica no se ha conocido la función, la vasta mayoría de éstas así como la mayoría de los genes humanos tienen homólogos C. elegans . Estos homólogos pueden analizarse rápidamente utilizando el enfoque antes mencionado para elucidar la biología funcional del gen humano homólogo . Una conclusión sorprendente de los estudios de C. elegans es que los mecanismos celulares y moleculares que operan en este nemátodo son sorprendentemente similares a aquellos que operan en animales más complejos, incluyendo el hombre. Estas similitudes son tan grandes que los genes humanos homólogos pueden funcionar en- nemátodos y los genes de nemátodos pueden funcionar en células de mamíferos. Los investigadores por lo tanto están utilizando este nemátodo para numerosos tipos de experimentos relacionados con el desarrollo de agentes farmacéuticos para el uso en humanos y otros animales más altos. A pesar del poder potencial y la velocidad para utilizar los organismos multicelulares como los programas actuales de C. el egans para el descubrimiento de fármaco farmacéutico rápido para no emplear técnicas de separación de alta velocidad. Como ejemplo, con las técnicas de biología molecular de hoy en día, un laboratorio grande puede producir mutaciones de supresión en organismos multicelulares a una velocidad de 20 a 30 por mes. Para evaluar el efecto de una biblioteca de compuestos químicos (que puede contener frecuentemente 100,000 o más miembros) en una clase de organismos mutados, uno debe manipular primero y depositar un número preciso de organismos en la misma etapa de desarrollo dentro de un- recipiente, tal como los pozos de una matriz de placa de microtítulo. Los organismos de la etapa de desarrollo diferentes deben excluirse ya que pueden convolusionar la respuesta medida. Al utilizar métodos manuales lentos, la selección y deposición de organismos del tipo adecuado es un cuello de botella para todo el proceso de descubrimiento farmacéutico. Si los compuestos de prueba están presentes como microesferas, entonces la selección adecuada y distribución de microesferas añaden cuello de botella adicional. Además, los métodos manuales dependen de las pipetas que distribuyan volúmenes exactos de fluido y no números" exactos de organismo. En muchos estudios donde la velocidad de reproducción se altera por la mutación, ~es necesario comenzar el estudio del efecto de un compuesto a partir de la biblioteca combinatoria con un número exacto y conocido de organismos multicelulares ^en cada pozo. Cualquier sistema de selección basado en el volumen es capaz de distribuir números inexactos de organismos debido a _las suspenciones precisamente uniformes de organismos que son imposibles de mantener. De la misma forma, si los compuestos de prueba están disponibles como microesferas es extremadamente difícil colocar un número controlado de microesferas en cada pozo. Además, la población de microesferas puede mezclarse para que los resultados últimos requieran no sólo el conteo preciso sino también la selección de microesferas, claramente una tarea imposible para las pipetas simples. Los citómetros de flujo tiene caracterísficas operacionales que los hacen adaptables para los problemas de la automatización de la selección y deposición de organismos multicelulares y otros objetos grandes tales como microesferas. Los citómetros de flujo se han utilizado para contar en número de nemátodos en un volumen dado de fluido. Tal dispositivo fue escrito por Byerly et al (Byerly, L., R.C. Cassada, and R.L. Russell, "Machine for Rapidly Counting and Measuring the Size of Small Nematodes", Rev. Sci. Instrum. Vol 46, No. 5, May 1975), donde el citómetro de flujo utilizó flujo envolvente para orientar los nemátodos a lo largo de la dirección de flujo para que-- su longitud pudiera medirse y los conteos de organismo por organismo pudieran hacerse mediante un método de impedancia eléctrica similar a aquel utilizado en un contador Coulter ® comercial. Un citómetro de flujo para trabajar con los organismos multicelulares no se limita a utili-zar un sensor de impedancia, aunque pueden ser un citómetro de flujo de detección ópticamente más moderno. Por ejemplo, un citómetro de flujo óptico para analizar organismos alargados tales como plancton con anchuras de 500 µm y longitudes de más de 1000 µm se han descrito en un número de artículos publicados tales como Peeters, J. C, G. B Dubelaar, J. Ringelberg, y J. . Visser "Optical Plankton Analyser: a Flow Cytometer for Plankton Analysis, I: Design Considerations" Cytometry Sept 10(5): 522-528 T1989); y Dubelaar, G. B., A. C. Groenwegen, W. Stokdijk, G.J. van den Engh, y J.W. Viseer, "Optical Plankton Analyser: a Flow Cytometer for Plankton Analysis, II: Specifications", Cytometry Stept 10 (5) : 529-539 (1989) . El rango de tamaño de plancton utilizado en estos citómetros de flujo óptico es similar aquel encontrado con nemátodos, larvas de mosca de la fruta, y embriones de zebrafish. En todas _ estas referencias, los organismos multicelulares se analizaron meramente aunque no se seleccionaron y depositaron. Similarmente, el análisis de microesferas grandes con citómetros de flujo es una rutina ya que el área de corte transversal de la célula de flujo es suficiente para acomodar la microesfera. La selección y deposición y organismos no multicelulares y otros objetos pequeños con citómetros de flujo es bien conocida. El método utilizado para seleccionar y depositar los organismos específicos u objetos (por ejemplo, microesferas) en el dominio del citómetro de flujo consiste de un mecanismo para cambiar la dirección de la corriente de flujo de los organismos u objetos que emergen de la célula de flujo del citómetro de flujo para que los objetos analizados puedan depositarse específicamente en una placa de micropozos o recipiente similar. El cambio se realiza en un tiempo de retardo fijo después de que el citómetro de flujo ha identificado un organismo deseable. El retardo típicamente es la escala de tiempo de un milisegundo a decenas de milesegundos. El método más común encontrado en separadores de células comerciales es la desviación electrostática de objeto deseados una vez que han emergido de un puerto de salida en la célula de flujo en aire. La desviación electrostáticas se logra mediante placas cargadas que operan sobre una corriente en gotículas . Sin embargo, los separadores de células electrostático están diseñadas específicamente para células individuales y no son útiles para separar objetos grandes tales como nemátodos, larvas de mosca de la fruta, zebrafish o microesferas grandes. Esto es debido a que la célula de flujo de una célula electrostática se hace vibrar mecánicamente a frecuencias de decenas de kilohertz para romper mecánicamente la corriente de fluido en gotículas
(cargada o no cargada) en aire que están en el orden de 50µm de diámetro. Ese tamaño de gotita es óptimo _ para células individuales típicas con diámetros de 5 µm a 30 µm, pero es mucho más pequeño que la mayor parte de los organismos multicelulares, los cuales típicamente son del orden de un 1 mm de longitud. La etapa de vibración mecánica y la desintegración subsecuente de la corriente --en gotículas pequeñas típicamente es letal para los organismos multicelulares . La frecuencia de vibración de un separador de células electrostático no es variable, por lo tanto, uno no puede cambiar el tamaño de gotita para acomodar los organismos multicelulares. Por otra parte, toda la célula de flujo siempre vibra en esta frecuencia, haciéndola imposible para crear gotículas individuales en el dominio. La JP 06 109617 A utiliza una corriente de gas para" contraer la corriente de muestra de fluido para proteger las células delicadas antes de la separación electrostática. La JP 62 229045 describe un sistema que reduce el daño celular en un separador electrostático utilizando un flujo de gas para soplar las gotículas hacia arriba. La EP-A-0 626 455 utiliza separación electrostática con un material de encapsulamiento para proteger las muestras. En el caso de microesferas grandes utilizadas en la química combinatoria no existe preocupación de que la vibración mecánica dañará la microesfera. Sin embargo, los separadores electrostáticos no pueden seleccionar efectivamente" y depositar tales objetos grandes. Esto es un resultado de la geometría utilizada con las placas de desviación electrostática. A voltajes comúnmente utilizados de carga estática resulta en una desviación de sólo algunos grados. Es imposible producir desviaciones más grandes para incrementar los voltajes debido a que el arqueo ocurrirá. La desviación adecuada para separar las gotículas seleccionadas de las rechazadas se logra permitiendo que la co-rriente caiga a una distancia suficiente más allá de las placas cargadas. En el caso de la gotita de 50 µm típica, las gotículas caen 2.5 cm adicional más allá de las placas de desviación. Si el tamaño de gotita es el doble de 100 µm (todavía insuficiente para acomodar una microesfera química que combinatorio de 100 µm ) la gotita más grande tiene masa incrementada ampliamente lo cual quiere decir que el ángulo de desviación es más pequeño; por lo tanto, una distancia de caída más grande es necesaria para producir la desviación adecuada (es decir, el ángulo de desviación es más pequeño) . El resultado neto es que las gotículas de 100 µm requieren una distancia de caída de 20 cm. Con tal distancia de caída grande, las microinestabilidades de la corriente de flujo se amplían en desviaciones apreciables. Los micropozos de las placas en el uso actual pueden ser en el orden de uno hasta algunos milímetros de diámetro. Con una distancia de caída de 20 cm, los separadores electrostáticos actuales no pueden acertar exactamente un objetivo pequeño. El problema se vuelve aún más agudo cuando el tamaño de gotita se incrementa además para acomodar microesferas de 4QG_ µm o en organismos multicelulares. Con un tamaño de gotita de un milímetro (el tamaño necesario para acomodar un nemátodo típico) la distancia de caída incrementa aproximadamente 1Z5 cm haciéndolo típicamente imposible depositar las gotículas en recipientes objetivo de aún varios milímetros de diámetro. De este modo, los separadores electrostáticos son inadecuados completamente para los organismos multicelulares u otros objetos grandes. Aún si el proceso no daña o mata el organismo, la geometría de desviación hace imposible depositar exactamente los objetos grandes. Otros métodos de separación se han utilizado en un intento por solucionar las desventajas de los separadores electrostáticos. La JP 04 204254A describe un sistema en donde una boquilla de salida de una cámara de análisis se vuelve a colocar magnéticamente para alterar la trayectoria de una corriente de fluido en aire. La GB-A-1 318 720 utiliza un vació para extraer las partículas selectivamente en tubos de colección -que se pueden volver a colocar. La JP 04 001568 utiliza un vació para extraer una corriente de muestra en aire selectivamente en cámaras de colección. La EP-A-0 422 616 utiliza corrientes de fluido para desviar y selectivamente rectificar una corriente de muestra en el aira. La US-A-1 756 "427 utiliza una depresión para desviar selectivamente una corriente de muestra. La invención presenta un instrumento para seleccionar y distribuir exactamente organismos multicelulares y otros objetos grandes. El instrumento utiliza condiciones de flujo hidrodinámica en una cámara de alineación para alinear los organismos de muestra multicelulares alargados en organismos centrales u objetos en el centro de una corriente de flujo de fluido después de _que pasa una hilera individual a través de una zona de desviación que preferiblemente está dentro de la cámara. En la zona de detección, los objetos alineados y centrados son interrogados de preferencia mediante un haz de luz. Los detectores ópticos reciben luz refractada, reflejada, fluorescente y reunida de los objetos interrogados y el resultado que corresponde a las señales eléctricas. Un sistema" computarizado de procesamiento de señal utiliza estas señales para seleccionar los objetos analizados deseados. Un primer cambio de fluido corriente abajo de la zona de detección y fuera de la cámara es responsable de las señales desarrolladas por el sistema computarizado. Cuando el cambio se abre, la corriente de flujo que contiene los objetos pasa el cambio dentro de un recipiente de recolección. Cuando el cambio se cierra, una corriente de fluido desde el cambio desvía la corriente de fluido que contiene los objetos analizados y la previene de alcanzar el recipiente de recolección. En modalidades preferidas, el cambio de fluido puede Incluir una fuente cambiada de gas comprimido que tiene una salida de gas dirigida hacia una ubicación corriente abajo de la zona de detección y afuera de la cámara. La fuente cambiada de gas comprimido puede incluir una fuente de gas comprimido y una válvula operada eléctricamente, tal como una válvula solenoide, para interrumpir una corriente de gas desde la fuente de gas comprimido. La fuente cambiada de gas comprimido puede ser operativa para interactuar con la corriente de flujo de fluido que lleva a los objetos desde la zona de detección con la fuerza suficiente para convertir el fluido portador en una aspersión en gotículas. Una fuente de muestra puede ser operativa para suministrar un fluido que porte una "concentración lo suficientemente baja de los objetos de muestra grandes para que los objetos fluyan sustancialmente uno a uno a través de la zona de detección. El cambio de fluido puede ser responsable de una señal de detección retardada desde el sistema computarizado. El cable de fluido puede ser operativo para incluir solamente cantidades predeterminadas de fluido con el objeto de muestra seleccionado. El sistema computarizado puede ser operativo para provocar que el cambio seleccione un objeto a la vez, con cada objeto estando acompañado por un volumen predeterminado de fluido. Uña fuente de iluminación puede dirigirse hacia la zona de detección, con el detector siendo un detector óptico. El sistema computarizado puede ser operativo para determinar la longitud de por lóamenos uno de los objetos seleccionados midiendo el tiempo en que por lo menos uno de los objetos toma para pasar entre el detector y la fuente de iluminación. El --detector puede ser un detector sobre eje, localizado a través de la zona de detección junto con el eje de iluminación de la fuente de iluminación. El detector puede ser un detector fuera de eje generalmente perpendicular a un eje de iluminación de la fuente de iluminación. Un detector sobre eje puede localizarse a través de la zona de detección junto con el eje de iluminación de la fuente de iluminación. La fuente de iluminación puede ser un láser de baja potencia enfocado. La zona de detección puede tener una anchura de aproximadamente 10-40 µm. La zona de detección puede tener una sección transversal cuadrada. La abertura de salida de la fuente de muestra puede separarse de- la zona de detección mediante un volumen de conducto total de menos de 500 microlitros. Un segundo cambio de fluido corriente abajo del primer cambio de fluido y fuera de la cámara puede distribuir los objetos seleccionados dentro de los recipientes diferentes . En otro aspecto general, la invención presenta un organismo multicelular o instrumento de distribución de partícula grande que incluye medios para alinear los organismos u objetos en una corriente de fluido en una dirección paralela a una dirección de flujo de la corriente de fluido, medios para detectar la presencia de los organismos 'u objetos en la corriente de fluido localizada "corriente abajo de los medios para alinear, y medios para desviar selectivamente las porciones del fluido, con los medios para desviar selectivamente estando localizados corriente abajo de los medios para detectar, estando fuera de cualquier cámara que contenga los medios para alinear y ser responsables de los medios para detectar.
En modalidades preferidas, el organismo multicelular y el instrumento de distribución de objeto grande puede incluir adicionalmente medios para redirigir un resultado de los medios para determinar relativos en un recipiente para dispersarlos adicionalmente de los organismos de un segundo recipiente. Los medios para desviar selectivamente pueden ser para incluir solamente una cantidad predeterminada de fluido con cada uno de los organismos seleccionados . En un aspecto general adicional, la invención presenta un método para distribuir organismos multicelulares y objetos grandes que incluye centrar y orientar los organismos u objetos en una orientación longitudinal en una cámara, soplando los organismos — en la orientación longitudinal a través del centro de una zona de detección con un fluido portador, y detectar la presencia de los organismos u objetos en la zona de detección. Por lo menos parte del fluido portador se desvía por medio para la desviación basada en la etapa de detectar los organismos u objetos y los organismos u objetos que permanecen en las porciones del fluido portador que no se desviaron, se recolectan. Los medios para la desviación se disponen fuera de la cámara. En modalidades preferidas, la etapa de desviar puede incluir una etapa de convertir el fluido portador en una en gotículas. La etapa de desviar puede ocurrir durante un periodo predeterminado de tiempo para cada uno de los organismos detectados. El método también puede incluir la etapa de iluminar la zona de detección, con la etapa de detectar la luz desde la etapa de iluminación. La etapa de detectar puede emplear un detector sobre eje y un de detector fuera de eje y combinar las señales a partir de estos detectores. La etapa de centrar puede incluir una etapa de transportar un fluido envolvente que pasa por una boquilla. La etapa de transportar puede realizarse con un número de Reynolds máximo de alrededor de- un ciento. El método puede incluir adicionalmente una etapa de separar los organismos u objetos en una pluralidad de categorías después de la etapa de separaciónr con la etapa de recolectar eTL cambio los organismos u objetos en una pluralidad de recipientes diferentes . El método puede incluir adicionalmente la etapa de exponer los organismos recolectados en la etapa de recolectar a un agente farmacéutico, que puede sostenerse por un objeto grande. La e-tapa de distribuir los organismos pueden incluir distribuir números predeterminados de nemátodos en cada uno del número de recipientes-. La etapa de soplar puede introducir partículas de referencia junto con los nemátodos. La etapa de distribuir puede incluir distribuir solamente los organismos multicelulares que tiene una característica particular en un recipiente dado. En otro -aspecto general, la invención presenta un instrumento de distribución que incluye una fuente de organismos u objetos grandes, una zona de detección responsable de la presencia de organismos u objetos, un detector dirigido hacia la zona de detección, y una primer fuente cambiada de fluido que tiene un resultado dirigido hacia una ubicación corriente abajo desde el detector y que tiene una entrada de control responsable del detector. En modalidades preferidas, la fuente cambiada de fluido puede incluir una fuente de gas comprimido y una válvula operada eléctricamente, tal como ~ una válvula solenoide, para interrumpir una corriente de gas desde la fuente de gas comprimido. La fuente cambiada de fluido puede ser operativa para interactuar con una corriente de fluido desde el detector con suficiente fuerza para convertir el fluido en la corriente de fluido detector en una aspersión en gotículas . La fuente cambiada de fluido no se contiene dentro de cualquier cámara de flujo para no introducir inestabilidades de fluido. La fuente cambiada de fluido puede ser responsable de una señal de detección retardada desde el detector. El cambio de fluido de distribución puede ser operativo para dejar repetidamente cantidades predeterminadas de corriente de fluido detector inadvertida,- El instrumento de distribución puede incluir adicionalmente una segunda fuente cambiada de fluido colocada para desviar el fluido dejado inadvertido por la primer fuente cambiada de fluido.
En un aspecto general adicional, la invención presenta un instrumento de distribución que incluye medios para proporcionar objetos portadores de corriente de fluido, los medios para proporcionar están localizados dentro de una cámara de flujo, medios para detectar la presencia de los objetos en la corriente de fluido, los medios para detectar están localizados corriente abajo de los medios para proporcionar, y los primeros medios para selectivamente dirigir una corriente de gas hacia la corriente de fluido para desviar las porciones de fluido, los medios para dirigir selectivamente están localizados corriente abajo para detectar, fuera de la cámara, y siendo responsable de los medios para detectar. En modalidades preferidas, un segundo medio puede proporcionarse para dirigir selectivamente un resultado del primer medio para dirigir selectivamente, con relación al primer recipiente para distribuir con esto las porciones de la corriente de fluido en un segundo recipiente. Los medios para desviar selectivamente pueden ser para incluir solamente una cantidad predeterminada de fluido con cada uno de los objetos seleccionados. En otro aspecto general, la invención presenta un método de distribución que incluye objetos de alimentación a través del centro de una zona de detección con un fluido portador, detectar la presencia de los objetos, desviar por lo menos parte del fluido portador basado en la etapa de detección, y recolectar los objetos que permanecen en porciones del fluido portador. En modalidades preferidas, la etapa de desviar puede incluir una etapa de convertir el fluido portador en un aspersión en gotículas. La etapa de desviar puede ocurrir durante un periodo predeterminado de tiempo para cada uno de los objetos. La etapa de desviar se elimina físicamente desde la etapa de detectar para que evite introducir inestabilidad de fluido. El método puede incluir adicionalmente una etapa de separar los objetos en una pluralidad de categorías después de la etapa de desviar y la etapa de recolectar pueden recolectar los objetos en una pluralidad de recipientes diferentes. El método puede incluir adicionalmente la etapa de exponer los objetos recolectados en la etapa de recolectar para un agente farmacéutico: La etapa de distribuir los objetos puede incluir distribuir números predeterminados de los objetos en cada uno de un número de recipientes . La etapa de alimentación puede alimentar partículas de referencia con los objetos. La etapa de distribuir puede incluir distribuir solamente los objetos que tienen una característica particular en un recipiente. Los sistemas de acuerdo con la invención pueden ayudar a acelerar y reducir el costo d-e desarrollo farmacéutico. Al separar rápidamente y depositar los números grandes de poblaciones vivas con características particulares, un instrumento de separación de acuerdo con la invención puede dejar que muchos compuestos se prueben en los organismos separados en un periodo de tiempo dado. Permitiendo que los tipos particulares de organismos multicelulares se seleccionen a partir de poblaciones grandes, los individuos con mutaciones infrecuentes pueden recolectarse y estudiarse más rápidamente. Al permitir la selección y deposición exacta de microesferas grandes que soportan los compuestos de prueba, los organismos de prueba y los compuestos de prueba pueden combinarse rápida y exactamente. Como resultado, más experimentos pueden realizarse en la misma cantidad de tiempo, y estos experimentos puede realizarse a un costo más bajo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un esquema diagramático general del análisis y sistema de distribución de la presente invención; la Figura 2A es un diagrama de bloque del sistema que muestra una vista más detallada de la celda de flujo y la muestra y^las cámaras envolventes. La Figura 2B es un diagrama de bloque del sistema que muestra una vista más detallada del sistema corriente abajo de la célula de flujo; la Figura 3 es una vista en corte transversal diagramática de una célula de flujo para el uso -en el sistema de la Figura 2; la Figura 4 es un diagrama que ilustra la alineación de los organismos de prueba agrandados en la célula de flujo envolvente de la Figura 3; la Figura 5A es una vista en sección transversal axial de una cámara de detección de una célula de flujo y detector para el sistema de la Figura 2; la Figura 5B es una vista en sección transversal longitudinal de la zona de detección de la célula de flujo y el detector para el sistema de la Figura 2 ; la Figura 6 es un diagrama en corte transversal longitudinal que ilustra la relación entre un nemátodo y una zona de detección óptica de una célula de flujo envolvente para el sistema de la Figura2; La Figura 7 es un esquema diagramático del voltaje contra el tiempo durante una señal de bloqueo "de luz en el sistema de la Figura 2; La Figura 8A es un diagrama de bloque de un primer sistema impulsado por fluido alternativo para el sistema de la Figura 2; la Figura 8B es un diagrama "en corte transversal de una jeringa para el sistema de la Figura 8A; la Figura 9 es un diagrama de bloque -de un segundo sistema impulsado por fluido alternativo para el sistema de la Figura 2;
la Figura 10A es un esquema diagramático de voltaje contra el tiempo durante una señal de bloqueo de luz producida por un nemátodo adulto y un huevo coincidente; la Figura 10B es un esquema diagramático del derivado de la señal de la Figura 10A; la Figura 11 es un diagrama de flujo que ilustra la operación total del sistema de la Figura 1; la Figura 12 es una vista en corte transversal diagramática de las secciones de una modalidad del sistema de distribución de objeto grande en la Figura 1; y la Figura 13 es un diagrama que ilustra el nemátodo de flujo sobre el tiempo en señales electrónicas correspondientes para un nemátodo en una escala de diferencia, para las porciones del sistema de distribución de la Figura 12. - La siguiente descripción se proporciona para permitir que alguien con experiencia- en la técnica haga y utilice la invención y establezca los mejores modos contemplados por la invención para llevar a cabo la misma. Varias modificaciones, sin embargo, fácilmente permanecerán aparentes para aquellos expertos en la técnica, ya que los principios generales de la presente invención se han definido en la presente específicamente para proporcionar el dispositivo para seleccionar y depositar organismos multicelulares ~ alargados u otros objetos grandes utilizando un cambio fluídico de alta velocidad y corriente de fluido controlada para desviar organismos no seleccionados. Esta solicitud se refiere repetidamente a los objetos grandes y organismos multicelulares. Por medio de "grande" se da a entender que los objetos _u organismos significativamente más grandes que aquellos analizados y separados por un separador electrostático tradicional que normalmente separa los objetos en el orden de 10 µm de diámetro con gotículas en el orden de 50µm de diámetro. Los objetos grandes son más grandes de 50 µm de diámetro y de preferencia tienen por lo menos una dimensión que varia entre 70 y 500 µm o más grande. Los tamaños en gotículas empleados con la invención actual son por lo menos de 100 µm de diámetro y de preferencia 1 mm de diámetro. De este modo, los objetos "grandes" están por lo menos en el orden de una magnitud más grande que aquellos manejados por los separadores electrostáticos tradicionales. La Figura 1 muestra una representación extremadamente diagramática del instrumento de la presente invención. La atención debe ponerse a los elementos sobresalientes de la presente invención. Los objetos de muestra más grandes de una fuente 46 se centran y alinean en una corriente de fluido en una cámara 16 de flujo para enfocamiento hidrodinámico. Los detectores detectan las características de los objetos de la muestra en la corriente de flujo. Corriente abajo de los detectores y físicamente separados de los detectores para evitar la propagación de las inestabilidades de fluido, una corriente de control de fluido bajo el control de una válvula 20 electrónica separa las porciones de la corriente de la muestra no "deseada. Las porciones de corriente de la muestra que contiene los objetos de muestra que cumplen las características predeterminadas no se desvían y pasan dentro de una pluralidad de recipientes 82 indexables . Con referencia a la Figura 2, un sistema 10 de distribución para animales vertebrados multicelulares agrandados, tales, nemátodos, o para otros objetos grandes incluyen un sistema 12 impulsado por fluido envolvente, un sistema 14 impulsado por fluido de nemátodo, una célula 16 de flujo envolvente, un sistema 18 de detección, un accionador 20 de separación, un sistema 22 de activación de recipiente, y un procesador 24 de diagnóstico y control- El sistema impulsado por fluido envolvente incluye un primer regulador 30 de etapas que tiene una abertura de salida para una fuente de gas presurizado, tal como un nitrógeno de 25-30 psig o una fuente de aire comprimida. Un segundo regulador de etapas tiene una entrada conectada al primer regulador de tapas y gas de suministro de salida a una presión regulada para un deposito 34 de fluido envolvente. Un sensor 35 de nivel electrónico controla una" línea 33 de entrada de fluido- envolvente para mantener un nivel constante en el depósito. Un filtro 36 de partículas se conecta- entre una salida del depósito de fluido envolvente y una abertura 38 de entrada de la célula de flujo para prevenir que cualquier partícula en el fluido envolvente pase dentro de la célula de- flujo. Un sistema impulsado por fluido de muestra similarmente incluye un primer regulador 40 en etapas conectado a una fuente de gas presurizado, tal como nitrógeno presurizado de 25-30 psig o fuente de aire--. Un segundo -regulador 42 en etapas se conecta entre el primer regulador 40 de etapas y una entrada de un recipiente 44 de presión de muestra, el cual se sella por una tapa 50 sujetada por abrazaderas. El recipiente 44 de presión de muestra incluye un deposito 46 de almacenamiento de muestra montado sobre un dispositivo 48 de mezcla. Los organismos _ de muestran multicelulares tales como nemátodos se colocan dentro del depósito 46 de almacenamiento de muestra. El dispositivo 48 de mezcla puede ser un agitador magnético que incluye aspas que producen un levantamiento en el fluido que contiene los organismos u objetos de muestras suspendidos. Una línea afluente - se proporciona entre el depósito 46 de almacenamiento de muestra y una entrada 52 de alimentación de muestra de las células 16 de flujo. La célula 16 de flujo incluye una cámara 54 de alimentación de muestra, una cámara 56 de iluido envolvente, y una cámara 58 de detección. Para operar efectivamente en establecimientos comerciales, el volumen muerto en la línea de afluente y la célula de flujo debe ser baja, al menos de 500 microlitros. El subsistema 18 de detección incluye una fuente 60 y un detector 62 colocado sobre cada lado de la cámara 58 de detección. La fuente puede ser una fuente óptica, tal como un láser (es decir un láser semiconductor o un láser de helio-neón (HeNe) ) , La fuente también puede ser una fuente no óptica, o puede omitirse aún, tal como cuando se utilizan los marcadores luminescentes, fosforescentes o radiactivos sobre los organismos u objetos mismos. La modalidad preferida utiliza un detector óptico aunque puede ser suplementado fácilmente con un detector adicional para --radiación no óptica, propiedades de magnetismo u otras físicas que pueden distinguir organismos u otros objetos analizados. Un detector óptico puede ser un fotodiódo, o cualquier otro tipo adecuado de detector óptico o no óptico. Un segundo detector fuera de eje también puede proporcionarse, tal como para detectar la luz reunida desde la cámara de detección en ángulo recto. El detector fuera de eje se localiza generalmente perpendicular a un eje de iluminación de la fuente. El accionador 20 de separación puede ser una fuente cambiada de fluido. Un ejemplo puede ser una válvula de alta velocidad que cambie el aire desde una fuente de aire presurizado. Las válvulas de alta velocidad hechas por aplicaciones de impresión por chorro de tinta tiene características apropiadas . Las válvulas adecuadas de este tipo incluyen las series Inka (por ejemplo., INKA4004212H) las válvulas solenoides miniaturas, disponibles de Lee Company of estbrook, Connecticut. Estas válvulas pueden operar a partir de una fuente de voltaje bajo a velocidades de hasta 1200 Hz, permitiendo fácilmente que el sistema maneje velocidades de 50 organismos de muestra por segundo o mejor, aunque las velocidades de 10 a 20 organismos por segundo son satisfactorias en forma relativa para distribuir en placas de 96 pozos. Un aspecto extremadamente importante de la invención actual es la colocación del accionador 20. Los objetos que se analizan y depositan se orientan y de preferencia se detectan dentro de una cámaras de flujo; el accionador 20 debe colocarse corriente abajo y fuera de esta cámara de flujo para que los procesos _de desviación se aislen físicamente de la cámara. De otra manera, los disturbios de fluido introducidos por los procesos de desviación pueden prevenir el análisis y selección de los objetos grandes en cualquier velocidad elevada razonablemente. Una cuneta revestida 21 se coloca a través del accionador de tal forma que atrapa animales u objetos que se desvían cuando el accionador está en su estado abierto. En resumen, cuando el accionador se cierra, la corriente de muestra que contiene los organismos de muestra pasa a través de la célula de flujo y dentro del recipiente de recolección tal como un micropozo de una placa de microtítu-lo . Cuando el accionador está abierto," la corriente de muestra se desvía en la cuneta revestida 21 y no alcanza el micropozo. Claramente, tal proceso de desviación opera óptimamente cuando la desviación ocurre fuera de y lejos de la cámara de flujo. El sistema 22 de activación de recipiente incluye una placa 80 (es decir, una placa de microtítulo) que incluye una pluralidad de recipientes 82A... 82N (por ejemplo., micropozos) dentro del cual el sistema distribuye los organismos de muestra. La placa se monta sobre un accionador 84 de placa que incluye un mecanismo-impulsor . El mecanismo impulsor coloca, exitosamente los recipientes de la placa en la trayectoria afluente de la célula 16- de flujo. El mecanismo impulsor está bajo el control del procesador 24 de diagnostico y control. El procesador 24 de diagnostico y control incluye una interfase 70 de adquisición que tiene una salida responsable del detector 62. También incluye un módulo de operación de propósito general, y uno o más módulos 76, 78 80 de protocolo. Un tablero 82 (o medio de entrada de datos similar) que se conecta operacionalmente al sistema de computo que también acciona una pantalla 84. El procesador 24 de diagnóstico y control también incluye una interfase 72 de control que puede proporcionar una señal de control de accionador al accionador 20 y una señal de control de fuente para controlar la fuente 60. El procesador 24 de diagnóstico y control puede incluir hardware dedicado como software de propósito especial que corre sobre un procesador de computadora de propósito general, o una combinación de los dos. La decisión para implementar cualquier funcionalidad específica que utiliza un enfoque particular se basara en un número de consideraciones económicas y técnicas y transacciones mutuas. Por ejemplo, la interfaz 70 de adquisición puede filtrar y condicionar la señal recibida desde el detector 62 que utiliza cualquier circuito análogo o software de señal que procesa las rutinas o un hardware DSP (procesador de señal digital) . Los objetivos del sistema también pueden cumplirse por variantes de la arquitectura mostrada. Por ejemplo, el accionador de placa puede controlarse por un controlador que es independiente del procesador de diagnóstico y control, tal como un detector de nivel de relleno dedicado. Los cambios también pueden hacerse a las porciones hidráulicas de sistemas sin impactar su funcionalidad u objetivos siempre y cuando se_ observe ciertos puntos: el proceso de desviación fluídica debe aislarse físicamente a partir de la orientación y procesos de detección. Un método óptimo para lograr este aislamiento es colocar la desviación fluídica corriente abajo y fuera de la cámara de flujo donde la desviación fluídica opera sobre una corriente de muestra en aire. Esto lo hace imposible para las inestabilidades de fluido provocadas por el proceso de desviación que se transmite corriente arriba en la zona de detección donde pueden perturbar todo el proceso.- Con referencia a las Figuras 2 y 11, la operación del -sistema 10 comienza con la selección del usuario de un protocolo para una operación de distribución particular (etapa 100) . Esto puede lograse llamando uno de los módulos 76, 78, 80, de protocolo, los cuales manejan diferentes tipos de operaciones. Por ejemplo, un módulo de conteo simple permite que el sistema distribuye un número fijo de organismos de muestra en cada uno de los recipientes 82A 82N. Uña operación de conteo más sofisticado puede contar los organismos mientras que elimina el material indeseable tales como huevos, etc. Aún protocolos más elaborados pueden detectar las características del —manejo individual o partículas y solamente selecciona aquellos con desarrollo particular, genético u otras características, detectando un marcador radiactivo fluorescente en el organismo o partícula o detectando un tamaño particular o configuración del objeto. Protocolos aún más complejos permiten que las partes del sistema separen los objetos en dos o_más subpoblaciones, mientras que también rechaza un material indeseable (es decir, organismos de la etapa errónea o tipo o restos o partículas del tamaño erróneo, etc.) .
La primera etapa especificada por el protocolo es para adquirir a partir del detector €2 una señal que represente la interacción entre la luz de la fuente 60 y los objetos de muestra en la cámara 58 de detección, cuando un esquema de detección óptico se emplea (etapa 102) . El procesador 24 de diagnóstico y control entonces realiza las operaciones de procesamiento de señal, tal como la filtración, sobre la señal adquirida para incrementar la detección del objeto muestra (etapa 104) . El sistema computarizado prueba la señal procesada para una condición de detección-, hasta que un objeto meta se encuentra (etapa 106) . La condición de detección puede ser diferente para los protocolos diferentes. Por ejemplo, el sistema computarizado solamente puede buscar animales y huevos coincidentes, u otros restos. Alternativamente, puede requerir que un organismo de muestra o partícula cumpla el tamaño particular o criterio de configuración. Tipos diferentes de detectores también pueden asociarse con condiciones de detección diferentes. Por ejemplo, un radiómetro puede necesitarse para detectar un umbral de nivel de radiación para detectar un marcador radiactivo en un animal. Un detector magnético puede detectar las partículas magnéticas utilizadas en química combinatoria. Alternativamente, un detector óptico puede necesitarse para detectar un nivel particular de luz para detectar el marcador bioluminescente, de luminescencia, fosforescente o fluorescente. Cuando la computadora encuentra un objeto meta que cumple el criterio- adecuado, la válvula del accionador 20 de separación interrumpe el flujo de gas que se dirige en la corriente de muestra que sale de la célula 16 de flujo (etapa 108) durante un periodo predeterminado de- tiempo que corresponde a la longitud del objeto meta. Esto previene que el objeto meta se sople accidentalmente dentro de la cuneta 21 revestida. Si esto no es el último objeto necesitado en un recipiente particular, el sistema continúa adquiriendo, procesando, y probando las señales hasta que otro objeto meta se detecte, hasta que un cronómetro expire, o hasta que una señal de error se encuentre (etapa 110) . Cuando el sistema alcanza la cuenta objetivo por el recipiente, y otros recipientes sigan rellenándose (etapa 112) , la interfaz 72 de control del sistema 24 computarizado instruye al accionador 84 de placa para hacer avanzar la placa 80 (etapa 114) . Después de que la placa se ha hecho avanzar, la señal de nuevo es adquirida, procesada, y probadas para seleccionar los objetos para distribuirlos dentro del siguiente recipiente . Protocolos más complejos pueden operar un par de accionadores 20' de separación, o un accionador de niveles múltiples, para dirigir los objetos meta a tres o más designaciones, tales como un recipiente, una primera cuneta 21 revestida, una segunda cuneta 21' revestida colocada corriente abajo desde la primera cuneta 21 revestida (véase líneas discontinuas en la Figura 1) . En este tipo de configuración, el sistema puede separar fácilmente una población de objetos muestra en dos subpoblaciones, mientras que también rechaza el material indeseable. Nuevamente, ambos accionadores de separación están corriente abajo desde y fuera de la cámara de flujo para que el proceso de separación no pueda introducir las inestabilidades de fluido. Con referencia a las Figuras 3 Y 4, las células 16 de flujo se construyen para centrar y alinear los organismos de muestra alargados en la cámara de detección. Velocidades diferentes dentro del fluido en la célula de flujo provocan que los organismos se alineen con la dirección de flujo. Esto sucede ya que el fluido fluye adicionalmente desde el centro de la célula (por ejemplo 86) que se mueve a una velocidad más rápida que el fluido que fluye más cerca del centro de la célula 87 (por ejemplo el fluido a lo largo de la línea 88) . Esta diferencia de velocidad provoca que los organismos se alineen en casi todos los casos. Aunque el doblamiento ocasional de los organismos de muestra puede ocurrir, tales organismos pueden rechazarse por el mecanismo de separación. El efecto de alineación de la célula 16 de flujo puede representarse imaginando una tira de espagueti blando que se mueve a través del agua mediante una bastón suave de intersección. El espagueti siempre virtualmente enderezará y deslizará el bastón debido al arrastre desbalanceado sobre el extremo más largo de la tira. El único caso donde esto no ocurre es cuando el bastón está exactamente a la mitad de la tira. La célula 16 de flujo se configura para provocar que el líquido de flujo envolvente fluya pasando a través de la abertura del tubo 54 de alimentación de organismo de muestra a una velocidad que mantiene el número de Reynolds del fluido envolvente debajo de aproximadamente un ciento. Mantener el número de Reynolds por debajo de aproximadamente un ciento asegura que el flujo sea laminar y sin estabilidad de Van Karman, que ayuda a mantener los organismos de muestra centrados en la cámara de detección. El número de Reynolds se computa tratando el borde 55 de la abertura del tubo 54 de flujo de muestra, como un objeto aplastado. La hidrodinámica de los objetos aplastados se discute en, por- ejemplo, las secciones 9.1-9.2 de "Principies of Heat Transfer," por Frank Kreith, International Textbook Company, Sranton, PA, 1966, la cual se incorpora en la presente para referencia. Es importante centrar los organismos de muestra en la corriente de flujo ya que la velocidad del_ fluido no es la misma a través del diámetro de la cámara 58 de detección. Ya que la viscosidad de fluido, densidad, y velocidad utilizada en un sistema se seleccionan para dar co o resultado el flujo laminar, el perfil de velocidad es parabólico en la célula de detección. Esto quiere decir que la velocidad es una constante aproximada y máxima sobre una región razonablemente amplia del centro de la célula, y es cero en el limite entre el fluido y la pared celular. Como resultado, los organismos de muestra centrados fluirán a una velocidad sencilla y no pasaran entre sí o juntos "racimos". Si los organismos no se centraron, aquello cerca de la pared puede fluir más lentamente que aquellos en el centro, lo cual puede resultar en "conteo de coincidencia" (por ejemplo, más de un organismo individual a un tiempo pasando la zona de detección) aún cuando la dilución de organismo se mueve en la cámara de organismo de muestra ha sido calculada para evitar tal coincidencias. La falta de centrado puede también significar-que, después de la detección, un organismo cerca de la pared puede viajar tan lentamente que otros organismos pueden pasarlo, entrar al espacio de fluido que se reservó para el organismo más lento, y distribuirse ncorrectamente. Esencialmente no existe ninguna mezcla del fluido de muestra con el fluido envolvente hasta que se distribuyan las dos en el recipiente. Con referencia a las Figuras 5A, 5B, y 6, la cámara 58 de detección tiene una sección transversal cuadrada. Esta configuración hace que la célula se alinee fácilmente en forma óptica, y puede permanecer en la alineación adecuada durante meses sin la intervención del operador. La configuración del haz en la región focal, o "zona de detección", es extremadamente importante. El haz debe ser amplio en la dirección x, (es decir a lo largo del haz) y estrecho en la dirección z (es decir a lo largo del eje horizontal) . Después desde el punto de vista del diseño cinemático óptico, la única dirección de alineación difícil de un sistema es la dirección x, que es la razón por la cual se utiliza un haz de condonación en esta dimensión. Un centro bien definido (Figura 5B) y la dimensión z permite que el sistema mida un organismo de muestra a lo largo de su eje (longitud) midiendo su "tiempo de vuelo" a través de la zona de detección. Optimizado en una modalidad, para los organismos aproximadamente 70 µm en diámetro, la zona de detección óptica en 20 µm de grueso en la dirección z, y la cámara de detección es de 3Q0 µm de ancho en las direcciones x y y. Las posiciones relativas de la fuente 60, a la cámara 58 de detección, y el detector 62 provocan "que el detector mida el bloqueo de luz. Cuando un organismo de muestra pasa dentro de la zona de detección, parte de la_ luz se dispersa fuera del haz (efecto mayor) , mientras que parte de la luz se absorberá (efecto menor) . Ambos de estos efectos cooperan para disminuir el nivel de luz en el_ detector cuando un organismo pasa a través de la cámara de detección. La caída en la luz que pasa desde la fuente hasta el detector puede registrase fácilmente como un conteo por un detector de umbral electrónico, pasarse sobre el procesador 24, o ha un dispositivo menos sofisticado, tal como un mecanismo contador. El ruido generado en el láser de detector no debe ser la consideración en la detección de objetos como tan grandes de organismos de muestra multicelulares. El sistema puede utilizar pulsaciones del detector para simplificar el conteo y activar un comando de distribución, aunque las pulsaciones también puede utilizarse para dimensionar el organismo de muestra. La dimensión no es cuantitativamente esencial en una población de muestra que ha sido purificada por un gradiente, pero sin embargo es importante establecer un umbral de tamaño para separar los restos anteriores de los organismos objetivos. La presencia de un objeto se detecta por una caída en el voltaje desde el detector, la cual persiste ya que está en la zona de detección (véase Figura 7) donde la anchura 93 de la pulsación 91 detectada es representante de tiempo de residencia del organismo en la zona de detección) . Se sabe que si la velocidad del objeto (es decir la velocidad de fluido en el centro de la célula de detección) y la duración del tiempo del impulso que se hace negativo, el procesador puede calcular la longitud del objeto (particularmente valuable con organismos multicelulares alargados) . La velocidad de fluido puede mantenerse mediante diseño mecánico de precisión, o, menos caro, inseminando el fluido con una concentración muy baja de microesferas de poliestireno pequeños y después detectando la señal de exhibición de luz desde estas microesferas - mientras los organismos de muestra están siendo contados. Los organismos y microesferas pueden hacerse que tengan completamente señales de extinción de luz que se pueden distinguir que puede accionarse en forma diferente por electrónica computacional, aún si objetos de la muestra y una microesfera pasa a través de la zona de detección juntos. El tiempo de vuelo de la microesfera introducida no se utiliza para regular la velocidad de fluido, la cual tiende a ser cara y difícil, aunque solamente para cambiar los parámetros computacionales utilizados para calcular la longitud del organismo de muestra. El efe-cto biológico de las microesferas plásticas puede ser dañino para ciertas especies o para procesos corriente abajo, y por lo tanto deben evaluarse cuidadosamente antes de la implementación. Si existe una correlación biológica buena entre la longitud y el diámetro del organismo, la medición de la longitud de tiempo de vuelo puede rendir la suficiente información de tamaño. Si esta correlación no existe en la población de interés y las microesferas no pueden utilizarse, los diámetros del organismo pueden medirse por un segundo detector colocado .fuera de eje en la dirección x. Este detector registrará un impulso de luz reunida electrónicamente que se hace positivo. La amplitud, como opuesta a la duración, del impulso electrónico puede relacionarse en tiempo real al diámetro del organismo de prueba mediante un juego de ecuaciones de reunión de luz almacenados del sistema computarizado. La señal de exhibición de luz desde el detector sobre el eje y la señal de reunión de luz desde el detector fuera de eje puede combinarse por la computadora para dar un cálculo de tiempo real de todas - las dimensiones del organismo de muestra. Desde luego, diferentes tipos de organismos (por ejemplo nemátodos contra la larvas de la mosca de la fruta) requerirán de alguna forma diferente información de reunión prealmacenada. Con referencia a las Figuras 10A y 10B, la teoría de la reunión de luz usualmente aplicada a los- objetos en la citometría de flujo se llama teoría de Rayleigh-Gans, o difracción anormal. Aplica a los objetos que son grandes comparados con la longitud de onda de la fuente y que exhiben un bajo índice refractivo con relación al medio circundante, el cual es agua en este caso. Utilizando este tratamiento teorético como una primera aproximación, el procesador puede utilizar la suposición de que las señales de bloqueo de luz sigan el área de la sombra geométrica para los organismos de muestra. En el caso de nemátodos, la población de muestra puede influir gusanos, larvas adultas, y huevos. Bajo esta suposición, la señal temporal para un nemátodo adulto y un huevo juntos aparecen como se muestra en la Figura 10A. Los métodos electrónicos estándar pueden aplicarse a tal señal para distinguir entre una señal del nemátodo adulto y una que es coincidente con un huevo. Por ejemplo, computar el derivado de una señal de bloqueo, como se muestra en la Figura 1DB, permite que una coincidencia del huevo-adulto sea más fácilmente detectada; por ejemplo, un número extraño de impulsos en un tren de impulsos es indicativo de una coincidencia. Se observa que aunque los nemátodos son demasiado largos en diámetro para ser manejados adecuadamente por Rayleigh-Gans, o la teoría de difracción anormal, ese tratamiento puede ser suficiente para muchos propósitos . Modelos más detallados, pueden también desarrollarse para obtener más información sobre los nemátodos u otros organismos de muestra multicelulares. En general, la detección óptica es particularmente versátil en la medición de tamaño y configuración de los organismos de muestra u otros objetos grandes. Con referencia a las Figuras 8A, 8B y 9, aunque el diseño de fluido presentado en la Figura 2 es barato y de fácil limpieza, otros diseños de fluido .también presentan ventajas. En un primer diseño alternativo, el recipiente envolvente es presurizado, y el flujo de muestra (nemátodo) se impulsa en una bomba 90 de jeringa (véase Figura 7A) . El costo de tal sistema es más elevado y la limpieza puede ser más difícil, aunque esta alternativa muestra estabilidad de flujo más grande la cual permite que la velocidad de flujo sea más fuertemente regulada, la cual puede hacer a las microesferas innecesarias mientras que proporciona más distinción de tamaño exacto. El cilindro de jeringa en este diseño alternativo puede hacerse girar para mantener los organismos de la muestra en la suspensión (véase Figura 7B) . Este puede lograrse más fácilmente haciendo girar el cilindro de atrás hacia adelante (rotación oscilatoria) debido a que no existe necesidad para un sello de fluido de tal señal. Un interior con costillas para el cilindro de jeringa también puede facilitar el mezclado. En un segundo enfoque alternativo, una jeringa 92 se proporciona con una cámara 94 de muestra dirigida al
(nemátodo) a través de un sistema de válvulas 96, 98 (Véase
Figura 9) . En este sistema alternativo, los organismos de muestra no se extraen realmente en el cilindro de jeringa, si no que se mantiene en la cámara 94 rígida. Un fluido amable con el organismo de la muestra sin organismos se extrae de la jeringa periódicamente a través de las válvulas de verificación y el mezclado ocurre fuera de la jeringa a medida que el fluido entra a la cámara 94 (la cual está equipada con mezcladores para mantener los organismos en suspensión) . Este método alternativo de operación no requiere cambios de la jeringa para rellenar el suministro de organismo. Ambos enfoques alternativos pueden utilizar jeringas de plástico desechables ordinarias. Los diseños alternativos pueden ser menos probables para producir transientes de depresión significantes en las líneas "de fluido. Tales transientes de presión pueden bajar la velocidad detener el flujo de muestra en la célula de flujo todo junto y resulta en un periodo durante el cual los organismos no se centran ni se orientan. En un sistema fluidico presentado en la Figura 2, los métodos para agitar los organismos deben escogerse para mantenerlos en suspensión sin introducir transientes de presión significantes. Los agitadores magnéticos que producen la corriente ascendente están disponibles, y pueden ser la solución más simple. Un haz con rodillos o configuración de tornillo de Arquimides no introduce ruido fluidico y proporciona la suspensión efectiva de los organismos de muestra. Las líneas de fluido en el recipiente de almacenamiento no deben moverse durante la operación, y por esta razón la célula de flujo debe permanecer estacionaria mientras la placa se mueve para efectuar los cambios en la posición del recipiente. Aunque muy estables, los recipientes de muestra en las modalidades alternativas deben volverse a llenar al final, lo cual puede resultar en disminución de tiempo para el sistema cuando se compara con el dispositivo de la Figura 2 donde la muestra puede rellenarse rápidamente. Con referencia a la Figura 12, una modalidad de la cámara 58 de detección puede hacerse de un paralelepípedo rectangular de cuarzo recto con un diámetro de 250 µm capilar que pasa a través de su eje longitudinal y_ que define una zona de detección. Nótese, que aunque se prefiere la sección transversal cuadrada, también es posible utilizar otras geometrías de cámaras de detección, o aún omitir la paredes de cámara de detección juntas, dejando sólo una zona de detección abierta. La salida de fluido del accionador 20 se localiza de preferencia al menos de aproximadamente un centímetro debajo de la salida del capilar y aproximadamente un milímetro de la posición no trastornada del flujo líquido. Es importante que el accionador 20 se localice para no introducir inestabilidades de fluido en la _ corriente de flujo. La dimensión de un milímetro se ha encontrado para ser óptimo para esta modalidad, ya que parece resultar en la automatización del fluido en vez de una desviación del flujo, el cual tiende a resultar en disturbios- del flujo. La dirección del flujo de fluido de activación se apunta sustancialmente en ángulos rectos al flujo de fluido de la muestra . Con referencia a la Figura 13, el flujo de los organismos de muestra (en la presente nemátodos) 120A, 120B,....120N con el tiempo tiende a ser irregular. Simplemente distribuyendo los grupos de los mismos mientras que sale de la válvula del accionador desactivada puede resultar en volúmenes diferentes de líquidos que se transportan con grupos diferentes. Por esta razón, la válvula se desactiva solamente cuando uno de los nemátodos está presente. Cuando un nemátodo (por ejemplo 120D) se detecta en el capilar, una señal 122 de detección pico se deriva de la salida del detector. Después de un periodo 124 de viaje que se relaciona con el tiempo de viaje del nemátodo desde el- haz detector hasta el accionador y al tiempo de respuesta del accionador, el accionador se desactiva (bordes 128) . El accionador entonces aleja durante un periodo 126 de paso, encendido,
(borde 130) , y se deja o hasta que una señal de detección de pico se detecta para en nemátodo siguiente. Este tiempo permite que el nemátodo y una cantidad predeterminada de líquido 121B circundante pase dentro del recipiente por debajo, aunque previene el exceso de líquido de entrar al recipiente. En una modalidad, el periodo de viaje es de cuatro microsegundos, y el periodo de pase se puede ajustar de cuatro a diez microsegundos. El sistema también puede programarse para pasar más de un nemátodo en cada periodo de pase. Típicamente, el organismo se encierra en un segmento de fluido cilindrico que tiene varios milímetros en longitud y aproximadamente 0.2 milímetros en diámetro. El volumen del segmento del fluido que contiene el organismo es del orden de magnitud de un microlitro o ligeramente menos. "Por lo tanto, si solamente uno o algunos organismos se distribuyen en cada micropozo, el efecto de dilución sobre una muestra de prueba de 50-100 microlitros es insignificante. Para asegurar que solamente una cantidad predeterminada de líquido acompaña una población de organismos de muestra es benéfico por varias razones. Puede ser difícil medir exactamente dosis similares de sustancias de prueba en recipientes diferentes si existen cantidades -diferentes de líquido en cada uno de los recipientes. La longevidad y actividad de los organismos de muestra también puede afectarse, ya que el ingrediente de la cantidad de líquido en cada recipiente incrementa la relación del área de volumen a superficie para el recipiente, el cual puede afectar la toma de oxígeno para el organismo de muestra. Hacer que las gotículas largas, individuales, alargadas cada una contenga un organismo de muestra individual también ayuda a evitar el daño al organismo a medida que se dispersa. Otros métodos también pueden ser adecuados para desviar el flujo de fluido. Tales métodos pueden incluir el uso de cambios electrostáticos, piezoeléctricos, ferrofluidicos, u otros fluidos adecuados, con el fin de mantener vivos los organismos de muestra, sin embargo, estos métodos deben ajustarse cuidadosamente. Por ejemplo, los experimentos con los arreglos de cambio electrostático parecen indicar que los organismos multicelulares de exposición tales como los nemátodos a vibraciones mecánicas de alta frecuencia utilizados para romper la corriente de flujo en gstículas cargadas variables y a los campos eléctricos de alta intensidad utilizados para desviar aquellas gotículas es frecuentemente letal a los organismos. Como resultado, los niveles de campo eléctrico y los niveles de vibración para este tipo de cambio pueden tener que reducirse en costo de otros parámetros de sistema para actuar como un cambio adecuado para los organismos multicelulares. Aún después que el análisis presentado anteriormente indique las distancias de gran caída requeridas por la desviación adecuada en gotículas grandes (por ejemplo más grandes de aproximadamente 50 µm) esencialmente imposibilita el uso de métodos de separación electrostáticos con objetos grandes. Los aditivos ferrofluidicos también pueden comprobar el deterioro a los organismos de prueba o interactuar con agentes para probarse en los organismos, de tal modo que el efecto de cualquier aditivo debe evaluarse cuidadosamente antes de su selección. Además, la visión de un material ferrofluidico añade a la complejidad de costo y experimental. Las válvulas piezoeléctricas, tales como aquellas presentadas en "A New Fluid Switching Flow Sorter," by J. Duhnen et al., Histochemistry 77:117, (1983), introduce válvulas de choque sustancial en el fluido y por lo tanto también pueden resultar en daño a los organismos multicelulares . La palanca de salida mecánica del transductor, la geometría del separador, y el margen de cambio por lo tanto deben ajustarse para adecuar la población que se separa. Por las razones discutidas en lo anterior, el uso de una válvula de fluido se contempla en breve para ser el enfoque más apropiado para desviar el flujo de fluido para los organismos multicelulares. Nuevamente, es importante que la válvula de fluido se aisle físicamente de la habitación de flujo y los sistemas de detección para evitar que se introduzcan inestabilidades de fluido que puedan desviar la orientación y la -detección. En muchos de los agentes descritos, el fluido de desviación es un gas, es decir aire". Es claro que otros gases tales como nitrógeno o argón pueden sustituirse fácilmente por aire. También se contempla que otros fluidos tales como líquidos pueden utilizarse en la presente invención . Otros tipos de objetos pueden separarse utilizando técnicas descritas en esta solicitud, animales multicelulares alargados son de particular interés. Por ejemplo, larvas de la mosca de la fruta vivas { Drosophila melanoga s ter) se han distribuido exitosamente utilizando estas técnicas. También se cree que estas técnicas son bien adecuadas para distribuir y separar los embriones alargados de la zebrafish ( Danio rerio) . Obviamente, otros organismos multicelulares de tamaños similares tales como nemátodo adicional u otros gusanos, larvas de insectos, otros artrópodos, o moluscos o larvas vertebradas son igualmente utilizadas en la presente invención. No deben pasarse por alto los embriones de varias plantas para los compuestos de prueba de la agricultura en vez del uso farmacéutico. A parte de los organismos multicelulares, las microesferas grandes utilizadas en la química combinatoria para producir bibliotecas de compuestos de pruebas se prefieren que los objetos se analicen y depositen por el instrumento de la presente invención. Además de los equivalentes de los elementos reivindicados, sustituciones obvias ahora o más adelante conocidas para alguien con experiencia en la técnica se define para estar dentro del alcance de los elementos definidos. Las reivindicaciones de este modo se entenderán para incluir lo que se ilustra específicamente y describe en lo anterior, lo cual es equivalente conceptualmente, que puede ser obviamente sustituido y también lo que se incorpora esencialmente, la idea esencial de la invención. Por lo tanto, se" entenderá, que dentro del enfoque de las reivindicaciones anexas, la invención puede practicarse diferente de lo que se _ describe específicamente en la presente.