MXPA01010175A - Metodo de tamizado de compuestos.. - Google Patents

Metodo de tamizado de compuestos..

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Abstract

La presente invencion se refiere a metodos de tamizado mediante el empleo de gusanos nematodos, especial pero no exclusivamente C. elegans, los cuales son adaptados para efectuarse en un formato de alto rendimiento.

Description

MÉTODO DE TAMIZADO DE COMPUESTOS La presente invención se refiere al campo de la farmacología y particularmente al tamizado de substancias químicas con actividad farmacológica potencial utilizando gusanos nematodos tales como Caenorhabdi tis elegans . Específicamente, la invención se refiere a métodos adaptados para tamizado de alto rendimiento efectuados en un formato de placa de pozos múltiples. Caenorhabdi tis elegans es un gusano neiaatodo que se encuentra naturalmente en el suelo pero que puede ser cultivado fácilmente en el laboratorio en agar nutriente o en caldo nutriente líquido inoculado con bacterias, de preferencia E. coli, de las cuales se alimenta. Cada gusano crece a partir de un embrión hasta llega a ser un gusano adulto de aproximadamente lmm de longitud en aproximadamente 3 días. Puesto que es totalmente transparente en todas las etapas de su vida, se pueden observar divisiones celulares, migraciones y diferenciación en animales vivos. Además aún cuando su anatomía es sencilla, sus células somáticas representan la mayoría de los tipos de tejidos diferenciados principales incluyendo músculos, neuronas, intestinos y epidermis. Por consiguiente, diferencias de fenotipo que se alejan de lo que es un gusano de tipo silvestre son relativamente fáciles de observar, ya sea directamente por microscopía o bien mediante el uso de procedimientos selectivos de tinción.
Estas características de C. elegans hacen que este gusano sea una herramienta extremadamente útil en el proceso de descubrimiento de fármacos. Particularmente, C. elegans puede emplearse en el desarrollo de tamizados de compuestos útiles en la identificación de fármacos candidatos potenciales, en los cuales se exponen los gusanos al compuesto en prueba y se registran los cambios fenotípicos y/o de comportamiento resultantes . La posibilidad que C. elegans pueda ser útil par establecer interacciones entre moléculas internas y genes específicos por comparación de los fenotipos de C. elegans generados por exposición a compuestos particulares y por mutaciones seleccionadas es contemplada por Rand y Johnson en Methods of Cell Biology (Métodos de Biología Celular) , capítulo 8, volumen 84, Caenorhabditis elegans: análisis biológico moderno de un organismo, Ed Epstein and Shakes, Academic Press, 1995, y J. Ahringer in Curr. Op. In Gen. And Dev. 7, 1997, 410-415. Rand and Johnson describen en particular ensayos de tamizados de compuestos en los cuales varias composiciones de los compuestos a probar se agregan a agar o caldo nutriente que es subsecuentemente sembrado con bacterias y después inoculados con gusanos. Cualquier cambio fenotípico en el gusano como resultado de la exposición al compuesto es después observado.
Aún cuando el nematodo y en particular C. elegans, es una herramienta potente y eficiente para la identificación o descubrimiento de moléculas farmacológicamente activas, las técnicas conocidas actualmente para el tamizado de compuestos no se prestan fácilmente a un tamizado de alto rendimiento. Esto se debe en gran medida al hecho que las técnicas de ensayo conocidas se basan en la instrucción visual de gusanos expuestos al compuesto de prueba con el objeto de determinar si el compuesto tiene un efecto sobre el fenotipo de los gusanos. Por consiguiente, aun si se efectuará un ensayo en el formato de ensayo de pozos múltiples necesario para un tamizado de alto rendimiento, sería necesario calificar cada pozo individual visualmente con el objeto de determinar el resultado del ensayo. Existe por consiguiente la necesidad de métodos de tamizado confiables y reproducibles utilizando C. elegans vivo que no requieran de calificación por inspección visual y por consiguiente más adecuados para su uso en tamizado de alto rendimiento automatizado. La disponibilidad de tales métodos de tamizado incrementaría dramáticamente la utilidad de C. elegans como herramienta de tamizado, permitiendo a los investigadores explotar el enorme potencial de C. elegans como sistema de animal entero para descubrimiento y desarrollo de fármacos. Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención ofrece un método para identificar sustancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencial utilizando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples. (b) poner en contacto los gusanos nematodos con una muestra de una sustancia química; (c) detectar una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos utilizando un medio de detección no visual. Este método es en efecto un tamizado de compuestos estándar en el cual gusanos están expuestos a compuestos candidatos y se registran cambios en el fenotipo, comportamiento bioquímica o fisiología de los gusanos como resultado de la exposición al compuesto. Tales ensayos pueden ser efectuados utilizando nematodos de tipo silvestre en donde los "cambios" detectados en el paso (c) serán generalmente cambios alejándose del comportamiento de tipo silvestre, etc. Sin embargo, según el tipo de actividad a detectar, tamizados de compuestos pueden también efectuarse utilizando gusanos no de tipo silvestre, como por ejemplo, gusanos mutantes o transgénicos que pueden presentar características no de tipo silvestre. En este caso, el "cambio" detectado en la parte (c) puede ser una reversión al tipo silvestre. Típicamente, ensayos de tamizado de compuestos involucran la realización de varias mezclas de ensayos en paralelo con concentraciones diferentes de la sustancia química de prueba. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, la concentración 0 de la sustancia de prueba. Cambios en cuanto a comportamiento, fenotipo, bioquímica o fisiología, etc. Que resultan a la exposición al compuesto pueden ser evaluados en comparación con el control negativo. En un segundo aspecto, la invención ofrece un método para determinar el modo de acción de una sustancia química utilizando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de un panel de gusanos nematodos mutantes diferentes en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con la sustancia química; (c) detectar una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales. En este método, una metodología de tamizado de compuesto básica puede ser extendida con el objeto de determinar el modo de acción de una sustancia química. Esto puede efectuarse, por ejemplo mediante la detección/medición de propiedades o características de gusanos expuestos al compuesto y comparando el resultado con propiedades o características de gusanos mutantes que llevan mutaciones en proteínas conocidas. El ejemplo 4 de los ejemplos anexos ofrece una ilustración de esto en el campo del sistema nervioso central. En un tercer aspecto, la invención ofrece un método para identificar componentes adicionales de la vía bioquímica en la cual actúa un compuesto que tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) someter una población de gusanos nematodos a mutagénesis aleatoria; (b) suministrar un gusano nematodo Fl mutagenizado en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (c) permitir que los gusanos nematodos Fl generen crías F2 ; (d) poner en contacto los gusanos nematodos con el compuesto; y (e) detectar una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales . Este método de la invención es de hecho un tamizado de supresor genético clásico efectuado en formato de pozos múltiples. En un ensayo de supresor, el propósito es identificar una mutación que suprime el fenotipo generado por exposición del gusano a una sustancia química. Gusanos que llevan mutaciones de supresor son habitualmente identificados con base al hecho que presentan un fenotipo de tipo "más silvestre" en presencia del compuesto, en comparación con el fenotipo generado por la exposición de gusanos de tipo silvestre al mismo compuesto. Por consiguiente, para identificar un mutante de supresor, se busca efectivamente mutantes que no muestran ningún cambio o bien que muestran cambios menores en cuanto a características fenotípicas, fisiológicas, bioquímicas o de comportamiento en la parte (e) después de la exposición al compuesto. Existen .muchas ventajas que se pueden obtener a partir del desarrollo de tamizado de supresores genéticos en un formato de pozos múltiples de conformidad con lo descrito por los inventores. Particularmente, se requiere de una menor cantidad de compuesto para efectuar un ensayo en una placa de pozos múltiples en comparación con un ensayo en placa de agar estándar. Además, puesto que el ensayo en placas de pozos múltiples se efectúa en líquido, los compuestos a probar son recogidos más efectivamente por los nematodos que en el ensayo de placa estándar y también los compuestos presentan una tendencia a una menor precipitación en líquido que en placas de agar debido a la concentración menor. En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para identificar substancias químicas que modulan el efecto de un primer compuesto, dicho compuesto tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayos de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con el primer compuesto; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con una sustancia química adicional; y (d) detectar una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los .gusanos nematodos utilizando medio de detección no visuales . Este método puede ser empleado para tamizar antagonistas de un compuesto dado, este principio es ilustrado en el ejemplo 8 adjunto. Los métodos de la invención son efectuados todos en un formato de placa que pozos múltiples y por consiguiente son especialmente adecuados para su uso en tamizado de rendimiento medio a elevado. En la modalidad preferida, las placas de pozos múltiples tienen 96 pozos, pero la invención se puede aplicar también a placas de pozos múltiples con otro número de pozos, incluyendo sin restricción, placas con 6, 12, 24, 384, 864 o bien 1536 pozos. Los términos "placa de pozos múltiples" y "placa de microtitulación" se emplean de manera intercambiable en este documento. Como en el caso de todos los métodos de tamizado descritos aquí, los métodos descritos arriba se efectúan de preferencia empleando gusanos nematodos del género Caenorhabditis, con mayor preferencia en C. elegans o bien C. Briggsae . Aún cuando C. elegans y C. Briggsae se prefieren se observará que los métodos de tamizado descritos aquí podrían efectuarse con otros nematodos y particularmente con otros nematodos microscópicos, de preferencia nematodos microscópicos que pertenecen al género Caenorhabditis. Como se emplea aquí el término nematodos "microscópico" abarca nematodos de aproximadamente el mismo tamaño que C. elegans, del orden de lmm de largo en la etapa adulta. Nematodos microscópicos de este tamaño aproximadamente son extremadamente adecuados para su uso en tamizado de rendimiento medio a elevado puesto que pueden ser fácilmente criados en pozos de una placa de pozos múltiples. Todos los métodos de la invención requieren de la detección de una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos de comportamiento o bioquímicos que ocurren en los gusanos nematodos en presencia del compuesto de prueba. Es una característica esencial de los métodos de esta invención que esta señal se conoce también como lectura sea detectada utilizando medios de detección no visuales. Como se emplea aquí, el término "medio de detección no visual" se refiere a cualquier medio de detección de una señal que no requiere de una inspección visual por el ojo humano. El uso de un sistema de detección no visual representa una ventaja principal en comparación con métodos de tamizado previamente conocidos que requieren de la inspección visual de los nematodos con el objeto de detectar cambios grandes fenotípicos o de comportamiento. La señal generada como resultado de cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos pueden ser.de varios tipos incluyendo, una señal fluorescente, luminiscente o calorimétrica generada en los gusanos nematodos mismos o un cambio de densidad óptica en una suspensión entera de gusanos. En una modalidad de los métodos una señal es generada por una molécula de marcador que se agrega a los gusanos después del contacto con la sustancia química de prueba. La molécula de marcador es absorbida por los gusanos y la actividad de la sustancia química en los gusanos nematodos pueden ser también monitoreada ya sea directa o indirectamente mediante la detección de una señal que resulta de un cambio en cuanto a las propiedades de la molécula de marcador como resultado de cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos. Existen varias formas a través de las cuales los gusanos pueden absorber la molécula de marcador. Por ejemplo, los gusanos pueden absorber el marcador como resultado de la acción de una sustancia química de prueba. Otra posibilidad es que los gusanos puedan ser precargados con la molécula de marcador antes de la adición de una sustancia química o bien la molécula de marcador puede ser suministrada a través del medio en el cual se cultivan los gusanos o bien a través de bacterias o bien otras partículas alimenticias de las cuales se alimentan los gusanos. Alternativamente, la molécula de marcador puede ser un marcador genéticamente codificado que es expresado en células de los gusanos nematodos mismos. Métodos de rutina para la construcción de C. elegans transgénico son bien conocidos en la técnica y con el uso de secuencia de promotor apropiadas se pueden construir C. elegans transgénicos que expresar- una molécula de marcador genéticamente codificada en todas las células, en un tejido particular o bien en uno o varios tipos de células específicos. Moléculas de marcador genéticamente codificadas adecuadas incluyen proteínas fluorescentes autónomas (AFPs) como por ejemplo proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente azul (BFP) aecuorina, fosfatasa alcalina, luciferasa, beta-glucuronidasa, beta-lactamasa, beta-galactosidasa, acetohidroxiácido sintasa, cloranfenicol acetiltransferasa, peroxidasa de rábano agrio, nopalinsintasa o bien octapinsintasa. La molécula de marcador puede también ser agregada a los nematodos como una molécula "precursora" que puede ser sometidas a cambios químicos en los nematodos como resultado de la actividad bioquímica del nematodo. Esta actividad bioquímica en el precursor cambia sus propiedades, lo que resulta en una generación que puede ser medida. Un ejemplo típico de este sistema es el uso de una molécula de marcador de precursor que puede ser disociada por encimas presentes en el intestino de los gusanos nematodos para generar una molécula de marcador con una propiedad detectable como por ejemplo fluorescencia. Ejemplo de tales moléculas de marcador de precursor incluyen calceína-AM, diacetato de fluoresceína (FDA) y BCECF-AM que son disociadas por esterasas, sustratos de fosfatasa alcalina, por ejemplo difosfatos de fluoresceína y AMPPD, sustrato de aminopeptidasa tales como CMB-leu, y sustratos de glucuronidasa tales como X-gluc. Con el objeto de ayudar a medir una señal generada empleando una molécula de marcador, se pueden emplear apagadores de fluorescencia o bien apagadores de luminiscencia. Por ejemplo, un apagador puede ser agregado al medio con el objeto de apagar cualquier fluorescencia de fondo en el i: medio, esto puede hacer más fácil visualizar una señal de fluorescencia proveniente del intestino de los nematodos. Medios de detección no visuales adecuados incluyen lectores de placa de pozos múltiples que se conocen también como lectores de placa de microtitulación o bien lectores de placa elisa. El uso de lectores de placa de microtitulación facilita un tamizado de alto rendimiento para seleccionar sustancias químicas activas con una actividad farmacológica potencial. Lectores de placa de pozos múltiples adecuados son empleados comúnmente en la técnica y están disponibles en el comercio. Tales lectores de placa pueden emplearse con un amplio rango de métodos de detección que incluyen detección de fluorescencia, detección de luminiscencia, detección calorimétrica, detección espectrofotométrica, detección inmunoquímica, detección de radiaciones y detección de densidad óptica. La ventaja de lectores de placa de pozos múltiples es que pueden emplearse para efectuar mediciones cuantitativas de la señal generada como resultado de la actividad de las sustancias químicas en los gusanos nematodos. La capacidad de realizar mediciones cuantitativas significa que es posible construir curvas de respuesta a la dosis cuantitativas de la actividad de un compuesto químico en los nematodos. Mediante la utilización de estas curvas de respuesta a las dosis se puede determinar la IC50 y la ED50 de compuestos en nematodos tales como C. elegans, y por consiguiente determinar las concentraciones óptimas. Además, las curvas de respuestas a la dosis permiten la determinación de cualquier efecto tóxico del compuesto y pueden también proporcionar una indicación de blancos secundarios posibles y efectos colaterales del compuesto. Sistemas de detección no visuales otros que los lectores de placa de pozos múltiples pueden también emplearse en los métodos de la invención. Un ejemplo de un sistema de detección de este tipo se basa en un "aparato surtidor de gusanos" comercialmente disponible en Unión Biométrica, Inc, Somerville, MA, USA. Este aparato tiene aparato tiene propiedades análogos a los citómetros de flujo, tales como dispositivos de exploración y clasificación de células activados por fluorescencia (FANS) . Por consiguiente, se puede conocer como un aparato "FANS" para dispositivo de exploración de exploración y clasificación de nematodos activado por fluorescencia "FANS". El dispositivo FANS mediante la medición de propiedades de nematodos microscópicos como por ejemplo tamaño, densidad óptica, fluorescencia, y luminiscencia. Para ensayos de tamizado a efectuar con un pequeño número de nematodos o bien para ensayos que proporcionan una señal débil, o bien para ensayos para los cuales la presencia de alimentos puede ser una desventaja en la medición de la señal, un FANS es un instrumento de detección preferida. Sin embargo, el uso de un FANS no se limita a estas condiciones experimentales, se puede emplear FANS generalmente para todos los métodos de tamizado descritos aquí. Un método de tamizado que utiliza un dispositivo FANS es bastante análogo al método de tamizado descrito en el caso de lector de placa de pozos múltiples. En resumen, gusanos entran en contacto con las substancias químicas con o sin adición de una molécula de marcador. Después del tiempo apropiado, las placas de pozos múltiples son sometidos al aparato FANS en un procedimiento totalmente automatizado los gusanos son analizados pozo por pozo para determinar características tales como tamaño global, fluorescencia, luminiscencia, o densidad óptica. Las características deseadas son después calificadas con el uso del dispositivo FANS se pueden efectuar también tamizados de manera cuantitativa. Con el objeto de generar resultados cuantitativos empleando los métodos de la invención, puede ser importante asegurar que números sustancialmente iguales de nematodos individuales se agregan a cada uno de los pozos . El número de gusanos que se agregan a los pozos puede variar según el tipo de tamiz efectuado y la sensibilidad requerida. En todos los formatos de placa incluyendo placas de 96 pozos, es preferible utilizar de 1 a 100 gusanos por pozo, con mayor preferencia de 10 a 80 gusanos por pozo. Y especialmente 80 gusanos por pozo. Se pueden emplear varios métodos para asegurar que se agregan números sustancialmente iguales de gusanos a cada uno de los pozos. Una forma de lograr esto es tomando gusanos cultivados de conformidad con los procedimientos estándares conocidos por parte de los expertos en la materia en medios sólidos o líquidos y resuspender los gusanos en una solución viscosa con el objeto de lograr una suspensión homogénea. La viscosidad de la solución mantiene una distribución regular de gusanos en la suspensión, y por consiguiente se puede surtir números sustancialmente iguales de gusanos mediante la adición de volúmenes iguales de la suspensión homogénea de gusanos a uno de los pozos. Soluciones viscosas adecuadas incluyen una solución que contiene una baja concentración de material de polímero (por ejemplo, 0.25% de agarrado con bajo punto de fusión), glicerol, etc. Como alternativa al enfoque descrito arriba, una solución igual de gusanos en los pozos en la placa de pozos múltiples puede lograrse utilizando un dispositivo de suministro de gusanos, como por ejemplo el dispositivo desarrollado por Union Biométrica, Inc. El surtidor de gusanos puede ser programado para agregar un número establecido de gusanos a cada uno de los pozos de la placa. Además, se puede emplear para seleccionar gusanos de tal manera que se suministren solamente hermafroditas o machos o dauers y puede también ajustarse con base en el tamaño para suministrar específicamente huevos Ll, L2, L3, L4 o bien gusanos adultos. Los inventores han observado que el uso de un medio viscoso en los métodos de la invención puede tener ventajas además de asegurar que números iguales de gusanos s n agregados a los pozos de la placa de pozos múltiples. Les tamices de pozos múltiples descritos por los inventores son efectuados en medio líquido. Sin embargo, puesto que el entorno natural de nematodos tales como C. elegans es sólido (por ejemplo suelo) , el crecimiento en un medio liquide resulta en gusanos de menor salud. Los gusanos criados en medio líquido son más largos y más delgados, la faringe bcr-cea a un régimen reducido, los gusanos presentan menor r-ovimiento y ponen menos huevos. Los inventores han encontrado una solución a este problema agregando un polímero soluble en agua al medio con el objeto de incrementar su viscosidad (es decir, producir una viscosidad mayor que la viscosidad del medio líquido normal utilizado para el cultive de los nematodos, como por ejemplo M9) . El uso de un medio líquido viscoso conserva las ventajas del cultivo líquido, es decir, la facilidad de manejar nematodos en líquido, mientras que conserva la salud de los gusanos. Tipos preferidos de polímero son agarosa de bajo punto de fusión, carboximetilcelulosa y polietilenglicol (especialmente PEG8000) . La cantidad óptima de polímero a agregar puede ser determinada por experimente de rutina y puede variar según la naturaleza de la lectura del ensayo. Por ejemplo, en el "ensayo", descrito a continuación, se ha determinado que la adición de carboximetilcelulosa de viscosidad media al 0.3% es óptima. Los inventores han utilizado diferentes variantes de viscosidad de carboximetilcelulosa para determinar las condiciones óptimas para efectuar los tamices descritos aquí, en experimento, tres variantes de carboximetilcelulosa, es decir, carboximetilcelulosa de viscosidad baja, de viscosidad media y de viscosidad alta, proporcionados por Sigma (St.
Louis, MO, USA), fueron probadas en concentraciones de 0.4% (véase figura 11) . Se observó que en esta concentración, la carboximetilcelulosa de viscosidad media y la carboximetilcelulosa de viscosidad alta ' presentaban los mejores resultados en los tamices. Por razones prácticas, se prefiere utilizar carboximetilcelulosa de viscosidad media. Una concentración de aproximadamente 0.3% de carboximetilcelulosa es adecuada para la mayoría de los tamices. La adición de un polímero soluble en agua para incrementar la viscosidad del medio de ensayo puede resultar en una mejor significativa de cualesquier de los tipos de ensayos descritos aquí, incluyendo los ensayos de bombeo de faringe, ensayos de movimiento, ensayos de acoplamiento, ensayos de puesta de huevos y ensayos de defecación, y de hecho cualquier tipo de ensayo utilizando nematodos tades como C. elegans que se efectúa en una placa de pozos múltiples (microtitulación) . Los ensayos de tamizado descritos aquí pueden también ser mejorados mediante la adición de un polímero soluble en agua, posiblemente en una concentración menor de lo que es requerido para incrementar la viscosidad del medio, a una concentración suficiente para evitar que los nematodos se peguen en los pozos de la placa de microtitulación. Debido a la naturaleza del material plástico utilizado para la construcción de las placas de microtitulación, las superficies de tales placas son generalmente hidrofóbicas. Por consiguiente, debido a que la superficie externa de nematodos tales como C. elegans es también hidrofóbica, los nematodos tienen preferencia para pegarse sobre las paredes de las placas de microtitulación, los que impide significativamente el desempeño del ensayo efectuado en placas de microtitulación. Este problema puede ser evitado con el uso de tipos diferentes de placas de microtitulación pero a la fecha no hay placas de microtitulación disponibles en el mercado que reducen suficientemente este problema. Los presente inventores han encontrado ahora que el problema de la adhesión de los nematodos sobre las paredes de las placas de microtitulación puede ser superado mediante la adición de una concentración adecuada de un polímero soluble en agua al medio de ensayo . Tipos preferidos de polímero soluble en agua son polietilenglicol (PEG) , particularmente PEG8000, alcohol polivinílico (PVA) y polivinilpirrolidona (PVP) , prefiriéndose especialmente PEG8000. Para un tipo dado de polímero en un tipo dado de ensayo de tamizado, la concentración óptima de polímero a agregar al medio puede ser fácilmente determinada mediante experimento de rutina. En el caso de PEG8000, una concentración de 0.11 proporciona buenos resultados en la mayoría de los tipos de tamices. Concentraciones de polímeros dentro de un rango de 0.01 a 10% pueden también ser adecuadas, según el tipo de ensayo. La adición de un polímero al medio de ensayo resulta en una mejora particular para ensayos efectuados en placas de pozos múltiples que tienen más que 96 pozos evitando que los gusanos se peguen sobre las paredes del pozo. Además, la presencia del polímero en el medio facilita generalmente manipulaciones de nematodos en cultivo líquido, como por ejemplo manipulación con pipetas y operación de sistema de surtido automatizados tales como el dispositivo FANS, el dispositivo Qfit2 de Genetix (Dorset, Reino Unido) y otros sistemas automatizados utilizados para llenar placas de microtitulación. La adición del polímero soluble en agua al medio de ensayo con el objeto de evitar que los nematodos se peguen a superficies sólidas tales como las paredes de una placa de microtitulación pueden resultar en una mejora significativa en cualesquiera de los tipos específicos de ensayos descritos aquí, incluyendo los ensayos de bombeo de faringe, ensayos de movimiento, ensayos de acoplamiento, ensayos de puesta de huevos, y ensayos de defecación, y de hecho cualquier otro tipo de ensayo que utiliza nematodos tales como C elegans que se efectúa en una placa de microtitulación. Todos los métodos de tamizado descritos aquí pueden ser efectuados empleando varios tipos de C. eiegans, incluyendo gusanos de tipo silvestre, mutantes seleccionados, gusanos transgénicos y gusanos humanizados. Las cepas transgénicas pueden ser cepas que expresan un transgen en el organismo entero, o bien una parte del organismo, en un tejido único, en un subconjunto de tipos de células, en un tipo único de células, o aun en una célula del organismo. Los gusanos mutantes pueden llevar una mutación en un gen simple, o en dos o más genes diferentes. Gusanos humanizados son especialmente útiles para la identificación de compuestos con actividad terapéutica potencial en el campo farmacéutico humano puesto que pueden ser empleados para efectuar tamices que son específicamente dirigidos a proteínas blanco de ser humano pero que tienen todas las ventajas de la biología y facilidad de manipulación de los nematodos. Métodos especiales para cultivar nematodos son descritos en Methods in Cell biology (Métodos en Biología Celular) volumen 48, 1995, y por Epstein and Shakes, Academic press. Métodos estándares son conocidos para crear gusanos mutantes con mutaciones en genes seleccionados de C. elegans como por ejemplo véase J. Sutton y J. Hodgkin en "The Nematode Caenorhabditis elegans" (El nematodo Caenorhabdtitis elegans) editado por William B. Wood y the Community of C. elegans Researchers CSHL, 1988 594-595; Z aal et al, "Target -Selected Gene Inactivation in Caenorhabditis elegans by using a Frozen Transposon Insertion Mutant Bank (desactivación de gen blanco seleccionado en Caenorhabdtitis elegans mediante la utilización de banco de mutantes de inserción de transposones congelados) 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 pp 7431 - 7435; fire et al, Potent and Specific Genetic Interference by Double Stranded RNA in C. elegans (interferencia genética potente y específica por ARN de doble cadena en C. elegans) 1998, nature 391, 860-811. Una población de gusanos puede ser sometida a mutagénesis aleatoria mediante la utilización de EMS, TPM-UV o bien radiación (methods in Cell Biology (Métodos en biología celular) , Vol 48 , ibid) . Varias rondas de selección de reacción en cadena de polimerasa pueden ser efectuadas después para seleccionar un gusano mutante con una remoción en un gen deseado. Además, una gama de mutantes específicos de C. elegans está disponible en la recolección de mutantes de C. elegans en el C. elegans Genetic Center, University of Minnesota, St Paul, Minnesota. Las sustancias químicas o "compuestos" a probar en los métodos de la invención pueden ser cualquier molécula foránea no habitualmente presente en el gusano o a la cual el gusano no se encuentra normalmente expuesto durante su ciclo de vida. Estos términos pueden ser empleados de manera intercambiable. Por ejemplo el gusano puede estar expuesto a una sustancia/compuesto químico listado en una farmacopea con actividad farmacológica conocida. Alternativamente, la sustancia/compuesto químico puede ser una sustancia/compuesto conocido por interactuar con una vía bioquímica o gen particular. Una alternativa adicional es probar moléculas conocidas sin actividad biológica conocida o moléculas totalmente nuevas o bibliotecas de moléculas que pueden ser generadas por química de combinación. Compuestos que ADN, ARN, PNA, Polipéptidos o proteínas no son excluidos. En una modalidad, los métodos de la invención se efectúan utilizando C. elegans transgénico que expresa un transgen que comprende un "gen tóxico". En este contexto, el término "gen tóxico" abarca cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que ex tóxica para la célula. Ejemplos adecuados incluyen ácido nucleico que codifica ataxina, alfa-sinucleina, ubiquitina, el producto de gen tau, el producto de gen de Huntington (Huntingtina) el producto de gen de la distrofia macular de Best, el producto de distrofia molecular relacionado con la edad o el producto del gen unc-53 "genes tóxicos" que codifican proteínas involucradas en la apoptosis o necrosis pueden también ser utilizados con efecto equivalente. La utilización de promotores específicos para tejido o específicos para tipos de células, se pueden construir C. elegans transgénicos que expresan uno o varios genes tóxicos en un tejido individual, en un subgrupo de tipos de células, en un tipo único de células, o aun en una célula única, por ejemplo, una neurona individual. La expresión de un gen tóxico resultará generalmente en anormalidad/mal función de las células y tejidos que expresan el gen tóxico. Muchos promotores adecuados específicos para tejido, tipos de células o de desarrollo- son conocidos para su uso en C. elegans . Todos los métodos de tamizado descritos aquí pueden también efectuarse utilizando cultivos de gusanos sincronizados. Los gusanos sincronizados son gusanos que se encuentran en la misma etapa del desarrollo. Las varias etapas del desarrollo de los gusanos nematodos tales como C. elegans son huevos, la etapa Ll, la etapa L2, la etapa L3, la etapa L4 y la etapa adulta. Además, en una modalidad preferida de la invención, los gusanos nematodos sincronizados son de un sexo específico. Los cultivos sincronizados pueden ser hermafroditas o machos o nematodos en una etapa larval especial, designados como dauers. Técnicas adecuadas para su uso en la generación de los varios cultivos sincronizados se conocen en la técnica, véase, por ejemplo Methods in Cell Biology (Métodos en Biología Celular) , volumen 48, ibid. La población principal de cultivo de C. elegans consiste de gusanos hermafroditas, de tal manera que no se requiere de ninguna técnica especial para generar nematodos hermafroditas sincronizados en diferentes etapas del crecimiento. Para generar gusanos machos, se han descrito varias técnicas en la literatura. Cultivos de C. elegans enriquecidos o que consisten exclusivamente de gusanos machos han sido descritos en C. elegans II, por Fiddle, Blumenthal, Meyer and Pries, 1997, CSHL press. Cepas para preparar muestras enriquecidas con machos o exclusivamente con machos han sido descritas por Johnathan Hodgkin, Worm breeder 's (revista de los creadores de gusanos) 15 (5), 1999). Para generar dauers de C. elegans, se han descrito varias técnicas (Elegans II, ibid) . Principalmente, un mutante de C. elegans daf-c sensible a la temperatura es utilizado para generar dauers, aun cuando existen otras posibilidades tales como daf2-ts que producen 100% de dauers a 25° C. En una modalidad particular de los métodos de la invención, el paso de detectar una señal que indica cambio fenotípicos, fisiológicos de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales comprende la detección de cambios en el régimen de bombeo de la faringe de los gusanos nematodos. Estos métodos pueden ser conocidos de manera colectiva a continuación "ensayos de bombeo de faringe". C. elegans se alimenta ingiriendo líquido que contiene su alimento por ejemplo bacterias. Después escupe el líquido, aplasta las partículas de alimento e internaliza dichas partículas en el lumen intestinal. Este proceso es efectuado por los músculos de la faringe. El proceso de ingerir líquido y escupirlo subsecuentemente se conoce como bombeo faríngeo o bombeo de la faringe. Puesto que el proceso de bombeo de la faringe involucra tanto los músculos de la faringe como las neuronas faríngeas, la medición del régimen de bombeo de la faringe puede ser explotada para proporcionar un tamiz útil para identificar substancias químicas que tienen un efecto sobre la actividad de los músculos y/o nervios. El régimen de bombeo de la faringe puede ser medido fácilmente mediante la detección de la acumulación de moléculas de marcador en el intestino del gusano. Si esto se efectúa empleando un lector de placa de pozos múltiples entonces el ensayo puede ser efectuado de manera rápida y cuantitativa. En particular, el régimen de bombeo de la faringe puede ser medido mediante el precursor de molécula de marcador que puede ser disociable por encimas presentes en el intestino de los nematodos, de conformidad cpn lo descrito arriba. Se prefiere especialmente la calceína AM para este propósito. La calceína-AM es un sustrato de esterasa, y al efectuarse disociación de calceína-AM por esterasas, se libera calceínas (una molécula fluorescente) . Puesto que esterasas están presentes en el intestino de los nematodos tales como C. elegans, el régimen de bombeo de la faringe puede ser medido directamente mediante la medición de la fluorescencia de calceína. En los ejemplos proporcionados aquí, se ha utilizado calceína-AM para medir el régimen de bombeo de la faringe en C. elegans en presencia o ausencia de varias substancias químicas. Estas mediciones pueden ser efectuadas en forma de rendimiento altamente cuantitativo, permitiendo la selección de sustancias químicas que alteran el régimen de bombeo de la faringe de C. elegans . Este método no se limita al uso de calceína-AM y otros sustratos de precursor podrían emplearse como por ejemplo: Con una lectura de fluorescencia: - sustrato de esterasa. Calceína-AM, FDA, BCECF-AM - sustratos de fosfatasa alcalina: difosfato de fluoresceína FDP) - endoproteasa: sustratos de aminopeptidasa: CMB-leu con lectura luminiscente: - sustratos de fosfatasa alcalina: AMPPD con lectura de color: - sustrato de glucuronidasa: X-gluc Esta lista no es exclusiva, precursores de moléculas de marcador pueden también encontrarse o desarrollarse los cuales pueden ser disociados por otras encimas que estén presentes en el intestino de C. elegans como por ejemplo ADNasas, ATPasas, lipasas, amilasas, etc. Una vez que un precursor de marcador de este tipo penetra en el intestino, es disociado para liberar el marcador detectable que puede ser después monitoreado. Así, es posible medir el régimen de bombeo de la faringe indirectamente mediante la medición de la acumulación de una molécula de marcador detectable en el intestino. El pH del intestino de C. elegans es bajo por consiguiente moléculas que se vuelven fluorescentes en un pH bajo son herramientas útiles para evaluar el régimen de bombeo de la faringe. Verde LysoSensor de Molecular probes presenta dichas propiedades y ha sido utilizado exitosamente para evaluar el bombeo de la faringe. La fluorescencia observada en el intestino es similar a la fluorescencia obtenida con calceína-AM, pero menos brillante. Sin embargo, moléculas de marcadores que son fluorescente en un pH bajo tienen la ventaja adicional que pueden utilizarse juntas con una fuente de alimentos para nematodos. Por ejemplo, bacterias, que no deben interferir con la lectura puesto que depende solamente de un cambio de pH y no depende de encima. Moléculas de marcadores LysoSensor o sondas son bases débiles que son concentradas selectivamente en organelos ácidos como resultado de protonación. Esta protonación puede también liberar el aparato de la fluorescencia del colorante por su cadena lateral de base débil. Así, los colorantes LysoSensor se vuelven más fluorescentes en entornos ácidos. La sonda de fluorescencia azul LysoSensor plus y la sonda de fluorescencia verde LysoSensor Breen están disponible con sensibilidad de pH óptima tanto en el rango ácido como en el rango neutral (pKa aproximadamente 5.2 o aproximadamente 7.5). con sus valores pKa bajos, LysoSensor Blue DND-167 y LysoSensor Green DND son casi no fluorescentes excepto en compartimientos ácidos . Los ensayos de bombeo de faringe pueden también ser empleados empleando cepas de C. elegans mutantes que tienen una faringe que bombea constitutivamente o bien mediante la utilización de cepas transgénicas que presentan también este genotipo. Mediante la utilización de una cepa de tipo silvestre o la cepa de bombeo consecutivo de faringe es posible identificar substancias químicas que incrementan, inhiben o modulan el régimen de bombeo, respectivamente. Puesto que la faringe del nematodo C. elegans es un músculo y el régimen de bombeo es principalmente regido por ciertas neuronas seleccionadas, la medición de cambios en el régimen de bombeo de la faringe es una buena herramienta para estudiar señales de neurotransmisor y estimulación de músculos. Puesto que el régimen de bombeo de la faringe puede ser medido cuantitativamente y puesto que se ha desarrollado un método para tamizar substancias químicas que influencian este régimen de bombeo, la presente invención es un método para tamizar y aislar substancias químicas con actividad farmacológica potencial. Substancias químicas que influencian el régimen de bombeo de la "faringe serán probablemente substancias que tienen una actividad sobre la biología general de los músculos, y/o sobre las vías de los neurotransmisores . Ejemplos de proteínas que pueden ser el blanco de estas substancias químicas son neuroreceptores de neurotransmisores tales como receptores muscarínicos, receptores de glutamato, receptores de hormonas y receptores de 5-HT, receptores de canabinoides, receptores adrenérgicos, receptores dopaminérgicos, receptores de opioides, receptores de GABA, receptores de adenosina, receptores de VIP y receptores nicotínicos, proteínas involucradas en la síntesis de los neurotransmisores, proteínas de la vía de liberación de neurotransmisores, proteínas de receptores acoplados con proteína G. Además, proteínas para vías de segundo mensajero acopladas a proteína G tales como adenilatociclasa, proteinquinasa A, proteínas de enlace de elementos que responden a cAMP, IP3, diacilglicerol, proteinquinasa C fosfolipasa A-D, fosfodiesterasas, y proteínas que codifican funciones en uniones de intervalos, proteínas involucrada en la fosforilación oxidantes en mitocondrias y proteínas involucradas en otras vías relacionadas con la energía, proteínas de canal de iones y proteínas de bomba de iones son también blancos potenciales para estas substancias químicas. Ejemplos de canales de iones de este tipo son canales de sodio/calcio, canales de calcio, canales de sodio, canales de cloruro, en general, fármacos o substancias químicas que afectan el régimen de bombeo de la faringe de C. elegans y que son identificados con el tamiz de bombeo de faringe serán con mayor probabilidad compuestos que muestran las siguientes actividades: moléculas que tienen influencia sobre moléculas de neurotransmisores o que son precursores para la síntesis de un neurotransmisor, - moléculas que incrementan, inhiben o modulan la síntesis de un neurotransmisor, - moléculas que tienen una función en el agotamiento del neurotransmisor, - molécula que evitan o estimulan la liberación del transmisor a partir de las vesículas sinápticas en la hendidura sináptica, - moléculas que funcionan como un inhibidor de receptor o estimulador de receptor, moléculas que imitan las moléculas de transmisor que funcionan como inhibidores o activadores de conducción, - moléculas que funcionan como activador o inhibidor del bloqueo de la conducción, moléculas que evitan o estimulan la reabsorción del transmisor después de la excitación de la neurona, - moléculas que funcionan como falso transmisor (+/-) , - moléculas que previenen o estimulan la acumulación de receptores, - moléculas que actúan en vías novedosas. Así, los ensayos de bombeo de la faringe pueden ser empleados para tamizar un amplio rango de substancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencial que puede tener un uso terapéutico como agente anti-psicóticos, antidepresivos, anxiolíticos, tranquilizantes, anti-epilépticos, relajante muscular, sedantes o hipnóticos. Los ensayos pueden también ser utilizados para identificar substancias químicas que pueden tener un efecto sobre la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Además, fármacos anti-pruríticos, anti-histamínicos, y anti-convulsantes pueden también ser aislados utilizando el ensayo de bombeo de la faringe. El ensayo de bombeo puede también ser utilizados para identificar nematocidas e insecticidas. El ensayo de bombeo de la faringe puede también ser utilizado para identificar substancias químicas que modulan las vías de neurotransmisores que involucran acetilcolina, dopamina, serotonina, glutamato, GAB y octopamina. Esto puede lograrse utilizando C. elegans mutantes seleccionados que presentan niveles alterados de uno o varios de los neurotransmisores * presentados en la lista anterior. Con el ensayo de bombeo de la faringe, existe el potencial de tamizar de 10 a 15 modos de acción y de 2 a 6 vías de neurotransmisores y canales de iones. Puesto que se puede observar tanto la activación como la inhibición, este método de tamizado hace posible tamizar de 40 a 180 blancos en un tamiz simple. La metodología del ensayo de bombeo de faringe, además de los tamices descritos arriba puede ser adaptada para utilizarse para determinar el modo de acción de una sustancia química, o bien para seleccionar substancias químicas que actúan sobre un blanco específico. Con el objeto de efectuar un tamiz para identificar el modo de acción de un compuesto, números substancialmente iguales de un panel de nematodos mutantes, transgénicos o humanizados definidos diferentes se suministran en los pozos de una placa de ensayos de pozos múltiples. Una muestra de la substancia química de prueba es después agregada a cada uno de los pozos, y se detectan cambios en el régimen de bombeo de la faringe de conformidad con lo descrito arriba. Para cada una de las cepas mutantes, transgénicas o humanizadas, se califica el régimen de bombeo de la faringe en ausencia de sustancia química. El ensayo de bombeo de la faringe puede por consiguiente ser empleado para identificar agentes químicos que incrementan o suprimen el régimen de bombeo de la faringe de una cepa mutante, transgénica o humanizada definida. Los ejemplos proporcionados aquí listan varias cepas de C. elegans mutantes y transgénicas que son útiles en este aspecto de la invenció. Principalmente, estos mutantes y transgénicos se relacionan con la síntesis de neurotransmisores, tansducción de señales de neurotransmisores y canales de iones. Más específicamente ejemplos de gusanos mutantes, transgénicos y humanizados se proporcionan los cuales se relacionan con receptores de neurotransmisores tales como receptores muscarínicos, receptores de glutamato, recetores de hormona, receptores de 5-HT, receptores canabinoides, receptores adrenérgicos, receptores dopaminé'rgicos, receptores opioides, receptores de GABA, receptores de adenosina, receptores de VIP y receptores nicotínicos, proteínas involucradas en la síntesis de neurotransmisores, vías de liberación de neurotransmisores, y proteínas de receptores acoplados con proteína G, vías de segundo mensajero acoplado con proteína G tales como adenilatociclasa, proteinquinasa A, proteínas de enlace de elementos que responden a cAMP, IP3, diacilglicerol, proteinquinasa C, fosfolipasa Q y proteínas que codifican funciones en uniones de intervalo, proteínas de canales de iones y proteínas de bomba de iones . Una lista no completa de mutantes bien conocidos que son adecuados para su uso en este aspecto de la invención se proporciona en los ejemplos ofrecidos aquí. Utilizando tales cepas mutantes, transgénicas o humanizadas, es posible tamizar substancias químicas que actúan sobre un blanco específico y por consiguiente identificar un rango amplio de substancias químicas que pueden tener un uso terapéuticos como agentes anti-psicóticos, anti-depresivos, anxiolíticos, tranquilizantes, anti-epilépticos, relajantes musculares, sedantes o hipnóticos, pero el tamiz resultará también en sustancias químicas que pueden tener un efecto sobre la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Además se pueden aislar fármacos anti-pruríticos, anti-histamínicos y anti-convulsantes. Las vías de transmisores que pueden ser efectuadas por sustancias químicas y por consiguiente pueden ser detectadas por el ensayo son las vías para acetilcolina, dopamina, serotonina, glutamato GABA y octopamina. Utilizando cepas transgénicas, mutantes o modificadas apropiadas, es posible tamizar substancias químicas que actúan en blancos específicos y por consiguiente especificar también insecticidas y nematocidas. Estos gusanos mutantes, transgénicos y humanizados permiten también el desarrollo de tamices de substancias químicas que tienen una actividad en vías bioquímicas bien definidas. Por ejemplo, es posible tamizar compuestos que rescatan el fenotipo de C. elegans mutante seleccionado que llevan una mutación definida en un gen conocido o compuestos que incrementan el fenotipo de C. elegans mutante seleccionado. En una modalidad particularmente importante de la invención, el tamiz de bombeo de faringe puede ser empleado para tamizar compuestos que tienen una actividad insecticida potencial. Los inventores han observado que la exposición de C. elegans a compuestos que tienen una actividad pesticida, como por ejemplo herbicidas, insecticidas, nematocidas o funguicidas, tiene un efecto sobre el régimen de bombeo de la faringe. Esto se ilustra en las figuras anexas 18 a 21 que muestran los efectos de insecticidas conocidos cobre el régimen de bombeo de la faringe de C. elegans, de conformidad cor- lo medido utilizando la metodología de ensayo de faringe. Por consiguiente, el tamiz de bombeo de la faringe puede ser fácilmente adaptado para tamizar compuestos que tienen una actividad pesticida. En otra modalidad de la invención, la metodología del ensayo de bombeo de la faringe puede ser empleada para identificar componentes adicionales de la vía bioquímica en la cual actúa un compuesto que tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos. Empleando este tamiz, es posible identificar genes que incrementan, suprimen o modulan la actividad de un compuesto seleccionado. El tamiz puede ser efectuado directa y rápidamente puesto que utilizando placas de pozos múltiples miles de gusanos pueden ser tamizados de una vez. Primero se genera un conjunto aleatorio de gusanos mutantes. Varias técnicas tales como mutagénesis por EMS, mutagénesis por TMP-UV y mutagénesis por radiación han sido descritas para generar gusanos mutantes (Methods in Cell biology (métodos en biología celular), Vol. 48, ibid). Un nematodo Fl mutagenizado es después surtido en cada uno de los pozos de la placa de pozos múltiples y la generación F2 pueden producir crías en los pozos. Una muestra de un compuesto que tiene una actividad conocida cobre los gusanos nematodos es después agregada a los gusanos F2. Cambios en el régimen de bombeo de la faringe son después monitoreados de conformidad con lo descrito arriba, como por ejemplo utilizando una molécula de marcador o bien un precursor de molécula de marcador. Se califican gusanos mutantes en los cuales el efecto del compuesto sobre el régimen de bombeo de la faringe es suprimido, incrementado o modulado. Estos gusanos mutantes tendrán mutaciones 1 o varios genes que son afectados por el compuesto. El gen mutado o los genes mutados pueden ser después aislados utilizando técnicas genéticas y de biología molecular estándares. Estos genes, y sus proteínas correspondientes se consideran genes y proteínas importantes de la vía afectada, y por consiguiente son nuevos blancos putativos para el desarrollo adicional de tamices en el proceso de descubrimiento de fármaco. Como en el caso de todos los métodos descritos aquí, este método se efectúa de preferencia utilizando nematodos microscópicos, particularmente gusanos del género Caenorhabditis y especialmente C. elegans . En otra modalidad de la invención, la metodología de ensayo de bombeo de la faringe puede también emplearse para tamizar substancias químicas que son incrementadores, supresores o moduladores de un compuesto químico seleccionado que tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos. En este ensayo, se colocan gusanos en placas de pozos múltiples con un compuesto que tiene un efecto conocido sobre el régimen de bombeo de la faringe de los gusanos nematodos. Una segunda sustancia química es después agregada a cada uno de los pozos y substancias químicas que incrementan, reducen o modulan el efecto del compuesto seleccionado son identificadas mediante la detección de cambios en el régimen de bombeo de la faringe de los gusanos nematodos utilizando los métodos descritos arriba. Este método es útil para tamizar substancias químicas que son activas en una vía bioquímica seleccionada. Las substancias químicas aisladas de esta forma pueden ser agentes terapéuticos putativos o bien pueden ser consideradas descubrimientos para nuevos desarrollos farmacéuticos. En otra modalidad adicional del ensayo de bombeo de la faringe, el ensayo es efectuado utilizando C. elegans que son transgénicos, o mutantes o humanizados para el gen Sarco/calcio retículo endoplásmico ATPasa (SERCA) y/o para sus reguladores fosfolambano (PLB) y Sarcolipina (SLN) , estos genes son importes para la regulación del almacenamiento interno de calcio en la célula. Substancias químicas que alteran el régimen de bombeo de la faringe en estos gusanos mutantes, trangénicos o humanizados son substancias que regulan la actividad de SERCA o PLB o SLN o que alteran la interacción de SERCA-PLB o que alteran la interacción de SERCA-SLN o que alteran la actividad de la vía de SERCA. Tales substancias químicas pueden ser útiles como agentes terapéuticos o bien pueden ser compuestos novedosos útiles para desarrollo farmacológico adicional en el área de las enfermedades cardiovasculares, incluyen hipertensión, hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca, pero también el área de diabetes mellitus y en el área de enfermedades musculares esqueletales incluyendo enfermedad de Brody. En una modalidad adicional del ensayo de bombeo de la faringe, el ensayo puede efectuarse nematodos que presentan una morfología y/o función aberrante de la faringe. La faringe del nematodo consiste en varios tipos de células y todas estas células son necesarias para que la faringe funcione adecuadamente. Además, el bombeo de la faringe es regulado por varias neuronas. Las células esenciales para la morfología de la faringe y la función de la faringe son los músculos faríngeos, las células epiteliales faríngeas, las glándulas faríngeas y las neuronas faríngeas. Si uno de estos tipos de células es alterado, degenerado o disfuncional, la faringe presentará una morfología aberrante o un funcionamiento aberrante que resultará en un bombeo alterado de la faringe. Los ejemplos ofrecidos a continuación presentan una lista de mutantes conocidos de C. elegans que presentan un régimen de bombeo alterado como resultado de una morfología alterada de la faringe. Además, es posible generar gusanos C. elegans que muestran un defecto en una o varias de los tipos de células requeridos para mantener la morfología y/o función de la faringe de C. elegans . Esto puede lograrse mediante la expresión de "genes tóxicos" en las células de la faringe. En este contexto el término "genes tóxicos abarca cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que es tóxica para la célula. Ejemplos adecuados incluyen el ácido nucleico que codifica . la ataxina, alfa-sinucleina, ubiquitina, el producto de gen tau, el producto de gen de huntington (huntingtina) , el producto de gen de distrofia macular de Best, el producto de distrofia macular relacionada con la edad o bien el producto de gen ung-53 "genes tóxicos" que codifican proteínas involucradas en la apoptosis o necrosis pueden también ser empleados con efecto equivalente. La expresión de los genes tóxicos en la faringe o en tipos particulares de células dentro de la faringe puede lograrse utilizando promotores específicos para tejido o promotores específicos para tipo de células que son capaces de dirigir el patrón de expresión apropiado. Por ejemplo, el promotor myo-2 puede también emplearse para dirigir la expresión en la faringe y el promotor unc-129 puede emplearse para dirigir la expresión en las neuronas faríngeas. Otros promotores adecuados incluyen el promotor de tropomiosina tmy-1 y el promotor daf-7. La expresión de un gen tóxico en uno o varios tipos de células de la faringe o en las neuronas faríngeas resultará en una morfología y/o una función cambiada de la faringe, y por consiguiente una alteración del régimen de bombeo de la faringe. Es interesante observar que el trastorno de la neurona ASI por expresión de un gen tópico bajo el control del promotor daf-7 resulta en la formación de dauer. Esto es el resultado directo de una falta de insulina por consiguiente C. elegans donde la neurona ASI es trastornada puede ser empleada para efectuar tamices que son útiles con relación a la diabetes. Estos tamices pueden ser efectuados utilizando lectura de ensayo de bombeo de faringe o alternativamente la lectura de ensayo de movimiento descrita abajo (véase ejemplo 12) . Gusanos mutantes o transgénicos que presentan un régimen de bombeo de faringe alterado pueden ser empleados para tamizar sustancias químicas que alteran adicionalmente el régimen de bombeo de la faringe por ejemplo, que rescatan el fenotipo mutante/transgénico o que incrementan el fenotipo mutante/transgénico. Las substancias químicas aisladas de esta forma pueden ser útiles como agentes terapéuticos o bien como compuestos novedosos para el desarrollo de fármacos adicionales en áreas de enfermedades tales como agentes antidepresivos, anti-psicóticos, anxiolíticos, tranquilizantes, anti-epilépticos, relajantes musculares, ' sedantes, fármacos antimigraña. Analgésicos e hipnóticos. Además, mediante la alteración de la naturaleza del gen tóxico expresado en células de la faringe/neuronas faríngeas, substancias químicas serán aisladas las cuales son útiles en el desarrollo de tratamiento para la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de cuerpo de Lewy, la distrofia muscular de Best, la distrofia macular relacionada con la edad, y las enfermedades inducidas por poliglutamina tales como enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy y ataxia. Gusanos mutantes o transgénicos que presentan un régimen de bombeo de faringe alterado pueden ser utilizados además para tamizar pesticidas tales como herbicidas, nematocidas, insecticidas y fungicidas. El desarrollo de los ensayos de bombeo de la faringe descritos aquí pueden ser mejorados mediante la adición de polímero soluble en agua al medio de ensayo con el objeto de incrementar la viscosidad del medio de ensayo. Tipos preferidos de polímero son carboximetilcelulosa, polietilenglicol (especialmente PEG8000) y agarosa de bajo punto de fusión. Para cualquier tipo dado de polímero, el tipo de ensayo de bombeo de faringe, la concentración óptima de polímero agregado al medio puede determinarse a través de experimentos de rutina. De conformidad con lo ilustrado en las figuras 14 y 15 anexas, la adición de un polímero para incrementar la viscosidad del medio de ensayo resulta en un bombeo de faringe incrementado en C. elegans . Se cree que el uso de un más viscoso puede imitar las condiciones más sólidas en las cuales vive naturalmente C. elegans . El desempeño de tamices de faringe puede también ser mejorado mediante la adición de un polímero soluble de agua al medio de ensayo en una concentración suficiente para prevenir que los gusanos nematodos se adhieran sobre las paredes de la placa de pozos múltiples. Tipos preferidos de polímeros son polietilenglicol, particularmente PEG8000, PVA y PVP, prefiriéndose especialmente PEG8000.para cualquier tipo dado de polímero y tipo de ensayo de bombeo de faringe, la concentración óptima de polímero que se agrega al medio puede ser determinada por experimento de rutina. En el caso de PEG8000, se prefiere particularmente una concentración de 0.1%. Los inventores han observado que la adición de PEG al medio de ensayo en el ensayo de bombeo de faringe resulta en una calidad incrementada, lo que se debe principalmente a una reducción en cuanto al número de individuos muertos o dañados. Durante el establecimiento del ensayo, los nematodos deben ser divididos entre los diferentes pozos y placas, ya sea manualmente o bien utilizando sistemas automatizados. Durante estas manipulaciones de los nematodos, existe el riesgo que el gusano se adhiera a la pared de la pipeta o de otra herramienta. El flujo del medio en el cual el nematodo est{a suspendido puede entonces resultar en la muerte del gusano. Uno puede llegar a la conclusión que la adición de PEG8000 al medio resulta en un mayor bombeo y una variación menor en cuanto al ensayo de bombeo de faringe (véase figura 10) . En una modalidad adicional de la invención, el paso de detectar una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos empleando medios de detección no visuales incluye la detección de cambios en los niveles intracelulares de iones, metabolitos, o mensajeros secundarios en células de los gusanos nematodos. En esta modalidad particular de la invención, la actividad de una sustancia química no es detectada indirectamente mediante la medición de una señal a partir de una molécula de marcador, sino mediante la medición de la actividad de un sensor genéticamente codificados cuyas propiedades son alteradas en presencia de iones específicos, metabolitos específicos o mensajeros secundarios. Por ejemplo cambios en niveles intracelulares de Ca2+ pueden ser detectados utilizando moléculas de sensor de calcio codificadas genéticamente GFP-calmodulina o aecuorina. Se sabe que GFP-calmodulina es fluorescente en presencia de iones calcio. Así, cuando ios niveles de calcio intracelulares son bajos, no se puede detectar fluorescencia pero si los niveles de calcio se incrementan el calcio se une a la GFP-calmodulina provocando un cambio de conformación que resulta en una molécula fluorescente que puede ser detectada, por ejemplo, empleando un lector de placa de pozos múltiples. Otras moléculas de sensor genéticamente codificadas pueden emplearse cuyas propiedades fluorescentes o luminiscentes son alteradas en presencia de mensajeros secundarios tales como, por ejemplo cAMP, diacilglicerol o bien trifosfatos de inositol (IP3) . De preferencia este aspecto de la invención es efectuado utilizando C. eiegans transgénicos que expresan el sensor codificado genéticamente en todas las células, o bien en tejidos específicos, o bien en células seleccionadas. Esto puede lograrse a través del uso de promotores específicos para tejido o promotores específicos para tipos de células con actividad adecuada. El método puede ser efectuado empleando gusanos transgénicos que expresan GFP-calmodulina en células/tejidos del nematodo que son sensibles a la señalización de calcio, incluyendo células de la faringe, músculos de la vulva, músculos de la pared muscular y neuronas. Como ejemplos previos, el gusano transgénico puede ser con antecedentes genéticos de tipo silvestre, una cepa transgénica mutante o una cepa humanizada. Puesto que los niveles de calcio intracelular en las células de la faringe se correlacionan con el régimen de bombeo de la faringe, la fluorescencia detectada en nematodos transgénicos que expresan GFP-calmodulina en esta células es una indicación del régimen de bombeo de la faringe y estos gusanos transgénicos pueden también ser utilizados para tamizar substancias químicas que influencian el régimen de bombeo de la faringe. En una modalidad adicional de la invención, el paso de detectar una señal que indica un cambio fenotípico, fisiológico, de comportamiento o biológico en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales incluye la detección de cambios en el comportamiento de movimiento de los gusanos nematodos.
Gusanos nematodos colocados en un cultivo líquido se desplazarán de tal manera que mantengan una distribución más o menos regular (o bien homogénea en el cultivo) . Gusanos nematodos que son defectuosos en cuanto a movimiento se precipitarán hacia el fondo en el cultivo líquido. Debido a esta característica de los gusanos nematodos como resultado de su fenotipo de movimiento, es posible monitorear y detectar la diferencia entre gusanos nematodos qué se mueven y nematodos que no se mueven. El movimiento de los gusanos nematodos es principalmente el resultado de la acción de los músculos de la pared corporal y es regulado por la actividad neuronal. Por consiguiente, tamices basados en la detección de un comportamiento de movimiento alterado pueden ser desarrollados con el objeto de identificar substancias químicas que pueden tener un efecto sobre la actividad muscular y/o neuronal. Lectores de placa de pozos múltiples avanzados pueden detectar subregiones de las paredes de placas de pozos múltiples. Mediante la utilización de estos lectores de placas, es posible efectuar mediciones en áreas seleccionadas de la superficie de los pozos de las placas de pozos múltiples. Si el área de medición es centralizado de tal manera que solamente la parte media del pozo es medida, se puede observar una diferencia en cuanto a la autofluorescencia de nematodos (fluorescencia que ocurre en ausencia de una molécula de marcador externa) o bien densidad óptica en los pozos que contienen los nematodos que se desplazan normalmente en comparación con pozos que contienen nematodos que son defectuosos para el movimiento. En caso de los pozos que contienen los nematodos que se desplazan normalmente, se observará un nivel bajo de autofluorescencia o densidad óptica, mientras que se podrá observar un nivel alto de autofluorescencia o densidad óptica en los pozos que contienen los nematodos que son defectuosos para el movimiento. La densidad óptica se mide empleando una variación del ensaño de agregación plaquetaria, lo que es bien conocido por parte de los expertos en la materia. Utilizando el dispositivo de revelado MRX de Dynex (Estados Unidos de América) se puede medir la densidad óptica en puntos múltiples por pozo, mostrando el patrón de precipitación de los nematodos. En una adaptación del ensayo de movimiento, la medición de la autofluorescencia o la medición de densidad óptica puede tomarse en dos áreas de la superficie del pozo, una medición en el centro del pozo, una medición en el borde del pozo. Comparando las dos mediciones se obtienen resultados análogos como en el caso en el cual solamente se mide el centro del pozo pero la medición adicional del borde del pozo resulta en un control adicional y resultados relativamente diferentes. El ensayo de movimiento puede ser empleado para los mismos propósitos que el ensayo de bombeo de faringe descrito arriba, es decir, el ensayo de movimiento puede ser utilizado para identificar substancias químicas que alteran el comportamiento de movimiento del nematodo y por consiguiente pueden tener un efecto sobre , la actividad muscular y/o neuronal, para la identificación de incre entadores, supresores y moduladores genéticos de un compuesto seleccionado que tiene un efecto conocido sobre gusanos nematodos .o bien para la identificación de substancias químicas que son incrementadores, supresores o moduladores de un compuesto seleccionado. Substancias químicas que son identificadas empleando el ensayo de movimiento como teniendo un efecto sobre el comportamiento de movimiento de gusanos nematodos (se resume en la tabla 10) se encuentran generalmente en la clase de fármacos relacionados con el sistema nervioso central pero incluyen también antagonistas de GABA, antagonistas de NMDA, antagonistas de m-Glu y antagonistas adrenérgicos. El ensayo de movimiento se basa en el principio que los nematodos en movimiento permanecerán suspendidos en el medio mientras que los nematodos que no se desplazan se hundirán hacia el fondo del pozo. Esa diferencia en cuanto a la ubicación de los nematodos resulta en una diferencia de densidad óptica cuando se mide centralmente en el pozo como se describió arriba. Aún cuando los gusanos en movimiento permanecen diluidos en el medio, tienden a hundirse con el paso del tiempo como resultado de la atracción de la gravedad. Los inventores han observado que este problema puede ser superado con la adición de un polímero al medio líquido con el objeto de incrementar la viscosidad del medio. La viscosidad incrementada permite una resistencia mayor al gusano en movimiento y por consiguiente "una mejor suspensión en el medio. Los inventores han probado variantes de viscosidad baja, media y alta de carboximetilcelulosa (de Sigma, St. Louis, Mo, Estados Unidos de América y descrito arriba) para determinar condiciones óptimas para el ensayo de movimiento. Una concentración de carboximetilcelulosa de viscosidad media al 0.3% fue determinada como concentración óptima. Este efecto sin embargo no se limita a la carboximetilcelulosa y una mejora similar en cuanto al ensayo de movimiento puede lograrse utilizando otros tipos de polímeros soluble en agua, por ejemplo agarosa de bajo punto de fusión, PEG etc. la concentración precisa de polímero que se utiliza en cualquier ensayo dado depende evidentemente del tipo específico de ensayo que se desea efectuar; si la concentración de polímero es demasiado baja, la viscosidad del medio será insuficiente, si la concentración de polímero es demasiado alta, el resultado será la formación de un gel, impidiendo que los gusanos que no mueven caigan hacia el fondo durante el ensayo. Para un tipo dado de polímero y un tipo dado de ensayo, la concentración de polímero que se requiere para un desempeño óptimo del ensayo pueden ser determinados fácilmente a través de un experimento de rutina. El efecto de la viscosidad sobre el ensayo de movimiento ha sido determinado para varios mutantes de C. elegans en un estudio comparativo cuyos resultados están ilustrados en las figuras 12 y 13, en este estudio mutantes C. elegans Une y Ace que tienen defectos de movimiento fueron comparados entre ellos y con C. elegans de tipo silvestre N2 en medio M9 y en medios con varias viscosidades. Los resultados de este experimento muestran que las concentraciones media a elevada de carboximetilcelulosa mejoran el ensayo de movimiento. El desempeño de los ensayos de movimiento descritos aquí puede ser mejorado adicionalmente mediante la adición de un polímero soluble en agua al medio de ensayo en una concentración suficiente para prevenir que los gusanos nematodos se adhieran sobre las paredes de la placa de pozos múltiples. Tipos preferidos de polímeros son polietilenglicol, particularmente PEG8000, PVA y PVP, prefiriéndose especialmente PEG8000. Para cualquier tipo dado de polímero y para cualquier tipo dado de ensayo de movimiento, la concentración óptima de polímero que se agrega al medio puede se determinada por experimento de rutina. En el caso de PEG8000, se prefiere particularmente una concentración de 0.1%. Como en el caso de otros métodos de tamizado descritos aquí, los métodos de ensayo de movimiento se efectúan de preferencia utilizando gusanos nematodos microscópicos, especialmente los del género Caenorhabditis y muy especialmente C. elegans . El ensayo de movimiento puede ser efectuado utilizando cultivos de gusanos sincronizados en diferentes etapas de crecimiento, empleando gusanos machos, hermaf oditos o dauers o bien utilizando gusanos mutantes transgénicos o humanizados. Una cepa de C. elegans mutante, la ace-1, ace-2 mutante doble es particularmente adecuada para su uso en ensayos de movimiento. Esta cepa no muestra ningún movimiento y tiene un fenotipo de tipo espasmo. Puede por consiguiente emplearse para tamizar substancias químicas que rescatan el fenotipo de movimiento defectuoso. Estas substancias químicas pueden tener un efecto farmacológico sobre la actividad muscular y/o neuronal. En otra modalidad de la presente invención, el paso de detectar una señal que indica un cambio fenotípico, fisiológico, de comportamiento o bioquímico en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales comprende la detección de cambios en el comportamiento de acoplamiento de los gusanos nematodos. ' El comportamiento de acoplamiento de los nematodos tales como C. elegans es muy complejo, involucrando por lo menos los siguientes pasos: reconocimiento, soporte, ondulación de la cola, ubicación de la vulva y copulación. Para efectuar este comportamiento, el nematodo macho tiene por lo menos 41 músculos adicionales especializados, 79 neuronas adicionales, 36 células de soporte neuronal adicionales, 23 células protocdeales y 16 células hipodérmicas asociadas con estructuras de acoplamiento. La función de algunas de las neuronas ha sido descrita. Así mismo varios mutantes han sido descritos que presenta defectos en cuanto al comportamiento de acoplamiento (C. elegans II, ibid; J. Sulton et al., W13G 7(2) 22; Loer and Kenyon WBG 12(2).80, 1992; Handju et al., International wor meating abstract (resumen de la junta internacional sobre gusanos) 15 1, 199 1) . Debido a la naturaleza ' compleja del comportamiento de acoplamiento, varias condiciones y mutantes han sido descritos para incrementar el comportamiento de acoplamiento en C. elegans .
Una de estas condiciones es el uso de hermafroditos con un movimiento disminuido, como por ejemplo el mutante unc-52 (e44) que muestra un comportamiento paralizado en la etapa adulta. Puesto que el acoplamiento involucra la actividad tanto de músculos como de neuronas, tamices basados en la detección de cambios en el comportamiento de acoplamiento de gusanos nematodos (el ensayo de acoplamiento) pueden emplearse para identificar substancias químicas que pueden modular la actividad muscular y/o neuronal. El ensayo de acoplamiento puede ser empleado para aislar sustancias química que modulan el acoplamiento, o bien para aislar substancias químicas que modulan la actividad de un compuesto que afecta el comportamiento de acoplamiento, o bien para aislar genes y vías que son activas en el comportamiento de acoplamiento, o bien para aislar genes y vías que modulan la actividad de un compuesto que afecta el comportamiento de acoplamiento. En otras palabras, el ensayo de acoplamiento puede ser empleado para los mismos propósitos que los ensayos de bombeo de la faringe y ensayos de movimiento descritos arriba. C. elegans no pueden efectuar acoplamiento en medio líquido. Los tamices de alto rendimiento basados en comportamiento de acoplamiento se efectúan por consiguiente en condiciones semilíquidas . Una solución de agarosa de bajo punto de fusión de aproximadamente 0.05* es adecuada para este propósito. Este medio semilíquido proporciona un soporte suficiente para los nematodos para que se desplacen uno hacia el otro y para que efectúen el acoplamiento. La adición de otros polímeros para obtener un medio adecuadamente viscoso puede también utilizarse en el ensayo de acoplamiento. El desempeño de acoplamiento se mide mediante la medición del número de huevos por crías que se producen a partir de un experimento de acoplamiento. En una modalidad particular de la invención, se emplean cepas específicas que no pueden generar crías por autofertilización. Estos hermafroditos conocidos como "no autoreproductores" no pueden generar crías, pero hermafroditos que se han acoplado generan crías. Las crías pueden ser determinadas directamente a través de la prueba de movimiento descrita previamente, o bien se puede agregar un colorante marcador al medio como por ejemplo calceína-AM de tal manera que se pueda efectuar el tamiz de bombeo de faringe descrito previamente. Alternativamente, anticuerpos específicos y anticuerpos fluorescentes pueden ser empleados para detectar las crías. Cualquier anticuerpo específico que reconoce solamente huevos o bien solamente gusanos en las etapas Ll o L3 o L4, reconocerá solamente crías a título de ejemplo un anticuerpo que reconoce el antígeno en la superficie de las larvas en etapa Ll de C. elegans ha sido descrito por He mer et al., (1991) J Cell Biol, 115(5) : 1237-47. Finalmente, el número de huevos o crías en cada pozo puede ser contado directamente utilizando un dispositivo FANS. En otra modalidad de la invención los gusanos machos o bien los gusanos hermafroditas pueden ser gusanos transgénicos que expresan una molécula de marcador de manera estable, como por ejemplo una proteína fluorescente autónoma (GFP o BFP) o bien un marcador luminiscente en algunos tipos de células o bien en la totalidad de los tipos de células. Las crías generadas del acoplamiento de estos gusanos transgénicos expresarán también la molécula de marcador y por consiguiente serán fácilmente medidas utilizando un lector de placas de pozos múltiples c bien un dispositivo FANS. En el caso en el cual • los gusanos machos son los gusanos transgénicos que expresan el marcador entonces los hermafroditas no requieren de ser "no autoreproductores" puesto que solamente las crías que resultan del acoplamiento de machos y hermafroditos expresarán el marcador mientras que crías generadas a partir de la autofertilización de hermafroditas no contendrán la molécula de marcador. Por consiguiente, se puede distinguir las crías que resultan de acoplamiento y las crías que resultan de autofertilización. En el caso en el cual el gusano hermafrodita es la cepa transgénica que expresa la molécula de marcador, la cepa hermafrodita es de preferencia también una cepa "no autoreproductora" . El ensayo de acoplamiento puede también efectuarse C. elegans en donde la función de una neurona específica para machos involucrada en el comportamiento de acoplamiento es trastornada. Los ejemplos incluidos aquí proporcionan una lista de neuronas específicas para machos involucradas en comportamiento de acoplamiento. La función de una o varias de estas neuronas puede ser trastornada, por ejemplo, mediante la expresión de uno de los genes tóxicos listados arriba con relación a los ensayos de bombeo de faringe. Mediante la utilización de C. elegans que tienen defectos en una o varias neuronas específicas, es posible efectuar tamices para identificar substancias químicas que actúan en una vía de señalización neuronal específica. Las substancias químicas •identificadas empleando tales tamices pueden tener una actividad farmacológica relacionada con el sistema nervioso central . El ensayo de acoplamiento puede ser efectuado también utilizando C. elegans transgénicos que presentan un comportamiento de acoplamiento alterado como resultado de la expresión de un gen tóxico en un tejido específico o en un tipo específico de células. C. elegans trangénicos adecuados pueden ser construidos de conformidad con técnicas estándares conocidas empleando uno de los genes tóxicos listados arriba bajo el control de un promotor apropiado específico para tipo de tejido o tipo de células. Promotores que pueden ser útiles para este propósito incluyen el promotor her-1 P2 que dirige la expresión de genes en CP9, el promotor mab-18 (empalme alternativo de vab-3 homólogo de pax-6) que dirige la expresión de gen en ray6 y el promotor spe-Tl que dirige la expresión de gen en 60 células de la espermateca. En otra modalidad adicional de la invención, el paso de detección de una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos mediante la utilización de dispositivos de detección no visuales comprende la detección de cambios en el comportamiento de puesta de huevos de los gusanos nematodos. La vulva de los nematodos C. elegans hermafroditas contiene por lo menos 24 células y varis neuronas, de las cuales las neuronas HSN se consideran como las más importantes en la puesta de huevos. Además por lo menos 8 músculos uterinos han sido descritos. Varios mutantes han sido descritos en desarrollo de gónada, puesta de huevos, desarrollo y función de la vulva (The nematode Caenorhabditis elegans (el nematodo Caenorhabditis elegans) ibid.; C. el egans II, ibid.). por consiguiente, ensayos de tamizado de alto rendimiento pueden ser desarrollados los cuales utilizan una lectura basada en la detección de cambios en el comportamiento de puesta de huevos de nematodos tales como C. elegans . Otra vez ensayos basados en la detección de la puesta de huevos pueden ser empelados para los mismos propósitos que los ensayes de bombeo de faringe y movimiento descritos aquí. En estos ensayos, el número de huevos puestos es detectado mediar-te el conteo de los números de crías resultante utilizando las técnicas descritas para el ensayo de acoplamiento. Los ensayos de puesta de huevos y los ensayos de acoplar.iento se basan en la medición de los huevos y de las crías. En ciertas modalidades, la cantidad de huevos puede ser medida mediante la aplicación de anticuerpos específicos para los huevos, y la tinción de contador con colorantes específicos para los anticuerpos que reconocen los huevos como se sabe en la técnica. En modalidades adicionales, los métodos pueden comprender la detección de número de huevos producidos con el uso de colorantes específicos que reconocen la cascara de huevo. En una modalidad específica, la detección del número de huevos en un pozo se efectúa utilizando un colorante que reconoce una sustancia liberada durante la salida del cascarón. Durante el proceso de salida del cascarón, la enzima quitinasa es liberada en el medio. La enzima reconoce el sustrato 2-D-N,N,N, -triacetilquitotriosido de 4-metilumbeliferilo (0 bien beta-D-N,N'-diacetilquitobiosido de 4-metilumbeliferilo) que es una molécula de precursor fluorescente (suministrada por Sigma, St. Louis, MO) . La hidrólisis del sustrato sintético triacetilquitotriosido de 4-metilumbeliferilo es seguida por la medición de la fluorescencia de la 4-metilumbeliferona liberada en un lector de placa de microtitulación. Otros sustratos que comprende un colorante, que puede ser un colorante luminiscente, fluorescente o colorido, ligado a una porción quitina pueden emplearse en dicho tamizado. Un ejemplo de esto es resorufina n-acetil-2-glucosaminida o bien CM-DCF-NAG proporcionado por Molecular Probes, Eugene, OR, o bien proporcionada por Sigma. Ensayos de puesta de huevos utilizando sustratos de quitinasa pueden ser efectuados utilizando la siguiente metodología general: coloque 30 nematodos en una placa de microtitulación en 80 µl de medio M9. Agregue el compuesto a probar en una concentración apropiada en 10 µl. Agregue el sustrato de quitinasa en una concentración apropiada en 10 µl . Mida la fluorescencia, luminiscencia o formación de color en varios intervalos de tiempo. Los resultados de experimentos típicos se muestran en las figuras 16 y 17, los cuales indican claramente que el incremento del intervalo de tiempo resultan en mejoras lecturas. En otra modalidad adicional de la invención, el paso de detección de una señal que indica un cambio fenotípico, fisiológico, de comportamiento o bioquímico en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales comprende la detección de un cambio en el comportamiento de defecación de los gusanos nematodos. La defecación en cuanto a nematodos tales como C. elegans se logra mediante la activación periódica de una secuencia estereotipada de contracciones musculares. Estas contracciones empiezan en los músculos de la pared anterior del cuerpo. En el cénit de las contracciones del cuerpo anterior, los cuatro músculos anales se contraen también. Los cuatro músculos anales o entéricos son los dos músculos intestinales, el depresor anal y el esfínter anal. Además de esta serie de contracciones muscular, neuronas específicas están también involucradas en la regulación de la defecación, incluyendo las neuronas motoras, AVL y DVB. Puesto que la defecación requiere de la actividad tanto de músculos como de neuronas, se pueden desarrollar ensayos de tamizado de alto rendimiento que emplean lectura basada en la detección de cambios en el comportamiento de defecación de nematodos tales como C. elegans . Otra vez, ensayos basados en la detección de la defecación pueden ser utilizados para los mismos propósitos que los ensayos de bombeo de faringe y movimiento descritos aquí. El ensayo de defecación se efectúa de preferencia utilizando mutantes de C. elegans que tienen un comportamiento de defecación defectuoso y particularmente con mutantes de C. elegans constipados. Varios mutantes con todos tipos de defectos en el ciclo de defecación han sido reportados (Thomas, Genetics 124: 855-872, 1990; Iwasaki et al., 141: 961-976, 1995) . Sin embargo, el ensayo de defecación puede también ser efectuado utilizando gusanos de tipo silvestre o bien gusanos sin defectos de defecación lo que permite el tamizado de compuestos que son inhibidores de la defecación. Puesto que la defecación en C. elegans requiere de la actividad de músculos y de neuronas, compuestos que alteran el régimen de defecación pueden tener potencialmente una actividad farmacológica relacionada con el sistema nervioso central. El régimen de defecación de nematodos tales como C. elegans puede ser medido fácilmente utilizando una molécula de marcador sensible al pH, por ejemplo, el marcador fluorescente BCECF. Esta molécula de marcador puede ser cargada en el intestino de C. elegans en forma del precursor BCECF-AM que no es fluorescente per se. Si se agrega BCECF-AM al medio en los pozos de la placa de pozos múltiples, los gusanos absorberán el compuesto que es después disociado por las esterasas presentes en el intestino de C. el egans . La fluorescencia de BCECF es sensible al pH y en condiciones de pH relativamente bajo en el intestino de C. elegans (pH<6) , el compuesto no presenta ninguna fluorescencia o bien una fluorescencia muy limitada. Como resultado del proceso de defecación, el BCECF es expulsado en el medio que tiene un pH más alto que el intestino de C. elegans y el BCECF es por consiguiente fluorescente. El nivel de fluorescencia de BCECF en el medio (medio empleando un lector de placa de pozos múltiples en ajustes Ex/Em=485/550) es por consiguiente un indicador del régimen de defecación de los nematodos, La defecación puede también ser medida utilizando un método basado en las características luminiscentes de la quelación de los lantánidos tales como terbio en presencia de un grupo aromático como por ejemplo aspirina. El método requiere de dos pasos de precarga, primero los pozos de una placa de pozos múltiples son precargados con aspirina conjugada con un quelador como por ejemplo DTPA (antes de la adición de los gusanos nematodos) y segundo, bacterias y otras partículas fuente de alimento para nematodos son precargadas con terbio utilizando técnicas estándares conocidas. Se colocan después C. elegans en los pozos precargados con aspirina conjugada con un quelador como por ejemplo DTPA y los gusanos son alimentados con las bacterias previamente cargadas con terbio. El terbio presente en las bacterias previamente cargadas agregadas a los pozos resulta en un nivel bajo de luminiscencia de fondo. Cuando las bacterias son comidas por los nematodos, el contenido bacteriano será digerido pero el terbio será defecado en el medio. El terbio libre será después quelado por la aspirina previamente cargado en los pozos lo que resulta en una luminiscencia medible. La luminiscencia observada de esta forma es por consiguiente un indicador de la defecación de nematodos . Un método adicional para detectar la defecación se basa en queladores de lantánidos esterificados. Este método es esencialmente similar al método descrito arriba para detectar la defecación por quelación de terbio por aspirina. La ventaja principal del método de quelación de lantánidcs es que el quelador no tiene que ser revestido en los pozos sino que puede eer agregado al medio líquido en donde se coloca el nematodo . Los lantánidos son metales de tierras raras de los cuales se saben que presentan una fluorescencia de larga duración cuando son quelados en presencia de un grupo aromático. Lantánidos bien conocidos son Europio y Terbio; un queiador típico es el ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA) . El ensayo se basa en el principio que un DTPA esterificado no puede quelar el terbio. Después de la ingesta por C. elegans dicho quelador esterificado será procesado por las esterasas intestinales. Al ser liberado por defecación, quelará fácilmente el terbio, permitiendo así la detección utilizando fluorescencia revelado en el tiempo, como se sabe en la técnica. Este método permite la detección de cantidades muy pequeñas de material. Cuando es adaptado para un tiempo de incubación corto, el método puede permitir el monitoreo de defectos en el proceso de defecación. La invención se explicará adicionalmente con referencia a los ejemplos experimentales siguientes juntos con las figuras anexas en las cuales: La figura 1 es una perspectiva general de las neuronas y de los transmisores de los cuales se saben que tienen una influencia directa sobre el régimen de bombeo de la faringe de C. elegans . La figura 2 muestra un ejemplo de la detección de incrementadores del régimen de bombeo de la faringe de C. elegans, utilizando una lectura fluorescente. La figura 3 muestra un ejemplo de la detección de inhibidores del régimen de bombeo de la faringe de C. elegans utilizando una lectura fluorescente. La figura 4 muestra curvas de dosis-respuesta para los inhibidores tamoxifeno, BP554 y pimazida. La figura 5 muestra una curva dosis-respuesta para el realzador clomipramina, mostrando el efecto tóxico de DMSO.
La figura 6 muestra una curva dosis-respuesta para tapsigargina que muestra el efecto realzador en concentraciones altas y el efecto inhibidor en concentraciones altas. La figura 7 ilustra el principio del ensayo de movimiento.
La figura 8 ilustra los principios de selección de sustrato químico y selección de antagonista utilizando el tamiz de movimiento . La figura 9 muestra los resultados de un ensayo de movimiento representativo que ilustra el cambio de autofluorescencia de nematodos (eje y) con el tiempo (eje x) . La figura 10 ilustra el resultado de un experimento para mostrar el efecto de PEG8000 sobre el desempeño del ensayo de bombeo de faringe. 100 gusanos (cepa HD8) fueron incubados durante 3 horas en presencia de 0.5 uM de calceína-m. fueron manejados con o sin adición de PEG 0.1%. La figura 11 ilustra los resultados de experimento para mostrar el efecto de la viscosidad del medio sobre el desempeño del ensayo de movimiento. La figura 12 y la figura 13 ilustran el efecto de la viscosidad del medio sobre el desempeño del ensayo de movimiento para varios mutantes de C. eiegans en un estudio comparativo. 100 gusanos fueron encubados en una placa de microtitulación con fondo redondo. Se midió la densidad óptica en 340 nm en varios medios viscosos (M9, carboximetilcelulosa de viscosidad media y carboximetilcelulosa de viscosidad alta) . Las mediciones fueron efectuadas por triplicado. Las figuras 14 y 15 ilustran el efecto de la viscosidad del medio sobre el tamiz de bombeo de la faringe. N2 + MC indica gusanos de tipo silvestre en el medio que contiene carboximetilcelulosa. Las figuras 16 y 17 ilustran las características cinéticas de los ensayos de puesta de huevos utilizando gusanos N2 con base en la detección de la actividad quitinasa empleando un sustrato fluorescente. Los ensayos fueron efectuados en presencia de varias concentraciones de clomipramina y fluoxetina, respectivamente. Las figuras 18 a 21 ilustran el efecto de compuesto de actividad insecticida conocida sobre el régimen de bombeo de la faringe de C. e-Iegans. La figura 18 - pricotoxina, Figura 19 - Rotenona, Figura 20 - Dieldrina, Figura 21 Ivermectina. Una reducción del régimen de bombeo de la faringe al exponerse al insecticida se observa claramente. Ejemplo 1 Distribución de Nematodos y Dilución de Compuestos El protocolo básico para efectuar un tamizado utilizando el método de la invención se describe para placas de pozos múltiples con 96 pozos, pero otras placas de pozos múltiples con 6, 12, 24, 384 0 1536 pozos podrían emplearse. De preferencia, se utilizan gusanos sincronizados. La producción de grandes cantidades de gusanos sincronizados ha sido descrita en Methods in cell biology (métodos de biología celular) Vol. 48, ibid. después del crecimiento de los gusanos hasta llegar a la etapa preferida, dichos gusanos son lavados en amortiguador M9 antes de utilización adicional, y resuspendidos en un amortiguador de ensayo (40 mM NaCl, 6mM Kcl, lmM CaCl;, lmM MgCl2) . (10 x amortiguador M9: 30 g KH2P04, 60 g Na2HP04, 50 g NaCl, 10 ml MgS04 1M, hasta un 1 litro con H0) . Otros amortiguadores diferentes del amortiguador M9 pueden ser adecuados para este propósito. Los gusanos son después diluidos y resuspendidos en agar semisuave (concentración final de agarosa de bajo punto de fusión 0.25% en amortiguador M9) . Este procedimiento resulta en una suspensión igual, homogénea y estabilizada de los nematodos. Polímeros otros que agarosa de bajo punto de fusión pueden emplearse en este procedimiento. La presencia de una suspensión homogénea de gusanos facilita la distribución igual de los gusanos en las placas de pozos múltiples, pero no es un aspecto esencial para el ensayo de tamizado descrito. Cualquier otro método que resulte en una distribución homogénea de los gusanos nematodos en los pozos será útil. Más específicamente,' el uso de un surtidor de gusanos resultará en una distribución todavía mejor y por consiguiente más igual de los gusanos en los pozos de la placa de pozos múltiples. Los gusanos son distribuidos en las placas de pozos múltiples empleando pipetas electrónicas de 8 canales . En un arreglo preferido de este experimento, se agregan 40 +/- 5 gusanos a cada pozo de la placa de microtitulación. Las substancias química se vuelve solubles en DMSO. Cualquier otro solvente puede ser empleado para este propósito, pero la mayoría de las substancias químicas seleccionadas parecen ser solubles en DMSO. La sustancia química se agrega en los pozos en varias concentraciones pero de preferencia en una concentración entre tres y 30 µM se selecciona puesto que una concentración de este tipo proporciona los resultados más claros. Es posible tamizar para efectos de dosificación variando la concentración de la sustancia química de menos que 1 µM hasta 100 µM. La concentración de DMSO no debe ser excesivamente elevada y de preferencia no debe rebasar ei 1%, ' con mayor preferencia la concentración del DMSO no debe rebasar el 0.5% y con preferencia aun mayor, la concentración de DMSO es menor que 0.3%. Ejemplo 2 Condiciones para un Ensayo de Bombeo de la Faringe Según el ensayo específico que se desea efectuar, se pueden emplear cepas diferentes de C. elegans . Tamizados para seleccionar substancias químicas que inhiben el régimen de bombeo de la faringe de C. eiegans se efectúan generalmente con cepas mutantes de C. elegans que tienen una faringe que bombea constitutivamente. Gusanos de tipo silvestre pueden también ser empleados en este tamizado, pero se prefieren los gusanos murantes. Otros mutantes de C. el egans pueden ser empleados en este tamizado par seleccionar inhibidores del bombeo. C. elegans mutantes seleccionado con la faringe de bombeo constitutivo bombea el medio en el intestino a un régimen constante y reducción/rescate de este fenotipo puede ser calificado fácilmente, lo que facilita la detección y selección de substancias químicas. Para seleccionar substancias químicas que incrementan el bombeo de la faringe de C. elegans, el tamizado es efectuado generalmente utilizando gusanos C. eiegans de tipo silvestre pero otros mutantes podrían ser empleados en este tamiz. Gusanos de tipo silvestre no bombean ni muestran un régimen de bombeo reducido en un medio líquido que no contienen ninguna fuente de alimentos puesto que la fuente de alimentos es una de las señales para inducir el bombeo de la faringe. Puesto que los gusanos de tipo silvestre muestran un régimen de bombeo reducido en este ensayo, el increme'nto del régimen de bombeo puede ser fácilmente calificado. El régimen de bombeo de la faringe se mide indirectamente mediante la adición de un precursor de molécula de marcador como por ejemplo calceína-AM al medio y mediante la medición de la formación de colorante de marcador en el intestino de C. elegans. La calceína-AM es disociada por esterasas presentes en el intestino de C. elegans para liberar calceína, que es una molécula fluorescente. El régimen de bombeo de la faringe determinará la cantidad de medio que penetra en el intestino del gusano, y por consiguiente la cantidad de calceína-AM que penetrará en el intestino del gusano. Por consiguiente, mediante la medición de la acumulación de calceína en el intestino de nematodo, detectable por fluorescencia, es posible determinar régimen de bombeo de la faringe. Substancias químicas "que alteran el régimen de bombeo de la faringe resultarán en una absorción mayor o menor de calceína-AM y por consiguiente en una señal más o menos fluorescente. Además, utilizando el lector de placa de pozos múltiples, la fluorescencia puede ser medida rápidamente y cuantitativamente, lo que resulta en un método de tamizado de alto rendimiento cuantitativo para la identificación de sustancias químicas con una actividad farmacológica potencial . Para efectuar el tamizado de bombeo de faringe con calceína-AM, se agrega al medio una concentración entre 1 y 100 µM de calceína-AM. De preferencia, se emplea de 5 a 10 µM de calceína-AM. La fluorescencia es medida empleando un lector de placa de pozos múltiples (Victor, Wallac Oy, Finlandia) con los siguientes ajustes: Ex/Em = 485/530. Esta medición del régimen de bombeo de la faringe mediante la detección de la acumulación de una molécula de marcador no se limita a calceína-AM. Otro precursores pueden ser empleados y por consiguiente el ensayo descrito aquí puede ser cambiado de tal manera que sea adecuado para otros precursores. El precursor puede ser disociado por esterasas, pero puede también ser un sustrato para otras enzimas en el intestino del nematodo. Además, la molécula de marcador no necesariamente es una molécula fluorescente, sino que puede ser una molécula detectable por otros métodos. Muchas de estas substancias precursoras están disponibles en el comercio o bien podrían ser sintetizadas de conformidad con métodos conocidos en la técnica. Algunos ejemplos son: Con una lectura de fluorescencia: sustratos de esterasas: calceína-AM, FDA, BCECF-AM sustratos de fosfatasa alcalina: difosfato de fluoresceina (FDP) endoproteasas; sustratos de aminopeptidasa: CMB-leu con una lectura de luminiscencia: sustratos de fosfatasa alcalina: AMPPD con una lectura de colar: - sustratos de glucuronidasa: X-gluc Otras enzimas blanco presentes en el intestino para las cuales se pueden encontrar o revelar sustratos son ADNasas ATPasas, lipasas y amilasas. Una reseña de varias moléculas de marcadores, especialmente fluorescentes, pueden, encontrarse en Handbook of fluorescente probes and research chemicals (manual de sondas fluorescentes y sustancias químicas de investigación) , Molecular Probes editado por R. P. Haughland. Ejemplo 3 Prueba de Ensayo de Bomba de Faringe con compuestos de la Farmacopea 160 fármacos bien conocidos seleccionados entre la Farmacopea fueron empleados en un tamizado para probar el desempeño del método de bombeo de la faringe. Los fármacos probados pertenecen a varias categoría, que incluyen analgésicos, antidiabéticos, antiarrítmicos, bloqueadores de los canales del calcio, diuréticos, inhibidores de la colinesterasa, inhibidores de la bomba de protones y antidepresivos. Los fármacos fueron distribuidos aleatoriamente en los pozos de dos placas de pozos múltiples de 96 pozos. El régimen de bombeo de la faringe de C. elegans fue medido empleado calceína-AM de conformidad con lo descrito en el ejemplo 2. La cepa de tipo silvestre de C. elegans N2 fue empleada para seleccionar realzadores del fenotipo de bombeo y una cepa mutante de C. elegans con una faringe de bombeo constitutivo fue empleada para detectar inhibidores de bombeo.
En un primer ensayo, la calceína-AM de sustrato fue agregada al medio al mismo tiempo que los gusanos y los compuestos. La fluorescencia fue medida después de aproximadamente 1 hora. En una variación de este protocolo, compuestos y gusanos se agregan al medio primero y se incuban durante aproximadamente 1 hora. Después de este periodo de incubación que permite que las sustancias químicas activen o inhiban el régimen de bombeo de la faringe, se agrega calceína-AM. Las placas fueron después incubadas adicionalmente durante una hora antes de la medición de la fluorescencia en el lector de placas de microtitulación. Aún cuando se seleccionaron un amplio rango de agentes químicos a partir de la farmacopea con varias acciones, la mayoría de los compuestos sino es que la totalidad de los compuestos que presentaron una actividad sobre el régimen de bombeo de la faringe pertenecen a la familia de los fármacos del sistema nervioso central, inhibidores de los canales del calcio y relajantes musculares, lo que indica que el ensayo de la faringe de C. elegans es un buen sistema de modelo para tamizar compuestos que tienen una actividad en las áreas descritas arriba. La variación del protocolo resultó en la detección de algunos compuestos nuevos, además de los compuestos que habían sido previamente detectados; estos compuestos nuevos incluyen las sustancias químicas metrifonato, fisostigmina, atropina, L-hyoscia ina, difenilhidantoina y ZAPA. Todos esos compuestos se conocen como fármacos para el sistema nervioso central o bien se emplean para tratar la enfermedad de Alzheimer o bien se emplean como fármacos antipsicóticos, antidepresivos o antiepilépticos. Ejemplo 4 Selección del Modo de Acción de un Compuesto y Selección de Compuestos que Actúan sobre Blancos Específicos Entre 14 tipos de neuronas faríngeas, por lo menos las neuronas 11, 12, 13, M3, MC, NSM, Ml, RIP y M4 son importantes para el bombeo de la faringe. Se sabe que las neuronas MC, M3, M4 y NSM regulan la contracción/régimen de bombeo de la faringe. Controlan respectivamente el régimen de bombeo, temporización de la relajación muscular, peristalsis del istmo y la percepción de alimento. Los neurotransmisores principales involucrados en la transducción de señales neuronales en el nematodo C. elegans son la acetilcolina y la serotonina, glutamato, octopamina, dopamina y GABA (The nematode Caenorhabditis elegans "El nematodo Caenorhabditis elegans" editado por W. B. Wood et al., CSHL press 1988, páginas 337-392) . A partir de los fármacos seleccionados en el tamizado básico de la faringe (ejemplo 3) resulta claro que el régimen de bombeo de la faringe es influenciado por inhibidores y agonistas de neurotransmisores y por compuestos que inhiben o incrementan los canales de calcio de la vía de neurotransmisores, canales del sodio/calcio, canales del cloruro. Estas sustancias químicas se emplean en un rango muy amplio de fármacos preescritos tales como antidepresivos, antipsicóticos, anxiolíticos, tranquilizantes, antiepilépticos, relajantes musculares, sedantes, fármacos antimigraña, analgésicos e hipnóticos. Algunos de estos fármacos relacionados con el sistema nervioso central (CNS) tienen aplicaciones en áreas de enfermedad tales como enfermedades genéticas relacionadas con el sistema nervioso central tales como enfermedad de parkinson y enfermedad de Alzheimer. Para tener una visón global de los fármacos actuales relacionados con el sistema nervioso central es mejor clasificarlos según su función bioquímica en la cascada de la vía de los neurotransmisores. En resumen, los fármacos relacionados con el sistema nervioso central pueden tener por lo menos influencia sobre una de las características siguientes de la vía: - Un fármaco para el sistema nervioso central puede tener influencia sobre los compuestos precursores, o bien puede ser una molécula precursora para la síntesis de un neurotransmisor . - Un fármaco para el sistema nervioso central puede incrementar, inhibir o modular la síntesis de un neurotransmisor - Un fármaco para el sistema nervioso central puede tener una función en el agotamiento del neurotransmisor. - Un fármaco para el sistema nervioso central puede prevenir o estimular la liberación del transmisor a partir de las vesículas sinápticas en la hendidura sináptica. Un fármaco para el sistema nervioso central puede funcionar como un inhibidor o estimulador de los receptores . Un fármaco para el sistema nervioso central puede imitar el transmisor. - Un fármaco para el sistema nervioso central puede funcionar como inhibidor o activador de la conducción. - Un fármaco para el sistema nervioso central puede funcionar como activador o inhibidor del bloqueo de la conducción. Un fármaco para el sistema nervioso central impide o estimula la reabsorción de transmisor después de la excitación de la neurona. - Un fármaco para el sistema nervioso central puede funcionar como un falso transmisor (+/-) . Además de estas características todas relacionadas con las vías de neurotransmisor, numerosos fármacos relacionados con el sistema nervioso central pueden encontrarse en las clases de bloqueadores de los canales del cloruro, bloqueadores de los canales del sodio/calcio, bloqueadores del calcio, y bloqueadores de otros canales de iones. Para tamizar los fármacos relacionados con el sistema nervioso central, varios ensayos de tamizado "In vitro" han sido desarrollados en la técnica anterior. Estos métodos de tamizado designados como "ensayos de enlace In vitro" o bien "sistemas de ensayo de transportador clonado" son bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Para estos ensayos, membranas celulares que contienen un tipo específico de receptor son aisladas de cultivo de tejido de mamífero o cultivos de tejido específico. En la mayoría de los casos, estas membranas son aisladas de células que expresan el receptor deseado. Según el tipo de receptor presente en la membrana, neurotransmisores tales como acetilcolina, dopamina, serotonina, glutamato, GABA y octopamina, pero también substancias hormonales tales como norepinefriña, adrenalina y otras son el tema del ensayo de tamizado. Cuando el ligando de receptor (que es el neurotransmisor en la mayoría de los casos) es marcado de manera radioactiva, es posible medir el número de enlace del ligando con el receptor. Condiciones experimentales pueden ser establecidas para comparar el número de enlace del ligando radioactivo con el receptor. Fármacos optativos para el sistema nervioso central y otras sustancias química pueden después ser aislados que alteran el enlace del ligando con el receptor. Numerosas variaciones de esta metodología han sido empleadas, algunas de las cuales pueden aislar compuestos que inhiben la reabsorción del ligando como por ejemplo serotonina, norepinefriña y dopamina (Koppel et al., Chem. Biol. 1995, Jul 2:7 483-7; Beique et al., Eur. J. Pharmacol. 1998, May 15 349:1 129-32) . Otros sistemas que han sido desarrollados 'para tamizar fármacos relacionados con el sistema nervioso central involucran tejidos aislados u órganos de mamíferos. Sistemas adicionales han sido descritos para aislar fármacos relacionados con el sistema nervioso central, con animales vivos tales como ratones. Aún cuando estos ensayos de tamizado pueden ser empleados para aislar antagonistas de neurotransmisores, estos ensayos "in vivo" no reflejan el efecto in vivo del compuesto aislado, puesto que solamente la asociación con el receptor deseado es monitoreada. Además para cada blanco potencial en la cascada de vía de neurotransmisores, se requiere del desarrollo de un "ensayo de enlace in vitro". Además, para algunos de blancos putativos para fármacos relacionados con el sistema nervioso central de conformidad con lo descrito arriba, no se han desarrollado ensayos o bien estos ensayos son difíciles de desarrollar o bien no es posible un tamizado de alto rendimiento. Todos los ensayos conocidos con tejido y modelos de animales adolecen también de este último problema. Además, los ensayos que emplean tejidos u órganos de animales involucran la necesidad de sacrificar un gran número de animales, y los métodos de tamizados basados en el uso de animales superiores, especialmente mamíferos, son cada vez más evitados debido a problemas de bienestar de los animales. La metodología de ensayo de bombeo de la faringe puede emplearse para determinar en qué vía de neurotransmisor un compuesto muestra actividad (acetilcolina, dopamina, serotonina, glutamato, octopamina, GABA, etc.) . Además, es posible determinar el modo de acción de sustancias químicas recién aisladas y tamizar selectivamente en una cierta vía para sustancias químicas con actividad farmacológica potencial. Un conjunto de mutantes de nematodos C. elegans ha sido construido los cuales son defectuosos en uno o varios genes. El defecto puede ser introducido de manera estable por tecnología estándar (es decir, bloqueo de genes) pero puede también ser introducido de manera transiente por tecnología de ARNi . Ambas técnicas son bien conocidas en el ámbito de la manipulación genética de C. elegans los genes afectados en los nematodos de este conjunto son genes que están involucrados en una o varias vías de neurotransmisor. Ejemplos de genes afectados son genes que codifican receptores de neurotransmisor tales como receptores muscarínicos, receptores de glutamato, receptores de hormonas, receptores de 5-HT, receptores canabinoides, receptores adrenérgicos, receptores dopaminérgicos, receptores opioides, receptores de GABA, receptores de adenosina, receptores de VIP, receptores nicotínicos, proteínas involucradas en la síntesis de neurotransmisores o vías de liberación de neurotransmisores y receptores acopladas con proteína G, genes que codifican proteínas para vías de segundo mensajero acoplado a proteína G tales como adenilatociclasa, proteinquinasa A, proteínas de base con elementos que responden a cAMP, fosfolipasa C, genes que codifican funciones en uniones de intervalo y genes que codifican canales de iones y bombas de iones . Estos mutantes son probados en un tamizado de bombeo de faringe de conformidad con lo descrito en los ejemplos previos y los resultados son almacenados por referencia. Compuestos que tienen un modo desconocido de acción son después probados en el tamizado de bombeo de la faringe y los resultados obtenidos son comparados con los resultados de referencia obtenidos a partir de los mutantes con el objeto de determinar el modo de acción o la vía del compuesto. Además de estos mutantes, se construyeron gusanos transgénicos. C. elegans puede ser manipulado para expresar genes humanos utilizando tecnología estándar (según lo descrito en Methods in Cell Biology (métodos en biología celular), Vol. 48). Otra vez, se pueden construir tanto nematodos transgénicos transciendes como nematodos transgénicos estables, y los métodos para la manipulación de expresión de transgenes heterólogos y homólogos en el nematodo C. elegans son bien conocidos dentro de este ámbito. Estos transgenes pueden ser expresados solamente en células de la faringe con el uso de promotores específicos para faringe, pero pueden también ser expresados solamente en las neuronas que afectan el régimen de bombeo de la faringe. Para tamizar y aislar sustancias químicas que son activas en el área de fármacos relacionados con el sistema nervioso central, los transgenes expresados en C. elegans transgénicos pueden codificar receptores de neurotransmisores tales como receptores muscarínicos, receptores de glutamato, receptores de hormona, receptores de 5-HT, síntesis de neurotransmisores, vías de liberación de neurotransmisores y receptores acoplados a proteína G. estos transgenes pueden ser secuencias de origen humano que codifican proteína. Por lo menos 400 receptores acoplados a proteína G han sido secuenciados hasta la fecha. Además, genes que codifican proteínas para vías de segundo mensajero acoplado a proteína G tales como adenilatociclasas, proteinquinasa A, proteínas de enlace con elementos que responden a cAMP, fosfolipasa C y genes que codifican funciones en uniones de intervalo y genes que codifican canales de iones y bombas de iones podrían ser expresados en la faringe o en las neuronas del nematodo. El C. elegans transgénico descrito arriba puede tener un antecedente genético de tipo silvestre o bien puede ser una cepa mutante de C. elegans . De preferencia, los gusanos son humanizados, lo que significa que un transgen que es una secuencia de ácido nucleico que codifica proteína de origen humano es expresado en un gusano tornado mutante para el gen de C. elegans que codifica la proteína correspondiente. Una lista extensa de mutantes que pueden ser adecuados para su uso en ensayos de bombeo de la faringe pueden encontrarse en C. elegans II, CSHL press y en Neurobiology of the C. elegans Genome (neurobiología del genoma de C. elegans) , C. I. Bargmann, Science 282:2028-2033. Una lista completa de proteínas G puede encontrarse en "the complete family of G-pro'teins genes of Caenorhabditis elegans", (la familia completa de genes de proteína G de Caenorhabditis elegans) Jansen G. et al., the Wor Breeders Gazette, Vol. 15(5), Feb. 1999. Algunos ejemplos de mutantes de C. elegans con mutaciones en genes que codifican componentes de vías de señalización neuronales aparecen a continuación. La expresión de transgenes que codifican el C. elegans correspondiente y proteínas humanas puede ser manipulado en C. elegans de tipos silvestre o bien en cepas de C. elegans mutantes que resultan en gusanos transgénicos y humanizados, respectivamente.
Tabla 1 Neurotransmisores/Via Mutantes de C. elegans Acetilcolina eat-18, eat2, chat-1, unc-17 Acetilcolina esterasas ace-1, ace2, ace-3 Receptores nicotínicos de unc-29, unc-38, lev-1, deg-3 Acetilcolina acr-2 Dopamina cat-2, cat-4,bas-l, cat- l,cat-3, cat-5 serotonina bas-1, modalidad-5, goa-1 glutamato avr-15, eat-4, glr-1 GABA unc-147, unc-25, unc-46, unc-49 Exp-1 Subunidades de Na+/K+ATPasas eat-6 Canales del calcio eat-12, une-2, unc-36, une-13 Otros eat-5, unc7, unc-18, rab-3, snt- 1, ric-4, snb, unc-64, unc- 50,unc-74 Un rango de mutantes de C. eiegans puede ser obtenido a partir de la colección de C. elegans mutantes en el C. elegans Genetic Center, University de Minnesota, St Paul, Minnesota. Alternativamente, mutantes específicos pueden ser generados por métodos estándares tales métodos son descritos por Anderson en Methods in Cell Biology, (Métodos en Biología Celular) Vol. 48, "C. elegans : Modern Biological análisis of an organism" (C. elegans : Análisis Biológico Moderno de un organismo) páginas 31 a 58. Varias rondas de selección de la técnica de reacción en cadena de polimeraza pueden efectuarse para seleccionar un gusano mutante con la remoción de un gen deseado. Otros métodos para generar mutantes con expresión enfocada de gen defectuoso son descritos por Sutton and Hodgkin, Zwaal et al y FIRE et al de conformidad cor- lo descrito arriba. Ejemplo 5 Respuesta a la dosificación Para determinar la sensibilidad del ensayo de bombeo de la faringe, series de dilución fueron efectuadas para algunas sustancias químicas. Estas incluyen los agentes químicos clomipramina, tamoxifeno, BP554, pimazida y tapsigargina. Se elaboró un rango de concentración de menos que 1 µM hasta 100 µM y el ensayo de bombeo fue repetido de conformidad con lo descrito en ejemplos previos. A partir de estos resultados, se pudieron elaborar curvas de dosis-respuestas distintas. Este experimento muestra claramente que el ensayo de bombeo de la faringe es cuantitativo y puede emplearse para determinar la IC50 y la ED50 de sustancias químicas. Además, a partir de este experimento, se puede detectar el efecto tóxico de la sustancia química. La curva de respuesta a la dosificación del incrementador clomipramina muestra claramente el efecto tóxico del solvente DMSO en concentraciones más altas (figura 5) . Finalmente es posible detectar el efecto de una sustancia química sobre blancos secundarios o bien detectar efectos colaterales de una sustancia química en varias concentraciones. Esto puede observarse en la curva de respuesta a la dosificación de tapsigargina, de la cual se sabe que es un inhibidor de SERCA, lo que resulta en una disminución del régimen de bombeo de la faringe de C. elegans (figura 6) . Sin embargo, en concentración baja, se puede observar un incremento del bombeo. Es la primera observación de esta característica de la tapsigargina. Aún cuando investigación adicional es necesaria para explicar esta comportamiento, podría ser causado por un blanco secundario todavía desconocido por la tapsigargina o bien otorga ejemplo colateral, este experimento muestra claramente la sensibilidad del ensayo de la faringe y el uso del ensayo de la faringe para editar curvas de respuesta a la dosificación. Ejemplo 6 Detección de la actividad de sustancias químicas con técnicas genéticas Otras técnicas existen para medir el régimen de bombeo de la faringe de C. elegans . Puesto que la faringe es un músculo, la capacidad de contracción de la faringe depende de los niveles internos de calcio. Estos niveles pueden ser medidos empleando genes reporteros sensibles al calcio específicos.
Kerr et al. han reportado (West coast Wor meeting abstract (resumen de la junta en materia de gusanos de la Costa Occidental) 77, 1998) que una actividad eléctrica incrementada puede ser detectada indirectamente mediante la medición de los niveles de calcio en la faringe de C. elegans . Las proteínas a reportar sensibles al calcio descritas aquí son Aecuorina y GFP-calmodulina (Miyawaki et al., Nature 388:882-887). En este estudio, se expresó GFP-calmodulina en la faringe de C. elegans y se observo fluorescencia empleando microscopía de dos fotones. Se ha mostrado que inhibidores del bombeo tales como Ivermectina y realzadores del bombeo tales como serotonina influencia la fluorescencia observada de GFP-calmodulina de manera predicha. Gusanos transgénicos análogos que expresan GFP-calmodulina pueden ser empleados para tamizar substancias químicas que influencian el régimen de bombeo de la faringe de nematodo utilizando la metodología de ensayo de bombeo de la faringe. De manera análoga al ensayo de bombeo descrito para calceína-AM en los ejemplos previos, los gusanos transgénicos son colocados en placas de pozos múltiples y se agregan substancias químicas. La fluorescencia de GFP-calmodulina es después medida en lugar de la fluorescencia de calceína empleando el mismo instrumento de lectura de placas de pozos múltiples.
Con el uso de secuencias apropiadas de promotores, la expresión de Aecuorina o GFP-calmodulina puede ser manipulada en otros tejidos musculares, o bien hasta en neuronas con el objeto de monitorear los niveles de calcio en estas células. Tales transgénicos pueden ser empleados en un tamiz de conformidad con lo descrito arriba. Ejemplo 7 Tamizados de Realzadores y Supresores Genéticos Se pueden encontrar genes y por consiguiente vías bioquímicas que incrementan, suprimen o modulan la actividad de un compuesto dado. Cuando se aplica un compuesto al nematodc C. elegans, cambios fenotípicos pueden ser observados, sin embargo, el blanco del compuesto o su modo de acción puede ser conocido o desconocido. El método de tamizado descriro a continuación puede emplearse para identificar genes que suprimen o incrementan la actividad de un compuesto que tiene un efecto definido sobre el fenotipo de C. el egans . El compuesto 2, 5-difeniloxasol es un inhibidor del régimen de bombeo de la faringe tanto en gusanos de tipo silvestre como en gusanos de bombeo constitutivos. Se emplea aquí como un ejemplo de un compuesto que tiene un efecto definido sobre C. eiegans. Gusanos C. elegans son sometidos a mutagénesis aleatoria empleando técnicas estándares tales como EMS, TMP-UV o bien radiación (Methods in Cell Biology (métodos en biología celular) volumen 48) . La generación Fl de estos gusanos mutagenizados se coloca gusano por gusano en los pozos de placas de pozos múltiples y se deja crecer los gusanos y generar crías. Cuando las crías han alcanzado en la etapa de crecimiento deseado, se agrega 2, 5-difeniloxazol y calceína-AM. Las placas fueron después encubadas durante aproximadamente 1 hora y se midió la fluorescencia de la calceína generada utilizando un lector de placas de pozos múltiples. Los pozos que presentaban una lectura de fluorescencia más alta fueron calificados. Los gusanos en estos pozos fueron empleados para análisis adicional, puesto que contienen una mutación en un gen o una vía que suprime la actividad de 2, 5-difeniloxazol . Un tamizado análogo fue efectuado con el compuesto doxepina que es un incrementador del bombeo de la faringe. Mutantes fueron evaluados los cuales muestran un fenotipo de bombeo reducido en presencia del compuesto doxepina. Ejemplo 8 Tamizado para antagonistas de un compuesto (tapsigargina) Se sabe que el compuesto tapsigargina inhibe la actividad de calcio sarco/retículo endoplásmico ATPasa (SERCA) . La proteína SERCA bombea calcio en el sarco/retículo endoplásmico y proporciona a la célula un almacenamiento interno de calcio. El almacenamiento interno de calcio es importante para la actividad muscular. En C. elegans, la inhibición de la actividad SERCA mediante la aplicación de tapsigargina en el gusano resulta en una disminución del régimen de bombeo de la faringe. Otra característica observada por la acción de la tapsigargina sobre el gusano nematodo C. elegans es un movimiento disminuido como resultado de inhibición de SERCA de los músculos de la pared corporal . Un tamizado del bombeo de la faringe ha sido desarrollado para tamizar substancias químicas que suprimen la actividad de la tapsigargina sobre SERCA. Nematodos C. elegans, tanto nematodos de tipo silvestre como nematodos con una faringe de bombeo constitutivo se colocan en los pozos de placas de pozos múltiples de conformidad con lo descrito previamente. Se agrega tapsigargina a los gusanos en una concentración de inhibición y se agrega calceína-AM en una concentración de 5-10 µM de conformidad con lo previamente descrito. Finalmente, las substancias químicas a seleccionar se agregan. Pozos de control se establecen también los cuales contienen tapsigargina sin segundas sustancia química. De manera análoga al tamizado de bombeo de la faringe, la fluorescencia es medida utilizando un lector de placa de pozos múltiples. Los pozos que contienen una sustancia química en donde la fluorescencia medida es mayor que en los pozos de control que no contienen sustancia química son calificados. Estos pozos contienen una sustancia química que es un antagonista de la actividad tapsigargina, puesto que la actividad de inhibición de la tapsigargina es suprimida. Substancias químicas identificadas de esta forma pueden inhibir directamente la actividad de la tapsigargina o bien estimular la actividad de SERCA, o bien tener una actividad de incremento de la vía de SERCA y por consiguiente de la biología del calcio del organismo. Las substancias químicas seleccionadas en este tamizado son consideradas agentes terapéuticos potenciales o bien substancias novedosas para el desarrollo adicional de agentes terapéuticos en las áreas de enfermedad que son la causa de un mal funcionamiento de la biología del calcio del organismo. Ejemplos de las áreas de enfermedad para las cuales estos agentes terapéuticos son útiles son hipertrofia cardiaca, insuficiencia cardiaca, hipertensión arterial, diabetes de tipo H y enfermedad de Brody. En el ejemplo dado arriba, la tapsigargina se emplea como ejemplo de un compuesto que tiene un efecto fenotípico definido sobre C. elegans y cualquier compuesto que tiene una actividad de inhibición sobre el régimen de bombeo de la faringe puede emplearse en un tamizado análogo. Se pueden efectuar también tamizados para seleccionar substancias químicas que tienen una actividad antagonista en compuestos conocidos por incrementar el régimen de bombeo de la faringe. En un experimento de este tipo, una sustancia química es calificada si reduce el régimen de bombeo de la faringe en presencia del compuesto conocido por ser un incrementador del bombeo de la faringe. Experimentos análogos pueden efectuarse con compuestos que inhiben otras bombas del calcio o hasta otras bombas de iones . Ejemplo 9 Tamizados para substancias químicas en mutantes transgénicos y animales humanizados (SERCA-PLB) . La proteína humana SERCA-2 es conocido por regular negativamente, por lo menos una proteína, conocida como fosfolambano (PLB) . Ambas son expresadas en el corazón de vertebrados, y existen una lista extensa de literatura sobre las características de esta interacción. Un incremento del almacenamiento interno de calcio se considera en general como importante para la fuerza de la contracción muscular, y por consiguiente, una mejora o incremento de la contracción muscular puede obtenerse incrementando la actividad de SERCA. Sustancias químicas que incrementan la actividad de SERCA o bien inhiben la actividad SERCA- se consideran como agentes terapéuticos potenciales o bien como sustancias novedosas para el desarrollo adicional de agentes terapéuticos en las áreas de enfermedad que son la causa de una mal función de la biología del calcio de la célula u organismo. Ejemplos de áreas de enfermedad en donde una incremento de la actividad SERCA puede ser benéfica son la hipertrofia cardiaca, insuficiencia cardiaca, hipertensión arterial, diabetes de tipo II, y enfermedad de Brody. Existen varios genes e isoformas de SERCA que se relacionan con tipos diferentes de enfermedades; SERCA2 y PLB están asociados con enfermedades cardiovasculares SERCA1 y sarcolipina están asociados con enfermedades de músculos esqueletales, y tres genes de SERCA han sido asociados con diabetes mellitus no insulina dependiente. Con el objeto de efectuar tamizados para identificar substancias químicas que modulan la actividad de las vías de SERCA, genes de SEPCA y PLB han sido expresados en C. elegans . La expresión de estos genes puede ser regulada bajo el control de varios promotores específicos con las siguientes actividades: a) el promotor myo-2 de C. elegans que promueve la expresión en la faringe. b) El promotor de SERCA de C. elegans que promueve la expresión de los músculos de C. elegans, incluyendo la faringe, los músculos de la vulva y los músculos de la pared corporal. Los siguientes transgénicos fueron construidos: a) SERCA de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y/o myo-2. b) SERCA de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y/o myo-2 en C. elegans mutado para SERCA de C. elegans (noqueados y mutantes seleccionados) . c) PLB de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y/o myo-2. d) PLB de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y/o myo-2 en C. elegans mutado para SERCA de C. elegans (noqueado y mutantes seleccionados) . e) Fusión PLB-GFP de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y/o myo-2. f) Fusión PLB-GFP de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y/o myo-2 en C. elegans mutado para SERCA de C. el egans (noqueados y mutantes seleccionados) . g) SERCA de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y PLB de cerdo y/o ser humano bajo el promotor myo-2. h) SERCA de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y PLB de cerdo y/o ser humano bajo el promotor myo-2 en C. elegans mutado para SERCA de C. el egans (noqueados y mutantes seleccionados) . i) SERCA de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y PLB-GFP de cerdo y/o ser humano bajo el promotor myo- 2. j) SERCA de cerdo y/o ser humano bajo el promotor de SERCA y PLB-GFP de cerdo y/o ser humano bajo el promotor myo- 2 en C. elegans mutado para SERCA de C. elegans (noqueados y mutantes seleccionados) . Algunos de estos animales mutantes y transgénicos construidos presentan un cambio claro en cuanto al régimen de bombeo de la faringe de conformidad con lo medio por la fluorescencia de calceína en el intestino utilizando el ensayo de bombeo de faringe de calceína-AM. Algunas de estas sepas fueron consideradas como útiles para un desarrollo de tamizado adicional. De conformidad con lo descrito en los ejemplos previos, los animales transgénicos y mutantes fueron colocados en Ips pozos de placas de pozos múltiples. Se agregaron después calceína-AM y sustancias químicas en prueba. La fluorescencia de la calceína formada en el intestino fue medida en un lector de placas de pozos múltiples ajustado para medir la fluorescencia. Substancias químicas que alteran las propiedades del régimen de bombeo de la faringe y por consiguiente alteran la función y actividad de SERCA fueron seleccionadas para análisis adicional, y pueden ser consideradas como compuestos potenciales para uso terapéutico, o bien como compuestos novedosos para el desarrollo adicional de agentes terapéuticos. Un experimento análogo puede ser efectuado para el tamiz de SERCA1 y su regulador sarcolipina (SLN), con el objeto de detectar substancias químicas que alteran su actividad y/o regulación. Ejemplo 10 Tamizado para substancias químicas en animales transgénicos y/o animales mutantes (neurodegeneración) La anatomía de la faringe del nematodo consiste de varias partes, que contienen varias células y varios tipos de células. Incluyen los músculos de la faringe, las células epiteliales de la faringe, las glándulas faríngeas y las neuronas faríngeas. Por lo menos 14 neuronas están involucradas en la función, de las cuales las más importantes son II, 12, 13, M3, Me, NSM, Ml, RIP y M4 (reseñado en "The nematode C. elegans" (El nematodo C. elegans) editado por W.B. en punto Wood, 1988, CSHL Press). Mutaciones o disfunciones de cualquier parte de la faringe (los músculos de la faringe, las células epiteliales de la faringe, las glándulas faríngeas y las neuronas faríngeas) resultan en un régimen de bombeo de alterado de la faringe.
En la literatura se conocen varias mutaciones que provocan un régimen de bombeo alterado, o bien que tienen una morfología alterada de la faringe. Otra forma de alterar las células involucradas en la función de la faringe, bombeo de la faringe y morfología de la faringe es mediante la aplicación utilizando técnicas transgénicas al nematodo. La expresión de genes tóxicos en una de las células involucradas en la anatomía de la faringe y en la función faríngea resultará en una degeneración, disfunción o desarrollo anormal de las células respectivas. Como resultado, el régimen de bombeo de la faringe será alterado, con mayor probabilidad el régimen de bombeo será disminuido . Ejemplos de genes tóxicos que podrían ser empleados para este propósito aparecen arriba. C. elegans transgénico puede ser construido el cual expresa estos genes en forma específica para tejido. Por ejemplo el promotor myo-2 induce la expresión en los músculos de la faringe, el promotor unc-129 induce la expresión en las células neuronales. Para cada tipo de células o tejido, un promotor específico para tipo de células o un promotor específico para tejido puede ser seleccionado de tal manera que se puede controlar con precisión la degeneración de los tejidos. Promotores pueden ser seleccionados de tal manera que la expresión del gen tóxico sea inducida solamente en una célula específica. Mutantes y transgénicos que tienen una anatomía alterada de la faringe o un bombeo alterado de la faringe pueden ser utilizados en un tamizado de bombeo de la faringe para seleccionar substancias químicas que restauran o rescatan el defecto genético o morfológico. Si el animal mutante o transgénico tiene un régimen de bombeo disminuido, el tamizado identificará de preferencia substancias químicas que incrementan el régimen de bombeo. Si el mutante o transgénico muestra un régimen de bombeo incrementado, el tamizado identificará de preferencia substancias químicas que reducen el régimen de bombeo de la faringe. Tabla 2: Ejemplos de mutantes que pueden ser empleados en la faringe Gene Alelo Fenotipo Faríngeo otro fenotipo Dig-1 nl321 Torcido Eat-6 ad467 defectuoso para ATPasa Relajación Eat-13 ad522 Defectuoso para Crecimiento lento Relajación Goa-1 syl92 Bombeo incrementado hiperactivo Mig-4- rh51 Torcido Mlc-2 Defectos de bombeo Letal larva Pha-2 ad427 Faringe defectuosa letal larva Pha-3 ad607 Faringe defectuosa crecimiento lento Phm-2 ad538 Defecto de relajación Cha-1 pll52 Bombeo lento Une Clk-1 e-2519 Bombeo lento lento Eat-1 ad427 Bombeo irregular largo y delgado Eat-2 ad451 Bombeo lento hipersensibilidad A agonista de Colin. Eat-3 Bombeo muy lento mal formado Eat-4 Defectos de bombeo Eat-5 Bombeo no sincronizado Eat-7 Somnolencia Eat-8 Bombeo breve Eat-9 Bombeo irregular padece de hambre Eat-14 Defectos de relajación defectos de movimiento eat-18 Bombeo lento muerto de hambre est-x Defecto de bombeo osm Bombeo lento defecto de quimio- táxis snt-1 Defectos de bombeo Une une-11 Bombeo lento retorcido unc-13 Bombeo irregular paralizado une-17 Bombeo irregular pequeño unc-26 Lento poco movimiento une-31 Bombeo lento lento unc-36 Bombeo constitutivo paralizado une-57 Bombeo irregular pequeño une-58 Bombeo lento agitado une-90 Bombeo pegajoso corto unc-105 Bombeo pegajoso crecimiento insatisfactorio sma-1 Bombeo pegajoso sma-2 Defectos de la faringe sma-3 Bombeo reducido sma-4 Defectos de la faringe exp-2 sa267+ Defecto de la faringe Bombeo poco profundo agitado, constipado Rápido Ejemplo 12: Ejemplo específico del ensayo con dauers, neurogeneración y el uso de promotor daf-7 Las neuronas ASI de C. eiegans son neuronas químico sensoriales y son esenciales para la percepción de los alimentos y el bombeo de la faringe. Se ha reportado previamente que el trastorno de la neurona ASI, ADF, ASG o ASJ resulta en la formación de dauers. Esos experimentos que matan una o varias de estas neuronas fueron efectuados con ablación por láser (Shackwitz WS et al., Neuron 17:719-728, 1996) . Además se reportó que Daf-7 (un miembro de la familia TGF-beta) es expresado específicamente en la neurona ASI. En un experimento análogo al ejemplo 11, la neurona ASI ha sido matada, trastornada o alterada en cuanto a sus propiedades, más específicamente, genes tóxicos han sido expresados en esta neurona mediante la inducción de su expresión bajo el control del promotor daf-7. El trastorno dé la neurona de ASI de esta forma resulta en la formación de dauers . Tale cepas fueron utilizados en tamices de conformidad con lo descrito previamente. En un primer ejemplo los dauers resultantes fueron utilizados en un ensayo de bombeo de la faringe. Gusanos de tipo dauers no tienen bombeo de faringe o bien tienen solamente un bombeo reducido de la faringe. Substancias químicas fueron identificadas las cuales provocan que los gusanos eviten el fenotipo dauers y por consiguiente restauren el bombeo de la faringe. Como antes, el régimen de bombeo de la faringe utilizando calceína-AM. En un segundo ejemplo, los dauers fueron sometidos al ensayo de movimiento. Puesto que los gusanos dauers no se desplazan, y por consiguiente se precipitan en los pozos, pueden ser utilizados en el ensayo de movimiento para identificar substancias químicas que provocan que los gusanos eviten el fenotipo dauers y por consiguiente alteren el movimiento de los gusanos. El comportamiento de movimiento de los gusanos fue detectado utilizando autofluorescencia en el centro de los pozos. Ejemplo 13: Ejemplo específico del ensayo con dauers Daf-2 ts es un mutante nematodo que crece normalmente a un temperatura de 15°C pero que genera 100% de formación de dauers a una temperatura de 25°C, estos mutantes pueden también ser empleados para tamizados para aislar substancias químicas que provocan que los gusanos eviten el fenotipo dauers . Para efectuar dicho ensayo, gusanos daf-2 ts Ll sincronizados son distribuidos en los pozos de placas de microtitulación. Huevos sincronizados pueden también emplearse. Los gusanos fueron suministrados con alimento y fueron criados adicionalmente a una temperatura de 25°C, lo que resultó en la formación de dauers. Después de aproximadamente 4 días, el agente químico de prueba y calceína-AM se agregan y se mide la fluorescencia a intervalos de tipos seleccionados, que varían de una hora a cuatro días, manteniendo la temperatura a 25°C. Compuestos químicos fueron clasificados los cuales provocaron que los gusanos evitaran el fenotipo dauers. Debido a la presencia de substrato de alimento, puede ser difícil detectar la fluorescencia utilizando un lector de placas de pozos múltiples. El dispositivo FANS puede ser utilizado alternativamente para medir la fluorescencia en este caso. Un experimento análogo puede ser efectuado en el cual el agente químico de prueba es agregado a los pozos, aproximadamente junto con los gusanos Ll . En otra variante de este experimento, se cultivaron grandes cantidades de dauers daf-2 ts. Los dauers fueron después suministrados en los pozos de placas de pozos múltiples y se agregaron substancias químicas. Las placas de pozos múltiples - fueron colocadas en un lector de placas de pozos múltiples ajustados para efectuar un ensayo de movimiento, es decir, para medir la autofluorescencia. Las mediciones de autofluorescencia fueron registradas en varios intervalos de tiempo de una hora a cuatro días, manteniendo los pozos a una temperatura de 25°C. Ejemplo 14 Tamizado para substancias químicas y antagonistas con el ensayo de movimiento. El mutante nematodo (ace-1; ace-2) no muestra ningún movimiento y tiene un fenotipo de tipo espasmo. El gusano no muestra ninguna forma sinusoidal, pero presenta una forma recta. Esto se debe porque el mutante ha mutado en las acetilcolina esterasas, lo que resulta en concentraciones elevadas de acetilcolina en las sinapsis. La neostigmina, un inhibidor bien conocido de la acetilcolinesterasa, fue agregada a gusanos de tipo silvestre distribuidos en los pozos de una placa de pozos múltiples y metidos al ensayo de movimiento después de aproximadamente 2 horas . Como en la figura 8, el panel 1 muestra claramente que gusanos expuestos a la neostigmina muestran una disminución evidente en cuanto al movimiento. El hexametonio y la mecamilamina son antagonistas bien conocidos del receptor de la acetilcolina y por consiguiente deben reprimir la sobrecarga de acetilcolina en las sinapsis del mutante acel; ace2, lo que resulta en la restauración o rescate del movimiento. Como antagonista de receptor, el hexametonio resultará en una disminución del movimiento, puesto que evita una señalización apropiada. En el último panel de la figura 8, se muestra claramente que el hexametonio reprime el movimiento de gusanos de tipo silvestre, pero significativamente menos que la neostigmina (100% representa el movimiento normal de gusanos de tipo silvestre) . En otro experimento, gusanos de tipo silvestre fueron puestos en contacto con concentraciones inhibitorias de neostigmina para evitar el movimiento. Después de un periodo corto de incubación, varias concentraciones de hexametonio fueron agregadas y los pozos fueron sometidos al ensayo de movimiento (medición de la autofluorescencia) . Como lo muestra la figura 8, concentraciones crecientes de hexametonio resultaron en más movimiento que lo predicho (el hexametonio es un antagonista) , pero el límite superior parece ser determinado por la actividad de inhibición del hexametonio. En concentraciones muy altas de hexametonio (aun cuando menores que las concentraciones mostradas en el último panel) , se observa un efecto tóxico que resulta en una disminución del movimiento. Este efecto tóxico es probablemente causado por la presencia de altas concentraciones tanto de neostigmina como de hexametonio. Un experimento análogo fue efectuado con el mutante doble ace-1; ace-2. En este experimento, concentraciones crecientes de hexametonio fueron agregadas a los pozos en ausencia de neostigmina. Los resultados de ambos experimentos fueron comparables . Este experimento muestra claramente la capacidad de aplicación del ensayo de movimiento para seleccionar sustancias químicas y antagonistas de compuestos seleccionados . Ejemplo 15 Ejemplo de un ensayo de acoplamiento utilizando hermafroditas no autoreproductores Un análisis de alto rendimiento del comportamiento de acoplamiento de nematodos, pudo ser efectuado mediante el conteo de las crías del experimento de acoplamiento. Primero, cantidades iguales de gusanos machos fueron distribuidas en los pozos de placas de pozos múltiples. Hermafroditas fueron después agregados a los pozos de tal manera que cada pozo contenga una cantidad igual de hermafroditas. La proporción entre machos y hermafroditos puede ser variada de experimento a experimento . El hermafrodito seleccionado en este experimento tiene una capacidad reducida de producir autocrías o bien las crías no son viables ó de preferencia el hermafrodita es autoestéril, tales como los hermafroditas mutantes en los genes -fer c spe. Además, para incrementar el acoplamiento, el hermafrodita autoestéril tiene de preferencia un fenotipo de movimiento reducido o un fenotipo de ausencia de movimiento. Los nachos en estos experimentos pueden ser machos de tipo silvestre, o bien machos mutantes, o bien machos transgénicos, o bien machos humanizados. El comportamiento de acoplamiento es evaluado mediante la medición del número total de crías producidas, de conformidad con lo descrito arriba. Ejemplo 16 Ejemplo de un ensayo de acoplamiento de hermafroditas no autoreproductores que expresan GFP Se efectúa también un ensayo de acoplamiento con un hermafrodita transgénico autoestéril específico que tiene un fenotipo de movimiento reducido y expresa GFP de manera estable. Todas las crías de este ensayo de acoplamiento expresan GFP y por consiguiente el número de crías puede ser fácilmente detectado mediante la medición de la fluorescencia de GFP utilizando un lector de placas de pozos múltiples o bien un FANS. Hermafodritas que expresan otros marcadores tales como marcadores luminiscentes pueden ser empleados en un experimento análogo. Ejemplo 17 Ejemplo de un ensayo de acoplamiento de machos que expresan GFP En otra variante del ensayo de acoplamiento, se seleccionaron los hermafroditas en las siguientes combinaciones: a) Los hermafroditas fueron hermafroditas de tipo silvestre, o bien hermafroditas que muestran un fenotipo de movimiento reducido b) Los nematodos machos fueron de tipo silvestre, nematodos transgénicos, mutantes o humanizados, que expresan GFP.
En este experimento, las crías de la autofertilización de los hermafroditas, y las crías que resultan del acoplamiento genuino pudieron ser distinguidas siguiendo la fluorescencia de GFP puesto que solamente las crías que resultan de un acoplamiento presentaron expresión de GFP. Ejemplo 18 Neuronas especificas para machos La siguiente tabla 3 presenta una lista de neuronas específicas para machos de C. elegans y su función en el comportamiento de acoplamiento. El trastorno de una o varias de estas neuronas, por ejemplo por expresión de un gen tóxico, puede resultar en variantes de C. elegans que pueden ser útiles en tamizados de acoplamiento. Tabla 3 Neurona estructura clase función CAn cuerda ventral motor CPn cuerda ventral motor activación CEMn cabeza sensorial DXn motor CVE inter ¿activación o transferencia de esperma? DVF inter ¿activación o transferencia de esperma? Efn activación HOA gancho sensorial ubicación de vulva HOB gancho sensorial ubicación de vulva PCA p. c. s . sensorial ubicación de vulva PCB p .c. s . sensorial ubicación de vulva PCC p. c . s . sensorial ubicación de vulva PGA p.a.g. inter PGA p. a.g. inter PW p.a.g. inter PVY p.a.g. inter respaldo RÍA brazo sensorial ¿respuesta dorsal? R1B brazo sensorial ¿respuesta dorsal? R2A brazo sensorial ¿respuesta ventral? R2B brazo sensorial ¿respuesta ventral? R3A brazo sensorial R3B brazo sensorial R4A brazo sensorial ¿respuesta ventral? R4B brazo sensorial ¿respuesta ventral? R5A brazo sensorial ¿respuesta dorsal? ¿activación? R5B brazo sensorial ¿respuesta dorsal? R6A brazo sensorial R6B brazo sensorial R7A brazo sensorial ¿respuesta dorsal? R7B brazo sensorial ¿respuesta dorsal? ¿activación? R8A brazo sensorial ¿respuesta ventral? ¿activación? R8B brazo sensorial ¿respuesta ventral? ¿activación? R9A brazo sensorial ¿activación? R9B brazo sensorial ¿activación? SPC espículo motor/propio inserción de espículo SPD espículo sensorial inserción de espículo SPV espículo sensorial inhibe la eyacula- ción Ejemplo 19 C. elegans mutantes y transgénicos adicionales La siguiente tabla 4 presenta una lista de mutantes de C. elegans que presentan anormalidades en cuanto a comportamiento de acoplamiento de machos que pueden ser empleados en los ensayos de acoplamiento: Tabla 4 Gen (mutante) Defecto cat-1, cat-2, cat-4, cod-5 activación che-2, che-3, che-4, cod-10 respuesta a contacto cod-1, cod-2, cod-4, cod-6, cod-7, inserción de espículo cod-8 cod-12, cod-13, cod-14, cod-15 ubicación de vulva ram-1, ram-2, ram-3, ram-4, ram-5 morfología de brazo La siguiente tabla 5 muestra C. elegans mutantes que pueden ser utilizados en los ensayos de puesta de huevos: Tabla 5 Gen (mutante) Defecto egl-1, egl-43 migración y diferenciación de función HSN egl-1, sem-1, sem-4 desarrollo muscular de la vulva egl-15, egl-17 migración de mioblasto sexual egl-10, egl- 30 transmisión sináptica El ensayo de puesta de huevos puede también ser efectuado utilizando C. elegans transgénicos que muestran un comportamiento de puesta de huevos alterado como resultado de la expresión de un gen tóxico en un tejido específico o en un tipo específico de células. C. elegans transgénicos adecuados pueden ser construidos de conformidad con técnicas estándares conocidas utilizando uno de los genes tóxicos presentados en la lista arriba bajo el control de un promotor apropiado específico para tejido o tipo de células. Los promotores que pueden ser útiles para este propósito incluyen los promotores lin-31, egl-17, unc-17 y unc-53. La siguiente tabla 6 presenta una lista de C. elegans mutantes que pueden ser empleados en los ensayos de defecación: Tabla 6 gen (Mutante) defecto aex-1; aex-2, aex-3, aex-4; aBoc y expulsión aex-5, aex-6 unc-25; unc-47; exp-1; exp-2 constipado (expulsión) pho-1 a pho-7, egl-8 específico para aBoc dec-1, dec-2, dec-4, dec-7, ciclo de defecación dec-11, dec-12 Los ensayos de defecación pueden también ser efectuados utilizando C. eiegans transgénicos que muestran un comportamiento alterado de la defecación como resultado de la expresión de un gen tóxico en un tejido específico o un tipo específico de células. C. elegans transgénicos adecuados pueden ser construidos de conformidad con técnicas estándares conocidas utilizando uno de los genes tóxicos listados arriba bajo el control de un promotor apropiado específico para tejido o tipo de células. Promotores que pueden ser útiles para este propósito incluyen los promotores unc-43 y unc-25. La siguiente tabla 7 presenta una lista de C. elegans mutantes que pueden ser empleados en los ensayos de movimiento: Tabla 7 gen (Mutante) Defecto unc-17 receptor de acetilcolina; doblador ace-1; ace-2 acetilcolina esterasa; movimiento de la cabeza en forma de bucle unc-25; une-47 GABA; encogedor unc-15; une-54 paramiosina, miosina; paralizado une-36 canal de CA; paralizado Tabla 8: Realizadores del régimen de bombeo de la faringe de C. elegans aislados de la farmacopea. Nombre del modo de área de positivos compuesto acción enfermedad después de 1 hr . de incubación clomipramina inhibir de la antidepresivo absorción de ser amitriptilina inhibir de la antidepresivo absorción de ser desipramina inhibir de la antidepresivo absorción de ser fluvoxamina inhibir de la antidepresivo absorción de ser nortriptilina inhibir de la antidepresivo absorción de ser imipramina inhibir de la antidepresivo absorción de ser fluoxetina inhibir de la antidepresivo absorción de ser doxepina desconocido antidepresivo, antiprurítico nordoxepina desconocido antidepresivo, antiprurítico miansepna antagonista + de 5HT norclomipramina inhibir de la antidepresivo absorción de ser ciproheptadina antagonista antihistamínico del receptor antiprurítico; de ser estimulador del apetito ciclobenzaprina * depresor psico- motor; relajante muscular Tabla 9: Inhibidores del régimen de bombeo de la faringe de C. elegans aislados de la farmacopea. Nombre del modo de área de positivos compuesto acción enfermedad después de 1 hr. de incubación Pimozida antagonista de D2 antisicótico Haloperido antagonista de D2 antisicótico, Alzheimer Trazadona bloqueador de la Alzheimer, absorción de seroantidepresivo tonina antisicótico antagonista de metabolito D2 agonista de 5HT1 BP554 agonista de 5HT1 Ivermectina bloqueador de los antihelmíntico canales del cloro Levamisol antihelmíntico Metrifonato inhibidor de la antihelmíntico, colinesterasa Alzheimer Fisostigmina inhibidor de la Alzheimer + colinesterasa Tamoxifen bloqueador de los antihistamina canales del cloro Flunarizina bloqueadores de antisicótico los canales de Na /Ca Tapsigargina "bloqueador de los canales del cal- cío" Alfa NETA inhibir de la co- linacetiltransfe- rasa Atropina antagonista coli- + nérgico L-hiosciamina antagonista coliforma activa nérgico de atropina Difenilhidantoina anticombulsante antiepiléptico ZAPA antagonista de + GABA 2, 5-difeniloxazol Tabla 10: Lista parcial de agentes novedosos obtenidos al tamizar 800 compuestos a partir de una biblioteca de la farmacopea utilizando un ensayo de movimiento con C. eiegans.
Los compuestos novedosos fueron calificados como causando un cambio detectable en el comportamiento de movimiento de C. elegans. Harmano 9 B4 18431 55525 6085,208 1773,442 HCl 15 1 TMPA- 8 H6 21792 12077 71,94823 385,7584 HIT Prazosina E9 94689 11360 312,6242 362,8578 HIT Vigabatrina 6 H7 20828 61410 68,7655 196,1402 HIT (2S,3R) -cloro- 6 H8 21514 48736 71,03039 155,6601 HIT feg MSOPPE 6 E7 23760 44614 78,44576 142,4947 HIT (n) -acetil- 2 CÍO 23457 44156 77,44537 141,0319 HIT carnitina DPPE 5 Gil 20365 43629 67,23686 139,3487 HIT ácido indol- 2 A4 19362 43403 63,92537 138,6268 HIT 2-carboxílico N-desisopro- 6 A7 23737 43102 78,36982 137,6654 HIT pilpropanolol YS-035 3 E3 21415 42457 70,70353 135,6054 HIT L-AP5 1 G2 21446 42393 70,80588 135,4009 HIT 2, 4-dihidroxi- 2 G4 18057 42203 59,61679 134,7941 HIT fenilacetil-L-asparagina L-AP3 2 G2 22073 41858 72,87597 133,6922 HIT D-AP5 1 F2 19717 41697 65,09743 133,178 HIT O-fosfo-L-se- 1 A3 20292 41086 66,99584 131,2265 HIT riña ácido clofí- 6 D9 22933 40916 75,71534 130,6835 HIT brico ácido cis-aze- 7 D8 19503 40568 64,39089 139,572 HIT tidin-2, 4-di-carboxílico L-AP4 1 C2 19824 39523 65,4507 136,2343 HIT ácido spaglú- 3 E6 20295 38417 67,00575 122,7018 HIT mico éster but-2- 2 F5 20002 37675 66,03838 120,3319 HIT inílico de arecaidina cicloleucina 2 E4 19234 36560 63,50276 116,7707 HIT S(-)-atenolol 3 G6 18176 36336 60,00968 116,0552 HIT propanolol- 6 D7 17134 34849 56,56943 111,3058 HIT glicol GF 109203X 5 Eli 15685 34448 51,78542 110,025 HIT quetoconazol 8 Gil 15803 33531 52,17501 107,0962 HIT ácido DL-2- 1 H2 17141 33518 56,59254 107,0547 HIT aminosubérico HU 210 7 B9 15481 33514 51,1119 107,0419 HIT GR 46611 7 F8 15815 33199 52,21463 106,0358 HIT 7- (dimetil- 6 C2 14278 32900 47,14009 105,0808 HIT carbamoiloxi) -6-fenilpirrolo GBLD 345 6 G3 12620 32858 41,66605 104,9467 HIT L-701,324 7 E6 14647 32476 48,35837 103,7266 HIT tADA 7 E8 16096 32342 53,14238 103,2986 HIT RS 17053 8 B10 14439 32050 47,67164 102,366 HIT N-bencilnal- 6 G6 14932 31760 49,29933 101,4397 HIT trindol Tabla 11: realzadores del bombeo de la faringe de C. elegans encontrados a partir de tamizado de la biblioteca de compuestos Tocris (Bristol, Reino Unido) empleando un ensayo de bombeo de la faringe. Nombre Actividad farmacológica conocida Clomipramina inhibidor de la absorción de la serotonina 6-nitroquipazina inhibidor de la absorción de la serotonina Fluvoxamina inhibidor de la absorción de la serotonina Metiotepina antagonista de 5HT1,2 Oxalato de 5-noniloxi- agonista de 5HT IB triptamina N-desmetilclozapina antagonista de 5HT2C 3-metoxicarbonilamino- inhibidor de receptor de b-carbolina benzodiazepina 7- (dimetilcarbamoiloxi) - inhibidor de receptor de 6-fenilpirrol benzodiazepina Nimodipina bloqueador de canal de Ca CP 55,940 agonista de canabinoide WIN 55,212-2 agonista de canabinoide WIN 64338 agonista de canabinoide HU 210 agonista de canabinoide Bromocriptina agonista de D2 1- (2-benzo [b] tienil) - inhibidor de la absorción de N-butilciclohexanamina dopamina 1- [1- (2-benzo [b] tienil) inhibidor de la absorción de ciclohexil] pirrolidina dopamina 2-amino-4-metilpiridina inhibidor de iNOS 17-ODYA inhibidor de leucotrieno B4 hidrolasa Etazolato inhibidor de PDE4 cis- (n) -N-metil-N- [2- ligando de receptor sigma (3, 4-diclorofenil) -N-exo-biciclo [2,2,1] ligando de receptor sigma (sensible hept-2-il-N' - (2-yodofenil) al haloperidol) L-732,138 antagonista de receptor de sustancia P Ciclosporina A inhibidor de actividad de calcineu- rinfosfatasa Dioctanoilglicol inhibidor de diacilglicerolquinasa LY 225910 antagonista de receptor de CCKB a-NETA inhibidor de colinacetiltransferasa ácido 4-naftalimidobu- inhibidor de aldosa reductasa tírico Ergotamina oxitócico antimigraña

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar sustancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencial utilizando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) proporcionar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con una sustancia química; (c) detectar una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales. 2. Un método para determinar el modo de acción de una sustancia química utilizando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) proporcionar números sustancialmente iguales de un panel de gusanos nematodos mutantes diferentes en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con la sustancia química; y (c) detectar una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales. 3. Un método para identificar componentes adicionales de la vía bioquímica en la cual actúa un compuesto que tiene un efecto definido sobre un nematodo, dicho método comprende los pasos de: (a) someter una población de gusanos nematodos a mutagénesis aleatoria; (b) suministrar un gusano nematodo Fl mutagenizado en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (c) permitir que los gusanos nematodos Fl generen crías F2; (d) poner en contacto los gusanos nematodos con el compuesto; y (e) detectar un señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales. 4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, que comprende además los pasos de aislar un gen que es mutado en gusanos nematodos que generan una señal en la parte (e) utilizando técnicas genéticas. 5. Un método para identificar substancias químicas que modulan el efecto de un primer compuesto, dicho compuesto tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con el primer compuesto; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con una sustancia química adicional; y (d) detectar una señal que indica cambios fenotípicos, fisiológicos, de comportamiento o bioquímicos en los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales. 6. Un método de conformidad a la reivindicación 5, en donde la segunda sustancia química suprime el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 7. Un método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la segunda sustancia química incrementa el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 8. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los gusanos nematodos son gusanos nematodos microscópicos. 9. Un método de conformidad con la reivindicación 8, en donde los gusanos nematodos son C. elegans o C. Briggsae. 10. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el paso de detectar una señal comprende la detección de un cambio en una propiedad medible de una molécula de marcador, por lo que un cambio en la propiedad de la molécula de marcador indica un cambio fenotípico, fisiológico, de comportamiento o bioquímico en los gusanos nematodos. 11. Un método de conformidad con la reivindicación 10, en donde la molécula de marcador es una molécula fluorescente, una molécula luminiscente o una molécula de color. 12. Un método de conformidad con la reivindicación 10, en donde la molécula de marcador es un precursor de una molécula fluorescente, un precursor de una molécula luminiscente o un precursor de una molécula de color. 13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, en donde dicha molécula de marcador puede ser disociada por la acción de una enzima presente en el intestino de C. elegans con el objeto de generar una molécula fluorescente, una molécula luminiscente o una molécula de color. 14. Un método de conformidad con la reivindicación 10, en donde la molécula de marcador es una molécula de marcador genéticamente codificada. 15. Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde los nematodos son nematodos transgénicos que expresan la molécula de marcador genéticamente codificada. 16. Un método de conformidad con la reivindicación 14, o de conformidad con la reivindicación 15, en donde la molécula de marcador genéticamente codificada es una proteína fluorescente autónoma, fosfatasa alcalina, luciferaza, beta-glucuronidasa, beta-lactamasa, beta-galactosidasa, acetohidroxiácidosintasa, cloranfenicol acetil transferasa, peroxidasa de rábano agrio, nopalinsintasa, octapinsintasa o aecuorina. 17. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el medio de detección no visual es un detector de placa de pozos múltiples. 18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el lector de placa de pozos múltiples efectúa detección de luminiscencia, fluorescencia o detección espectrofotométrica . 19. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el medio de detección no visual es un dispositivo FANS. 20. Un método de conformidad con la reivindicación 19, en donde el dispositivo FANS efectúa detección de luminiscencia, fluorescencia o bien detección espectrofotométrica. 21. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el paso de detectar una señal comprende la detección del tamaño y/o etapa del desarrollo de los gusanos nematodos empleando un dispositivo FANS. 22. Un método de conformidad con la reivindicación 21, que comprende la detección de huevos, gusanos en etapa Ll, etapa L2, etapa L3, etapa L4, gusanos adultos o bien gusanos de tipo dauers . 23. Un método de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el paso (a) comprende suministrar volúmenes substancialmente iguales de una suspensión homogénea de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de la placa de ensayo de pozos múltiples. 24. Un método de conformidad con la reivindicación 23,' en donde la suspensión homogénea comprende una suspensión de C. elegans en una solución viscosa. 25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, en donde la solución viscosa comprende una solución de material polimérico. 26. Un método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el material polimérico es una agarosa de bajo punto de fusión. 27. Un método .de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los gusanos nematodos son sincronizados en la misma etapa de crecimiento. 22. Un método de conformidad con la reivindicación 27, en donde los gusanos nematodos son huevos, gusanos en etapa Ll, etapa L2, etapa L3, etapa L4, gusanos adultos o bien gusanos de tipo dauers . 29. Un método de conformidad con la reivindicación 27, o bien con la reivindicación 28, en donde los gusanos son hermafroditas o machos. 30. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los gusanos nematodos son una cepa de tipo silvestre, una cepa mutante, una cepa transgénica o una cepa humanizada. 31. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, en donde dichos gusanos nematodos son una cepa humanizada que expresa una o varias secuencias de ácido nucleico que codifican proteína e origen humano. 32. Un método de conformidad con la reivindicación 30, en donde dichos gusanos nematodos son C. elegans transgénico que expresan un transgen que comprende un gen tóxico. 33. Un método de conformidad con la reivindicación 32, en donde dicho gen tóxico codifica ataxina alfa-sinucleina, ubiquitina, el producto de gen tau, el producto de gen de Huntington, el producto de gen de distrofia macular de Best, el producto de distrofia macular relacionada con la edad o bien el producto de gen unc-53. 34. Un método de conformidad con la reivindicación 32, o bien de conformidad con la reivindicación 33, en donde la expresión del gen tóxico es impulsada por un promotor específico para tejido que es capaz de dirigir la expresión de gen en un tejido individual, un subconjunto de tipos de células, un tipo individual de células o bien una célula única de C. elegans . 35. Un método de conformidad con la reivindicación 34, en donde la expresión del gen tóxico es impulsada por el promotor daf-7. 36. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método es efectuado en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para incrementar la viscosidad del medio. 37. Un método de conformidad con la reivindicación 36, en donde el polímero soluble en agua es carboximetilcelulcsa, agarosa, con bajo punto de fusión o bien polietilenglicol. 38. Un método de conformidad con la reivindicación 37, en donde el polímero soluble en agua es una carboximetilcelulosa de viscosidad media. 39. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.3%. 40. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 35, en donde el método es efectuado en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para evitar que los gusanos nematodos se adhieran sobre los pozos de la placa de pozos múltiples. 41. Un método de conformidad con la reivindicación 41, en donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol, alcohol polivinílico o bien polivinilpirrolidona. 42 un método de conformidad con la reivindicación 40, o bien de conformidad con la reivindicación 42, en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.01% a 10%. 43. Un método de conformidad con la reivindicación 42, en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.1%. 44. Un método para identificar substancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencial utilizando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de : (a) proporcionar números substancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con una muestra de una sustancia química; (c) detectar cambios en el régimen de bombeo de la faringe de los gusanos nematodos empleando medios de detección no visuales. 45. Un método para determinar el modo de acción de una sustancia química empleando gusanos nematodos, dicho paso comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de un panel de gusanos nematodos mutantes, transgénicos o humanizados diferentes en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con la sustancia química; y (c) detectar cambios en el régimen de bombeo de la faringe de los gusanos nematodos empleando medios de detección no visuales. 46. Un método para identificar componentes adicionales de la vía bioquímica en la cual actúa un compuesto que tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende las etapas de: (a) someter una población de gusanos nematodos a mutagénesis aleatorio; (b) suministrar un gusano nematodo Fl mutagenizado en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (c) permitir que el gusano nematodo Fl genere crías F2; (d) poner en contacto los gusanos nematodos con el compuesto; y (e) detectar cambios en el régimen de bombeo de la faringe de los gusanos nematodos empleando medios de detección no visuales. 47. Un método de conformidad con la reivindicación 46, que comprende además los pasos de aislar un gen mutado en gusanos nematodos que presentan cambios en el régimen de bombeo de la faringe en la parte (e) utilizando técnicas genéticas. 48. Un método para identificar substancias química que modulan el efecto de un primer compuesto, dicho compuesto tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con el priner compuesto; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con una sustancia química adicional; y (d) detectar cambios en el régimen de bombeo de la faringe de los gusanos nematodos utilizando medio de detección no visuales. 49. Un método de conformidad con la reivindicación 48, en donde la segunda sustancia química suprime el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 50. Un método de conformidad con la reivindicación 48, en donde la segunda sustancia química incrementa el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 51. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 a 50, en donde los gusanos nematodos son nematodos microscópicos. 52. Un método de conformidad con la reivindicación 51, en donde los gusanos nematodos son C. elegans, o C. Briggsae. 53. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 a 52, en donde la etapa de detectar cambios en el régimen de bombeo de la faringe comprende la puesta en contacto de los gusanos nematodos con una molécula de marcador que genera una señal cuando es absorbida por gusanos nematodos y la detección de dicha señal utilizando medios de detección no visuales . 54. Un método de conformidad con la reivindicación 53, en donde la molécula de marcador es una molécula fluorescente, una molécula luminiscente, una molécula de color, un precursor de una molécula de marcador fluorescente, un precursor de una molécula de marcador luminiscente o un precursor de una molécula de marcador a color. 55. Un método de conformidad con la reivindicación 54, en donde dicha molécula de marcador puede ser disociada mediante la acción de una enzima presente en el intestino de los gusanos nematodos para generar una molécula fluorescente, una molécula luminiscente o una molécula de color. 56. Un método de conformidad con la reivindicación 55, en donde la molécula de marcador es calceína-AM, BCECF-AM, difosfato de fluoresceína (FDP) , diacetato de fluoresceína (FDA), CMB-leu, AMPPD o bien X-gluc. 57. Un método de conformidad con la reivindicación 55, en donde la molécula de marcador es sensible a cambios de pH. 58. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 a 57, en donde el medio de detección no visual es un lector de placas de pozos múltiples. 59. Un método de conformidad con la reivindicación 58, en donde el lector de placas de pozos múltiples efectúa detección de luminiscencia, fluorescencia o bien detección espectrofotométrica . 60. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 a 57, en donde el medio de detección no visual es un dispositivo FANS. 61. Un método de conformidad con la reivindicación 60, en donde el dispositivo FANS efectúa detección de luminiscencia, fluorescencia o bien detección espectrofotométrica. 62. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 a 61, en donde dichos gusanos nematodos son C. elegans de tipo silvestre, mutantes, transgénicos o humanizados . 63. Un método de conformidad con la reivindicación 62, en donde dicho C. elegans presenta un régimen de bombeo de la faringe alterado. 64. Un método de conformidad con la reivindicación 62, en donde dicho C. elegans mutante lleva una mutación en un gen que codifica una proteína SERCA y/o una proteína PLB y/o una proteína SLN. 65. Un método de conformidad con la reivindicación 63, en donde dicho C. elegans transgénico expresa un transgen que codifica una proteína SERCA o una proteína PLB. 66. Un método de conformidad con la reivindicación 65, en donde la expresión de dicho transgen es impulsada por un promotor específico para tejido. 67. Un método de conformidad con la reivindicación 65, o de conformidad con la reivindicación 66, en donde el C. elegans transgénico lleva además una mutación en el gen de C. elegans que codifica la proteína SERCA. 68. Un método de conformidad con la reivindicación 62, en donde dicho C. elegans muestra niveles alterados de uno o varios de los siguientes neurotransmisores: acetilcolina, serotonina, glutamato, octopamina, GABA o dopamina. 69. Un método de conformidad con la reivindicación 62, en donde dicho C. elegans transgénico expresa un transgen que comprende un gen tóxico. 70. Un método de conformidad con la reivindicación 69, en donde dicho gen tóxico codifica ataxina, alfa-sinucleina, ubiquitina, el producto de gen tau, el producto de gen de Huntington, el producto de gen de distrofia macular de Best, el producto de distrofia macular relacionado con la edad o bien el producto de gen unc-53. 71. Un método de conformidad con la reivindicación 69, o bien de conformidad con la reivindicación 70, en donde la expresión del gen tóxico es impulsada por un promotor específico para tejido que pueden dirigir la expresión de gen una faringe de C. elegans, en una subconjunto de células de la faringe de _C. elegans en las neuronas faríngeas o bien en una neurona faríngea única. 72. Un método de conformidad con la reivindicación 71, en donde la expresión del gen tóxico es impulsada por el promotor myo-2, el promotor unc-129, el promotor tmy-1 o el promotor daf-7. 73. Un método de conformidad con la reivindicación 69 o bien de conformidad con la reivindicación 70, en donde la expresión del transgen es impulsada por el promotor daf-7. 74. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 a 73, en donde los gusanos nematodos son sincronizados en la misma etapa de crecimiento. 75. Un método de conformidad con la reivindicación 74, en donde los gusanos nematodos son huevos, gusanos en etapa Ll, etapa L2, etapa L3, etapa L4, gusanos adultos o bien gusanos de tipo dauers. 76. Un método de conformidad con la reivindicación 74 o bien de conformidad con la reivindicación 75, en donde los gusanos son hermafroditas o machos. 77. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 a 76, en donde el método es efectuado en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para incrementar la viscosidad del medio. 78. Un método de conformidad con la reivindicación 77, en donde el polímero soluble en agua es carboximetilcelulosa, agarosa de bajo punto de fusión o bien polietilenglicol. 79. Un método de conformidad con la reivindicación 78, en donde el polímero soluble en agua es carboximetilcelulosa de viscosidad media. 80. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 77 a 79, en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es 0.3%. 81. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 a 76, en donde el método se efectúa en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para evitar que los gusanos nematodos se adhieran sobre las paredes de la placa de pozos múltiples. 82. Un método de conformidad con la reivindicación 81, en donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol, alcohol polivinílico o bien polivinilpirrolidona. 83. Un método de conformidad con la reivindicación 81, o de conformidad con la reivindicación 82, en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.01% a 10%. -84. Un método de conformidad con la reivindicación 83, en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.1%. 85. Un método de conformidad con la reivindicación 44, para su uso en la identificación de sustancias químicas que tienen una actividad insecticida potencial. 86. Un método para identificar substancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencial empleando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de : (a) proporcionar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con una muestra de una sustancia química; (c) detectar cambios en los niveles intracelulares de iones, metabolitos o bien mensajeros secundarios en células de los gusanos nematodos empleando un medio de detección no visual. 87. Un método de conformidad con la reivindicación 86, que comprende la detección de cambios en los niveles intracelulares de calcio, cAMP, diaciglicerol o bien IP3. 88. Un método de conformidad con la reivindicación 87, en donde los gusanos nematodos son C. elegans transgénicos que expresan una molécula de marcador codificada genéticamente, dicha molécula de marcador genera una señal en respuesta a cambios en cuanto a los niveles intracelulares de iones, metabolitos o mensajeros secundarios y el paso (c) comprende la detección de cambios en la señal generada por la molécula de marcador codificada genéticamente. 89. Un método de conformidad con la reivindicación 88, en donde la molécula de marcador codificada genéticamente es GFP-calmodulina o bien aecuorina. 90. Un método de conformidad con la reivindicación 88 o bien de conformidad con la reivindicación 89, en donde la molécula de marcador codificada genéticamente es expresada en células de la faringe, músculos de la vulva, músculos de la pared corporal o neuronas de C. elegans transgénico. 91. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 86 a 90, en donde el medio de detección no visual es un lector de placa de pozos múltiples. 92. Un método de conformidad con la reivindicación 91, en donde el lector de placa de pozos múltiples efectúa detección de fluorescencia, luminiscencia o detección espectrofotométrica . 93. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 86 a 90, en donde el medio de detección no visual es un dispositivo FANS. 94. Un método de conformidad con la reivindicación 93, en donde el dispositivo FANS efectúa detección de fluorescencia, luminiscencia o detección espectrofotométrica. 95. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 86 a 94 en donde los nematodos están sincronizados en la misma etapa de crecimiento. 96. Un método de conformidad con la reivindicación 95, en donde los nematodos son huevos, gusanos en etapa Ll, etapa L2, etapa L3, etapa L4, gusanos adultos o bien gusanos de tipo dauers . 97. Un método de conformidad con la reivindicación 95, o bien de conformidad con la reivindicación 96, en donde los nematodos son hermafroditas o machos. 98. Un método para identificar substancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencial utilizando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar número sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con una muestra de una sustancia química; (c) detectar cambios en el comportamiento de movimiento de los gusanos nematodos empleando medios de detección no visuales. 99. Un método para determinar el modo de acción de una sustancia química empleando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de un panel de gusanos nematodos mutantes, transgénicos o humanizados diferentes en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con la sustancia química; y (c) detectar cambios en el comportamiento de movimiento de los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales. 100. Un método para identificar componentes adicionales de la vía bioquímica sobre la cual actúa un compuesto que tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de : (a) someter una población de gusanos nematodos a mutagénesis aleatoria; (b) suministrar un gusano nematodo Fl mutagenizado en cada uno de los pozos de una placa de ensayes de pozos múltiples; (c) permitir que los gusanos nematodos Fl generar crías F2; (d) poner en contacto los gusanos nematodos cor- el compuesto; y (e) detectar cambios en el comportamiento de movimiento de los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales. 101. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 82, que comprende además los pasos de aislar un gen mutado en gusanos nematodos que presentan un cambio en cuanto al comportamiento de movimiento en la parte (e) utilizando técnicas genéticas. 102. Un método para identificar sustancias química que modulan el efecto de un primer compuesto, dicho compuesto tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de : (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con el primer compuesto; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con una sustancia química adicional; y (d) detectar cambios en el comportamiento de movimiento de los gusanos nematodos utilizando medios de detección no visuales. 103. Un método de conformidad con la reivindicación 102, en donde la segunda sustancia química suprime el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 104. Un método de conformidad con la reivindicación 103, en donde la segunda sustancia química incrementa el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 105. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 98 a 104, en donde los gusanos nematodos son nematodos microscópicos. 106. Un método de conformidad con la reivindicación 105, en donde los gusanos nematodos son C. elegans o C. Briggsae . 107. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 98 a 106, en donde el paso de detectar cambios en el comportamiento de movimiento de los gusanos nematodos comprende el nivel de autofluorescencia de una subregión del material en los pozos de la placa de ensayo de pozos múltiples. 108. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 98 a 107, en donde el medio de detección no visual es un lector de placa de pozos múltiples. 109. Un método de conformidad con la reivindicación 98, en donde el lector de placa de pozos múltiples efectúa detección de luminiscencia, fluorescencia, o bien detección espectrofotométrica. 110. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 98 a 109, en donde los gusanos nematodos están sincronizados en la misma etapa de crecimiento. 111. Un método de conformidad con la reivindicación 110, en donde los gusanos nematodos son huevos, gusanos en etapa Ll, etapa L2, etapa L3, etapa L4, gusanos adultos o bien gusanos de tipo dauer. 112. Un método de conformidad con la reivindicación 110 o bien de conformidad con la reivindicación 111, en donde los gusanos son hermafroditas o machos. 113. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 98 a 112, en donde los gusanos nematodos son una cepa de tipo silvestre, una cepa mutante, una cepa transgénica o una cepa humanizada. 114. Un método de conformidad con la reivindicación 113, en donde dichos gusanos nematodos son una cepa humanizada que expresa una o varias secuencias de ácido nucleico que codifica proteína de origen humano. 115. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 114, en donde dichos gusanos nematodos son C. elegans transgénicos que expresan un transgen que comprende un gen tóxico. 116. Un método de conformidad con la reivindicación 115, en donde dicho gen tóxico codifica ataxina alfa-sinucleina, ubiquitina, el producto de gen tau, el producto de gen de Huntington, el producto de gen de distrofia macular de Best, el producto de distrofia macular relacionada con la edad o bien el producto de gen unc-53. 117. Un método de conformidad con la reivindicación 115, o bien de conformidad con la reivindicación 116, en donde la expresión de gen tóxico es impulsada por un promotor específico para tejido que puede dirigir la expresión de genes en un tejido individual, un subconjunto de tipos de células, un tipo específico de células o bien una célula individual de C. elegans . 118. Un método de conformidad con la reivindicación 117, en donde la expresión del gen tóxico es impulsada por el promotor daf-7. 119. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 98 a 118 en donde el método se lleva a cabo en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para incrementar la viscosidad del medio. 120. Un método de conformidad con la reivindicación 119 en donde el polímero soluble en agua es carboximetilcelulosa, agarosa de bajo punto de fusión o bien polietilenglicol. 121. Un método de conformidad con la reivindicación 120 en donde el polímero soluble en agua es carboximetilcelulosa de viscosidad media. 122. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 119 a 121 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.3%. 123. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 98 a 118 en donde el método es efectuado en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para impedir que los gusanos nematodos se adhieran sobre las paredes de la placa de pozos múltiples. 124. Un método de conformidad con la reivindicación 123 en donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol, alcohol polivinílico o bien polivinilpirrolidona. 125. Un método de conformidad con la reivindicación 123 o bien de conformidad con la reivindicación 124 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.01% a 10%. 126. Un método de conformidad con la reivindicación 125 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.01%. 127. Un método para identificar sustancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencial utilizando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos hermafroditas en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos machos en cada uno de los pozos de dicha placa de ensayo de pozos múltiples; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con una muestra de una sustancia química; y (d) detectar la cantidad de huevos o crías que se producen utilizando medios de detección no visuales. 128. Un método para determinar el modo de acción de una sustancia química usando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos hermafroditas en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos machos en cada uno de los pozos de dicha placa de ensayo de pozos múltiples en donde los gusanos machos forman un panel de gusanos nematodos mutantes, transgénicos o humanizados diferentes; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con la sustancia química; y (d) detectar la cantidad de huevos o crías que se producen utilizando medios de detección no visuales. 129. Un método para identificar sustancias químicas que modulan el efecto de un primer compuesto, dicho compuesto tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende las etapas de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos hermafroditas en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos machos en cada uno de los pozos de dicha placa de ensayo de pozos múltiples; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con el primer compuesto; (d) poner en contacto los gusanos nematodos con una sustancia química adicional; y (e) detectar la cantidad de huevos o crías que se producen utilizando medios de detección no visuales. 130. Un método de conformidad con la reivindicación 129 en donde la segunda sustancia química suprime el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 131. Un método de conformidad con la reivindicación 129 en donde la segunda sustancia química incrementa el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 132. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 127 a 131, en donde los gusanos nematodos son nematodos microscópicos. 133. Un método de conformidad con la reivindicación 132 en donde los gusanos nematodos son C. elegans o C. Briggsae . 134. Un método de conformidad con la reivindicación 133 en donde los gusanos nematodos hermafroditas y/o gusanos nematodos machos son C. elegans mutantes, transgénicos o humanizados . 135. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 134 en donde C. el egans transgénicos expresan un transgen que comprende un gen tóxico. 136. Un método de conformidad con la reivindicación 135 en donde dicho gen tóxico codifica ataxina, alfa-sinucleina, ubiquitina, el producto de gen tau, el producto de gen de Huntington, el producto de gen de distrofia macular de Best, el producto de distrofia macular relacionada con la edad o bien el producto de gen unc-53. 137. Un método de conformidad con la reivindicación 135 o bien de conformidad con la reivindicación 136 en donde la expresión del gen tóxico es impulsada por el promotor her-1 P2, el promotor mab-18 o el promotor spe-Tl . 138. Un método para identificar sustancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencial empleando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos hermafroditas en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con una muestra de la sustancia química; y (c) detectar la cantidad de huevos o crías que se producen utilizando medios de detección no visuales. 139. Un método para determinar el modo de acción de una sustancia química empleando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de un panel de gusanos nematodos hermafroditas mutantes, transgénicos o humanizados diferentes en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con la sustancia química; y (c) detectar la cantidad de huevos o crías que se producen utilizando medios de detección no visuales. 140. Un método para identificar componentes adicionales de la vía bioquímica en la cual actúa un compuesto que tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) someter una población de gusanos nematodos a mutagénesis aleatoria; (b) suministrar un gusano nematodo Fl mutagenizado en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (c) permitir que el gusano nematodo Fl genere crías F2; (d) poner en contacto los gusanos nematodos con el compuesto; y (e) detectar la cantidad de huevos o crías que se producen empleando medios de detección no visuales. 141. Un método de conformidad con la reivindicación 140 que comprende además los pasos de aislar un gen mutado en los gusanos nematodos que presentan cambios en la cantidad de huevos o crías que se producen en la parte (e) empleando técnicas genéticas. 142. Un método para identificar sustancias químicas que modulan el efecto de un primer compuesto, dicho compuesto tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos hermafroditas en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con el primer compuesto; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con una sustancia química adicional; y (d) detectar la cantidad de huevos o crías que se producen empleando medios de detección no visuales. 143. Un método de conformidad con la reivindicación 142 en donde la segunda sustancia química suprime el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 144. Un método de conformidad con la reivindicación 142 en donde la segunda sustancia química incrementa el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 145. Un método de conformidad con la reivindicación 136 en donde los gusanos nematodos hermafroditas son C. elegans mutantes, transgénicos o humanizados. 146. Un método de conformidad con la reivindicación 145 en donde los C. elegans transgénicos expresan un transgen que comprende un gen tóxico . 147. Un método de conformidad con la reivindicación 146 en donde dicho gen tóxico codifica ataxina, alfa-sinucleina, ubiquitina, el producto de gen tau, el producto de ger- de Huntington, el producto de gen de distrofia macular de Best, el producto de distrofia macular relacionado con la edad o bien el producto de gen unc-53. 158. Un método de conformidad con la reivindicación 146 o bien de conformidad con la reivindicación 147 en donde la expresión del gen tóxico es impulsado por el promotor lin-31, el promotor egl-17, el promotor unc-17 o el promotor unc-53. 149. Un método de conformidad con la reivindicación 134 o de conformidad con la reivindicación 145 en donde los C. elegans transgénicos expresan una molécula de marcador. 150. Un método de conformidad con la reivindicación 149 en donde la molécula de marcador es una proteína fluorescente autónoma . 151. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 127 a 150 en donde el paso de detectar la cantidad de huevos o crías que se producen comprende la adición de un anticuerpo específico que se une con huevos, nematodos en etapa Ll, etapa L2, etapa L3 o bien etapa L4 y la detección de complejos formados por el enlace del anticuerpo con huevos, nematodos en etapa Ll, etapa L2, etapa L3, o bien etapa L4 empleando medios de detección no visuales. 152. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 127 a 151 en donde el medio de detección no visual es un lector de placa de pozos múltiples. 153. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 127 a 150 en donde el paso de detectar la cantidad de huevos o crías comprende el conteo directo del número de huevos o crías empleando un dispositivo FANS . 154. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 127 a 150 en donde el paso de detección de la cantidad de huevos producidos comprende la detección de la actividad de una enzima liberada a partir de los huevos al abrirse. 155. Un método de conformidad con la reivindicación 154 que comprende la detección de la actividad de quitinasa liberada de los huevos al abrirse. 156. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 127 a 155 en donde el método se efectúa en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para incrementar la viscosidad del medio. 157. Un método de conformidad con la reivindicación 156 en donde el polímero soluble en agua es carboximetilcelulosa, agarosa de bajo punto de fusión o bien polietilenglicol. 158. Un método de conformidad con la reivindicación 157 en donde el polímero soluble en agua es una carboximetilcelulosa de viscosidad media. 159. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 156 a 158 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.3%. 160. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 127 a 155 en donde el método se efectúa en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para evitar que los gusanos nematodos se adhieran sobre las paredes de la placa de pozos múltiples. 161. Un método de conformidad con la reivindicación 160 en donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol, alcohol polivinílico o bien polivinilpirrolidona. 162. Un método de conformidad con la reivindicación 160 o bien de conformidad con la reivindicación 161 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.01% a 10%. 163. Un método de conformidad con la reivindicación 162 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.1%. 164. Un método para identificar sustancias químicas que tienen una actividad farmacológica potencia empleando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos hermafroditas en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con una muestra de la sustancia química; y (c) detectar cambios en el comportamiento de defecación de los gusanos nematodos empleando un medio de detección no visual. 165. Un método para determinar el modo de acción de una sustancia química empleando gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de un panel de gusanos nematodos mutantes, transgénicos o bien humanizados diferentes en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con la sustancia química; y (c) • detectar cambios en el comportamiento de defecación de los gusanos nematodos utilizando un medio de detección no visual. 166. Un método para identificar componentes adicionales de la vía bioquímica en la cual actúa un compuesto que tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) someter una población de gusanos nematodos a mutagénesis aleatoria; (b) suministrar un gusano nematodo Fl mutagenizado en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (c) permitir que el gusano nematodo Fl genere crías F2; (d) poner en contacto los gusanos nematodos con el compuesto; (e) detectar cambios en el comportamiento de defecación de los gusanos nematodos empleando un medio de detección no visual. 167. Un método de conformidad con la reivindicación 166 que comprende además los pasos de aislar un gen mutado en gusanos nematodos que presentan cambios en cuanto al régimen de defecación en la parte (e) usando técnicas genéticas. 168. Un método para identificar sustancias químicas que modulan el efecto de un primer compuesto, dicho compuesto tiene un efecto definido sobre gusanos nematodos, dicho método comprende los pasos de: (a) suministrar números sustancialmente iguales de gusanos nematodos en cada uno de los pozos de una placa de ensayo de pozos múltiples; (b) poner en contacto los gusanos nematodos con el primer compuesto; (c) poner en contacto los gusanos nematodos con una sustancia química adicional; y (d) detectar cambios en el comportamiento de defecación de los gusanos nematodos empleando un medio de detección no visual. 169. Un método de conformidad con la reivindicación 163 en donde la segunda sustancia química suprime el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematcdos . 170. Un método de conformidad con la reivindicación 1€8 en donde la segunda sustancia química incrementa el efecto definido del primer compuesto sobre los gusanos nematodos. 171. Un método de conformidad con la reivindicación 170 en donde los gusanos nematodos son nematodos microscópicos. 172. Un método de conformidad con la reivindicación 171 en donde los gusanos nematodos son C. elegans o C. brigssae. 173. Un método de conformidad con la reivindicación 172 en donde los gusanos nematodos son C. elegans mutantes, transgénicos o humanizados. 174. Un método de conformidad con la reivindicación 173 en donde dichos C. elegans mutantes presentan un comportamiento de defecación anormal. 175. Un método de conformidad con la reivindicación 174 en donde los C. elegans mutantes están constipados. 176. Un método de conformidad con la reivindicación 174 en donde dichos C. elegans transgénicos expresan un transgen que comprende un gen tóxico. 177. Un método de conformidad con la reivindicación 176 en donde dicho gen tóxico codifica ataxina, alfa-sinucleina, ubiquitina, el producto de gen tau, el producto de gen de Huntington, el producto de gen de distrofia macular de Best, el producto de distrofia macular relacionada con la edad o bien el producto de gen t * 155 une-53. 178. Un método de conformidad con la reivindicación 176 o de conformidad con la reivindicación 177 en donde la expresión del gen tóxico es impulsada por el promotor unc-43 o el promotor unc-25. 179. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 164 a 178 en donde el método se lleva a cabo en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para incrementar la viscosidad del medio. 180. Un método de conformidad con la reivindicación 179 en donde el polímero soluble en agua es carboximetilcelulosa, agarosa de bajo punto de fusión o bien polietilenglicol. 181. Un método de conformidad con la reivindicación 180 en donde el polímero soluble en agua es carboximetilcelulosa de viscosidad media. 182. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 179 a 181 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es 0.3%: 183. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 164 a 178 en donde el método se efectúa en un medio de ensayo líquido que contiene un polímero soluble en agua en una concentración suficiente para evitar que los gusanos nematodos se adhieran sobre las paredes de la placa de pozos múltiples. 184. Un método de conformidad con la reivindicación 183 en donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol, alcohol polivinílico o bien polivinilpirrolidona. 185. Un método de conformidad con la reivindicación 183 o de conformidad con la reivindicación 184 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0.01% a 10%: 186. Un método de conformidad con la reivindicación 185 en donde la concentración de polímero soluble en agua en el medio líquido es de 0 .1%.
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