KR100848790B1

KR100848790B1 - 소나무 재선충, 다이플로스캡터 및 예쁜 꼬마선충에 대한살선충제의 고속 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR100848790B1
Application number: KR1020060134468A
Authority: KR
Inventors: 백융기; 정판영; 주효진; 이정의; 오완석
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-27
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2008-07-30
Also published as: WO2008078964A1; KR20080060425A

Abstract

본 발명은 소나무 재선충, 다이플로스캡터, 예쁜 꼬마선충의 살선충제로 이용 가능한 약물을 대량으로 고속 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 소나무 재선충, 다이플로 스캡터 및 예쁜 꼬마선충에 대한 살선충제의 고속 스크리닝 방법은, 소나무 재선충(B. xylophilus), 다이플로 스캡터(Diploscaptor) 그리고 예쁜 꼬마선충(C. elegans) 을 대상으로 96 웰플레이트와 에펜도르프 튜브를 이용한 1000 마리의 선충으로 약물에 대한 생존 유무를 확인한 결과를 에마멕틴 벤조에이드, 아바멕틴, 모란텔타트레이트 약물 결과를 대조군으로 비교하여 살선충제에 대한 효과를 테스트한다. 본 발명에 따르면, 소나무 재선충, 다이플로스캡터, 예쁜 꼬마선충을 죽이는 많은 약물을 실험실 내에서 빠르게 그 효과를 테스트할 수 있고, 이로 인하여 경제적인 효율성과 재현성이 증대된다.

대량 고속 스크리닝 분석방법, 소나무 재선충, 다이플로스캡터, 예쁜 꼬마선충, 살선충제

Description

소나무 재선충, 다이플로스캡터 및 예쁜 꼬마선충에 대한 살선충제의 고속 스크리닝 방법{HIGH SCREENING METHOD FOR NEMATICIDE TO B. XYLOPHILUS, DIPLO- SCAPTER AND C. ELEGANS}

도 1은 소나무 재선충(B. xylophilus)을 분리하는 사진이다.

도 2는 소나무 재선충, 다이플로스캡터(Diploscapter)와 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에 대한 대량 약물 스크리닝 방법을 도표화한 것이다.

도 3은 현재 효과가 밝혀진 약물(control drug)을 가지고 본 발명의 방법을 이용하여 효과를 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 4는 종래의 소나무 재선충에 대한 살선충 스크리닝 분석방법(screening system)인 코튼볼 분석방법(cotton ball assay)을 통한 비교 분석 결과 그래프이다.

본 발명은 소나무 재선충(B. xylophilus), 다이플로스캡터 (Diploscapter), 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 죽이는 약물(drug)을 대량 스크리닝하는 방법(high throughput assay)에 관한 것이다.

소나무 재선충(B. xylophilus)은 나무에 기생하는 선충으로서 나무 조직 내에 수분, 양분 이동통로를 막아 나무를 죽게 하는 해충으로, 가해 수종은 해송, 적송으로 현재 적합한 치료약이 없고 매개충에 대한 천적도 없어 한번 감염되면 100% 고사한다.

그리고, 다이플로스캡터(Diploscapter)는 흙속에서 사는 선충으로서 장균과 같은 박테리아를 섭취하면서 생존하는 선충으로 장 출혈성 대장균(O157:H7)을 비롯하여, 리스테리아 식중독균(Listeria monocytogenes) 및 살모넬라균(Salmonella entertica) 등과 같은 각종 병원성 미생물을 매개하는 것으로 밝혀졌다.

한편, 예쁜 꼬마 선충(C. elegans)은 다이플로스캡터(Diploscaptor)와 같이 흙속에서 사는 선충의 종류로서, 게놈 서열이 완전히 밝혀져 있고 실험군으로서 여러 장점을 갖고 있다. 따라서 현재 세계의 많은 과학자에 의하여 생화학적, 유전학적인 연구가 진행되고 있다.

그러나, 현재 소나무 재선충, 다이플로스캡터에 대한 방제약물을 개발하기 위한 효과적인 대량 스크리닝 방법(high throughput assay)은 없다.

소나무 재선충(B. xylophilus)의 경우, 현재 직접 소나무 재선충병에 감염된 나무에서 소수의 약물을 대상으로 스크리닝하는 방법과 코튼볼 분석방법(cotton ball assay) 등이 알려져 있으나 시간도 오래 걸리고, 경제성이나 재현성 문제점들 때문에 많은 약물을 고속으로 테스트하기에는 어려움이 많은 실정이다.

또한 다이플로스캡터(Diploscapter)의 경우에도, 병원성 미생물을 매개하는 선충이지만 아직까지 전 세계적으로 많은 연구가 이루어지지 않은 선충으로서, 약물테스트를 할 수 있는 방법이 알려져 있지 않다.

그리고, 예쁜 꼬마선충(C. elegans)은 토양에서 박테리아를 먹고사는 선충으로서 게놈서열이 완전히 밝혀져 있으며 연구를 위해 적합한 실험모델이다.

따라서, 본 발명은 상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 여러 기존의 약물을 대상으로 소나무 재선충, 다이플로스캡터(Diploscapter)를 죽이는 살선충제로 사용할 수 있는지를 대량으로 스크리닝할 수 있는 효과적인 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 기존의 번거롭고 제약이 심한 테스트 방법을 대신하여 실험실 내에서 수많은 약물을 손쉽고 간편하게 테스트할 수 있는 고속 스크리닝 방법을 제공한다.

그리고, 본 발명의 대량 약물 테스트(high throughput assay)시에 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 비교군으로 설정함으로써, 환경적인 약물 테스트가 가능하고, 더욱이 효과 있는 약물에 대한 생화학적 기전 연구가 동시에 가능하도록 하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 소나무 재선충, 다이플로 스캡터 및 예쁜 꼬마선충에 대한 살선충제의 고속 스크리닝 방법은, 소나무 재선충(B. xylophilus), 다이플로스캡터(Diploscaptor) 그리고 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 대상으로 96 웰플레이트와 에펜도르프 튜브를 이용한 선충으로 약물에 대한 생존 유무를 확인한 결과를 에마멕틴 벤조에이드, 아바멕틴, 모란텔타트레이트 약물 결과를 대조군으로 비교하여 살선충제에 대한 효과를 테스트하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 소나무 재선충, 다이플로 스캡터 및 예쁜 꼬마선충에 대한 살선충제의 고속 스크리닝 방법은,

첫 번째로, 소나무 재선충(B. xylophilus), 다이플로스캡터(Diploscapter) 및 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 10,000 선충수/㎖ 농도로 준비하고,

두 번째로는, 소나무 재선충(B. xylophilus)의 경우에는 96 웰플레이트(well plate)에, 다이플로스캡터(Diploscaptor)와 예쁜 꼬마선충(C. elegans)의 경우에는 에펜도르프 튜브(e-tuve)에 각각의 선충을 100 선충수/10 ㎕ 농도로 분주하고,

세 번째로는, 처리할 약물을 각각 200 mM 저장액(stock solution)으로 만들고, 이 저장액으로부터 5개의 최종농도 별로 희석시켜 이미 분주해 놓은 각각 선충에 처리하고,

네 번째로는, 각각의 선충별 생장 온도에서 배양하고,

다섯 번째로는, 배양 후 1시간, 6시간 때에 10 ㎕만을 따서 전체 선충수와 살아있는 혹은 죽어있는 선충의 수를 세고, 그리고 전체 선충수에 대한 죽어있는 선충의 수에 따라 각 약물의 50% 치사율 농도(IC50) 값을 결정하는 단계를 포함한 다.

또한, 소나무 재선충(B. xylophilus)의 경우에는 대량 약물 테스트(high throughput assay)에서 효과 있었던 약물을 대상으로 코튼볼 분석방법을 통하여 각 약물의 효과를 다시 확인한다.

여기서, 코튼볼 분석방법이란 효과 있었던 약물을 처리한 소나무 재선충을 플레이트에서 다시 5일간 배양한 후 재선충의 증식율을 구하여 약물의 살충효과를 다시 확인하는 방법이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예 만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

소나무 재선충(B. xylophilus ), 다이플로스캡터 ( Diploscapter ) 및 예쁜 꼬마선충( C. elegans)의 분리 및 준비

소나무 재선충(B. xylophilus)은 플레이트를 조각낸 후, 도 1과 같은 깔대기에 올려놓고 2차 증류수를 흘려보내면 소나무 재선충(B. xylophilus)들이 깔대기와 연결된 호스를 통하여 밑으로 내려간다. 호스 끝에는 밸브로 닫혀있어 소나무 재선충이 호스 끝에 침전된다. 재선충이 많이 모이면 밸브를 열어 재선충을 분리한다.

다이플로스캡터(Diploscaptor)와 예쁜 꼬마선충(C. elegans)은 플레이트에서 에스-완충액(S-basal) 혹은 엠9 완충액(M9 buffer)으로 플레이트에서 선충들을 닦아낸 후 원심분리기를 통하여 선충들만을 모은다.

실시예 2

각각 선충의 분주

각 선충들을 10,000 선충수/㎖ 농도로 소나무 재선충(B. xylophilus)의 경우에는 2차 증류수로 다이플로스캡터(Diploscaptor)와 예쁜 꼬마선충(C. elegans)의 경우에는 에스-완충액(S-basal) 혹은 엠9 완충액(M9 buffer)으로 희석시켜 준비한다.

그리고 소나무 재선충(B. xylophilus)은 96 웰플레이트에, 다이플로스캡터 (Diploscaptor)와 예쁜 꼬마선충(C. elegans)은 에펜도르프 튜브에 198 ㎕씩 분주한다.

실시예 3

각 약물들의 준비 및 선충에 처리

테스트할 약물들을 디메틸설폭시드(DMSO)에 200 mM로 녹인다 (DMSO의 최종농도는 1%가 되도록 한다. 이는 디메틸설폭시드 농도가 1% 이상이 되면 선충들에게 디메틸설폭시드가 좋지 않은 영향을 미치기 때문이다).

그리고 각 선충들이 분주된 96 웰플레이트 혹은 에펜도르프 튜브에 한 약물마다 최종 농도 2 mM, 1 mM, 0.1 mM, 0.01 mM, 0.001 mM로 각각 맞추어 약물들을 2㎕씩 처리한다.

실시예 4

전체 선충수와 살아있는 혹은 죽어있는 선충의 수를 세고 50% 치사율 농도( IC50 ) 결정 및 효과 있는 약물 스크리닝

소나무 재선충(B. xylophilus)과 다이플로스캡터(Diploscapter)는 25℃에서, 예쁜 꼬마선충(C. elegans)은 20℃에서 6시간을 반응시킨다. 그리고 배양 후 1시간, 6시간째에 각각 약물이 처리된 96 웰플레이트 혹은 에펜도르프 튜브에서 10 ㎕씩(100마리) 취하여 각각의 선충의 살아있는 선충수와 죽어있는 선충수를 센다.

그리고 각 농도에 따른 효과를 통하여 50% 치사율 농도(IC50) 값을 결정하고 효과 있는 약물을 결정한다. 효과 있는 약물의 결정시에는, 현재 소나무 재선충 방제약물로 알려진 에마멕틴 벤조에이드와 아바멕틴 모란텔 타트레이트(대조군)의 50% 치사율 농도와 비교하여 이보다 농도값이 낮은 약물들을 효과 있는 약물로 결정한다.

이와 같은 본 발명의 스크리닝 방법을 도 2에 도표화하여 나타내었다.

실시예 5

코튼볼 분석방법( cotton ball assay )

소나무 재선충(B. xylophilus)의 경우에는 대량 약물 테스트(high through-put assay)에서 효과 있었던 약물들을 대상으로 기존에 소나무 재선충에 대한 살선충 분석방법인 코튼볼 분석방법 (cotton ball assay)를 통하여 그 결과를 비교 및 확인하여 도 3 및 도 4에 나타내었다.

코튼볼 분석방법은 약물이 처리된 소나무 재선충이 일상적인 환경조건의 플레이트에서 재선충의 증식상태가 약물에 의하여 얼마나 영향을 받는지를 확인하는 방법으로서, 우선 소나무 재선충을 위의 스크리닝 분석방법과 마찬가지로 약물과 16-20 시간 동안 반응시킨다. 그리고 먹이로 사용되는 곰팡이가 처리된 플레이트에 약물을 처리한 소나무 재선충들을 올려놓고서 5일간 25℃에서 배양한다. 5일 후 재선충을 도 1의 방식으로 분리한 후 증식율을 구하여 약물의 살충효과를 다시 확인한다.

이상 기술한 바와 같이, 본 발명은 소나무 재선충병을 유발하는 소나무 재선충(B. xylophilus)과 장출혈성 대장균(O157:H7)을 비롯하여, 리스테리아 식중독균 (Listeria monocytogenes) 및 살모넬라균(Salmonella entertica) 등과 같은 각종 병원성 미생물을 매개하는 다이플로스캡터(Diploscaptor)를 특이적으로 죽일 수 있는 효과적인 약물을 찾아내기 위한 방법으로서, 많은 약물을 한꺼번에 스크리닝할 수 있는 대량 약물 테스트(high throughput assay) 방법이다.

본 발명에 의하여 종래의 방법보다 시간적, 경제적인 효율성이 증대될 뿐만 아니라 토양에서 박테리아를 먹고사는 선충인 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 비교군으로 설정함으로써 친환경적인 약물 테스트도 함께 가능하게 되었다.

또한,본 방법을 사용하게 되면 많은 비용과 시간이 들어가는 약물 스크리닝 방법을 실험실 내에서 굉장히 빠르고, 적은 비용으로 테스트할 수 있고, 종래의 방법보다 재현성을 높일 수 있어서 빠른 시간 안에 살선충제 약물을 개발하는 데 있어서 큰 효과가 있다.

Claims

삭제
소나무 재선충(B. xylophilus), 다이플로스캡터(Diploscapter) 및 예쁜 꼬마선충(C. elegans)을 10,000 선충수/㎖ 농도로 준비하는 제1 단계,

소나무 재선충(B. xylophilus)의 경우에는 96 웰플레이트(well plate)에, 다이플로스캡터(Diploscaptor)와 예쁜 꼬마선충(C. elegans)의 경우에는 에펜도르프 튜브(e-tuve)에 각각의 선충을 100 선충수/10 ㎕ 농도로 분주하는 제2 단계,

처리할 약물을 각각 200 mM 저장액(stock solution)으로 만들고, 이 저장액으로부터 5개의 최종농도 별로 희석시켜 이미 분주해 놓은 각각 선충에 처리하는 제3 단계,

각각의 선충별 생장 온도에서 배양하는 제 4단계, 그리고

배양 후 1시간, 6시간 때에 10 ㎕만을 따서 전체 선충수와 살아있는 혹은 죽어있는 선충의 수를 세고, 그리고 전체 선충수에 대한 죽어있는 선충의 수에 따라 각 약물의 50% 치사율 농도(IC50) 값을 결정하는 제5 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 소나무 재선충, 다이플로스캡터 및 예쁜 꼬마선충에 대한 살선충제의 고속 스크리닝 방법.
제2항에 있어서, 소나무 재선충(B. xylophilus)의 경우에는 대량 약물 테스트(high throughput assay) 결과 50% 치사율 농도(IC 50)가 결정이 된 약물을 대상으로 코튼볼 분석방법을 통하여 각 약물의 효과를 다시 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 소나무 재선충, 다이플로스캡터 및 예쁜 꼬마선충에 대한 살선충제의 고속 스크리닝 방법.
삭제