CN117625409B - 一株用于防治烟草根黑腐病的海洋球毛壳菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株用于防治烟草根黑腐病的海洋球毛壳菌菌株，其保藏号为：CGMCC NO.40804。本发明获得的对烟草根黑腐病有防治效果的MFT2329菌株，可应用于烟草上烟草根黑腐病的防治，采用琼脂扩散法测试粗提物抑菌活性，结果表明海洋真菌MFT2329菌株次级代谢粗提物浓度为10mg/mL时，对烟草根黑腐病菌的抑菌直径达到31.67mm。
Description
技术领域
本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株用于防治烟草根黑腐病的菌株，即一株来自海洋缘管浒苔的海洋球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌株，以及从该菌株中代谢得到的次级小分子化合物代谢产物；本发明的菌株和其代谢产物可应用在烟草根黑腐病防治方面。
背景技术
随着人们对自身健康和生存环境关注程度的日益增强，传统的害虫化学防治措施所带来的弊端已经引起人们的极大重视。化学农药泛滥使用导致环境中农药残留的增加，病虫抗药性的增强和病虫的再度猖獗等问题最为突出。随着世界各国对化学农药所带来的种种社会问题、环境问题、以及人类健康问题的进一步认识，越来越多的化学农药被限制使用或禁止使用。生物农药作为一种低毒、低残留，并且病虫害不易产生抗药性的新型农药，自然就成为现代农药产业关注并试图开发的热点，其研发和产业化也成为国家的战略需求。
微生物农药是生物农药的重要一类，包括农用抗生素和活体微生物农药。微生物农药是从天然产物中分离纯化出来的，可以直接作用于病虫害防治，也可以作为先导化合物合成新的农药。这些农药既可以保留原有生物活性物质的低毒、低残留等优点，同时克服了某些天然产物的稳定性差、活性不高等不足，使得生物活性物质的潜力得到充分挖掘。
真菌是开发微生物农药的重要资源，世界各国投入了大量的科研力量予以研究。目前已经注册的以陆生真菌或其代谢产物为有效成分的生物农药达70余种，这些微生物农药被广泛应用于防治植物病害、虫害和田间杂草。我国在应用和基础研究方面也取得了十分突出的成绩。尽管我国当前生物农药的产量仅占农药总产量的9％，但从人类长远利益角度考虑和农药发展趋势来看，生物农药的发展潜力十分巨大。海洋真菌来源于海洋环境，并不是陆地生物的寄生菌，在直接以微生物活体作为有效杀虫剂或杀菌成分的生物农药开发模式面前，海洋真菌于陆地真菌相比，没有优势可言，但在以微生物代谢为有效成分的农药开发模式下，海洋真菌却具有很大优势。
海洋真菌的生存环境比较苛刻(高盐、高压、缺氧、低营养、无光照等)，为求得生存空间，它们在长期的进化过程中产生了一些结构独特的次级代谢物质，特别是海洋动植物共附生真菌，为争取自身的最大生存，通过分泌具有各种生物活性的代谢物来积极地参与动植物的代谢活动，在动植物的抗感染、抗吞噬的生态防卫中发挥了重要的作用，被认为是筛选抗生素的最佳对象。从海洋真菌中分离得到的新化合物70％-80％具有各种各样的生物活性，也已引起化学家和生物学家的极大关注，种类包括萜类、肽类、生物碱、酮类以及酯类化合物，其中有很多是某些杀虫剂、杀菌剂的有效成分或前体物质。关于海洋真菌次级代谢物的功能与用途，研究者较多的关注于治疗人类疾病的医用药物的开发，海洋真菌代谢物农用杀虫、杀菌功能的研究较少。
烟草根黑腐病是一种由半知菌类真菌引起的烟草真菌土传病害，可侵染侵染茄科、豆科、菊科和葫芦科植物，烟草上最早发现于意大利，目前该病害已经在世界烟草生产区普遍发生，造成巨大的经济损失。烟草根黑腐病在苗期和大田期均能造成为害，主要危害烟株的根部，发病后根部组织呈现黑色坏死从而导致地上部分生长不良甚至死亡，又称之为“烂根、黑根”等。调查发现烟草根黑腐多见于苗床期，田间多为局部或零星发病，极少整田发病，但在适宜的条件下，也会发病严重。
抗病品种的选育在作物病害的防治中占主导地位，但是目前缺乏高效的、适合推广种植的抗病品种。化学防治见效快、成本低，近年来，为控制病害日益提高用量和次数，一定程度上控制住了病害，但也带来很多负面影响，如环境污染、抗性水平上升、生态平衡破坏等。为确保绿色、环保的烟草生产安全，高效生防菌剂的研制作为生物防治的重要手段就显得极为迫切。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于防治烟草根黑腐病的海洋球毛壳菌菌株，即一株来自海洋缘管浒苔的球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌株及其在烟草根黑腐病防治中的应用，同时将筛选的可产生对烟草根黑腐病菌有生物活性次级代谢物的菌株应用到烟草根黑腐病的防治中。
本发明首先提供一株来自海洋缘管浒苔的球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌株MFT2329，该菌株已于2023年8月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCCNO.40804。
本发明筛选的MFT2329菌株用于防治烟草根黑腐病，也可用来制备具有防治烟草根黑腐病功能的制品。
本发明还提供MFT2329菌株的代谢产物，其一种具体的制备方法如下：
将MFT2329菌株的发酵上清液加入乙酸乙酯萃取，所得有机相在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发至干获得MFT2329菌株代谢粗提物。
所述的发酵，是将MFT2329菌株接种于PDB海水培养基中，28℃下发酵。
上述的代谢产物用于防治烟草根黑腐病。
本发明获得的对烟草根黑腐病有防治效果的MFT2329菌株，可应用于烟草上烟草根黑腐病的防治，采用琼脂扩散法测试粗提物抑菌活性，结果表明海洋真菌MFT2329菌株次级代谢粗提物浓度为10mg/mL时，对烟草根黑腐病菌的抑菌直径达到31.67mm。
附图说明
图1：菌株MFT2329在PDA培养基上的菌落形态图，其中左图是培养基的正面图，右图是培养基的反面图；
图2：菌株MFT2329对烟草根黑腐病菌拮抗活性效果图，其中左图为MFT2329，中间图片为空白对照、右图为药剂对照；
图3：菌株MFT2329次级代谢产物TLC图谱；
图4：菌株MFT2329次级代谢产物HPLC谱图。
具体实施方式
本发明从生物防治方面进行探索，筛选对烟草根黑腐病有防治活性的海洋真菌菌株，为利用这些菌株及其次级代谢产物开发生物制剂防治烟草根黑腐病提供研究基础和实验材料。
下面结合具体实施例对本发明的菌株进行详细的描述。
实施例1：海洋真菌MFT2329菌株分离鉴定及培养
将从山东省青岛市石老人海水浴场采集的缘管浒苔置于PDA培养基上(培养基配制方法如下：马铃薯去皮，200g切成小块，加海水1L煮沸30min，4-6层纱布过滤，加20g葡萄糖，溶解，用蒸馏水补充失去的水分。固体培养基则加入1.5-2％的琼脂，121℃，高压灭菌20min。)在28℃下进行培养，单斑分离纯化获得了MFT2329菌株。
经18s rDNA ITS基因序列分析鉴定为球毛壳菌(Chaetomium globosum)。
其18s rDNA ITS基因序列如下：
AAGGATGATCCGCTCTACCTGATCCGAGGTCACCTTGGGTTAAAAGGTGGTTTAACGGCCGGAA
CCCGCGGCGCGACCAGAGCGAGATGTATGCTACTACGCTCGGTGCGACAGCGAGCCCGCCACTGCTTT
TCAGGGCCTGCGGCAGCCGCAGGTCCCCAACACAAGCCCGGGGGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGA
ACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTC
TGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT
TGAAAGTTTTGACTTATTCAGTACAGAAGACTCAGAGAGGCCATAAATTATCAAGAGTTTGGTGACCT
CCGGCGGGCGCCCGCGGTGGGGCCCAGGGGCGCCCGGGGGGTAAACCCCGGGGCCGCCCGCCGAAGCA
ACGGTATAGGTAACGTTCACAATGGTTTAGGGAGTTTTGCAACTCTGTAATGATCCCTCCGCAGGTTC
ACCTACGGAAG(SEQ ID NO:1)。
菌落培养形态及最适的培养条件如下：
菌落在PDA培养基上培养7d，平展，气生菌丝茂密、初期白色，后期黄白色，菌落边缘絮状；背面黄褐色(图1)。MFT2329菌株的最适生长温度28℃，最佳PH值10，最佳培养时间8d，最适培养基为海水PDB培养基。
所筛选的菌株的显微形态如下：
菌丝具横隔状，子囊壳灰褐色，卵形。侧生附属丝丝状，直或稍弯曲，浅橄榄褐色，微粗糙，有隔，向末端渐变细并趋透明。子囊棍棒形，透明，60-65×13-15μm，含8个子囊孢子，不规则排列。子囊孢子柠檬形，暗褐色至橄榄褐色，8-9.5×6-8μm。
实施例2：海洋真菌MFT2329菌株次级代产物对烟草根黑腐病的生物测定
将海洋真菌MFT2329菌株接种于PDB液体培养基，28℃，静置培养40d左右。发酵完毕后，取上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得有机相在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发至干获得MFT2329菌株代谢粗提物。
采用琼脂扩散法测试粗提物抑菌活性。
沿培养皿中心线均匀打3孔(孔径3mm)，将烟草根黑腐病菌饼接入中间孔。然后，取50μL粗提物溶液加入两侧孔中，置于28℃培养箱中培养。设置咪鲜胺为阳性对照，DMSO为阴性对照，设置3个重复。2-10天后检查与测量抑菌直径，根据测量结果统计分析抑菌活性大小。
结果表明，海洋真菌MFT2329菌株次级代谢粗提物浓度为10mg/mL时，抑菌直径达到35.67mm，抑制率为34.20％(图2)。表明本发明筛选的MFT2329菌株对于烟草根黑腐病具有很好的防治效果，具有很好的推广应用价值。
实施例3：海洋真菌MFT2329菌株次级代谢产物对烟蚜的活性
将海洋真菌MFT2329菌株接种于PDB液体培养基，28℃，静置培养40d左右。发酵完毕后，取上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得有机相在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发至干获得MFT2329菌株代谢粗提物。
采用浸虫浸叶法测试其次级代谢粗提物对烟蚜的毒力作用。培养皿(直径9cm)中铺上滤纸，加1mL蒸馏水保持适宜湿度，将大小适中的烟叶浸入溶液中10s后晾干，然后放入培养皿中，烟叶柄部用脱脂棉加水保湿。将带有蚜虫的烟叶浸入稀释的粗提物溶液中10s，挑取30头蚜虫(大小一致、健康的无翅蚜)于培养皿中。
用丙酮将粗提物配置成10000mg/L母液，以清水梯度稀释，分别配制5000mg/L、2500mg/L、1250mg/L、625mg/L和312.5mg/L的溶液，CK(丙酮)。各设3个重复，于24h检查统计各浓度粗提物下的烟蚜死亡情况，用SPSS软件处理数据，计算LC50、回归方程及相关系数。
结果表明海洋真菌MFT2329菌株次级代谢粗提物的活性成分对烟蚜有一定活性，在10mg/mL浓度下，对烟蚜48h校正死亡率为87.18％。通过SPSS软件进行统计分析得到菌株MFT2329发酵液提取物对烟蚜的LC50为7.02mg/mL，毒力回归方程为：y＝-0.0121+5.9238x，R＝0.67。
上述结果表明本发明筛选的MFT2329菌株对于烟蚜具有很好的防治效果，具有很好的推广应用价值。
实施例4：海洋真菌MFT2329菌株次级代谢产物丰富度分析
将海洋真菌MFT2329菌株分别接种于液体PDB培养基，28℃静置发酵培养40d左右。发酵完毕后，取液体PDB培养基上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得有机相分别在旋转蒸发仪上减压浓缩，用甲醇洗脱后室温下蒸发至干获得MFT2329菌株液体发酵和固体发酵次级代谢粗提物。
将获得的MFT2329菌株发酵粗提物用适量甲醇溶解，进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析，根据薄层板上样品点的数量、丰富程度和色谱峰的数量及紫外吸收曲线进行比较分析，分析菌株MFT2329次级代谢产物种类丰富度及含量情况。
TLC展开体系为二氯甲烷：甲醇＝10：1或20：1，显色剂为茴香醛-硫酸，而HPLC的洗脱程序如表1所示。
表1：HPLC标准程序表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | 甲醇 | 水 |
| 0-5 | 0.8 | 10％ | 90％ |
| 5-35 | 0.8 | 10％-100％ | 90％-0 |
| 35-45 | 0.8 | 100％ | 0 |
| 45-50 | 0.8 | 100％-10％ | 0-90％ |
| 50-60 | 0.8 | 10％ | 90％ |
从结果来看，两种培养方式下，菌株MFT2329次级代谢产物种类丰富度较高，有1条明显的色谱主峰，次峰6条(图3、图4)。
Claims (8)
1.一种球毛壳菌，其特征在于，所述的球毛壳菌(Chaetomium globosum)的保藏号为CGMCC NO.40804。
2.权利要求1所述的球毛壳菌在防治烟草根黑腐病中的应用。
3.权利要求1所述的球毛壳菌在防治烟蚜中的应用。
4.权利要求1所述的球毛壳菌在制备防治烟草根黑腐病或烟蚜的制品中的应用。
5.一种用于防治烟草根黑腐病或烟蚜的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的球毛壳菌。
6.如权利要求5所述的制品，其特征在于，所述的制品中还包含有权利要求1所述的球毛壳菌的代谢产物；所述的代谢产物，是将权利要求1所述的球毛壳菌的发酵上清用有机溶剂进行萃取，萃取的有机相进行浓缩获得浓缩产物，将浓缩产物干燥后获得代谢产物；所述的有机溶剂为乙酸乙酯。
7.如权利要求6所述的制品，其特征在于，所述的发酵上清，是将权利要求1所述的球毛壳菌接种于PDB海水培养基中，28℃下发酵获得的发酵上清。
8.如权利要求6所述的制品，其特征在于，所述的浓缩产物还使用甲醇进行洗脱。
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