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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Hochgeschwindigkeitsmechanismen zum
automatischen Identifizieren und physikalischen Auswählen von multizellularen
Organismen oder anderen großen Objekten
mit vorbestimmten Charakteristika aus gemischten Populationen und
Ablagern von ihnen in diskreten Standorten.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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Intakte
multizellulare Organismen, wie etwa Nematoden, Fruchtfliegenlarven
oder Zebrafischembryonen werden häufig als Modellsysteme verwendet um
zu helfen, die Funktion menschlicher Gene zu verstehen, die damit
in Zusammenhang gebracht werden, eine Rolle in Krankheiten zu spielen.
Humangenhomologe wurden in diesen Modellorganismen identifiziert
und es wurden Mutationen speziell in jenen Genhomologen eingeleitet.
Derartige Mutationen führen
häufig
zu einer phänotypischen Änderung in
dem Modellorganismus, die leicht zu beobachten ist, und es wurde
gezeigt, dass gewisse Mutanten auf pharmakologische Mischungen mit
einem messbaren Aktionsmodus reagieren. Mutanten von intakten Organismen
werden nun als eine neue Klasse von in vivo Medikamentenschablonen
für kombinatorische pharmakologische
Mischungsbibliotheken verwendet. Durch Verwenden dieser Organismen
kann man Ziele für
einen Medikamenteneingriff identifizieren, ohne komplexe biochemische
Bahnen zwischen dem Genotyp und dem Phänotyp ver stehen zu müssen. Außerdem werden
nun kombinatorische chemische Ansätze im Festkörperzustand
genutzt, um diese Medikamentenbibliotheken zu erzeugen; das Endergebnis
besteht darin, dass die Probenchemikalien, die zu testen sind, in
festen Mikrokugeln gewöhnlich zwischen
100 und 500 μm
im Durchmesser vorhanden sind. Diese Festkörperzustandstechniken beschleunigen
die Vorbereitung der Probenmischungsbibliothek beträchtlich,
machen aber ein Verfahren zum genauen Auswählen und Abgeben dieser Mikrokugeln
für Testzwecke
notwendig.
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Der
historische Ansatz zum Modellieren von Krankheiten in multizellularen
Organismen bestand darin, morphologische oder Verhaltensmutanten
mit wesentlichen phänotypischen
Defekten herzustellen. Die Absicht derartiger Untersuchung besteht
darin, einen Mutanten zu erzeugen, der einem Krankheitszustand ähnelt oder
ihn modelliert, sodass neue Therapeutika ohne Verwendung menschlicher "Meerschweinchen" überprüft werden können. In der Tat besteht unter
Betrachtung der gegenwärtigen
allgemeinen Geltung von Tierschutzaktivisten der sicherste Ansatz
darin, die Verwendung von Säugetieren
für Testzwecke
vollständig
zu meiden. Die Zielsetzung bestand dann darin, diese Modellkrankheitsdefekte und
ihre Interaktion mit Kandidatentherapeutika objektiv und mit hoher
Empfindlichkeit zu beobachten. Unglücklicherweise wurde diese Zielsetzung
häufig nicht
erfüllt.
Der nächste
Ansatz, um diese Zielsetzung zu erreichen, bestand darin, "lebendigtote" Proben zu erdenken,
die in Mikrotiterfeldern unter Verwendung optischer Auslesesysteme
ausgeführt
werden können.
Der Plan besteht darin, einzelne Organismen in Mikrotiterfelder
abzugeben, die Kandidatentherapeutik hinzuzufügen und die Reaktion optisch
zu erfassen. Falls die Kandidatentherapeutik in einer Mikrokugel
vorhanden ist, dann muss die Mikrokugel auch akkurat ausgewählt und
abgegeben werden.
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Die
Aussetzung von Modellorganismusmutanten gegenüber diversen pharmazeutischen
Mischungsbibliotheken, selbst wenn die Mutation nicht mit einem
menschlichen Genhomolog verknüpft
war, hilft auch, Genfunktion zu definieren. Die Hinzufügung von
derartigen funktionalen Genomtechniken zu dem Repertoire von Molekularbiologie
und Biochemieverfahren führt
zu einer beträchtlichen
Geschwindigkeitserhöhung
in dem pharmazeutischen Entdeckungsprozess. Forscher vermerken pharmazeutische
Medikamentenbibliotheken auf Giftigkeit, nicht-spezifische Aktivität oder Zellmembranendurchlässigkeit
etc. durch Beobachten ihres Verhaltens in intakten Organismen. Auf
diese Weise können
potenzielle neue Therapeutika, die Giftigkeit oder schädliche Ergebnisse
zeigen, ohne Verschwendung wertvoller Ressourcen frühzeitig
verworfen werden.
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Der
Bodennematode Caenorhabditis elegans ist ein besonders wichtiger
multizellularer Organismus für
diese Typen von Tests geworden, da seine Anatomie, Entwicklung,
Verhalten und Genom vollständiger
als das eines beliebigen anderen Tieres verstanden wird. C. elegans
ist ein kleines Gewebetier, das aus nur 959 Zellen besteht, die
jede aus einer einzelnen Zygotenzelle durch eine vollständig bekannte
Zellenabstammung generiert wird. Diese kleine Zahl von Zellen weist
dennoch eine Vielfalt von Zellentypen auf, die komplexere Tiere
verkörpert, einschließlich Haut,
Muskel, Darm und Nervenzellen.
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Auf
die Gene von C. elegans kann durch leistungsfähige klassische und molekulare
genetische Werkzeuge einfach zugegriffen werden. Die Sequenzierung
des Genoms von C. elegans ist auch weiter fortgeschritten als die
eines beliebigen anderen Tieres und ist ein Modell für das Human
Genome Project. Obwohl die meisten menschlichen Krankheitsgene,
die identifiziert und geklont wurden basierend auf chromosomaler
Position, keine Funktion haben, haben die große Mehrheit dieser ebenso wie
die meisten anderen menschlichen Gene Homologe von C. elegans. Diese
Homologe können
unter Verwendung des oben erwähnten
Ansatzes rasch analysiert werden, um die funktionale Biologie des
homologen menschlichen Gens zu beleuchten.
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Eine
beachtliche Schlussfolgerung aus Untersuchungen von C. elegans besteht
darin, dass die zellularen und molekularen Mechanismen, die in diesem
Nematod arbeiten, jenen beachtlich ähnlich sind, die in komplexeren
Tieren, einschließlich
des Menschen, arbeiten. Diese Ähnlichkeiten
sind so groß,
dass die homologen menschlichen Gene in Nematoden funktionieren
können
und Nematodongene in Säugetierzellen
funktionieren können.
Forscher verwenden deshalb diesen Nematoden für zahlreiche Typen von Experimenten
bezogen auf die Entwicklung von pharmazeutischen Wirkstoffen zur
Verwendung bei Menschen oder anderen höheren Tieren.
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Ungeachtet
der potenziellen Leistung und Geschwindigkeit einer Verwendung von
multizellularen Organismen wie C. elegans setzen gegenwärtige Programme
für rasche
pharmazeutische Medikamentenforschung Hochgeschwindigkeitsvorbereitungstechniken
nicht ein. Als ein Beispiel kann mit heutigen Techniken der Molekularbiologie
ein großes Labor
Zerstörungsmutationen
in multizellularen Organismen in einer Rate von 20 bis 30 pro Monat
erzeugen. Um den Effekt einer chemischen Mischungsbibliothek (die
häufig
100.000 oder mehr Elemente enthalten kann) in einer Klasse von mutierten
Organismen zu evaluieren, muss man zuerst eine präzise Zahl
von Organismen in der gleichen Entwicklungsstufe manipulieren und
in einen Container ablagern, wie etwa die Wannen eines Mikrotiterplattenfeldes. Organismen
einer anderen Entwicklungsstufe müssen ausgeschlossen werden,
da sie die gemessene Antwort verfälschen würden.
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Unter
Verwendung von langsamen manuellen Verfahren sind die Auswahl und
Ablagerung von Organismen des richtigen Typs der Flaschenhals für den ganzen
Prozess pharmazeutischer Forschung. Falls die Testmischungen als
Mikrokugeln vorhanden sind, dann fügt die genaue Auswahl und Abgabe
von Mikrokugeln einen zusätzlichen
Flaschenhals hinzu. Des weiteren beruhen manuelle Verfahren auf
Pipetten, die genaue Volumina eines Fluid und nicht genaue Zahlen
von Organismen abgeben. In vielen Untersuchungen, wo sich die Reproduktionsrate
durch die Mutation ändert,
ist es notwendig, die Untersuchung des Effektes einer Mischung von
der kombinatorischen Bibliothek mit einer genauen und bekannten
Zahl von multizellularen Organismen in jedem Titer zu beginnen.
Ein beliebiges Auswahlsystem basierend auf einem Volumen wird wahrscheinlich
ungenaue Zahlen von Organismen abgeben, da präzise gleichförmige Suspensionen
von Organismen unmöglich
aufrechterhalten werden. Falls die Testmischungen als Mikrokugeln
verfügbar
sind, ist es auf die gleiche Weise schwierig, eine gesteuerte Zahl von
Mikrokugeln in jede Wanne zu platzieren. Ferner kann die Mikrokugelpopulation
gemischt sein, sodass endgültige
Ergebnisse nicht nur genaues Zählen,
sondern Auswahl von Mikrokugeln erfordern – klar eine unmögliche Aufgabe
für einfache
Pipetten Flusszytometer haben Betriebscharakteristika, die gestatten,
sie an die Probleme einer Automatisierung der Auswahl und Ablagerung
von multizellularen Organismen und anderen großen Objekten, wie etwa Mikrokugeln,
anzupassen. Flusszytometer wurden verwendet, um die Zahl von Nematoden
in einem gegebenen Volumen eines Fluid zu zählen. Eine derartige Einrichtung
wurde durch Byerly et al (Byerly, L., R. C. Cassada und R. L. Russell, "Machine for Rapidly
Counting and Measuring the Size of Small Nematodes", Rev. Sci. Instrum.
Vol. 46, Nr. 5, Mai 1975) beschrieben, wo das Flusszytometer als
ein Hüllenfluss genutzt
wird, um die Nematoden entlang der Richtung des Flusses auszurichten,
sodass ihre Länge gemessen
werden konnte und Zählungen
Organismus für
Organismus durch ein elektrisches Impedanzverfahren durchgeführt werden
konnten, das dem ähnlich
ist, das in einem kommerziellen Coulter®-Zähler verwendet
wird. Ein Flusszytometer zum Arbeiten mit multizellularen Organismen
ist nicht auf eine Verwendung eines Impedanzsensors begrenzt, sondern
kann ein moderneres optisch abtastendes Flusszytometer sein.
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Z.
B. wurde ein optisches Flusszytometer zum Analysieren von gestreckten
Organismen, wie etwa Plankton mit einer Breite von 500 μm und einer Länge über 1000 μm in einer
Reihe von veröffentlichten
Artikeln beschrieben, wie etwa Peeters, J. C., G. B. Dubelaar, J.
Ringelberg und J. W. Visser, "Optical Plankton
Analyser: a Flow Cytometer for Plankton Analysis, I: Design Considerations" Cytometry Sept 10
(5): 522–528
(1989); und Dubelaar, G. B., A. C. Groenwegen, W. Stokdijk, G. J.
van den Engh und J. W. Visser, "Optical
Plankton Analyser: a Flow Cytometer for Plankton Analysis, II: Specifications", Cytometry Sept
10 (5): 529–539
(1989). Der Größenbereich
des Planktons, das in diesen optischen Flusszytometern verwendet
wird, ist ähnlich
zu dem, was bei Nematoden, Fruchtfliegenlarven oder Zebrafischembryonen
angetroffen wird. In allen diesen Literaturstellen wurden die multizellularen
Organismen lediglich analysiert, wurden aber nicht ausgewählt und
abgelagert. Ähnlich
ist Analyse großer
Mikrokugeln mit Flusszytometern Routine, solange wie die Querschnittsfläche der
Flusszelle ausreichend ist, die Mikrokugel unterzubringen.
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Auswahl
und Ablagerung von nicht-multizellularen Organismen und anderen
kleinen Objekten mit Flusszytometern ist gut bekannt. Das Verfahren, das
verwendet wird, um spezifische Organismen oder Objekte (z. B. Mikrokugeln)
auf Anweisung von dem Flusszytometer auszuwählen und abzulagern, besteht
aus einem Mechanismus, die Richtung des fließenden Stroms von Organismen
oder Objekten umzuschalten, der aus der Flusszelle des Flusszytometers
hervorkommt, sodass analysierte Objekte speziell in einer Mikrotiterplatte
oder einem ähnlichen Con tainer
abgelagert werden können.
Umschalten wird in einer festen Verzögerungszeit durchgeführt, nachdem
das Flusszytometer einen gewünschten Organismus
identifiziert hat. Die Verzögerung
ist typischerweise in der Größenordnung
von einer Millisekunde zu Dutzenden von Millisekunden. Das häufigste
Verfahren, das in kommerziellen Zellensortierungseinrichtungen vorgefunden
wird, ist elektrostatische Umlenkung von gewünschten Objekten, sobald sie
aus einem Ausgangsport in der Flusszelle in Luft hervorgekommen
sind. Elektrostatische Umlenkung wird durch geladene Platten bewerkstelligt,
die in einem Strom von Tropfen arbeiten.
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Elektrostatische
Zellensortierungseinrichtungen sind jedoch speziell für einzelne
Zellen gestaltet und zum Sortieren von großen Objekten, wie etwa Nematoden,
Fruchtfliegenlarven, Zebrafischembryonen oder großen Mikrokugeln
nicht von Nutzen. Dies ist so, da die Flusszelle einer elektrostatischen
Zelle in Frequenzen von Dutzenden von Kilohertz mechanisch vibriert
wird, um den Fluidstrom in (geladene oder nicht-geladene) Tropfen
in der Luft mechanisch aufzubrechen, die in der Größenordnung
von 50 μm im
Durchmesser sind. Ein Tropfen dieser Größe ist für typische einzelne Zellen
mit Durchmessern von 5 μm
bis 30 μm
optimal, er ist aber viel kleiner als die meisten multizellularen
Organismen, die typischerweise in der Größenordnung von 1 mm in der
Länge sind.
Der mechanische Vibrationsschritt und das anschließende Aufbrechen
des Stroms in kleine Tropfen ist für multizellulare Organismen
typischerweise tödlich.
Die Vibrationsfrequenz einer elektrostatischen Zellensortierungseinrichtung
ist nicht variabel; deshalb kann man die Tropfengröße nicht ändern, um
multizellulare Organismen unterzubringen. Des weiteren vibriert
die ganze Flusszelle immer in dieser Frequenz, was es unmöglich macht,
einzelne Tropfen auf Anweisung zu erstellen.
JP 06 109617 A verwendet
einen Gasstrom, um den Fluidprobenstrom zusammenzuziehen, um zarte
Zellen vor elektrostatischer Sor tierung zu schützen.
JP 62 229045 offenbart ein System,
das Schaden an einer Zelle in einer elektrostatischen Sortierungseinrichtung
reduziert, indem ein Gasfluss verwendet wird, um die Tropfen aufwärts zu blasen.
EP-A-0 626 455 verwendet
elektrostatische Sortierung mit einem kapselnden Material, um die
Proben zu schützen.
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In
dem Fall von großen
Mikrokugeln, die in kombinatorischer Chemie verwendet werden, gibt
es keine Sorge, dass mechanische Vibration die Mikrokugel beschädigen wird.
Ungeachtet dessen sind elektrostatische Sortierungseinrichtungen
nicht in der Lage, derartige große Objekte effektiv auszuwählen und
abzulagern. Dies ist ein Ergebnis der Geometrie, die mit den elektrostatischen
Ablenkungsplatten verwendet wird. In den Spannungen, die gewöhnlich verwendet
werden, führt
statische Ladung zu einer Abweichung von nur einigen Grad. Es ist
unmöglich, größere Abweichungen
durch Erhöhen
der Spannungen zu erzeugen, da Auffaltung auftreten wird. Eine adäquate Abweichung,
um ausgewählte
von zurückgewiesenen
Tropfen zu trennen, wird erreicht, indem dem Strom erlaubt wird,
einen ausreichenden Abstand über
die geladenen Platten hinaus zu fallen. In dem Fall der typischen
Tropfen von 50 μm
fallen die Tropfen zusätzliche
2,5 cm über
die Ablenkungsplatten hinaus. Falls die Tropfengröße auf 100 μm verdoppelt
wird (immer noch nicht ausreichend, um eine Mikrokugel kombinatorischer
Chemie von 100 μm
unterzubringen), hat der größere Tropfen
eine stark erhöhte
Masse, was bedeutet, dass der Winkel der Abweichung kleiner ist;
deshalb ist ein größerer Fallabstand
notwendig, um adäquate
Ablenkung zu erzeugen (d. h. der Ablenkungswinkel ist kleiner).
Das Nettoergebnis ist, dass Tropfen von 100 μm einen Fallabstand von 20 cm
erfordern. Mit einem derartigen großen Fallabstand werden winzige
Instabilitäten
in dem Flussstrom in merkliche Ablenkungen vergrößert. Die Mikrotiter der Platten
in gegenwärtiger
Verwendung können
in der Größenordnung
von einem bis zu einigen Millimetern im Durchmesser sein. Mit einem
Fallabstand von 20 cm sind die meisten aktuellen elektrostatischen
Sortierungseinrichtungen nicht in der Lage, ein derartiges kleines
Ziel genau zu treffen. Das Problem wird sogar noch größer, wenn die
Tropfengröße weiter
erhöht
wird, um Mikrokugeln von 400 μm
oder multizellulare Organismen unterzubringen. Mit einer Tropfengröße von einem
Millimeter (die Größe, die
notwendig ist, um einen typischen Nematoden abzudämpfen),
erhöht
sich der Fallabstand auf ungefähr
125 cm, was es vollständig
unmöglich
macht, Tropfen in Zielcontainern von sogar mehreren Millimetern
Durchmesser abzulagern. Somit sind elektrostatische Sortierungseinrichtungen
für multizellulare
Organismen oder andere große
Objekte vollständig
ungeeignet. Selbst wenn der Prozess den Organismus nicht tötet oder
beschädigt,
macht es die Ablenkungsgeometrie unmöglich, große Objekte genau abzulagern.
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Es
wurden andere Sortierungsverfahren in einem Versuch verwendet, die
Nachteile elektrostatischer Sortierungseinrichtungen zu überwinden.
JP 04 204254A offenbart
ein System, worin eine Ausgangsdüse
einer Analysekammer magnetischen neu positioniert wird, um den Pfad
eines Fluidstroms in der Luft zu ändern.
GB-A-3 318 720 verwendet
ein Vakuum, um Partikel in Sammelröhren, die neu positioniert
werden können,
selektiv einzuziehen.
JP 04 001568 verwendet
Vakuum, um einen Probenstrom in der Luft selektiv in Sammelkammern
einzuziehen.
EP-A-0 422 616 verwendet
Ströme
eines Fluid, um einen Probenstrom in der Luft umzulenken und selektiv
neu auszurichten.
US-A-4
756 427 verwendet Druckwellen, um einen Probenstrom selektiv
umzulenken.
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EP-A-0 626 455 offenbart
ein Verfahren und eine Vorrichtung für Analyse, Trennung und Mikro-Kapselung
von Zellenelementen. Genauer wird darin offenbart, dass von einem
Computer ein Polarisierungsimpuls zu einer Fokussierungskammer ankommt
und polarisierte Partikel durch Platten mit einer konstanten Spannung
von 2500 V so abgelenkt werden, um in einen Empfänger platziert zu werden, wobei
somit Partikel durch zuerst ihr elektrisches Polarisieren und dann
durch Anwenden eines elektrostatischen Feldes auf die elektrisch
polarisierten Partikel abgelenkt werden.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Instrument und ein
Verfahren eines relativ einfachen Aufbaus bzw. geeigneter Anwendbarkeit
zum Auswählen
und genauen Abgeben von multizellularen Organismen und anderen großen Objekten
bereitzustellen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird dieses Ziel durch ein Instrument gemäß Anspruch
1 bzw. ein Verfahren gemäß Anspruch
21 erreicht.
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Weitere
Verbesserungen davon sind in den Unteransprüchen bezogen jeweils auf Anspruch
1 und 21 spezifiziert.
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Das
Instrument verwendet hydrodynamische Flussbedingungen in einer Ausrichtungskammer,
um gestreckte multizellulare Probenorganismen auszurichten. und
Organismen oder Objekte in der Mitte des Fluidflussstroms zu zentrieren,
nachdem sie eines nach dem anderen eine Abtastungszone passiert haben,
die vorzugsweise innerhalb der Kammer ist. In der Abtastungszone
werden die ausgerichteten und zentrierten Objekte vorzugsweise durch
einen Lichtstrahl abgefragt. Optische Detektoren empfangen gebrochenes,
reflektiertes, fluoresziertes und gestreutes Licht von den befragten
Objekten und geben entsprechende elektrische Signale aus. Ein Signalverarbeitungs-Computersystem
verwendet diese Signale, um gewünschte
analysierte Objekte auszuwählen.
Ein erster Fluidschalter stromabwärts der Abtastungszone und
außerhalb
der Kammer reagiert auf Signale, die durch das Computersystem entwickelt
werden. Wenn der Schalter offen ist, passiert der Flussstrom, der
die Objekte enthält,
den Schalter und gelangt in einen Sammlungscontainer. Wenn der Schalter
geschlossen ist, lenkt ein Fluidstrom von dem Schalter den Flussstrom,
der die analysierte Objekte enthält,
ab und verhindert, dass er den Sammlungscontainer erreicht.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
kann der Fluidschalter eine geschaltete Quelle von komprimiertem
Gas mit einem Gas enthalten, das zu einem Standort stromaufwärts von
der Abtastungszone und außerhalb
der Kammer gerichtet wird. Die geschaltete Quelle aus komprimiertem
Gas kann eine Quelle von komprimiertem Gas und ein elektrisch betriebenes
Ventil, wie etwa ein Solenoidventil, enthalten, um einen Gasstrom
von der Quelle von komprimiertem Gas zu unterbrechen. Die geschaltete
Quelle von komprimiertem Gas kann betriebsfähig sein, mit dem Fluidflussstrom,
der Objekte von der Abtastungszone überträgt, mit einer ausreichenden
Kraft zu interagieren, um den Trägerfluid
in einen Strahl von Tropfen zu wandeln.
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Eine
Probenquelle kann betriebsfähig
sein, einen Fluid, der eine ausreichend geringe Konzentration von
großen
Probenobjekten überträgt, zu versorgen,
dass die Objekte im wesentlichen eines in einem Zeitpunkt durch
die Abtastungszone fließen.
Der Fluidschalter kann auf ein verzögertes Erfassungssignal von
dem Computersystem reagieren. Der Fluidschalter kann betriebsfähig sein,
nur vorbestimmte Beträge
eines Fluid mit dem ausgewählten
Probenobjekt zu enthalten. Das Computersystem kann betriebsfähig sein,
den Schalter zu veranlassen, ein Objekt in einem Zeitpunkt auszuwählen, wobei
jedes Objekt durch ein vorbestimmtes Volumen eines Fluid begleitet
wird.
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Eine
Illuminationsquelle kann zu der Abtastungszone gerichtet werden,
wobei der Detektor ein optischer Detektor ist. Das Computersystem
kann betriebsfähig
sein, die Länge
von mindestens einem der ausgewählten
Objekte zu bestimmen, indem die Zeit gemessen wird, die das mindestens
eine der Objekte benötigt,
um zwischen dem Detektor und der Illuminationsquelle zu passieren.
Der Detektor kann ein Detektor auf einer Achse sein, der sich über der Abtastungszone
entlang einer Illuminationsachse der Illuminationsquelle befindet.
Der Detektor kann ein Detektor außerhalb einer Achse sein, die
zu einer Illuminationsachse der Illuminationsquelle im allgemeinen
senkrecht ist. Ein Detektor auf einer Achse kann sich über der
Abtastungszone entlang der Illuminationsachse der Illuminationsquelle
befinden. Die Illuminationsquelle kann ein fokussierter Laser geringer
Leistung sein. Die Abtastungszone kann eine Breite von ungefähr 10–40 μm haben.
Die Abtastungszone kann einen quadratischen Querschnitt haben. Die
Ausgangsöffnung
der Probenquelle kann von der Abtastungszone durch ein gesamtes
Leitungsvolumen von weniger als 500 Mikrolitern getrennt sein. Ein
zweiter Fluidschalter stromabwärts des
ersten Fluidschalters und außerhalb
der Kammer kann die ausgewählten
Objekte in unterschiedliche Container abgeben.
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In
einem anderen allgemeinen Aspekt wird ein Abgabeinstrument für einen
multizellularen Organismus oder einen großen Partikel offenbart, das
enthält
Mittel zum Ausrichten der Organismen oder Objekte in einem Fluidstrom
in einer Richtung parallel zu einer Flussrichtung des Fluidstroms,
Mittel zum Erfassen des Vorhandenseins der Organismen oder Objekte
in dem Fluidstrom, die sich stromabwärts der Mittel zum Ausrichten
befinden, und Mittel zum selektiven Umlenken von Abschnitten des
Fluid, wobei sich die Mittel zum selektiven Umlenken stromabwärts von
den Mitteln zum Erfassen befinden, außerhalb irgend einer Kammer
sind, die die Mittel zum Ausrichten enthält und auf die Mittel zum Erfassen
reagieren.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
kann das Abgabeinstrument für
einen multizellularen Organismus oder ein großes Objekt ferner enthalten Mittel
zum Umlenken einer Ausgabe des Mit tels zum Bestimmen relativ zu
einem ersten Container, um dadurch weitere der Organismen in einen
zweiten Container abzugeben. Das Mittel zum selektiven Umlenken
kann dazu da sein, nur einen vorbestimmten Umfang eines Fluid mit
jedem der ausgewählten
Organismen zu enthalten.
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In
einem weiteren allgemeinen Aspekt wird ein Verfahren zum Abgeben
von multizellularen Organismen und großen Objekten offenbart, das
enthält Zentrieren
und Ausrichten der Organismen oder Objekte in einer Längsausrichtung
in einer Kammer, Fließen
der Organismen in der Längsausrichtung durch
die Mitte einer Abtastungszone mit einem Trägerfluid und Erfassen des Vorhandenseins
der Organismen oder Objekte in der Abtastungszone. Mindestens einiges
des Trägerfluid
wird durch Mittel zur Umlenkung basierend auf dem Schritt zum Erfassen
einiger der Organismen oder Objekte umgelenkt, und einige der Organismen
oder Objekte, die in Abschnitten des Trägerfluid verbleiben, die nicht
umgelenkt wurden, werden gesammelt. Die Mittel zur Ablenkung sind
außerhalb
der Kammer angeordnet.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
kann der Schritt zum Umlenken einen Schritt zum Wandeln des Trägerfluid
in einen Strahl von Tropfen (Tropfennebel) enthalten. Der Schritt
zum Umlenken kann für eine
vorbestimmte Zeitperiode für
jeden der erfassten Organismen stattfinden. Das Verfahren kann auch
einen Schritt zum Illuminieren der Abtastungszone enthalten, mit
dem Schritt zum Erfassen von Licht von dem Schritt zum Illuminieren.
Der Schritt zum Erfassen kann einen Detektor auf einer Achse und
einen Detektor außerhalb
einer Achse einsetzen und Signale von diesen Detektoren kombinieren.
Der Schritt zum Zentrieren kann einen Schritt zum Befördern eines
Hüllenfluid
vorbei an einer Düse
enthalten. Der Schritt zum Befördern
kann mit einer maximalen Reynolds-Zahl von ungefähr einhundert durchgeführt werden.
Das Verfahren kann ferner enthalten einen Schritt zum Sortieren
der Organismen oder Ob jekte in eine Vielzahl von Kategorien nach dem
Schritt zum Umlenken, wobei der Schritt zum Sammeln die Organismen
oder Objekte in eine Vielzahl unterschiedlicher Container platziert.
Das Verfahren kann ferner enthalten den Schritt zum Aussetzen der
Organismen, die in dem Schritt zum Sammeln gesammelt werden, einem
pharmazeutischen Wirkstoff, der durch ein großes Objekt hervorgebracht werden
kann. Der Schritt zum Abgeben der Organismen kann Abgeben vorbestimmter
Zahlen von Nematoden in jeden einer Zahl von Containern enthalten.
Der Schritt zum Fließen
kann Bezugspartikel zusammen mit den Nematoden einführen. Der Schritt
zum Abgeben kann Abgeben nur von multizellularen Organismen mit
einer bestimmten Charakteristik in einen gegebenen Container enthalten.
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In
einem anderen allgemeinen Aspekt wird ein Abgabeinstrument offenbart,
das enthält
eine Quelle von Organismen oder großen Objekten, eine Abtastungszone,
die auf Vorhandensein von Organismen oder Objekten reagiert, einen
Detektor, der zu der Abtastungszone gerichtet ist, und eine erste geschaltete
Quelle eines Fluid mit einem Ausgang, der zu einem Standort stromabwärts des
Detektors gerichtet ist und einen Steuereingang hat, der auf den
Detektor reagiert.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
kann die geschaltete Quelle eines Fluid eine Quelle von komprimiertem
Gas und ein elektrisch betriebenes Ventil, wie etwa eine Solenoidventil,
enthalten, um einen Gasstrom von der Quelle von komprimiertem Gas
zu unterbrechen. Die geschaltete Quelle eines Fluid kann betriebsfähig sein,
mit einem Fluidstrom von dem Detektor mit einer ausreichenden Kraft
zu interagieren, um den Fluid in dem Detektorfluidstrom in einen
Strahl von Tropfen zu wandeln. Die geschaltete Quelle eines Fluid
ist nicht in irgend einer Flusskammer enthalten, um nicht Fluidinstabilitäten einzuführen. Die
geschaltete Quelle eines Fluid kann auf ein Verzögerungserfassungssignal von
dem Detektor reagieren. Der Abgabefluidschalter kann betriebsfähig sein,
vorbestimmte Beträge
von Detektorfluid-Stromfluid wiederholt nicht-umgelenkt zu lassen.
Das Abgabeinstrument kann ferner eine zweite geschaltete Quelle
eines Fluid enthalten, die positioniert ist, einen Fluid umzulenken,
der durch die erste geschaltete Quelle eines Fluid nicht-umgelenkt
gelassen wird.
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In
einem weiteren allgemeinen Aspekt wird ein Abgabeinstrument offenbart,
das enthält
ein Mittel zum Bereitstellen eines Fluidstroms, der Objekte überträgt, wobei
sich das Mittel zum Bereitstellen innerhalb einer Flusskammer befindet,
ein Mittel zum Erfassen des Vorhandenseins der Objekte in dem Fluidstrom,
wobei sich das Mittel zum Erfassen stromabwärts von dem Mittel zum Bereitstellen
befindet, ein erstes Mittel zum selektiven Richten eines Gasstroms
zu dem Fluidstrom, um Abschnitte des Fluid umzulenken, wobei sich
das Mittel zum selektiven Richten stromabwärts des Mittels zum Erfassen befindet,
außerhalb
der Kammer, und auf das Mittel zum Erfassen reagiert.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
kann ein zweites Mittel bereitgestellt werden zum selektiven Richten
einer Ausgabe des ersten Mittels zum selektiven Richten, relativ
zu einem ersten Container, um dadurch Abschnitte des Fluidstroms
in einen zweiten Container abzugeben. Das Mittel zum selektiven Richten
kann dazu dienen, nur einen vorbestimmten Umfang des Fluid mit jedem
der ausgewählten
Objekte zu enthalten.
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In
einem anderen allgemeinen Aspekt wird ein Abgabeverfahren offenbart,
das enthält
Einspeisen von Objekten durch die Mitte einer Abtastungszone mit
einem Trägerfluid,
Erfassen des Vorhandenseins der Objekte, Umlenken von mindestens
einigem des Trägerfluid
basierend auf dem Schritt zum Erfassen und Sammeln einiger der Objekte,
die in Abschnitten des Trägerfluid
verbleiben.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
kann der Schritt zum Umlenken einen Schritt zum Wandeln des Trägerfluid
in einen Strahl von Tropfen enthalten. Der Schritt zum Umlenken
kann für
eine vorbestimmte Zeitperiode für
jedes der Objekte stattfinden. Der Schritt zum Umlenken ist von
dem Schritt zum Erfassen physikalisch entfernt, um Einführung von
Fluidinstabilitäten
zu vermeiden. Das Verfahren kann ferner enthalten einen Schritt
zum Sortieren der Objekte in eine Vielzahl von Kategorien nach dem
Schritt zum Umlenken, und der Schritt zum Sammeln kann die Objekte
in eine Vielzahl unterschiedlicher Container sammeln. Das Verfahren
kann ferner enthalten den Schritt zum Aussetzen der Objekte, die
in dem Schritt zum Sammeln gesammelt werden, einem pharmazeutischen
Wirkstoff. Der Schritt zum Abgeben der Objekte kann Abgeben vorbestimmter
Zahlen der Objekte in jeden einer Zahl von Container enthalten. Der
Schritt zum Einspeisen kann Bezugspartikel mit den Objekten einspeisen.
Der Schritt zum Abgeben kann Abgeben nur von Objekten mit einer
bestimmten Charakteristik in einen Container enthalten.
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Systeme
gemäß der Erfindung
können
helfen, zu beschleunigen und die Kosten pharmazeutischer Entwicklung
zu reduzieren. Durch rasches Sortieren und Ablagern großer Zahlen
lebendiger Populationen mit bestimmten Charakteristika kann ein Sortierungsinstrument
gemäß der Erfindung
erlauben, viele Mischungen in den sortierten Organismen in einer
gegebenen Zeitperiode zu testen. Indem erlaubt wird, dass bestimmte
Typen von multizellularen Organismen aus großen Populationen ausgewählt werden,
können
einzelne mit seltenen Mutationen gesammelt und rascher untersucht
werden. Indem die Auswahl und genaue Ablagerung großer Mikrokugeln
gestattet wird, die Testmischungen tragen, können die Testorganismen und
Testmischungen rasch und genau kombiniert werden. Als ein Ergebnis können mehr
Experimente in der gleichen Zeitperiode durchgeführt werden, und diese Experimente
können
bei geringerem Aufwand durchgeführt
werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine schematische Skizze des Analyse- und Abgabensystems der vorliegenden
Erfindung;
-
2A ist ein Blockdiagramm des Systems, das
eine detailliertere Ansicht der Flusszelle und Probe und Hüllenkammern
zeigt;
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2B ist ein Blockdiagramm des Systems, das
eine detailliertere Ansicht des Systems stromabwärts von der Flusszelle zeigt;
-
3 ist
ein schematischer Querschnitt einer Flusszelle zur Verwendung in
dem System von 2;
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4 ist
ein Diagramm, das die Ausrichtung gestreckter Probenorganismen in
der Hüllenflusszelle
von 3 veranschaulicht;
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5A ist
ein axialer Querschnitt einer Abtastungskammer einer Flusszelle
und eines Detektors für
das System von 2;
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5B ist
ein Längsquerschnitt
der Abtastungszone mit der Flusszelle und dem Detektor für das System
von 2;
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6 ist
ein Längsquerschnittsdiagramm, das
die Beziehung zwischen einem Nematoden und einer optischen Abtastungszone
der einer Hüllenflusszelle
für das
System von 2 veranschaulicht;
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7 ist
eine schematische Zeichnung der Spannung gegenüber der Zeit für ein Lichtblockierungssignal
in dem System von 2;
-
8A ist
ein Blockdiagramm eines ersten alternativen Fluidansteuersystems
für das
System von 2;
-
8B ist
ein Querschnittsdiagramm einer Spritze für das System von 8A;
-
9 ist
ein Blockdiagramm eines zweiten alternativen Fluidansteuersystems
für das
System von 2;
-
10A ist eine schematische Zeichnung der Spannung
gegenüber
der Zeit für
ein Lichtblockierungssignal, das durch einen erwachsenen Nematoden
und ein übereinstimmendes
Ei erzeugt wird;
-
10B ist eine schematische Zeichnung der Ableitung
des Signals von 10A;
-
11 ein
Flussdiagramm, das die gesamte Operation des Systems von 1 veranschaulicht;
-
12 ist
ein schematischer Querschnitt von Sektionen einer Ausführungsform
des Abgabensystems für
große
Objekte von 1; und
-
13 ist
ein Diagramm, das einen Nematodenfluss mit der Zeit und entsprechende
elektronische Signale für
einen Nematoden in einem anderen Maßstab veranschaulicht, für die Abgabensystemabschnitte
von 12.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Die
folgende Beschreibung wird bereitgestellt, um einem Fachmann zu
ermöglichen,
die Erfindung durchzuführen
und zu verwenden, und legt die besten Modi dar, die durch den Erfinder
zum Ausführen
dieser Erfindung betrachtet werden. Einem Fachmann werden jedoch
verschiedene Modifikationen rasch offensichtlich sein, da die allgemeinen
Prinzipien der vorliegenden Erfindung hierin speziell definiert wurden,
um eine Einrichtung zum Auswählen
und Ablagern von gestreckten multizellularen Organismen oder anderen
großen
Objekten unter Verwendung eines Fluidschalters hoher Geschwindigkeit und
eines gesteuerten Fluidstroms, um nicht ausgewählte Organismen abzulenken,
vorzusehen.
-
Diese
Anmeldung verweist wiederholt auf große Objekte und multizellulare
Organismen. Mit "groß" sind Objekte oder
Organismen gemeint, die beträchtlich
größer als
jene sind, die durch eine herkömmliche
elektrostatische Sortierungseinrichtung analysiert und sortiert
werden, die normalerweise Objekte in der Größenordnung eines Durchmessers von
10 μm mit
Tropfen in der Größenordnung
eines Durchmessers von 50 μm
sortiert. Große
Objekte sind größer als
ein Durchmesser von 50 μm
und haben vorzugsweise mindestens eine Abmessung, die zwischen 70
und 500 μm
oder größer reicht.
Die Tropfengrößen, die
mit der gegenwärtigen
Erfindung eingesetzt werden, sind im Durchmesser mindestens 100 μm und im
Durchmesser vorzugsweise 1 mm. Somit sind "große" Objekte mindestens
in einer Größenordnung
einer Größe, die
größer als
jene ist, die durch herkömmliche
elektrostatische Sortierungseinrichtungen behandelt werden.
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1 zeigt
eine äußerst schematische
Darstellung des Instrumentes der vorliegenden Erfindung. Es sollte
den hervorspringenden Elementen der vorliegenden Erfindung Aufmerksamkeit
geschenkt werden. Große
Probenobjekte von einer Quelle 46 werden in einem Fluidstrom
in einer Flusskammer 16 durch hydrodynamische Fokussierung zentriert
und ausgerichtet. Detektoren erfassen Charakteristika von Probenobjekten
in dem Flussstrom. Stromabwärts
der Detektoren und von den Detektoren physikalisch getrennt, um
Ausbreitung von Fluidinstabilitäten
zu vermeiden, lenkt ein Steuerstrom eines Fluid unter der Steuerung
eines elektronischen Ventils 20 Abschnitte des Probenstroms
um, die nicht erwünscht
sind. Probenstromabschnitte, die Probenobjekte enthalten, die vorbestimmte
Charakteristika erfüllen,
werden nicht umgelenkt und passieren in einen einer Vielzahl von
Containern 82, die indiziert werden können.
-
Bezug
nehmend auf 2 enthält ein Abgabensystem 10 für gestreckte
multizellulare wirbellose Tiere, wie etwa Nematoden, oder für andere
große Objekte
ein Hüllenfluidansteuersystem 12,
ein Nematodenfluidansteuersystem 14, eine Hüllenflusszelle 16,
ein Erfassungssystem 18, ein Sortierungsstellglied 20,
ein Containerbetätigungssystem 22 und
einen Diagnose- und Steuerprozessor 24. Das Hüllenfluidansteuersystem
enthält
einen ersten Stufenregulator 30, der eine Eingangsöffnung für eine unter Druck
gesetzte Gasquelle hat, wie etwa eine Stickstoff- oder Quelle komprimierter
Luft von 25–30
psig. Ein zweiter Stufenregulator hat einen Eingang, der mit dem
ersten Stufenregulator verbunden ist, und einen Ausgang, der Gas
in einem regulierten Druck zu einem Hüllenfluidreservoir 34 abgibt.
Ein elektronischer Pegelsensor 35 steuert eine Hüllenfluideingabeleitung 33,
um einen konstanten Pegel in dem Reservoir zu unterhalten. Ein Partikelfilter 36 ist
zwischen einem Ausgang des Hüllenfluidreservoirs
und einer Eingangsöffnung 38 der
Flusszelle verbunden um zu verhindern, dass beliebige Artikel in
dem Hüllenfluid
in die Flusszelle passieren.
-
Ein
Probenfluidansteuersystem enthält ähnlich einen
ersten Stufenregulator 40, der mit einer unter Druck gesetzten
Gas quelle verbunden ist, wie etwa einer unter Druck gesetzten Stickstoff-
oder Luftquelle von 25–30
psig. Ein zweiter Stufenregulator 42 ist zwischen dem ersten
Stufenregulator 40 und einem Eingang eines Probendruckgefäßes 44 verbunden,
das mit einer eingespannten Kappe 50 versiegelt ist. Das
Probendruckgefäß 44 enthält ein Probenspeicherreservoir 46,
das an einer Mischeinrichtung 48 montiert ist. Die multizellularen
Probenorganismen, wie etwa Nematoden, werden in das Probenspeicherreservoir 46 platziert.
Die Mischeinrichtung 48 kann ein magnetischer Rührer sein,
der Klingen enthält,
die einen Auftrieb in dem Fluid erzeugen, der die suspendierten
Probenorganismen oder Objekte enthält. Eine Ausflussleitung ist
zwischen dem Probenspeicherreservoir 46 und einem Probenspeiseeingang 52 der
Flusszelle 16 vorgesehen. Die Flusszelle 16 enthält eine
Probenspeisekammer 54, eine Hüllenfluidkammer 56 und
eine Abtastungskammer 58. Um in kommerziellen Umgebungen
effektiv zu arbeiten, sollte das tote Volumen in der Ausflussleitung
und Flusszelle gering sein, wie etwa kleiner als 500 Mikroliter.
-
Das
Erfassungsteilsystem 18 enthält eine Quelle 60 und
einen Detektor 62, die auf einer von beiden Seiten der
Abtastungskammer 58 platziert sind. Die Quelle kann eine
optische Quelle sein, wie etwa ein Laser (z. B. ein Halbleiterlaser
oder ein Helium-Neon-(HeHe)Laser). Die Quelle kann auch eine nicht-optische
Quelle sein, oder sich kann sogar weggelassen werden, wie etwa wenn
chemisch luminiszierende, phosphoriszierende oder radioaktive Markierungen
in den Organismen oder Objekten selbst verwendet werden. Die bevorzugte
Ausführungsform verwendet
einen optischen Detektor, kann aber einfach mit einem zusätzlichen
Detektor für
nicht-optische Abstrahlung, Magnetismus oder andere physikalische
Eigenschaften ergänzt
werden, der Organismen oder andere analysierte Objekte unterscheiden kann.
Ein optischer Detektor kann eine Fotodiode, oder ein beliebiger
anderer geeigneter Typ eines optischen oder nicht-optischen Detektors
sein. Es kann auch ein zweiter Detektor außerhalb einer Achse vorgesehen
sein, wie etwa, um Licht zu erfassen, das von der Abtastungskammer
in rechten Winkeln gestreut wird. Der Detektor außerhalb
der Achse befindet sich allgemein senkrecht zu einer Illuminationsachse
der Quelle.
-
Das
Sortierungsstellglied 20 kann eine geschaltete Quelle eines
Fluid sein. Ein Beispiel wäre ein
Ventil hoher Geschwindigkeit, das Luft von einer unter Druck gesetzten
Luftquelle umschaltet. In Ventile hoher Geschwindigkeit, die für Tintenstrahldruckanwendungen
hergestellt werden, haben geeignete Charakteristika. Geeignete Ventile
dieses Typs enthalten die INKA-Serie (z. B. INKA4004212H) Miniatur-Solenoidventile,
die von Lee Company of Westbrook, Connecticut, verfügbar sind.
Diese Ventile können
von einer Niederspannungsquelle in Raten bis zu 1200 Hz arbeiten,
was dem System einfach erlaubt, Raten von 50 Probenorganismen pro
Sekunde oder besser zu handhaben, obwohl Raten von 10 oder 20 Organismen
pro Sekunde zum Abgeben in 96-Wannenplatten relativ befriedigend
sind. Ein äußerst wichtiger
Aspekt der gegenwärtigen
Erfindung ist die Platzierung des Stellgliedes 20. Die
Objekte, die zu analysieren und abzulagern sind, werden ausgerichtet
und vorzugsweise erfasst innerhalb einer Flusskammer; das Stellglied 20 muss
stromabwärts und
außerhalb
dieser Flusskammer platziert sein, sodass der Umlenkungsprozess
physikalisch von der Kammer isoliert ist. Anderenfalls würden Fluidstörungen,
die durch den Umlenkungsprozess eingeführt werden, Analyse und Auswahl
von großen
Objekten in einer beliebigen vernünftig hohen Geschwindigkeit verhindern.
-
Eine
Rinne 21 ist quer von dem Stellglied auf eine derartige
Weise platziert, um Tiere oder Objekte zu fangen, die abgelenkt
werden, wenn das Stellglied in seinem offenen Zustand ist. Wenn
das Stellglied geschlossen ist, passiert der Pro benstrom, der die Probenorganismen
enthält,
durch die Flusszelle und in den Sammlungscontainer, wie etwa einen
Mikrotiter einer Mikrotiterplatte. Wenn das Stellglied offen ist,
wird der Probenstrom in der Rinne 21 umgelenkt und erreicht
den Mikrotiter nicht. Klar arbeitet ein derartiger Ablenkungsprozess
optimal, wenn die Ablenkung außerhalb
und weg von der Flusskammer geschieht.
-
Das
Containerbetätigungssystem 22 enthält eine
Platte 80 (z. B. einer Mikrotiterplatte), die eine Vielzahl
von Containern 82A ... 82N (z. B. Mikrotiter) enthält, in die
das System die Probenorganismen abgibt. Die Platte ist an einem
Plattenstellglied 84 montiert, das einen Ansteuermechanismus
enthält.
Der Ansteuermechanismus platziert die Container der Platte in den
Ausflusspfad der Flusszelle 16 aufeinanderfolgend. Der
Ansteuermechanismus ist unter einer Steuerung des Diagnose- und
Steuerprozessors 24.
-
Der
Diagnose- und Steuerprozessor 24 enthält eine Akquisitionsschnittstelle 70 mit
einem Eingang, der auf den Detektor 62 reagiert. Er enthält auch
ein Allzweck-Operationsmodul, und ein oder mehr Protokollmodule 76, 78, 80.
Eine Tastatur 82 (oder ein ähnliches Dateneingabemittel)
ist mit dem Berechnungssystem betriebsmäßig verbunden, das auch eine
Anzeige 84 ansteuert. Der Diagnose- und Steuerprozessor 24 enthält auch
eine Steuerschnittstelle 72, die dem Stellglied 20 ein
Stellgliedsteuersignal und ein Quellensteuersignal, um die Quelle 60 zu
steuern, bereitstellen kann.
-
Der
Diagnose- und Steuerprozessor 24 kann dedizierte Hardware,
Software eines speziellen Zwecks, die auf einem Allzweck-Computerprozessor läuft, oder
eine Kombination der beiden enthalten. Die Entscheidung, irgend
eine spezifische Funktionalität
zu implementieren, die einen bestimmten Ansatz verwendet, wird auf
einer Zahl von ökonomischen und
techni schen Betrachtungen und Kompromissen beruhen. Z. B. kann die
Akquisitionsschnittstelle 70 das Signal, das von dem Detektor 62 empfangen wird,
filtern und konditionieren, unter Verwendung entweder analoger Schaltungstechnik
oder Softwaresignalverarbeitungsroutinen oder eines Hardware-DSP
(digitaler Signalprozessor). Die Ziele des Systems können auch
durch Varianten der gezeigten Architektur erreicht werden. Z. B.
kann das Plattenstellglied durch eine Steuervorrichtung gesteuert werden,
die von dem Diagnose- und Steuerprozessor unabhängig ist, wie etwa einem dedizierten
Füllgraddetektor.
Es können
auch Änderungen
an den hydraulischen Abschnitten des Systems durchgeführt werden,
ohne seine Funktionalität
oder Ziele zu beeinträchtigen,
solange wie gewisse Punkte beachtet werden: der Fluidumlenkungsprozess
muss von den Ausrichtungs- und Erfassungsprozessen physikalisch
isoliert sein. Ein optimales Verfahren zum Erreichen dieser Isolation
besteht darin, die Fluidumlenkung stromabwärts und außerhalb der Flusskammer zu
platzieren, wo die Fluidumlenkung in einem Probenstrom in Luft arbeitet.
Dies macht es unmöglich,
dass Fluidinstabilitäten,
die durch den Umlenkungsprozess verursacht werden, stromaufwärts in die
Erfassungszone übertragen
werden, wo sie den gesamten Prozess unterbrechen würden.
-
Bezug
nehmend auf 2 und 11, beginnt
eine Operation des Systems 10 mit der Benutzerauswahl eines
Protokolls für
eine bestimmte Abgabeoperation (Schritt 100). Dies kann
durch Aufrufen eines der Protokollmodule 76, 78, 80 bewerkstelligt
werden, die unterschiedliche Typen von Operationen handhaben. Z.
B. erlaubt ein einfaches Zählmodul
dem System, eine feste Zahl von Probenorganismen in jeden der Container 82A ... 82N abzugeben.
Ein kompliziertere Zähloperation
kann die Organismen zählen,
während
unerwünschtes
Material beseitigt wird, wie etwa Eier etc. Noch weiter ausgearbeitete
Protokolle können
die Charakteristika von einzelnen Organismen oder Partikeln erfassen
und nur jene mit bestimmten Entwicklungs-, ge netischen oder anderen
Charakteristika auswählen,
wie etwa durch Erfassen einer radioaktiven oder fluoreszierenden
Markierung in dem Organismus oder Partikel oder durch Erfassen einer
bestimmten Größe oder Form
des Objektes. Noch komplexere Protokolle erlauben Teilen des Systems,
Objekte in zwei oder mehr Teilpopulationen zu sortieren, während auch unerwünschtes
Material (z. B. Organismen der falschen Stufe oder Typs oder Fremdkörper oder
Partikel der falschen Größe etc.)
zurückgewiesen
werden.
-
Der
erste Schritt, der durch das Protokoll spezifiziert wird, besteht
darin, von dem Detektor 62 ein Signal zu erlangen, das
die Interaktion zwischen Licht von der Quelle 60 und Probenobjekten
in der Abtastungskammer 58 darstellt, wenn ein optisches Erfassungsschema
eingesetzt wird (Schritt 102). Der Diagnose- und Steuerprozessor 24 führt dann
Signalverarbeitungsoperationen, wie etwa Filtern, in dem erlangten
Signal durch, um die Erfassung eines Probenobjektes zu verbessern
(Schritt 104). Das Computersystem testet das verarbeitete
Signal auf eine Erfassungsbedingung, bis ein Zielobjekt gefunden
ist (Schritt 106). Die Erfassungsbedingung kann sich für unterschiedliche
Protokolle unterscheiden. Z. B. kann das Computersystem nur Tiere
mit übereinstimmenden
Eiern, oder andere Fremdkörper
suchen. Alternativ kann es erforderlich sein, dass ein Probenorganismus
oder Partikel bestimmte Größen- oder
Formkriterien erfüllt.
-
Unterschiedliche
Typen von Detektoren können
auch mit unterschiedlichen Erfassungsbedingungen in Verbindung stehen.
Z. B. kann ein Strahlungszähler
eine Strahlungspegelschwelle abtasten müssen, um eine radioaktive Markierung
in einem Tier zu erfassen. Ein magnetischer Sensor kann magnetische
Partikel erfassen, die in kombinatorischer Chemie verwendet werden.
Alternativ kann ein optischer Detektor einen bestimmten Pegel von
Licht abtasten müssen,
um eine bioluminiszierende, chemo luminiszierende, phosphoriszierende
oder fluoreszierende Markierung zu erfassen. Wenn der Computer ein Zielobjekt
findet, das die richtigen Kriterien erfüllt, unterbricht das Ventil
des Sortierungsstellgliedes 20 den Gasfluss, der in dem
Probenstrom gerichtet ist, der die Flusszelle 16 verlässt (Schritt 108)
für eine vorbestimmte
Zeitperiode entsprechend der Länge des
Zielobjektes. Dies verhindert, dass ein großes Objekt unbeabsichtigt in
die Rinne 21 geblasen wird. Falls dies nicht das letzte
Objekt ist, das in einem bestimmten Container benötigt wird,
setzt das System fort, die Signale zu erlangen, zu verarbeiten und
zu testen, bis entweder ein anderes Zielobjekt erfasst ist, bis
ein Timer abläuft
oder bis ein Fehlersignal angetroffen wird (Schritt 110).
Wenn das System die Zielzahl für
den Container erreicht, und andere Container bleiben, die zu füllen sind
(Schritt 112), instruiert die Steuerschnittstelle 72 des
Computersystems 24 das Plattenstellglied 84, die
Platte 80 vorzurücken (Schritt 114).
Nachdem die Platte vorgerückt
wurde, wird das Signal erneut erlangt, verarbeitet und getestet,
um Objekte auszuwählen,
um sie in den nächsten Container
abzugeben.
-
Komplexere
Protokolle können
ein Paar von Sortierungsstellgliedern 20' oder ein mehrstufiges Stellglied
betreiben, um Zielobjekte zu drei oder mehr Zielen zu richten, wie
etwa ein Gefäß, eine
erste Rinne 21 oder eine zweite Rinne 21', die stromabwärts der
ersten Rinne 21 platziert ist (siehe gestrichelte Linien
in 1). In diesem Typ einer Konfiguration kann das
System eine Population von Probenobjekten in zwei Teilpopulationen
einfach trennen, während
auch unerwünschtes
Material zurückgewiesen wird.
Erneut sind beide Sortierungsstellglieder stromabwärts von
und außerhalb
der Flusskammer, sodass der Sortierungsprozess Fluidinstabilitäten nicht einführen kann.
-
Bezug
nehmend auf 3 und 4 ist die Flusszelle 16 aufgebaut,
die gestreckten Probenorganismen in der Erfassungskammer zu zentrieren und
auszurichten. Unterschiedliche Geschwindigkeiten innerhalb des Fluid
in der Flusszelle bewirken, dass die Organismen mit der Flussrichtung
ausgerichtet werden. Dies geschieht, da sich ein Fluid, der weiter
von der Mitte der Zelle fließt
(z. B. 86), in einer schnelleren Rate als ein Fluid bewegt,
der näher
zu der Mitte der Zelle 87 fließt (z. B. ein Fluid entlang
Linie 88). Dieser Geschwindigkeitsunterschied bewirkt, dass
die Organismen in nahezu allen Fällen
ausgerichtet werden. Obwohl gelegentliches Falten der Probenorganismen
auftreten kann, können
derartige Organismen durch den Sortierungsmechanismus zurückgewiesen
werden.
-
Der
Ausrichtungseffekt der Flusszelle 16 kann durch eine Abbildung
einer Strähne
von schlaffen Spagetti bildhaft dargestellt werden, die sich durch
Wasser um eine schneidende glatte Stange bewegt. Die Spagetti wird
sich praktisch immer gerade machen und von der Stange gleiten wegen
dem nicht ausgeglichenen Zug in dem längeren Ende der Strähne. Der
einzige Fall, wo dies nicht auftritt, ist, wenn die Stange genau
in der Mitte der Strähne
ist.
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Die
Flusszelle 16 ist konfiguriert, die Hüllenflussflüssigkeit zu veranlassen, an
der Öffnung
des Probenorganismenspeiserohres 54 in einer Rate vorbei
zu fließen,
die die Reynolds-Zahl des Hüllenfluid unter
ungefähr
einhundert beibehält.
Beibehaltung der Reynolds-Zahl unter ungefähr einhundert stellt sicher,
dass der Fluss laminar und ohne Van-Karman-Instabilität ist, was
hilft, die Probenorganismen in der Abtastungskammer zentriert zu
halten. Die Reynolds-Zahl wird durch Behandeln der Kante 55 der Öffnung des
Probenflussrohres 54 als ein Klippenobjekt berechnet. Die
Hydrodynamik von Klippenobjekten wird z. B. in Sektionen 9.1–9.2 von "Principles of Heat
Transfer" von Frank
Kreith, International Textbook Company, Scranton, PA, 1966 erörtert.
-
Es
ist wichtig, die Probenorganismen in dem Flussstrom zu zentrieren,
da die Geschwindigkeit des Fluid quer über den Durchmesser der Abtastungskammer 58 nicht
die gleiche ist. Da Fluidviskosität, Dichte und Geschwindigkeit,
die in dem System verwendet werden, ausgewählt werden, um einen laminaren
Fluss zu ergeben, ist das Geschwindigkeitsprofil in der Erfassungszelle
parabelförmig.
Dies bedeutet, dass die Geschwindigkeit über eine vernünftig breite
Region der Mitte der Zelle maximal und ungefähr konstant ist, und in der
Grenze zwischen dem Fluid und der Zellenwand Null ist. Als ein Ergebnis
werden zentrierte Probenorganismen alle in einer einzelnen Geschwindigkeit
fließen
und einander nicht passieren oder zusammen "bündeln". Falls die Organismen
nicht zentriert wären,
könnten
jene nahe der Wand langsamer als jene in der Mitte fließen, was zu
einer "Zufallszählung" (z. B. mehr als
ein einzelner Organismus in einem Zeitpunkt, der die Abtastungszone
passiert) führen
könnte,
sogar wenn die Lösung von
Organismen in der Probenorganismenkammer kalkuliert wurde, eine
derartige Zufälligkeit
zu vermeiden. Fehlen von Zentrierung könnte auch bedeuten, dass sich
nach Erfassung ein Organismus nahe der Wand so langsam bewegen kann,
dass ihn andere Organismen passieren könnten, in den Fluidraum eintreten,
der für
den langsameren Organismus reserviert war, und falsch abgegeben
werden. Es ist wesentlich, den Probenfluid nicht mit dem Hüllenfluid zu
vermischen, bis die zwei in den Container abgegeben sind.
-
Bezug
nehmend auf 5A, 5B und 6 hat
die Abtastungskammer 58 einen rechteckigen Querschnitt.
Diese Form macht es einfach, die Zelle optisch auszurichten, und
sie sollte in richtiger Ausrichtung für Monate ohne einen Eingriff
eines Bedieners bleiben. Die Form des Strahls in der Fokusregion,
oder "Abtastungszone", ist äußerst wichtig. Der
Strahl sollte in der x-Richtung (d. h. entlang des Strahls) breit
sein, und in der z-Richtung (d. h. entlang der horizontalen Achse)
eng sein. Aus der Sicht von optischen kinematischen Design ist die
einzige schwierige Ausrichtungsrichtung in dem System die x-Richtung,
was deshalb ist, warum ein breiter vergebender Strahl in dieser
Dimension verwendet wird. Ein scharfer Fokus (5B)
in der z-Dimension gestattet dem System, einen Probenorganismus
entlang seiner Achse (Länge)
durch Messen seiner "Flugzeit" durch die Abtastungszone
zu messen. In einer Ausführungsform
ist, optimiert für
Organismen mit einem Durchmesser von ungefähr 70 μm, die optische Abtastungszone
20 μm stark
in der z-Richtung, und die Abtastungskammer ist 300 μm breit in
den x- und y-Richtungen. Die relativen Positionen der Quelle 60,
der Abtastungskammer 58 und des Detektors 62 veranlassen
den Detektor, Lichtblockade zu messen. Wenn ein Probenorganismus
in die Abtastungszone passiert, wird einiges Licht aus dem Strahl
gestreut (Haupteffekt), während
einiges Licht absorbiert wird (Nebeneffekt). Beide diese Effekte
arbeiten zusammen, um den Lichtpegel in dem Detektor abzusenken,
wenn ein Organismus die Abtastungskammer passiert. Der Abfall in
dem Licht, das von der Quelle zu dem Detektor durchläuft, kann
als eine Zählung
durch einen elektronischen Schwellendetektor einfach registriert
und zu dem Prozessor 24, oder sogar zu einer weniger komplizierten
Einrichtung, wie etwa einem Zähler
weitergegeben werden. Rauschen, das in dem Laser und dem Detektor
generiert wird, sollte keine Betrachtung in der Erfassung von Objekten
sein, die so groß wie
multizellulare Probenorganismen sind.
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Das
System kann Detektorimpulse verwenden, um einfach zu zählen und
einen Abgabebefehl zu aktivieren, Impulse können aber auch verwendet werden,
um die Größe des Probenorganismus
auszumessen. Ausmessung ist in einer Probenpopulation nicht quantitativ
wesentlich, die durch einen Gradienten gereinigt wurde, ist aber
dessen ungeachtet wichtig, eine Größenschwelle einzustellen, um
Hintergrundfremdkörper
von den Zielorganismen zu trennen. Das Vorhandensein eines Objektes
wird durch einen Abfall in der Spannung von dem Detektor abgetastet,
der solange anhält,
wie das Objekt in der Abtastungszone ist (siehe 7,
wo die Breite 93 des erfassten Impulses 91 eine
Organismusverweilzeit in der Abtastungszone darstellt). Falls die
Objektgeschwindigkeit (d. h. die Fluidgeschwindigkeit in der Mitte
der Abtastungszelle) und die Zeitdauer des negativ-gehenden Impulses
bekannt sind, kann der Prozessor die Länge des Objektes kalkulieren
(bei gestreckten multizellularen Organismen besonders wertvoll).
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Die
Fluidgeschwindigkeit kann durch Präzisionsmechanikdesign oder
weniger aufwändig
durch Setzen des Fluid mit einer sehr geringen Konzentration von
kleinen Styropormikrokugeln und dann Erfassen des Lichtlöschungssignals
von diesen Mikrokugeln, während
die Probenorganismen gezählt
werden, aufrechterhalten werden. Die Organismen und Mikrokugeln
können
hergestellt werden, vollständig unterscheidbare
Lichtlöschungssignale
zu haben, in denen durch die Berechnungselektronik unterschiedlich
agiert werden kann, selbst wenn ein Probenobjekt und eine Mikrokugel
die Abtastungszone gemeinsam passieren. Die eingeführte Flugzeit
der Mikrokugel wird nicht verwendet, um die Fluidgeschwindigkeit
zu regulieren, was dazu tendiert, aufwändig und schwierig zu sein,
sondern nur die Berechnungsparameter zu ändern, die verwendet werden,
um die Probenorganismuslänge
zu kalkulieren. Der biologische Effekt der Plastikmikrokugeln kann für gewisse
Spezies oder für
stromabwärtige
Prozesse schädlich
sein, und sollte deshalb vor einer Implementierung sorgfältig evaluiert
werden.
-
Falls
es eine gute biologische Korrelation zwischen Länge und Durchmesser des Organismus gibt,
kann die Flugzeitlängenmessung
ausreichende Größeninformation
liefern. Falls diese Kor relation in der Population von Interesse
nicht existiert und Mikrokugeln nicht verwendet werden können, können die
Durchmesser des Organismus durch einen zweiten Detektor gemessen
werden, der außerhalb
der Achse in der x-Richtung positioniert ist. Dieser Detektor wird
einen elektronisch positivgehenden Lichtstreuimpuls registrieren.
Die Amplitude, im Gegensatz zu der Dauer, des elektronischen Impulses
kann in Echtzeit auf den Durchmesser des Probenorganismus über eine
Menge von Lichtstreugleichungen bezogen werden, die in dem Computersystem
gespeichert sind. Das Lichtauslöschungssignal
von dem Detektor auf der Achse und das Lichtstreusignal von dem
Detektor außerhalb
der Achse können
durch den Computer kombiniert werden, um eine Echtzeitkalkulation
aller Dimensionen des Probenorganismus zu ergeben. Natürlich werden
unterschiedliche Typen von Organismen (z. B. Nematoden gegenüber Fruchtfliegenlarven)
etwas unterschiedliche vorher gespeicherte Streuinformation erfordern.
-
Bezug
nehmend auf 10A und 10B wird
die Lichtstreutheorie, die gewöhnlich
auf Objekte in Flusscytometrie angewendet wird, Rayleigh-Gans, oder
anomale Brechung, Theorie genannt. Sie trifft auf Objekte zu, die
im Vergleich zu der Quellenwellenlänge groß sind und die einen geringen Brechungsindex
relativ zu dem umgebenden Medium aufweisen, was in diesem Fall Wasser
ist. Unter Verwendung dieser theoretischen Behandlung als eine erste
Annäherung
kann der Prozessor die Annahme verwenden, dass Lichtblockadesignale
dem Bereich eines geometrischen Schattens für die Probenorganismen folgen.
In dem Fall von Nematoden kann die Probenpopulation erwachsene Würmer, Larven
und Eier enthalten. Unter dieser Annahme würde das zeitliche Signal für einen
erwachsenen Nematoden und ein Ei gemeinsam erscheinen, wie in 10A gezeigt. Standardmäßige elektronische Verfahren
können
auf ein derartiges Signal angewendet werden, um zwischen einem Signal
eines erwachsenen Nematoden und einem zu unterscheiden, das mit
einem Ei über einstimmt.
Berechnung der Ableitung eines Blockadesignals z. B., wie in 10B gezeigt, erlaubt, eine Erwachsener-Ei-Übereinstimmung rasch zu erfassen;
z. B. zeigt eine ungerade Zahl von Impulsen in einer Impulsfolge
eine Übereinstimmung
an. Es ist zu vermerken, dass obwohl die Nematoden im Durchmesser
zu groß sind,
um durch die Theorie nach Rayleigh-Gans oder anomaler Brechung genau
gehandhabt zu werden, diese Behandlung für viele Zwecke ausreichend sein
kann. Es könnten
auch detailliertere Modelle entwickelt werden, um mehr Information über die
Nematoden oder andere multizellulare Probenorganismen zu erhalten.
Insgesamt ist optische Erfassung bei einer Messung der Größe und Form
von Probenorganismen oder anderen großen Objekten besonders vielseitig.
-
Bezug
nehmend auf 8A, 8B und 9 stellen,
obwohl das in 2 vorgestellte Fluiddesign preiswert
und einfach zu reinigen ist, andere Fluiddesigns auch Vorteile dar.
In einer ersten Designalternative wird ein Hüllengefäß unter Druck gesetzt, und
der Proben-(Nematoden)Fluss wird durch eine Spritzenpumpe 90 angesteuert
(siehe 7A). Die Kosten eines derartigen
Systems sind höher
und Säuberung
kann schwieriger sein, aber diese Alternative weist größere Flussstabilität auf, was
erlaubt, dass die Flussgeschwindigkeit enger reguliert wird, was
Mikrokugeln unnötig
machen kann, während
genauere Größenunterscheidung
bereitgestellt wird. Die Spritzentrommel in diesem alternativen
Design kann rotiert werden, um die Probenorganismen in Suspension
zu halten (siehe 7B). Dies kann durch
Rollen der Trommel hin und her (Schwingungsrotation) am leichtesten
bewerkstelligt werden, da es keine Notwendigkeit für eine rotierende
Fluidversiegelung gibt. Ein gerippter Innenraum für die Spritzentrommel
kann auch Mischung erleichtern.
-
In
einem zweiten alternativen Ansatz ist eine Spritze 92 mit
einer starren Proben- (Nematoden) Kammer 94 durch ein System von
Prüfventilen 96, 98 versehen
(siehe 9). In diesem alternativen System werden Probenorganismen
nicht tatsächlich
in die Spritzentrommel gezogen, sondern stattdessen in der starren
Kammer 94 gehalten. Es wird ein für einen Probenorganismus freundlicher
Fluid ohne Organismen in die Spritze durch die Prüfventile
periodisch gezogen und Mischung findet außerhalb der Spritze statt,
während
der Fluid in die Kammer 94 eintritt (die mit Mischern ausgerüstet ist,
um die Organismen in Suspension zu halten). Dieses alternative Verfahren
einer Operation erfordert nicht Spritzenänderungen, um die Organismuszufuhr
aufzufüllen. Beide
diese alternativen Ansätze
können
gewöhnliche
Einwegplastikspritzen verwenden.
-
Es
kann sein, dass die alternativen Designs weniger wahrscheinlich
beträchtliche
Druckübergänge in den
Fluidleitungen erzeugen. Derartige Druckübergänge könnten einen Probenstrom in
der Flusszelle verlangsamen oder vollständig abschneiden und zu einer
Periode führen,
während
der Organismen nicht zentriert und nicht ausgerichtet werden. In dem
in 2 vorgestellten Fluidsystem sollten Verfahren
zum Umrühren
der Organismen gewählt
werden, um sie in Suspension zu halten, ohne beträchtliche
Druckübergänge einzuführen. Es
sind magnetische Rührvorrichtungen
verfügbar,
die Auftrieb erzeugen, und können
die einfachste Lösung
sein. Eine Rollenflasche oder Schraubenkonfiguration nach Archimedes
führt Fluidrauschen
nicht ein und stellt effektive Suspension der Probenorganismen bereit. Die
Fluidleitungen in dem Speichergefäß sollten sich während einer
Operation nicht bewegen, und aus diesem Grund sollte die Flusszelle
stationär
bleiben, während
die Platte bewegt wird, um Änderungen
in der Containerposition zu bewirken. Während sehr stabil, müssen die
Probencontainer in den alternativen Ausführungsformen letztlich neu
gefüllt
werden, was zu einer Auszeit für
das System im Vergleich zu der Einrichtung von 2 führen kann,
wo die Probe rasch neu aufgefüllt
werden kann.
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Bezug
nehmend nun auf 12, kann eine Ausführungsform
der Abtastungskammer 58 aus einem aufrechten rechteckigen
Parallelepipped aus Quarz mit einer Kapillare mit einem Durchmesser
von 250 μm
hergestellt werden, die seine Längsachse passiert
und eine Abtastungszone definiert. Es wird vermerkt, dass obwohl
der rechteckige Querschnitt bevorzugt wird, es auch möglich ist,
eine andere Geometrie der Abtastungskammer zu verwenden, oder sogar
die Wände
der Abtastungskammer insgesamt wegzulassen, wobei nur eine offene
Abtastungszone gelassen wird. Der Fluidausgang des Stellgliedes 20 befindet
sich weniger als ungefähr
einen Zentimeter unter dem Auslass der Kapillare und in ungefähr einem
Millimeter von der ungestörten
Position des Flüssigkeitsflusses.
Es ist wichtig, dass das Stellglied 20 so angeordnet ist,
um Fluidinstabilitäten
nicht in den Flussstrom einzuführen.
Die Abmessung von einem Millimeter wurde herausgefunden, für diese Ausführungsform
optimal zu sein, da es erscheint, dass sie zu einer Zerstäubung des
Fluid an Stelle zu einer Ablenkung des Flusses führt, was dazu tendiert, zu
Flussstörungen
zu führen.
Die tätige
Fluidflussrichtung zielt im wesentlichen in rechten Winkeln zu dem
Probenfluidfluss.
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Bezug
nehmend auf 13 tendiert der Fluss von Probenorganismen
(hier Nematoden) 120A, 120B, ... 120N mit
der Zeit dazu, unregelmäßig zu sein.
Einfaches Abgeben von Gruppen von ihnen, während das Stellgliedventil
deaktiviert gelassen wird, kann zu unterschiedlichen Volumina von
Flüssigkeit
führen,
die mit unterschiedlichen Gruppen befördert werden. Aus diesem Grund
wird das Ventil nur deaktiviert, wenn einer der Nematoden vorhanden ist.
Wenn ein Nematod (z. B. 120D) in der Kapillare erfasst
wird, wird ein Spitzenerfassungssignal 122 aus der Ausgabe
des Detektors abgeleitet. Nach einer Bewegungsperiode 124,
die auf die Bewegungszeit des Nematoden von dem Detektorstrahl zu
dem Stellglied und auf die Antwortzeit des Stellgliedes bezogen
ist, wird das Stellglied ausgeschaltet (Flanke 128). Das
Stellglied wird dann für
eine Durchlaufperiode 126 ausgeschaltet gelassen, eingeschaltet (Flanke 130)
und gelassen, bis ein Spitzenerfassungssignal für den nächsten Nematoden erfasst wird.
Diese Zeitsteuerung erlaubt dem Nematoden und einer vorbestimmten
Menge von umgebender Flüssigkeit 121B,
in das Gefäß darunter
zu passieren, verhindert aber, dass überschüssige Flüssigkeit in das Gefäß eintritt.
In einer Ausführungsform
ist die Bewegungsperiode vier Mikrosekunden, und die Durchlaufperiode
kann von vier bis zehn Mikrosekunden abgestimmt werden. Das System
kann auch programmiert sein, mehr als einen Nematoden in jeder Durchlaufperiode
passieren zu lassen. Typischerweise ist der Organismus in einem
zylindrischen Fluidsegment eingeschlossen, das mehrere Millimeter
in der Länge
und ungefähr
0,2 Millimeter im Durchmesser ist. Das Volumen des Fluidsegmentes,
das den Organismus enthält,
ist in der Größenordnung
einer Größe von einem
Mikroliter oder etwas weniger. Falls nur einer oder einige Organismen
in jeden Mikrotiter abgegeben werden, ist der Lösungseffekt in einer Testprobe
von 50–100
Mikroliter vernachlässigbar.
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Sicherstellen,
dass nur eine vorbestimmte Menge von Flüssigkeit eine Population von
Probenorganismen begleitet, ist aus mehreren Gründen von Nutzen. Es kann schwierig
sein, ähnliche
Dosen von Testsubstanzen in unterschiedliche Container zu dosieren,
falls es unterschiedliche Mengen von Flüssigkeit in jedem der Container
gibt. Es können
auch Langlebigkeit und Aktivität
der Probenmechanismen beeinträchtigt
werden, da eine Erhöhung
der Menge von Flüssigkeit
in jedem Container das Volumen-zu-Fläche-Bereichsverhältnis für den Container erhöht, was
Sauerstoffaufnahme für
den Probenorganismus beeinträchtigen
kann. Herstellen von großen,
einzelnen, gestreckten Tropfen, die jeder einen einzelnen Probenorganismus enthalten,
hilft auch, eine Verletzung an dem Organismus zu vermeiden, während er
abgegeben wird.
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Andere
Verfahren können
auch zum Umlenken des Fluidflusses geeignet sein. Derartige Verfahren
können
die Verwendung von elektrostatischen, piezoelektrischen, Ferrofluid-
oder anderen geeigneten Fluidschaltern einschließen. Um die Probenorganismen
lebendig zu halten, müssen
jedoch diese Verfahren sorgfältig
maßgeschneidert
werden. Z. B. scheinen Experimente mit elektrostatischen Schaltanordnungen
anzuzeigen, dass Aussetzen von multizellularen Organismen, wie etwa
Nematoden, gegenüber
mechanischen Vibrationen hoher Frequenz, die verwendet werden, um
den Flussstrom in variabel geladene Tropfen aufzubrechen, und gegenüber elektrischen
Feldern hoher Intensität,
die verwendet werden, um jene Tropfen abzulenken, häufig für die Organismen
tödlich
ist. Als ein Ergebnis müssten
die elektrischen Feldpegel und Vibrationspegel für diesen Typ eines Schalters
zu Lasten anderer Systemparameter reduziert werden, um als ein geeigneter Schalter
für multizellulare
Organismen zu agieren. Selbst dann zeigt die oben präsentierte
Analyse an, dass die großen
Fallabstände,
die für
adäquate
Ablenkung von großen
(z. B. größer als
50 μm) Tropfen erforderlich
sind, im wesentlichen die Verwendung von elektrostatischen Sortierungsverfahren
mit großen
Objekten ausschließen.
Ferrofluidzuschlagsstoffe haben sich auch erwiesen, für die Probenorganismen
schädlich
zu sein, oder interagieren mit Wirkstoffen, die in den Organismen
zu testen sind, sodass der Effekt eines beliebigen derartigen Zuschlagstoffs vor
seiner Auswahl sorgfältig
evaluiert werden muss. Ferner trägt
die Hinzufügung
eines Ferrofluidmaterials zu Aufwand und experimenteller Komplexität bei. Piezoelektrische
Ventile, wie etwa jene, die in "A
New Fluid Switching Flow Sorter" von
J. Duhnen et al., Histochemistry 77: 117, (1983) vorgestellt werden, führen wesentliche
Schockwellen in den Fluid ein und können deshalb auch zu einer
Verletzung von multizellularen Organismen führen. Der mechanische Ausgangspegel
eines Messumformers, die Geometrie der Sortierungseinrichtung und
der Schaltspielraum müssen
deshalb abgestimmt werden, um zu der Population zu passen, die zu
sortieren ist. Aus den oben erörterten
Gründen
wird die Verwendung eines Fluidventils gegenwärtig betrachtet, der am meisten
geeignete Ansatz zum Umlenken des Fluidflusses für multizellulare Organismen
zu sein. Erneut ist es wichtig, dass das Fluidventil von der Flussausrichtung
und Erfassungssystemen physikalisch isoliert ist, um Einführung von
Fluidinstabilitäten
zu vermeiden, die Ausrichtung und Erfassung beeinträchtigen
würden.
In vielen der beschriebenen Beispiele ist der Umlenkungsfluid ein
Gas, nämlich
Luft. Es ist klar, dass andere Gase, wie etwa Stickstoff oder Argon,
leicht gegen Luft eingetauscht werden können. Es wird auch betrachtet,
dass andere Fluids, wie etwa Flüssigkeiten,
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
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Es
können
andere Typen von Objekten unter Verwendung von Techniken, die in
dieser Anmeldung beschrieben werden, sortiert werden, gestreckte
multizellulare Tiere sind von besonderem Interesse. Z. B. wurden
lebendige Fruchtfliegenlarven (Drosophila melanogaster) unter Verwendung
dieser Techniken erfolgreich abgegeben. Es wird auch geglaubt, dass diese
Techniken zum Abgeben und Sortieren der gestreckten Embryonen von
Zebrafisch (Danio rerio) und geeignet sind. Offensichtlich sind
andere multizellulare Organismen ähnlicher Größen, wie etwa zusätzliche
Nematoden oder andere Würmer,
Insektenlarven, andere Arthropoden oder Weichtier- oder Wirbeltierlarven
gleichermaßen
in der vorliegenden Erfindung verwendbar. Es sollten auch nicht
Embryonen verschiedener Pflanzen zum Testen von Mischungen landwirtschaftlicher
an Stelle pharmazeutischer Verwendung übersehen werden. Abgesehen von
multizellularen Organismen sind große Mikrokugeln, die in kombinatorischer
Chemie verwendet werden, um Bibliotheken von Testmischungen zu erzeugen,
bevorzugte Objekte, die durch das Instrument der vorliegenden Erfindung
zu analysieren und abzulagern sind.
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Zusätzlich zu
den Entsprechungen der beanspruchten Elemente werden offensichtliche
Ersetzungen, die jetzt oder später
einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, definiert, in dem Bereich
der definierten Elemente zu sein. Die Ansprüche sind somit zu verstehen
zu enthalten, was oben speziell veranschaulicht und beschrieben
wird, was konzeptionell äquivalent
ist, was offensichtlich ersetzt werden kann und was auch im wesentlichen
die wesentliche Idee der Erfindung einbezieht. Deshalb ist zu verstehen,
dass innerhalb des Bereiches der angefügten Ansprüche die Erfindung anders als
hierin speziell beschrieben praktiziert werden kann.