JP2002542466A - 化合物スクリーニング法 - Google Patents

化合物スクリーニング法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、高処理能力形式で行うのに適した、線虫、特に非排他的にＣ．ｅｌｅｇａｎｓを用いるスクリーニング法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、薬理学分野、特にＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ
などの線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質のスクリーニングに
関する。詳細には、本発明は、マルチウェルプレート形式で行われる高処理スク
リーニングを適用した方法に関する。
【０００２】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、土壌中に天然に存在するが、細菌Ｅ．ｃｏｌｉなどの
食物源（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ）と共に播種した栄養寒天上で実験室にて容
易に成長させることができる線虫である。各蠕虫は幼虫から体長約１ｍｍの成虫
まで３日ほどで成長する。その寿命の全ての段階で完全に透明であるので、細胞
分裂、移動、および分化が生きた動物で容易に認めることができる。さらに、そ
の解剖学的性質が単純であるにもかかわらず、体細胞は、筋肉、ニューロン、腸
、および表皮を含む最も主要な分化組織型を示す。したがって、野生型蠕虫とか
け離れた表現型の相違が顕微鏡で直接か選択染色法によって比較的容易に観察さ
れる。
【０００３】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのこれらの特徴により、薬物発見工程における非常に有用
なツールとなる。特に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを、試験化合物に暴露して任意の得
られた表現型および／または挙動の変化を記録する、潜在的な候補薬物の同定に
有用な高処理化合物スクリーニングの開発に使用することができる。
【０００４】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが、特定の化合物への暴露および選択変異によって作製さ
れたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ表現型の比較によって外部分子と特異的遺伝子との間の
相互作用の確立に有用であり得る可能性は、Ｒａｎｄ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第８章、第８４巻、「Ｃ
ａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ：現在の生物学的生物分析」、Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈａｋｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９
５およびＪ．Ａｈｒｉｎｇｅｒ、Ｃｕｒｒ，Ｏｐ．ｉｎ Ｇｅｎ．ａｎｄ Ｄｅ
ｖ．、７、１９９７、４１０〜４１５によって考慮されている。
【０００５】 特に、Ｒａｎｄ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎは、種々の濃度の試験化合物を栄養
寒天およびブロスに添加し、その後細菌を播種して蠕虫とインキュベートする化
合物スクリーニングアッセイを記載している。次いで、化合物への暴露の結果と
しての蠕虫の任意の表現型の変化を観察する。
【０００６】 線虫、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓは薬理学的に活性な分子の同定または発見に強
力で有効なツールを提供するにもかかわらず、現在公知の化合物スクリーニング
技術は高処理スクリーニングに容易に供されない。これは、主に、化合物が蠕虫
の表現型に対する効果を有するかどうかを決定するために公知のアッセイ技術が
試験化合物に暴露される蠕虫の視覚的検査に依存するためである。従って、たと
え高処理スクリーニングに必要なマルチウェルアッセイ形式で行われても、アッ
セイ結果を同定するために肉眼で各ウェルを記録する必要がある。
【０００７】 したがって、目視検査による記録を必要としないので自動化高処理スクリーニ
ングでの使用により適切な生きたＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用した信頼でき且つ再
現性のあるスクリーニング法が必要である。このようなスクリーニング法が利用
可能になれば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのスクリーニングツールとしての有用性は劇
的に増大し、研究者が薬物発見および開発用の全動物系として非常に潜在的なＣ
．ｅｌｅｇａｎｓを利用することができる。
【０００８】 従って、第１の態様では、本発明は、線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有
する化学物質の同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 （ｂ）前記線虫と化学物質とを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する方法を提供する。
【０００９】 この方法は、事実上、蠕虫が候補化合物に暴露されて化合物への暴露の結果と
して蠕虫の表現型、挙動、生化学、または生理学の変化を記録する、標準的な化
合物スクリーニングである。このようなアッセイを、野生型線虫を使用して行う
ことができ、この場合、工程（ｃ）で検出される「変化」は、一般に、野生型の
挙動などからかけ離れた変化である。しかし、検出される活性の型に依存して、
化合物スクリーニングを、非野生型線虫（例えば、非野生型特性を示すことがで
きる変異またはトランスジェニック蠕虫）を使用して行うこともできる。この場
合、工程（ｃ）で検出される「変化」は、野生型の逆であり得る。典型的には、
化合物スクリーニングアッセイは、異なる濃度の試験化学物質と平行して多数の
混合物のアッセイを含む。典型的には、これらの濃度の１つを、ネガティブコン
トロール（すなわち、ゼロ濃度の試験物質）として使用する。次いで、化合物の
暴露に起因する挙動、表現型、生化学、または生理学などの変化を、ネガティブ
コントロールと比較して評価することができる。
【００１０】 第２の態様では、本発明は、線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であっ
て、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の異なる変異線虫のパネルをマルチウェルアッセイプレート
の各ウェルに分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する方法を提供する。
【００１１】 この方法では、基本的な化合物スクリーニング方法論を拡大して、化学物質の
作用様式を決定することができる。例えば、化合物を暴露した蠕虫の性質または
特徴の検出／測定およびこの結果と既知のタンパク質において変異を保有する変
異蠕虫の性質または特徴との比較によってこれを行うことができる。添付の実施
例の実施例４は、ＣＮＳ分野におけるこの例示を提供する。
【００１２】 第３の態様では、本発明は、線虫に対して定義された効果を有する化合物が作
用する生化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 （ａ）線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 （ｂ）１つの変異誘発Ｆ１線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
配する工程と、 （ｃ）Ｆ１線虫にＦ２子孫を産生させる工程と、 （ｄ）前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 （ｅ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する方法を提供する。
【００１３】 本発明のこの方法は、事実上、マルチウェル形式で行われる古典的な遺伝子サ
プレッサースクリーニングである。サプレッサースクリーニングでは、蠕虫の化
学物質への暴露によって作製された表現型を抑制する変異の同定を目的とする。
抑制変異を保有する蠕虫を、通常、同一の化合物への野生型蠕虫の暴露によって
得られた表現型と比較して、化合物の存在下でより多数の「野生型」表現型を示
すことを基本として同定する。従って、抑制変異を同定するために、化合物への
暴露後に工程（ｅ）において、表現型、生理学、生化学、または挙動の特徴が全
く変化しないか少ししか変化しない変異体を有効に調査する。
【００１４】 本発明者らが記載するように、マルチウェル形式での遺伝的サプレッサースク
リーニングの実行によって得られる多くの利点が存在する。特に、標準的な寒天
プレートアッセイと比較して、マルチウェルプレートアッセイを行うにはより少
量の化合物しか必要としない。さらに、マルチウェルプレートを液体中で行うの
で、試験化合物は標準的プレートアッセイより有効に線虫によって取り込まれ、
また、液体では化合物は低濃度であるために寒天プレートよりも沈殿が少ない傾
向がある。
【００１５】 第４の態様では、本発明は、化合物が線虫に対する定義された効果を有する、
第１の化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
る工程と、 （ｂ）前記線虫と前記第１の化合物とを接触させる工程と、 （ｃ）前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 （ｄ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する方法を提供する。
【００１６】 この方法を使用して、所与の化合物のアンタゴニストについてスクリーニング
することができる。この原理を、添付の実施例８で例示する。
【００１７】 本発明の方法はすべて、マルチウェル形式で行われるので中程度から高速スク
リーニングでの使用に適切である。好ましい実施形態では、マルチウェルプレー
トは９６ウェルであるが、本発明はまた、別の数のウェル（６、１２、２４、３
８４、８６４、または１５３６ウェルが含まれるが、これらに限定されない）を
有するマルチウェルプレートを適用可能である。用語「マルチウェルプレート」
および「マイクロタイタープレート」を、全体にわたって交換可能に使用する。
【００１８】 本明細書中に記載の全てのスクリーニング法と同様に、上記の方法を、Ｃａｅ
ｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属由来の線虫（特に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用して
行うことが好ましい。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＣ．ｂｒｉｇｇｓａｅが好まし
いが、本明細書中に記載のスクリーニング法を、他の線虫（特に、他の微視的線
虫、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属に属する微視的線虫）を使用して行うこと
ができることが認識される。本明細書中で使用される、用語「微視的」線虫は、
成虫段階でＣ．ｅｌｅｇａｎｓとほぼ同サイズ（１ｍｍオーダーの長さ）の線虫
を含む。このおおよそのサイズの微視的線虫は、このようなスクリーニングを行
うために当該分野で一般的に使用される型の多ウェルプレートのウェルで容易に
成長することができるので、中程度から高処理スクリーニングでの使用に非常に
適切である。
【００１９】 本発明の全ての方法は、試験化合物の存在下での線虫の表現型、生理学、挙動
、または生化学の変化を示すシグナルの検出を必要とする。非視覚的検出手段を
使用してこのシグナル（読み出しともいう）を検出することが本発明の方法の本
質的特徴である。本明細書中で使用される、用語「非視覚的検出手段」は、ヒト
の目での目視検査を必要としない任意のシグナル検出手段をいう。
【００２０】 非視覚的検出系の使用は、全体的な表現型または挙動の変化を検出するために
、肉眼による線虫の目視検査を必要とする方法を使用して以前から公知のスクリ
ーニング方を超える大きな利点を示す。
【００２１】 線虫の表現型、生理学、挙動、または生化学の変化の結果として発生するシグ
ナルは、例えば、線虫自体が発生させる蛍光、発光、または比色シグナルまたは
蠕虫の全懸濁液中の光学密度の変化を含む種々の型であり得る。
【００２２】 本方法の１つの実施形態では、シグナルは、試験化合物との接触後に蠕虫に添
加されたマーカー分子から発生する。マーカー分子は線虫によって取り込まれ、
線虫における化学物質の活性を表現型、生理学、挙動、または生化学の変化の結
果としてのマーカー分子の性質の変化に起因するシグナルの検出によって直接ま
たは間接的に監視することができる。
【００２３】 蠕虫がマーカー分子を取り込むことができる種々の方法が存在する。例えば、
蠕虫は、試験化学物質の作用の結果としてマーカーを取り込むことができる。別
の可能性は、蠕虫に化学物資の添加前にマーカー分子を予備充填することができ
るか、蠕虫が培養された培地を介するか蠕虫が摂取する細菌もしくは他の食物粒
子を介してマーカー分子を送達させることができることである。
【００２４】 あるいは、マーカー分子は、線虫自体の細胞において発現される遺伝子コード
マーカーであり得る。トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓの日常的な構築法
は当該分野で周知であり、適切なプロモーター配列を使用して、全ての細胞（特
に、組織または１つまたは複数の特定の細胞型）において遺伝子コードマーカー
を発現するＣ．ｅｌｅｇａｎｓを構築することができる。適切な遺伝子コードマ
ーカー分子には、自己蛍光タンパク質（ＡＦＰ）（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）など）、エクオリン、アルカリホスファ
ターゼ、ルシフェラーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマーゼ、βガラクトシ
ダーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ノパリンシンターゼ、オクタピン
シンターゼが含まれる。
【００２５】 マーカー分子を、線虫の生化学的活性の結果として線虫に化学的変化を起こす
ことができる「前駆体」分子として線虫に添加することができる。この前駆体の
性質の変化に対する生化学活性によって測定することができるシグナルが発生す
る。この系の典型的な例は、線虫の腸に存在する酵素によって切断されて検出可
能な性質を有するマーカー分子（例えば、蛍光など）を発生させることができる
前駆体マーカー分子の使用である。このような前駆体マーカーの例には、カルセ
イン−ＡＭ、エステラーゼによって切断されるフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）
およびＢＣＥＣＦ−ＡＭ、アルカリホスファターゼ基質（フルオレセイン二リン
酸（ＦＤＰ）およびＡＭＰＰＤ）、アミノペプチダーゼ基質（ＣＭＢ−ｌｅｕな
ど）、グルクロニダーゼ基質（Ｘ−ｇｌｕｃなど）が含まれる。
【００２６】 マーカー分子を使用して発生するシグナルの測定を補助するために、蛍光消光
剤または発光消光剤を使用することができる。例えば、培地中の任意のバックグ
ラウンド蛍光を消光するために培地に消光剤を添加することができ、これにより
、線虫の腸由来の蛍光の視覚化をより容易にすることができる。
【００２７】 適切な非視覚的検出手段には、マルチウェルプレートリーダーが含まれ、これ
はマイクロタイターリーダーまたはｅｌｉｓａプレートリーダーとしても公知で
ある。マイクロタイタープレートリーダーの使用により、潜在的な薬理学的活性
を有する活性な化学物質を選択するための高処理スクリーニングが容易になる。
適切なマルチウェルプレートリーダーは、当該分野で一般的に使用されており、
市販されている。蛍光検出、発光検出、比色検出、分光光度検出、免疫化学的検
出、放射線検出、および光学密度検出を含む広範な検出法を使用して、このよう
なプレートリーダーを使用することができる。
【００２８】 マルチウェルプレートリーダーの利点は、これを使用して線虫に対する化学物
質の活性の結果として発生するシグナルを定量的に測定することができることで
ある。定量的測定を行う能力とは、線虫に対する化合物の活性の定量的用量応答
曲線を構築することができることを意味する。この用量応答曲線を使用して、Ｃ
．ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫における化合物のＩＣ５０およびＥＤ５０を決定し
て、至適濃度を決定することができる。さらに、用量応答曲線は、化合物の任意
の毒性の同定が可能であり、化合物の可能な第２の標的および副作用の指標とも
なり得る。
【００２９】 マルチウェルプレートリーダー以外の非視覚的検出系を、本発明の方法に使用
することもできる。このような検出系の例は、Ｕｎｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ
ａ，Ｉｎｃ、Ｓｏｍｅｖｉｌｌｅ、ＭＡ、ＵＳＡから市販されている「線虫ディ
スペンサー装置」に基づく。この装置は、流動細胞計測器（蛍光表示式細胞分取
器（ＦＡＣＳ）など）と類似の性質を有する。したがって、これは、一般に、蛍
光表示式線虫分取デバイス（ＦＡＮＳ）に相当する「ＦＡＮＳ」装置ということ
ができる。ＦＡＮＳデバイスは、微視的線虫の性質（サイズ、光学密度、蛍光、
および発光など）の測定が可能である。少数の線虫を用いて行われるスクリーニ
ングアッセイ、わずかなシグナルを発するアッセイ、または食物の存在がシグナ
ルの測定に不利であり得るアッセイでは、ＦＡＮＳは好ましい検出装置である。
しかし、ＦＡＮＳの使用はこれらの実験条件に限定されず、一般に、ＦＡＮＳは
本明細書中に記載の全てのスクリーニング法に使用することができる。
【００３０】 ＦＡＮＳデバイスを使用したスクリーニング法は、マルチウェルプレートリー
ダーについて記載したスクリーニング法と非常に類似している。簡単に述べれば
、蠕虫をマーカー分子を含むか含まない化学物質と接触させる。適当な時間をお
いて、マルチウェルプレートを、ＦＡＮＳ装置に供して、完全に自動化した手順
で蠕虫の特徴（全体のサイズ、蛍光、発光、または光学密度など）についてウェ
ル毎に分析する。次いで、所望の特性を記録する。ＦＡＮＳデバイスを使用して
、定量的にスクリーニングを行うこともできる。
【００３１】 本発明の方法を使用して定量的結果を得るために、実質的に同数の線虫の各ウ
ェルへの添加を確実にすることが重要であり得る。ウェルに添加された正確な蠕
虫数は、行われるスクリーニングの型および必要な感度に非常に依存し得る。９
６ウェルプレートを含む全てのプレート形式では、ウェルあたり１〜１００匹、
より好ましくはウェルあたり１０〜８０匹、もっとも好ましくはウェルあたり８
０匹の蠕虫を使用することが好ましい。
【００３２】 種々の方法を使用して、実質的に同数の蠕虫の各ウェルへの添加を確実にする
ことができる。これを行うことができる１つの方法は、固体または液体培地中で
の当業者に公知の標準的な手順に従って培養した蠕虫の獲得およびこの蠕虫の粘
性溶液中への再懸濁による均一な懸濁液の形成である。溶液の粘度により懸濁液
中の蠕虫が均一に分散されるので、各ウェルへの同体積の均一な蠕虫懸濁液の添
加により実質的に同数の蠕虫を分配することができる。適切な粘性溶液には、低
濃度のポリマー材料（例えば、０．２５％の低融点アガロース）、グリセロール
などを含む溶液が含まれる。
【００３３】 上記のアプローチの代わりとして、マルチウェルプレートのウェルへの蠕虫の
均等な分配を、Ｕｎｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ，Ｉｎｃ．などによって開発
された分配デバイスを用いて行うことができる。プレートの各ウェルへの設定数
の蠕虫を添加するように蠕虫ディスペンサーをプログラミングすることができる
。さらに、これを使用して、雌雄同体もしくは雄または耐性幼虫のみを分配する
ような方法において蠕虫を選択することができ、特に卵、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ
４、または成虫の蠕虫を分散させるようなサイズを基本として選択することもで
きる。
【００３４】 本発明者らは、本発明の方法での粘性培地の使用は、同数の蠕虫を確実にマル
チウェルプレートのウェルに添加するのを超える利点を有し得ることを観察した
。本発明者らが記載したマルチウェルスクリーニングを、液体培地中で行う。し
かし、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫の天然の環境は固体（例えば、土壌）であ
るので、液体培地での成長ではあまり健常な蠕虫が得られない。液体培地で成長
した蠕虫は、より長くかつ細く、咽頭ポンプ速度は減少し、蠕虫は運動性が低く
、あまり産卵しない。本発明者らは、粘性を増大させるため（すなわち、線虫培
養用の通常の液体培地（Ｍ９など）よりも高い粘度を得るため）の培地への水溶
性ポリマーの添加によりこの問題に対する解決法を見出した。粘性液体培地の使
用により、液体培地の利点（すなわち、液体での線虫の取り扱いやすさ）を保持
しながら蠕虫の健康が維持される。好ましいポリマー型は、低融点アガロース、
カルボキシメチルセルロース、およびポリエチレングリコール（特に、ＰＥＧ８
０００）である。ポリマーの至適添加量を日常的な実験によって同定することが
でき、これは、アッセイの読み出しの性質に依存して変化し得る。例えば、以下
の記載の「運動アッセイ」では、０．３％の培地粘性カルボキシメチルセルロー
スの添加が最適であることを見出した。本発明者らは、本明細書中に記載のスク
リーニングを行うための至適条件を決定するために、カルボキシメチルセルロー
スのいくつかの粘度変形形態を使用した。１つの実験では、カルボキシメチルセ
ルロースの３つの変形形態（すなわち、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、
ＵＳＡ）から入手した低粘度、中程度の粘度、および高粘度のカルボキシメチル
セルロース）を、０．３％の濃度で試験した（図１１を参照のこと）。この濃度
で培地および高粘度カルボキシメチルセルロースはスクリーニングでの最高の結
果が得られることが認められた。実用的理由により、中程度の粘度のカルボキシ
メチルセルロースを使用することが好ましい。約０．３％のカルボキシメチルセ
ルロース濃度が大多数のスクリーニングに適切である。アッセイ培地の粘度を増
大させるための水溶性ポリマーの添加により、本明細書中に記載の任意の特異的
アッセイ型（咽頭ポンピングアッセイ、運動アッセイ、交配アッセイ、産卵アッ
セイ、および検出アッセイを含む）および事実上マルチウェル（マイクロウェル
）プレートで行われるＣ．ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫を使用した他の任意のアッ
セイ型を有意に改良することができる。
【００３５】 本明細書中に記載のスクリーニングアッセイを、おそらく培地の粘度の増加に
必要とされるよりも低濃度（線虫がマイクロタイタープレートのウェルに固着を
回避するのに十分な濃度）への水溶性ポリマーの添加によって改良することもで
きる。
【００３６】 マイクロタイタープレートの構築に使用した可塑性材料の性質により、一般に
このようなプレートの表面は疎水性である。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどの
線虫の外表はマイクロタイタープレート壁に固着する傾向があるので、マイクロ
タイタープレートで行われるアッセイの性能は著しく妨害される。異なる型のマ
イクロタイタープレートを使用してこの問題を回避することができるが、現在、
この問題を十分に低減するマイクロタイタープレートは市場に存在しない。本発
明者らは、線虫がマイクロタイタープレートの壁に固着するという問題を、アッ
セイ培地への適切な濃度の水溶性ポリマーの添加によって克服することができる
ことを新規に見出した。
【００３７】 水溶性ポリマーの好ましい型は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（特に、
ＰＥＧ８０００）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、およびポリビニルピロリ
ドン（ＰＶＰ）であり、ＰＥＧ８０００が最も好ましい。所与のスクリーニング
アッセイ型における所与のポリマー型について、培地に添加するポリマーの至適
添加濃度を日常的な実験によって容易に同定することができる。ＰＥＧ８０００
では、０．１％の濃度が、ほとんどのスクリーニング型で良好な結果が得られる
。０．０１％〜１０％の範囲のポリマー濃度も適切であり得るが、アッセイ型に
依存する。
【００３８】 アッセイ培地へのポリマーの添加により、蠕虫のウェルの壁への固着の回避に
よる９６ウェルを超えるウェルを有するマルチウェルプレートで行われるアッセ
イが特に改良される。さらに、倍地中のポリマーの存在により、一般に、液体培
地中での線虫の操作（ピペッティングおよびＦＡＮＳデバイス、Ｇｅｎｅｔｉｘ
（Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）のＧｆｉｔ２デバイス、およびマイクロタイタープレー
トへの充填に使用される他の自動化システムなどの操作）が容易になる。
【００３９】 マイクロタイタープレートの壁などの固体表面への線虫の固着を回避するため
のアッセイ培地への水溶性ポリマーの添加により、本明細書中に記載の任意の特
異的アッセイ型（咽頭ポンピングアッセイ、運動アッセイ、交配アッセイ、産卵
アッセイ、および検出アッセイを含む）および事実上マルチウェル（マイクロウ
ェル）プレートで行われるＣ．ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫を使用した他の任意の
アッセイ型を有意に改良することができる。
【００４０】 種々のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ類（野生型蠕虫、選択変異、トランスジェニック蠕
虫、およびヒト化蠕虫を含む）を使用して、本明細書中に記載の全てのスクリー
ニング法を行うことができる。トランスジェニック株は、生物の全体、生物の一
部、単一の組織、細胞型のサブセット、単一の細胞型、または生物の１つの細胞
において導入遺伝子を発現する株であり得る。変異蠕虫は、単一の遺伝子または
２つまたはそれ以上の異なる遺伝子において変異を有し得る。ヒト化蠕虫は、ヒ
ト標的タンパク質に特異的に指向されるが線虫の生物学のすべての利点および操
作の容易さを有するスクリーニングを行うために使用することができるので、ヒ
ト薬学的分野における潜在的な治療活性を有する化合物の同定に特に有用である
。
【００４１】 線虫の標準的な培養法は、Ｅｐｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈａｋｅｓ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載されている。選択したＣ．ｅｌｅｇａｓ
遺伝子の変異を有する標準的な変異蠕虫作製法については、例えば、Ｊ．ｓｕｔ
ｔｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｈｏｄｇｋｉｎ、「線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ
ｅｌｅｇａｎｓ」、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂ．Ｗｏｏｄ編、およびＣｏｍｍｕｎｉｔ
ｙ ｏｆ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ＣＳＨＬ、１９８８
、５９４〜５９５；Ｚｗａａｌ ｅｔ ａｌ．、「標的−凍結トランスポゾン挿
入変異バンクの使用によるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓの不
活化」、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、７
４３１〜７４３５；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．、「Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの二本鎖Ｒ
ＮＡによる強力で特異的な遺伝学的干渉」、Ｎａｔｕｒｅ， ３９１、８６０〜
８１１を参照のこと。蠕虫集団を、ＥＭＳ、ＴＭＰ−ＵＶ、または照射の使用に
よってランダム変異誘発に供することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４８巻、同書）。次いで、所望の遺伝子中に欠失を有す
る変異蠕虫を選択するために、いくつかのＰＣＲ選択ラウンドを行うことができ
る。さらに、特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ変異体の範囲を、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏ
ｔａ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから利用可能である。
【００４２】 本発明の方法で試験される「化学物質」または「化合物」は、通常蠕虫に存在
しないか、蠕虫が通常その生活環の間に暴露されない任意の外来分子であり得る
。これらの用語を、交換可能に使用することができる。例えば、蠕虫を公知の薬
理学的活性を有する薬局方に列挙の化学物質／化合物に暴露することができる。
あるいは、化学物質／化合物は、特定の生化学的経路または遺伝子との相互作用
が公知のものであり得る。さらにその代わりとして、こうちの生物活性を有さな
い公知の分子もしくは全く新規の分子または組み合わせ化学などによって得るこ
とができる分子のライブラリーを試験することである。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ
、ポリペプチド、またはタンパク質である化合物も排除されない。
【００４３】 １つの実施形態では、本発明の方法を、「毒性遺伝子」を含む導入遺伝子を発
現するトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用して行う。この文脈では、
用語「毒性遺伝子」は、細胞に対して毒性を示すタンパク質をコードする任意の
核酸配列を含む。適切な例には、アタキシン、αシクレイン、ユビキチン、τ遺
伝子産物、ハンチントン遺伝子産物（ハンチングチン）、ｂｅｓｔ黄斑ジストロ
フィー遺伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはｕｎｃ−５３遺
伝子産物が含まれる。等価の効果を有するアポトーシスまたは壊死に関連するタ
ンパク質をコードする「毒性遺伝子」を使用することもできる。適切な組織特異
的または細胞型特異的プロモーターを使用して、単一の組織、細胞型のサブセッ
ト、単一の細胞型、または単一の細胞（例えば、単一のニューロン）中の１つま
たは複数の毒性遺伝子を発現するトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを構築
することができる。毒性遺伝子の発現により、一般に、毒性遺伝子を発現する細
胞および組織の異常性／機能障害が得られる。多数の適切な組織、細胞型、また
は発達特異的プロモーターは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける使用が公知である。
【００４４】 同期化蠕虫培地を使用して、本明細書中に記載の全てのスクリーニング法を行
うこともできる。同期化蠕虫は、同一の成長期のものである。Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｓなどの線虫の種々の成長期は、卵、Ｌ１期、Ｌ２期、Ｌ３期、Ｌ４期、および
成虫期である。さらに、本発明の好ましい実施形態では、同期化線虫は、特定の
性である。同期化培養物は、雌雄同体もしくは雄または耐性幼虫と呼ばれる特定
の幼虫期の線虫であり得る。
【００４５】 種々の同期化培養物の作製での使用に適切な技術は当該分野で公知であり、例
えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４８巻、同書）を
参照のこと。標準的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ培養物の主な集団は雌雄同体蠕虫からな
るので、異なる成長期の同期化雌雄同体線虫を作製するための特別な技術は必要
ない。雄蠕虫を作成するために、いくつかの技術が文献中に記載されている。雄
が多数であるか、排他的に構成されるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ培養物は、Ｃ．ｅｌｅ
ｇａｎｓ ＩＩ、Ｆｉｄｄｌｅ，Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ，Ｍｅｙｅｒ ａｎｄ
Ｐｒｉｅｓ編、１９９７、ＣＳＨＬ ｐｒｅｓｓに記載されている。多数である
か純粋な雄サンプルの作製株は、Ｊｏｈｎａｔｈａｎ Ｈｏｄｇｋｉｎ、Ｗｏｒ
ｍ ｂｒｅｅｄｅｒ’ｓ ｇａｚｅｔｔｅ、１５（５）、１９９９に記載されて
いる。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ耐性幼虫を作製するために、いくつかの技術が記載さ
れている（Ｅｌｅｇａｎｓ ＩＩ、同書）。主に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの温度感
受性ｄａｆ−ｃ変異体を使用して耐性幼虫を作製するが、２５℃で１００％の耐
性幼虫を産生させるｄａｆ２−ｔｓ変異体などの他の可能性も存在する。
【００４６】 本発明の方法の特定の実施形態では、非視覚的検出を使用した線虫の表現型、
生理学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の咽頭ポ
ンピング速度の変化を検出する工程を包含する。これらの方法を、その後集合的
に「咽頭ポンピングアッセイ」という。
【００４７】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、その食物（例えば、細菌）を含む液体の取り込みによ
って摂食する。次いで、液体を吐き出し、食物粒子を破砕し、腸内腔に内在化す
る。この工程を、咽頭の筋肉によって行う。液体の取り込みおよび吐き出しの工
程を、咽頭ポンピングまたは咽頭ポンピングと呼ぶ。
【００４８】 咽頭ポンピング工程は咽頭筋肉および咽頭ニューロンの両方に関連するので、
咽頭ポンピングの測定を利用して、筋肉および／または神経活性に対する効果を
有する化学物質を同定するための有用なスクリーニングを得ることができる。
【００４９】 蠕虫の腸中のマーカー分子の蓄積の検出によって、咽頭ポンピング速度を容易
に測定することができる。マルチウェルプレートリーダーを使用してこれを行う
場合、アッセイを迅速且つ定量的に行うことができる。
【００５０】 特に、上記のように線虫の腸に存在する酵素によって切断可能なマーカー分子
前駆体の使用によって、咽頭ポンピング速度を測定することができる。この目的
には、カルセイン−ＡＭが特に好ましい。カルセイン−ＡＭはエステラーゼの基
質であり、エステラーゼによるカルセイン−ＡＭの切断の際にカルセイン（蛍光
分子）を放出する。エステラーゼはＣ．ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫の腸に存在す
るので、カルセイン蛍光の測定によって咽頭ポンピング速度を直接測定すること
ができる。
【００５１】 本明細書中に記載の実施例では、カルセイン−ＡＭを使用して、いくつかの化
学物質の存在下または非存在下でのＣ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭ポンピング速度を
測定した。これらの測定を定量的高処理法で行って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ咽頭の
ポンピング速度を変化させる化学物質を選択することができる。この方法は、カ
ルセイン−ＡＭの使用に制限されず、以下の他の前駆体基質を使用することがで
きる： −エステラーゼ基質：カルセイン−ＡＭ、ＦＤＡ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ −アルカリホスファターゼ基質：フルオレセイン二リン酸（ＦＤＰ） −エンドプロテアーゼ：アミノペプチダーゼ基質：ＣＭＢ−ｌｅｕ 発光読み出し −アルカリホスファターゼ基質：ＡＭＰＰＤ 比色読み出し −グルクロニダーゼ基質：Ｘ−ｇｌｕｃなど。
【００５２】 このリストは排他的ではなく、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの腸に存在する他の酵素で
切断可能なマーカー分子前駆体（ＤＮアーゼ、ＡＴＰアーゼ、リパーゼ、アミラ
ーゼなど）を見出すか開発することができる。一旦このようなマーカー分子が腸
に侵入すると、切断されてその後監視することができる検出可能なマーカーを放
出する。したがって、腸中の検出可能なマーカー分子の蓄積の側によって咽頭ポ
ンピング速度を直接測定可能である。
【００５３】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの腸のｐＨが低いので、咽頭ポンピング速度の評価には低
ｐＨで蛍光を発する分子が有用である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓのＬ
ｙｓｏＳｅｎｓｏｒ ｇｒｅｅｎはこの性質を示し、これを首尾よく使用して咽
頭ポンピングを評価した。腸で認められる蛍光は類似しているが、カルセイン−
ＡＭで得られる蛍光と比較してあまり蛍光を発しない。しかし、低ｐＨで蛍光を
発するマーカー分子は、線虫の食物源（例えば、細菌）と共に使用することがで
き、ｐＨの変化のみに依存し、関連する酵素ではないのでその後の読み出しを干
渉しないというさらなる利点を有する。
【００５４】 ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒマーカー分子またはプローブは、プロトン化の結果とし
て酸性細胞小器官中に選択的に濃縮される弱酸である。このプロトン化はまた、
その弱酸側鎖による色素の蛍光消光を軽減する。したがって、ＬｙｓｏＳｅｎｓ
ｏｒ色素は、酸性条件下でより多くの蛍光を発する。酸性または中性の範囲（ｐ
Ｋａ約５．２または約７．５）のいずれかで至適ｐＨ感受性である青色蛍光Ｌｙ
ｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅおよび緑色蛍光ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ
プローブが利用可能である。その低ｐＫａ値を有するＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂ
ｌｕｅ ＤＮＤ−１６７およびＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤは、
内部酸性区画に存在する場合以外はほとんど蛍光を発しない。
【００５５】 構成的にポンピングする咽頭を有する変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ株の使用または
この表現型も示すトランスジェニック株の使用によって、咽頭ポンピングアッセ
イを行うこともできる。野生型株または構成的咽頭ポンピング株の使用によって
、ポンピング速度を向上、阻害、または調整する化学物質の同定が可能である。
【００５６】 線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭は筋肉であり、ポンピング速度は主にいくつか
の選択されたニューロンに支配されるので、咽頭ポンピング速度の変化の測定は
、神経伝達物質のシグナルおよび筋肉の刺激を研究するための良好なツールであ
る。咽頭ポンピング速度を定量的に測定することができ、このポンピング速度に
影響を与える化学物質をスクリーニングする方法を開発したので、本発明は、潜
在的な薬理学的活性を有する化学物質のスクリーニングおよび単離法である。
【００５７】 咽頭ポンピング速度に影響を与える化学物質は、おそらく一般的な筋肉生物学
および／または神経伝達物質経路に対する活性を有する物質である。これらの化
学物質の標的であり得るタンパク質の例は、神経伝達物質レセプター（ムスカリ
ンレセプター、グルタミン酸レセプター、ホルモンレセプターおよび５−ＨＴレ
セプター、カンナビノイドレセプター、アドレナリンレセプター、ドーパミンレ
セプター、オピオイドレセプター、ＧＡＢＡレセプター、アデノシンレセプター
、ＶＩＰレセプター、およびニコチンレセプターなど）、神経伝達物質合成に関
与するタンパク質、神経伝達物質放出経路タンパク質、Ｇタンパク質結合レセプ
タータンパク質である。さらに、（アデニル酸シクラーゼ、プロテインキナーゼ
Ａ、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質、ＩＰ３、ジアシルグリセロール、
プロテインキナーゼＣホスホリパーゼＡ〜Ｄ、ホスホジエステラーゼなど）のＧ
タンパク質結合二次メッセンジャー経路についてのタンパク質、ギャップ結合機
能をコードするタンパク質、ミトコンドリアの酸化的リン酸化に関与するタンパ
ク質、イオンチャネルタンパク質、およびイオンポンプタンパク質もまた、この
ような化学物質の潜在的な標的である。このようなイオンチャネルの例は、ナト
リウム／カルシウムチャネル、カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル、およ
び塩素イオンチャネルである。一般に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ咽頭のポンピング速
度に影響を与え、且つ咽頭ポンピングスクリーニングを使用して同定される薬物
または化学物質は、おそらく以下の活性を示す化合物であろう。 −神経伝達分子に影響を与えるか神経伝達物質の合成前駆体である分子、 −神経伝達物質の合成を向上、阻害、または調整する分子、 −伝達物質を枯渇させる機能を有する分子、 −シナプス間隙中のシナプス小胞からの伝達物質の放出を防止または刺激する分
子、 −レセプターのインヒビターまたは刺激因子として機能する分子、 −伝達のインヒビターまたは刺激因子として機能する伝達分子を模倣する分子、
−伝達妨害物のアクチベーターまたはインヒビターとして機能する分子、 −ニューロンの興奮後に伝達物質の再取り込みを防止または刺激する分子、 −偽伝達物質（＋／−）として機能する分子、 −レセプター集積を防止または刺激する分子、 −新規の経路で作用する分子。
【００５８】 安薬、精神安定剤、抗癲癇薬、筋肉弛緩薬、鎮静薬、または睡眠薬として治療に
使用することができる潜在的な薬理学的活性を有する広範な化学物質をスクリー
ニングすることができる。このアッセイを使用して、パーキンソン病およびアル
ツハイマー病に有効な化学物質を同定することもできる。さらに、咽頭ポンピン
グアッセイを使用して鎮痒薬、抗ヒスタミン薬、および抗痙攣薬を単離すること
もできる。ポンピングアッセイを使用して、抗線虫薬および殺虫剤を同定するこ
ともできる。
【００５９】 咽頭ポンピングアッセイを使用して、神経伝達経路を調整する化学物質（アセ
チルコリン、ドーパミン、セロトニン、グルタミン酸、ＧＳＢＡ、およびオクト
パミンを含む）同定することもできる。１つまたは複数の上記神経伝達物質レベ
ルの変化を示す選択性変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを使用してこれを行うことができ
る。
【００６０】 咽頭ポンピングアッセイを使用すれば、１０〜１５個の作用様式および２〜６
個の神経伝達経路およびイオンチャネルをスクリーニングできる潜在性がある。
阻害と同様に活性化を観察することができるので、このスクリーニング法は、１
回のスクリーニングで４０〜１８０個の標的のスクリーニングが可能である。
【００６１】 上記のスクリーニングに加えて、咽頭ポンピングアッセイ法を、化学物質の作
用様式の決定または特異的標的に作用する化学物質の選択に適用することができ
る。
【００６２】 化合物の作用様式を同定するためのスクリーニングを行うために、実質的に同
数の定義された異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化線虫をマルチウ
ェルアッセイプレートのウェルに分配する。次いで、試験化合物のサンプルを各
ウェルに添加し、上記のように咽頭ポンピング速度の変化を検出する。各変異、
トランスジェニック、またはヒト化株について、任意の化学物質の非存在下での
咽頭ポンピング速度も記録する。従って、咽頭ポンピングアッセイを使用して、
定義された変異、トランスジェニック、またはヒト化株における咽頭ポンピング
速度を向上させるか抑制する化合物を同定することができる。
【００６３】 本明細書中に記載の実施例では、本発明の態様で有用ないくつかの変異および
トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを列挙する。主に、これらの変異体およ
びトランスジェニックは、神経伝達物質合成、神経伝達物質シグナル伝達、およ
びイオンチャネルに関する。より詳細には、神経伝達物質レセプター（ムスカリ
ンレセプター、グルタミン酸レセプター、ホルモンレセプター、５−ＨＴレセプ
ター、カンナビノイドレセプター、アドレナリンレセプター、ドーパミンレセプ
ター、オピオイドレセプター、ＧＡＢＡレセプター、アデノシンレセプター、Ｖ
ＩＰレセプター、およびニコチンレセプターなど）、神経伝達物質合成に関与す
るタンパク質、神経伝達物質放出経路タンパク質、Ｇタンパク質結合レセプター
経路（アデニル酸シクラーゼ、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ応答エレメント
結合タンパク質、ＩＰ３、ジアシルグリセロール、プロテインキナーゼＣ、ホス
ホリパーゼＱなど）、ギャップ結合機能をコードするタンパク質、イオンチャネ
ルタンパク質、およびイオンポンプタンパク質に関する変異、トランスジェニッ
ク、およびヒト化蠕虫の例を示す。完全ではないが、本発明のこの態様での使用
に適切な周知の変異のリストを、本明細書中の実施例中に示す。
【００６４】 このような変異、トランスジェニック、またはヒト化株を使用して、特定の標
的に作用する化学物質をスクリーニングして抗精神病薬、抗鬱薬、抗不安薬、精
神安定剤、抗癲癇薬、筋肉弛緩薬、鎮静薬、または睡眠薬として治療に使用する
ことができる広範な化学物質を同定することが可能であるだけでなく、このスク
リーニングはパーキンソン病およびアルツハイマー病に効果を有し得る化学物質
も得られる。さらに、鎮痒薬、抗ヒスタミン薬、および抗痙攣薬を単離すること
ができる。おそらく化学物質の影響を受けることによって本アッセイによって検
出することができる伝達物質経路はアセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、
グルタミン酸、ＧＳＢＡ、およびオクトパミンの経路である。適切なトランスジ
ェニック、変異、または修飾株を使用して、特異的標的で作用する化合物につい
てスクリーニングすることが可能であり、殺虫剤および抗線虫薬もまた同定する
ことが可能である。
【００６５】 これらの変異、トランスジェニック、およびヒト化蠕虫はまた、十分に定義さ
れた生化学的経路で活性を有する化学物質のスクリーニングを開発することがで
きる。例えば、公知の遺伝子または化合物中の選択された変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｓの表現型を向上させる定義された変異を保有する選択された変異Ｃ．ｅｌｅｇ
ａｎｓの表現型を回復する化合物のスクリーニングが可能である。
【００６６】 本発明の特に重要な実施形態では、咽頭ポンピングスクリーニングを使用して
、潜在的な殺虫活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。本発明
者らは、殺虫活性を有する化合物（除草剤、殺虫剤、抗線虫薬、または抗真菌薬
など）へのＣ．ｅｌｅｇａｎｓの暴露は、咽頭ポンピング速度に影響を与えるこ
とを観察した。これを、咽頭ポンピング法を使用して測定するとＣ．ｅｌｅｇａ
ｎｓの咽頭ポンピング速度に対する公知の殺虫剤の効果を示す添付の図１８〜図
２１に例示する。従って、殺虫活性を有する化合物をスクリーニングするために
、咽頭ポンピングスクリーニングを容易に適用することができる。
【００６７】 本発明の別の実施形態では、咽頭ポンピングアッセイ法を使用して、線虫に対
して定義された効果を有する化合物が作用する生化学的経路の成分をさらに同定
することができる。このスクリーニングを使用して、選択された化合物の活性を
向上、抑制、または調整する遺伝子の同定が可能である。マルチウェルプレート
を使用して何千もの蠕虫を１回でスクリーニングすることができるので、このス
クリーニングを直接勝つ迅速に行うことができる。
【００６８】 第１に、変異蠕虫の無作為なプールを作製する。変異蠕虫を作製するためのい
くつかの技術（ＥＭＳ変異誘発、ＴＭＰ−ＵＶ変異誘発、または照射変異誘発）
が記載されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４８
巻、同書）。次いで、変異誘発Ｆ１線虫をマルチウェルプレートの各ウェルに分
配し、ウェル中にＦ２世代に子孫を産生させる。次いで、線虫に対する公知の活
性を有する化合物のサンプルを、Ｆ２蠕虫に添加する。咽頭ポンピング速度の変
化を上記のように（例えば、マーカー分子またはマーカー分子前駆体の使用）監
視する。
【００６９】 咽頭ポンピングに対する化合物の効果を抑制、向上、または調整する変異蠕虫
を記録する。これらの変異蠕虫は、化合物によって影響を受ける１つまたは複数
の遺伝子の変異を有する。次いで、遺伝学的および分子生物学的技術を使用して
変異遺伝子を単離することができる。これらの遺伝子およびその対応するタンパ
ク質は、影響を受けた経路の重要な遺伝子およびタンパク質であると考えられる
ので、薬物発見肯定におけるさらなるスクリーニング開発用の新規の推定標的で
ある。本明細書中に記載の全ての方法と同様に、好ましくは微視的線虫、特にＣ
ａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の蠕虫、最も好ましくはＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使
用してこの方法を行う。
【００７０】 本発明のさらに別の実施形態では、咽頭ポンピングアッセイ法を使用して、線
虫に対して定義された効果を有する選択された化学物質のエンハンサー、サプレ
ッサー、またはモジュレーターである化学物質をスクリーニングすることもでき
る。
【００７１】 このアッセイでは、線虫の咽頭ポンピング速度に対して公知の効果を有する化
合物をマルチウェルプレートに置く。次いで、第２の化学物質を各ウェルに添加
し、選択された化合物の効果を向上、低減、または調整する化学物質を上記の方
法を使用した線虫の咽頭ポンピング速度の変化の検出によって同定する。この方
法は、選択された生化学的経路で活性な化学物質のスクリーニングに有用である
。従って、単離した化学物質は推定治療薬であるか、さらなる薬物開発の出発物 質 と考えることができる。
【００７２】 咽頭ポンピングアッセイのさらなる実施形態では、Ｓａｒｃｏ／小胞体カルシ
ウムＡＴＰアーゼ遺伝子（ＳＥＲＣＡ）および／またはそのレギュレーターであ
るホスホランバン（ＰＬＢ）、およびサルコリピン（ＳＬＮ）をトランスジェニ
ック、変異、ヒト化したＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用してアッセイを行う。これら
の遺伝子は細胞中のカルシウムの内部保存の制御に重要である。
【００７３】 これらの変異、トランスジェニック、またはヒト化蠕虫において咽頭ポンピン
グ速度を変化させる化学物質は、ＳＥＲＣＡ、ＰＬＢ、またはＳＬＮの活性を変
化させるか、ＳＥＲＣＡ−ＰＬＢの内在化を変化させるか、ＳＥＲＣＡ−ＳＬＮ
の相互作用を変化させるか、ＳＥＲＣＡ経路の活性を変化させる物質である。こ
のような化学物質は、治療薬として有用であるか、心血管疾患（高血圧、心肥大
、および心不全を含む）の領域だけでなく真性糖尿病の領域および骨格筋疾患（
ブロディー病を含む）の領域のさらなる薬物開発に有用な出発化合物であり得る
。
【００７４】 咽頭ポンピングアッセイのさらなる実施形態では、異常な咽頭形態学および／
または機能を示す線虫を使用してアッセイを行うことができる。
【００７５】 線虫の咽頭は、いくつかの細胞型からなり、これらの全ては咽頭が適切に機能
するために必要である。さらに、咽頭ポンピングはいくつかのニューロンによっ
て制御されている。咽頭形態学および咽頭機能に必須の細胞は、咽頭筋細胞、咽
頭上皮細胞、咽頭腺細胞、および咽頭ニューロンである。これらの細胞型の１つ
が変化するか、変性するか、機能障害を起こした場合、咽頭は異常な形態学また
は異常な機能を有するので咽頭ポンピングが変化する。
【００７６】 下記の例は、咽頭形態学の変化の結果としてポンピングの変化を示す公知のＣ
．ｅｌｅｇａｎｓ変異体を列挙する。さらに、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭の形態
学および／または機能を維持するために必要な１つまたは複数の細胞型の欠失を
示すＣ．ｅｌｅｇａｎｓ蠕虫を作製することが可能である。これを、咽頭の細胞
中の「毒性遺伝子」の発現によって行うことができる。この文脈では、用語「毒
性遺伝子」は、細胞に毒性を示すタンパク質をコードする任意の核酸配列を含む
。適切な例には、アタキシン、αシクレイン、ユビキチン、τ遺伝子産物、ハン
チントン遺伝子産物、ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー遺伝子産物、年齢関連性黄斑
ジストロフィー産物、またはｕｎｃ−５３遺伝子産物をコードする核酸が含まれ
る。等価の効果を有するアポトーシスまたは壊死に関連するタンパク質をコード
する「毒性遺伝子」を、使用することもできる。適切な発現パターンを指向する
ことができる組織特異的または細胞型特異的プロモーターを使用して、咽頭また
は咽頭内の特定の細胞型における毒性遺伝子の発現を行うことができる。例えば
、ｍｙｏ−２プロモーターを使用して咽頭中の発現を指向し、ｕｎｃ−１２９プ
ロモーターを使用して咽頭ニューロン中に発現を指向することができる。他の適
切なプロモーターには、トロポミオシンプロモーターｔｍｙ−１およびｄａｆ−
７プロモーターが含まれる。咽頭の１つまたは複数の細胞型または咽頭ニューロ
ン中の毒性遺伝子の発現により、咽頭の形態学および／または機能が変化し、そ
れにより咽頭ポンピング速度が変化する。興味深いことに、ｄａｆ−７プロモー
ターの調節下での毒性遺伝子の発現によるＡＳＩニューロンの破壊により、耐性
幼虫が形成される。これはインスリンの欠乏の結果であるので、ＡＳＩニューロ
ンを破壊したＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用して糖尿病との関連付けに有用であるス
クリーニングを行うことができる。下記の咽頭ポンピングアッセイの読み出しま
たは運動アッセイの読み出しを使用してこれらのスクリーニングを行うことがで
きる（実施例１２を参照のこと）。
【００７７】 咽頭ポンピング速度の変化を示す変異またはトランスジェニック蠕虫を使用し
て、咽頭ポンピング速度を変化させる（例えば変異／トランスジェニック表現型
を回復させるか変異／トランスジェニック表現型を向上させる）化学物質をスク
リーニングすることができる。従って、単離した化学物質は、抗鬱薬、抗精神病
薬、抗不安薬、精神安定剤、抗癲癇薬、筋肉弛緩薬、鎮静薬、抗片頭痛薬、鎮痛
剤、または睡眠薬などの治療薬または疾患領域のさらなる薬物開発の出発化合物
として有用であり得る。さらに、咽頭／咽頭ニューロンの細胞中に発現する毒性
遺伝子の性質の変化によって、パーキンソン病、アルツハイマー病、ローリー病
、Ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー、年齢関連性黄斑ジストロフィー、およびポリグ
ルタミン誘導性疾患（ハンチントン病、ケネディー病、および運動失調など）の
治療法開発に有用な化学物質を単離することができる。さらに、咽頭ポンピング
速度の変化を示す変異またはトランスジェニック蠕虫を使用して、除草剤、殺線
虫薬、殺虫剤、および抗真菌薬などの農薬をスクリーニングすることができる。
【００７８】 アッセイ培地の粘度を増大させるためのアッセイ培地への水溶性ポリマーの添
加によって本明細書中に記載の咽頭ポンピングアッセイの能力を改良することが
できる。好ましいポリマー型は、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレング
リコール（特に、ＰＥＧ８０００）、および低融点アガロースである。任意の所
与のポリマー型および咽頭ポンピングアッセイ型について、培地に添加した至適
濃度のポリマーを、日常的な実験によって同定することができる。添付の図１４
および図１５に例示のように、アッセイ培地の粘度を増大させるためのポリマー
の添加により、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭ポンピングが増大する。これは、より
粘性の高い培地を使用するほどＣ．ｅｌｅｇａｎｓが自然界で生息する固体条件
により近づけることができると考えられる。
【００７９】 線虫のマルチウェルプレートのウェルへの固着を回避するのに十分な濃度の水
溶性ポリマーのアッセイ培地への添加によって、咽頭スクリーニングの能力を改
良することもできる。好ましいポリマー型は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）（特に、ＰＥＧ８０００）、ＰＶＡ、およびＰＶＰであり、ＰＥＧ８０００が
最も好ましい。所与の任意のポリマー型および咽頭ポンピング型における所与の
ポリマー型について、日常的な実験によって至適濃度のポリマーを培地に容易に
同定することができる。０．１％の濃度のＰＥＧ８０００が特に好ましい。
【００８０】 本発明者らは、咽頭ポンピングアッセイにおけるアッセイ培地へのＰＥＧの添
加により、主に個体の死滅するか損傷を受けた個体数の減少による質が向上する
ことを観察した。アッセイの準備中に、手動または自動化システムのいずれかを
使用して異なるウェルおよびプレートに線虫を分配する必要がある。これらの線
虫の操作中には、線虫がピペットまたは他のツールに固着するリスクが存在する
。線虫が懸濁している培地の流動により、蠕虫が死滅する。培地へのＰＥＧ８０
００の添加により、咽頭ポンピングアッセイにおいてポンピングが増加し、変形
が減少すると結論付けることができる（図１０を参照のこと）。
【００８１】 本発明のさらなる実施形態では、非視覚的検出手段を使用した線虫の表現型、
生理学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程には、線虫細胞中
のイオン、代謝産物、または二次メッセンジャーの細胞内レベルの変化を検出す
る工程を包含する。
【００８２】 本発明のこの特定の実施形態では、化学物質の活性を、マーカー分子由来のシ
グナルの測定によって間接的に検出するのではなく、特異的イオン、代謝産物、
または二次メッセンジャーの存在下で性質を変化させた遺伝子コードセンサーの
活性の測定によって検出する。例えば、Ｃａ２＋の細胞内レベルを、遺伝子コー
ドカルシウムセンサー分子ＧＦＰ−カルモジュリンまたはエクオリンを使用して
検出することができる。ＧＦＰ−カルモジュリンは、カルシウムイオンの存在下
で蛍光を発することが公知である。従って、細胞内カルシウムレベルが低い場合
は蛍光を検出することができないが、カルシウムレベルが増加した場合、カルシ
ウムはＧＦＰ−カルモジュリンと結合して高次構造の変化を生じ、例えばマルチ
ウェルプレートリーダーを使用して検出することができる蛍光分子が得られる。
二次メッセンジャー（ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、またはイノシトール三
リン酸（ＩＰ３）など）の存在下で蛍光または発光性を変化させた他の遺伝子コ
ードセンサー分子を使用することができる。
【００８３】 好ましくは、本発明のこの態様を、全細胞、特異的組織、または選択された細
胞中で遺伝子コードセンサーを発現するトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ
を用いて行う。これを、適切な活性を有する組織特異的または細胞型特異的プロ
モーターを使用して行うことができる。カルシウムシグナル伝達に感受性を示す
線虫の任意の細胞／組織（咽頭、陰門筋、体壁筋、およびニューロンを含む）中
でＧＦＰ−カルモジュリンを発現するトランスジェニック蠕虫を使用してこの方
法を行うことができる。先の例として、トランスジェニック蠕虫は野生型、トラ
ンスジェニック、またはヒト化株であり得る。
【００８４】 咽頭細胞の細胞内カルシウムレベルは、咽頭ポンピング速度と相関し、これら
の細胞中のＧＦＰ−カルモジュリンを発現するトランスジェニック線虫において
検出される蛍光は咽頭ポンピングの指標であり、また、これらのトランスジェニ
ック蠕虫を使用して咽頭のポンピング速度に影響を与える化学物質をスクリーニ
ングすることができる。
【００８５】 本発明のさらなる実施形態では、非視覚的検出を使用した線虫の表現型、生理
学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の運動性の変
化を検出する工程を包含する。
【００８６】 液体培地に存在する線虫は、培養の間中おおよそ一様な（均一の）分配を維持
するような方法で運動する。運動性が不完全な線虫は、液体培地の底の沈殿する
。線虫の運動表現型の結果としての線虫のこの特徴のために、運動する線虫と運
動しない線虫との間の相違の監視および検出が可能である。
【００８７】 線虫の運動性は、主に体壁筋の作用の結果であり、ニューロンの活性によって
制御される。従って、筋肉および／またはニューロン活性に対する効果を有し得
る化学物質を同定するための運動性の変化の検出に基づくスクリーニングを開発
することができる。
【００８８】 進歩したマルチウェルプレートリーダーは、マルチウェルプレートのウェルの
小領域を検出することができる。このプレートリーダーの使用によって、マルチ
ウェルプレートのウェルの選択された表面領域の測定が可能である。ウェルの中
央のみが測定されるように測定領域を中心に集める場合、線虫の自己蛍光（いか
なる外部マーカー分子の非存在下でも発生する蛍光）または光学密度を、運動性
が不完全な線虫を含むウェルと比較して正常に運動する線虫を含むウェル中で観
察することができる。正常に運動する線虫を含むウェルでは、低レベルの自己蛍
光または光学密度が認められる一方で、運動性が不完全な線虫を含むウェル中で
は高レベルの自己蛍光または光学密度が認められる。当該分野で周知の血小板凝
集アッセイの変形形態を使用して、光学密度を測定する。Ｄｙｎｅｘ（ＵＳＡ）
のＭＲＸ暴露デバイスを使用して、ウェルあたり複数のポイントで線虫の沈殿パ
ターンを示す光学密度を測定することができる。
【００８９】 運動性アッセイの適用では、ウェル表面の２つの領域（一方はウェルの中央で
の測定および他方はウェルの縁での測定）で自己蛍光または光学密度の測定を行
うことができる。ウェルの中央だけでなくウェルの縁をさらに測定してさらなる
調節およびいくらかより明白な結果が得られるので、２つの測定の比較により類
似の結果が得られる。
【００９０】 上記の咽頭ポンピングアッセイと同様の目的のために運動性アッセイを行うこ
とができる。すなわち、運動性アッセイを使用して線虫の運動性を変化させる化
学物質を同定することができるので、化合物の遺伝子エンハンサー、サプレッサ
ー、またはモジュレーターの同定用の筋肉および／またはニューロン活性に対す
る効果を有し得る。線虫の運動性に対する効果を有することが運動性アッセイを
使用して同定された化学物質（表１０にまとめた）は、一般に、ＣＮＳ関連薬の
クラスに属することだけでなく、ＧＡＢＡアンタゴニスト、ＮＭＤＡアンタゴニ
スト、ｍ−Ｇｌｕアンタゴニスト、およびアドレナリンアンタゴニストも含まれ
ることが見出された。
【００９１】 運動性アッセイは、運動している線虫が培地中で懸濁されたままである一方で
運動しない線虫はウェルの底に沈むという原理に基づく。上記のように、線虫の
位置の違いにより、ウェルの中央で測定した場合にＯＤが異なる。運動している
線虫は倍地中で希釈されたままであるが、重力の影響により長い時間をかけて沈
殿する傾向がある。
【００９２】 本発明者らは、培地の粘度を増大させるために液体培地へのポリマーの添加を
用いてこの問題を克服することができることを観察した。粘度の増大により、運
動している蠕虫に対する耐性をさらに増大させて培地中より良好に懸濁させるこ
とができる。本発明者らは、カルボキシメチルセルロースの低粘度、中程度の粘
度、および高粘度の変形（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ（上記
））を試験して、運動アッセイの最適条件を決定した。０．３％の濃度の培地粘
性カルボキシメチルセルロースが最適であると決定した。しかし、この結果は、
カルボキシメチルセルロースに制限されず、水溶性ポリマー（例えば、低融点ア
ガロース、ＰＥＧなど）を使用して運動性アッセイに類似の改良を達成すること
ができる。勿論、任意の所与のアッセイで使用した正確なポリマー濃度は、実行
が望まれる特定の型のアッセイに依存し、ポリマー濃度が非常に低い場合は培地
粘度が不十分であり、ポリマー濃度が非常に高い場合はゲルを形成して、アッセ
イ中に運動しない蠕虫が沈まなくなる。任意の所与のポリマー型およびアッセイ
型では、アッセイの至適な実行に必要なポリマー濃度を、日常的な実験で容易に
決定することができる。
【００９３】 比較研究において種々のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ変異体についての運動性アッセイ
における粘度の効果を同定し、その結果を図１２および図１３に例示する。この
研究では、運動性に欠陥を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＵｎｃおよびＡｃｅ変異
体を、Ｍ９培地および粘度の異なる培地において互いに及び野生型Ｃ．ｅｌｅｇ
ａｎｓ Ｎ２と比較した。この実験結果は、高濃度のカルボキシメチルセルロー
ス培地が運動性アッセイを改良することを例示する。
【００９４】 線虫のマルチウェルプレートのウェルへの固着を回避するのに十分な濃度に水
溶性ポリマーをアッセイ培地に添加することによって、本明細書中に記載の運動
性アッセイの能力をさらに改良することができる。好ましいポリマー型は、ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）（特に、ＰＥＧ８０００）、ＰＶＡ、およびＰＶ
Ｐであり、ＰＥＧ８０００が最も好ましい。所与の任意のポリマー型および運動
性アッセイ型について、培地に添加するポリマーの至適濃度を日常的な実験によ
って容易に同定することができる。ＰＥＧ８０００では、０．１％の濃度が特に
好ましい。
【００９５】 本明細書中に記載の他のスクリーニング法と同様に、好ましくは微視的線虫、
特にＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の蠕虫、最も好ましくはＣ．ｅｌｅｇａｎ
ｓを使用して運動アッセイ法を行うことが好ましい。異なる成長期で同期化した
蠕虫培養物を使用するか、雄、雌雄同体、または耐性幼虫を使用するか、変異、
トランスジェニック、またはヒト化蠕虫を使用して運動性アッセイを行うことが
できる。１つの変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ株であるａｃｅ−１、ａｃｅ−２二重変
異体は、運動性アッセイでの使用に特に有用である。この株は、いかなる運動性
も示さず、痙攣様表現型を有する。従って、これを使用して、不完全な運動表現
型を回復する化学物質をスクリーニングすることができる。これらの化学物質は
、筋肉および／またはニューロン活性に対する薬理学的効果を有し得る。
【００９６】 本発明のさらなる実施形態では、非視覚的検出を使用した線虫の表現型、生理
学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の交配挙動の
変化を検出する工程を包含する。
【００９７】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫の交配挙動は、非常に複雑であり、少なくとも
以下の工程が含まれる：バッキング、尾の湾曲、陰門の位置、および交尾。この
挙動を示すために、雄線虫は、交配構造に関連する少なくとも４１個の特別の筋
肉細胞、７９個のさらなるニューロン、３６個のさらなるニューロン支持細胞、
２３個の肛門細胞、および１６個の皮下組織細胞を有する。いくつかのニューロ
ンの機能が記載されている。交配挙動が不完全ないくつかの変異体も記載されて
いる（Ｃ．ｅｌｇａｎｓ ＩＩ同書、Ｊ．Ｓｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｗ１３
Ｇ、７（２）、２２；Ｌｏｅｒ ａｎｄ Ｋｅｎｙｏｎ、ＷＢＧ、１２（２）、
８０、１９９２；Ｈａｄｊｕ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｗｏ
ｒｍ ｍｅｔｔｉｎｇ ａｂｓｔｒａｃｔ、１５１、１９９１）。交配挙動の複
雑な性質のために、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの交配挙動を向上させるためのいくつか
の条件および変異体が記載されている。これらのうちの１つは、成虫期に麻酔さ
れた挙動を示すｕｎｃ−５２（ｅ４４４）などの運動性が減少した雌雄同体の使
用である。
【００９８】 交配には、筋肉およびニューロンの両方の活性が関与するので、線虫の交配挙
動の変化の検出に基づくスクリーニング（交配アッセイ）を使用して、筋肉およ
び／またはニューロンの活性を調整することができる化学物質を同定することが
できる。交配アッセイを使用して、交配を調整する化学物質を単離するか、交配
挙動にもたらす化合物の活性を調整する化学物質を単離するか、交配挙動におい
て活性である遺伝子および経路を単離するか、交配挙動に影響を与える化合物の
活性を調整する遺伝子および経路を単離することができる。言い換えれば、上記
の咽頭ポンピングアッセイおよび運動性アッセイと全く同一の目的に交配アッセ
イを使用することができる。
【００９９】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、液体培地中で交配することができない。従って、半固
体条件下で、交配挙動に基づく高処理スクリーニングを行うことができる。この
目的には約０．５％の低融点アガロース溶液が適切である。この半固体培地によ
り、線虫は互いに移動して交配するのに十分に支持される。交配アッセイで適切
な粘度の培地を獲得するための他のポリマーの添加も使用することができる。
【０１００】 交配実験由来の卵または子孫の産生数の測定によって、交配能力を測定する。
本発明の特定の実施形態では、自家受精によって子孫を産生することができない
特異的株を使用する。このようないわゆる雌雄同体「非自殖」は、子孫を産生し
ないが、交配した雌雄同体は、子孫を産生する。上記の運動性試験によって子孫
を直接測定するか、上記の咽頭ポンピングスクリーニングを行うことができるよ
うにカルセイン−ＡＭなどの色素を培地に添加することができる。あるいは、特
異的抗体および蛍光抗体を使用して、子孫を検出することができる。卵、Ｌ１期
、Ｌ２期、Ｌ３期、またはＬ４期の蠕虫のみを認識する任意の特異的抗体は子孫
のみを認識し、例として、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ Ｌ１幼虫の表面上の抗原を認識
する抗体が、Ｈｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．、１１５（５）、１２３７〜４７に記載されている。最後に、各ウェル中の卵
または子孫の数を、ＦＡＮＳデバイスを用いて直接計数することができる。
【０１０１】 本発明の別の実施形態では、雄蠕虫または雌雄同体蠕虫は、自己蛍光タンパク
質（ＧＦＰまたはＢＦＰ）などのマーカー分子またはいくつかまたは全ての細胞
型中の蛍光マーカーを安定に発現するトランスジェニック蠕虫であり得る。これ
らのトランスジェニック蠕虫の交配によって産生された子孫もまたマーカー分子
を発現するので、マルチウェルプレートリーダーまたはＦＡＮＳデバイスを使用
して容易に測定することができる。雄蠕虫がマーカーを発現するトランスジェニ
ック蠕虫である場合、雄および雌雄同体の交配に起因する子孫のみがマーカーを
発現し、雌雄同体の自家受精から産生された子孫はマーカー分子を保有しないの
で、雌雄同体は「非自殖」である必要が無い。したがって、交配および自家受精
に起因する子孫を、区別することができる。雌雄同体蠕虫はマーカー分子を発現
するトランスジェニック株である場合、雌雄同体株はまた「非自殖」株であるこ
とが好ましい。
【０１０２】 交配挙動に関連する雄特異的ニューロンが破壊されているＣ．ｅｌｅｇａｎｓ
を使用して、交配アッセイを行うこともできる。本明細書中に含まれる例により
、交配挙動に関連する特異的ニューロンのリストが得られる。例えば、咽頭ポン
ピングアッセイに関する上記の１つの毒性遺伝子発現によって、１つまたは複数
のこれらのニューロンの機能を破壊することができる。１つまたは複数の特異的
ニューロンが欠損したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの使用によって、特異的ニューロンシ
グナル伝達経路に作用する化学物質を同定するためのスクリーニングが可能であ
る。このようなスクリーニングを使用して同定した化学物質は、ＣＮＳ関連薬理
学的活性を有し得る。
【０１０３】 特異的組織または細胞型における毒性遺伝子の発現の結果として交配挙動の変
化を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用して、交配アッセイを行
うこともできる。適切な組織または細胞型特異的プロモーターの調節下で上記の
毒性遺伝子の１つを使用した当該分野で公知の標準的技術に従って、適切なトラ
ンスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを構築することができる。この目的に有用で
あり得るプロモーターには、ＣＰ９での遺伝子に発現を指向するｈｅｒ−１ Ｐ
２プロモーター、ｒａｙ６での遺伝子発現を指向するｍａｂ−１８（ｐａｘ−６
ホモログｖａｂ−３での遺伝子発現を指向する）プロモーター、受精嚢の６０個
の細胞中の遺伝子発現を指向するｓｐｅ−Ｔ１プロモーターが含まれる。
【０１０４】 本発明のさらなる実施形態では、非視覚的検出を使用した線虫の表現型、生理
学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の産卵挙動の
変化を検出する工程を包含する。
【０１０５】 雌雄同体Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ線虫の陰門は、少なくとも２４個の細胞および数
個のニューロンを含み、そのうちＨＳＮニューロンは産卵に最も重要であると考
えられている。さらに、少なくとも８個の子宮筋肉を記載した。生殖腺発達、産
卵、陰門発達、および機能におけるいくつかの変異体が記載されている（線虫Ｃ
ａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、同書；Ｃ．ｅｌｇａｎｓ ＩＩ
、同書）。
【０１０６】 従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫の産卵挙動の変化の検出に基づいた読
み出しを使用する高処理スクリーニングアッセイを開発することができる。また
、本明細書中に記載の咽頭ポンピングおよび運動性アッセイと同一の目的で、産
卵の検出に基づくアッセイを使用することができる。このアッセイでは、上記の
交配アッセイ技術を使用して得られた子孫数の計数によって産卵数を検出する。
【０１０７】 産卵アッセイおよび交配アッセイは、卵および子孫の測定に基づく。一定の実
施形態では、卵への特異的抗体の適用および当該分野で公知の卵を認識する抗体
に特異的な色素での対比染色によって、卵の量を測定することができる。さらな
る実施形態では、この方法は、卵殻を認識する特異的色素を使用して産卵数を検
出する工程を包含する。１つの特定の実施形態では、卵の孵化の際に放出される
物質を認識する色素を使用して、ウェル中の卵数の検出を行う。孵化工程の間に
、酵素キチナーゼが培地に放出される。酵素は、蛍光前駆体分子である基質４−
メチルウンベリフェリル２−Ｄ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリアセチルキトトリオシド（
または４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシド
）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販）を認識する。合成基質４−
メチルウンベリフェリルトリアセチルキトトリオシドの加水分解後にマイクロタ
イタープレートリーダー中の遊離４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定する
。キチン部分に連結した色素を含むか、発光、蛍光、または有色色素であり得る
他の基質を、このようなスクリーニングで使用することができる。この例は、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲまたはＳｉｇｍａから市
販されているＮ−アセチル−２−グルコサミニドまたはＣＭ−ＤＣＦ−ＮＡＧで
ある。キチナーゼ基質を用いた産卵アッセイを以下の一般的方法を使用して行う
ことができる。マイクロタイタープレート中の８０μｌのＭ９培地に３０匹の線
虫を置く。１０μｌの適切な濃度の試験化合物を添加する。１０μｌの適切な濃
度のキチナーゼ基質を添加する。蛍光、発光、または色素の形成を種々の時間間
隔で測定する。典型的な実験結果を、図１６および図１７に示し、これは、時間
間隔が増加するほど良好な読み出せることを明白に示している。
【０１０８】 本発明のさらに別の実施形態では、非視覚的検出を使用した線虫の表現型、生
理学、挙動、または生化学の変化を示すシグナルの検出工程は、線虫の排泄挙動
の変化を検出する工程を包含する。
【０１０９】 筋収縮の常同性配列の周期的活性化によって、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫
の排泄を行う。これらの収縮は、前側の体壁筋から開始される。前側の体の収縮
頂点で、４つの肛門筋も収縮する。４つの肛門および腸筋は２つの腸筋、肛門下
制筋、および肛門括約筋である。この一連の筋収縮に加えて、運動ニューロンＡ
ＶＬおよびＤＶＢを含む特異的ニューロンもまた、排便の制御に関連する。排泄
には筋肉およびニューロンの両方の活性が必要であるので、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
などの線虫の排泄挙動の変化の検出に基づく読み出しを使用する高処理スクリー
ニングアッセイを開発することができる。また、本明細書中に記載の咽頭ポンピ
ングおよび運動性アッセイと同一目的に、排泄の検出に基づくアッセイを使用す
ることができる。
【０１１０】 不完全な排泄挙動を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ変異体（特に、便秘しているＣ
．ｅｌｅｇａｎｓ変異体）を使用して、排泄アッセイを行うことが好ましい。排
泄周期における全ての欠損を有するいくつかの変異体が報告されている（Ｔｈｏ
ｍａｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２４、８５５〜８７２、１９９０；Ｉｗａｓａｋ
ｉ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、９２、１０３１７〜１０３２１、１９９５；Ｒｅ
ｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４１、９６１〜９７６、１９９
５）。しかし、排泄インヒビターである化合物をスクリーニング可能な野生学蠕
虫または排泄欠損を含まない蠕虫を使用して、排泄アッセイを行うこともできる
。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの排泄には筋肉およびニューロンの活性が必要であるので
、排泄速度を変化させる化合物は、ＣＮＳ関連薬理学的活性を潜在的に有し得る
。
【０１１１】 ｐＨに感受性を示すマーカー分子（例えば、蛍光マーカーＢＣＥＣＦ）を使用
して、Ｃ．ｅｌｇａｎｓなどの線虫の排泄速度を容易に測定することができる。
マーカー分子を、それ自体が蛍光を発しない前駆体ＢＣＥＣＦ−ＡＭの形態でＣ
．ｅｌｅｇａｎｓの腸に充填することができる。ＢＣＥＣＦ−ＡＭをマルチウェ
ルプレートのウェル中の培地に添加する場合、蠕虫は化合物を取り込んでＣ．ｅ
ｌｅｇａｎｓの腸に存在するエステラーゼによって切断されてＢＣＥＣＦを放出
する。ＢＣＥＣＦ蛍光は、ｐＨ感受性であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの腸の比較的
低いｐＨ条件下（ｐＨ６未満）で化合物は全く蛍光を発しないか非常に低い蛍光
を示す。排泄工程の結果として、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの腸よりも高いｐＨを有す
る培地にＢＣＥＣＦが放出されるので、ＢＣＥＣＦは蛍光を発する。従って、倍
地中のＢＣＥＣＦ蛍光レベル（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５５０に設定したマルチウ
ェルプレートリーダーを使用して測定）は、線虫の排泄速度の指標である。
【０１１２】 アスピリンなどの芳香基の存在下でテルビウムなどのランタニドのキレート化
の発光特性に基づく方法を使用して、排泄を測定することもできる。この方法は
２つの予備充填工程（第１に、マルチウェルプレートのウェルを、（線虫の添加
前に）ＤＴＰＡなどのキレート剤に結合させたアスピリンを予備充填し、第２に
当該分野で公知の標準的な技術を使用して細菌または他の線虫食物源粒子を予備
充填する）を必要とする。次いで、ＤＴＰＡなどのキレート剤を結合させたアス
ピリンでＣ．ｅｌｅｇａｎｓを予備充填し、テルビウムを予備充填した細菌を与
える。
【０１１３】 ウェルに添加した予備充填細菌中に存在するテルビウムにより、バックグラウ
ンド発光レベルが低下する。線虫が細菌を摂取する場合、細菌成分は消化される
が、テルビウムは倍地中で純化される。次いで、遊離テルビウムを、ウェル中に
予備充填したアスピリンによってキレート化されて測定可能な発光が得られる。
したがって、認められた発光は、線虫排泄の指標である。
【０１１４】 さらなる排泄検出法は、ランタニドのエステル化キレート剤に基づく。この方
法は、テルビウムのアスピリンキレート化によって排泄を検出する上記の方法と
本質的に類似している。ランタニドキレート化法の主な利点は、キレート剤でウ
ェルを被覆するのではなく、線虫を入れた液体培地に添加することができること
である。
【０１１５】 ランタニドは、芳香基の存在下でキレート化された場合、寿命の長い蛍光を示
すことが公知の希土類金属である。周知のランタニドはユーロピウムおよびテル
ビウムであり、典型的なキレート剤はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）
である。アッセイは、エステル化ＤＴＰＡはテルビウムをキレート化できないと
いう原理に基づく。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓによる消化後、このようなエステル化キ
レート剤は、腸エステラーゼで処理される。従って、排泄による放出の際、テル
ビウムを容易にキレート化するので、当該分野で公知の時間分解蛍光を使用して
検出可能である。この方法は、非常に少量の物質の検出が可能である。短いイン
キュベーション時間に適用する場合、この方法により排泄工程の欠損の監視が可
能である。
【０１１６】 添付の図面と共に以下の実施例を参照して、本発明がさらに理解される。
【０１１７】 実施例１：線虫の分配および化合物の希釈。本発明の方法を使用したスクリー
ニングの基本的実行プロトコルは、９６ウェルを有するマルチウェルプレートに
ついて記載しているが、他のウェルプレート（６、１２、２４、３８４、または
１５３６ウェル）も使用することができる。
【０１１８】 好ましくは、同期化蠕虫を使用する。大量の同期化蠕虫集団は、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ、第４８巻、同書に記載されている。蠕虫を
好ましい時期まで成長させた後、その後使用する前にＭ９緩衝液で洗浄し、アッ
セイ緩衝液（４０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２）に再懸
濁した。（１０×Ｍ９緩衝液：３０ｇ ＫＨ２ＰＯ４、６０ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４ 、５０ｇ ＮａＣｌ、１０ｍｌ ＭｇＳＯ４をＨ２Ｏで１リットルにメスアップ
）。Ｍ９緩衝液以外の他の緩衝液も、この目的に適切であり得る。
【０１１９】 次いで、蠕虫を希釈して半軟寒天（最終濃度が０．２５％の低融点アガロース
を含むＭ９緩衝液）に再懸濁する。この手順により、均一で安定な蠕虫懸濁液が
得られる。低融点アガロース以外の他のポリマーもこの目的に使用することがで
きる。均一な蠕虫懸濁液の存在により、マルチウェルプレート中の蠕虫の等しい
分配が容易になるが、これは記載のスクリーニングアッセイには重要ではない。
ウェル上で均一な線虫の分布が得られる任意の他の方法も有用である。より詳細
には、蠕虫ディスペンサーの使用がさらに良好であり、マルチウェルプレートの
ウェル上により均一に蠕虫が分配される。
【０１２０】 電子８チャネルピペットを使用して、マルチウェルプレートに蠕虫を分配する
。この実験の好ましい設定では、４０＋／−５匹の蠕虫をマイクロタイタープレ
ートの各ウェルに添加する。
【０１２１】 化学物質をＤＭＳＯ中に溶解する。任意の他の溶媒をこの目的に使用すること
ができるが、選択したほとんどの化学物質は、ＤＭＳＯに溶解するようである。
種々の濃度の化学物質をウェルに添加するが、最も明白な結果が得られるように
３μＭと３０μＭとの間の濃度を選択することが好ましい。化学物質濃度を１μ
Ｍ未満〜１００μＭに変化させることによって用量効果のスクリーニングが可能
である。ＤＭＳＯ濃度は高すぎるべきではなく、好ましくは１％を超えるべきで
はなく、より好ましくはＤＭＳＯ濃度は０．５％を超えるべきではなく、さらに
より好ましくはＤＭＳＯ濃度は０．３％より低い。
【０１２２】 実施例２：咽頭ポンピングアッセイ条件。所望される特異的アッセイに依存し
て、異なるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ株を使用することができる。一般に、Ｃ．ｅｌｅ
ｇａｎｓの咽頭のポンピング速度を阻害する化学物質を選択するためのスクリー
ニングを、構成的にポンピングする咽頭を有する変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ株を用
いて行う。野生型蠕虫もこの目的に使用することができるが、変異蠕虫が好まし
い。ポンピングのインヒビターを選択するために、他のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ変異
体をこのスクリーニングで使用することができる。構成的にポンピングする咽頭
を有する選択された変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、一定の速度で腸に培地をポンピ
ングし、この表現型の減少／回復を容易に記録することができ、化学物質の検出
および選択が容易である。
【０１２３】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ咽頭ポンピングを向上させる化学物質を選択するために、
一般に、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ蠕虫を使用してスクリーニングを行うが、他
の変異体をこのスクリーニングに使用することができる。食物源は咽頭ポンピン
グを誘導するためのシグナルの１つであるので、いかなる食物源も含まない液体
培地中で野生型蠕虫はポンピングしないかポンピングが減少する。野生型蠕虫は
、このアッセイでポンピング速度が減少し、ポンピング速度の向上を容易に記録
することができる。
【０１２４】 培地へのカルセイン−ＡＭなどのマーカー分子前駆体の添加およびＣ．ｅｌｅ
ｇａｎｓ腸中のマーカー色素の形成の測定によって咽頭ポンピング速度を直接測
定する。カルセイン−ＡＭを、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの腸に存在するエステラーゼ
によって切断し、蛍光分子であるカルセインを放出させる。どの程度の培地が蠕
虫の腸に侵入し、どの程度のカルセイン−ＡＭが蠕虫の腸に侵入するのかを、咽
頭ポンピング速度によって同定する。したがって、線虫の腸中の蛍光で検出可能
なカルセインの蓄積の測定によって、咽頭のポンピング速度の決定が可能である
。
【０１２５】 咽頭ポンピング速度を変化させる化学物質により、カルセイン−ＡＭがいくら
か取り込まれるので、幾らかの蛍光シグナルが得られる。さらに、マルチウェル
プレートリーダーを使用して蛍光を迅速且つ定量的に測定することができるので
、潜在的な薬理学的活性を有する化学物質同定用の迅速で定量的な高処理スクリ
ーニング法が得られる。
【０１２６】 カルセイン−ＡＭを用いた咽頭ポンピングスクリーニングを行うために、１μ
Ｍと１００μＭとの間の濃度のカルセイン−ＡＭを培地に添加する。５〜１０μ
Ｍのカルセイン−ＡＭを使用するのが好ましい。以下の設定：Ｅｘ／Ｅｍ＝４８
５／５３０のマルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ２、Ｗａｌｌａｃ
Ｏｙ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、蛍光を測定する。
【０１２７】 マーカー分子の蓄積の検出によるこの咽頭ポンピング速度の測定は、カルセイ
ン−ＡＭに限定されない。他の手順を使用することができるので、本明細書中に
記載のアッセイを他の手順に適切なように変更することができる。前駆体をエス
テラーゼで切断することができるが、これは、線虫の腸中の他の酵素の基質であ
ってもよい。さらに、マーカー分子は、蛍光分子である必要は無いが、他の方法
で検出可能な分子であり得る。これらの前駆体物質のほとんどが市販されている
か、当該分野で公知の方法により合成することができる。いくつかの例を以下に
示す。 蛍光読み出し −エステラーゼ基質：カルセイン−ＡＭ、ＦＤＡ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、 −アルカリホスファターゼ基質：フルオレセイン二リン酸（ＦＤＰ）、 −エンドプロテアーゼ：アミノペプチダーゼ基質：ＣＭＢ−ｌｅｕ、 発光読み出し −アルカリホスファターゼ基質：ＡＭＰＰＤ、 色素読み出し −グルクロニダーゼ基質：Ｘ−ｇｌｕｃ。
【０１２８】 基質を見出すか発生させることができる腸に存在する他の標的酵素は、ＤＮＡ
アーゼ、ＡＴＰアーゼ、リパーゼ、およびアミラーゼである。種々のマーカー分
子（主に蛍光）の概要は、「蛍光プローブおよび実験化合物ハンドブック」、ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｈｌａｎｄ編に見出すこと
ができる。
【０１２９】 実施例３：薬局方由来の化合物を用いた咽頭ポンピングアッセイ試験。薬局方
から選択した１６０種の周知の薬物をスクリーニングで使用して、咽頭ポンピン
グ法の能力を試験した。試験した薬物は、種々のカテゴリーに属し、鎮痛剤、抗
糖尿病薬、抗不整脈薬、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、コリンエステラー
ゼインヒビター、プロトンポンプインヒビター、および抗鬱薬が含まれる。
【０１３０】 ２つの９６ウェルマルチウェルプレートに薬物を無作為に分配した。Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓ咽頭のポンピング速度を、実施例２に記載のようにカルセイン−ＡＭ
を使用して測定した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生型Ｎ２株を使用して、ポンピング
表現型のエンハンサーを選択し、構成的にポンピングする咽頭を有する変異Ｃ．
ｅｌｅｇａｎｓ株を使用して、ポンピングのインヒビターを検出した。
【０１３１】 第１のアッセイでは、基質カルセイン−ＡＭを蠕虫および化合物と同時に培地
に添加した。約１時間後に蛍光を測定した。
【０１３２】 このプロトコールの変形形態では、最初に化合物および蠕虫を培地に添加して
約１時間インキュベートする。化学物質が咽頭のポンピング速度を活性化または
阻害させるこのインキュベーション期間後、カルセイン−ＡＭを添加した。次い
で、プレートをさらに１時間インキュベート後、マイクロタイタープレートリー
ダーで蛍光を測定した。
【０１３３】 種々の作用を有する広範な化合物を薬局方から選択したにもかかわらず、全部
ではないが咽頭ポンピング速度活性を有するほとんどの化合物がＣＮＳ薬、カル
シウムチャネルインヒビター、および筋肉弛緩薬のファミリーに属し、これは、
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ咽頭アッセイは上記の領域で活性を有する化合物スクリーニ
ングの良好なモデル系であることを示す。
【０１３４】 プロトコールの変形形態により、いくつかの新規の化合物（以前に検出したほ
とんどの化合物）が検出され、これらには、以下のが含まれる：メトリホナート
、フィゾスチグミン、アトロピン、Ｌ−ヒヨスチアミン、ジフェニルヒダントイ
ン、およびＺＡＰＡ。これら全ての化合物は、ＣＮＳ薬として公知であるか、ア
ルツハイマー病の治療に使用されているか、抗精神病薬、抗鬱薬、または抗癲癇
薬として使用されている。
【０１３５】 実施例４：化合物の作用様式の選択および特異的標的に作用する化合物の選択
。１４種の咽頭ニューロンのうち、少なくともニューロンＩ１、Ｉ２、Ｍ３、Ｍ
Ｃ、ＮＳＭ、Ｍ１、ＲＩＰ、およびＭ４は咽頭ポンピングに重要であることが示
されており、ニューロンＭＣ、Ｍ３、Ｍ４、およびＮＳＭは咽頭の収縮／ポンピ
ング比を制御することが公知である。これらは、それぞれポンピング速度、筋肉
弛緩のタイミング、峡部蠕動、および食物の認知を調節する。線虫Ｃ．ｅｌｅｇ
ａｎｓにおけるニューロンシグナル伝達に関与する主な神経伝達物質は、アセチ
ルコリン、セロトニン、グルタミン酸、オクトパミン、ドーパミン、およびＧＡ
ＢＡである（線虫ｋＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｗ．Ｂ．
Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．編、ＣＳＨＬ ｐｒｅｓｓ、１９８８、３３７〜３９２
）。
【０１３６】 基本的咽頭スクリーニングで選択された薬物（実施例３）から、咽頭ポンピン
グ速度は神経伝達物質のインヒビターおよびアゴニストならびに神経伝達経路（
カルシウムチャネル、ナトリウム／カルシウムチャネル、塩素イオンチャネル）
を阻害するか向上させる化合物に影響を受けることが明らかである。これらの化
学物質は、広範な処方薬（抗鬱薬、抗精神病薬、抗不安薬、精神安定剤、抗癲癇
薬、筋肉弛緩薬、鎮静薬、抗片頭痛薬、鎮痛剤、または睡眠薬など）で使用され
ている。これらの中枢神経系（ＣＮＳ）関連薬のいくつかは、ＣＮＳ関連性遺伝
病（パーキンソン病およびアルツハイマー病）などの疾患領域に適用されている
。
【０１３７】 本発明のＣＮＳ関連薬を概説するために、神経伝達物質経路カスケードにおけ
るその生化学的機能にしたがって分類することが最適である。簡単に述べれば、
ＣＮＳ関連薬は、少なくとも以下の経路の特徴によって影響され得る。 −ＣＮＳ薬は前駆体化合物に影響され得るか、神経伝達物質合成用の前駆体分子
であり得る。 −ＣＮＳ薬は、神経伝達物質合成を向上、阻害、または調整することができる。
−ＣＮＳ薬は、伝達物質の枯渇機能を有し得る。 −ＣＮＳ薬は、シナプス間隙中のシナプス小胞からの伝達物質の放出を防止する
か刺激することができる。 −ＣＮＳ薬は、レセプターのインヒビターまたは刺激剤として機能することがで
きる。 −ＣＮＳ薬は、伝達物質を模倣することができる。 −ＣＮＳ薬は、誘導インヒビターまたはアクチベーターとして機能することがで
きる。 −ＣＮＳ薬は、誘導遮断のアクチベーターまたはインヒビターとして機能するこ
とができる。 −ＣＮＳ薬は、ニューロン興奮後の伝達物質の再取り込みを防止または刺激する
。 −ＣＮＳ薬は、偽伝達物質（−／＋）として機能することができる。
【０１３８】 全て神経伝達物質経路に関連するこれらの特徴のほとんど（多数のＣＮＳ関連
薬）を、塩化物イオンチャネル遮断薬、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、
カルシウム遮断薬、および他のイオンチャネル遮断薬のクラスで見出すことがで
きる。
【０１３９】 ＣＮＳ関連薬をスクリーニングするために、先行技術でいくつかの「ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ」スクリーニング法が開発されている。これらのスクリーニング法（「
ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ」または「クローン化輸送体アッセイ系」とよぶ
）は、当業者に周知である。これらのアッセイでは、特定のレセプターを保有す
る細胞膜を、哺乳動物組織または特異的組織培養物から単離する。ほとんどの場
合、所望のレセプターを過剰発現する細胞からこれらの膜を単離する。膜に存在
するレセプター型に依存して、神経伝達物質（アセチルコリン、ドーパミン、セ
ロトニン、グルタミン酸、ＧＳＢＡ、およびオクトパミンなど）だけでなくホル
モン物質（ノルエピネフリン、アドレナリンなど）などがスクリーニングアッセ
イの対象である。レセプターリガンド（ほとんどの場合神経伝達物質である）が
放射性標識されている場合、レセプターへのリガンドの結合速度の測定が可能で
ある。次いで、レセプターへの放射性リガンドの結合速度を比較する実験条件を
設定することができる。次いで、レセプターへのリガンドの結合を変化させる推
定ＣＮＳ薬および他の化学物質を単離することができる。この方法のいくつかの
変形形態が開発されており、そのいくつかにより、リガンドの再取り込みを阻害
する化合物（セロトニン、ノルエピネフリン、およびドーパミンなど）を単離す
ることができる（Ｋｏｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１９９
５、Ｊｕｌ ２：７、４８３〜７；Ｂｅｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９８、Ｍａｙ １５、３４９：１、１２９〜３２）
。ＣＮＳ関連薬のスクリーニング用に開発されている他の系は、哺乳動物由来の
単離組織または器官を含む。さらに、マウスなどの生きた動物を用いたＣＮＳ関
連薬を単離するための系が記載されている。
【０１４０】 これらのスクリーニングアッセイを使用して神経伝達物質のアンタゴニストを
単離することができるにもかかわらず、これらの「ｉｎ ｖｉｖｏ」アッセイは
、所望のレセプターとの会合のみを監視するので、単離化合物のｉｎ ｖｉｖｏ
効果を反映しない。さらに、神経伝達物質経路カスケードにおけるそれぞれの潜
在的な標的について、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ」を開発する必要がある
。さらに、上記のＣＮＳ関連薬の推定標的のいくつかについては、アッセイが開
発されていないか、これらのアッセイは開発が困難であるか、高処理スクリーニ
ングが不可能である。組織および動物モデルを用いた公知の全てのアッセイもま
た、後者の問題を抱えている。さらに、動物組織または器官を使用したアッセイ
は、大量の動物の屠殺および高等動物の使用に基づく方法のスクリーニングを含
み、動物福祉の問題により避けられつつある。
【０１４１】 咽頭ポンピングアッセイ法を使用して、神経伝達物質（アセチルコリン、ドー
パミン、セロトニン、グルタミン酸、オクトパミン、ＧＡＢＡなど）が活性を示
すかどうかを同定することができる。さらに、新規に単離した化学物質の作用様
式を決定し、潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の一定の経路を選択的にス
クリーニングすることが可能である。
【０１４２】 １つまたは複数の遺伝子が欠損しているＣ．ｅｌｅｇａｎｓ線虫変異体群が構
築されている。標準的技術（すなわち、遺伝子ノックアウト）によって欠損を安
定に移入することができるが、ＲＮＡｉ技術によって一過性に移入することもで
きる。両技術はＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝学の分野で周知である。この線虫群に影
響を与える遺伝子は、１つまたは複数の神経伝達物質経路に関連するものである
。影響を受ける遺伝子の例は、神経伝達物質レセプター（ムスカリンレセプター
、グルタミン酸レセプター、ホルモンレセプターおよび５−ＨＴレセプター、カ
ンナビノイドレセプター、アドレナリンレセプター、ドーパミンレセプター、オ
ピオイドレセプター、ＧＡＢＡレセプター、アデノシンレセプター、ＶＩＰレセ
プター、およびニコチンレセプターなど）、神経伝達物質合成または神経伝達物
質放出経路に関与するタンパク質、Ｇタンパク質結合レセプターをコードする遺
伝子、アデニル酸シクラーゼ、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ応答エレメント
結合タンパク質、ホスホリパーゼＣなどのＧタンパク質結合二次メッセンジャー
についてのタンパク質をコードする遺伝子、ギャップ結合機能をコードする遺伝
子、ならびにイオンチャネルおよびイオンポンプをコードする遺伝子である。
【０１４３】 上記の実施例に記載のように咽頭ポンピングスクリーニングにおいてこれらの
変異体を試験し、参考に結果を蓄積しておく。次いで、咽頭ポンピングスクリー
ニングにおいて未知の作用様式を有する化合物を試験し、得られた結果を変異体
から得た参考結果と比較して、化合物の作用様式または経路を決定する。
【０１４４】 これらの変異体に加えて、トランスジェニック蠕虫も構築した。標準的な技術
（Ｍｉｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４８巻に記載）を使用し
て、ヒト遺伝子を発現するようにＣ．ｅｌｅｇａｎｓを操作することができる。
一過性および安定なトランスジェニック線虫を再度構築することができ、線虫Ｃ
．ｅｌｅｇａｎｓにおける非相同的および相同的導入遺伝子操作法は、当該分野
で周知である。これらの導入遺伝子を、咽頭特異的プロモーターを使用して咽頭
細胞中に単独で発現させることができるが、咽頭のポンピング速度に影響を与え
るニューロン中に単独で発現させることもできる。
【０１４５】 ＣＮＳ関連薬の領域で活性な化学物質をスクリーニングするか単離するために
、トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ中で発現する導入遺伝子は、神経伝達
物質レセプター（ムスカリンレセプター、グルタミン酸レセプター、ホルモンレ
セプターおよび５−ＨＴレセプターなど）、神経伝達物質合成、神経伝達物質放
出経路、およびＧタンパク質結合レセプターをコードすることができる。これら
の導入遺伝子は、ヒト起源の配列をコードするタンパク質であり得る。現在まで
に、少なくとも４００個のＧタンパク質結合レセプターが配列決定されている。
さらに、アデニル酸シクラーゼ、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ応答エレメン
ト結合タンパク質、ホスホリパーゼＣなどのＧタンパク質結合二次メッセンジャ
ーについてのタンパク質をコードする遺伝子、ギャップ結合機能をコードする遺
伝子、ならびにイオンチャネルおよびイオンポンプをコードする遺伝子を、線虫
の咽頭またはニューロンに発現させることができる。
【０１４６】 上記のトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓは、野生型の遺伝的背景を有す
るか、変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ株であり得る。好ましくは、蠕虫は、ヒト化され
ており、これは、ヒト起源のタンパク質コード核酸配列である導入遺伝子が対応
するタンパク質をコードするＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子用に作製した変異させた
蠕虫で発現することを意味する。
【０１４７】 咽頭ポンピングアッセイでの使用に適切であり得る変異体の広範なリストを、
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＩＩ、ＣＳＨＬ ｐｒｅｓｓおよび「Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
ゲノムの神経生物学」、Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２、
２０２８〜２０３３に見出すことができる。Ｇタンパク質の完全なリストを、「
Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓの完全なＧタンパク質遺伝子フ
ァミリー」、Ｊａｎｓｅｎ Ｇ．ｅｔ ａｌ．、Ｗｏｒｍ Ｂｒｅｅｄｅｒｓ
Ｇａｚｅｔｔｅ、第１５（５）巻、１９９９年２月に見出すことができる。
【０１４８】 ニューロンシグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子中に変異を有するＣ．
ｅｌｅｇａｎｓ変異体のいくつかの例を、以下に列挙する。対応するＣ．ｅｌｅ
ｇａｎｓおよびヒトタンパク質をコードする導入遺伝子の発現をＣ．ｅｌｅｇａ
ｎｓ野生型またはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ変異株で操作して、トランスジェニックお
よびヒト化蠕虫を得ることができる。
【０１４９】
【表１】
【０１５０】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭｉｎｎｅｓｏｔａのＣ．ｅｌ
ｅｇａｎｓ変異体群から、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ変異体の範
囲を得ることができる。あるいは、特異的変異体を標準的方法で作製することが
できる。このような方法は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４８巻、「Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ：生物の現代生物学的分
析」、３１〜５８に記載されている。所望の遺伝子が欠失したへに蠕虫を選択す
るために、ＰＣＲ技術のいくつかの選択ラウンドを行うことができる。標的化欠
損遺伝子発現を使用した変異体の他の作製法は、Ｓｕｔｔｏｎ ａｎｄ Ｈｏｄ
ｇｋｉｎ、Ｚｗａａｌ ｅｔ ａｌ．およびＦｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（上記）に
記載されている。
【０１５１】 実施例５：用量反応。咽頭ポンピングアッセイの感受性を同定するために、い
くつかの化学物質について連続希釈を行った。化合物には、クロミプラミン、タ
モキシフェン、ＢＰ５５４、ピマジド、およびタプシガルジンが含まれる。濃度
範囲を１μＭ未満〜１００μＭまでとし、ポンピングアッセイを上記の実施例に
記載のように繰り返した。これらの結果から、明白な用量反応曲線を作製するこ
とができる。
【０１５２】 この実験により、咽頭ポンピングアッセイは定量的であり、これを使用して化
学物質のＩＣ５０およびＥＤ５０を同定することができることが明白に示される
。
【０１５３】 さらに、この実験から、化学物質の毒作用を検出することができる。エンハン
サークロミプラミンの用量反応曲線は、高濃度の溶媒ＤＭＳＯの毒作用が明白に
示される（図５）。
【０１５４】 最後に、二次標的に対する化学物質の効果の検出または種々の濃度の化学物質
の副作用の検出が可能である。これにより、ＳＥＲＣＡのインヒビターとして公
知のタプシガルジンの用量反応曲線がＣ．ｅｌｅｇａｎｓ咽頭のポンピング速度
を減少させることが認められる（図６）。にもかかわらず、低濃度でのポンピン
グの向上が認められる。これは、タプシガルジンのこの特徴の第一の所見である
。さらに未知のタプシガルジンの二次標的または他の副作用によって引き起こさ
れるこの挙動を説明するためにさらなる研究が必要であり、この実験により、咽
頭アッセイの感度および用量反応曲線を編集するための咽頭アッセイの使用が明
白に示される。
【０１５５】 実施例６：遺伝学技術を使用した化学物質活性の検出。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ咽
頭のポンピング速度を測定するための他の技術が存在する。咽頭は筋肉であるの
で、咽頭の収縮性は内部カルシウムレベルに依存する。これらのカルシウムレベ
ルを、特異的カルシウム感受性レポーター遺伝子を使用して測定することができ
る。
【０１５６】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭におけるカルシウムレベルの測定によって電気的活
性の増加を直接検出することができることがＫｅｒｒ ｅｔ ａｌ．（Ｗｅｓｔ
ｃｏａｓｔ Ｗｏｒｍ ｍｅｅｔｉｎｇ ａｂｓｔｒｕｃｔ、７７、１９９８
）によって報告されている。それに記載のカルシウム感受性レポータータンパク
質は、エクオリンおよびＧＦＰ−カルモジュリンである（Ｍｉｙａｗａｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８８、８８２〜８８７）。
【０１５７】 この研究では、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭中でＧＦＰ−カルモジュリンが発現
され、二光子顕微鏡を用いて蛍光が認められた。インベルメクチンなどのポンピ
ングインヒビターおよびセロトニンなどのポンピングエンハンサーが予想される
方法で観察されたＧＦＰ−カルモジュリンの蛍光に影響を与えることが示されて
いる。
【０１５８】 ＧＦＰ−カルモジュリンを発現する類似のトランスジェニック蠕虫を使用した
、咽頭ポンピングアッセイ法を使用して線虫の咽頭のポンピング速度に影響を与
える化学物質をスクリーニングすることができる。前述の実施例におけるカルセ
イン−ＡＭについて記載のポンピングアッセイと同様に、トランスジェニック蠕
虫をマルチウェルプレートに置き、化学物質を添加する。次いで、同一のマルチ
ウェルプレートリーダー装置を用いて、カルセイン蛍光よりもむしろＧＦＰ−カ
ルモジュリンの蛍光を測定する。
【０１５９】 適切なプロモーター配列を使用して、他の筋肉組織またはニューロンにおける
エクオリンまたはＧＦＰ−カルモジュリンの発現を操作してこれらの細胞中のカ
ルシウムレベルを監視することができる。このようなトランスジェニックを、上
記のスクリーニングで使用することができる。
【０１６０】 実施例７：遺伝子エンハンサーおよびサプレッサーのスクリーニング。所与の
化合物の活性を向上、抑制、または調整する遺伝子および生化学的経路を見出す
ことができる。化合物を線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに適用した場合、表現型の変化
が認められるが、しかし、化合物の標的またはその作用様式は既知であるか未知
であり得る。下記のスクリーニング法を使用して、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの表現型
に対する定義された効果を有する化合物の活性を抑制するか向上させる遺伝子を
同定することができる。
【０１６１】 化合物２，５−ジフェニルオキサゾールは、野生型蠕虫および構成的にポンピ
ングする蠕虫の両方の咽頭のポンピング速度のインヒビターである。Ｃ．ｅｌｅ
ｇａｎｓに対して定義された効果を有する化合物の例として、本明細書中ではこ
の化合物を使用する。
【０１６２】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ蠕虫を、標準的技術（ＥＭＳ、ＴＭＰ−ＵＶ、または照射
など）を使用したランダム変異誘発に供する（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４８巻）。これらの変異誘発蠕虫のＦ１世代を、蠕虫ごと
にマルチウェルプレートのウェルに置き、蠕虫を成長させて子孫を産生させる。
子孫が所望の成長期に達した場合、２，５−ジフェニルオキサゾルおよびカルセ
イン−ＡＭを添加する。プレートを約１時間さらにインキュベートし、発生した
カルセインの蛍光を、マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。より
高い蛍光読み取りを有するウェルを記録した。これらのウェル中の蠕虫は、遺伝
子中に変異を保有するか２，５−ジフェニルオキサゾール活性を抑制するので、
さらなる分析に使用した。
【０１６３】 咽頭ポンピングのエンハンサーである化合物ドクサピンを使用して、類似のス
クリーニングを行った。化合物ドクサピンの存在下でポンピング表現型の減少を
示す変異体を記録した。
【０１６４】 実施例８：化合物（タプシガルジン）のアンタゴニストのスクリーニング。化
合物タプシガルジンは、Ｓａｒｃｏ／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣ
Ａ）の活性を阻害することが公知である。ＳＥＲＣＡタンパク質は、カルシウム
をｓａｒｃｏ／小胞体にポンピングし、カルシウムが内部に保存された細胞が得
られる。カルシウムの内部保存は、筋肉活性に重要である。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
では、タプシガルジンの蠕虫への適用によるＳＥＲＣＡ活性の阻害により、咽頭
ポンピング速度が減少する。線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対するタプシガルジン作
用によって認められる他の特徴は運動性の低下であり、これは体壁筋のＳＥＲＣ
Ａ活性の阻害の結果である。
【０１６５】 ＳＥＲＣＡに対するタプシガルジンの活性を抑制する化学物質をスクリーニン
グするための咽頭ポンピングスクリーニングを開発した。上記のように、Ｃ．ｅ
ｌｅｇａｎｓ線虫（野生型線虫および構成的ポンピング咽頭を有する線虫の両方
）を、マルチウェルプレーのウェルに置く。上記のように、阻害濃度のタプシガ
ルジンを蠕虫に添加し、５〜１０μＭの濃度のカルセイン−ＡＭを添加する。最
後に、選択した化学物質を添加する。第２の化学物質を含まないタプシガルジン
を含むコントロールウェルも準備する。
【０１６６】 咽頭ポンピングスクリーニングと同様に、マルチウェルプレートリーダーを使
用して蛍光を測定する。測定した蛍光が化学物質を含まないコントロールウェル
よりも高い化学物質を保有するウェルを記録する。これらのウェルは、タプシガ
ルジンの阻害活性が抑制されるのでタプシガルジン活性のアンタゴニストである
化学物質を保有する。したがって、同定された化学物質は、タプシガルジンの活
性を直接阻害するか、ＳＥＲＣＡ活性を刺激するか、ＳＥＲＣＡ経路（すなわち
、生物のカルシウム生物学）に対してエンハンサー活性を有し得る。
【０１６７】 このスクリーニングで選択された化学物質を、潜在的な治療薬、または生物の
カルシウム生物学の機能障害の原因である疾患領域の治療薬のさらなる開発の出
発物質と考えられる。これらの治療薬が有用な疾患領域の例は、心肥大、心不全
、高血圧、Ｈ型糖尿病、ブロディー病である。
【０１６８】 上記の例では、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対する定義された表現型効果を有する化
合物の例としてタプシガルジンを使用したが、咽頭ポンピング速度に対して阻害
活性を有する任意の化合物を類似のスクリーニングで使用することができる。
【０１６９】 咽頭ポンピング速度を向上させることが公知の化合物に対してアンタゴニスト
活性を有する化学物質を選択するためのスクリーニングを行うこともできる。こ
のような実験では、咽頭ポンピングを向上させることが公知の化合物の存在下で
咽頭ポンピング速度を減少させる場合、化学物質を記録する。
【０１７０】 他のカルシウムポンプおよび他のイオンポンプを阻害する化合物を使用して、
類似の実験を行うことができる。
【０１７１】 実施例９：トランスジェニック変異体およびヒト化動物中の化学物質（ＳＥＲ
ＣＡ−ＰＬＢ）のスクリーニング。ヒトＳＥＲＣＡ−２タンパク質は、ホスホラ
ンバン（ＰＬＢ）として公知の少なくとも１つのタンパク質によって負に制御さ
れることが公知である。両タンパク質は、脊椎動物の心臓で発現され、この相互
作用の特徴について文献に広範なリストが存在する。
【０１７２】 カルシウムの内部保存の増加は、一般に、筋収縮強度に受容であると考えられ
、したがって、この筋収縮の改良または増加をＳＥＲＣＡ活性の向上によって実
現することができる。ＳＥＲＣＡ活性を向上させるかＳＥＲＣＡ−ＰＬＢ相互作
用を阻害する化学物質は、潜在的な治療薬または細胞または生物のカルシウム生
物学の機能障害の原因である疾患領域の治療薬のさらなる開発の出発物質と考え
られる。ＳＥＲＣＡ活性が有利であり得る疾患領域の例は、心肥大、心不全、高
血圧、１１型糖尿病、ブロディー病である。
【０１７３】 異なる疾患型に関連するいくつかのＳＥＲＣＡ遺伝子およびイソ型が存在し、
ＳＥＲＣＡ２およびＰＬＢは心血管疾患に関連し、ＳＥＲＣＡ１およびサルコリ
ピンは骨格筋疾患に関連し、３つのＳＥＲＣＡ遺伝子は非インスリン依存性真性
糖尿病に関連する。
【０１７４】 ＳＥＲＣＡ経路の活性を調整する化学物質を同定するためのスクリーニングを
行うために、ＳＥＲＣＡ遺伝子およびＰＬＢをＣ．ｅｌｅｇａｎｓ中で発現させ
た。これらの遺伝子発現を、以下の活性を有するいくつかの特異的プロモーター
の調節化で制御することができる。 ａ）咽頭中の発現を促進するＣ．ｅｌｅｇａｎｓｍｙｏ−２プロモーター、 ｂ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ筋肉（咽頭、陰門筋、および体壁筋を含む）中の発現を
促進するＣ．ｅｌｅｇａｎｓＳＥＲＣＡプロモーター。
【０１７５】 以下のトランスジェニックを構築した。 ａ）ＳＥＲＣＡおよび／またはｍｙｏ−２プロモーター下でのブタおよび／また
はヒトＳＥＲＣＡ。 ｂ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＥＲＣＡを変異させたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ノック
アウトおよび選択変異）におけるＳＥＲＣＡおよび／またはｍｙｏ−２プロモー
ター下でのブタおよび／またはヒトＳＥＲＣＡ。 ｃ）ＳＥＲＣＡおよび／またはｍｙｏ−２プロモーター下でのブタおよび／また
はヒトＰＬＢ。 ｄ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＥＲＣＡを変異させたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ノック
アウトおよび選択変異）におけるＳＥＲＣＡおよび／またはｍｙｏ−２プロモー
ター下でのブタおよび／またはヒトＰＬＢ。 ｅ）ＳＥＲＣＡおよび／またはｍｙｏ−２プロモーター下でのブタおよび／また
はヒトＰＬＢ−ＧＦＰ。 ｆ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＥＲＣＡを変異させたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ノック
アウトおよび選択変異）におけるＳＥＲＣＡおよび／またはｍｙｏ−２プロモー
ター下でのブタおよび／またはヒトＳＥＲＣＡ。 ｃ）ＳＥＲＣＡおよび／またはｍｙｏ−２プロモーター下でのブタおよび／また
はヒトＰＬＢ−ＧＦＰ。 ｇ）ＳＥＲＣＡプロモーター下でのブタおよび／またはヒトＳＥＲＣＡならびに
／またはｍｙｏ−２プロモーター下でのブタおよび／またはヒトＰＬＢ。 ｈ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＥＲＣＡを変異させたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ノック
アウトおよび選択変異）におけるＳＥＲＣＡプロモーター下でのブタおよび／ま
たはヒトＳＥＲＣＡならびに／またはｍｙｏ−２プロモーター下でのブタおよび
／またはヒトＰＬＢ。 ｉ）ＳＥＲＣＡプロモーター下でのブタおよび／またはヒトＳＥＲＣＡならびに
／またはｍｙｏ−２プロモーター下でのブタおよび／またはヒトＰＬＢ−ＧＦＰ
。 ｊ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＥＲＣＡを変異させたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ノック
アウトおよび選択変異）におけるＳＥＲＣＡプロモーター下でのブタおよび／ま
たはヒトＳＥＲＣＡならびに／またはｍｙｏ−２プロモーター下でのブタおよび
／またはヒトＰＬＢ−ＧＦＰ。
【０１７６】 構築したこれらのトランスジェニックおよび変異動物のいくつかは、カルセイ
ン−ＡＭ咽頭ポンピングアッセイを使用して腸中のカルセイン蛍光によって測定
することができるので、明白な咽頭ポンピング速度の変化を示す。これらの株の
いくつかは、さらなるスクリーニング開発に有用であると考えられた。前述の実
施例に記載のように、トランスジェニックおよび変異動物をマルチウェルプレー
トに置いた。次いで、カルセイン−ＡＭおよび試験化学物質を添加した。腸で形
成されたカルセインの蛍光を、蛍光を測定するように設定したマルチウェルプレ
ートリーダーで測定した。咽頭ポンピング速度の特性を変化するのでＳＥＲＣＡ
経路の機能および活性を変化させる化学物質をさらなる分析用に選択し、これは
、治療用の潜在的な化合物またはさらなる治療薬開発の出発物質と考えることが
できる。
【０１７７】 ＳＥＲＣＡ１遺伝子およびそのレギュレーターを使用してその活性および／ま
たは制御を変化させる化学物質を検出するための類似の実験を行うことができる
。
【０１７８】 実施例１０：トランスジェニックおよび／または変異動物における化学物質（
神経変性）のスクリーニング。線虫の咽頭の解剖学は、いくつかの部分からなり
、いくつかの細胞および細胞型が含まれる。これらには、咽頭筋、咽頭上皮細胞
、咽頭腺、および咽頭ニューロンが含まれる。少なくとも１４種のニューロンが
ニューロン機能に関連し、そのうち最も重要なものはＩ１、Ｉ２、Ｉ３、Ｍ３、
ＭＣ、ＮＳＭ、Ｍ１、ＲＩＰ、およびＭ４である（「線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄ
ｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ」、Ｗ．Ｂ．Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．編、１９８８、
ＣＳＨＬ ｐｒｅｓｓに概説）。
【０１７９】 咽頭の任意の部分（咽頭筋、咽頭上皮細胞、咽頭腺、咽頭ニューロン）の変異
または機能不全により、咽頭ポンピング速度が変化する。ポンピング速度が変化
を生じるか、ポンピング形態学の変化を有するいくつかの変異が文献中で公知で
ある。
【０１８０】 咽頭機能、咽頭ポンピング、および咽頭形態学に関連する細胞を変化させる別
の方法は、線虫にトランスジェニック技術を適用することである。咽頭解剖学お
よび咽頭機能に関連する１つの細胞中の毒性遺伝子の発現により、それぞれの細
胞が変性されるか、機能不全になるか、または異常に発達する。結果として咽頭
のポンピング速度が変化し、おそらくポンピング速度が減少する。
【０１８１】 この目的で使用することができる毒性遺伝子の例を上に列記する。組織特異的
方法においてこれらの遺伝子を発現するトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ
を構築することができる。例えば、ｍｙｏ−２プロモーターは咽頭筋中の発現を
誘導し、ｕｎｃ−１２９プロモーターはニューロン細胞中の発現を誘導する。各
細胞型または組織について、組織の変性を正確に調節することができるように細
胞型特異的組織特異的プロ−モーターを選択することができる。毒性遺伝子の発
現が１つの特異的細胞のみで誘導されるような方法で、プロモーターを選択する
ことができる。
【０１８２】 咽頭解剖学または咽頭ポンピングを変化させる変異体およびトランスジェニッ
クを、遺伝子または形態学的欠失を修復または回復する化学物質を選択するため
の咽頭ポンピングスクリーニングで使用することができる。変異体またはトラン
スジェニック動物のポンピング速度が減少している場合、スクリーニングにより
ポンピング速度を向上させる化学物質を同定することが好ましい。変異体または
トランスジェニック動物のポンピング速度が増加している場合、スクリーニング
によりポンピング速度を減少させる化学物質を同定することが好ましい。
【０１８３】
【表２】
【０１８４】
【表３】
【０１８５】 実施例１２：耐性幼虫を用いたアッセイ、神経変性、およびｄａｆ−７プロモ
ーターの使用の特例。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＡＳＩニューロンは、化学感覚神経
であり、食物認識および咽頭ポンピングに必須である。ＡＳＩまたはＡＤＦまた
はＡＳＧまたはＡＳＪニューロンの破壊による耐性幼虫が形成されることが以前
に報告されている。レーザー切断を用いて１つまたは複数のこれらのニューロン
を死滅させたこれらの実験を行った。（Ｓｃｈａｃｋｗｉｔｚ ＷＳ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ、１７、７１９〜７２８、１９９６）。さらに、Ｄａｆ−７
（ＴＧＦ−βファミリーメンバー）がＡＳＩニューロン中で特異的に発現される
ことが報告されている。
【０１８６】 実施例１１と類似の実験では、ＡＳＩニューロンを死滅させるか、破壊するか
、その性質を変化させる。より詳細には、ｄａｆ−７プロモーターの調節化での
毒性遺伝子の発現の誘導によって、毒性遺伝子をこのニューロン中に発現させる
。このような方法におけるＡＳＩニューロンの破壊によって、耐性幼虫が形成さ
れる。
【０１８７】 このような株を上記のスクリーニングに使用する。第１の実施例では、得られ
た耐性幼虫を、咽頭ポンピングアッセイに使用した。耐性蠕虫は、咽頭ポンピン
グを行わないか、減少した咽頭ポンピングのみを行う。蠕虫が耐性表現型を迂回
して咽頭ポンピングを回復する化学物質を同定した。前述のように、咽頭ポンピ
ング速度を、カルセイン−ＡＭを使用して測定した。
【０１８８】 第２の実施例では、耐性幼虫を運動性アッセイに供した。耐性幼虫は運動せず
に壁に沈殿するので、これを運動性アッセイに使用して蠕虫が耐性表現型を迂回
して蠕虫の運動性を変化させる化学物質を同定することができる。ウェルの中央
より上の自己蛍光を使用して、蠕虫の運動性挙動を検出した。
【０１８９】 実施例１３：耐性幼虫を使用したアッセイの特例。Ｄａｆ−２ ｔｓは、通常
１５℃で成長するが、２５℃では１００％が耐性幼虫を形成する線虫変異体であ
り、これらの変異体をスクリーニングに使用して蠕虫が耐性表現型を迂回する化
学物質を単離することができる。
【０１９０】 このようなアッセイを行うために、同期化Ｌ１ Ｄａｆ−２ ｔｓ蠕虫をマイ
クロタイタープレーのウェル上に分配する。同期化卵も使用することができる。
蠕虫に食物を供給し、２５℃でさらに成長させて耐性幼虫を形成させた。約４日
後、試験化合物およびカルセイン−ＡＭを添加し、２５℃に温度を維持しながら
１時間〜４日間の範囲の選択した時間間隔で蛍光を測定する。蠕虫が耐性表現型
を迂回する化合物を記録した。食物基質の存在により、マルチウェルプレートリ
ーダーを使用して蛍光を検出するのは困難である。この場合、代わりにＦＡＮデ
バイスを使用して蛍光を測定することができる。
【０１９１】 Ｌ１蠕虫と共に試験化合物をウェルに添加する類似の実験を行うことができる
。
【０１９２】 この実験の他の変形形態では、大量のＤａｆ−２ ｔｓ耐性幼虫を培養した。
次いで、耐性幼虫をマルチウェルプレートのウェル上に分配し、化学物質を添加
した。マルチウェルプレートを、運動性アッセイを行うように設定した（すなわ
ち、自己蛍光を測定する）マルチウェルプレートリーダー上に置いた。ウェルを
２５℃に維持しながら１時間〜４日間の範囲の選択した時間間隔で自己蛍光測定
値を記録した。
【０１９３】 実施例１４：運動性アッセイを用いた化学物質および化合物アンタゴニストの
スクリーニング。線虫変異体（ａｃｅ−１；ａｃｅ−２）は、全く運動性を示さ
ず、痙攣様表現型を有する。蠕虫は全く洞様形を示さないが、直線状である。こ
れらは、変異体がアセチルコリンエステラーゼで変異されてシナプス中のアセチ
ルコリン濃度が高いからである。ネオスチグミン（周知のアセチルコリンエステ
ラーゼインヒビター）を、マルチウェルプレートのウェル上に分配した野生型蠕
虫に添加して、約２時間後に運動性アッセイに供した。図８のパネル１は、ネオ
スチグミンに暴露した蠕虫の運動性が明らかに減少することを示す。
【０１９４】 ヘキサメトニウムおよびメカミラミンは周知のアセチルコリンレセプターアン
タゴニストであるので、ａｃｅ１；ａｃｅ２変異体のシナプスへのアセチルコリ
ンの過剰充填を抑制して運動性を修復または回復する。レセプターアンタゴニス
トとして、ヘキサメトニウムはまた適切なシグナル伝達を妨害するので運動性が
減少する。図８の最後のパネルでは、ヘキサメトニウムは野生型蠕虫の運動性を
抑制するが、ネオスチグミンより有意に少ないことが明白に示される（１００％
は野生型蠕虫の正常な運動性を示す）。
【０１９５】 別の実験では、運動性を妨害するために、野生型蠕虫を阻害濃度のネオスチグ
ミンと接触させた。少しのインキュベーション後、種々の濃度のヘキサメトニウ
ムを添加し、ウェルを運動性アッセイ（自己蛍光の測定）に供した。図８に示す
ように、漸増濃度のヘキサメトニウムによって予想したように運動性が増すが（
ヘキサメトニウムはアンタゴニストである）、非常に高濃度（しかし最後のパネ
ルに示した濃度より低い）のヘキサメトニウムでは毒作用が認められ、運動性が
減少する。この毒作用は、おそらく高濃度のネオスチグミンおよびヘキサメトニ
ウムの存在による。
【０１９６】 ａｃｅ−１；ａｃｅ−２二重変異体を使用して類似の実験を行った。この実験
では、ネオスチグミンの非存在下で漸増濃度のヘキサメトニウムをウェルに添加
した。両実験結果を比較した。
【０１９７】 この実験は、化学物質を選択するための運動性アッセイの能力および選択され
た化合物のアンタゴニストを明白に示す。
【０１９８】 実施例１５：雌雄同体（非自殖）を使用した交配アッセイの例。交配実験によ
る子孫の計数によって、線虫の交配挙動の高処理分析を行うことができる。第１
に、マルチウェルプレートのウェル上に等量の雄蠕虫を分配した。次いで、各ウ
ェルが等量の雌雄同体を含むような方法で雌雄同体をウェル上に添加した。雄と
雌雄同体との比は、実験によって変化し得る。
【０１９９】 この実験で選択した雌雄同体は自己子孫が減少するか、子孫は生存不可能であ
り、好ましくは雌雄同体は自家不稔性を示す（ｆｅｒまたはｓｐｅにおける雌雄
同体変異体など）。さらに、交配を向上させるために、自家不稔性雌雄同体は運
動性が減少しているか運動表現型を示さないことが好ましい。この実験における
雄は野生型雄、変異雄、トランスジェニック雄、またはヒト化雄であり得る。
【０２００】 上記のように全子孫産生数の測定によって、交配挙動を評価する。
【０２０１】 実施例１６：雌雄同体（非自殖）発現ＧＦＰの交配アッセイの例。また、運動
性減少表現型を有し且つＧＦＰを安定に発現する特異的自家不稔性トランスジェ
ニック雌雄同体を用いて、交配アッセイを行った。この交配アッセイの全子孫は
ＧＦＰを発現するので、マルチウェルプレートリーダーまたはＦＡＮＳを使用し
たＧＦＰ蛍光の測定によって子孫数を容易に検出することができる。発光マーカ
ーなどの他のマーカーを発現する雌雄同体を、類似の実験に使用することができ
る。
【０２０２】 実施例１７：ＧＦＰを発現する雄の交配アッセイの例。交配アッセイの別の変
形形態では、雌雄同体を以下の組み合わせで選択した。 ａ）雌雄同体は、野生型雌雄同体、減少した運動表現型を示す雌雄同体であった
。 ｂ）雄線虫は、ＧＦＰを発現する野生型、トランスジェニック、変異、またはヒ
ト化線虫であった。
【０２０３】 この実験では、交配に起因する子孫のみがＧＦＰ発現を示すので、雌雄同体の
自家不燃性の子孫および真の交配に起因する子孫を、ＧＦＰの蛍光に従って分配
することができる。
【０２０４】 実施例１８：雄特異的ニューロン。以下の表３は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの雄特
異的ニューロンおよびその交配挙動の役割を列挙する。例えば毒性遺伝子の発現
による１つまたは複数のこれらのニューロンの破壊により、交配スクリーニング
に有用であり得るＣ．ｅｌｅｇａｎｓ変異体を得ることができる。
【０２０５】
【表４】
【０２０６】
【表５】
【０２０７】 実施例１９：さらなる変異およびトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ。以
下の表４は、交配アッセイに使用することができる雄が交配挙動の異常を示すＣ
．ｅｌｅｇａｎｓ変異体を列挙する。
【０２０８】
【表６】
【０２０９】 以下の表５は、産卵アッセイに使用することができる変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
ｋを列挙する。
【０２１０】
【表７】
【０２１１】 特異的組織または細胞型における毒性遺伝子の発現の結果として産卵挙動の変
化を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用して、産卵アッセイを行
うこともできる。適切な組織または細胞型特異的プロモーターの調節下で上記の
毒性遺伝子の１つを使用した当該分野で公知の標準的技術にしたがって、適切な
トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを構築することができる。この目的に有
用であり得るプロモーターには、ｌｉｎ−３１、ｅｇｌ−１７、ｕｎｃ−１７、
およびｕｎｃ−５３プロモーターが含まれる。
【０２１２】 以下の表６は、排泄アッセイに使用することができる変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
を列挙する。
【０２１３】
【表８】
【０２１４】 特異的組織または細胞型における毒性遺伝子の発現の結果として排泄挙動の変
化を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用して、排泄アッセイを行
うこともできる。適切な組織または細胞型特異的プロモーターの調節下で上記の
毒性遺伝子の１つを使用した当該分野で公知の標準的技術にしたがって、適切な
トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓを構築することができる。この目的に有
用であり得るプロモーターには、ｕｎｃ−４３およびｕｎｃ−２５プロモーター
が含まれる。
【０２１５】 以下の表７は、運動性アッセイに使用することができる変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｓを列挙する。
【０２１６】
【表９】
【０２１７】
【表１０】
【０２１８】
【表１１】
【０２１９】
【表１２】
【０２２０】
【表１３】
【０２２１】
【表１４】
【０２２２】
【表１５】
【０２２３】
【表１６】
【０２２４】
【表１７】
【０２２５】
【表１８】
【０２２６】
【表１９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのポンピング速度に対する直接的栄養を有す
ることが公知のニューロンおよび神経伝達物質の概要を示す図である。
【図２】 蛍光読み出しを使用したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ咽頭のポンピング速
度のエンハンサーの検出例を示す図である。
【図３】 蛍光読み出しを使用したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ咽頭のポンピング速
度のインヒビターの検出例を示す図である。
【図４】 インヒビタータモキシフェン、ＢＰ５５４、およびピマジドの用
量反応曲線を示す図である。
【図５】 ＤＭＳＯの毒作用を示すエンハンサークロミピラミンの用量反応
曲線を示す図である。
【図６】 高濃度でのエンハンサー効果および高濃度でのインヒビター効果
を示すタプシガルジンの用量反応曲線を示す図である。
【図７】 運動性アッセイの原理を示す図である。
【図８】 運動性アッセイを使用した化学的基質選択およびアンタゴニスト
選択の原理を示す図である。
【図９】 線虫の時間（ｘ軸）に対する自己蛍光（ｙ軸）の変化を示す代表
的な運動性アッセイの結果を示す図である。
【図１０】 咽頭ポンピングアッセイの能力に対するＰＥＧ８０００の効果
を示すための実験結果を示す。１００匹の線虫（ＨＤ８株）を０．５μＭカルセ
イン−ＡＭの存在下で３時間インキュベートした。０．１％ＰＥＧを添加するか
添加しないで取扱った。
【図１１】 咽頭ポンピングアッセイの能力に対する培地の粘度の効果を示
すための実験結果を示す。
【図１２】 比較研究における種々のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ変異体の運動性ア
ッセイの能力に対する培地粘度の効果を示す図である。１００匹の蠕虫を丸底マ
イクロタイタープレート中でインキュベートした。種々の粘性培地（Ｍ９、培地
粘性カルボキシメチルセルロース、および高粘度カルボキシメチルセルロース）
の３４０ｎｍのＯＤを測定した。３連で測定を行った。
【図１３】 図１２と同様である。
【図１４】 咽頭ポンピングスクリーニングに対する培地の粘度の効果を示
す図である。Ｎ２＋ＭＣは、カルボキシメチルセルロースを含む培地中の野生型
蠕虫を示す。
【図１５】 図１４と同様である。
【図１６】 蛍光基質を使用したキチナーゼ活性の検出に基づくＮ２蠕虫を
使用した産卵アッセイの反応速度を示す図である。それぞれ種々の濃度のクロミ
プラミンおよびフルオキセチンの存在下でアッセイを行った。
【図１７】 図１６と同様である。
【図１８】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭ポンピング速度に対する公知の殺虫
活性化合物の効果を示す図である。図１８−ピクロトキシン、図１９−ロテノン
、図２０−ディルドリン、図２１−イベルメクチン。殺虫剤への暴露による咽頭
ポンピング速度の減少が明らかに認められる。
【図１９】 図１８と同様である。
【図２０】 図１８と同様である。
【図２１】 図１８と同様である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クリスト・プラテーウ ベルギー、ベー−9052ヘント−ズウェイナ ールデ、テヒノロギーパルク９番、デフヘ ン・ナムローゼ・フェンノートシャップ (72)発明者 グヴラディ・クヴィリエ ベルギー、ベー−9052ヘント−ズウェイナ ールデ、テヒノロギーパルク９番、デフヘ ン・ナムローゼ・フェンノートシャップ (72)発明者 ティエリー・ボゲール ベルギー、ベー−9052ヘント−ズウェイナ ールデ、テヒノロギーパルク９番、デフヘ ン・ナムローゼ・フェンノートシャップ Ｆターム(参考） 2G045 AA29 BB01 BB50 BB51 CB17 FB12 4B024 AA11 BA38 CA01 DA02 GA11

Claims (186)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の同定
    法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
    る工程と、 （ｂ）前記線虫と化学物質とを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
    の変化、または生物学的変化を示すシグナルを検出する工程とを包含する、方法
    。
  2. 【請求項２】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前記方
    法は、 （ａ）実質的に同数の異なる変異線虫のパネルをマルチウェルアッセイプレート
    の各ウェルに分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
    の変化、または生物学的変化を示すシグナルを検出する工程とを包含する、方法
    。
  3. 【請求項３】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する生化
    学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 （ａ）線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 （ｂ）１つの変異誘発Ｆ１線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
    配する工程と、 （ｃ）Ｆ１線虫にＦ２子孫を産生させる工程と、 （ｄ）前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 （ｅ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
    の変化、または生物学的変化を検出する工程とを包含する、方法。
  4. 【請求項４】 遺伝学的技術を使用して工程（ｅ）においてシグナルを発生
    させる線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請求項３に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第１の化合
    物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
    る工程と、 （ｂ）前記線虫と前記第１の化合物とを接触させる工程と、 （ｃ）前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 （ｄ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の表現型の変化、生理学的変化、挙動
    の変化、または生物学的変化を示すシグナルを検出する工程とを包含する、方法
    。
  6. 【請求項６】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義され
    た効果を抑制する、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義され
    た効果を向上させる、請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記線虫が微視的線虫である、請求項１〜請求項７のいずれ
    か１項に記載方法。
  9. 【請求項９】 前記線虫がＣ．ｅｌｅｇａｎｓまたはＣ．ｂｒｉｇｇｓａｅ
    である、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記シグナル検出工程がマーカー分子の測定可能な性質の
    変化を検出する工程をさらに包含し、前記マーカー分子の性質の変化が前記線虫
    の表現型の変化、生理学的変化、挙動の変化、または生物学的変化を示す、前記
    請求項のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記マーカー分子が、蛍光分子、発光分子、または有色分
    子である、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記マーカー分子が、蛍光分子の前駆体、発光分子の前駆
    体、または有色分子の前駆体である、請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記マーカー分子がＣ．ｅｌｅｇａｎｓの腸に存在する酵
    素の作用によって切断されて、蛍光分子、発光分子、または有色分子を得ること
    ができる、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記マーカー分子が遺伝子コードマーカー分子である、請
    求項１０に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記線虫が前記遺伝子コードマーカー分子を発現するトラ
    ンスジェニック線虫である、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記遺伝子コードマーカー分子が、自己蛍光タンパク質、
    アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマー
    ゼ、βガラクトシダーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、クロラムフェニコー
    ルアセチルトランスフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ノパリンシンタ
    ーゼ、オクタピンシンターゼ、またはエクオリンである、請求項１４または請求
    項１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダーで
    ある、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記マルチウェルプレートリーダーが、発光、蛍光、また
    は分光光度検出を行う、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記非視覚的検出手段がＦＡＮＳデバイスである、請求項
    １〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記ＦＡＮＳデバイスが、発光、蛍光、または分光光度検
    出を行う、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記シグナル検出工程が、ＦＡＮＳデバイスを用いた線虫
    のサイズおよび／または発達期の検出を包含する、請求項１〜請求項９のいずれ
    か１項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 卵、Ｌ１期、Ｌ２期、Ｌ３期、Ｌ４期、成虫蠕虫、および
    耐性蠕虫の検出を包含する、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記工程（ａ）が実施的に同量の線虫の均一な懸濁液をマ
    ルチウェルプレートアッセイプレートの各ウェルに分配する工程を包含する、前
    記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記均一な懸濁液は、粘性溶液中にＣ．ｅｌｅｇａｎｓの
    懸濁液を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記粘性溶液はポリマー材料の溶液を含む、請求項２４に
    記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ポリマー材料は低融点アガロースである、請求項２５
    に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記線虫を同一の成長期に合わせる、前記請求項のいずれ
    か１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記線虫が卵、Ｌ１期、Ｌ２期、Ｌ３期、Ｌ４期、成虫蠕
    虫、または耐性蠕虫である、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記蠕虫が雌雄同体または雄である、請求項２７または請
    求項２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記線虫は、野生株、変異株、トランスジェニック株、ま
    たは、ヒト化株である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記線虫がヒト起源の１つまたは複数のタンパク質コード
    核酸配列を発現するヒト化株である、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記線虫が、毒性遺伝子を含む導入遺伝子を発現するトラ
    ンスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓである、請求項３０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキチ
    ン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー遺伝
    子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはｕｎｃ−５３遺伝子産物を
    コードする、請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記毒性遺伝子発現が、単一の組織、細胞型のサブセット
    、単一の細胞型、または単一のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞の遺伝子発現を指向する
    ことができる組織特異的プロモーターによって駆動される、請求項３２または請
    求項３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記毒性遺伝子の発現がｄａｆ−７プロモーターによって
    駆動される、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水溶
    性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、前記請求項のいずれか１項に
    記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低融
    点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項３６に記載の方法
    。
  38. 【請求項３８】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロー
    スである、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．３％である、
    請求項３６〜請求項３９のいずれか１項に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの固
    着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行われ
    る、請求項１〜請求項３５のいずれか１項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビ
    ニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項４１に記載の方法
    。
  42. 【請求項４２】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．０１％〜１０
    ％である、請求項４０または請求項４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が０．１％である
    、請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の同
    定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
    る工程と、 （ｂ）前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の咽頭ポンピング速度の変化を検出す
    る工程とを包含する、方法。
  45. 【請求項４５】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前記
    方法は、 （ａ）実質的に同数の異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化線虫のパ
    ネルをマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の咽頭ポンピング速度の変化を検出す
    る工程とを包含する、方法。
  46. 【請求項４６】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する生
    化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 （ａ）線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 （ｂ）１つの変異誘発Ｆ１線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
    配する工程と、 （ｃ）Ｆ１線虫にＦ２子孫を産生させる工程と、 （ｄ）前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 （ｅ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の咽頭ポンピング速度の変化を検出す
    る工程とを包含する、方法。
  47. 【請求項４７】 遺伝学的技術を使用して工程（ｅ）において咽頭ポンピン
    グ速度の変化を示す線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請求項
    ４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第１の化
    合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
    る工程と、 （ｂ）前記線虫と前記第１の化合物とを接触させる工程と、 （ｃ）前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 （ｄ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の咽頭ポンピング速度の変化を検出す
    る工程とを包含する、方法。
  49. 【請求項４９】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義さ
    れた効果を抑制する、請求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義さ
    れた効果を向上させる、請求項４８に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記線虫が微視的線虫である、請求項４４〜請求項５０の
    いずれか１項に記載方法。
  52. 【請求項５２】 前記線虫がＣ．ｅｌｅｇａｎｓまたはＣ．ｂｒｉｇｇｓａ
    ｅである、請求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記咽頭ポンピング速度の変化の検出工程が、前記線虫と
    線虫に取り込まれた場合にシグナルを発するマーカー分子との接触工程および、
    非視覚的検出手段を用いて前記シグナルを検出する工程を包含する、請求項４４
    〜請求項５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記マーカー分子が、蛍光分子、発光分子、有色分子、蛍
    光マーカー分子の前駆体、発光マーカー分子の前駆体、または有色マーカー分子
    の前駆体である、請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記マーカー分子が線虫の腸に存在する酵素の作用によっ
    て切断されて、蛍光分子、発光分子、または有色分子を得ることができる、請求
    項５４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記マーカー分子が、カルセイン−ＡＭ、ＢＣＥＣＦ−Ａ
    Ｍ、フルオレセイン二リン酸（ＦＤＰ）、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、Ｃ
    ＭＢ−ｌｅｕ、ＡＭＰＰＤ、またはＸ−ｇｌｕｃである、請求項５５に記載の方
    法。
  57. 【請求項５７】 前記マーカー分子がｐＨ変化に感受性を示す、請求項５５
    に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダーで
    ある、請求項４４〜請求項５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記マルチウェルプレートリーダーが、発光、蛍光、また
    は分光光度検出を行う、請求項５８に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記非視覚的検出手段がＦＡＮＳデバイスである、請求項
    ４４〜請求項５７のいずれか１項に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記ＦＡＮＳデバイスが、発光、蛍光、または分光光度検
    出を行う、請求項６０に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記線虫が野生型変異、トランスジェニック、またはヒト
    化Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓである、請求項４４〜請求項６１のいずれか１項に記載の
    方法。
  63. 【請求項６３】 前記Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが咽頭ポンピング速度の変化を示
    す、請求項６２に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 前記変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓがＳＥＲＣＡタンパク質およ
    び／またはＰＬＢタンパク質および／またはＳＬＮタンパク質をコードする遺伝
    子の変異を保有する、請求項６２に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 前記トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓはＳＥＲＣＡ
    タンパク質またはＰＬＢタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する、請求項
    ６３に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記導入遺伝子の存在が組織特異的プロモーターによって
    駆動される、請求項６５に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 前記トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓはＳＥＲＣＡ
    タンパク質をコードするＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子中に変異をさらに保有する、
    請求項６５または請求項６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが、１つまたは複数の以下の神経
    伝達物質：アセチルコリン、セロトニン、グルタミン酸、オクトパミン、ＧＡＢ
    Ａ、またはドーパミンの１つまたは複数のレベルの変化を示す、請求項６２に記
    載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓは毒性遺伝子
    を含む導入遺伝子を発現する、請求項６２に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキチ
    ン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー遺伝
    子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはｕｎｃ−５３遺伝子産物を
    コードする、請求項６９に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記毒性遺伝子の発現が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭、Ｃ
    ．ｅｌｅｇａｎｓの細胞のサブセット、咽頭ニューロン、または単一の咽頭ニュ
    ーロンの遺伝子発現を指向することができる組織特異的プロモーターによって駆
    動される、請求項６９または請求項７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記毒性遺伝子の発現が、ｍｙｏ−２プロモーター、ｕｎ
    ｃ−１２９プロモーター、ｔｍｙ−１プロモーター、またはｄａｆ−７プロモー
    ターによって駆動される、請求項７１に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記導入遺伝子の発現がｄａｆ−７プロモーターによって
    駆動される、請求項６９または請求項７０のいずれか１項に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記線虫を同一の成長期に合わせる、請求項４４〜請求項
    ７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 前記線虫が卵、Ｌ１期、Ｌ２期、Ｌ３期、Ｌ４期、成虫蠕
    虫、または耐性蠕虫である、請求項７４に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 前記蠕虫が雌雄同体または雄である、請求項７４または請
    求項７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水溶
    性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、請求項４４〜請求項７６のい
    ずれか１項に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低融
    点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項７７に記載の方法
    。
  79. 【請求項７９】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロー
    スである、請求項７８に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．３％である、
    請求項７７〜請求項７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの固
    着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行われ
    る、請求項４４〜請求項７６のいずれか１項に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビ
    ニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項８１に記載の方法
    。
  83. 【請求項８３】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．０１％〜１０
    ％である、請求項８１または請求項８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が０．１％である
    、請求項８３に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 潜在的な殺虫活性を有する化学物質の同定に使用される、
    請求項４４に記載の方法。
  86. 【請求項８６】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の同
    定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
    る工程と、 （ｂ）前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫細胞中の鉄、代謝産物、または二次メ
    ッセンジャーレベルの変化を検出する工程とを包含する、方法。
  87. 【請求項８７】 カルシウム、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、またはＩ
    Ｐ３の細胞内レベルの変化の検出を包含する、請求項８６に記載の方法。
  88. 【請求項８８】 前記線虫は、遺伝子コードマーカー分子を発現するトラン
    スジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓであり、前記マーカー分子は鉄、代謝産物、ま
    たは二次メッセンジャーの細胞内レベルの変化に応答してシグナルを発し、工程
    （ｃ）が前記遺伝子コードマーカー分子によって発生するシグナルの変化の検出
    工程を包含する、請求項８７に記載の方法。
  89. 【請求項８９】 前記遺伝子コードマーカー分子がＧＦＰ−カルモジュリン
    またはエクオリンである、請求項８８に記載の方法。
  90. 【請求項９０】 前記遺伝子コードマーカー分子が、トランスジェニックＣ
    ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭、陰門、体壁筋、またはニューロンにおいて発現される
    、請求項８８または請求項８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 【請求項９１】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダーで
    ある、請求項８６〜請求項９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 【請求項９２】 前記マルチウェルプレートリーダーが、蛍光、発光、また
    は分光光度検出を行う、請求項９１に記載の方法。
  93. 【請求項９３】 前記非視覚的検出手段がＦＡＮＳデバイスである、請求項
    ８６〜請求項９０のいずれか１項に記載の方法。
  94. 【請求項９４】 前記ＦＡＮＳデバイスが、蛍光、発光、または分光光度検
    出を行う、請求項９３に記載の方法。
  95. 【請求項９５】 前記線虫を同一の成長期に合わせる、請求項８６〜請求項
    ９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 【請求項９６】 前記線虫が卵、Ｌ１期、Ｌ２期、Ｌ３期、Ｌ４期、成虫蠕
    虫、または耐性蠕虫である、請求項９５に記載の方法。
  97. 【請求項９７】 前記蠕虫が雌雄同体または雄である、請求項９５または請
    求項９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 【請求項９８】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の同
    定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
    る工程と、 （ｂ）前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の運動性の変化を検出する工程とを包
    含する、方法。
  99. 【請求項９９】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前記
    方法は、 （ａ）実質的に同数の異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化線虫のパ
    ネルをマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の運動性の変化を検出する工程とを包
    含する、方法。
  100. 【請求項１００】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する
    生化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 （ａ）線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 （ｂ）１つの変異誘発Ｆ１線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
    配する工程と、 （ｃ）Ｆ１線虫にＦ２子孫を産生させる工程と、 （ｄ）前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 （ｅ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の運動性の変化を検出する工程とを包
    含する、方法。
  101. 【請求項１０１】 遺伝学的技術を使用して工程（ｅ）において運動性の変
    化を示す線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請求項８２に記載
    の方法。
  102. 【請求項１０２】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第１の
    化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
    る工程と、 （ｂ）前記線虫と前記第１の化合物とを接触させる工程と、 （ｃ）前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 （ｄ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の運動性の変化を検出する工程とを包
    含する、方法。
  103. 【請求項１０３】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義
    された効果を抑制する、請求項１０２に記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義
    された効果を向上させる、請求項１０３に記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 前記線虫が微視的線虫である、請求項９８〜請求項１０
    ４のいずれか１項に記載方法。
  106. 【請求項１０６】 前記線虫がＣ．ｅｌｅｇａｎｓまたはＣ．ｂｒｉｇｇｓ
    ａｅである、請求項１０５に記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 前記線虫の運動性の変化の検出工程が、マルチウェルア
    ッセイプレートのウェル中の材料の小領域の自己蛍光レベルの測定を包含する、
    請求項９８〜請求項１０６のいずれか１項に記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダー
    である、請求項９８〜請求項１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 前記マルチウェルプレートリーダーが、発光、蛍光、ま
    たは分光光度検出を行う、請求項９８に記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 前記線虫を同一の成長期に合わせる、請求項９８〜請求
    項１０９のいずれか１項に記載の方法。
  111. 【請求項１１１】 前記線虫が卵、Ｌ１期、Ｌ２期、Ｌ３期、Ｌ４期、成虫
    蠕虫、または耐性蠕虫である、請求項１１０に記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 前記蠕虫が雌雄同体または雄である、請求項１１０また
    は請求項１１１のいずれか１項に記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 前記線虫は、野生株、変異株、トランスジェニック株、
    または、ヒト化株である、請求項９８〜請求項１１２のいずれか１項に記載の方
    法。
  114. 【請求項１１４】 前記線虫がヒト起源の１つまたは複数のタンパク質コー
    ド核酸配列を発現するヒト化株である、請求項１１３に記載の方法。
  115. 【請求項１１５】 前記線虫が、毒性遺伝子を含む導入遺伝子を発現するト
    ランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓである、請求項１１４に記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキ
    チン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー遺
    伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはｕｎｃ−５３遺伝子産物
    をコードする、請求項１１５に記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 前記遺伝子発現が、単一の組織、細胞型のサブセット、
    単一の細胞型、または単一のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞の遺伝子発現を指向するこ
    とができる組織特異的プロモーターによって駆動される、請求項１１５または請
    求項１１６のいずれか１項に記載の方法。
  118. 【請求項１１８】 前記毒性遺伝子の発現がｄａｆ−７プロモーターによっ
    て駆動される、請求項１１７に記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水
    溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、請求項９８〜請求項１１８
    のいずれか１項に記載の方法。
  120. 【請求項１２０】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低
    融点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項１１９に記載の
    方法。
  121. 【請求項１２１】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロ
    ースである、請求項１２０に記載の方法。
  122. 【請求項１２２】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．３％である
    、請求項１１９〜請求項１２１のいずれか１項に記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの
    固着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行わ
    れる、請求項９８〜請求項１１８のいずれか１項に記載の方法。
  124. 【請求項１２４】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ
    ビニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項１２３に記載の
    方法。
  125. 【請求項１２５】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．０１％〜１
    ０％である、請求項１２３または請求項１２４のいずれか１項に記載の方法。
  126. 【請求項１２６】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が０．１％であ
    る、請求項１２５に記載の方法。
  127. 【請求項１２７】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の
    同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
    に分配する工程と、 （ｂ）実質的に同数の雄線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配
    する工程と、 （ｃ）前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 （ｄ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
    する工程とを包含する、方法。
  128. 【請求項１２８】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前
    記方法は、 （ａ）実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
    に分配する工程と、 （ｂ）実質的に同数の雄線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配
    する工程であって、前記雄線虫は、異なる変異、トランスジェニック、またはヒ
    ト化線虫のパネルを形成し、 （ｃ）前記線虫と化学物質とを接触させる工程と、 （ｄ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
    する工程とを包含する、方法。
  129. 【請求項１２９】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第１の
    化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
    に分配する工程と、 （ｂ）実質的に同数の雄線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配
    する工程と、 （ｃ）前記線虫と第１の化学物質とを接触させる工程と、 （ｄ）前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 （ｅ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
    する工程とを包含する、方法。
  130. 【請求項１３０】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義
    された効果を抑制する、請求項１２９に記載の方法。
  131. 【請求項１３１】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義
    された効果を向上させる、請求項１２９に記載の方法。
  132. 【請求項１３２】 前記線虫が微視的線虫である、請求項１２７〜請求項１
    ３１のいずれか１項に記載方法。
  133. 【請求項１３３】 前記線虫がＣ．ｅｌｅｇａｎｓまたはＣ．ｂｒｉｇｇｓ
    ａｅである、請求項１３２に記載の方法。
  134. 【請求項１３４】 前記雌雄同体線虫および／または雄線虫が変異、トラン
    スジェニック、またはヒト化Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓである、請求項１３３に記載の
    方法。
  135. 【請求項１３５】 前記トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓが毒性遺伝
    子を含む導入遺伝子を発現する、請求項１３４に記載の方法。
  136. 【請求項１３６】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキ
    チン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー遺
    伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはｕｎｃ−５３遺伝子産物
    をコードする、請求項１３５に記載の方法。
  137. 【請求項１３７】 前記毒性遺伝子の発現がｈｅｒ−１ Ｐ２プロモーター
    、ｍａｂ−１８プロモーター、またはｓｐｅ−Ｔ１プロモーターによって駆動さ
    れる、請求項１３５または請求項１３６のいずれか１項に記載の方法。
  138. 【請求項１３８】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の
    同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
    に分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
    する工程とを包含する、方法。
  139. 【請求項１３９】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前
    記方法は、 （ａ）実質的に同数の異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化雌雄同体
    線虫のパネルをマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
    する工程とを包含する、方法。
  140. 【請求項１４０】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する
    生化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 （ａ）線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 （ｂ）１つの変異誘発Ｆ１線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
    配する工程と、 （ｃ）Ｆ１線虫にＦ２子孫を産生させる工程と、 （ｄ）前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 （ｅ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
    する工程とを包含する、方法。
  141. 【請求項１４１】 遺伝学的技術を使用して工程（ｅ）において卵または子
    孫の産生量の変化を示す線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請
    求項１４０に記載の方法。
  142. 【請求項１４２】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第１の
    化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
    に分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と前記第１の化合物とを接触させる工程と、 （ｃ）前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 （ｄ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の卵または子孫の産生量の変化を検出
    する工程とを包含する、方法。
  143. 【請求項１４３】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義
    された効果を抑制する、請求項１４２に記載の方法。
  144. 【請求項１４４】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義
    された効果を向上させる、請求項１４２に記載の方法。
  145. 【請求項１４５】 前記雌雄同体線虫が、変異、トランスジェニック、また
    はヒト化Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓである、請求項１３８に記載の方法。
  146. 【請求項１４６】 前記トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓが毒性遺伝
    子を含む導入遺伝子を発現する、請求項１４５に記載の方法。
  147. 【請求項１４７】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキ
    チン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー遺
    伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはｕｎｃ−５３遺伝子産物
    をコードする、請求項１４６に記載の方法。
  148. 【請求項１４８】 前記毒性遺伝子の発現がｌｉｎ−３１プロモーター、ｅ
    ｇｌ−１７プロモーター、ｕｎｃ−１７プロモーター、またはｕｎｃ−５３プロ
    モーターによって駆動される、請求項１４６または請求項１４７のいずれか１項
    に記載の方法。
  149. 【請求項１４９】 前記トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓがマーカー
    分子を発現する、請求項１３４または請求項１４５のいずれか１項に記載の方法
    。
  150. 【請求項１５０】 前記マーカー分子が、自己蛍光タンパク質である、請求
    項１４９に記載の方法。
  151. 【請求項１５１】 前記卵または子孫の産生量の検出工程が、卵、Ｌ１期、
    Ｌ２期、Ｌ３期、またはＬ４期の線虫に結合する特異的抗体を添加する工程およ
    び前記抗体と卵、Ｌ１期、Ｌ２期、Ｌ３期、またはＬ４期の線虫との結合によっ
    て形成された複合体を非視覚的検出手段を使用して検出する工程とを包含する、
    請求項１２７〜請求項１５０のいずれか１項に記載の方法。
  152. 【請求項１５２】 前記非視覚的検出手段がマルチウェルプレートリーダー
    である、請求項１２７〜請求項１５１のいずれか１項に記載の方法。
  153. 【請求項１５３】 前記卵または子孫の量の検出工程が、ＦＡＮＳデバイス
    を使用して卵または子孫数を直接計数する工程を包含する、請求項１２７〜請求
    項１５３のいずれか１項に記載の方法。
  154. 【請求項１５４】 前記卵または子孫の産生量の検出工程が、孵化の際に卵
    から放出される酵素の活性を検出する工程を包含する、請求項１２７に記載の方
    法。
  155. 【請求項１５５】 孵化の際に卵から放出されるキチナーゼの活性を検出す
    る工程を包含する、請求項１５４に記載の方法。
  156. 【請求項１５６】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水
    溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、請求項１２７〜請求項１５
    ５のいずれか１項に記載の方法。
  157. 【請求項１５７】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低
    融点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項１５６に記載の
    方法。
  158. 【請求項１５８】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロ
    ースである、請求項１５７に記載の方法。
  159. 【請求項１５９】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．３％である
    、請求項１５６〜請求項１５８のいずれか１項に記載の方法。
  160. 【請求項１６０】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの
    固着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行わ
    れる、請求項１２７〜請求項１５５のいずれか１項に記載の方法。
  161. 【請求項１６１】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ
    ビニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項１６０に記載の
    方法。
  162. 【請求項１６２】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．０１％〜１
    ０％である、請求項１６０または請求項１６１のいずれか１項に記載の方法。
  163. 【請求項１６３】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が０．１％であ
    る、請求項１６２に記載の方法。
  164. 【請求項１６４】 線虫を用いた潜在的な薬理学的活性を有する化学物質の
    同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の雌雄同体線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェル
    に分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と化学物質のサンプルとを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の排泄挙動の変化を検出する工程とを
    包含する、方法。
  165. 【請求項１６５】 線虫を用いた化学物質の作用様式の決定法であって、前
    記方法は、 （ａ）実質的に同数の異なる変異、トランスジェニック、またはヒト化線虫のパ
    ネルをマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配する工程と、 （ｂ）前記線虫と前記化学物質とを接触させる工程と、 （ｃ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の排泄挙動の変化を検出する工程とを
    包含する、方法。
  166. 【請求項１６６】 線虫に対して定義された効果を有する化合物が作用する
    生化学的経路の成分をさらに同定する方法であって、前記方法は、 （ａ）線虫集団をランダム変異誘発に供する工程と、 （ｂ）１つの変異誘発Ｆ１線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分
    配する工程と、 （ｃ）Ｆ１線虫にＦ２子孫を産生させる工程と、 （ｄ）前記線虫と前記化合物とを接触させる工程と、 （ｅ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の排泄挙動の変化を検出する工程とを
    包含する、方法。
  167. 【請求項１６７】 遺伝学的技術を使用して工程（ｅ）において排泄速度の
    変化を示す線虫で変異した遺伝子の単離工程をさらに包含する、請求項１６６に
    記載の方法。
  168. 【請求項１６８】 化合物が線虫に対する定義された効果を有する、第１の
    化合物の効果を調整する化学物質の同定法であって、前記方法は、 （ａ）実質的に同数の線虫をマルチウェルアッセイプレートの各ウェルに分配す
    る工程と、 （ｂ）前記線虫と前記第１の化合物とを接触させる工程と、 （ｃ）前記線虫とさらなる化学物質とを接触させる工程と、 （ｄ）非視覚的検出手段を用いて前記線虫の排泄挙動の変化を検出する工程とを
    包含する、方法。
  169. 【請求項１６９】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義
    された効果を抑制する、請求項１６８に記載の方法。
  170. 【請求項１７０】 前記第２の化学物質が線虫に対する第１の化合物の定義
    された効果を向上させる、請求項１６８に記載の方法。
  171. 【請求項１７１】 前記線虫が微視的線虫である、請求項１７０に記載方法
    。
  172. 【請求項１７２】 前記線虫がＣ．ｅｌｅｇａｎｓまたはＣ．ｂｒｉｇｇｓ
    ａｅである、請求項１７１に記載の方法。
  173. 【請求項１７３】 前記線虫が、変異、トランスジェニック、またはヒト化
    Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓである、請求項１７２に記載の方法。
  174. 【請求項１７４】 前記変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが異常な排泄挙動を示す、
    請求項１７３に記載の方法。
  175. 【請求項１７５】 前記変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが便秘している、請求項１
    ７４に記載の方法。
  176. 【請求項１７６】 前記トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓが毒性遺伝
    子を含む導入遺伝子を発現する、請求項１７４に記載の方法。
  177. 【請求項１７７】 前記毒性遺伝子が、アタキシン、αシクレイン、ユビキ
    チン、τ遺伝子産物、ハンチントン遺伝子産物、ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー遺
    伝子産物、年齢関連性黄斑ジストロフィー産物、またはｕｎｃ−５３遺伝子産物
    をコードする、請求項１７６に記載の方法。
  178. 【請求項１７８】 前記毒性遺伝子の発現が、ｕｎｃ−４３プロモーターま
    たはｕｎｃ−２５プロモーターによって駆動される、請求項１７６または請求項
    １７７のいずれか１項に記載の方法。
  179. 【請求項１７９】 前記方法が培地の粘度を増大させるのに十分な濃度の水
    溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地中で行われる、請求項１６４〜請求項１７
    ８のいずれか１項に記載の方法。
  180. 【請求項１８０】 前記水溶性ポリマーがカルボキシメチルセルロース、低
    融点アガロース、またはポリエチレングリコールである、請求項１７９に記載の
    方法。
  181. 【請求項１８１】 前記水溶性ポリマーが培地粘性カルボキシメチルセルロ
    ースである、請求項１８０に記載の方法。
  182. 【請求項１８２】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．３％である
    、請求項１７９〜請求項１８１のいずれか１項に記載の方法。
  183. 【請求項１８３】 前記方法が、線虫のマルチウェルプレートのウェルへの
    固着を回避するのに十分な濃度の水溶性ポリマーを含む液体アッセイ培地で行わ
    れる、請求項１６４〜請求項１７８のいずれか１項に記載の方法。
  184. 【請求項１８４】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ
    ビニルアルコール、またはポリビニルピロリドンである、請求項１８３に記載の
    方法。
  185. 【請求項１８５】 前記液体培地中の水溶性ポリマー濃度が０．０１％〜１
    ０％である、請求項１８３または請求項１８４のいずれか１項に記載の方法。
  186. 【請求項１８６】 前記液体培地中の水溶性ポリマーの濃度が０．１％であ
    る、請求項１８５に記載の方法。
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