CN103013837A - 一株用于防治烟蚜的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株用于防治烟蚜的菌株，为来自海洋褐藻的小不整球壳属（Plectosphaerella cucumerina） mfz19菌株，其保藏编号为：CGMCC No.6859。本发明获得的对烟蚜有生物活性的mfz19菌株，可应用于烟草上烟蚜的防治，采用毛细管滴定法对烟蚜的生物测定表明，其发酵液中次生代谢物对烟蚜的致死率最高可达92.9％。采用GC/MS进行化学分析和结构鉴定后，次生代谢物包括有9种主要化合物，其中酯类化合物4种，酸类化合物两种，肼类化合物、脲类化合物、醇类化合物各1种。对烟蚜乙酰胆碱酯酶的抑制作用研究表明，抑制率最高可达76.45%。

Description

一株用于防治烟蚜的菌株

技术领域

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株用于防治烟蚜的菌株，即一株来自海洋褐藻的小不整球壳属（Plectosphaerella cucumerina）菌株，以及从该菌株中得到的次生小分子化合物的混合物；本发明的菌株和其代谢产物可应用在烟蚜防治方面。

背景技术

随着人们对自身健康和生存环境关注程度的日益增强，传统的害虫化学防治措施所带来的弊端，已经引起人们的极大重视。化学农药泛滥使用导致环境中农药残留的增加，病虫抗药性的增强和病虫的再度猖獗等问题最为突出。随着世界各国对化学农药所带来的种种社会问题、环境问题、以及人类健康问题的进一步认识，越来越多的化学农药被限制使用或禁止使用。生物农药作为一种低毒、低残留，并且病虫害不易产生抗药性的新型农药，自然就成为现代农药产业关注并试图开发的热点，其研发和产业化也成为国家的战略需求。

微生物农药是生物农药的重要一类，包括农用抗生素和活体微生物农药。微生物农药是从天然产物中分离纯化出来的，可以直接作用于病虫害防治，也可以作为先导化合物合成新的农药。这些农药既可以保留原有生物活性物质的低毒、低残留等优点，同时克服了某些天然产物的稳定性差、活性不高等不足，使得生物活性物质的潜力得到充分挖掘。

真菌是开发微生物农药的重要资源，世界各国投入了大量的科研力量予以研究。目前已经注册的以陆生真菌或其代谢产物为有效成分的生物农药达70余种，这些微生物农药被广泛应用于防治植物病害、虫害和田间杂草。我国在应用和基础研究方面也取得了十分突出的成绩。尽管我国当前生物农药的产量仅占农药总产量的9%，但从人类长远利益角度考虑和农药发展趋势来看，生物农药的发展潜力十分巨大。海洋真菌来源于海洋环境，并不是陆地生物的寄生菌，在直接以微生物活体作为有效杀虫剂或杀菌成分的生物农药开发模式面前，海洋真菌于陆地真菌相比，没有优势可言，但在以微生物代谢为有效成分的农药开发模式下，海洋真菌却具有很大优势。

海洋真菌的生存环境比较苛刻（高盐、高压、缺氧、低营养、无光照等），为求得生存空间，它们在长期的进化过程中产生了一些结构独特的次生代谢物质，特别是海洋动植物共附生真菌，为争取自身的最大生存，通过分泌具有各种生物活性的代谢物来积极地参与动植物的代谢活动，在动植物的抗感染、抗吞噬的生态防卫中发挥了重要的作用，被认为是筛选抗生素的最佳对象。从海洋真菌中分离得到的新化合物70%-80%具有各种各样的生物活性，也已引起化学家和生物学家的极大关注，种类包括萜类、肽类、生物碱、酮类以及酯类化合物，其中有很多是某些杀虫剂、杀菌剂的有效成分或前体物质。关于海洋真菌次生代谢物的功能与用途，研究者较多的关注于治疗人类疾病的医用药物的开发，海洋真菌代谢物农用杀虫、杀菌功能的研究较少。

烟蚜Myzus persicae (Sulzer)属同翅目蚜科，是重要的农业害虫之一，可为害烟草、十字花科蔬菜、桃树等多种植物，同时也是黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒（PVY）等多种植物病毒的传播媒介。目前，烟蚜的防治最有效的方法仍是化学防治，同时也有诸多有关生物防治方法的成功应用（例如天敌烟蚜茧蜂的繁殖和释放等），但对于利用海洋微生物次生代谢物来探索开发烟蚜生物制剂还未见报道。因此本试验将从生物防治方面进行探索，筛选对烟蚜有毒杀活性的海洋真菌菌株，为将来利用这些菌株及其次生代谢产物开发生物制剂防治烟蚜提供研究基础和实验材料。

发明内容

本发明的目的是提供一株用于防治烟蚜的菌株，即一株来自海洋褐藻的小不整球壳属（Plectosphaerella cucumerina）菌种及其在烟蚜生物防治中的应用，同时将筛选的可产生对烟蚜有生物活性次生代谢物的菌株应用到烟蚜的生物防治中,从而弥补现有技术的不足。

本发明的来自海洋褐藻的小不整球壳属（Plectosphaerella cucumerina） mfz19菌株，已于2012年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC NO.6859。

mfz19菌株的生长温度范围为25～30℃，最佳生长温度为28℃；最适pH值为10.0；使用的培养基为PDA海水培养基。

本发明筛选的mfz19菌株用于防治烟蚜，也可用来制备具有防治烟蚜功能的制品。

本发明的mfz19菌株的代谢产物，其制备方法如下：

1）首先将mfz19菌株进行扩大培养，然后将培养液中培养基去掉，获得的菌体中加入乙酸乙酯进行萃取；将萃取液旋转蒸发后制成浸膏；

 2）取D101大孔吸附树脂，先用去离子水洗净，再用无水乙醇洗至液体不浑浊；将处理后的D101大孔吸附树脂上柱后，用氢氧化钠洗至中性，再用盐酸洗至流出液呈酸性，去离子水洗至中性后，将步骤1）制备的浸膏用甲醇溶解后，再用等量去离子水混合，用大孔吸附树脂静态吸附24 h，然后用无水乙醇梯度洗脱，洗脱液减压浓缩获得mfz19菌株的代谢产物。

上述的代谢产物用于防治烟蚜。

本发明获得的对烟蚜有生物活性的mfz19菌株，可应用于烟草上烟蚜的防治，采用微量点滴法对烟蚜的生物测定表明，其发酵液中次生代谢物对烟蚜的致死率最高可达92.9％。采用GC/MS进行化学分析和结构鉴定后，次生代谢物包括有9种主要化合物，其中酯类化合物4种、酸类化合物2种，肼类化合物、脲类化合物、醇类化合物各1种。对乙酰胆碱酯酶的抑制作用研究表明，抑制率最高可达76.45%。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的菌株进行详细的描述。

一、小不整球壳属Plectosphaerella cucumerina mfz19菌株的筛选

将从山东省青岛市黄岛银沙滩采集的褐藻用70%的酒精浸泡30s，切成0.5cm的长条，将切成长条的褐藻置于PDA培养基上（培养基配制方法：马铃薯去皮，200g切成小块，加海水1 L煮沸30min，4-6层纱布过滤，加20g葡萄糖，溶解，用蒸馏水补充失去的水分。固体培养基则加入1.5-2%的琼脂，121℃，高压灭菌20min。）在28℃下进行培养，单斑分离纯化获得了mfz19菌株。经18s rDNA ITS基因序列分析鉴定为小不整球壳属（Plectosphaerella cucumerina）。

二、mfz19菌株的形态、理化参数

1、mfz19菌株的形态特征

显微镜下观察， mfz19菌株菌丝分枝，有隔膜，宽约1～2μm；孢子纺锤形，有横隔，长约6～8μm，宽约2～3μm，无色。

2、培养条件

mfz19菌株在PDA平板上培养后，菌落呈乳白色至浅粉色，边缘较整齐，后期部分产生黑色颗粒状的物质。在 PDA液体培养基上培养后菌体呈球状。  mfz19菌株的最适生长温度28℃，最佳PH值10，最佳培养时间8d，最适培养基为海水PDA培养基。

3、次生代谢活性物质的分离纯化

将筛选出的活性菌株mfz19接种到PDA培养基上纯化，挑取单菌落保存于试管中的培养基斜面上。挑取培养基平板上生长良好的单一菌落接种到液体PDA培养基中，于28℃，120 rpm，培养8d。用多层灭菌纱布过滤，弃去渣滓。用等量于发酵液体积的乙酸乙酯反复萃取三次，收集有机相，在旋转蒸发仪上减压浓缩至浸膏，有机相浓缩温度控制在50℃。

取适量的D101大孔吸附树脂先用去离子水洗净，再用无水乙醇洗至液体不浑浊。湿法上柱，用2%盐酸洗至中性，再用2%氢氧化钠洗至流出液呈碱性，去离子水洗至中性，待用。将样品液上柱，静态吸附24小时。用无水乙醇梯度洗脱，比例（无水乙醇/水）分别为1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1、10/0。将上述洗脱液混合置于旋转蒸发仪中蒸馏，得到的物质用少量丙酮洗脱收集，室温蒸发，作为生物测定待测液。用毛细管滴定法对烟蚜进行生物测定，对生测结果较好的洗脱液蒸馏所得物用丙酮洗脱液收集，用GC/MS测定成分。

GC/MS测定条件：

色谱柱：DB-5MS型弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。初始柱温50℃，保持2分钟，以5℃/min升温至280℃，保持2min；气化室温度250℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压为7.62psi，载气流量为1.0mL/min；进样量1 μL；分流比40：1。

质谱条件： EI源为离子源；离子源温度230℃；倍增器电压2047V；接口温度280℃；溶剂延迟3min；全扫描方式，扫描范围10amu～550amu。

按照上述条件对浓缩提取物进行分离鉴定，通过HPMSD化学工作站，结合NIST98标准质谱图库并结合有关文献人工检索，进行物质鉴定，共检出41种物质，通过HPMSD化学工作站，经与质谱数据库和标准谱图对照进行物质鉴定，共得到9种主要化合物，其中酯类化合物4种、酸类化合物2种，肼类化合物、脲类化合物、醇类化合物各1种。对乙酰胆碱酯酶的抑制作用研究表明，抑制率最高可达76.45%。

三、小不整球壳属（Plectosphaerella cucumerina ）mfz19菌株在烟蚜生物防治中的应用

实施例1 菌株mfz19发酵液对烟蚜的田间防效实验

对菌株mfz19进行大量发酵培养，8 d后收集发酵液，经8层纱布滤去菌体，取发酵上清液进行田间防效实验。在烟田烟蚜发生高峰期，用1L喷雾器将发酵上清液均匀喷雾于烟株上部有蚜叶片正反面。喷雾前调查虫口基数，喷雾后第1，3，7d各调查一次剩余的活虫数量，根据调查结果计算发酵上清液第1，3，7d对烟蚜的校正防效，分别为82.98%，86.48%，49.21%。结果表明菌株mfz19发酵上清液对烟蚜有一定的田间防治效果。

实施例2  菌株mfz19次生代谢活性物质对烟蚜的生物测定

对菌株mfz19进行大量发酵培养，8 d后收集发酵液，经8层纱布滤去菌体，等量乙酸乙酯萃取3次，合并有机相蒸馏，得到的物质用5 mL丙酮洗脱转移至5 mL离心管中，室温蒸发至液面不再下降时作为生测液备用。选取带有10～15头蚜虫的烟叶置于培养皿中。用丙酮将待测液稀释为5个浓度梯度，分别为500 μL/mL、250 μL/mL、125 μL/mL、62.5 μL/mL、31.25 μL/mL，选用0.0776 μL的毛细管微量点滴器，采用点滴法进行点滴测定，设置丙酮作为对照，每处理重复4次，24 h后调查统计蚜虫死亡数量，计算LC₅₀。

生物测定结果表明菌株mfz19发酵液提取物中的活性成分对烟蚜有较高毒性，浓度越高杀虫率也越高，在处理浓度为500 μL/mL时杀虫率可达92.9%。通过DPS软件进行统计分析得到菌株mfz19发酵液提取物对烟蚜的LC₅₀为91.4 μL/mL，毒力回归方程为：Y=2.15X+0.79 ，95%置信限为：67.22～116.99。

上述结果表明本发明筛选的mfz19菌株对于烟蚜具有很好的防治效果，具有很好的推广应用价值。

Claims (5)

1.一株小不整球壳属（Plectosphaerella cucumerina） mfz19菌株，其保藏编号为：CGMCC NO.6859。

2.如权利要求1所述的菌株，其生长温度范围为25～30℃，最佳生长温度为28℃；最适pH值为10.0；使用的培养基为PDA海水培养基。

3.权利要求1所述的菌株在防治烟蚜中的应用。

4.用于防治烟蚜的制品，其特征在于，是用权利要求1所述的菌株制备的。

5.如权利要求4所述的用于防治烟蚜的制品，其特征在于是用如下的方法制备的：

1）首先将权利要求1所述的菌株进行扩大培养，然后去掉培养液中渣滓，获得的发酵液中加入乙酸乙酯进行萃取；将萃取液旋转蒸发后制成浸膏；

2）取D101大孔吸附树脂，先用去离子水洗净，再用无水乙醇洗至液体不浑浊；将处理后的D101大孔吸附树脂上柱后，用氢氧化钠洗至中性，再用盐酸洗至流出液呈酸性，去离子水洗至中性后，将步骤1）制备的浸膏用甲醇溶解后，再用等量去离子水混合，用大孔吸附树脂静态吸附24 h，然后用无水乙醇梯度洗脱，洗脱液减压浓缩获得mfz19菌株的代谢产物。