CN112379064B - 一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物病虫害防治领域，尤其涉及一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法。松树是我国最主要的造林树种，但近三十多年来松材线虫病一直是头号森林病虫害，危害十分严重，防治药物却有限，因此迫切需要补充筛选更多防治药剂，以备更为有效地防控。本发明旨在为筛选更多松材线虫防治药剂提供技术支持。上述的高通量筛选松材线虫抑制剂的方法，步骤如下：1）松材线虫收集，即从疫木中分离松材线虫，再加以扩大培养；2）松材线虫筛选，即将培养出来的线虫按成虫和幼虫进行区分并计数；3）测试板制作，即在微孔板中设置对照和测试区域并配置一定浓度的试剂；4）数据记录及处理，即记录线虫随着时间的死活变化，统计药效，进行筛选。

Description

一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法。
背景技术
松材线虫病是由松材线虫危害引起松树萎蔫死亡的一种国际重大检疫性病害。自1982年我国首次在南京市紫金山黑松上发现松材线虫病以来，该病先后在18个省的300多个市县发生。近三十多年来松材线虫病一直是我国头号森林病虫害。松树是我国最主要的造林树种，全国松林面积有5亿多亩，主要栽植树种马尾松、黑松、赤松、琉球松、华山松、云南松、思茅松、黄山松、华山松、红松等都是易感病树种。在控制松材线虫病方面，生产上用的比较多的是用生物杀线剂阿维菌素、甲维盐等进行注杆。树干注射主要在重要区域或古树名木上应用，注药一次能防2-3年。但是这种树干注射剂仍然成本较高，通常只能应用在古树名木上。随着这些生物杀线剂的使用，松材线虫对这些制剂的抗药性也在局部地区逐渐地产生，生产上迫切需要补充筛选更多防治药剂，以备更为有效地防控。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法，为筛选更多松材线虫防治药剂提供技术支持；
为了达到上述目的，本发明采用如下方案：
本发明所述的一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法，包括如下步骤：
1.松材线虫收集，即从疫木中分离松材线虫，再加以扩大培养，具体包括如下步骤：
（1）准备好PDA平板，接种灰葡萄孢菌，25℃培养长满整个平板，倒放于4℃备用；
（2）将松木用纱布包裹，放于密封的塑料袋中，加无菌水，于20-25℃水浴浸泡过夜，浸泡液用2-4层纱布过滤，滤液经1000g离心1-5min，去上清，留1-5ml虫液；
（3）20-50μL的虫液滴加到长满菌丝的灰葡萄孢菌平板上，25℃生长至虫子面积达平板2/3以上，4℃冰箱放置备用；
2.松材线虫筛选，即将培养出来的线虫按成虫和幼虫进行区分并计数，具体包括如下步骤：
（1）用移液器将无菌水加入长有线虫的平板来清洗该平板，然后收集清洗出来的虫液到无菌烧杯；
（2）收集的虫液通过10-20μm的尼龙滤膜过滤，滤液为幼虫液，滤膜上留存粘附的为成虫，将滤膜从微孔滤器中取出，在无菌水中漂洗，这样就得到了所需的成虫液，可视实验需要进行幼虫或成虫抑制剂的筛选；
（3）将上述得到的虫液1000g低速离心1-5min，去掉部分上清，用千分之一的琼脂糖溶液调节溶液至千分之0.5琼脂糖浓度，使线虫分散均匀，借助40倍显微镜观察，调节每mL线虫数目至2000-4000条；
（4）取96孔板，按每孔25μL加虫液，再分别加无菌水25μL，调整总体为50μL容量的同时也降低了琼脂糖浓度，便于显微镜观察；
3.测试板制作，即在96孔板中设置对照和测试区域并配置一定浓度的试剂，包括如下步骤：
（1）板上设置阳性对照区、目标测试区和阴性对照区，每个处理有四个孔重复，每个孔加样采用A+B模式，即A样品25μL加B样品25μL,这样便于研究两种物质的互作关系，而虫液体积为50μL，则每个孔总体积是100μL；
（2）阳性对照组为已知对松材线虫效果较好的农药甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（简称甲维盐），阳性对照组的每孔加入浓度为20mg/L的甲维盐25μL，再加入25μL水，最后与50μL虫液混合，使得甲维盐的终浓度为5mg/L。可以设置多个阳性对照组，比如设置不同的甲维盐浓度，形成浓度梯度，这样有助于推断目标测试药剂的效果；
（3）阴性对照为水，其它目标测试区按所需浓度添加。用排枪将配置好的各浓度测试液一次性加入到分装有50μL虫液的板中，轻轻震荡几下混匀，静置25℃培养；
4.数据记录及处理，即记录线虫随着时间的死活变化，统计药效，具体包括如下步骤：
（1）用倒置显微镜在40倍放大下依次拍摄96孔板中的各孔，每隔2h拍摄一次所有孔的照片，追踪24h以上线虫的死活变化；
（2）在人工识别的基础上利用绘图软件标记线虫的状态，将线虫分为s形，g形，c形和J形。根据线虫死活的观察，s形、g形相加是活的线虫数，c形和J形为死的线虫数；
（3）将标识的状态进行统计汇总，绘制每组线虫处理与时间的关系图，根据图形确定药物的抑制线虫效果。
附图说明
图1为松材线虫在农药甲维盐的不同浓度测试板下培养后的显微照片；
图中，将s形线虫标记为圆圈，将g形线虫标记为方框，将c形线虫标记为十字星，将J形标记为*字；
图2为甲维盐阳性对照各孔的线虫死亡率数据；
图3为测试样品1中各孔的线虫死亡率数据；
图4为测试样品6中各孔的线虫死亡率数据；
图5为阴性对照各孔的线虫死亡率数据。
具体实施方式
实例1. 线虫分离和培养
（1）准备PDA培养基：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，用4层纱布滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克、琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌（即121度）15分钟。在9cm无菌培养皿上准备PDA平板，用0.5cm打孔器接种灰葡萄孢菌，25℃培养长满整个平板，倒放于4℃备用；
（2）将大块松木切成0.5*3cm左右的小片，用纱布包裹，放于密封的塑料中，加无菌水，于20-25℃水浴浸泡过夜，浸泡液用2-4层纱布过滤，滤液经1000g离心1-5min，去上清，留1-5ml虫液；
（3）20-50μL的虫液滴加到长满菌丝的灰葡萄孢菌平板上，25℃生长至虫子面积达培养皿2/3以上，4度冰箱放置备用。
实例2. 线虫筛选
（1）用1mL移液器吸取1mL无菌水加入长有线虫的9cm平板上，如此多次，清洗线虫平板，然后收集清洗出来的虫液到无菌烧杯里；
（2）收集的虫液混匀后，经过10-20μm的尼龙滤膜过滤，滤液经10*40倍显微镜检测确认为幼虫液，滤膜上留存粘附的为成虫，将滤膜从微孔滤器中取出，在无菌水中漂洗，这样就得到了所需的成虫液，这里采用成虫液进行药剂测试；
（3）将上述得到的虫液1000g低速离心5min，去掉部分上清，用千分之一的琼脂糖溶液调节溶液至千分之0.5琼脂糖浓度，使线虫分散均匀，借助40倍显微镜观察，调节每mL线虫数目至2000-4000条；
（4）取96孔板，按每孔25μL加虫液，再分别加无菌水25μL，调整总体体积为50μL的同时也降低了琼脂糖浓度，便于显微镜观察。
实例3. 几种生物农药测试板的配制和数据处理
（1）按如下表1的配方，在96孔板中进行试剂的配制：
表1. 测试板试剂配方
组名 1、2、3、4 5、6、7、8 9、10、11、12
A I 25μL+25μL水 J 25μL+25μL水 K 25μL +25μL水
B L 25μL +25μL水 M 25μL +25μL水 N 25μL +25μL水
C L 25μL +25μL水 M 25μL +25μL水 N 25μL +25μL水
D L 25μL +25μL水 M 25μL +25μL水 N 25μL +25μL水
E L 25μL +25μL水 M 25μL +25μL水 N 25μL +25μL水
F L 25μL +25μL水 M 25μL +25μL水 N 25μL +25μL水
G L 25μL +25μL水 M 25μL +25μL水 N 25μL +25μL水
H 50μL水
表1中：
A.阳性对照； B.测试样品1； C.测试样品2； D.测试样品3；
E.测试样品4； F.测试样品5； G.测试样品6； H.阴性对照；
I.浓度为(20mg/L)的甲维盐溶液； J.浓度为(10mg/L)的甲维盐溶液；
K.浓度为(5mg/L)的甲维盐溶液； L.浓度为(20mg/L)的待测样品；
M.浓度为(10mg/L)的待测样品； N.浓度为(5mg/L)的待测样品；
（2）配制好后，将试剂用12道移液器加入到已准备好的50μL虫液中，25度室温放置，每隔2h，用倒置显微镜olympus IX71 在40倍下逐个孔拍照，8h后改为24h最后拍照一次；
（3）拍好的照片，如图1所示进行死虫、活虫的标记；
（4）按照死活标记，计算机统计数据，并上传至电子表格，数据统计格式以阳性对照为例(表2）；
（5）最后绘制统计图，如图2、3、4、5所示；从图中可以看出，在图5阴性对照几乎没有致死的情况下，阳性对照甲维盐的浓度越高，其致死效果越好，表现为A(1-4)是最好的，24h后达到100%的致死率。测试样品1的药效与甲维盐类似。相比之下，测试样品6则几乎没有药效，其与阴性对照水的致死效果相近。其它组的分析方法类似；
表2.甲维盐阳性对照组A(1-4)的24h死活统计
组名 时间 S形 g形 C形 J形 总数 c+J/总数 g形/总数 s形/总数
A(1-4) 2 53 20 0 0 73 0.0% 27.4% 72.6%
A(1-4) 2 26 15 0 0 41 0.0% 36.6% 63.4%
A(1-4) 2 29 10 10 0 49 20.4% 20.4% 59.2%
A(1-4) 2 39 15 0 1 55 1.8% 27.3% 70.9%
A(1-4) 4 30 0 8 0 38 21.1% 0.0% 78.9%
A(1-4) 4 17 0 9 0 26 34.6% 0.0% 65.4%
A(1-4) 4 24 0 13 0 37 35.1% 0.0% 64.9%
A(1-4) 4 34 0 5 0 39 12.8% 0.0% 87.2%
A(1-4) 6 20 0 12 9 41 51.2% 0.0% 48.8%
A(1-4) 6 11 0 9 2 22 50.0% 0.0% 50.0%
A(1-4) 6 18 1 18 0 37 48.6% 2.7% 48.6%
A(1-4) 6 29 2 1 11 43 27.9% 4.7% 67.4%
A(1-4) 8 11 3 26 0 40 65.0% 7.5% 27.5%
A(1-4) 8 8 0 22 0 30 73.3% 0.0% 26.7%
A(1-4) 8 13 0 20 0 33 60.6% 0.0% 39.4%
A(1-4) 8 21 1 21 0 43 48.8% 2.3% 48.8%
A(1-4) 24 0 0 19 15 34 100.0% 0.0% 0.0%
A(1-4) 24 0 0 21 10 31 100.0% 0.0% 0.0%
A(1-4) 24 1 0 25 9 35 97.1% 0.0% 2.9%
A(1-4) 24 0 0 26 15 41 100.0% 0.0% 0.0%

Claims (2)

1.一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法，其特征在于本方法由以下步骤组成：
（1）线虫收集：准备好PDA平板，接种灰葡萄孢菌，25℃培养长满整个平板，倒放于4℃备用；将松木用纱布包裹，放于密封的塑料袋中，加无菌水，于20-25℃水浴浸泡过夜，浸泡液用2-4层纱布过滤，滤液经1000g离心1-5min，去上清，留1-5ml虫液；20-50μL的虫液滴加到长满菌丝的灰葡萄孢菌平板上，25℃生长至虫子面积达平板2/3面积以上，4度冰箱放置备用；
（2）线虫筛选：用移液器将无菌水加入到步骤（1）中长有线虫的平板，清洗该平板，收集清洗出来的虫液到无菌烧杯；收集的虫液过10-20μm的尼龙滤膜，滤液为幼虫液，滤膜上留存粘附的为成虫，将滤膜从微孔滤器中取出，在无菌水中漂洗，得到了所需的成虫液，视实验需要进行幼虫或成虫抑制剂的筛选；将所述的得到的虫液1000g低速离心1-5min，去掉部分上清液，用千分之一的琼脂糖溶液调节虫液至千分之0.5琼脂糖浓度，使线虫分散均匀，40倍显微镜观察，调节每mL线虫数目至2000-4000条；取96孔板，按每孔25μL加虫液，再每孔分别加无菌水25μL，调整总体为50μL的同时也降低了琼脂糖浓度，便于显微镜观察；
（3）测试板制作：取96孔板，板上设置阳性对照区、目标测试区和阴性对照区，每个处理有四个孔重复，每个孔加样采用A+B模式，即A样品25μL加B样品25μL，这样便于研究两种物质的互作关系，加虫液体积为50μL，每个孔总体积是100μL；阳性对照组为甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐简称甲维盐，阳性对照组的每孔加入浓度为20mg/L的甲维盐25μL，再加入25μL水，最后与50μL虫液混合，使得甲维盐的终浓度为5mg/L；阴性对照为水，其它目标测试区按所需浓度添加；用排枪将配置好的各浓度测试液一次性加入到分装有50μL虫液的板中，轻轻震荡混匀，静置25℃培养；
（4）数据记录及处理：用倒置显微镜在40倍放大下依次拍摄96孔板中的各孔，每隔2h拍摄一次所有孔的照片，追踪24h以上线虫的死活变化；在人工识别的基础上利用绘图软件标记线虫的状态，将线虫分为s形、g形、c形和J形；根据线虫死活的观察，s形、g形相加是活的线虫数，c形和J形相加为死的线虫数；将标识的状态进行统计汇总，绘制每组线虫处理与时间的关系图，根据图形确定药物的抑制线虫效果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于测试板制作步骤中还包括设置多个由不同浓度梯度甲维盐构成的阳性对照组。
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