JPH06109617A

JPH06109617A - セルソータ

Info

Publication number: JPH06109617A
Application number: JP3246502A
Authority: JP
Inventors: Tomonori Kawakami; 友則川上; Akira Mizuno; 彰水野; Masateru Nishioka; 将輝西岡; Mitsuo Watanabe; 光雄渡辺
Original assignee: Jasco Corp
Current assignee: Jasco Corp
Priority date: 1991-09-02
Filing date: 1991-09-02
Publication date: 1994-04-22

Abstract

(57)【要約】【目的】植物プロトプラストのようにたとえ機械的強
度の弱いものであっても確実かつ迅速に選別・捕集する
ことのできるセルソータを提供すること。【構成】細胞を含むサンプル液を搬送射出する噴射管
２０の先端が下方に向けて折曲した状態で配置され、こ
の噴射管の先端の周囲を囲繞するように円筒状のノズル
２２を配置している。このノズルは、その下端が徐々に
縮径された円錐状となっており、その最下端部が開口さ
れて射出口２２ａとなっており、ノズル内には生理食塩
水が順次供給されるようなっている。さらに、上記ノズ
ルの下方部を囲繞するようにしてガスシース用ノズル２
４が配置されている。このガスシース用ノズルは、上方
が円筒状で下方が縮径された円錐状から形成されてお
り、上記噴射管並びにノズルと同心円上に配置されてい
る。そして、このガスシース用ノズル内に供給されるガ
スによってノズルから噴射された混合液が縮径される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はセルソータに関するもの
で、より具体的には細胞が含まれたサンプル液などを噴
射させるノズル部分の改良に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】セルソータ（細胞選別装置）は、液流中
の細胞に光を照射し、その細胞から発する散乱光、蛍光
強度等を解析することにより細胞を識別したり、細胞を
選別・捕集することを、細胞が生存状態のまま大量かつ
高速度に行うことのできるものであり、その具体的な構
成を示すと、図４に示すようになっている。

【０００３】すなわち、試料管１内に細胞を含むサンプ
ル液２が充填されており、このサンプル液２が、試料管
１に連結されたガス導入管３を介して試料管１内に送り
込まれたガス圧により押し出され、試料管１に連結され
た噴射管４を介して噴射される。また、この噴射管４の
周囲を囲繞するようにして下端に噴射口５ａを有するノ
ズル５が配置されている。さらに、このノズル５の側面
には、生理食塩水（シース液）６が充填された貯槽７に
接続された連結管８が連結されており、この生理食塩水
６は、上記のサンプル液２と同様にガス圧にてノズル５
内に供給される。この結果、サンプル液２はその外周囲
を生理食塩水６で構成される層流にて包まれた状態でノ
ズル５の噴射口５ａ（口径は５０〜７５μｍ程度）から
外部に吐出される。

【０００４】そして、吐出された混合液（ジェット流）
９は、集光系１０を通過したレーザービーム１１が照射
され、散乱光を発する。この散乱光を、レーザービーム
１１の前方並びに側方にそれぞれ配置された検出器１
２，１３にて検出する。このとき、前方散乱光１４は細
胞の大きさを示し、側方散乱光１５は細胞の屈折率，形
態等により変化するため細胞の内部構造，特性，性質等
を示すことになる。

【０００５】さらに、吐出された混合液９はノズル５の
上端に装着された超音波振動子１６から振動を受け、略
均一な粒径の液滴１７を形成する。そして、所望の細胞
を含む液滴１７に対し電荷を与え、下方に位置する一対
の偏光電極１８，１８間に、所定方向の電圧を印加させ
ることにより帯電した液滴１７を一方の偏光電極側に引
き寄せながら落下させ、さらに下方に位置させた所定の
捕集管１９，１９の一方側に捕集するようになってい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
た従来のセルソータでは、以下に示す問題があった。す
なわち、一般の染色体に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋
白、酵素などの細胞に対して選別・捕集を行う場合に
は、ノズル５の噴射口５ａから射出された混合液９の流
速は１０ｍ／ｓｅｃ、液滴１７を作る超音波振動子１６
の周波数は、１５ｋＨｚ程度で行っているが、選別対象
が例えば細胞壁を持たず機械的強度が小さく、しかも直
径の大きな植物プロトプラストのようなものの場合に上
記の従来のセルソータを用いて選別等をすると、植物プ
ロトプラストが破損してしまうという問題を有する。

【０００７】この問題を解決するため、従来は、ノズル
５の射出口５ａの径を２００μｍ程度に大きくすると共
に、噴射時の流速を３ｍ／ｓｅｃ程度に抑え、しかも、
周波数を３〜４ｋＨｚ程度まで小さくした条件のもとで
作業を行うようにした。係る構成を採ることにより植物
プロトプラストの損傷はなくなったが、以下に示す新た
な問題を生じた。

【０００８】すなわち、流速の低下にともない射出され
た混合液７の単位時間あたりの移動量が小さくなったた
めに、選別速度（処理速度）が遅くなる。また、周波数
の低下並びに射出口径の拡大により、液滴１７の粒径が
大きくなり測定精度が低下する。つまり、このように測
定精度が低下するのは、以下の理由によるものと推測さ
れる。すなわち、混合液９の流速は、中心ほど早くなっ
ており、外側にいくにしたがって遅くなっている。そし
て、液滴１７に電荷を与えるか否かの判断対象となる細
胞はサンプル液２すなわち、混合液９の中心側を流れて
いるが、中心から径方向に対し所定のばらつきをもって
位置し、流れている。その結果、検出器１２，１３が所
望の細胞を検出してから、その細胞が所定の位置まで落
下するに要する時間にばらつきを生じ（流速が位置によ
り異なるため）、所望の細胞を含む液滴１７に所望の電
荷を与えることができなくなるためと考えられる。な
お、かかる現象は、植物プロトプラスト用のセルソータ
に限ること無く従来の通常のものにもあてはまる。

【０００９】本発明は、上記した背景に鑑みてなされた
もので、その目的とするところは、対象物が例えば植物
プロトプラストのようにたとえ機械的強度の弱いもので
あっても確実かつ迅速に選別・捕集することのできるセ
ルソータを提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記した目的を達成する
ために、本発明に係るセルソータでは、細胞を含む液体
を噴射するノズルの周囲にガス噴射装置を設け、そのガ
ス噴射装置から噴射されたガスをノズルから噴射された
前記液体の外周囲に対して内方に向けて吹き付けるよう
にした。

【００１１】

【作用】先ず、ガス噴射装置を作動させてガスを噴射さ
せ、その噴射させたガスをノズルから噴射された液体の
外周囲に対して内方に向けて吹き付ける。すると、その
ガス圧により徐々に液体の径が縮径され、内部に存在す
る比較的強度の弱い細胞であっても損傷しない。これに
より超音波を受けて形成される液滴の粒径も小さく、し
かも流速も早くすることができる。また、ガスに直接接
触する液体の外周囲側ほどガスの下方向の力成分を受け
増速され、水平平面における速度差が低減される。

【００１２】

【実施例】以下、本発明のセルソータに係る好適な実施
例を添付図面に基づいて詳述する。図１は本発明の一実
施例の要部断面図を示している。まず、細胞を含むサン
プル液Ｌを搬送射出する噴射管２０の先端が下方に向け
て折曲した状態で配置され、他端が図外のサンプル液Ｌ
が充填された試料管に接続されている。そして、噴射管
２０の先端部が開口されて噴射口２０ａが形成されてい
る。

【００１３】また、噴射管２０の先端の周囲を囲繞する
ように円筒状のノズル２２を配置している。このノズル
２２は、その下端が徐々に縮径された円錐状となってお
り、その最下端部が開口されて射出口２２ａとなってい
る。そして、この射出口２２ａの径は約２００μｍ程度
に設定し、上記した噴射管２０と同心円上に配置してい
る。さらに本例では、ノズル２２の上端側面の一部を開
口しシース液となる生理食塩水Ｓ供給用の連結管２２ｂ
を一体的に形成している。また、ノズル２２の上面には
超音波振動子２３を載置しており、本例ではこの超音波
振動子２３の周波数を１５ｋＨｚに設定している。

【００１４】ここで本発明では、上記ノズル２２の下方
部を囲繞するようにしてガス噴出装置たるガスシース用
ノズル２４を配置している。このガスシース用ノズル２
４は、上方が円筒状で下方が縮径された円錐状から形成
されており、上記噴射管２０並びにノズル２２と同心円
上に配置されている。そして、このガスシース用ノズル
２４の下端には、直径が約３００μｍの透孔２４ａが形
成されている。さらに、ガスシース用ノズル２４の上端
側面にはガス導入管２４ｂが一体に形成されており、こ
のガス導入管２４ｂの端部は、ガスボンベ等のガス供給
源に直接または間接的に連繋されている。そして、使用
するガスとしては、空気或いは窒素ガスなどの不活性ガ
ス等が望ましいが、他のガスを用いても良い。

【００１５】さらに本例では、ガスシース用ノズル２４
の下方に、所定間隔を隔てて一対の偏光電極２６，２６
が対向配置され、さらにその下方には上端開口された採
取管２８，２８が所定角度に傾斜した状態で配置されて
いる。なお、本例では採取管２８の内部に疎水性の良好
なフィルム、例えばパラフィルム３０を設置している。
かかる構成にすることにより、高速度で落下し、採取管
２８内に入ってきた液滴が一度パラフィルム３０に当接
した後、そのフィルム面に沿って下降し採取管２８内に
捕集されるため、液滴すなわち内部に存在する細胞を損
傷させること無く確実に捕集することができる。

【００１６】次に上記した実施例の作用について説明す
る。まず、従来と同様に、ガス圧等を利用して細胞（植
物プロトプロスト等）を含んだサンプル液Ｌが噴射管２
０の噴射口２０ａを介して下方に向けて噴射され、ま
た、生理食塩水（シース液）Ｓはノズル２２内に供給さ
れ、下方の縮径された内壁面に沿って中央に寄せられな
がら下方に移動し、上記噴射管２０から射出されたサン
プル液の外周囲を包みこむようにして下降し、ノズル２
２の射出口２２ａより射出される。このとき、ノズル２
２内の生理食塩水Ｓは、下降移動するにしたがって縮径
されることからセンチュリー効果等により全体的な流速
は増加するものの、生理食塩水Ｓのうち内壁面と当接し
ている部位はその接触抵抗により移動が抑制される方向
に力を受ける。その結果、水平平面上で見ると、生理食
塩水Ｓの流速はノズル２２の内壁面に当接する外周ほど
速度が遅く、中心にいくにしたがって早くなっている。

【００１７】そして、ノズル２２の射出口２２ａから射
出された混合液はいったん膨らむ（約２５０μｍ程度）
ものの、ガスシース用ノズル２４内を流れるガスＧから
中心方向に向かった付勢力を受け、そのガス圧により混
合液の径が縮径（約１５０μｍ程度）される。すなわ
ち、ガスシース用ノズル２４内を流れるガスは、そのノ
ズル２４の下方の縮径された内壁面に沿ってそれぞれ中
央に向かいながら下降移動する。すなわち、係るガスは
中心方向に向かう成分と、下方に向かう成分の二つの力
成分を有している。したがって、係るガスＧに当接する
混合液Ｍは、上記中心方向に向かう成分により縮径さ
れ、かつ、下方に向かう成分により混合液Ｍの落下速度
が増幅される。

【００１８】このように本例ではガスＧを用いて徐々に
混合液Ｍの径を縮径するようにしたため、内部に存在す
る比較的強度の弱い細胞であっても損傷することはな
い。この結果、流速（落下速度）を早くすることがで
き、処理速度の向上を測ることができる。また、ガスに
直接接触する混合液の外周囲側ほどガスの下方向の力成
分を受け増速されるため、水平平面における速度差が低
減される。これにより、細胞の落下速度は、混合液のど
の位置にあってもほぼ等しくなるため、測定精度が向上
する。

【００１９】そして、ガスシース用ノズル２４の透孔２
４ａを通過した混合液Ｍは、従来と同様の工程により超
音波振動子２３から力を受けて液滴が作成され、所望の
液滴を荷電し、偏光電極２６，２６により移動方向が規
制され、所定の採取管２８内に捕集される。ここで超音
波振動子２３が高周波で動作し、しかも上述のごとくガ
スＧにより混合液Ｍが縮径されるため、液化された粒径
も小さくなるため、高速処理並びに高精度化が可能とな
る。

【００２０】尚、例えばガスシース用ノズル２４の透孔
２４ａより外部に吐出されたガスが、混合液の周囲に位
置しつつ下降移動するようにするとともに、ガスとして
窒素ガスなどの不活性ガスを用いると、従来細胞の変質
の防止等を目的として設置されていたガスバリア設備が
不要となる。

【００２１】＊実験結果上記の装置を用い、本発明の効果を実証するための試験
を行った。本実験では、異なる２個の細胞を融合させ一
体化（２つの性質を有している）させた複合プロトプラ
ストの識別を行うもので、まず、一方のプロトプラスト
に緑色蛍光（５２０ｎｍ）を有するＦＩＴＣで染色し、
他方をクロロフィル（６６０ｎｍ）を含有する細胞を用
いた。そして、この両者を融合するすると両方の蛍光を
有しており、他のもの（単独、或いはどちらも有してい
ない）と明確に識別できる。このことを利用し、小松菜
プロトプラストとキャベツプロトプラスト（小松菜の方
が多くのクロロフィルを持っている）からなる融合プロ
トプラストの識別を行った。ここでまず両者のクロロフ
ィル赤色蛍光の対数分布を調べると、図２に示すように
なっている。すなわち、赤色蛍光の強度の少ないＡ領域
がキャベツプロトプロストで、Ｂ領域が小松菜プロトプ
ロストとなる。よって、クロロフィルの状態から両者を
識別できる。

【００２２】したがって、まず第１にキャベツプロトプ
ロストＦＩＴＣを用い染色し、緑蛍光を持たせた。つい
で、それぞれのプロトプラストを等しい密度で混合し、
電気融合を行った。このときの融合条件は、２．６ｋＶ
／ｃｍ，パルス幅４０μｓで行った。

【００２３】上記した条件のもとで対象物となる細胞を
作成し、それを上記した本発明のセルソータを用いて選
別した。すなわち、融合細胞のみが赤色と緑色の２色の
蛍光を有することになるため、そのことを利用して処理
する。すなわち、まずレーザービームの波長を４８８ｎ
ｍとし、運転条件は流速７ｍ／ｓｅｃ，周波数１０ｋＨ
ｚとした。そして、融合細胞の入っている液滴と、その
前後の３滴を荷電し、選別した。

【００２４】その結果を図３に示す。ここで図中横軸は
緑蛍光の強度、縦軸は赤色蛍光の強度の対数である。Ａ
は融合しなかったキャベツプロトプラスト、Ｂは融合し
なかった小松菜プロトプラスト、Ｃは大部分がキャベツ
と小松菜の融合プロトプラストの分布領域である。選別
条件をＣの領域に設定した。回収したものは顕微鏡で観
察すると大部分は小松菜のクロロフィルを持っており、
かつＦＩＴＣの緑螢光を持っていた。図３のＣ領域の個
数の全体に占める割合は３．０％であり、顕微鏡で測定
した融合細胞の割合とほぼ等しかった。回収した融合細
胞の割合は約９０％であり、１０％はクロロフィルの多
いキャベツプロトプラストであった。これは、キャベツ
同士の融合細胞が通常のキャベツプロトプラストより多
くのクロロフィルを持っているためと考えられる。な
お、クロロフィルの代わりに赤色螢光（５８０ｎｍ）を
有するＲＩＴＣを用いると、さらに高い分離精度が得ら
れた。

【００２５】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明では
細胞を含む液体を噴射するノズルの周囲にガス噴射装置
を設け、そのガス噴射装置から噴射されたガスをノズル
から噴射された前記液体の外周囲に対して内方に向けて
吹き付けるようにしたため、ガスを用いて徐々に液体の
径を縮径することかできる。その結果、たとえ流速を増
加させたとしても、内部に存在する比較的強度の弱い細
胞は損傷することはない。すなわち、処理速度の向上が
図れる。

【００２６】また、ガスに直接接触する液体の外周囲側
ほどガスの下方向の力成分を受けて増速されるため、水
平平面における速度差が低減される。これにより、細胞
の落下速度は、液体のどの位置にあってもほぼ等しくな
るため、測定精度が向上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るセルソータの好適な一実施例を示
す要部断面図である。

【図２】本発明の効果を立証するための実験結果を示す
グラフである。

【図３】本発明の効果を立証するための実験結果を示す
グラフである。

【図４】従来のセルソータの一例を示す概略構成図であ
る。

【符号の説明】

２０噴射管２２ノズル２４ガスシース用ノズル

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者西岡将輝愛知県豊橋市高師本郷町字北沢15−12 (72)発明者渡辺光雄東京都八王子市石川町2967番地の５日本分光工業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞を含む液体を噴射するノズルの周囲
にガス噴射装置を設け、そのガス噴射装置から噴射され
たガスを前記ノズルから噴射された前記液体の外周囲に
対して内方に向けて吹き付けるようにしたことを特徴と
するセルソータ。