JP2002542466A - 化合物スクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
Description
などの線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質のスクリーニングに
関する。詳細には、本発明は、マルチウェルプレート形式で行われる高処理スク
リーニングを適用した方法に関する。
食物源(好ましくは、E.coli)と共に播種した栄養寒天上で実験室にて容
易に成長させることができる線虫である。各蠕虫は幼虫から体長約1mmの成虫
まで3日ほどで成長する。その寿命の全ての段階で完全に透明であるので、細胞
分裂、移動、および分化が生きた動物で容易に認めることができる。さらに、そ
の解剖学的性質が単純であるにもかかわらず、体細胞は、筋肉、ニューロン、腸
、および表皮を含む最も主要な分化組織型を示す。したがって、野生型蠕虫とか
け離れた表現型の相違が顕微鏡で直接か選択染色法によって比較的容易に観察さ
れる。
なツールとなる。特に、C.elegansを、試験化合物に暴露して任意の得
られた表現型および/または挙動の変化を記録する、潜在的な候補薬物の同定に
有用な高処理化合物スクリーニングの開発に使用することができる。
れたC.elegans表現型の比較によって外部分子と特異的遺伝子との間の
相互作用の確立に有用であり得る可能性は、Rand and Johnson
、Methods of Cell Biology、第8章、第84巻、「C
aenorhabditis elegans:現在の生物学的生物分析」、E
pstein and Shakes、Academic Press、199
5およびJ.Ahringer、Curr,Op.in Gen.and De
v.、7、1997、410〜415によって考慮されている。
寒天およびブロスに添加し、その後細菌を播種して蠕虫とインキュベートする化
合物スクリーニングアッセイを記載している。次いで、化合物への暴露の結果と
しての蠕虫の任意の表現型の変化を観察する。
力で有効なツールを提供するにもかかわらず、現在公知の化合物スクリーニング
技術は高処理スクリーニングに容易に供されない。これは、主に、化合物が蠕虫
の表現型に対する効果を有するかどうかを決定するために公知のアッセイ技術が
試験化合物に暴露される蠕虫の視覚的検査に依存するためである。従って、たと
え高処理スクリーニングに必要なマルチウェルアッセイ形式で行われても、アッ
セイ結果を同定するために肉眼で各ウェルを記録する必要がある。
ングでの使用により適切な生きたC.elegansを使用した信頼でき且つ再
現性のあるスクリーニング法が必要である。このようなスクリーニング法が利用
可能になれば、C.elegansのスクリーニングツールとしての有用性は劇
的に増大し、研究者が薬物発見および開発用の全動物系として非常に潜在的なC
.elegansを利用することができる。
する化学物質の同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と化学物質とを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する方法を提供する。
して蠕虫の表現型、挙動、生化学、または生理学の変化を記録する、標準的な化
合物スクリーニングである。このようなアッセイを、野生型線虫を使用して行う
ことができ、この場合、工程(c)で検出される「変化」は、一般に、野生型の
挙動などからかけ離れた変化である。しかし、検出される活性の型に依存して、
化合物スクリーニングを、非野生型線虫(例えば、非野生型特性を示すことがで
きる変異またはトランスジェニック蠕虫)を使用して行うこともできる。この場
合、工程(c)で検出される「変化」は、野生型の逆であり得る。典型的には、
化合物スクリーニングアッセイは、異なる濃度の試験化学物質と平行して多数の
混合物のアッセイを含む。典型的には、これらの濃度の1つを、ネガティブコン
トロール(すなわち、ゼロ濃度の試験物質)として使用する。次いで、化合物の
暴露に起因する挙動、表現型、生化学、または生理学などの変化を、ネガティブ
コントロールと比較して評価することができる。
て、前記方法は、 (a)実質的に同数の異なる変異線虫のパネルをマルチウェルアッセイプレート
の各ウェルに分配する工程と、 (b)前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する方法を提供する。
作用様式を決定することができる。例えば、化合物を暴露した蠕虫の性質または
特徴の検出/測定およびこの結果と既知のタンパク質において変異を保有する変
異蠕虫の性質または特徴との比較によってこれを行うことができる。添付の実施
例の実施例4は、CNS分野におけるこの例示を提供する。
用する生化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 (a)線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 (b)1つの変異誘発F1線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
配する工程と、 (c)F1線虫にF2子孫を産生させる工程と、 (d)前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 (e)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する方法を提供する。
プレッサースクリーニングである。サプレッサースクリーニングでは、蠕虫の化
学物質への暴露によって作製された表現型を抑制する変異の同定を目的とする。
抑制変異を保有する蠕虫を、通常、同一の化合物への野生型蠕虫の暴露によって
得られた表現型と比較して、化合物の存在下でより多数の「野生型」表現型を示
すことを基本として同定する。従って、抑制変異を同定するために、化合物への
暴露後に工程(e)において、表現型、生理学、生化学、または挙動の特徴が全
く変化しないか少ししか変化しない変異体を有効に調査する。
リーニングの実行によって得られる多くの利点が存在する。特に、標準的な寒天
プレートアッセイと比較して、マルチウェルプレートアッセイを行うにはより少
量の化合物しか必要としない。さらに、マルチウェルプレートを液体中で行うの
で、試験化合物は標準的プレートアッセイより有効に線虫によって取り込まれ、
また、液体では化合物は低濃度であるために寒天プレートよりも沈殿が少ない傾
向がある。
第1の化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と前記第1の化合物とを接触させる工程と、 (c)前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 (d)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する方法を提供する。
することができる。この原理を、添付の実施例8で例示する。
リーニングでの使用に適切である。好ましい実施形態では、マルチウェルプレー
トは96ウェルであるが、本発明はまた、別の数のウェル(6、12、24、3
84、864、または1536ウェルが含まれるが、これらに限定されない)を
有するマルチウェルプレートを適用可能である。用語「マルチウェルプレート」
および「マイクロタイタープレート」を、全体にわたって交換可能に使用する。
norhabditis属由来の線虫(特に、C.elegans)を使用して
行うことが好ましい。C.elegansおよびC.briggsaeが好まし
いが、本明細書中に記載のスクリーニング法を、他の線虫(特に、他の微視的線
虫、Caenorhabditis属に属する微視的線虫)を使用して行うこと
ができることが認識される。本明細書中で使用される、用語「微視的」線虫は、
成虫段階でC.elegansとほぼ同サイズ(1mmオーダーの長さ)の線虫
を含む。このおおよそのサイズの微視的線虫は、このようなスクリーニングを行
うために当該分野で一般的に使用される型の多ウェルプレートのウェルで容易に
成長することができるので、中程度から高処理スクリーニングでの使用に非常に
適切である。
、または生化学の変化を示すシグナルの検出を必要とする。非視覚的検出手段を
使用してこのシグナル(読み出しともいう)を検出することが本発明の方法の本
質的特徴である。本明細書中で使用される、用語「非視覚的検出手段」は、ヒト
の目での目視検査を必要としない任意のシグナル検出手段をいう。
、肉眼による線虫の目視検査を必要とする方法を使用して以前から公知のスクリ
ーニング方を超える大きな利点を示す。
ナルは、例えば、線虫自体が発生させる蛍光、発光、または比色シグナルまたは
蠕虫の全懸濁液中の光学密度の変化を含む種々の型であり得る。
加されたマーカー分子から発生する。マーカー分子は線虫によって取り込まれ、
線虫における化学物質の活性を表現型、生理学、挙動、または生化学の変化の結
果としてのマーカー分子の性質の変化に起因するシグナルの検出によって直接ま
たは間接的に監視することができる。
蠕虫は、試験化学物質の作用の結果としてマーカーを取り込むことができる。別
の可能性は、蠕虫に化学物資の添加前にマーカー分子を予備充填することができ
るか、蠕虫が培養された培地を介するか蠕虫が摂取する細菌もしくは他の食物粒
子を介してマーカー分子を送達させることができることである。
マーカーであり得る。トランスジェニックC.elegansの日常的な構築法
は当該分野で周知であり、適切なプロモーター配列を使用して、全ての細胞(特
に、組織または1つまたは複数の特定の細胞型)において遺伝子コードマーカー
を発現するC.elegansを構築することができる。適切な遺伝子コードマ
ーカー分子には、自己蛍光タンパク質(AFP)(緑色蛍光タンパク質(GFP
)および青色蛍光タンパク質(BFP)など)、エクオリン、アルカリホスファ
ターゼ、ルシフェラーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマーゼ、βガラクトシ
ダーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ノパリンシンターゼ、オクタピン
シンターゼが含まれる。
ことができる「前駆体」分子として線虫に添加することができる。この前駆体の
性質の変化に対する生化学活性によって測定することができるシグナルが発生す
る。この系の典型的な例は、線虫の腸に存在する酵素によって切断されて検出可
能な性質を有するマーカー分子(例えば、蛍光など)を発生させることができる
前駆体マーカー分子の使用である。このような前駆体マーカーの例には、カルセ
イン−AM、エステラーゼによって切断されるフルオレセイン二酢酸(FDA)
およびBCECF−AM、アルカリホスファターゼ基質(フルオレセイン二リン
酸(FDP)およびAMPPD)、アミノペプチダーゼ基質(CMB−leuな
ど)、グルクロニダーゼ基質(X−glucなど)が含まれる。
剤または発光消光剤を使用することができる。例えば、培地中の任意のバックグ
ラウンド蛍光を消光するために培地に消光剤を添加することができ、これにより
、線虫の腸由来の蛍光の視覚化をより容易にすることができる。
はマイクロタイターリーダーまたはelisaプレートリーダーとしても公知で
ある。マイクロタイタープレートリーダーの使用により、潜在的な薬理学的活性
を有する活性な化学物質を選択するための高処理スクリーニングが容易になる。
適切なマルチウェルプレートリーダーは、当該分野で一般的に使用されており、
市販されている。蛍光検出、発光検出、比色検出、分光光度検出、免疫化学的検
出、放射線検出、および光学密度検出を含む広範な検出法を使用して、このよう
なプレートリーダーを使用することができる。
質の活性の結果として発生するシグナルを定量的に測定することができることで
ある。定量的測定を行う能力とは、線虫に対する化合物の活性の定量的用量応答
曲線を構築することができることを意味する。この用量応答曲線を使用して、C
.elegansなどの線虫における化合物のIC50およびED50を決定し
て、至適濃度を決定することができる。さらに、用量応答曲線は、化合物の任意
の毒性の同定が可能であり、化合物の可能な第2の標的および副作用の指標とも
なり得る。
することもできる。このような検出系の例は、Union Biometric
a,Inc、Someville、MA、USAから市販されている「線虫ディ
スペンサー装置」に基づく。この装置は、流動細胞計測器(蛍光表示式細胞分取
器(FACS)など)と類似の性質を有する。したがって、これは、一般に、蛍
光表示式線虫分取デバイス(FANS)に相当する「FANS」装置ということ
ができる。FANSデバイスは、微視的線虫の性質(サイズ、光学密度、蛍光、
および発光など)の測定が可能である。少数の線虫を用いて行われるスクリーニ
ングアッセイ、わずかなシグナルを発するアッセイ、または食物の存在がシグナ
ルの測定に不利であり得るアッセイでは、FANSは好ましい検出装置である。
しかし、FANSの使用はこれらの実験条件に限定されず、一般に、FANSは
本明細書中に記載の全てのスクリーニング法に使用することができる。
ダーについて記載したスクリーニング法と非常に類似している。簡単に述べれば
、蠕虫をマーカー分子を含むか含まない化学物質と接触させる。適当な時間をお
いて、マルチウェルプレートを、FANS装置に供して、完全に自動化した手順
で蠕虫の特徴(全体のサイズ、蛍光、発光、または光学密度など)についてウェ
ル毎に分析する。次いで、所望の特性を記録する。FANSデバイスを使用して
、定量的にスクリーニングを行うこともできる。
ェルへの添加を確実にすることが重要であり得る。ウェルに添加された正確な蠕
虫数は、行われるスクリーニングの型および必要な感度に非常に依存し得る。9
6ウェルプレートを含む全てのプレート形式では、ウェルあたり1〜100匹、
より好ましくはウェルあたり10〜80匹、もっとも好ましくはウェルあたり8
0匹の蠕虫を使用することが好ましい。
ことができる。これを行うことができる1つの方法は、固体または液体培地中で
の当業者に公知の標準的な手順に従って培養した蠕虫の獲得およびこの蠕虫の粘
性溶液中への再懸濁による均一な懸濁液の形成である。溶液の粘度により懸濁液
中の蠕虫が均一に分散されるので、各ウェルへの同体積の均一な蠕虫懸濁液の添
加により実質的に同数の蠕虫を分配することができる。適切な粘性溶液には、低
濃度のポリマー材料(例えば、0.25%の低融点アガロース)、グリセロール
などを含む溶液が含まれる。
均等な分配を、Union Biometrica,Inc.などによって開発
された分配デバイスを用いて行うことができる。プレートの各ウェルへの設定数
の蠕虫を添加するように蠕虫ディスペンサーをプログラミングすることができる
。さらに、これを使用して、雌雄同体もしくは雄または耐性幼虫のみを分配する
ような方法において蠕虫を選択することができ、特に卵、L1、L2、L3、L
4、または成虫の蠕虫を分散させるようなサイズを基本として選択することもで
きる。
チウェルプレートのウェルに添加するのを超える利点を有し得ることを観察した
。本発明者らが記載したマルチウェルスクリーニングを、液体培地中で行う。し
かし、C.elegansなどの線虫の天然の環境は固体(例えば、土壌)であ
るので、液体培地での成長ではあまり健常な蠕虫が得られない。液体培地で成長
した蠕虫は、より長くかつ細く、咽頭ポンプ速度は減少し、蠕虫は運動性が低く
、あまり産卵しない。本発明者らは、粘性を増大させるため(すなわち、線虫培
養用の通常の液体培地(M9など)よりも高い粘度を得るため)の培地への水溶
性ポリマーの添加によりこの問題に対する解決法を見出した。粘性液体培地の使
用により、液体培地の利点(すなわち、液体での線虫の取り扱いやすさ)を保持
しながら蠕虫の健康が維持される。好ましいポリマー型は、低融点アガロース、
カルボキシメチルセルロース、およびポリエチレングリコール(特に、PEG8
000)である。ポリマーの至適添加量を日常的な実験によって同定することが
でき、これは、アッセイの読み出しの性質に依存して変化し得る。例えば、以下
の記載の「運動アッセイ」では、0.3%の培地粘性カルボキシメチルセルロー
スの添加が最適であることを見出した。本発明者らは、本明細書中に記載のスク
リーニングを行うための至適条件を決定するために、カルボキシメチルセルロー
スのいくつかの粘度変形形態を使用した。1つの実験では、カルボキシメチルセ
ルロースの3つの変形形態(すなわち、Sigma(St.Louis、MO、
USA)から入手した低粘度、中程度の粘度、および高粘度のカルボキシメチル
セルロース)を、0.3%の濃度で試験した(図11を参照のこと)。この濃度
で培地および高粘度カルボキシメチルセルロースはスクリーニングでの最高の結
果が得られることが認められた。実用的理由により、中程度の粘度のカルボキシ
メチルセルロースを使用することが好ましい。約0.3%のカルボキシメチルセ
ルロース濃度が大多数のスクリーニングに適切である。アッセイ培地の粘度を増
大させるための水溶性ポリマーの添加により、本明細書中に記載の任意の特異的
アッセイ型(咽頭ポンピングアッセイ、運動アッセイ、交配アッセイ、産卵アッ
セイ、および検出アッセイを含む)および事実上マルチウェル(マイクロウェル
)プレートで行われるC.elegansなどの線虫を使用した他の任意のアッ
セイ型を有意に改良することができる。
必要とされるよりも低濃度(線虫がマイクロタイタープレートのウェルに固着を
回避するのに十分な濃度)への水溶性ポリマーの添加によって改良することもで
きる。
このようなプレートの表面は疎水性である。従って、C.elegansなどの
線虫の外表はマイクロタイタープレート壁に固着する傾向があるので、マイクロ
タイタープレートで行われるアッセイの性能は著しく妨害される。異なる型のマ
イクロタイタープレートを使用してこの問題を回避することができるが、現在、
この問題を十分に低減するマイクロタイタープレートは市場に存在しない。本発
明者らは、線虫がマイクロタイタープレートの壁に固着するという問題を、アッ
セイ培地への適切な濃度の水溶性ポリマーの添加によって克服することができる
ことを新規に見出した。
PEG8000)、ポリビニルアルコール(PVA)、およびポリビニルピロリ
ドン(PVP)であり、PEG8000が最も好ましい。所与のスクリーニング
アッセイ型における所与のポリマー型について、培地に添加するポリマーの至適
添加濃度を日常的な実験によって容易に同定することができる。PEG8000
では、0.1%の濃度が、ほとんどのスクリーニング型で良好な結果が得られる
。0.01%〜10%の範囲のポリマー濃度も適切であり得るが、アッセイ型に
依存する。
よる96ウェルを超えるウェルを有するマルチウェルプレートで行われるアッセ
イが特に改良される。さらに、倍地中のポリマーの存在により、一般に、液体培
地中での線虫の操作(ピペッティングおよびFANSデバイス、Genetix
(Dorset、UK)のGfit2デバイス、およびマイクロタイタープレー
トへの充填に使用される他の自動化システムなどの操作)が容易になる。
のアッセイ培地への水溶性ポリマーの添加により、本明細書中に記載の任意の特
異的アッセイ型(咽頭ポンピングアッセイ、運動アッセイ、交配アッセイ、産卵
アッセイ、および検出アッセイを含む)および事実上マルチウェル(マイクロウ
ェル)プレートで行われるC.elegansなどの線虫を使用した他の任意の
アッセイ型を有意に改良することができる。
虫、およびヒト化蠕虫を含む)を使用して、本明細書中に記載の全てのスクリー
ニング法を行うことができる。トランスジェニック株は、生物の全体、生物の一
部、単一の組織、細胞型のサブセット、単一の細胞型、または生物の1つの細胞
において導入遺伝子を発現する株であり得る。変異蠕虫は、単一の遺伝子または
2つまたはそれ以上の異なる遺伝子において変異を有し得る。ヒト化蠕虫は、ヒ
ト標的タンパク質に特異的に指向されるが線虫の生物学のすべての利点および操
作の容易さを有するスクリーニングを行うために使用することができるので、ヒ
ト薬学的分野における潜在的な治療活性を有する化合物の同定に特に有用である
。
emic Press、1995に記載されている。選択したC.elegas
遺伝子の変異を有する標準的な変異蠕虫作製法については、例えば、J.sut
ton and J.Hodgkin、「線虫Caenorhabditis
elegans」、William B.Wood編、およびCommunit
y of C.elegans Researchers CSHL、1988
、594〜595;Zwaal et al.、「標的−凍結トランスポゾン挿
入変異バンクの使用によるCaenorhabditis elegansの不
活化」、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、7
431〜7435;Fire et al.、「C.elegansの二本鎖R
NAによる強力で特異的な遺伝学的干渉」、Nature, 391、860〜
811を参照のこと。蠕虫集団を、EMS、TMP−UV、または照射の使用に
よってランダム変異誘発に供することができる(Methods in Cel
l Biology、第48巻、同書)。次いで、所望の遺伝子中に欠失を有す
る変異蠕虫を選択するために、いくつかのPCR選択ラウンドを行うことができ
る。さらに、特異的C.elegans変異体の範囲を、C.elegans
Genetic Center、University of Minneso
ta、St.Paul、Minnesotaから利用可能である。
しないか、蠕虫が通常その生活環の間に暴露されない任意の外来分子であり得る
。これらの用語を、交換可能に使用することができる。例えば、蠕虫を公知の薬
理学的活性を有する薬局方に列挙の化学物質/化合物に暴露することができる。
あるいは、化学物質/化合物は、特定の生化学的経路または遺伝子との相互作用
が公知のものであり得る。さらにその代わりとして、こうちの生物活性を有さな
い公知の分子もしくは全く新規の分子または組み合わせ化学などによって得るこ
とができる分子のライブラリーを試験することである。DNA、RNA、PNA
、ポリペプチド、またはタンパク質である化合物も排除されない。
現するトランスジェニックC.elegansを使用して行う。この文脈では、
用語「毒性遺伝子」は、細胞に対して毒性を示すタンパク質をコードする任意の
核酸配列を含む。適切な例には、アタキシン、αシクレイン、ユビキチン、τ遺
伝子産物、ハンチントン遺伝子産物(ハンチングチン)、best黄斑ジストロ
フィー遺伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはunc−53遺
伝子産物が含まれる。等価の効果を有するアポトーシスまたは壊死に関連するタ
ンパク質をコードする「毒性遺伝子」を使用することもできる。適切な組織特異
的または細胞型特異的プロモーターを使用して、単一の組織、細胞型のサブセッ
ト、単一の細胞型、または単一の細胞(例えば、単一のニューロン)中の1つま
たは複数の毒性遺伝子を発現するトランスジェニックC.elegansを構築
することができる。毒性遺伝子の発現により、一般に、毒性遺伝子を発現する細
胞および組織の異常性/機能障害が得られる。多数の適切な組織、細胞型、また
は発達特異的プロモーターは、C.elegansにおける使用が公知である。
うこともできる。同期化蠕虫は、同一の成長期のものである。C.elegan
sなどの線虫の種々の成長期は、卵、L1期、L2期、L3期、L4期、および
成虫期である。さらに、本発明の好ましい実施形態では、同期化線虫は、特定の
性である。同期化培養物は、雌雄同体もしくは雄または耐性幼虫と呼ばれる特定
の幼虫期の線虫であり得る。
えば、Methods in Cell Biology、第48巻、同書)を
参照のこと。標準的C.elegans培養物の主な集団は雌雄同体蠕虫からな
るので、異なる成長期の同期化雌雄同体線虫を作製するための特別な技術は必要
ない。雄蠕虫を作成するために、いくつかの技術が文献中に記載されている。雄
が多数であるか、排他的に構成されるC.elegans培養物は、C.ele
gans II、Fiddle,Blumenthal,Meyer and
Pries編、1997、CSHL pressに記載されている。多数である
か純粋な雄サンプルの作製株は、Johnathan Hodgkin、Wor
m breeder’s gazette、15(5)、1999に記載されて
いる。C.elegans耐性幼虫を作製するために、いくつかの技術が記載さ
れている(Elegans II、同書)。主に、C.elegansの温度感
受性daf−c変異体を使用して耐性幼虫を作製するが、25℃で100%の耐
性幼虫を産生させるdaf2−ts変異体などの他の可能性も存在する。
生理学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の咽頭ポ
ンピング速度の変化を検出する工程を包含する。これらの方法を、その後集合的
に「咽頭ポンピングアッセイ」という。
って摂食する。次いで、液体を吐き出し、食物粒子を破砕し、腸内腔に内在化す
る。この工程を、咽頭の筋肉によって行う。液体の取り込みおよび吐き出しの工
程を、咽頭ポンピングまたは咽頭ポンピングと呼ぶ。
咽頭ポンピングの測定を利用して、筋肉および/または神経活性に対する効果を
有する化学物質を同定するための有用なスクリーニングを得ることができる。
に測定することができる。マルチウェルプレートリーダーを使用してこれを行う
場合、アッセイを迅速且つ定量的に行うことができる。
前駆体の使用によって、咽頭ポンピング速度を測定することができる。この目的
には、カルセイン−AMが特に好ましい。カルセイン−AMはエステラーゼの基
質であり、エステラーゼによるカルセイン−AMの切断の際にカルセイン(蛍光
分子)を放出する。エステラーゼはC.elegansなどの線虫の腸に存在す
るので、カルセイン蛍光の測定によって咽頭ポンピング速度を直接測定すること
ができる。
学物質の存在下または非存在下でのC.elegansの咽頭ポンピング速度を
測定した。これらの測定を定量的高処理法で行って、C.elegans咽頭の
ポンピング速度を変化させる化学物質を選択することができる。この方法は、カ
ルセイン−AMの使用に制限されず、以下の他の前駆体基質を使用することがで
きる: −エステラーゼ基質:カルセイン−AM、FDA、BCECF−AM −アルカリホスファターゼ基質:フルオレセイン二リン酸(FDP) −エンドプロテアーゼ:アミノペプチダーゼ基質:CMB−leu 発光読み出し −アルカリホスファターゼ基質:AMPPD 比色読み出し −グルクロニダーゼ基質:X−glucなど。
切断可能なマーカー分子前駆体(DNアーゼ、ATPアーゼ、リパーゼ、アミラ
ーゼなど)を見出すか開発することができる。一旦このようなマーカー分子が腸
に侵入すると、切断されてその後監視することができる検出可能なマーカーを放
出する。したがって、腸中の検出可能なマーカー分子の蓄積の側によって咽頭ポ
ンピング速度を直接測定可能である。
pHで蛍光を発する分子が有用である。Molecular probesのL
ysoSensor greenはこの性質を示し、これを首尾よく使用して咽
頭ポンピングを評価した。腸で認められる蛍光は類似しているが、カルセイン−
AMで得られる蛍光と比較してあまり蛍光を発しない。しかし、低pHで蛍光を
発するマーカー分子は、線虫の食物源(例えば、細菌)と共に使用することがで
き、pHの変化のみに依存し、関連する酵素ではないのでその後の読み出しを干
渉しないというさらなる利点を有する。
て酸性細胞小器官中に選択的に濃縮される弱酸である。このプロトン化はまた、
その弱酸側鎖による色素の蛍光消光を軽減する。したがって、LysoSens
or色素は、酸性条件下でより多くの蛍光を発する。酸性または中性の範囲(p
Ka約5.2または約7.5)のいずれかで至適pH感受性である青色蛍光Ly
soSensor Blueおよび緑色蛍光LysoSensor Green
プローブが利用可能である。その低pKa値を有するLysoSensor B
lue DND−167およびLysoSensor Green DNDは、
内部酸性区画に存在する場合以外はほとんど蛍光を発しない。
この表現型も示すトランスジェニック株の使用によって、咽頭ポンピングアッセ
イを行うこともできる。野生型株または構成的咽頭ポンピング株の使用によって
、ポンピング速度を向上、阻害、または調整する化学物質の同定が可能である。
の選択されたニューロンに支配されるので、咽頭ポンピング速度の変化の測定は
、神経伝達物質のシグナルおよび筋肉の刺激を研究するための良好なツールであ
る。咽頭ポンピング速度を定量的に測定することができ、このポンピング速度に
影響を与える化学物質をスクリーニングする方法を開発したので、本発明は、潜
在的な薬理学的活性を有する化学物質のスクリーニングおよび単離法である。
および/または神経伝達物質経路に対する活性を有する物質である。これらの化
学物質の標的であり得るタンパク質の例は、神経伝達物質レセプター(ムスカリ
ンレセプター、グルタミン酸レセプター、ホルモンレセプターおよび5−HTレ
セプター、カンナビノイドレセプター、アドレナリンレセプター、ドーパミンレ
セプター、オピオイドレセプター、GABAレセプター、アデノシンレセプター
、VIPレセプター、およびニコチンレセプターなど)、神経伝達物質合成に関
与するタンパク質、神経伝達物質放出経路タンパク質、Gタンパク質結合レセプ
タータンパク質である。さらに、(アデニル酸シクラーゼ、プロテインキナーゼ
A、cAMP応答エレメント結合タンパク質、IP3、ジアシルグリセロール、
プロテインキナーゼCホスホリパーゼA〜D、ホスホジエステラーゼなど)のG
タンパク質結合二次メッセンジャー経路についてのタンパク質、ギャップ結合機
能をコードするタンパク質、ミトコンドリアの酸化的リン酸化に関与するタンパ
ク質、イオンチャネルタンパク質、およびイオンポンプタンパク質もまた、この
ような化学物質の潜在的な標的である。このようなイオンチャネルの例は、ナト
リウム/カルシウムチャネル、カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル、およ
び塩素イオンチャネルである。一般に、C.elegans咽頭のポンピング速
度に影響を与え、且つ咽頭ポンピングスクリーニングを使用して同定される薬物
または化学物質は、おそらく以下の活性を示す化合物であろう。 −神経伝達分子に影響を与えるか神経伝達物質の合成前駆体である分子、 −神経伝達物質の合成を向上、阻害、または調整する分子、 −伝達物質を枯渇させる機能を有する分子、 −シナプス間隙中のシナプス小胞からの伝達物質の放出を防止または刺激する分
子、 −レセプターのインヒビターまたは刺激因子として機能する分子、 −伝達のインヒビターまたは刺激因子として機能する伝達分子を模倣する分子、
−伝達妨害物のアクチベーターまたはインヒビターとして機能する分子、 −ニューロンの興奮後に伝達物質の再取り込みを防止または刺激する分子、 −偽伝達物質(+/−)として機能する分子、 −レセプター集積を防止または刺激する分子、 −新規の経路で作用する分子。
使用することができる潜在的な薬理学的活性を有する広範な化学物質をスクリー
ニングすることができる。このアッセイを使用して、パーキンソン病およびアル
ツハイマー病に有効な化学物質を同定することもできる。さらに、咽頭ポンピン
グアッセイを使用して鎮痒薬、抗ヒスタミン薬、および抗痙攣薬を単離すること
もできる。ポンピングアッセイを使用して、抗線虫薬および殺虫剤を同定するこ
ともできる。
チルコリン、ドーパミン、セロトニン、グルタミン酸、GSBA、およびオクト
パミンを含む)同定することもできる。1つまたは複数の上記神経伝達物質レベ
ルの変化を示す選択性変異C.elegansを使用してこれを行うことができ
る。
個の神経伝達経路およびイオンチャネルをスクリーニングできる潜在性がある。
阻害と同様に活性化を観察することができるので、このスクリーニング法は、1
回のスクリーニングで40〜180個の標的のスクリーニングが可能である。
用様式の決定または特異的標的に作用する化学物質の選択に適用することができ
る。
数の定義された異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化線虫をマルチウ
ェルアッセイプレートのウェルに分配する。次いで、試験化合物のサンプルを各
ウェルに添加し、上記のように咽頭ポンピング速度の変化を検出する。各変異、
トランスジェニック、またはヒト化株について、任意の化学物質の非存在下での
咽頭ポンピング速度も記録する。従って、咽頭ポンピングアッセイを使用して、
定義された変異、トランスジェニック、またはヒト化株における咽頭ポンピング
速度を向上させるか抑制する化合物を同定することができる。
トランスジェニックC.elegansを列挙する。主に、これらの変異体およ
びトランスジェニックは、神経伝達物質合成、神経伝達物質シグナル伝達、およ
びイオンチャネルに関する。より詳細には、神経伝達物質レセプター(ムスカリ
ンレセプター、グルタミン酸レセプター、ホルモンレセプター、5−HTレセプ
ター、カンナビノイドレセプター、アドレナリンレセプター、ドーパミンレセプ
ター、オピオイドレセプター、GABAレセプター、アデノシンレセプター、V
IPレセプター、およびニコチンレセプターなど)、神経伝達物質合成に関与す
るタンパク質、神経伝達物質放出経路タンパク質、Gタンパク質結合レセプター
経路(アデニル酸シクラーゼ、プロテインキナーゼA、cAMP応答エレメント
結合タンパク質、IP3、ジアシルグリセロール、プロテインキナーゼC、ホス
ホリパーゼQなど)、ギャップ結合機能をコードするタンパク質、イオンチャネ
ルタンパク質、およびイオンポンプタンパク質に関する変異、トランスジェニッ
ク、およびヒト化蠕虫の例を示す。完全ではないが、本発明のこの態様での使用
に適切な周知の変異のリストを、本明細書中の実施例中に示す。
的に作用する化学物質をスクリーニングして抗精神病薬、抗鬱薬、抗不安薬、精
神安定剤、抗癲癇薬、筋肉弛緩薬、鎮静薬、または睡眠薬として治療に使用する
ことができる広範な化学物質を同定することが可能であるだけでなく、このスク
リーニングはパーキンソン病およびアルツハイマー病に効果を有し得る化学物質
も得られる。さらに、鎮痒薬、抗ヒスタミン薬、および抗痙攣薬を単離すること
ができる。おそらく化学物質の影響を受けることによって本アッセイによって検
出することができる伝達物質経路はアセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、
グルタミン酸、GSBA、およびオクトパミンの経路である。適切なトランスジ
ェニック、変異、または修飾株を使用して、特異的標的で作用する化合物につい
てスクリーニングすることが可能であり、殺虫剤および抗線虫薬もまた同定する
ことが可能である。
れた生化学的経路で活性を有する化学物質のスクリーニングを開発することがで
きる。例えば、公知の遺伝子または化合物中の選択された変異C.elegan
sの表現型を向上させる定義された変異を保有する選択された変異C.eleg
ansの表現型を回復する化合物のスクリーニングが可能である。
、潜在的な殺虫活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。本発明
者らは、殺虫活性を有する化合物(除草剤、殺虫剤、抗線虫薬、または抗真菌薬
など)へのC.elegansの暴露は、咽頭ポンピング速度に影響を与えるこ
とを観察した。これを、咽頭ポンピング法を使用して測定するとC.elega
nsの咽頭ポンピング速度に対する公知の殺虫剤の効果を示す添付の図18〜図
21に例示する。従って、殺虫活性を有する化合物をスクリーニングするために
、咽頭ポンピングスクリーニングを容易に適用することができる。
して定義された効果を有する化合物が作用する生化学的経路の成分をさらに同定
することができる。このスクリーニングを使用して、選択された化合物の活性を
向上、抑制、または調整する遺伝子の同定が可能である。マルチウェルプレート
を使用して何千もの蠕虫を1回でスクリーニングすることができるので、このス
クリーニングを直接勝つ迅速に行うことができる。
くつかの技術(EMS変異誘発、TMP−UV変異誘発、または照射変異誘発)
が記載されている(Methods in Cell Biology、第48
巻、同書)。次いで、変異誘発F1線虫をマルチウェルプレートの各ウェルに分
配し、ウェル中にF2世代に子孫を産生させる。次いで、線虫に対する公知の活
性を有する化合物のサンプルを、F2蠕虫に添加する。咽頭ポンピング速度の変
化を上記のように(例えば、マーカー分子またはマーカー分子前駆体の使用)監
視する。
を記録する。これらの変異蠕虫は、化合物によって影響を受ける1つまたは複数
の遺伝子の変異を有する。次いで、遺伝学的および分子生物学的技術を使用して
変異遺伝子を単離することができる。これらの遺伝子およびその対応するタンパ
ク質は、影響を受けた経路の重要な遺伝子およびタンパク質であると考えられる
ので、薬物発見肯定におけるさらなるスクリーニング開発用の新規の推定標的で
ある。本明細書中に記載の全ての方法と同様に、好ましくは微視的線虫、特にC
aenorhabditis属の蠕虫、最も好ましくはC.elegansを使
用してこの方法を行う。
虫に対して定義された効果を有する選択された化学物質のエンハンサー、サプレ
ッサー、またはモジュレーターである化学物質をスクリーニングすることもでき
る。
合物をマルチウェルプレートに置く。次いで、第2の化学物質を各ウェルに添加
し、選択された化合物の効果を向上、低減、または調整する化学物質を上記の方
法を使用した線虫の咽頭ポンピング速度の変化の検出によって同定する。この方
法は、選択された生化学的経路で活性な化学物質のスクリーニングに有用である
。従って、単離した化学物質は推定治療薬であるか、さらなる薬物開発の出発物 質 と考えることができる。
ウムATPアーゼ遺伝子(SERCA)および/またはそのレギュレーターであ
るホスホランバン(PLB)、およびサルコリピン(SLN)をトランスジェニ
ック、変異、ヒト化したC.elegansを使用してアッセイを行う。これら
の遺伝子は細胞中のカルシウムの内部保存の制御に重要である。
グ速度を変化させる化学物質は、SERCA、PLB、またはSLNの活性を変
化させるか、SERCA−PLBの内在化を変化させるか、SERCA−SLN
の相互作用を変化させるか、SERCA経路の活性を変化させる物質である。こ
のような化学物質は、治療薬として有用であるか、心血管疾患(高血圧、心肥大
、および心不全を含む)の領域だけでなく真性糖尿病の領域および骨格筋疾患(
ブロディー病を含む)の領域のさらなる薬物開発に有用な出発化合物であり得る
。
または機能を示す線虫を使用してアッセイを行うことができる。
するために必要である。さらに、咽頭ポンピングはいくつかのニューロンによっ
て制御されている。咽頭形態学および咽頭機能に必須の細胞は、咽頭筋細胞、咽
頭上皮細胞、咽頭腺細胞、および咽頭ニューロンである。これらの細胞型の1つ
が変化するか、変性するか、機能障害を起こした場合、咽頭は異常な形態学また
は異常な機能を有するので咽頭ポンピングが変化する。
.elegans変異体を列挙する。さらに、C.elegansの咽頭の形態
学および/または機能を維持するために必要な1つまたは複数の細胞型の欠失を
示すC.elegans蠕虫を作製することが可能である。これを、咽頭の細胞
中の「毒性遺伝子」の発現によって行うことができる。この文脈では、用語「毒
性遺伝子」は、細胞に毒性を示すタンパク質をコードする任意の核酸配列を含む
。適切な例には、アタキシン、αシクレイン、ユビキチン、τ遺伝子産物、ハン
チントン遺伝子産物、best黄斑ジストロフィー遺伝子産物、年齢関連性黄斑
ジストロフィー産物、またはunc−53遺伝子産物をコードする核酸が含まれ
る。等価の効果を有するアポトーシスまたは壊死に関連するタンパク質をコード
する「毒性遺伝子」を、使用することもできる。適切な発現パターンを指向する
ことができる組織特異的または細胞型特異的プロモーターを使用して、咽頭また
は咽頭内の特定の細胞型における毒性遺伝子の発現を行うことができる。例えば
、myo−2プロモーターを使用して咽頭中の発現を指向し、unc−129プ
ロモーターを使用して咽頭ニューロン中に発現を指向することができる。他の適
切なプロモーターには、トロポミオシンプロモーターtmy−1およびdaf−
7プロモーターが含まれる。咽頭の1つまたは複数の細胞型または咽頭ニューロ
ン中の毒性遺伝子の発現により、咽頭の形態学および/または機能が変化し、そ
れにより咽頭ポンピング速度が変化する。興味深いことに、daf−7プロモー
ターの調節下での毒性遺伝子の発現によるASIニューロンの破壊により、耐性
幼虫が形成される。これはインスリンの欠乏の結果であるので、ASIニューロ
ンを破壊したC.elegansを使用して糖尿病との関連付けに有用であるス
クリーニングを行うことができる。下記の咽頭ポンピングアッセイの読み出しま
たは運動アッセイの読み出しを使用してこれらのスクリーニングを行うことがで
きる(実施例12を参照のこと)。
て、咽頭ポンピング速度を変化させる(例えば変異/トランスジェニック表現型
を回復させるか変異/トランスジェニック表現型を向上させる)化学物質をスク
リーニングすることができる。従って、単離した化学物質は、抗鬱薬、抗精神病
薬、抗不安薬、精神安定剤、抗癲癇薬、筋肉弛緩薬、鎮静薬、抗片頭痛薬、鎮痛
剤、または睡眠薬などの治療薬または疾患領域のさらなる薬物開発の出発化合物
として有用であり得る。さらに、咽頭/咽頭ニューロンの細胞中に発現する毒性
遺伝子の性質の変化によって、パーキンソン病、アルツハイマー病、ローリー病
、Best黄斑ジストロフィー、年齢関連性黄斑ジストロフィー、およびポリグ
ルタミン誘導性疾患(ハンチントン病、ケネディー病、および運動失調など)の
治療法開発に有用な化学物質を単離することができる。さらに、咽頭ポンピング
速度の変化を示す変異またはトランスジェニック蠕虫を使用して、除草剤、殺線
虫薬、殺虫剤、および抗真菌薬などの農薬をスクリーニングすることができる。
加によって本明細書中に記載の咽頭ポンピングアッセイの能力を改良することが
できる。好ましいポリマー型は、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレング
リコール(特に、PEG8000)、および低融点アガロースである。任意の所
与のポリマー型および咽頭ポンピングアッセイ型について、培地に添加した至適
濃度のポリマーを、日常的な実験によって同定することができる。添付の図14
および図15に例示のように、アッセイ培地の粘度を増大させるためのポリマー
の添加により、C.elegansの咽頭ポンピングが増大する。これは、より
粘性の高い培地を使用するほどC.elegansが自然界で生息する固体条件
により近づけることができると考えられる。
溶性ポリマーのアッセイ培地への添加によって、咽頭スクリーニングの能力を改
良することもできる。好ましいポリマー型は、ポリエチレングリコール(PEG
)(特に、PEG8000)、PVA、およびPVPであり、PEG8000が
最も好ましい。所与の任意のポリマー型および咽頭ポンピング型における所与の
ポリマー型について、日常的な実験によって至適濃度のポリマーを培地に容易に
同定することができる。0.1%の濃度のPEG8000が特に好ましい。
加により、主に個体の死滅するか損傷を受けた個体数の減少による質が向上する
ことを観察した。アッセイの準備中に、手動または自動化システムのいずれかを
使用して異なるウェルおよびプレートに線虫を分配する必要がある。これらの線
虫の操作中には、線虫がピペットまたは他のツールに固着するリスクが存在する
。線虫が懸濁している培地の流動により、蠕虫が死滅する。培地へのPEG80
00の添加により、咽頭ポンピングアッセイにおいてポンピングが増加し、変形
が減少すると結論付けることができる(図10を参照のこと)。
生理学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程には、線虫細胞中
のイオン、代謝産物、または二次メッセンジャーの細胞内レベルの変化を検出す
る工程を包含する。
グナルの測定によって間接的に検出するのではなく、特異的イオン、代謝産物、
または二次メッセンジャーの存在下で性質を変化させた遺伝子コードセンサーの
活性の測定によって検出する。例えば、Ca2+の細胞内レベルを、遺伝子コー
ドカルシウムセンサー分子GFP−カルモジュリンまたはエクオリンを使用して
検出することができる。GFP−カルモジュリンは、カルシウムイオンの存在下
で蛍光を発することが公知である。従って、細胞内カルシウムレベルが低い場合
は蛍光を検出することができないが、カルシウムレベルが増加した場合、カルシ
ウムはGFP−カルモジュリンと結合して高次構造の変化を生じ、例えばマルチ
ウェルプレートリーダーを使用して検出することができる蛍光分子が得られる。
二次メッセンジャー(cAMP、ジアシルグリセロール、またはイノシトール三
リン酸(IP3)など)の存在下で蛍光または発光性を変化させた他の遺伝子コ
ードセンサー分子を使用することができる。
胞中で遺伝子コードセンサーを発現するトランスジェニックC.elegans
を用いて行う。これを、適切な活性を有する組織特異的または細胞型特異的プロ
モーターを使用して行うことができる。カルシウムシグナル伝達に感受性を示す
線虫の任意の細胞/組織(咽頭、陰門筋、体壁筋、およびニューロンを含む)中
でGFP−カルモジュリンを発現するトランスジェニック蠕虫を使用してこの方
法を行うことができる。先の例として、トランスジェニック蠕虫は野生型、トラ
ンスジェニック、またはヒト化株であり得る。
の細胞中のGFP−カルモジュリンを発現するトランスジェニック線虫において
検出される蛍光は咽頭ポンピングの指標であり、また、これらのトランスジェニ
ック蠕虫を使用して咽頭のポンピング速度に影響を与える化学物質をスクリーニ
ングすることができる。
学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の運動性の変
化を検出する工程を包含する。
するような方法で運動する。運動性が不完全な線虫は、液体培地の底の沈殿する
。線虫の運動表現型の結果としての線虫のこの特徴のために、運動する線虫と運
動しない線虫との間の相違の監視および検出が可能である。
制御される。従って、筋肉および/またはニューロン活性に対する効果を有し得
る化学物質を同定するための運動性の変化の検出に基づくスクリーニングを開発
することができる。
小領域を検出することができる。このプレートリーダーの使用によって、マルチ
ウェルプレートのウェルの選択された表面領域の測定が可能である。ウェルの中
央のみが測定されるように測定領域を中心に集める場合、線虫の自己蛍光(いか
なる外部マーカー分子の非存在下でも発生する蛍光)または光学密度を、運動性
が不完全な線虫を含むウェルと比較して正常に運動する線虫を含むウェル中で観
察することができる。正常に運動する線虫を含むウェルでは、低レベルの自己蛍
光または光学密度が認められる一方で、運動性が不完全な線虫を含むウェル中で
は高レベルの自己蛍光または光学密度が認められる。当該分野で周知の血小板凝
集アッセイの変形形態を使用して、光学密度を測定する。Dynex(USA)
のMRX暴露デバイスを使用して、ウェルあたり複数のポイントで線虫の沈殿パ
ターンを示す光学密度を測定することができる。
の測定および他方はウェルの縁での測定)で自己蛍光または光学密度の測定を行
うことができる。ウェルの中央だけでなくウェルの縁をさらに測定してさらなる
調節およびいくらかより明白な結果が得られるので、2つの測定の比較により類
似の結果が得られる。
とができる。すなわち、運動性アッセイを使用して線虫の運動性を変化させる化
学物質を同定することができるので、化合物の遺伝子エンハンサー、サプレッサ
ー、またはモジュレーターの同定用の筋肉および/またはニューロン活性に対す
る効果を有し得る。線虫の運動性に対する効果を有することが運動性アッセイを
使用して同定された化学物質(表10にまとめた)は、一般に、CNS関連薬の
クラスに属することだけでなく、GABAアンタゴニスト、NMDAアンタゴニ
スト、m−Gluアンタゴニスト、およびアドレナリンアンタゴニストも含まれ
ることが見出された。
運動しない線虫はウェルの底に沈むという原理に基づく。上記のように、線虫の
位置の違いにより、ウェルの中央で測定した場合にODが異なる。運動している
線虫は倍地中で希釈されたままであるが、重力の影響により長い時間をかけて沈
殿する傾向がある。
用いてこの問題を克服することができることを観察した。粘度の増大により、運
動している蠕虫に対する耐性をさらに増大させて培地中より良好に懸濁させるこ
とができる。本発明者らは、カルボキシメチルセルロースの低粘度、中程度の粘
度、および高粘度の変形(Sigma、St.Louis、MO、USA(上記
))を試験して、運動アッセイの最適条件を決定した。0.3%の濃度の培地粘
性カルボキシメチルセルロースが最適であると決定した。しかし、この結果は、
カルボキシメチルセルロースに制限されず、水溶性ポリマー(例えば、低融点ア
ガロース、PEGなど)を使用して運動性アッセイに類似の改良を達成すること
ができる。勿論、任意の所与のアッセイで使用した正確なポリマー濃度は、実行
が望まれる特定の型のアッセイに依存し、ポリマー濃度が非常に低い場合は培地
粘度が不十分であり、ポリマー濃度が非常に高い場合はゲルを形成して、アッセ
イ中に運動しない蠕虫が沈まなくなる。任意の所与のポリマー型およびアッセイ
型では、アッセイの至適な実行に必要なポリマー濃度を、日常的な実験で容易に
決定することができる。
における粘度の効果を同定し、その結果を図12および図13に例示する。この
研究では、運動性に欠陥を有するC.elegans UncおよびAce変異
体を、M9培地および粘度の異なる培地において互いに及び野生型C.eleg
ans N2と比較した。この実験結果は、高濃度のカルボキシメチルセルロー
ス培地が運動性アッセイを改良することを例示する。
溶性ポリマーをアッセイ培地に添加することによって、本明細書中に記載の運動
性アッセイの能力をさらに改良することができる。好ましいポリマー型は、ポリ
エチレングリコール(PEG)(特に、PEG8000)、PVA、およびPV
Pであり、PEG8000が最も好ましい。所与の任意のポリマー型および運動
性アッセイ型について、培地に添加するポリマーの至適濃度を日常的な実験によ
って容易に同定することができる。PEG8000では、0.1%の濃度が特に
好ましい。
特にCaenorhabditis属の蠕虫、最も好ましくはC.elegan
sを使用して運動アッセイ法を行うことが好ましい。異なる成長期で同期化した
蠕虫培養物を使用するか、雄、雌雄同体、または耐性幼虫を使用するか、変異、
トランスジェニック、またはヒト化蠕虫を使用して運動性アッセイを行うことが
できる。1つの変異C.elegans株であるace−1、ace−2二重変
異体は、運動性アッセイでの使用に特に有用である。この株は、いかなる運動性
も示さず、痙攣様表現型を有する。従って、これを使用して、不完全な運動表現
型を回復する化学物質をスクリーニングすることができる。これらの化学物質は
、筋肉および/またはニューロン活性に対する薬理学的効果を有し得る。
学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の交配挙動の
変化を検出する工程を包含する。
以下の工程が含まれる:バッキング、尾の湾曲、陰門の位置、および交尾。この
挙動を示すために、雄線虫は、交配構造に関連する少なくとも41個の特別の筋
肉細胞、79個のさらなるニューロン、36個のさらなるニューロン支持細胞、
23個の肛門細胞、および16個の皮下組織細胞を有する。いくつかのニューロ
ンの機能が記載されている。交配挙動が不完全ないくつかの変異体も記載されて
いる(C.elgans II同書、J.Sulton et al.、W13
G、7(2)、22;Loer and Kenyon、WBG、12(2)、
80、1992;Hadju et al.、Internationa wo
rm metting abstract、151、1991)。交配挙動の複
雑な性質のために、C.elegansの交配挙動を向上させるためのいくつか
の条件および変異体が記載されている。これらのうちの1つは、成虫期に麻酔さ
れた挙動を示すunc−52(e444)などの運動性が減少した雌雄同体の使
用である。
動の変化の検出に基づくスクリーニング(交配アッセイ)を使用して、筋肉およ
び/またはニューロンの活性を調整することができる化学物質を同定することが
できる。交配アッセイを使用して、交配を調整する化学物質を単離するか、交配
挙動にもたらす化合物の活性を調整する化学物質を単離するか、交配挙動におい
て活性である遺伝子および経路を単離するか、交配挙動に影響を与える化合物の
活性を調整する遺伝子および経路を単離することができる。言い換えれば、上記
の咽頭ポンピングアッセイおよび運動性アッセイと全く同一の目的に交配アッセ
イを使用することができる。
体条件下で、交配挙動に基づく高処理スクリーニングを行うことができる。この
目的には約0.5%の低融点アガロース溶液が適切である。この半固体培地によ
り、線虫は互いに移動して交配するのに十分に支持される。交配アッセイで適切
な粘度の培地を獲得するための他のポリマーの添加も使用することができる。
本発明の特定の実施形態では、自家受精によって子孫を産生することができない
特異的株を使用する。このようないわゆる雌雄同体「非自殖」は、子孫を産生し
ないが、交配した雌雄同体は、子孫を産生する。上記の運動性試験によって子孫
を直接測定するか、上記の咽頭ポンピングスクリーニングを行うことができるよ
うにカルセイン−AMなどの色素を培地に添加することができる。あるいは、特
異的抗体および蛍光抗体を使用して、子孫を検出することができる。卵、L1期
、L2期、L3期、またはL4期の蠕虫のみを認識する任意の特異的抗体は子孫
のみを認識し、例として、C.elegans L1幼虫の表面上の抗原を認識
する抗体が、Hemmer et al.、1991、J.Cell Biol
.、115(5)、1237〜47に記載されている。最後に、各ウェル中の卵
または子孫の数を、FANSデバイスを用いて直接計数することができる。
質(GFPまたはBFP)などのマーカー分子またはいくつかまたは全ての細胞
型中の蛍光マーカーを安定に発現するトランスジェニック蠕虫であり得る。これ
らのトランスジェニック蠕虫の交配によって産生された子孫もまたマーカー分子
を発現するので、マルチウェルプレートリーダーまたはFANSデバイスを使用
して容易に測定することができる。雄蠕虫がマーカーを発現するトランスジェニ
ック蠕虫である場合、雄および雌雄同体の交配に起因する子孫のみがマーカーを
発現し、雌雄同体の自家受精から産生された子孫はマーカー分子を保有しないの
で、雌雄同体は「非自殖」である必要が無い。したがって、交配および自家受精
に起因する子孫を、区別することができる。雌雄同体蠕虫はマーカー分子を発現
するトランスジェニック株である場合、雌雄同体株はまた「非自殖」株であるこ
とが好ましい。
を使用して、交配アッセイを行うこともできる。本明細書中に含まれる例により
、交配挙動に関連する特異的ニューロンのリストが得られる。例えば、咽頭ポン
ピングアッセイに関する上記の1つの毒性遺伝子発現によって、1つまたは複数
のこれらのニューロンの機能を破壊することができる。1つまたは複数の特異的
ニューロンが欠損したC.elegansの使用によって、特異的ニューロンシ
グナル伝達経路に作用する化学物質を同定するためのスクリーニングが可能であ
る。このようなスクリーニングを使用して同定した化学物質は、CNS関連薬理
学的活性を有し得る。
化を示すトランスジェニックC.elegansを使用して、交配アッセイを行
うこともできる。適切な組織または細胞型特異的プロモーターの調節下で上記の
毒性遺伝子の1つを使用した当該分野で公知の標準的技術に従って、適切なトラ
ンスジェニックC.elegansを構築することができる。この目的に有用で
あり得るプロモーターには、CP9での遺伝子に発現を指向するher−1 P
2プロモーター、ray6での遺伝子発現を指向するmab−18(pax−6
ホモログvab−3での遺伝子発現を指向する)プロモーター、受精嚢の60個
の細胞中の遺伝子発現を指向するspe−T1プロモーターが含まれる。
学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の産卵挙動の
変化を検出する工程を包含する。
個のニューロンを含み、そのうちHSNニューロンは産卵に最も重要であると考
えられている。さらに、少なくとも8個の子宮筋肉を記載した。生殖腺発達、産
卵、陰門発達、および機能におけるいくつかの変異体が記載されている(線虫C
aenorhabditis elegans、同書;C.elgans II
、同書)。
み出しを使用する高処理スクリーニングアッセイを開発することができる。また
、本明細書中に記載の咽頭ポンピングおよび運動性アッセイと同一の目的で、産
卵の検出に基づくアッセイを使用することができる。このアッセイでは、上記の
交配アッセイ技術を使用して得られた子孫数の計数によって産卵数を検出する。
施形態では、卵への特異的抗体の適用および当該分野で公知の卵を認識する抗体
に特異的な色素での対比染色によって、卵の量を測定することができる。さらな
る実施形態では、この方法は、卵殻を認識する特異的色素を使用して産卵数を検
出する工程を包含する。1つの特定の実施形態では、卵の孵化の際に放出される
物質を認識する色素を使用して、ウェル中の卵数の検出を行う。孵化工程の間に
、酵素キチナーゼが培地に放出される。酵素は、蛍光前駆体分子である基質4−
メチルウンベリフェリル2−D−N,N,N,−トリアセチルキトトリオシド(
または4−メチルウンベリフェリルβ−D−N,N’−ジアセチルキトビオシド
)(Sigma、St.Louis、MOから市販)を認識する。合成基質4−
メチルウンベリフェリルトリアセチルキトトリオシドの加水分解後にマイクロタ
イタープレートリーダー中の遊離4−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定する
。キチン部分に連結した色素を含むか、発光、蛍光、または有色色素であり得る
他の基質を、このようなスクリーニングで使用することができる。この例は、M
olecular Probes、Eugene、ORまたはSigmaから市
販されているN−アセチル−2−グルコサミニドまたはCM−DCF−NAGで
ある。キチナーゼ基質を用いた産卵アッセイを以下の一般的方法を使用して行う
ことができる。マイクロタイタープレート中の80μlのM9培地に30匹の線
虫を置く。10μlの適切な濃度の試験化合物を添加する。10μlの適切な濃
度のキチナーゼ基質を添加する。蛍光、発光、または色素の形成を種々の時間間
隔で測定する。典型的な実験結果を、図16および図17に示し、これは、時間
間隔が増加するほど良好な読み出せることを明白に示している。
理学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の排泄挙動
の変化を検出する工程を包含する。
の排泄を行う。これらの収縮は、前側の体壁筋から開始される。前側の体の収縮
頂点で、4つの肛門筋も収縮する。4つの肛門および腸筋は2つの腸筋、肛門下
制筋、および肛門括約筋である。この一連の筋収縮に加えて、運動ニューロンA
VLおよびDVBを含む特異的ニューロンもまた、排便の制御に関連する。排泄
には筋肉およびニューロンの両方の活性が必要であるので、C.elegans
などの線虫の排泄挙動の変化の検出に基づく読み出しを使用する高処理スクリー
ニングアッセイを開発することができる。また、本明細書中に記載の咽頭ポンピ
ングおよび運動性アッセイと同一目的に、排泄の検出に基づくアッセイを使用す
ることができる。
.elegans変異体)を使用して、排泄アッセイを行うことが好ましい。排
泄周期における全ての欠損を有するいくつかの変異体が報告されている(Tho
mas、Genetics、124、855〜872、1990;Iwasak
i et al.、PNAS、92、10317〜10321、1995;Re
iner et al.、Genetics、141、961〜976、199
5)。しかし、排泄インヒビターである化合物をスクリーニング可能な野生学蠕
虫または排泄欠損を含まない蠕虫を使用して、排泄アッセイを行うこともできる
。C.elegansの排泄には筋肉およびニューロンの活性が必要であるので
、排泄速度を変化させる化合物は、CNS関連薬理学的活性を潜在的に有し得る
。
して、C.elgansなどの線虫の排泄速度を容易に測定することができる。
マーカー分子を、それ自体が蛍光を発しない前駆体BCECF−AMの形態でC
.elegansの腸に充填することができる。BCECF−AMをマルチウェ
ルプレートのウェル中の培地に添加する場合、蠕虫は化合物を取り込んでC.e
legansの腸に存在するエステラーゼによって切断されてBCECFを放出
する。BCECF蛍光は、pH感受性であり、C.elegansの腸の比較的
低いpH条件下(pH6未満)で化合物は全く蛍光を発しないか非常に低い蛍光
を示す。排泄工程の結果として、C.elegansの腸よりも高いpHを有す
る培地にBCECFが放出されるので、BCECFは蛍光を発する。従って、倍
地中のBCECF蛍光レベル(Ex/Em=485/550に設定したマルチウ
ェルプレートリーダーを使用して測定)は、線虫の排泄速度の指標である。
の発光特性に基づく方法を使用して、排泄を測定することもできる。この方法は
2つの予備充填工程(第1に、マルチウェルプレートのウェルを、(線虫の添加
前に)DTPAなどのキレート剤に結合させたアスピリンを予備充填し、第2に
当該分野で公知の標準的な技術を使用して細菌または他の線虫食物源粒子を予備
充填する)を必要とする。次いで、DTPAなどのキレート剤を結合させたアス
ピリンでC.elegansを予備充填し、テルビウムを予備充填した細菌を与
える。
ンド発光レベルが低下する。線虫が細菌を摂取する場合、細菌成分は消化される
が、テルビウムは倍地中で純化される。次いで、遊離テルビウムを、ウェル中に
予備充填したアスピリンによってキレート化されて測定可能な発光が得られる。
したがって、認められた発光は、線虫排泄の指標である。
法は、テルビウムのアスピリンキレート化によって排泄を検出する上記の方法と
本質的に類似している。ランタニドキレート化法の主な利点は、キレート剤でウ
ェルを被覆するのではなく、線虫を入れた液体培地に添加することができること
である。
すことが公知の希土類金属である。周知のランタニドはユーロピウムおよびテル
ビウムであり、典型的なキレート剤はジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)
である。アッセイは、エステル化DTPAはテルビウムをキレート化できないと
いう原理に基づく。C.elegansによる消化後、このようなエステル化キ
レート剤は、腸エステラーゼで処理される。従って、排泄による放出の際、テル
ビウムを容易にキレート化するので、当該分野で公知の時間分解蛍光を使用して
検出可能である。この方法は、非常に少量の物質の検出が可能である。短いイン
キュベーション時間に適用する場合、この方法により排泄工程の欠損の監視が可
能である。
ニングの基本的実行プロトコルは、96ウェルを有するマルチウェルプレートに
ついて記載しているが、他のウェルプレート(6、12、24、384、または
1536ウェル)も使用することができる。
好ましい時期まで成長させた後、その後使用する前にM9緩衝液で洗浄し、アッ
セイ緩衝液(40mMNaCl、6mM KCl、1mM CaCl2)に再懸
濁した。(10×M9緩衝液:30g KH2PO4、60g Na2HPO4 、50g NaCl、10ml MgSO4をH2Oで1リットルにメスアップ
)。M9緩衝液以外の他の緩衝液も、この目的に適切であり得る。
を含むM9緩衝液)に再懸濁する。この手順により、均一で安定な蠕虫懸濁液が
得られる。低融点アガロース以外の他のポリマーもこの目的に使用することがで
きる。均一な蠕虫懸濁液の存在により、マルチウェルプレート中の蠕虫の等しい
分配が容易になるが、これは記載のスクリーニングアッセイには重要ではない。
ウェル上で均一な線虫の分布が得られる任意の他の方法も有用である。より詳細
には、蠕虫ディスペンサーの使用がさらに良好であり、マルチウェルプレートの
ウェル上により均一に蠕虫が分配される。
。この実験の好ましい設定では、40+/−5匹の蠕虫をマイクロタイタープレ
ートの各ウェルに添加する。
ができるが、選択したほとんどの化学物質は、DMSOに溶解するようである。
種々の濃度の化学物質をウェルに添加するが、最も明白な結果が得られるように
3μMと30μMとの間の濃度を選択することが好ましい。化学物質濃度を1μ
M未満〜100μMに変化させることによって用量効果のスクリーニングが可能
である。DMSO濃度は高すぎるべきではなく、好ましくは1%を超えるべきで
はなく、より好ましくはDMSO濃度は0.5%を超えるべきではなく、さらに
より好ましくはDMSO濃度は0.3%より低い。
て、異なるC.elegans株を使用することができる。一般に、C.ele
gansの咽頭のポンピング速度を阻害する化学物質を選択するためのスクリー
ニングを、構成的にポンピングする咽頭を有する変異C.elegans株を用
いて行う。野生型蠕虫もこの目的に使用することができるが、変異蠕虫が好まし
い。ポンピングのインヒビターを選択するために、他のC.elegans変異
体をこのスクリーニングで使用することができる。構成的にポンピングする咽頭
を有する選択された変異C.elegansは、一定の速度で腸に培地をポンピ
ングし、この表現型の減少/回復を容易に記録することができ、化学物質の検出
および選択が容易である。
一般に、野生型C.elegans蠕虫を使用してスクリーニングを行うが、他
の変異体をこのスクリーニングに使用することができる。食物源は咽頭ポンピン
グを誘導するためのシグナルの1つであるので、いかなる食物源も含まない液体
培地中で野生型蠕虫はポンピングしないかポンピングが減少する。野生型蠕虫は
、このアッセイでポンピング速度が減少し、ポンピング速度の向上を容易に記録
することができる。
gans腸中のマーカー色素の形成の測定によって咽頭ポンピング速度を直接測
定する。カルセイン−AMを、C.elegansの腸に存在するエステラーゼ
によって切断し、蛍光分子であるカルセインを放出させる。どの程度の培地が蠕
虫の腸に侵入し、どの程度のカルセイン−AMが蠕虫の腸に侵入するのかを、咽
頭ポンピング速度によって同定する。したがって、線虫の腸中の蛍光で検出可能
なカルセインの蓄積の測定によって、咽頭のポンピング速度の決定が可能である
。
か取り込まれるので、幾らかの蛍光シグナルが得られる。さらに、マルチウェル
プレートリーダーを使用して蛍光を迅速且つ定量的に測定することができるので
、潜在的な薬理学的活性を有する化学物質同定用の迅速で定量的な高処理スクリ
ーニング法が得られる。
Mと100μMとの間の濃度のカルセイン−AMを培地に添加する。5〜10μ
Mのカルセイン−AMを使用するのが好ましい。以下の設定:Ex/Em=48
5/530のマルチウェルプレートリーダー(Victor2、Wallac
Oy、Finland)を使用して、蛍光を測定する。
ン−AMに限定されない。他の手順を使用することができるので、本明細書中に
記載のアッセイを他の手順に適切なように変更することができる。前駆体をエス
テラーゼで切断することができるが、これは、線虫の腸中の他の酵素の基質であ
ってもよい。さらに、マーカー分子は、蛍光分子である必要は無いが、他の方法
で検出可能な分子であり得る。これらの前駆体物質のほとんどが市販されている
か、当該分野で公知の方法により合成することができる。いくつかの例を以下に
示す。 蛍光読み出し −エステラーゼ基質:カルセイン−AM、FDA、BCECF−AM、 −アルカリホスファターゼ基質:フルオレセイン二リン酸(FDP)、 −エンドプロテアーゼ:アミノペプチダーゼ基質:CMB−leu、 発光読み出し −アルカリホスファターゼ基質:AMPPD、 色素読み出し −グルクロニダーゼ基質:X−gluc。
アーゼ、ATPアーゼ、リパーゼ、およびアミラーゼである。種々のマーカー分
子(主に蛍光)の概要は、「蛍光プローブおよび実験化合物ハンドブック」、m
olecular probes、R.P.Haughland編に見出すこと
ができる。
から選択した160種の周知の薬物をスクリーニングで使用して、咽頭ポンピン
グ法の能力を試験した。試験した薬物は、種々のカテゴリーに属し、鎮痛剤、抗
糖尿病薬、抗不整脈薬、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、コリンエステラー
ゼインヒビター、プロトンポンプインヒビター、および抗鬱薬が含まれる。
egans咽頭のポンピング速度を、実施例2に記載のようにカルセイン−AM
を使用して測定した。C.elegans野生型N2株を使用して、ポンピング
表現型のエンハンサーを選択し、構成的にポンピングする咽頭を有する変異C.
elegans株を使用して、ポンピングのインヒビターを検出した。
に添加した。約1時間後に蛍光を測定した。
約1時間インキュベートする。化学物質が咽頭のポンピング速度を活性化または
阻害させるこのインキュベーション期間後、カルセイン−AMを添加した。次い
で、プレートをさらに1時間インキュベート後、マイクロタイタープレートリー
ダーで蛍光を測定した。
ではないが咽頭ポンピング速度活性を有するほとんどの化合物がCNS薬、カル
シウムチャネルインヒビター、および筋肉弛緩薬のファミリーに属し、これは、
C.elegans咽頭アッセイは上記の領域で活性を有する化合物スクリーニ
ングの良好なモデル系であることを示す。
とんどの化合物)が検出され、これらには、以下のが含まれる:メトリホナート
、フィゾスチグミン、アトロピン、L−ヒヨスチアミン、ジフェニルヒダントイ
ン、およびZAPA。これら全ての化合物は、CNS薬として公知であるか、ア
ルツハイマー病の治療に使用されているか、抗精神病薬、抗鬱薬、または抗癲癇
薬として使用されている。
。14種の咽頭ニューロンのうち、少なくともニューロンI1、I2、M3、M
C、NSM、M1、RIP、およびM4は咽頭ポンピングに重要であることが示
されており、ニューロンMC、M3、M4、およびNSMは咽頭の収縮/ポンピ
ング比を制御することが公知である。これらは、それぞれポンピング速度、筋肉
弛緩のタイミング、峡部蠕動、および食物の認知を調節する。線虫C.eleg
ansにおけるニューロンシグナル伝達に関与する主な神経伝達物質は、アセチ
ルコリン、セロトニン、グルタミン酸、オクトパミン、ドーパミン、およびGA
BAである(線虫kCaenorhabditis elegans、W.B.
Wood et al.編、CSHL press、1988、337〜392
)。
グ速度は神経伝達物質のインヒビターおよびアゴニストならびに神経伝達経路(
カルシウムチャネル、ナトリウム/カルシウムチャネル、塩素イオンチャネル)
を阻害するか向上させる化合物に影響を受けることが明らかである。これらの化
学物質は、広範な処方薬(抗鬱薬、抗精神病薬、抗不安薬、精神安定剤、抗癲癇
薬、筋肉弛緩薬、鎮静薬、抗片頭痛薬、鎮痛剤、または睡眠薬など)で使用され
ている。これらの中枢神経系(CNS)関連薬のいくつかは、CNS関連性遺伝
病(パーキンソン病およびアルツハイマー病)などの疾患領域に適用されている
。
るその生化学的機能にしたがって分類することが最適である。簡単に述べれば、
CNS関連薬は、少なくとも以下の経路の特徴によって影響され得る。 −CNS薬は前駆体化合物に影響され得るか、神経伝達物質合成用の前駆体分子
であり得る。 −CNS薬は、神経伝達物質合成を向上、阻害、または調整することができる。
−CNS薬は、伝達物質の枯渇機能を有し得る。 −CNS薬は、シナプス間隙中のシナプス小胞からの伝達物質の放出を防止する
か刺激することができる。 −CNS薬は、レセプターのインヒビターまたは刺激剤として機能することがで
きる。 −CNS薬は、伝達物質を模倣することができる。 −CNS薬は、誘導インヒビターまたはアクチベーターとして機能することがで
きる。 −CNS薬は、誘導遮断のアクチベーターまたはインヒビターとして機能するこ
とができる。 −CNS薬は、ニューロン興奮後の伝達物質の再取り込みを防止または刺激する
。 −CNS薬は、偽伝達物質(−/+)として機能することができる。
薬)を、塩化物イオンチャネル遮断薬、ナトリウム/カリウムチャネル遮断薬、
カルシウム遮断薬、および他のイオンチャネル遮断薬のクラスで見出すことがで
きる。
itro」スクリーニング法が開発されている。これらのスクリーニング法(「
in vitro結合アッセイ」または「クローン化輸送体アッセイ系」とよぶ
)は、当業者に周知である。これらのアッセイでは、特定のレセプターを保有す
る細胞膜を、哺乳動物組織または特異的組織培養物から単離する。ほとんどの場
合、所望のレセプターを過剰発現する細胞からこれらの膜を単離する。膜に存在
するレセプター型に依存して、神経伝達物質(アセチルコリン、ドーパミン、セ
ロトニン、グルタミン酸、GSBA、およびオクトパミンなど)だけでなくホル
モン物質(ノルエピネフリン、アドレナリンなど)などがスクリーニングアッセ
イの対象である。レセプターリガンド(ほとんどの場合神経伝達物質である)が
放射性標識されている場合、レセプターへのリガンドの結合速度の測定が可能で
ある。次いで、レセプターへの放射性リガンドの結合速度を比較する実験条件を
設定することができる。次いで、レセプターへのリガンドの結合を変化させる推
定CNS薬および他の化学物質を単離することができる。この方法のいくつかの
変形形態が開発されており、そのいくつかにより、リガンドの再取り込みを阻害
する化合物(セロトニン、ノルエピネフリン、およびドーパミンなど)を単離す
ることができる(Koppel et al.、Chem.Biol.、199
5、Jul 2:7、483〜7;Beique et al.、Eur.J.
Pharmacol.、1998、May 15、349:1、129〜32)
。CNS関連薬のスクリーニング用に開発されている他の系は、哺乳動物由来の
単離組織または器官を含む。さらに、マウスなどの生きた動物を用いたCNS関
連薬を単離するための系が記載されている。
単離することができるにもかかわらず、これらの「in vivo」アッセイは
、所望のレセプターとの会合のみを監視するので、単離化合物のin vivo
効果を反映しない。さらに、神経伝達物質経路カスケードにおけるそれぞれの潜
在的な標的について、「in vitro結合アッセイ」を開発する必要がある
。さらに、上記のCNS関連薬の推定標的のいくつかについては、アッセイが開
発されていないか、これらのアッセイは開発が困難であるか、高処理スクリーニ
ングが不可能である。組織および動物モデルを用いた公知の全てのアッセイもま
た、後者の問題を抱えている。さらに、動物組織または器官を使用したアッセイ
は、大量の動物の屠殺および高等動物の使用に基づく方法のスクリーニングを含
み、動物福祉の問題により避けられつつある。
パミン、セロトニン、グルタミン酸、オクトパミン、GABAなど)が活性を示
すかどうかを同定することができる。さらに、新規に単離した化学物質の作用様
式を決定し、潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の一定の経路を選択的にス
クリーニングすることが可能である。
築されている。標準的技術(すなわち、遺伝子ノックアウト)によって欠損を安
定に移入することができるが、RNAi技術によって一過性に移入することもで
きる。両技術はC.elegans遺伝学の分野で周知である。この線虫群に影
響を与える遺伝子は、1つまたは複数の神経伝達物質経路に関連するものである
。影響を受ける遺伝子の例は、神経伝達物質レセプター(ムスカリンレセプター
、グルタミン酸レセプター、ホルモンレセプターおよび5−HTレセプター、カ
ンナビノイドレセプター、アドレナリンレセプター、ドーパミンレセプター、オ
ピオイドレセプター、GABAレセプター、アデノシンレセプター、VIPレセ
プター、およびニコチンレセプターなど)、神経伝達物質合成または神経伝達物
質放出経路に関与するタンパク質、Gタンパク質結合レセプターをコードする遺
伝子、アデニル酸シクラーゼ、プロテインキナーゼA、cAMP応答エレメント
結合タンパク質、ホスホリパーゼCなどのGタンパク質結合二次メッセンジャー
についてのタンパク質をコードする遺伝子、ギャップ結合機能をコードする遺伝
子、ならびにイオンチャネルおよびイオンポンプをコードする遺伝子である。
変異体を試験し、参考に結果を蓄積しておく。次いで、咽頭ポンピングスクリー
ニングにおいて未知の作用様式を有する化合物を試験し、得られた結果を変異体
から得た参考結果と比較して、化合物の作用様式または経路を決定する。
(Mithod in Cell Biology、第48巻に記載)を使用し
て、ヒト遺伝子を発現するようにC.elegansを操作することができる。
一過性および安定なトランスジェニック線虫を再度構築することができ、線虫C
.elegansにおける非相同的および相同的導入遺伝子操作法は、当該分野
で周知である。これらの導入遺伝子を、咽頭特異的プロモーターを使用して咽頭
細胞中に単独で発現させることができるが、咽頭のポンピング速度に影響を与え
るニューロン中に単独で発現させることもできる。
、トランスジェニックC.elegans中で発現する導入遺伝子は、神経伝達
物質レセプター(ムスカリンレセプター、グルタミン酸レセプター、ホルモンレ
セプターおよび5−HTレセプターなど)、神経伝達物質合成、神経伝達物質放
出経路、およびGタンパク質結合レセプターをコードすることができる。これら
の導入遺伝子は、ヒト起源の配列をコードするタンパク質であり得る。現在まで
に、少なくとも400個のGタンパク質結合レセプターが配列決定されている。
さらに、アデニル酸シクラーゼ、プロテインキナーゼA、cAMP応答エレメン
ト結合タンパク質、ホスホリパーゼCなどのGタンパク質結合二次メッセンジャ
ーについてのタンパク質をコードする遺伝子、ギャップ結合機能をコードする遺
伝子、ならびにイオンチャネルおよびイオンポンプをコードする遺伝子を、線虫
の咽頭またはニューロンに発現させることができる。
るか、変異C.elegans株であり得る。好ましくは、蠕虫は、ヒト化され
ており、これは、ヒト起源のタンパク質コード核酸配列である導入遺伝子が対応
するタンパク質をコードするC.elegans遺伝子用に作製した変異させた
蠕虫で発現することを意味する。
C.elegans II、CSHL pressおよび「C.elegans
ゲノムの神経生物学」、C.I.Bargmann、Science、282、
2028〜2033に見出すことができる。Gタンパク質の完全なリストを、「
Caenorhabditis elegansの完全なGタンパク質遺伝子フ
ァミリー」、Jansen G.et al.、Worm Breeders
Gazette、第15(5)巻、1999年2月に見出すことができる。
elegans変異体のいくつかの例を、以下に列挙する。対応するC.ele
gansおよびヒトタンパク質をコードする導入遺伝子の発現をC.elega
ns野生型またはC.elegans変異株で操作して、トランスジェニックお
よびヒト化蠕虫を得ることができる。
of Minnesota、St.Paul、MinnesotaのC.el
egans変異体群から、C.elegans C.elegans変異体の範
囲を得ることができる。あるいは、特異的変異体を標準的方法で作製することが
できる。このような方法は、Anderson、Methods in Cel
l Biology、第48巻、「C.elegans:生物の現代生物学的分
析」、31〜58に記載されている。所望の遺伝子が欠失したへに蠕虫を選択す
るために、PCR技術のいくつかの選択ラウンドを行うことができる。標的化欠
損遺伝子発現を使用した変異体の他の作製法は、Sutton and Hod
gkin、Zwaal et al.およびFire et al.(上記)に
記載されている。
くつかの化学物質について連続希釈を行った。化合物には、クロミプラミン、タ
モキシフェン、BP554、ピマジド、およびタプシガルジンが含まれる。濃度
範囲を1μM未満〜100μMまでとし、ポンピングアッセイを上記の実施例に
記載のように繰り返した。これらの結果から、明白な用量反応曲線を作製するこ
とができる。
学物質のIC50およびED50を同定することができることが明白に示される
。
サークロミプラミンの用量反応曲線は、高濃度の溶媒DMSOの毒作用が明白に
示される(図5)。
の副作用の検出が可能である。これにより、SERCAのインヒビターとして公
知のタプシガルジンの用量反応曲線がC.elegans咽頭のポンピング速度
を減少させることが認められる(図6)。にもかかわらず、低濃度でのポンピン
グの向上が認められる。これは、タプシガルジンのこの特徴の第一の所見である
。さらに未知のタプシガルジンの二次標的または他の副作用によって引き起こさ
れるこの挙動を説明するためにさらなる研究が必要であり、この実験により、咽
頭アッセイの感度および用量反応曲線を編集するための咽頭アッセイの使用が明
白に示される。
頭のポンピング速度を測定するための他の技術が存在する。咽頭は筋肉であるの
で、咽頭の収縮性は内部カルシウムレベルに依存する。これらのカルシウムレベ
ルを、特異的カルシウム感受性レポーター遺伝子を使用して測定することができ
る。
性の増加を直接検出することができることがKerr et al.(West
coast Worm meeting abstruct、77、1998
)によって報告されている。それに記載のカルシウム感受性レポータータンパク
質は、エクオリンおよびGFP−カルモジュリンである(Miyawaki e
t al.、Nature、388、882〜887)。
され、二光子顕微鏡を用いて蛍光が認められた。インベルメクチンなどのポンピ
ングインヒビターおよびセロトニンなどのポンピングエンハンサーが予想される
方法で観察されたGFP−カルモジュリンの蛍光に影響を与えることが示されて
いる。
、咽頭ポンピングアッセイ法を使用して線虫の咽頭のポンピング速度に影響を与
える化学物質をスクリーニングすることができる。前述の実施例におけるカルセ
イン−AMについて記載のポンピングアッセイと同様に、トランスジェニック蠕
虫をマルチウェルプレートに置き、化学物質を添加する。次いで、同一のマルチ
ウェルプレートリーダー装置を用いて、カルセイン蛍光よりもむしろGFP−カ
ルモジュリンの蛍光を測定する。
エクオリンまたはGFP−カルモジュリンの発現を操作してこれらの細胞中のカ
ルシウムレベルを監視することができる。このようなトランスジェニックを、上
記のスクリーニングで使用することができる。
化合物の活性を向上、抑制、または調整する遺伝子および生化学的経路を見出す
ことができる。化合物を線虫C.elegansに適用した場合、表現型の変化
が認められるが、しかし、化合物の標的またはその作用様式は既知であるか未知
であり得る。下記のスクリーニング法を使用して、C.elegansの表現型
に対する定義された効果を有する化合物の活性を抑制するか向上させる遺伝子を
同定することができる。
ングする蠕虫の両方の咽頭のポンピング速度のインヒビターである。C.ele
gansに対して定義された効果を有する化合物の例として、本明細書中ではこ
の化合物を使用する。
など)を使用したランダム変異誘発に供する(Methods in Cell
Biology、第48巻)。これらの変異誘発蠕虫のF1世代を、蠕虫ごと
にマルチウェルプレートのウェルに置き、蠕虫を成長させて子孫を産生させる。
子孫が所望の成長期に達した場合、2,5−ジフェニルオキサゾルおよびカルセ
イン−AMを添加する。プレートを約1時間さらにインキュベートし、発生した
カルセインの蛍光を、マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。より
高い蛍光読み取りを有するウェルを記録した。これらのウェル中の蠕虫は、遺伝
子中に変異を保有するか2,5−ジフェニルオキサゾール活性を抑制するので、
さらなる分析に使用した。
クリーニングを行った。化合物ドクサピンの存在下でポンピング表現型の減少を
示す変異体を記録した。
合物タプシガルジンは、Sarco/小胞体カルシウムATPアーゼ(SERC
A)の活性を阻害することが公知である。SERCAタンパク質は、カルシウム
をsarco/小胞体にポンピングし、カルシウムが内部に保存された細胞が得
られる。カルシウムの内部保存は、筋肉活性に重要である。C.elegans
では、タプシガルジンの蠕虫への適用によるSERCA活性の阻害により、咽頭
ポンピング速度が減少する。線虫C.elegansに対するタプシガルジン作
用によって認められる他の特徴は運動性の低下であり、これは体壁筋のSERC
A活性の阻害の結果である。
グするための咽頭ポンピングスクリーニングを開発した。上記のように、C.e
legans線虫(野生型線虫および構成的ポンピング咽頭を有する線虫の両方
)を、マルチウェルプレーのウェルに置く。上記のように、阻害濃度のタプシガ
ルジンを蠕虫に添加し、5〜10μMの濃度のカルセイン−AMを添加する。最
後に、選択した化学物質を添加する。第2の化学物質を含まないタプシガルジン
を含むコントロールウェルも準備する。
用して蛍光を測定する。測定した蛍光が化学物質を含まないコントロールウェル
よりも高い化学物質を保有するウェルを記録する。これらのウェルは、タプシガ
ルジンの阻害活性が抑制されるのでタプシガルジン活性のアンタゴニストである
化学物質を保有する。したがって、同定された化学物質は、タプシガルジンの活
性を直接阻害するか、SERCA活性を刺激するか、SERCA経路(すなわち
、生物のカルシウム生物学)に対してエンハンサー活性を有し得る。
カルシウム生物学の機能障害の原因である疾患領域の治療薬のさらなる開発の出
発物質と考えられる。これらの治療薬が有用な疾患領域の例は、心肥大、心不全
、高血圧、H型糖尿病、ブロディー病である。
合物の例としてタプシガルジンを使用したが、咽頭ポンピング速度に対して阻害
活性を有する任意の化合物を類似のスクリーニングで使用することができる。
活性を有する化学物質を選択するためのスクリーニングを行うこともできる。こ
のような実験では、咽頭ポンピングを向上させることが公知の化合物の存在下で
咽頭ポンピング速度を減少させる場合、化学物質を記録する。
類似の実験を行うことができる。
CA−PLB)のスクリーニング。ヒトSERCA−2タンパク質は、ホスホラ
ンバン(PLB)として公知の少なくとも1つのタンパク質によって負に制御さ
れることが公知である。両タンパク質は、脊椎動物の心臓で発現され、この相互
作用の特徴について文献に広範なリストが存在する。
、したがって、この筋収縮の改良または増加をSERCA活性の向上によって実
現することができる。SERCA活性を向上させるかSERCA−PLB相互作
用を阻害する化学物質は、潜在的な治療薬または細胞または生物のカルシウム生
物学の機能障害の原因である疾患領域の治療薬のさらなる開発の出発物質と考え
られる。SERCA活性が有利であり得る疾患領域の例は、心肥大、心不全、高
血圧、11型糖尿病、ブロディー病である。
SERCA2およびPLBは心血管疾患に関連し、SERCA1およびサルコリ
ピンは骨格筋疾患に関連し、3つのSERCA遺伝子は非インスリン依存性真性
糖尿病に関連する。
行うために、SERCA遺伝子およびPLBをC.elegans中で発現させ
た。これらの遺伝子発現を、以下の活性を有するいくつかの特異的プロモーター
の調節化で制御することができる。 a)咽頭中の発現を促進するC.elegansmyo−2プロモーター、 b)C.elegans筋肉(咽頭、陰門筋、および体壁筋を含む)中の発現を
促進するC.elegansSERCAプロモーター。
はヒトSERCA。 b)C.elegans SERCAを変異させたC.elegans(ノック
アウトおよび選択変異)におけるSERCAおよび/またはmyo−2プロモー
ター下でのブタおよび/またはヒトSERCA。 c)SERCAおよび/またはmyo−2プロモーター下でのブタおよび/また
はヒトPLB。 d)C.elegans SERCAを変異させたC.elegans(ノック
アウトおよび選択変異)におけるSERCAおよび/またはmyo−2プロモー
ター下でのブタおよび/またはヒトPLB。 e)SERCAおよび/またはmyo−2プロモーター下でのブタおよび/また
はヒトPLB−GFP。 f)C.elegans SERCAを変異させたC.elegans(ノック
アウトおよび選択変異)におけるSERCAおよび/またはmyo−2プロモー
ター下でのブタおよび/またはヒトSERCA。 c)SERCAおよび/またはmyo−2プロモーター下でのブタおよび/また
はヒトPLB−GFP。 g)SERCAプロモーター下でのブタおよび/またはヒトSERCAならびに
/またはmyo−2プロモーター下でのブタおよび/またはヒトPLB。 h)C.elegans SERCAを変異させたC.elegans(ノック
アウトおよび選択変異)におけるSERCAプロモーター下でのブタおよび/ま
たはヒトSERCAならびに/またはmyo−2プロモーター下でのブタおよび
/またはヒトPLB。 i)SERCAプロモーター下でのブタおよび/またはヒトSERCAならびに
/またはmyo−2プロモーター下でのブタおよび/またはヒトPLB−GFP
。 j)C.elegans SERCAを変異させたC.elegans(ノック
アウトおよび選択変異)におけるSERCAプロモーター下でのブタおよび/ま
たはヒトSERCAならびに/またはmyo−2プロモーター下でのブタおよび
/またはヒトPLB−GFP。
ン−AM咽頭ポンピングアッセイを使用して腸中のカルセイン蛍光によって測定
することができるので、明白な咽頭ポンピング速度の変化を示す。これらの株の
いくつかは、さらなるスクリーニング開発に有用であると考えられた。前述の実
施例に記載のように、トランスジェニックおよび変異動物をマルチウェルプレー
トに置いた。次いで、カルセイン−AMおよび試験化学物質を添加した。腸で形
成されたカルセインの蛍光を、蛍光を測定するように設定したマルチウェルプレ
ートリーダーで測定した。咽頭ポンピング速度の特性を変化するのでSERCA
経路の機能および活性を変化させる化学物質をさらなる分析用に選択し、これは
、治療用の潜在的な化合物またはさらなる治療薬開発の出発物質と考えることが
できる。
たは制御を変化させる化学物質を検出するための類似の実験を行うことができる
。
神経変性)のスクリーニング。線虫の咽頭の解剖学は、いくつかの部分からなり
、いくつかの細胞および細胞型が含まれる。これらには、咽頭筋、咽頭上皮細胞
、咽頭腺、および咽頭ニューロンが含まれる。少なくとも14種のニューロンが
ニューロン機能に関連し、そのうち最も重要なものはI1、I2、I3、M3、
MC、NSM、M1、RIP、およびM4である(「線虫Caenorhabd
itis elegans」、W.B.Wood et al.編、1988、
CSHL pressに概説)。
または機能不全により、咽頭ポンピング速度が変化する。ポンピング速度が変化
を生じるか、ポンピング形態学の変化を有するいくつかの変異が文献中で公知で
ある。
の方法は、線虫にトランスジェニック技術を適用することである。咽頭解剖学お
よび咽頭機能に関連する1つの細胞中の毒性遺伝子の発現により、それぞれの細
胞が変性されるか、機能不全になるか、または異常に発達する。結果として咽頭
のポンピング速度が変化し、おそらくポンピング速度が減少する。
方法においてこれらの遺伝子を発現するトランスジェニックC.elegans
を構築することができる。例えば、myo−2プロモーターは咽頭筋中の発現を
誘導し、unc−129プロモーターはニューロン細胞中の発現を誘導する。各
細胞型または組織について、組織の変性を正確に調節することができるように細
胞型特異的組織特異的プロ−モーターを選択することができる。毒性遺伝子の発
現が1つの特異的細胞のみで誘導されるような方法で、プロモーターを選択する
ことができる。
クを、遺伝子または形態学的欠失を修復または回復する化学物質を選択するため
の咽頭ポンピングスクリーニングで使用することができる。変異体またはトラン
スジェニック動物のポンピング速度が減少している場合、スクリーニングにより
ポンピング速度を向上させる化学物質を同定することが好ましい。変異体または
トランスジェニック動物のポンピング速度が増加している場合、スクリーニング
によりポンピング速度を減少させる化学物質を同定することが好ましい。
ーターの使用の特例。C.elegansのASIニューロンは、化学感覚神経
であり、食物認識および咽頭ポンピングに必須である。ASIまたはADFまた
はASGまたはASJニューロンの破壊による耐性幼虫が形成されることが以前
に報告されている。レーザー切断を用いて1つまたは複数のこれらのニューロン
を死滅させたこれらの実験を行った。(Schackwitz WS et a
l.、Neuron、17、719〜728、1996)。さらに、Daf−7
(TGF−βファミリーメンバー)がASIニューロン中で特異的に発現される
ことが報告されている。
、その性質を変化させる。より詳細には、daf−7プロモーターの調節化での
毒性遺伝子の発現の誘導によって、毒性遺伝子をこのニューロン中に発現させる
。このような方法におけるASIニューロンの破壊によって、耐性幼虫が形成さ
れる。
た耐性幼虫を、咽頭ポンピングアッセイに使用した。耐性蠕虫は、咽頭ポンピン
グを行わないか、減少した咽頭ポンピングのみを行う。蠕虫が耐性表現型を迂回
して咽頭ポンピングを回復する化学物質を同定した。前述のように、咽頭ポンピ
ング速度を、カルセイン−AMを使用して測定した。
に壁に沈殿するので、これを運動性アッセイに使用して蠕虫が耐性表現型を迂回
して蠕虫の運動性を変化させる化学物質を同定することができる。ウェルの中央
より上の自己蛍光を使用して、蠕虫の運動性挙動を検出した。
15℃で成長するが、25℃では100%が耐性幼虫を形成する線虫変異体であ
り、これらの変異体をスクリーニングに使用して蠕虫が耐性表現型を迂回する化
学物質を単離することができる。
クロタイタープレーのウェル上に分配する。同期化卵も使用することができる。
蠕虫に食物を供給し、25℃でさらに成長させて耐性幼虫を形成させた。約4日
後、試験化合物およびカルセイン−AMを添加し、25℃に温度を維持しながら
1時間〜4日間の範囲の選択した時間間隔で蛍光を測定する。蠕虫が耐性表現型
を迂回する化合物を記録した。食物基質の存在により、マルチウェルプレートリ
ーダーを使用して蛍光を検出するのは困難である。この場合、代わりにFANデ
バイスを使用して蛍光を測定することができる。
。
次いで、耐性幼虫をマルチウェルプレートのウェル上に分配し、化学物質を添加
した。マルチウェルプレートを、運動性アッセイを行うように設定した(すなわ
ち、自己蛍光を測定する)マルチウェルプレートリーダー上に置いた。ウェルを
25℃に維持しながら1時間〜4日間の範囲の選択した時間間隔で自己蛍光測定
値を記録した。
スクリーニング。線虫変異体(ace−1;ace−2)は、全く運動性を示さ
ず、痙攣様表現型を有する。蠕虫は全く洞様形を示さないが、直線状である。こ
れらは、変異体がアセチルコリンエステラーゼで変異されてシナプス中のアセチ
ルコリン濃度が高いからである。ネオスチグミン(周知のアセチルコリンエステ
ラーゼインヒビター)を、マルチウェルプレートのウェル上に分配した野生型蠕
虫に添加して、約2時間後に運動性アッセイに供した。図8のパネル1は、ネオ
スチグミンに暴露した蠕虫の運動性が明らかに減少することを示す。
タゴニストであるので、ace1;ace2変異体のシナプスへのアセチルコリ
ンの過剰充填を抑制して運動性を修復または回復する。レセプターアンタゴニス
トとして、ヘキサメトニウムはまた適切なシグナル伝達を妨害するので運動性が
減少する。図8の最後のパネルでは、ヘキサメトニウムは野生型蠕虫の運動性を
抑制するが、ネオスチグミンより有意に少ないことが明白に示される(100%
は野生型蠕虫の正常な運動性を示す)。
ミンと接触させた。少しのインキュベーション後、種々の濃度のヘキサメトニウ
ムを添加し、ウェルを運動性アッセイ(自己蛍光の測定)に供した。図8に示す
ように、漸増濃度のヘキサメトニウムによって予想したように運動性が増すが(
ヘキサメトニウムはアンタゴニストである)、非常に高濃度(しかし最後のパネ
ルに示した濃度より低い)のヘキサメトニウムでは毒作用が認められ、運動性が
減少する。この毒作用は、おそらく高濃度のネオスチグミンおよびヘキサメトニ
ウムの存在による。
では、ネオスチグミンの非存在下で漸増濃度のヘキサメトニウムをウェルに添加
した。両実験結果を比較した。
た化合物のアンタゴニストを明白に示す。
る子孫の計数によって、線虫の交配挙動の高処理分析を行うことができる。第1
に、マルチウェルプレートのウェル上に等量の雄蠕虫を分配した。次いで、各ウ
ェルが等量の雌雄同体を含むような方法で雌雄同体をウェル上に添加した。雄と
雌雄同体との比は、実験によって変化し得る。
り、好ましくは雌雄同体は自家不稔性を示す(ferまたはspeにおける雌雄
同体変異体など)。さらに、交配を向上させるために、自家不稔性雌雄同体は運
動性が減少しているか運動表現型を示さないことが好ましい。この実験における
雄は野生型雄、変異雄、トランスジェニック雄、またはヒト化雄であり得る。
性減少表現型を有し且つGFPを安定に発現する特異的自家不稔性トランスジェ
ニック雌雄同体を用いて、交配アッセイを行った。この交配アッセイの全子孫は
GFPを発現するので、マルチウェルプレートリーダーまたはFANSを使用し
たGFP蛍光の測定によって子孫数を容易に検出することができる。発光マーカ
ーなどの他のマーカーを発現する雌雄同体を、類似の実験に使用することができ
る。
形形態では、雌雄同体を以下の組み合わせで選択した。 a)雌雄同体は、野生型雌雄同体、減少した運動表現型を示す雌雄同体であった
。 b)雄線虫は、GFPを発現する野生型、トランスジェニック、変異、またはヒ
ト化線虫であった。
自家不燃性の子孫および真の交配に起因する子孫を、GFPの蛍光に従って分配
することができる。
異的ニューロンおよびその交配挙動の役割を列挙する。例えば毒性遺伝子の発現
による1つまたは複数のこれらのニューロンの破壊により、交配スクリーニング
に有用であり得るC.elegans変異体を得ることができる。
下の表4は、交配アッセイに使用することができる雄が交配挙動の異常を示すC
.elegans変異体を列挙する。
kを列挙する。
化を示すトランスジェニックC.elegansを使用して、産卵アッセイを行
うこともできる。適切な組織または細胞型特異的プロモーターの調節下で上記の
毒性遺伝子の1つを使用した当該分野で公知の標準的技術にしたがって、適切な
トランスジェニックC.elegansを構築することができる。この目的に有
用であり得るプロモーターには、lin−31、egl−17、unc−17、
およびunc−53プロモーターが含まれる。
を列挙する。
化を示すトランスジェニックC.elegansを使用して、排泄アッセイを行
うこともできる。適切な組織または細胞型特異的プロモーターの調節下で上記の
毒性遺伝子の1つを使用した当該分野で公知の標準的技術にしたがって、適切な
トランスジェニックC.elegansを構築することができる。この目的に有
用であり得るプロモーターには、unc−43およびunc−25プロモーター
が含まれる。
sを列挙する。
ることが公知のニューロンおよび神経伝達物質の概要を示す図である。
度のエンハンサーの検出例を示す図である。
度のインヒビターの検出例を示す図である。
量反応曲線を示す図である。
曲線を示す図である。
を示すタプシガルジンの用量反応曲線を示す図である。
選択の原理を示す図である。
的な運動性アッセイの結果を示す図である。
を示すための実験結果を示す。100匹の線虫(HD8株)を0.5μMカルセ
イン−AMの存在下で3時間インキュベートした。0.1%PEGを添加するか
添加しないで取扱った。
すための実験結果を示す。
ッセイの能力に対する培地粘度の効果を示す図である。100匹の蠕虫を丸底マ
イクロタイタープレート中でインキュベートした。種々の粘性培地(M9、培地
粘性カルボキシメチルセルロース、および高粘度カルボキシメチルセルロース)
の340nmのODを測定した。3連で測定を行った。
す図である。N2+MCは、カルボキシメチルセルロースを含む培地中の野生型
蠕虫を示す。
使用した産卵アッセイの反応速度を示す図である。それぞれ種々の濃度のクロミ
プラミンおよびフルオキセチンの存在下でアッセイを行った。
活性化合物の効果を示す図である。図18−ピクロトキシン、図19−ロテノン
、図20−ディルドリン、図21−イベルメクチン。殺虫剤への暴露による咽頭
ポンピング速度の減少が明らかに認められる。
Claims (186)
- 【請求項1】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の同定
法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と化学物質とを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を示すシグナルを検出する工程とを包含する、方法
。 - 【請求項2】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前記方
法は、 (a)実質的に同数の異なる変異線虫のパネルをマルチウェルアッセイプレート
の各ウェルに分配する工程と、 (b)前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を示すシグナルを検出する工程とを包含する、方法
。 - 【請求項3】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する生化
学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 (a)線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 (b)1つの変異誘発F1線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
配する工程と、 (c)F1線虫にF2子孫を産生させる工程と、 (d)前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 (e)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する、方法。 - 【請求項4】 遺伝学的技術を使用して工程(e)においてシグナルを発生
させる線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請求項3に記載の方
法。 - 【請求項5】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第1の化合
物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と前記第1の化合物とを接触させる工程と、 (c)前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 (d)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を示すシグナルを検出する工程とを包含する、方法
。 - 【請求項6】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義され
た効果を抑制する、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義され
た効果を向上させる、請求項5に記載の方法。 - 【請求項8】 前記線虫が微視的線虫である、請求項1〜請求項7のいずれ
か1項に記載方法。 - 【請求項9】 前記線虫がC.elegansまたはC.briggsae
である、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記シグナル検出工程がマーカー分子の測定可能な性質の
変化を検出する工程をさらに包含し、前記マーカー分子の性質の変化が前記線虫
の表現型の変化、生理学的変化、挙動の変化、または生物学的変化を示す、前記
請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 前記マーカー分子が、蛍光分子、発光分子、または有色分
子である、請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 前記マーカー分子が、蛍光分子の前駆体、発光分子の前駆
体、または有色分子の前駆体である、請求項10に記載の方法。 - 【請求項13】 前記マーカー分子がC.elegansの腸に存在する酵
素の作用によって切断されて、蛍光分子、発光分子、または有色分子を得ること
ができる、請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】 前記マーカー分子が遺伝子コードマーカー分子である、請
求項10に記載の方法。 - 【請求項15】 前記線虫が前記遺伝子コードマーカー分子を発現するトラ
ンスジェニック線虫である、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 前記遺伝子コードマーカー分子が、自己蛍光タンパク質、
アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマー
ゼ、βガラクトシダーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ノパリンシンタ
ーゼ、オクタピンシンターゼ、またはエクオリンである、請求項14または請求
項15のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項17】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダーで
ある、請求項1〜請求項16のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項18】 前記マルチウェルプレートリーダーが、発光、蛍光、また
は分光光度検出を行う、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 前記非視覚的検出手段がFANSデバイスである、請求項
1〜請求項16のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項20】 前記FANSデバイスが、発光、蛍光、または分光光度検
出を行う、請求項19に記載の方法。 - 【請求項21】 前記シグナル検出工程が、FANSデバイスを用いた線虫
のサイズおよび/または発達期の検出を包含する、請求項1〜請求項9のいずれ
か1項に記載の方法。 - 【請求項22】 卵、L1期、L2期、L3期、L4期、成虫蠕虫、および
耐性蠕虫の検出を包含する、請求項21に記載の方法。 - 【請求項23】 前記工程(a)が実施的に同量の線虫の均一な懸濁液をマ
ルチウェルプレートアッセイプレートの各ウェルに分配する工程を包含する、前
記請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項24】 前記均一な懸濁液は、粘性溶液中にC.elegansの
懸濁液を含む、請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 前記粘性溶液はポリマー材料の溶液を含む、請求項24に
記載の方法。 - 【請求項26】 前記ポリマー材料は低融点アガロースである、請求項25
に記載の方法。 - 【請求項27】 前記線虫を同一の成長期に合わせる、前記請求項のいずれ
か1項に記載の方法。 - 【請求項28】 前記線虫が卵、L1期、L2期、L3期、L4期、成虫蠕
虫、または耐性蠕虫である、請求項27に記載の方法。 - 【請求項29】 前記蠕虫が雌雄同体または雄である、請求項27または請
求項28のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項30】 前記線虫は、野生株、変異株、トランスジェニック株、ま
たは、ヒト化株である、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項31】 前記線虫がヒト起源の1つまたは複数のタンパク質コード
核酸配列を発現するヒト化株である、請求項30に記載の方法。 - 【請求項32】 前記線虫が、毒性遺伝子を含む導入遺伝子を発現するトラ
ンスジェニックC.elegansである、請求項30に記載の方法。 - 【請求項33】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキチ
ン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、best黄斑ジストロフィー遺伝
子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはunc−53遺伝子産物を
コードする、請求項32に記載の方法。 - 【請求項34】 前記毒性遺伝子発現が、単一の組織、細胞型のサブセット
、単一の細胞型、または単一のC.elegans細胞の遺伝子発現を指向する
ことができる組織特異的プロモーターによって駆動される、請求項32または請
求項33のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項35】 前記毒性遺伝子の発現がdaf−7プロモーターによって
駆動される、請求項34に記載の方法。 - 【請求項36】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水溶
性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、前記請求項のいずれか1項に
記載の方法。 - 【請求項37】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低融
点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項36に記載の方法
。 - 【請求項38】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロー
スである、請求項37に記載の方法。 - 【請求項39】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.3%である、
請求項36〜請求項39のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項40】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの固
着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行われ
る、請求項1〜請求項35のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項41】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビ
ニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項41に記載の方法
。 - 【請求項42】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.01%〜10
%である、請求項40または請求項41のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項43】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が0.1%である
、請求項42に記載の方法。 - 【請求項44】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の同
定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の咽頭ポンピング速度の変化を検出す
る工程とを包含する、方法。 - 【請求項45】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前記
方法は、 (a)実質的に同数の異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化線虫のパ
ネルをマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配する工程と、 (b)前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の咽頭ポンピング速度の変化を検出す
る工程とを包含する、方法。 - 【請求項46】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する生
化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 (a)線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 (b)1つの変異誘発F1線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
配する工程と、 (c)F1線虫にF2子孫を産生させる工程と、 (d)前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 (e)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の咽頭ポンピング速度の変化を検出す
る工程とを包含する、方法。 - 【請求項47】 遺伝学的技術を使用して工程(e)において咽頭ポンピン
グ速度の変化を示す線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請求項
46に記載の方法。 - 【請求項48】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第1の化
合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と前記第1の化合物とを接触させる工程と、 (c)前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 (d)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の咽頭ポンピング速度の変化を検出す
る工程とを包含する、方法。 - 【請求項49】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義さ
れた効果を抑制する、請求項48に記載の方法。 - 【請求項50】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義さ
れた効果を向上させる、請求項48に記載の方法。 - 【請求項51】 前記線虫が微視的線虫である、請求項44〜請求項50の
いずれか1項に記載方法。 - 【請求項52】 前記線虫がC.elegansまたはC.briggsa
eである、請求項51に記載の方法。 - 【請求項53】 前記咽頭ポンピング速度の変化の検出工程が、前記線虫と
線虫に取り込まれた場合にシグナルを発するマーカー分子との接触工程および、
非視覚的検出手段を用いて前記シグナルを検出する工程を包含する、請求項44
〜請求項52のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項54】 前記マーカー分子が、蛍光分子、発光分子、有色分子、蛍
光マーカー分子の前駆体、発光マーカー分子の前駆体、または有色マーカー分子
の前駆体である、請求項53に記載の方法。 - 【請求項55】 前記マーカー分子が線虫の腸に存在する酵素の作用によっ
て切断されて、蛍光分子、発光分子、または有色分子を得ることができる、請求
項54に記載の方法。 - 【請求項56】 前記マーカー分子が、カルセイン−AM、BCECF−A
M、フルオレセイン二リン酸(FDP)、フルオレセイン二酢酸(FDA)、C
MB−leu、AMPPD、またはX−glucである、請求項55に記載の方
法。 - 【請求項57】 前記マーカー分子がpH変化に感受性を示す、請求項55
に記載の方法。 - 【請求項58】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダーで
ある、請求項44〜請求項57のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項59】 前記マルチウェルプレートリーダーが、発光、蛍光、また
は分光光度検出を行う、請求項58に記載の方法。 - 【請求項60】 前記非視覚的検出手段がFANSデバイスである、請求項
44〜請求項57のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項61】 前記FANSデバイスが、発光、蛍光、または分光光度検
出を行う、請求項60に記載の方法。 - 【請求項62】 前記線虫が野生型変異、トランスジェニック、またはヒト
化C.elegansである、請求項44〜請求項61のいずれか1項に記載の
方法。 - 【請求項63】 前記C.elegansが咽頭ポンピング速度の変化を示
す、請求項62に記載の方法。 - 【請求項64】 前記変異C.elegansがSERCAタンパク質およ
び/またはPLBタンパク質および/またはSLNタンパク質をコードする遺伝
子の変異を保有する、請求項62に記載の方法。 - 【請求項65】 前記トランスジェニックC.elegansはSERCA
タンパク質またはPLBタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する、請求項
63に記載の方法。 - 【請求項66】 前記導入遺伝子の存在が組織特異的プロモーターによって
駆動される、請求項65に記載の方法。 - 【請求項67】 前記トランスジェニックC.elegansはSERCA
タンパク質をコードするC.elegans遺伝子中に変異をさらに保有する、
請求項65または請求項66のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項68】 前記C.elegansが、1つまたは複数の以下の神経
伝達物質:アセチルコリン、セロトニン、グルタミン酸、オクトパミン、GAB
A、またはドーパミンの1つまたは複数のレベルの変化を示す、請求項62に記
載の方法。 - 【請求項69】 前記トランスジェニックC.elegansは毒性遺伝子
を含む導入遺伝子を発現する、請求項62に記載の方法。 - 【請求項70】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキチ
ン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、best黄斑ジストロフィー遺伝
子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはunc−53遺伝子産物を
コードする、請求項69に記載の方法。 - 【請求項71】 前記毒性遺伝子の発現が、C.elegansの咽頭、C
.elegansの細胞のサブセット、咽頭ニューロン、または単一の咽頭ニュ
ーロンの遺伝子発現を指向することができる組織特異的プロモーターによって駆
動される、請求項69または請求項70のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項72】 前記毒性遺伝子の発現が、myo−2プロモーター、un
c−129プロモーター、tmy−1プロモーター、またはdaf−7プロモー
ターによって駆動される、請求項71に記載の方法。 - 【請求項73】 前記導入遺伝子の発現がdaf−7プロモーターによって
駆動される、請求項69または請求項70のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項74】 前記線虫を同一の成長期に合わせる、請求項44〜請求項
73のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項75】 前記線虫が卵、L1期、L2期、L3期、L4期、成虫蠕
虫、または耐性蠕虫である、請求項74に記載の方法。 - 【請求項76】 前記蠕虫が雌雄同体または雄である、請求項74または請
求項75のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項77】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水溶
性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、請求項44〜請求項76のい
ずれか1項に記載の方法。 - 【請求項78】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低融
点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項77に記載の方法
。 - 【請求項79】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロー
スである、請求項78に記載の方法。 - 【請求項80】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.3%である、
請求項77〜請求項79のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項81】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの固
着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行われ
る、請求項44〜請求項76のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項82】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビ
ニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項81に記載の方法
。 - 【請求項83】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.01%〜10
%である、請求項81または請求項82のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項84】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が0.1%である
、請求項83に記載の方法。 - 【請求項85】 潜在的な殺虫活性を有する化学物質の同定に使用される、
請求項44に記載の方法。 - 【請求項86】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の同
定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫細胞中の鉄、代謝産物、または二次メ
ッセンジャーレベルの変化を検出する工程とを包含する、方法。 - 【請求項87】 カルシウム、cAMP、ジアシルグリセロール、またはI
P3の細胞内レベルの変化の検出を包含する、請求項86に記載の方法。 - 【請求項88】 前記線虫は、遺伝子コードマーカー分子を発現するトラン
スジェニックC.elegansであり、前記マーカー分子は鉄、代謝産物、ま
たは二次メッセンジャーの細胞内レベルの変化に応答してシグナルを発し、工程
(c)が前記遺伝子コードマーカー分子によって発生するシグナルの変化の検出
工程を包含する、請求項87に記載の方法。 - 【請求項89】 前記遺伝子コードマーカー分子がGFP−カルモジュリン
またはエクオリンである、請求項88に記載の方法。 - 【請求項90】 前記遺伝子コードマーカー分子が、トランスジェニックC
.elegansの咽頭、陰門、体壁筋、またはニューロンにおいて発現される
、請求項88または請求項89のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項91】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダーで
ある、請求項86〜請求項90のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項92】 前記マルチウェルプレートリーダーが、蛍光、発光、また
は分光光度検出を行う、請求項91に記載の方法。 - 【請求項93】 前記非視覚的検出手段がFANSデバイスである、請求項
86〜請求項90のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項94】 前記FANSデバイスが、蛍光、発光、または分光光度検
出を行う、請求項93に記載の方法。 - 【請求項95】 前記線虫を同一の成長期に合わせる、請求項86〜請求項
94のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項96】 前記線虫が卵、L1期、L2期、L3期、L4期、成虫蠕
虫、または耐性蠕虫である、請求項95に記載の方法。 - 【請求項97】 前記蠕虫が雌雄同体または雄である、請求項95または請
求項96のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項98】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の同
定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の運動性の変化を検出する工程とを包
含する、方法。 - 【請求項99】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前記
方法は、 (a)実質的に同数の異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化線虫のパ
ネルをマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配する工程と、 (b)前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の運動性の変化を検出する工程とを包
含する、方法。 - 【請求項100】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する
生化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 (a)線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 (b)1つの変異誘発F1線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
配する工程と、 (c)F1線虫にF2子孫を産生させる工程と、 (d)前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 (e)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の運動性の変化を検出する工程とを包
含する、方法。 - 【請求項101】 遺伝学的技術を使用して工程(e)において運動性の変
化を示す線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請求項82に記載
の方法。 - 【請求項102】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第1の
化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と前記第1の化合物とを接触させる工程と、 (c)前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 (d)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の運動性の変化を検出する工程とを包
含する、方法。 - 【請求項103】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義
された効果を抑制する、請求項102に記載の方法。 - 【請求項104】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義
された効果を向上させる、請求項103に記載の方法。 - 【請求項105】 前記線虫が微視的線虫である、請求項98〜請求項10
4のいずれか1項に記載方法。 - 【請求項106】 前記線虫がC.elegansまたはC.briggs
aeである、請求項105に記載の方法。 - 【請求項107】 前記線虫の運動性の変化の検出工程が、マルチウェルア
ッセイプレートのウェル中の材料の小領域の自己蛍光レベルの測定を包含する、
請求項98〜請求項106のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項108】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダー
である、請求項98〜請求項107のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項109】 前記マルチウェルプレートリーダーが、発光、蛍光、ま
たは分光光度検出を行う、請求項98に記載の方法。 - 【請求項110】 前記線虫を同一の成長期に合わせる、請求項98〜請求
項109のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項111】 前記線虫が卵、L1期、L2期、L3期、L4期、成虫
蠕虫、または耐性蠕虫である、請求項110に記載の方法。 - 【請求項112】 前記蠕虫が雌雄同体または雄である、請求項110また
は請求項111のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項113】 前記線虫は、野生株、変異株、トランスジェニック株、
または、ヒト化株である、請求項98〜請求項112のいずれか1項に記載の方
法。 - 【請求項114】 前記線虫がヒト起源の1つまたは複数のタンパク質コー
ド核酸配列を発現するヒト化株である、請求項113に記載の方法。 - 【請求項115】 前記線虫が、毒性遺伝子を含む導入遺伝子を発現するト
ランスジェニックC.elegansである、請求項114に記載の方法。 - 【請求項116】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキ
チン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、best黄斑ジストロフィー遺
伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはunc−53遺伝子産物
をコードする、請求項115に記載の方法。 - 【請求項117】 前記遺伝子発現が、単一の組織、細胞型のサブセット、
単一の細胞型、または単一のC.elegans細胞の遺伝子発現を指向するこ
とができる組織特異的プロモーターによって駆動される、請求項115または請
求項116のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項118】 前記毒性遺伝子の発現がdaf−7プロモーターによっ
て駆動される、請求項117に記載の方法。 - 【請求項119】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水
溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、請求項98〜請求項118
のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項120】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低
融点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項119に記載の
方法。 - 【請求項121】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロ
ースである、請求項120に記載の方法。 - 【請求項122】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.3%である
、請求項119〜請求項121のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項123】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの
固着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行わ
れる、請求項98〜請求項118のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項124】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ
ビニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項123に記載の
方法。 - 【請求項125】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.01%〜1
0%である、請求項123または請求項124のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項126】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が0.1%であ
る、請求項125に記載の方法。 - 【請求項127】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の
同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
に分配する工程と、 (b)実質的に同数の雄線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配
する工程と、 (c)前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 (d)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
する工程とを包含する、方法。 - 【請求項128】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前
記方法は、 (a)実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
に分配する工程と、 (b)実質的に同数の雄線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配
する工程であって、前記雄線虫は、異なる変異、トランスジェニック、またはヒ
ト化線虫のパネルを形成し、 (c)前記線虫と化学物質とを接触させる工程と、 (d)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
する工程とを包含する、方法。 - 【請求項129】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第1の
化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
に分配する工程と、 (b)実質的に同数の雄線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配
する工程と、 (c)前記線虫と第1の化学物質とを接触させる工程と、 (d)前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 (e)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
する工程とを包含する、方法。 - 【請求項130】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義
された効果を抑制する、請求項129に記載の方法。 - 【請求項131】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義
された効果を向上させる、請求項129に記載の方法。 - 【請求項132】 前記線虫が微視的線虫である、請求項127〜請求項1
31のいずれか1項に記載方法。 - 【請求項133】 前記線虫がC.elegansまたはC.briggs
aeである、請求項132に記載の方法。 - 【請求項134】 前記雌雄同体線虫および/または雄線虫が変異、トラン
スジェニック、またはヒト化C.elegansである、請求項133に記載の
方法。 - 【請求項135】 前記トランスジェニックC.elegansが毒性遺伝
子を含む導入遺伝子を発現する、請求項134に記載の方法。 - 【請求項136】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキ
チン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、best黄斑ジストロフィー遺
伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはunc−53遺伝子産物
をコードする、請求項135に記載の方法。 - 【請求項137】 前記毒性遺伝子の発現がher−1 P2プロモーター
、mab−18プロモーター、またはspe−T1プロモーターによって駆動さ
れる、請求項135または請求項136のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項138】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の
同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
に分配する工程と、 (b)前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
する工程とを包含する、方法。 - 【請求項139】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前
記方法は、 (a)実質的に同数の異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化雌雄同体
線虫のパネルをマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配する工程と、 (b)前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
する工程とを包含する、方法。 - 【請求項140】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する
生化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 (a)線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 (b)1つの変異誘発F1線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
配する工程と、 (c)F1線虫にF2子孫を産生させる工程と、 (d)前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 (e)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
する工程とを包含する、方法。 - 【請求項141】 遺伝学的技術を使用して工程(e)において卵または子
孫の産生量の変化を示す線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請
求項140に記載の方法。 - 【請求項142】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第1の
化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
に分配する工程と、 (b)前記線虫と前記第1の化合物とを接触させる工程と、 (c)前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 (d)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
する工程とを包含する、方法。 - 【請求項143】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義
された効果を抑制する、請求項142に記載の方法。 - 【請求項144】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義
された効果を向上させる、請求項142に記載の方法。 - 【請求項145】 前記雌雄同体線虫が、変異、トランスジェニック、また
はヒト化C.elegansである、請求項138に記載の方法。 - 【請求項146】 前記トランスジェニックC.elegansが毒性遺伝
子を含む導入遺伝子を発現する、請求項145に記載の方法。 - 【請求項147】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキ
チン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、best黄斑ジストロフィー遺
伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはunc−53遺伝子産物
をコードする、請求項146に記載の方法。 - 【請求項148】 前記毒性遺伝子の発現がlin−31プロモーター、e
gl−17プロモーター、unc−17プロモーター、またはunc−53プロ
モーターによって駆動される、請求項146または請求項147のいずれか1項
に記載の方法。 - 【請求項149】 前記トランスジェニックC.elegansがマーカー
分子を発現する、請求項134または請求項145のいずれか1項に記載の方法
。 - 【請求項150】 前記マーカー分子が、自己蛍光タンパク質である、請求
項149に記載の方法。 - 【請求項151】 前記卵または子孫の産生量の検出工程が、卵、L1期、
L2期、L3期、またはL4期の線虫に結合する特異的抗体を添加する工程およ
び前記抗体と卵、L1期、L2期、L3期、またはL4期の線虫との結合によっ
て形成された複合体を非視覚的検出手段を使用して検出する工程とを包含する、
請求項127〜請求項150のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項152】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダー
である、請求項127〜請求項151のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項153】 前記卵または子孫の量の検出工程が、FANSデバイス
を使用して卵または子孫数を直接計数する工程を包含する、請求項127〜請求
項153のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項154】 前記卵または子孫の産生量の検出工程が、孵化の際に卵
から放出される酵素の活性を検出する工程を包含する、請求項127に記載の方
法。 - 【請求項155】 孵化の際に卵から放出されるキチナーゼの活性を検出す
る工程を包含する、請求項154に記載の方法。 - 【請求項156】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水
溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、請求項127〜請求項15
5のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項157】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低
融点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項156に記載の
方法。 - 【請求項158】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロ
ースである、請求項157に記載の方法。 - 【請求項159】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.3%である
、請求項156〜請求項158のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項160】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの
固着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行わ
れる、請求項127〜請求項155のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項161】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ
ビニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項160に記載の
方法。 - 【請求項162】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.01%〜1
0%である、請求項160または請求項161のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項163】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が0.1%であ
る、請求項162に記載の方法。 - 【請求項164】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の
同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
に分配する工程と、 (b)前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の排泄挙動の変化を検出する工程とを
包含する、方法。 - 【請求項165】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前
記方法は、 (a)実質的に同数の異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化線虫のパ
ネルをマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配する工程と、 (b)前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 (c)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の排泄挙動の変化を検出する工程とを
包含する、方法。 - 【請求項166】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する
生化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 (a)線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 (b)1つの変異誘発F1線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
配する工程と、 (c)F1線虫にF2子孫を産生させる工程と、 (d)前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 (e)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の排泄挙動の変化を検出する工程とを
包含する、方法。 - 【請求項167】 遺伝学的技術を使用して工程(e)において排泄速度の
変化を示す線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請求項166に
記載の方法。 - 【請求項168】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第1の
化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 (a)実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 (b)前記線虫と前記第1の化合物とを接触させる工程と、 (c)前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 (d)非視覚的検出手段を用いて前記線虫の排泄挙動の変化を検出する工程とを
包含する、方法。 - 【請求項169】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義
された効果を抑制する、請求項168に記載の方法。 - 【請求項170】 前記第2の化学物質が線虫に対する第1の化合物の定義
された効果を向上させる、請求項168に記載の方法。 - 【請求項171】 前記線虫が微視的線虫である、請求項170に記載方法
。 - 【請求項172】 前記線虫がC.elegansまたはC.briggs
aeである、請求項171に記載の方法。 - 【請求項173】 前記線虫が、変異、トランスジェニック、またはヒト化
C.elegansである、請求項172に記載の方法。 - 【請求項174】 前記変異C.elegansが異常な排泄挙動を示す、
請求項173に記載の方法。 - 【請求項175】 前記変異C.elegansが便秘している、請求項1
74に記載の方法。 - 【請求項176】 前記トランスジェニックC.elegansが毒性遺伝
子を含む導入遺伝子を発現する、請求項174に記載の方法。 - 【請求項177】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキ
チン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、best黄斑ジストロフィー遺
伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはunc−53遺伝子産物
をコードする、請求項176に記載の方法。 - 【請求項178】 前記毒性遺伝子の発現が、unc−43プロモーターま
たはunc−25プロモーターによって駆動される、請求項176または請求項
177のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項179】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水
溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、請求項164〜請求項17
8のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項180】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低
融点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項179に記載の
方法。 - 【請求項181】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロ
ースである、請求項180に記載の方法。 - 【請求項182】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.3%である
、請求項179〜請求項181のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項183】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの
固着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行わ
れる、請求項164〜請求項178のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項184】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ
ビニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項183に記載の
方法。 - 【請求項185】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が0.01%〜1
0%である、請求項183または請求項184のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項186】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が0.1%であ
る、請求項185に記載の方法。
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