CN114982769A

CN114982769A - 含有甲维盐和球孢白僵菌作为有效成分联用的杀虫药及在防治普通大蓟马防治中的应用

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Publication number: CN114982769A
Application number: CN202210626680.2A
Authority: CN
Inventors: 吴建辉; 张友丹; 肖卡特·阿里; 邱宝利; 王兴民
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-06-04
Filing date: 2022-06-04
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-06-04
Also published as: CN114982769B

Abstract

本发明属于植物保护领域，具体涉及球孢白僵菌和甲维盐对普通大蓟马的协同防治。其中球孢白僵菌SB063和甲维盐对普通大蓟马的毒杀作用产生了显著的协同增效作用。经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，该球孢白僵菌与甲维盐的联合使用对普通大蓟马有很好的防治效果，在其生物防治中具有非常强的应用潜力，可减少化学农药使用量，兼具低毒、抗药性低的特点，对环境无污染、无残留，有利于延缓蓟马类害虫抗药性的发生和发展。

Description

含有甲维盐和球孢白僵菌作为有效成分联用的杀虫药及在防治普通大蓟马防治中的应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域。具体涉及普通大蓟马防治的生物防治，更具体地，涉及一种球孢白僵菌和甲维盐对普通大蓟马的协同防治。

背景技术

根据公共信息（粮农组织，2015年），从2000年到2015年，中国农药的使用总量增加了39.35％。目前，中国已成为世界上最大的农药生产国和消费国之一。分别是世界平均水平的1.5和4.0倍，现代农业中农药的广泛使用导致世界范围内河流和溪流的农业面源污染，威胁到饮用水资源和水生生态系统 (Jargentz, S., Mugni, H., Bonetto, C.,Schulz, R., 2005. Assessment of insecticidecontamination in runoff and streamwater of small agricultural streams in themain soybean area of Argentina.Chemosphere 61, 817-826. )杀虫剂对鱼类，藻类和水生无脊椎动物的毒性也已有报道（Li, H., Cheng, F., Wei, Y., Lydy, M.J., You, J., 2017. Global occurrence ofpyrethroidinsecticides in sediment and the associated toxicological effectson benthicinvertebrates: an overview. J. Hazard Mater. 324B, 258-271）。随着化学农药长期大量的使用，带来的“3R”问题即害虫抗药性 (Resistance ) 、农药残留(Residue)和害虫再猖厥 (Resurgence ) 以及环境污染问题越来越严重。因此，要改变使用化学农药为主的传统防治方式，贯彻“预防为主，综合防治”的植保方针，坚持农业防治为主、生物防治为基础，并结合其他防治措施对害虫进行综合治理的可持续建康发展具有极其重要的意义（杨运华, 杜开书, 石明旺. 虫生真菌的生物防治研究进展[J]. 河南科技学院学报, 2011, 39(1):34-37）。随着现代绿色食品生产的迅速发展，传统的病虫害防治模式需要改变，急需寻求可持续的绿色治理途径（Chen X, Li L, Hu Q, et al..Expression of dsRNA in recombinant Isariafumosorosea strain the TLR7 gene inBemisiatabaci[J]. Bmc Biotechnology, 2015, 15(64).）。甲维盐是基于阿维菌素B1 发酵合成的新型高效半合成抗生素杀虫剂，在应用于蔬菜、果树、棉花等作物的虫害防治方面，都起到了良好的效果。甲维盐不同复配方式所具有的高效、低毒、低残留、无公害等特征，在应用范围上也不断扩展，极大地助推了绿色农业发展。（刘丽虹,鲁森.甲维盐复配剂在草地贪夜蛾防治中的应用研究[J].南方农机,2022,53(09):74-76+89.）

普通大蓟马Megalurothripsusitatus（Bagrall）又称豆大蓟马、豆花蓟马，是缨翅目Thysanoptera蓟马亚族Thripina（Stephens）Priesner大蓟马属Megalurothrips昆虫(韩运发. 中国经济昆虫志第五十五册：缨翅目[M]. 北京：科学出版社, 1997:39-59.)。普通大蓟马属于杂食性昆虫，寄主植物包括28种，分属于9科，其中16种为豆科作物（Aliakbarpour H , Rawi C S M . The species composition of thrips (insecta:thysanoptera) inhabiting mango orchards in pulau pinang, malaysia.[J].Tropical Life Sciences Research, 2012, 23(1):45.）。普通大蓟马主要发生于10月至次年5月，隐蔽性强，仅在成花开放时刻观察到，其余大多数时间躲藏与花中取食，单花虫量高达35头，为害数量大，防治难度大（唐良德, 韩云, 吴建辉, 等. 豆大蓟马室内对不同颜色及光波的趋性反应[J]. 植物保护, 2015(6):169-172.）。该蓟马隐蔽性强繁殖速度快的特点给防治带来了极大的难度，植株受害部位起初呈现白色，之后逐渐枯萎变成褐色，心叶被害时皱缩卷曲变形直至植株死亡，对幼苗期为害较轻，主要为害豇豆花和果，造成黑头，黑尾严重影响商品的外观品质和营养价值。目前，蓟马的防治还主要依赖化学防治手段。由于大量化学药剂的不合理使用，从而引发害虫抗药性、杀伤天敌、农药残留、环境污染等诸多问题，产品质量安全也受到威胁。所以，寻求环境友好型防治策略极为迫切的今天，生物防治在蓟马类害虫的防治工作中具有广阔的应用前景。

球孢白僵菌隶属半知菌亚门(Deuteromycotina)，丛梗孢目(Moniliales)，丛孢梗科(moniliaceae)，白僵菌属(Beaveriaspp)，是重要的生防菌种。球孢白僵菌在墨西哥黑蝗(Melanopiusmexicanus)上首次发现，70年代初期，首次作为生防菌应用于西方五月鳃金龟中，并取得成功，引起广泛关注。例如，袁盛勇等（2011和2013）从银纹夜蛾幼虫上分离获得对西花蓟马高毒力的球孢白僵菌MZ050724菌株，以及对榕母管蓟马高毒力的球孢白僵菌Bb080717菌株和MZ050724菌株（西南大学学报、环境昆虫学报、中国森林病虫）；王海鸿等从玉米螟上分离获得两株对西花蓟马具良好防治效果的球孢白僵菌（CN104212724 A 和CN104263655 A）；涂雄兵等（2016）发现了一株对苜蓿蓟马具良好防治效果的球孢白僵菌（CN106135295 A），等等。其中可见，研究最多的是球孢白僵菌对蓟马的生防作用。

昆虫病原真菌不但具备显著的流行潜力、对人畜和环境安全、害虫不易产生抗性而且有着生产的便利性，应用其防治普通大蓟马有巨大潜力。球孢白僵菌是一种比较常见的寄生型真菌，球孢白僵菌在寄生的时候，寄主的涉及范围比较广，同时球孢白僵菌的致病性和适应性都非常强烈。球孢白僵菌在实际应用过程中，其主要是通过昆虫的体壁逐渐侵入到球孢白僵菌的寄主身上，同时也可以通过消化道等各种不同的途径，逐渐进入到虫体当中。根据相关研究结果可以得出，其实这种球孢白僵菌对人体或者是对一些动植物而言，并没有太大的伤害。同时，球孢白僵菌对环境也不会造成污染影响，但是对害虫的致病力却非常高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有普通大蓟马防治技术的缺陷和不足，提供一种高效、无污染、无残留的具有协同增效作用的球孢白僵菌和甲维盐联用的杀虫药。本发明通过对球孢白僵菌和甲维盐复配效果进行研究发现，所述杀虫药复配后能够表现出显著的协同增效作用，提高防治效果，并可明显减低化学农药单剂的使用剂量、减少环境污染，有效解决现有农药易产生抗性、药效不明显等问题。

本发明基于多株球孢白僵菌对普通大蓟马具有一定生物防治效果的基础上，为了进一步寻求更好的防治效果，经过大量探究和探索实验发现，球孢白僵菌菌株SB063和甲维盐联用能够产生显著的协同增效作用，对蓟马类害虫具有显著的防治效果，最终完成本发明。

因此，本发明首先提供一种球孢白僵菌和甲维盐联用的杀虫药，所述球孢白僵菌是球孢白僵菌菌株SB063，其保藏编号为GDMCC NO：61304；所述杀虫药用于防治普通大蓟马。该菌株SB063，最初在土壤中分离而来，为中国本土菌株，能很好地适应本地的自然环境。

优选地，上述杀虫药中，所述球孢白僵菌为球孢白僵菌孢子，可以是悬浮液，也可以是孢子粉。

更优选地，所述球孢白僵菌和甲维盐的用量比按照如下标准进行：球孢白僵菌的终浓度为1×10⁴~1×10⁷分生孢子/mL，优选为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL，甲维盐的终浓度为0.3125~5mg/ L，优选为1.25~5 mg/ L；更优选为球孢白僵菌和甲维盐的比例为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL：1.25~5mg/ L，更优选为球孢白僵菌和甲维盐的比例为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL：2.5~5mg/ L，进一步优选为球孢白僵菌和甲维盐的比例为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL：2.5~5 mg/ L。最优选，所述球孢白僵菌和甲维盐的比例为1×10⁷分生孢子/ mL：5mg/ L。

本发明进一步提供上述杀虫药在防治普通大蓟马害虫中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的杀虫剂中的球孢白僵菌SB063和甲维盐对普通大蓟马的毒杀作用产生了显著的协同增效作用，经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，该球孢白僵菌与甲维盐的联合使用对普通大蓟马有很好的防治效果，且甲维盐对球孢白僵菌SB063的生长影响不大，兼容性好，因此在蓟马类害虫的生物防治中具有非常强的应用潜力。由于本发明的杀虫药防治效果好，因而可减少化学农药使用量，兼具低毒、抗药性低的特点，适应了有机食品生产的需求，对环境无污染、无残留，有利于延缓蓟马类害虫抗药性的发生和发展。

其中，本发明的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)SB063，已于2020年11月20日在广东省微生物菌种保藏中心(地址：中国广东广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)进行了保藏，其保藏编号是GDMCC No：61304(并在专利申请202110008662.3中记载)。

附图说明

图1 甲维盐对普通大蓟马的毒力测定结果。

图2 甲维盐对白僵菌SB063菌株菌落生长的影响。

图3 甲维盐对白僵菌SB063菌株孢子萌发率的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1高毒力菌株的筛选

1.1 供试昆虫

普通大蓟马于2017年采自广东省广州市增城区朱村豇豆田，采回后在RXZ-500C型智能人工气候箱（宁波江南仪器厂）内用豇豆豆荚饲养，饲养条件为温度（26±5）℃，光照周期12 L: 12 D，相对湿度（70±5）%。

1.2 供试菌株

列出供筛选的菌株均属于球孢白僵菌(Beauveriabassiana) 菌，均保藏于华南农业大学生物防治教育部工程研究中心，具体如下：SP433、SB036、SB062、SB037、SB015、SB063、SB051、SB041、SB004 、SB043、SP016、SB038、SB050、SB006。

其中，对于SB063和SB038还进行了用于专利程序的生物材料保藏。

1.3 实验方法

1.3.1 孢子悬浮液的配制

在PDA平板上26±1 ℃培养7 d后，充分产孢的虫生真菌分生孢子用0.05%吐温-80无菌水洗脱孢子，用磁力搅拌器搅拌，再置于摇床180rpm25 ℃振荡培养25min后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成1×10⁸孢子/mL的孢子悬浮液。

1.3.2 虫生真菌对普通大蓟马的毒力测定

将配制好的孢子悬浮液置于15ml离心管中，挑取普通大蓟马雌成虫20头浸泡菌液10s，然后放至有1cm豆角（两端无孔）的35mm的培养皿中，保鲜膜封口，扎孔，置于人工气候箱中，以0.05%吐温-80无菌水为空白对照，每个处理重复4次，连续7d记录其死亡率。

将筛选出的高毒力菌株，用0.05%吐温-80无菌水配制为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴孢子/mL的孢子悬浮液，以同样的生测方法测定其死亡率。

1.3.3 数据处理

利用SPSS19.0软件进行试验处理分析，采用单因素方差分析对各结果进行分析，并运用Tukey检验差异显著性。

1.2 实验结果

实验结果显示，不同菌株孢子悬浮液对普通大蓟马的致病力差异显著，菌株SB038和菌株SB063显著高于其他菌株(表1)，普通大蓟马雌成虫的死亡率随着浓度和处理时间的增加而上升，当浓度为1×108孢子/mL时SB038和SB063在第7d的累计死亡率分别为91.07%和83.33%，显著高于其他浓度。

结果表明，菌株SB038和SB063对普通大蓟马均有较好致死效果，属于潜在优良生防。对这两个菌株进行不同浓度、不同处理时间致病力的测试，其结果分别如表2和表3所示。后续针对菌株SB063进行进一步研究。

表 1 不同菌株对普通大蓟马的校正死亡率（%）

注: 经 Tukey 检验, 同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著（P＜0.05）。

表 2 SB063菌株不同浓度对普通大蓟马的校正死亡率（%）

菌株SB063最初于2010年在贺兰山脉中部哈拉乌树下土壤中分离而来，为中国本土菌株，其保藏编号为GDMCC NO：61304。

实施例2 甲维盐对普通大蓟马的毒力测定

采用药膜法，配制不同浓度梯度的甲维盐，将5 cm的离心管（扎孔）在药液中浸泡2h，1 cm豆角（两端无孔）在药液中浸泡10 s，自然晾干，然后挑取普通大蓟马雌成虫20头至放有豆角的离心管中，每个浓度设4个重复在培养箱中饲养，观察5天，记录其死亡率。

利用SPSS19.0软件进行实验数据处理分析，采用单因素方差分析生物/化学农药对蓟马毒力结果分析，并运用Tukey检验差异显著性。

结果如图1所示，其表明：不同浓度的甲维盐处理普通大蓟马后，其校正死亡率随着浓度的增加而增加，其中甲维盐浓度为5mg/L时，在第5天时其死亡率高达100%，远超其他浓度的死亡率。甲维盐浓度为0.3125mg/L时，在第5天时其死亡率为58.33%，不同浓度甲维盐对普通大蓟马的毒力差异显著。

实施例3甲维盐和白僵菌SB063相容性研究

1 材料与方法

1.1 供试菌株

白僵菌SB063。

1.2 供试药剂

甲维盐。

1.3 供试培养基

沙式培养基（Sabouraud dextrose agar, SDA）：蛋白胨10 g、琼脂20 g、葡萄糖40g，加入蒸馏水定容至1000 mL，121℃，30 min高压蒸汽灭菌。

1.4 不同浓度孢子悬浮液的配制

将白僵菌SB063菌株接种于PDA培养基上，置于生化培养箱内26℃下活化10 d，挑选活性强的分生孢子再次接种于PDA平板并在生化培养箱内扩繁培养7 d，待大量产孢后，用0.05％吐温-80无菌水洗脱孢子，磁力搅拌器搅拌，灭菌后的双层脱脂纱布过滤，在生物显微镜下镜检，血球计数板计数，配制浓度为1 × 10⁸孢子/mL的母液孢子悬浮液，再依次稀释成1 × 10⁷、1 × 10⁶、1 × 10⁵、1 × 10⁴孢子/mL的悬浮液备用。

1.5 甲维盐对白僵菌SB063菌株菌落生长的影响

将配制好的PDA培养基中加入甲维盐，倒完平板后置于超净工作台紫外照射2 h，配制成合适浓度梯度的含药PDA培养基平板。取活化后菌丝生长均匀的高毒力菌株一皿，打孔器打制成5 mm的菌饼并置于含药PDA培养基平板中间进行接种，在生化培养箱内26℃条件下培养，每天用十字交叉法测定菌落直径，共测定7天。每个处理设置10个重复，以添加无菌水的培养基作为空白对照。

1.6 甲维盐对白僵菌SB063菌株孢子萌发率的影响

将配制好的SDA液体培养基中加入甲维盐并置于超净工作台紫外照射2 h，配制成合适浓度梯度的含药SDA液体培养基。将活化后的高毒力菌株配制成1.0 × 10⁶孢子/mL的孢子悬浮液，并加入2 mL于50 mL不同浓度的含药SDA液体培养基中，置于摇床180 rpm 25℃振荡培养3 d，每天于超净工作台内取样，在血球计数板上镜检菌株孢子萌发情况，计算其孢子萌发率。每个处理设置3个重复，以添加无菌水的培养基作为空白对照。

1.7 数据统计与分析

利用SPSS 19.0软件进行试验数据分析，并运用Tukey检验差异显著性。用GraphPad Prism 6和Excel绘制图表。

2 结果与分析

2.1 甲维盐对白僵菌SB063菌株菌落生长的影响

结果显示，不同浓度甲维盐处理白僵菌SB063后，菌株直径随着浓度的增加而减小，且差异显著（图2）。在处理3 d后，高浓度甲维盐处理后菌株菌落直径小于空白对照（16.0 mm），0.3125、0.625、1.25、2.5和5 mg/L浓度的甲维盐处理的白僵菌SB063，菌落直径分别为13.5、12.8、11.6、10、8.6 mm。在处理7 d后，0.3125、0.625、1.25、2.5和5 mg/L浓度的甲维盐处理的白僵菌SB063，菌落直径分别为27、24、21、18、15 mm，低浓度处理与空白对照无显著差异（31 mm）。

2.2 甲维盐对白僵菌SB063菌株孢子萌发率的影响

甲维盐处理白僵菌SB063后对菌株孢子萌发率的较小，与空白对照无显著差异（图3）。处理3天后，0.3125、0.625、1.25、2.5和5 mg/L浓度的甲维盐处理的白僵菌SB063，菌株孢子萌发率分别为94.83%、94.37%、93.78%、85.21%、76.37%，低浓度处理与空白对照无显著差异（94 %），高浓度5 mg/L与空白对照差异显著。

综上所述：甲维盐对菌株的影响较小。在本试验中，处理3 d后，浓度（0.3125、0.625、1.25）甲维盐对白僵菌SB063的孢子萌发与空白对照相比没有显著差异；菌落生长处理7 d后，低浓度（0.3125、0.625 mg/L）甲维盐对白僵菌SB063的菌落生长与空白对照相比无显著差异。因此，甲维盐相容性好，可用于后续试验。

实施例4 球孢白僵菌SB063和甲维盐对普通大蓟马防治的协同作用

3.1材料与方法

3.1.1供试虫源

普通大蓟马同1.1。

3.1.2供试菌株

SB063。

3.1.3甲维盐对普通大蓟马的毒力测定

采用药膜法，配制不同浓度梯度的甲维盐，将5cm的离心管（扎孔）在药液中浸泡2h,1cm豆角（两端无孔）在药液中浸泡10s,自然晾干，然后挑取普通大蓟马雌成虫20头至放有豆角的离心管中，每个浓度设4个重复在培养箱中饲养，观察2天，记录其死亡率。

3.1.4高毒力菌株与甲维盐两者复配剂对普通大蓟马的毒力测定方法

分别配制0.3125、0.625 mg/ L的甲维盐与、1×10⁶、1×10⁷孢子/mL的高毒力菌株孢子悬浮液备用，在把配制的各浓度甲维盐分别与各浓度菌株两两组合，进行毒力测定。毒力测定方法同1.3.2。

3.1.5数据统计与分析

利用SPSS19.0软件进行试验数据处理分析，采用单因素方差分析对普通大蓟马死亡率进行结果分析，并运用Tukey检验差异显著性。数据计算公式参照Huangetal.（2013），具体公式如下：

公式中，各项含义如下：

Ma：甲维盐单独对普通大蓟马的实际校正死亡率；

Mb：高毒力菌株单独对普通大蓟马的实际校正死亡率；

Mab：菌药复配剂对普通大蓟马的实际校正死亡率；

Me：菌药复配剂对普通大蓟马的期望死亡率；

根据公式，分别计算出菌药复配剂的χ2值，在χ2表格中查找df=1对应的P值为3.841。

当计算得的χ2＜3.841，则表示菌株和甲维盐复配表现出拮抗作用；

当计算得的χ2＞3.841，则表示菌株和甲维盐复配表现出协同增效作用。

3.2实验结果

白僵菌SB063与甲维盐协同作用对普通大蓟马的毒力结果：单独使用不同浓度的甲维盐0.3125、0.625mg/L）处理普通大蓟马，第5 d的校正死亡率分别为58.33%、65%；单独使用不同浓度的球孢白僵菌（1×10⁶、1×10⁷孢子/ mL）处理普通大蓟马，第5 d的校正死亡率分别为38.33%、21.67%。而不同浓度甲维盐与不同浓度球孢白僵菌复配对普通大蓟马的致死率显著高于各单剂（表3）。在甲维盐和球孢白僵菌SB063联合作用对普通大蓟马的毒力测定中，各复配浓度都表现出协同增效作用。在处理5d后，各复配浓度增效达100%。

表 3 白僵菌SB063与甲维盐协同作用对普通大蓟马的毒力

注：表中数据为平均值±标准误，经Tukey检验，不同小写字母表示同一时间不同组合浓度间差异显著（P＜0.05），括号内的数值表示计算得到卡方值χ²，*表示具有协同增效作用的组合。

Claims

1.一种含有甲维盐和球孢白僵菌作为有效成分联用的杀虫药，所述球孢白僵菌是球孢白僵菌菌株SB063，其保藏编号为GDMCC NO：61304；所述杀虫药用于防治普通大蓟马。

2.如权利要求1所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌为球孢白僵菌孢子的悬浮液或孢子粉形式。

3.如权利要求2所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌和甲维盐的用量比按照如下标准进行：球孢白僵菌的终浓度为1×10⁴~1×10⁷分生孢子/mL，优选为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/ mL，甲维盐的终浓度为0.3125~5 mg/ L，优选为1.25~5mg/ L。

4.如权利要求3所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌和甲维盐的比例为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL：1.25~5 mg/ L，优选为球孢白僵菌和甲维盐的比例为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL：2.5~5 mg/ L。

5.如权利要求4所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌和甲维盐的比例为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL：1.25~5mg/ L。

6.如权利要求3所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌和甲维盐的比例为1×10⁶分生孢子/ mL：5 mg/ L。

7.如权利要求1至6任一项所述的杀虫药在防治普通大蓟马中的应用。